RU2846103C2

RU2846103C2 - Антитела к CD20 собачьих

Info

Publication number: RU2846103C2
Application number: RU2023132570A
Authority: RU
Inventors: Аллан БРЭДЛИ; Дэниел БОЛЛАНД; Цзюэсюань ВАН; Рахча Виджай СУТАВАНИ
Original assignee: Пэтмедикс Лтд
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2025-08-29

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены выделенные антитела собачьих или их антигенсвязывающие части, специфически связывающие CD20 собачьих, и конъюгаты указанных антител с терапевтическими компонентами. Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела или их антигенсвязывающие части, экспрессионные векторы и клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, способ получения антител. Данное изобретение также относится к композициям, наборам и способам, предназначенным для диагностики и лечения состояния, опосредованного В-клетками, у субъекта, являющегося представителем собачьих. Изобретение может найти дальнейшее применение в терапии опосредованных В-клетками заболеваний у представителей собачьих. 13 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 12 пр.

Description

Введение

Формы лимфомы собачьих являются одними из наиболее распространенных видов рака, диагностируемых у собак, составляя примерно 7-14% всех форм рака. Как и у людей, у собачьих существует множество различных форм лимфомы, от быстро прогрессирующего рака до хронического заболевания.

CD20 представляет собой белок клеточной поверхности, который, как полагают, участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки В-клеток. Антиген содержит четыре трансмембранные области и присутствует на поверхности почти всех В-клеток, как нормальных, так и озлокачествленных.

Антитела человека, которые распознают CD20 человека, такие как ритуксимаб, используют для лечения заболеваний человека, характеризующихся избыточным количеством В-клеток или сверхактивными или дисфункциональными В-клетками. Эти антитела разрушают В-клетки. Ритуксимаб рассматривается как революционное достижение в лечении В-клеточной лимфомы.

С момента разработки антител для людей, таких как ритуксимаб, более двух десятилетий назад, в литературе сообщалось о ряде антител, распознающих CD20 собачьих. Однако на данный момент ни одно из них не используется в клинической практике. Поэтому все еще остается потребность в различных вариантах терапии. Целью данного изобретения является удовлетворение этой потребности.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту данное изобретение относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связывают CD20 собачьих, причем указанное антитело содержит

а) последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 27, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 27,

b) последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 28, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2, 3 или 4 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 28,

c) последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 29, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 29,

d) последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 30, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID No. 30,

e) последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 31, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID No. 31, и

1) последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 32, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 32.

В другом аспекте данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 7, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 8, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 9, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 10, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 11, и последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 12.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 17, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 18, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 19, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID No. 20, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 21, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 22.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую SEQ ID No. 37, последовательность CDR2 НС, содержащую SEQ ID No. 38, последовательность CDR3 НС, содержащую SEQ ID No. 39, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID No. 40, последовательность CDR2 LC, содержащую SEQ ID No. 41, и последовательность CDR3 LC, содержащую SEQ ID No. 42.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 47, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 48, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 49, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 50, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 51, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 52.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 82, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 83, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 84, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 85, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 86, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 87.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 92, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 93, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 94, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 95, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 96, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 97.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 102, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 103, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 104, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 105, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 106, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 107.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 112, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 113, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 114, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 115, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 116, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 117.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 122, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 123, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 124, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 125, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 126, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 127.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 132, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 133, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 134, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 135, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 136, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 137.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 142, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 143, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 144, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 145, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 146, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 147.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 152, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 153, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 154, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 155, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 156, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 157.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 162, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 163, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 164, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 165, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 166, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 167.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 172, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 173, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 174, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 175, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 176, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 177.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 182, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 183, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 184, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 185, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 186, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 187.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 192, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 193, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 194, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 195, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 196, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 197.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 202, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 203, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 204, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 205, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 206, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 207.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта указанное антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 212, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 213, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 214, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 215, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 216, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 217.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 222, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 223, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 224, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 225, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 226, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 227.

