RU2847245C1 - Регенеративный матрикс "нейромат" для терапии спинальной травмы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к регенеративному матриксу, выполненному в виде 3D биодеградируемого скаффолда. При этом основу указанного матрикса составляют аллогенные мезенхимальные стволовые клетки из Вартонового студня нормальной плаценты человека или аутологичные или аллогенные МСК из костного мозга, выращенные в бессывороточной среде с добавлением 5% тромбоцитарного лизата человека, суспендированные в аутологичной плазме, обогащенной тромбоцитами, включенные в фибриновый гидрогель, концентрация которого составляет 50-75 мг/мл. Изобретение эффективно для заполнения патологических полостей в спинном и головном мозге, а также позволяет усиливать регенерацию спинного мозга и потенцировать эффект нейромодуляции. 5 ил., 5 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, клеточной биотехнологии, нейрохирургии и неврологии. Регенеративный матрикс, основу которого составляют аллогенные мезенхимальные стволовые клетки из Вартонового студня нормальной плаценты человека или аутологичные или аллогенные МСК из костного мозга, суспендированные в аутологичной плазме обогащенной тромбоцитами, включенные в фибриновый гидрогель может быть применен для заполнения патологических полостей в спинном и головном мозге при терапии острой осложненной позвоночно-спинномозговой травмы (ПСМТ) и других повреждений центральной нервной системы.

Глобальная, общемировая заболеваемость осложненной позвоночно-спинномозговой травмой (ПСМТ) по разным оценкам составляет от 26,5 до 50 случаев на миллион населения [Barbiellini Amidei С, 2022]. Применяемые в клинической практике методы терапии и нейрореабилитации пациентов с ПСМТ, включающие декомпрессионную и реконструктивную спинальную хирургию, различные виды механореабилитации, кинезиотерапии, магнито- и электростимуляции при тяжелой спинальной травме (уровень поражения по шкале Американской ассоциации спинальной травмы (ASIA) А или В) мало эффективны.

Одним из наиболее перспективных подходов к регенерации спинного мозга является регенеративная терапия с помощью стволовых/прогениторных клеток, таких как нейральные прогениторные клетки или мезенхимальные стволовые клетки. Проведенный мета-анализ результатов 188 доклинических исследований по трансплантации 16 видов стволовых клеток на животных моделях ПСМТ показал, что применение клеточной терапии вместе с различными скаффолдами существенно улучшает функциональное восстановление спинного мозга [Shang Z., 2022]. Это происходит за счет паракринного эффекта стволовых клеток, улучшающего выживание и регенерацию структур спинного мозга. Именно паракринным эффектом можно объяснить положительное влияние мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани на восстановление функций спинного мозга при интратекальном введении человеку в рамках I фазы клинических исследований [Bydon, М., 2024].

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) - это удовлетворяющие критериям стволовости клетки из популяций мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (согласно терминологии, разработанной по рекомендациям Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy - ISCT)) [Horwitz E.M., 2005]. Под критериями стволовости подразумевается способность дифференцироваться в мезодермальные, эктодермальные и энтодермальные клетки (то есть так называемая клеточная мультипотентность), наряду со способностью к делению и пролиферации. МСК широко применяются в клеточной терапии и регенеративной медицине, в связи с иммуномодулирующим, противовоспалительным, стимулирующим ангиогенез и снижающим клеточную гибель действием как самих МСК, так и биоактивных молекул, которые они секретируют [Jin Q, 2022, Pang Q-M, 2022].

В клиническом испытании NCT02481440 (фаза I/II) проводилась оценка безопасности и эффективности повторных (четырехкратных) интратекальных субарахноидальных введений аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека для терапии травм спинного мозга. Это было проспективное одноцентровое клиническое исследование с одной группой, куда рекрутировали 102 пациентов с полной или неполной шейной, грудной и грудопоясничной травмой спинного мозга. Испытание было завершено в марте 2020 года. В ходе исследования не было зарегистрировано серьезных нежелательных эффектов.

Рандомизированное двойное слепое перекрестное плацебо-контролируемое клиническое исследование фазы 1/2а под номером NCT03003364 было проведено на 10 пациентах с хронической полной травмой спинного мозга на дорсальном уровне. Введение МСК не привело к значительным нежелательным эффектам. После терапии МСК наблюдалось значительное улучшение ощущения уколов в дерматомах ниже уровня повреждения по сравнению с плацебо. Никаких изменений в двигательной функции, функции кишечника, качестве жизни или показателях независимости не наблюдалось.

В междисциплинарном клиническом исследовании фазы 1 CELLTOP проводимом в Mayo Clinic (идентификатор исследования NCT03308565), проводилось изучение безопасности и эффективность интратекальных инфузий аутологичных МСК, полученных из жировой ткани у пациентов с контузионной травмой спинного мозга. Клиническая оценка эффективности проводилась через 3, 6, 12 и 18 месяцев после инъекции, как по двигательным, так и по сенсорным показателям на основе Международных стандартов неврологической классификации повреждений спинного мозга. В отчете по исследованию сообщается о состоянии 53-летнего пациента, принявшего участие в исследование, с травмой класса С по классификации Американской ассоциации травм позвоночника на момент начала исследования. Согласно протоколу, пациент получил интратекальную инъекцию аутологичных МСК, которые были введены путем стандартной люмбальной пункции, в область на уровне L3-4 позвонка, через 11 месяцев после травмы. Каких-либо нежелательных эффектов после процедуры не наблюдалось.

Мета-анализ 26 клинических испытаний МСК при спинномозговой травме показал, что в пяти исследованиях у некоторых пациентов наблюдалось улучшение по классификации AIS от А до С, а в четырех исследованиях - от А до В. У большего числа пациентов, получавших МСК, состояние улучшилось от AIS А до С по сравнению с контрольной группой (только исследования, на пациентах в течение 8 недель после травмы) [Kvistad C.E., 2022].

Еще одним индуктором нейрогенеза является обогащенная тромбоцитами плазма (PRP). В ряде исследований показано, что PRP, за счет содержания различных факторов роста (PDGF-AB, TGF-β1, IGF-1, VEGF) и тромбоцитарных экзосом, содержащих микроРНК и другие сигнальные молекулы, способствует нейрогенезу и росту аксонов, усилению пролиферации и миграции Шванновских клеток, а также экспрессии NGF GDNF. Указанные свойства PRP позволяют рассматривать ее как перспективный источник аутологичных факторов роста и биомиметический скаффолд, создающий необходимое микроокружение.

Помимо PRP для усиления эффектов клеточной терапии применяются различные гидрогели, в том числе гидрогели на природных биоматериалах, таких как гиалуроновая кислота, хитозан, коллаген, фибрин и др. [Feng С., 2023].

Из уровня техники известен матрикс, описанный в патенте RU 2650638 «Способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в фибриновый матрикс». В данном матриксе применялись МСК из жировой ткани или из пульпы зуба, заключенные в фибриновый клей Tissucol. В отличие от указанного матрикса в РМ Нейромат МСК выделяют из Вартонова студня плаценты человека, дополнительными компонентами РМ является аутологичная плазма, обогащенная тромбоцитами. Кроме того, недостатком этого способа является наличие в составе клея Tissucol апротинина крупного рогатого скота, что повышает вероятность развития нежелательных явлений. РМ «Нейромат» полностью состоит из компонентов человеческого происхождения.

Из уровня техники также известен матрикс, описанный в патенте RU 2739912 «Способ стимулирования регенерации спинного мозга при помощи везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток жировой ткани». Так же как в РМ Нейромат в указанном матриксе применяется фибриновый гель. Вместе с тем, в отличие от указанного матрикса, в РМ Нейромат присутствуют не экзосомы, а живые аллогенные МСК из Вартонова студня плаценты, продуцирующие экзосомы на всем протяжении своей жизни, что обеспечивает больший терапевтический эффект.

Еще один известный из уровня техники матрикс, описанный в патенте RU 2659842 «Носитель для трансплантируемых клеток для замещения дефекта, полученного при черепно-мозговой травме» основан на гидрогелевом носителе хитозан, применяемом для заполнения патологических полостей с целью удержания стволовых клеток в зоне повреждения нервной ткани. Недостатком данной разработки является ксеногенное происхождение гидрогелевого матрикса, что значительно усложняет регистрацию такого медизделия и повышает риск нежелательных явлений. В отличие от патента RU 2659842, основой РМ Нейромат является фибриновый гидрогель, характеризующийся высокой степенью биосовместимости и низким риском нежелательных явлений.