Согласно другому аспекту данного изобретения или в варианте реализации первого аспекта антитело имеет последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 232, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 233, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 234, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 235, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 236, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 237.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть содержат последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 24, или последовательность с по меньшей мере 75%, 80%, 85% или 90% идентичностью последовательностей с ней, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 26, или последовательность с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательностей с ней.

Например, антитело или его антигенсвязывающая часть имеют

a) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 4, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 6;

b) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 14, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 16;

c) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 34, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 36;

d) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 44, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 46;

e) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 79, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 81, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 238;

f) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 89, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 91, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 239;

g) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 99, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 101, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 240;

h) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 109, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 111, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 241;

i) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 119, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 121;

j) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 129, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 131, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 242;

k) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 139, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 141, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 243;

l) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 149, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 151, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 244;

m) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 159, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 161, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 245;

n) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 169, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 171;

о) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 179, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 181, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 246;

р) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 189, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 191, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 247;

q) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 199, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 201, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 248;

r) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 209, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 211, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 249;

s) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 219, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 221; или

t) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 229, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 231, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 250.

Например, антигенсвязывающая часть представляет собой scFv, Fv, антитело, состоящее только из тяжелых цепей, или однодоменное антитело.

Данное изобретение также относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связываются с CD20 собачьих, конкурирующим с антителом или его антигенсвязывающей частью, как описано выше.

Например, антитело или его антигенсвязывающая часть конъюгированы с терапевтическим компонентом.

Например, терапевтический компонент представляет собой второе антитело или его антигенсвязывающую часть.

Например, второе антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с отличающейся мишенью.

Например, антитело или его антигенсвязывающая часть конъюгированы с дополнительным компонентом, выбранным из компонента, увеличивающего период полувыведения, метки, цитотоксина, липосомы, наночастицы или радиоизотопа.

Например, указанные антитело или его антигенсвязывающая часть являются а-фукозилированными.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано выше.

Данное изобретение также относится к способу лечения состояния, опосредованного В-клетками, у нуждающегося в этом субъекта, являющегося представителем собачьих, включающему введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше.

Например, состояние, опосредованное В-клетками, представляет собой В-клеточную лимфому или лейкоз.

Например, состояние, опосредованное В-клетками, представляет собой иммуноопосредованное заболевание.

Например, иммуноопосредованное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.

Например, другое терапевтическое средство можно вводить субъекту отдельно.

Например, терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое средство или радиотоксичное средство.

Например, терапевтическое средство представляет собой иммунодепрессант.

Например, терапевтическое средство представляет собой иммуномодулирующее средство, такое как цитокин или хемокин.

Данное изобретение также относится к антителу или антигенсвязывающей части, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше, для лечения заболевания.

Например, заболевание представляет собой заболевание, опосредованное В-клетками.

Например, заболевание, опосредованное В-клетками, представляет собой В-клеточную лимфому или лейкоз.

Например, заболевание, опосредованное В-клетками, представляет собой иммуноопосредованное заболевание.

Данное изобретение также относится к способу ингибирования роста опухоли или метастазирования, включающему приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающей части, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше.

Данное изобретение также относится к способу уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CD20, включающему приведение клетки в контакт с антителом, как описано выше, или фармацевтической композицией, как описано выше, вследствие чего происходит уничтожение клетки, экспрессирующей CD20.

Например, опухолевая клетка представляет собой опухолевую клетку собачьих.

Данное изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано выше.

Например, последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO. 3, 5, 13, 15, 23, 25, 33, 35, 43, 45, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118, 120, 128, 130, 138, 140, 148, 150, 158, 160, 168, 170, 178, 180, 188, 190, 198, 200, 208, 210, 218, 220, 228, 230, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270,271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 или 301.

Чертежи

Данное изобретение также относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, как описано выше.

Данное изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, как описано выше, или вектор, как описано выше.

Данное изобретение также относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано выше, или фармацевтическую композицию, как описано выше.

Например, дополнительно содержится реагент для выявления антитела или его антигенсвязывающей части.

Данное изобретение также относится к способу получения антитела собачьих, которое связывает CD20, включающему культивирование выделенной клетки-хозяина, как описано выше, и извлечение указанного антитела.

Данное изобретение также относится к способу получения антитела собачьих, которое связывает CD20, включающему этапы

a) иммунизации трансгенной мыши, в организме которой экспрессируется конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая V-гены тяжелой цепи собачьих и V-гены легкой цепи собачьих, антигеном CD20,

b) получения библиотеки антител от указанной мыши и

c) выделения антитела из указанной библиотеки.

Данное изобретение также относится к способу выявления белка CD20 или внеклеточного домена белка CD20 в биологическом образце от субъекта, являющегося представителем собачьих, включающему приведение биологического образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающей частью, как описано выше, причем указанные антитело или его антигенсвязывающая часть связаны с выявляемой меткой.

Например, биологический образец представляет собой биоптат, образец ткани, крови, сыворотки крови, плазмы крови или лимфатической жидкости.

Данное изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающей части, которые связывают антиген собачьих по эпитопу, который содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO: 2)

Чертежи

Данное изобретение дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих фигур.

Фиг. 1. Титр антитела у иммунизированных CD20 собачьих мышей Ky9. После иммунизации сыворотку крови серийно разводили (как показано) и добавляли к клеткам, экспрессирующим CD20 собачьих. Далее клетки инкубировали со вторичными антителами к IgG1, IgG2a, IgG2b мыши, конъюгированными с флуорофором, и образцы оценивали на проточном цитометре. Связывание сыворотки крови до иммунизации с клетками, экспрессирующими CD20 собачьих, представлено как фоновая кривая на графике.

Фиг. 2. (А) Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей mAb РМХ001, РМХ002, РМХ003, РМХ004 и РМХ005. Затенением обозначены CDR1-, CDR2- и CDR3-области в последовательностях как тяжелой цепи (НС), так и легкой цепи (LC) mAb. (В) выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей НС и LC mAb. Прямоугольниками обозначены CDR1-, CDR2- и CDR3-области в последовательностях как тяжелой цепи (НС), так и легкой цепи (LC) mAb.

Фиг. 3. Оценка связывания mAb к CD20 собачьих с использованием проточной цитометрии. РМХ001, РМХ002, РМХ003, РМХ004, РМХ005, 1E4-cIGGB, 4E1-7-cIGGB (см. А) и РМХ006, РМХ007, РМХ008, РМХ009, РМХ010, РМХ011 (см. В) и РМХ003, РМХ066, РМХ067, РМХ069, РМХ070, РМХ071, РМХ072, РМХ073, РМХ074, РМХ075, РМХ076, РМХ077, РМХ078, РМХ079, РМХ080, РМХ081, 1E4-CIGGB, 4E1-7-cIGGB (см. С) применяли для cCD20-экспрессирующих клеток MDCK II при 10 мкг/мл. Ритуксимаб-cIGGB (серое затенение) использовали в качестве изотипического контроля, и он представлен на каждом графике. (D) Определение аффинности mAb РМХ003, РМХ115 и РМХ070. Связывание серийно разведенных 1:2 антител с сСВ20-экспрессирующими клетками MDCK II оценивали в анализе связывания, и определяли средние значения сигнала флуорофора. График средней интенсивности флуоресценции (MFI) в зависимости от концентрации использовали для определения ЕС50 связывания, с использованием нелинейной регрессии, что соответствует кажущейся Kd связывания антитела с CD20 собачьих, экспрессирующимся на клеточной поверхности.

Фиг. 4. CDC-активность антител к CD20 собачьих. Как нативный, так и а-фукозилированный формат антител анализировали в диапазоне концентраций (как показано) в CDC-анализе. Химерное антитело ритуксимаб-cIGGB использовали в качестве «изотипического контроля». «F» относится к а-фукозилированному формату антител.