Наиболее близкий аналог РМ «Нейромат» описан в экспериментальной работе Medvediev, V.V. et al. (Implantation Effect of a Fibrin Matrix Associated with Mesenchymal Wharton's Jelly Stromal Cells on the Course of an Experimental Spinal Cord Injury. Cytol. Genet. 57, 19-34 (2023). https://doi.org/10.3103/S0095452723010073). Недостатком данного матрикса является то, что испытания проведены в эксперименте на крысах, патофизиология спинальной травмы у которых существенно отличается от аналогичной у человека. В проведенном Medvediev, V.V., et al. эксперименте не было обнаружено достоверного аддитивного эффекта МСК по сравнению с трансплантацией бесклеточного фибринового геля, что может быть объяснено низким регенеративным потенциалом МСК, выращенных в условиях нормоксии в среде с добавлением фетальной сыворотки теленка.

Общим недостатком имеющихся матриксов является то, что ни один из аналогов не предусматривает выращивание клеток в условиях гипоксии в бессывороточной среде с добавлением 5% тромбоцитарного лизата человека, что влияет на регенеративный потенциал МСК и обуславливает безопасность использование матрикса в клиническом применении. В целом, несмотря на наличие средств для замещения дефекта, полученного при повреждениях ЦНС, существует потребность в эффективных способах терапии и нейрореабилитации при спинальной травме методами регенеративной терапии.

Задачей настоящего изобретения является создание регенеративного матрикса для терапии спинальной травмы, основу которого составляют аллогенные мезенхимальные стволовые клетки из Вартонового студня нормальной плаценты человека, выращенные в бессывороточной среде с добавлением 5% тромбоцитарного лизата человека, суспендированные в аутологичной плазме, обогащенной тромбоцитами включенные в фибриновый гидрогель, концентрация которого составляет 50-75 мг/мл, для заполнения патологических полостей в спинном и головном мозге. Вместо плацентарных МСК для создания матрикса могут быть применены аутологичные или аллогенные МСК из костного мозга, обладающие аналогичным иммунофенотипом и критериями мультипотентности.

Техническим результатом данного изобретения является регенеративный матрикс, усиливающий регенерацию спинного мозга и потенциирующий эффект нейромодуляции (электрической стимуляции спинного мозга).

Концентрация фибринового гидрогеля подобрана таким образом, чтобы обеспечить надежную фиксацию МСК в очаге патологии и при этом не оказывать влияния на их жизнеспособность вследствие избыточной контракции геля и изменения биомеханических свойств. Экспериментально подобрано, что для соответствия указанным характеристикам концентрация фибриногена должна находится в переделах 50-75 мг/мл.

На Фиг. 1 раскрыта информация по иммунофенотипированию полученных по разработанной технологии МСК. На Фиг. 2 продемонстрирован повышенный клеточный индекс при культивировании МСК в присутствии 5% тромболизата, по сравнению с культивированием в аутологичной плазме. На Фиг. 3 показана количественная оценка экспрессии генов ростовых факторов и интерлейкинов в МСК из Вартонова студня плаценты человека. А. Высоко экспрессируемые гены. Б. Низко и средне экспрессируемые гены. На Фиг. 4 продемонстрировано влияние интраспинальной трансплантации РМ «Нейромат» на паттерны экспрессии генов иммунных клеток и генов, ассоциированных с нейрорегенерацией. Показано, что РМ «Нейромат» достоверно уменьшает экспрессию генов провоспалительных субпопуляций иммунных клеток: CD8+Т-лимфоцитов (А) и M1 макрофагов (Б). Отмечается тенденция увеличения экспрессии генов нейральных прогениторов (В) и уменьшения экспрессии генов реактивных астроцитов (Г). Обозначения: rMSC - РМ «Нейромат» с аллогенными МСК в фибриновом гидрогеле. Ctrl - контрольная группа (травма без трансплантации); hMSC - трансплантация ксеногенных МСК человека. На Фиг. 5. продемонстрирован пример применения регенеративного матрикса для заполнения патологических полостей в головном мозге. А. МРТ исследование в режиме Т2. Верхние панели - коронарная проекция. Нижние панели -трансверзальная проекция. Левые панели - МРТ после острой травмы перед введением регенеративного матрикса (красными стрелками показана патологическая полость). Правые панели - МРТ через час после введения регенеративного матрикса (матрикс, заполнивший патологическую полость показан зелеными стрелками). Б. Иммунофлюоресцентный анализ зоны травмы головного мозга спустя 3 суток после имплантации регенеративного матрикса. Показано выживание имплантированных клеток и отсутствие выраженной астроглиальной реакции (зеленые стрелки, красное окрашивание).

Ниже приводятся примеры достижения технических результатов.

Пример 1. МСК выделяют из Вартонового студня из области, предлежащей к материнской части плаценты вокруг входа пупочного канатика. Выделение МСК включает механическое измельчение и мягкую ферментативную обработку. Культивирование МСК производится в модифицированной бессывороточной среде, содержащей в качестве основного активного компонента 5% тромболизата человека, приготовленный из свежезамороженного патоген-редуцированного тромбоконцентрата по технологии, являющейся ноу-хау. Полученные МСК характеризуются следующим фенотипом: не менее 90% положительных клеток по маркерам CD29, CD44, CD73, CD90; не менее 85% положительных клеток по маркеру CD105, не более 10% положительных HLA-DR и не более 5% положительных CD34 и CD45 (фиг. 1); клеточный индекс не менее 5,8 через 120 часов культивирования (фиг. 2).

Полученные МСК характеризуются высокой паракринной активностью: лизат клеток содержит мРНК и белки IGFBP-3, -4, TGFbeta, VEGF, IL-6, BDNF, IGF2, PDGF, FGF2 (Фиг. 3).

С целью оценки регенеративного потенциала МСК из различных источников проводили сравнительный анализ мультипотентности и экспрессии поверхностных маркеров (CD29, CD73, CD90, CD105, CD34, CD44 и CD45) у МСК, полученных из Вартонового студня и костного мозга (аутологичных и аллогенных). Проведенное исследование показало, что МСК из двух указанных источников достоверно не отличаются друг от друга ни по экспрессии поверхностных маркеров, ни по способности дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлении. Таким образом, в составе РМ «Нейромат» могут применяться аутологичные и аллогенные МСК из костного мозга человека.

Пример 2. Концентрация фибринового гидрогеля подобрана таким образом, чтобы обеспечить надежную фиксацию МСК в очаге патологии и при этом не оказывать влияния на их жизнеспособность вследствие избыточной контракции геля и изменения биомеханических свойств. Экспериментально подобрано, что для соответствия указанным характеристикам концентрация фибриногена должна находиться в пределах 50 - 75 мг/мл. Показано, что концентрация менее 50 мг/мл приводит к вымываю МСК из гидрогеля, в то время как концентрация выше 75 мг/мл приводит к образованию плотного гидрогеля, в котором наблюдается снижение выживаемости МСК менее 80%. Суспендирование МСК в аутологичной плазме, обогащенной тромбоцитами, способствует повышению выживаемости МСК по сравнению с суспензией в PBS на 35% и 47% спустя 12 и 24 часа инкубации соответственно.

Пример 3. В регламентном доклиническом исследовании исследовали безопасность и эффективность интраоперационного внутриспинномозгового введения регенеративного матрикса «НейроМат» на модели контузионной травмы спинного мозга у карликовых свиней.

Объект и методы исследования: РМ «Нейромат» - комплексный высокотехнологичный лекарственный препарат на основе аллогенных мезенхимальных стромальных клеток, аутологичной PRP и фибриноген-тромбинового гидрогеля. Исследование проводили на половозрелых самцах и самках карликовых свиней (n=20). Тестируемый препарат вводили однократно в 1-й день эксперимента в очаг поражения и субдурально. В рамках эксперимента была проведена оценка эффективности тестируемого препарата в условиях модельной патологии контузионной травмы спинного мозга. Оценка эффективности включала в себя оценку кинематики движений и миографию, оценку неврологического статуса, а также исследование спинного мозга. Для изучения токсических свойств регистрировали картину интоксикации (ежедневное общеклиническое наблюдение), массу тела, клинико-лабораторные показатели и патоморфологическое исследование. Проводили оценку туморогенности тестируемого препарата. Оценивали фармакологическую безопасность в отношении сердечно-сосудистой (оценка ЭКГ, АД, ЧДД, гистологический анализ и массовые коэффициенты сердца) и дыхательной (ЧДД, анализ кислотно-основного состояния крови, гистологический анализ и массовые коэффициенты легких). Проводили оценку возможных иммунотоксических свойств тестируемого препарата.