Фиг. 5. ADCC-активность антител к CD20 собачьих. Как нативный, так и а-фукозилированный формат антител анализировали в диапазоне концентраций (как показано) в ADCC-анализе. Химерное антитело ритуксимаб-cIGGB использовали в качестве «изотипического контроля». «F» относится к а-фукозилированному формату антител. Значения ЕС50 также представлены для каждого антитела.

Фиг. 6. Эффективность истощения В-клеток в случае mAb к CD20 собачьих в цельной крови собачьих. Свежезабранную цельную кровь собаки разбавляли культуральной средой и инкубировали с 10 мкг/мл РМХ001, РМХ003, 1E4-CIGGB, 4Е1-7-cIGGB (см. А), нативным или а-фукозилированным форматом антител РМХ003 и 4Е1-7-cIGGB (см. В), РМХ003, РМХ006, РМХ007, РМХ008, РМХ009, РМХ010, РМХ011 (см. С), или без антитела, в течение 24 ч. Ритуксимаб-cIGGB использовали в качестве «изотипического контроля» (изот.контр.). «F» относится к а-фукозилированному формату антител.

Фиг. 7. Эффективность истощения В-клеток в случае mAb к CD20 собачьих у здоровых биглей. (А-В) Трем здоровым биглям в каждой группе исследуемого лекарственного средства внутривенно вводили следующие антитела: изотипический контроль (ритуксимаб-cIgGB, 2,5 мг/кг), РМХ003 в низкой дозе (0,5 мг/кг), РМХ003 в высокой дозе (2,5 мг/кг) и а-фукозилированное РМХ003 в низкой дозе (0,5 мг/кг). «F» относится к а-фукозилированному формату антител. Процентную долю CD21+ В-клеток (А) и CD8+ Т-клеток (В) в популяции лимфоцитов анализировали с использованием проточной цитометрии на 0-е, 1-е, 2-е, 5-е, 7-е, 15-е, 27-е и 43-е сутки. Показанные в этом случае данные соответствуют четырем техническим повторам. (С) Трем здоровым биглям в каждой группе исследуемого лекарственного средства внутривенно вводили следующие антитела: изотипический контроль (ритуксимаб-cIgGB, 2 мг/кг), РМХ115 в низкой дозе (0,5 мг/кг), РМХ115 в высокой дозе (2 мг/кг), РМХ070 в низкой дозе (0,5 мг/кг) и РМХ070 в высокой дозе (2 мг/кг). Процентную долю CD21+ В-клеток в популяции лимфоцитов анализировали с использованием проточной цитометрии на 0-е, 1-е, 4-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки. Показанные в этом случае данные соответствуют четырем техническим повторам.

Фиг. 8. Стратегия картирования эпитопов для антител к CD20. (А) последовательность внеклеточного домена CD20 собачьих подвергали мутации с замещением на последовательность CD20 человека в эквивалентных местоположениях в векторах DH01-DH09. (В) последовательность внеклеточного домена CD20 собачьих подвергали мутации с замещением на последовательность CD20 мышиных в эквивалентных местоположениях в векторах DM01-DM09. (С) Каждый остаток в малой петле и каждый второй остаток в большой петле внеклеточного домена CD20 собачьих подвергали мутации с замещением на аланин, в результате чего были получены векторы S01-S09 и L01-L25. Мутантные остатки выделены жирным шрифтом.

Фиг. 9. Связывание mAb РМХ003, РМХ115 и РМХ070 с клетками MDCK, экспрессирующими химерный CD20 собаки-человека или химерный CD20 собаки-мыши, оценивали с помощью проточной цитометрии. Черные столбики 01-09 на фигуре соответствуют связыванию с последовательностями DH01-DH09, показанными на Фиг. 8А, а серые столбики 01-09 на фигуре соответствуют связыванию с последовательностями DM01-DM09, показанными на Фиг. 8В. Клетки MDCK, экспрессирующие CD20 дикого типа собачьих, применяли в качестве положительных контролей, а клетки MDCK дикого типа использовали в качестве отрицательных контролей.