Индукцию патологии проводили под эндотрахеальным наркозом из заднего доступа к спинному мозгу. В проекции остистых отростков Th8-Тh11 выполняли срединный продольный разрез 8-10 см. Паравертебральные мыщцы тупым путем отслаивались, обнажались дужки позвонков Th9, Th10. Остистый отросток Th9 резецировался. Выполняли интерляминэктомию Th9, обнажали твердую мозговую оболочку, делая окно диаметром 10 мм. Контузионную травму наносили с помощью импактора, представляющего собой металлическую трубку длиной 70 см с внутренним диаметром 10 мм. Трубку стерилизовали и фиксировали интраоперационно над межпозвонковым окном с обнаженной твердой мозговой оболочкой строго вертикально с помощью шарнирной консоли с тремя степенями свободы. Металлический стержень массой 50 г и диаметром 9 мм, стерилизовали и размещали в трубке на высоте 50 см располагался по центру. Контузия возникала в результате свободного падения металлического стержня с высоты 50 см. До и после нанесения контузионной травмы выполняли регистрацию вызванных потенциалов. В случае подтверждения исчезновения SSEP и МЕР с нижних конечностей в контрольной группе операцию заканчивали. Выполняли санацию раны, после чего послойно ушивали и накладывали асептическую повязку. Все животные (n=18) были поделены на 4 группы: №1 - контрольная группа (n=6), в которой после нанесения травмы рана послойно ушивалась без какой-либо терапии; группа №2 - спинальная травма и трансплантация РМ «Нейромат» (n=4); группа №3 - спинальная травма, трансплантация РМ «Нейромат» и нейромодуляция путем эпидуральной электростимуляции спинного мозга (n=4); группа №4 - спинальная травма и нейромодуляция путем эпидуральной электростимуляции спинного мозга (n=4).

Трансплантацию РМ «Нейромат» в группах №2 и №3 выполняли непосредственно после индукции патологии. Для этого вскрывалась твердая мозговая оболочка и выполнялась ревизия повреждения. Затем выполняли интраспинальное введение суспензии аллогенных МСК (2×10⁷/мл) в 50% PRP и растворе фибриногена с концентрацией 50 мг/мл с одномоментным добавлением 100 мкл тромбина. Суммарно в патологические полости и субдурально каждому животному было введено 300 мкл смеси МСК в PRP с фибриногеном (50 мг/мл).

Дополнительно для оценки безопасности МСК интраспинально было введено по 100 мкл суспензии МСК (2×10⁷/мл) выше и ниже очага контузии в интактную ткань спинного мозга. Введение всех компонентов осуществляли со скоростью 100 мкл в минуту с помощью инсулинового шприца с иглой 26G. После образования сгустка всем животным, получившим тестируемый объект выполнялась пластика твердой мозговой оболочки с помощью аутофасции.

Всем экспериментальным животным на протяжении всего эксперимента после индукции патологии проводилась локомоторная реабилитация, включающая тренировку на беговой дорожке (все группы) и нейростимуляцию (группы №3 и №4). Тренировку на беговой дорожке проводили 3 раза в неделю, начиная с 7-го дня после индукции патологии.

Результаты исследования: Клинически значимых изменений в параметрах общего и биохимического анализа крови, коагулограммы, общего анализа мочи и патоморфологии органов во всех экспериментальных группах не выявлено, что свидетельствует о безопасности трансплантации РМ «Нейромат».

Кинематический анализ показал, что средние объемы углового движения в трех суставах тазовых конечностей при ходьбе на беговой дорожке резко снижаются после травмы спинного мозга во всех группах по сравнению с уровнем до травмы. Данное снижение носит достоверный характер (р<0.05).

Интраоперационный контроль моторных и соматосенсорных вызванных потенциалов был применен с целью верификации необратимости и степени двухстороннего повреждения эфферентных и афферентных путей спинного мозга. Последующий анализ моторных вызванных потенциалов (МВП) позволил изучить возможность спонтанного и индуцированного восстановления проводимости кортикоспинального тракта в исследуемых группах, а также объективизировать динамику проведения.

У всех 18 животных из четырех групп, включая выбывших из исследования, сразу после контузии спинного мозга наблюдалось двухстороннее исчезновение МВП.

На первой точке (1 месяц после контузии СМ) все животные сохраняли резко выраженное поражение кортикоспинального тракта, при этом у 6 животных из групп 2 и 3 удалось зарегистрировать МВП как минимум с одной исследуемой мышцы. Суммарная амплитуда МВП ответов в контрольной группе составила 103,0 мкВ, в группах 2 и 3 соответственно 313,5 и 154,0 мкВ.

На финальной точке через 3 месяца после контузии СМ отмечена выраженная динамика показателей МВП в группах №2-4, в то время, как динамика контрольной группы (№1) оказалась минимальной. В контрольной группе при последнем исследовании МВП зарегистрированы с 2 мышц только у одного животного. Наиболее выраженная положительная динамика проведения по кортикоспинальному тракту отмечена во второй и третьей группах. Во второй группе: у всех 4 животных (с 25 до 100% восстановления) зарегистрированы МВП ответ с 1-3 мышц. Суммарная амплитуда МВП ответов через 3 месяца составила 761,0 мкВ в контрольной группе, в то время как в группах 2 и 3 суммарная амплитуда составила 2449,5 мкВ и 1919,0 мкВ соответственно.

Восстановление показателей МВП у животных после трансплантации регенеративного матрикса свидетельствует о его эффективности в отношении восстановления функций спинного мозга. По совокупности показателей, наиболее выраженный эффект восстановления наблюдался в группе с комбинированной терапией - трансплантацией регенеративного матрикса и последующей эпидуральной электростимуляцией выше и ниже уровня травмы одномоментно с локомоторной реабилитацией (данные не представлены). Таким образом, в регламентном доклиническом исследовании была показана фармакологическая безопасность и эффективность интраоперационного внутриспинномозгового введения регенеративного матрикса (РМ) «Нейромат» на основе аллогенных процессированных мезенхимальных стромальных клеток и фибриноген-тромбинового гидрогеля с последующей нейромодуляцией и локомоторной реабилитацией для терапии тяжелой необратимой травмы спинного мозга.

Пример 4. С целью исследования механизмов действия РМ «Нейромат» после интраспинальной трансплантации в очаг контузионной травмы спинного мозга проведен эксперимент на 9 крысах с экспериментальной спинальной травмой. Крысы были поделены на 3 группы (n=3 в каждой): №1 - контрольная группа (травма без терапии); №2 -интраспинальная трансплантация РМ «Нейромат» с аллогенными МСК; №3 - интраспинальная трансплантация ксеногенных МСК. У каждой крысы проведено NGS секвенирование тотальной мРНК из очага травмы и из участка интактного спинного мозга выше уровня травмы на третьи сутки после контузионного повреждения спинного мозга и трансплантации. Было обнаружено, что интраспинальная трансплантация РМ «Нейромат», в отличие от трансплантации ксеногенных МСК способствует достоверному уменьшению экспрессии генов провоспалительных субпопуляций иммунных клеток, таких, как CD8+ Т-лимфоциты (Фиг. 4А) и M1 макрофаги (Фиг. 4Б). Кроме того, по данным транскриптомного анализа после интраспинальной трансплантации РМ «Нейромат» наблюдалось уменьшение экспрессии генов реактивных астроцитов (Фиг. 4Г) и повышение уровня экспрессии генов нейрональных прогениторов (Фиг. 4В).

Суммарно, обнаруженные изменения транскриптома свидетельствуют о том, что интраспинальная трансплантация РМ «Нейромат» способствует уменьшению воспалительного ответа и активации нейрорегенерации на уровне генных сигнатур.

Пример 5. С целью демонстрации применимости РМ «Нейромат» для заполнения патологических полостей в головном мозге был предпринят эксперимент на интактных крысах. Крыс вводили в ингаляционный наркоз, выполняли трепанацию черепа в проекции стриатума и с помощью вакуумного аспиратора удаляли 500 мкл вещества головного мозга. После гемостаза в патологическую полость иглой 27G, соединенной с наноинъектором вводили РМ «Нейромат», после чего рану послойно ушивали и животное выводили из наркоза. Клинически показана хорошая переносимость имплантации матрикса. МРТ головного мозга через час после введения РМ «Нейромат» визуализировала матрикс, полностью заполнивший патологическую полость (Фиг. 5А). Спустя трое суток после введения матрикса проводили перфузию головного мозга, приготавливали толстые криостатные срезы и исследовали методом конфокальной микроскопии. Иммунофлюоресцентный анализ зоны травмы головного мозга спустя 3 суток после имплантации регенеративного матрикса показал хорошее выживание имплантированных клеток, несмотря на ксеногенное микроокружение и состояние острой воспалительной реакции. Иммуногистохимическое окрашивание с помощью антител к GFAP показало отсутствие выраженной астроглиальной реакции (Фиг. 5Б).

ЛИТЕРАТУРА

1. Barbiellini Amidei С., Salmaso L., Bellio S., Saia M. Epidemiology of traumatic spinal cord injury: a large population-based study. Spinal Cord. 2022 Sep; 60 (9): 812-819. doi: 10.1038/s41393-022-00795-w. Epub 2022 Apr 8. PMID: 35396455; PMCID: PMC8990493.

2. Shang Z., Wang R., Li D., Chen J., Zhang B., Wang M., Wang X., Wanyan P. Spinal Cord Injury: A Systematic Review and Network Meta-Analysis of Therapeutic Strategies Based on 15 Types of Stem Cells in Animal Models. Front Pharmacol. 2022 Mar 14; 13: 819861. doi: 10.3389/fphar.2022.819861. PMID: 35359872; PMCID: PMC8964098.

3. Bydon, M., Qu, W., Moinuddin, F.M. et al. Intrathecal delivery of adipose-derived mesenchymal stem cells in traumatic spinal cord injury: Phase I trial. Nat Commun 15, 2201 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-46259-y

4. Feng С., Deng L., Yong Y.Y., Wu J.M., Qin D.L., Yu L., Zhou X.G., Wu A.G. The Application of Biomaterials in Spinal Cord Injury. Int J Mol Sci. 2023 Jan 3; 24 (1): 816. doi: 10.3390/ijms24010816. PMID: 36614259; PMCID: PMC9821025.

5. Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. - 2005. - №7 - P. 393-5. doi: 10.1080/14653240500319234

6. Jin Q.-H., Kim H.-K., Na J.-Y. et al. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cell-conditioned media inhibited macrophages activation in vitro // Scientific Reports. - 2022. - №12 - P. 4754. doi: 10.1038/s41598-022-08398-4

7. Pang Q.-M., Chen S.-Y., Fu S.-P. et al. Regulatory Role of Mesenchymal Stem Cells on Secondary Inflammation in Spinal Cord Injury // Journal of Inflammation Research. - 2022. - №Volume 15 - P. 573-93. doi: 10.2147/JIR.S349572

8. Kvistad C.E., Krakenes Т., Gjerde C, et al. Safety and Clinical Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Treatment in Traumatic Spinal Cord Injury, Multiple Sclerosis and Ischemic Stroke - A Systematic Review and Meta-Analysis // Frontiers in Neurology. - 2022. -№13 - P. 891514. doi: 10.3389/fheur.2022.891514

9. Karamian B.A., Siegel N., Nourie В. et al. The role of electrical stimulation for rehabilitation and regeneration after spinal cord injury // Journal of Orthopaedics and Traumatology. - 2022. - №23 - P. 2. doi: 10.1186/sl0195-021-00623-6

Claims (1)

1. Регенеративный матрикс для заполнения патологических полостей в спинном и головном мозге, выполненный в виде 3D биодеградируемого скаффолда, отличающийся тем, что основу составляют аллогенные мезенхимальные стволовые клетки из Вартонового студня нормальной плаценты человека или аутологичные или аллогенные МСК из костного мозга, выращенные в бессывороточной среде с добавлением 5% тромбоцитарного лизата человека, суспендированные в аутологичной плазме, обогащенной тромбоцитами, включенные в фибриновый гидрогель, концентрация которого составляет 50-75 мг/мл.