Таблица 1. Аминокислотные остатки и примеры консервативных аминокислотных замен.

Таблица 2. Последовательности.

Таблица 3. Использование генов VH и VL.

Таблица 4. Обобщение функциональных данных для антител.

Таблица 5. Профиль разрабатываемости для антител.

Подробное описание сущности изобретения

Далее будут описаны варианты реализации данного изобретения. В следующих параграфах описаны различные варианты реализации изобретения. Каждый определенный таким образом аспект может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное.

В общем случае номенклатура, используемая в связи с клеточным и тканевым культивированием, патологией, онкологией, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией белков и нуклеиновых кислот, и гибридизацией, описанными в данном документе, а также их методиками, хорошо известна и широко используется в данной области техники. Способы и методики данного изобретения в общем случае осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более специфических литературных источниках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании, если не указано иное. См., например, Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (редактор), Wiley, (2009); и Antibody Engineering, 2-е издание, тома 1 и 2, Ontermann and Dubel, ред., Springer-Verlag, Heidelberg (2010).

Ферментативные реакции и очистку проводят в соответствии со спецификациями производителя или так, как это общепринято в данной области техники, как описано в данном документе. Номенклатура, используемая в связи с этим, а также лабораторные процедуры и технологии аналитической, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данном документе, являются хорошо известными и общепринятыми в данной области техники. Для химического синтеза, химического анализа, фармацевтического изготовления, составления и доставки, а также лечения пациентов используют стандартные методики.

Авторы изобретения разработали полностью собачьи антитела, которые специфически связываются с CD20 собачьих. Эти антитела были получены в организме трансгенных грызунов, у которых экспрессируются V-, D-, J-гены. Следовательно, антитела с меньшей вероятностью будут иммуногенными для введения субъектам, являющимся представителями собачьих, чем канинизированные антитела или химерные антитела. Кроме того, поскольку эти антитела можно использовать напрямую, без дополнительных модификаций их вариабельных областей, нет риска снижения аффинности или иного нарушения функционирования антитела. Другие технологии рискуют привести к возникновению проблем в разработке или эффективности из-за комбинации ex vivo последовательностей антител собачьих с последовательностями антител другого вида, обычно грызунов. Таким образом, данное изобретение относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связывают CD20 собачьих.

Свойства антител и их антигенсвязывающих частей по данному изобретению могут быть использованы в терапевтических способах и применениях, а также в фармацевтических составах, как описано в данном документе.

Термин CD20 относится к В-лимфоцитарному антигену CD20. Антитела и их антигенсвязывающие части специфически связываются с CD20 дикого типа собачьих, как определено в SEQ ID No. 1 (нуклеотидная последовательность) и SEQ ID No. 2 (аминокислотная последовательность). Если не указано иное, термин CD20 в контексте данного документа относится к CD20 собачьих. В-лимфоцитарный антиген CD20 или CD20 экспрессируется на поверхности всех В-клеток, начиная с про-В фазы (CD45R+, CD117+), и при этом его концентрация постепенно увеличивается до зрелости. У людей и собачьих CD20 кодируется геном MS4A1.

Все из терминов «CD20-связывающие молекула/белок/полипептид/средство/компонент», «молекула/белок/полипептид/средство/компонент, связывающие антиген CD20», «антитело к CD20», «антитело к CD20 или его антигенсвязывающая часть» относятся к молекуле, способной специфически связываться с антигеном CD20 собачьих. Реакция связывания может быть продемонстрирована стандартными способами, например, с помощью теста с отрицательным контролем с использованием антитела несвязанной специфичности.

Антитело или его антигенсвязывающая часть по данному изобретению, включая полиспецифическое, например, биспецифическое или триспецифическое связывающее средство, описанное в данном документе, «которое связывает» или «способно связывать» представляющий интерес антиген, который представляет собой CD20 собачьих, является таковым, которое связывает антиген с достаточной аффинностью, так что антитело или его антигенсвязывающая часть являются пригодными в качестве терапевтического средства для нацеливания на клетку или ткань, экспрессирующую антиген CD20, как описано в данном документе.

Антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с данным изобретением специфически связываются с CD20 собачьих. Другими словами, связывание с антигеном CD20 измеримо отличается от неспецифического взаимодействия. В частности, антитела, описанные в данном документе, не реагируют перекрестно с CD20 мыши.

Термин «специфическое связывание» или «специфически связывается с» или является «специфическим в отношении» конкретного полипептида или эпитопа на конкретной полипептидной мишени в контексте данного документа может касаться, например, молекулы, имеющей KD в отношении мишени по меньшей мере около 10^-6 М, альтернативно, по меньшей мере около 10^-7 М, альтернативно, по меньшей мере около 10^-8 М, альтернативно, по меньшей мере около 10^-9 М, альтернативно, по меньшей мере около 10^-10 М, альтернативно, по меньшей мере около 10^-11 М, альтернативно, по меньшей мере около 10^-12 М или ниже. В одном варианте реализации изобретения KD составляет от по меньшей мере около 10^-8 М до около 10^-9 М, например, в одном варианте реализации изобретения KD находится в наномолярном диапазоне. В одном варианте реализации изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без существенного связывания с любым другим полипептидом или полипептидным эпитопом. Термины KD и K_D в данном документе используются взаимозаменяемо.

Термин «антитело» в контексте данного документа в широком смысле относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig) или ее антигенсвязывающей части, состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, или любому ее функциональному фрагменту, мутанту, варианту или производному, которые сохраняют основные характеристики связывания эпитопа молекулы Ig.

В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области или домена тяжелой цепи (в данном документе сокращено как HCVR) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области или домена легкой цепи (в данном документе сокращено как LCVR) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C_L.

Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи дополнительно могут быть разделены на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных, от амино-конца к карбокси-концу, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Молекулы иммуноглобулинов в целом могут относиться к любому изотипу, классу или подклассу. C_H3-домен в соответствии с различными аспектами данного изобретения представляет собой C_H3-домен подтипа IgG собачьих, например, IgG-A, IgG-B, IgG-C и IgG-D.

У собачьих есть четыре тяжелые цепи IgG, называемые А, В, С и D. Эти тяжелые цепи соответствуют четырем разным подклассам IgG собак, которые называются IgG-A, IgG-B, IgG-C и IgG-D. ДНК- и аминокислотные последовательности этих четырех тяжелых цепей впервые были идентифицированы Tang et al. (Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259-270 (2001)). Аминокислотные и ДНК-последовательности для этих тяжелых цепей также доступны в базах данных GenBank (IgGA: номер доступа AAL35301.1, IgGB: номер доступа AAL35302.1, IgGC: номер доступа AAL35303.1, IgGD: номер доступа AAL35304.1). Антитела собачьих также содержат два типа легких цепей, каппа и лямбда (номер доступа для аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи в GenBank ABY 57289.1, номер доступа в GenBank ABY 55569.1). Антитела согласно данному документу могут иметь легкую лямбда- или каппа-цепь. В одном варианте реализации изобретения легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.

Термин «CDR» относится к определяющей комплементарность области в пределах вариабельных последовательностей антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи имеются три CDR, которые обозначаются CDR1, CDR2 и CDR3, для каждой из вариабельных областей. Термин «набор CDR» относится к группе из трех CDR, которые встречаются в одной вариабельной области, способной связывать антиген. Точные границы этих CDR могут быть определены по-разному в соответствии с разными системами, известными в данной области техники.

Определяющие комплементарность области (CDR) согласно Kabat основаны на вариабельности последовательностей и являются наиболее часто применяемыми (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 и Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, Министерство здравоохранения и социальных служб США, публикация NIH №91-3242). Chothia вместо этого предусматривает расположение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Система нумерации no Kabat обычно используется при описании остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи). Другой системой является схема нумерации ImMunoGeneTics (IMGT). Схема нумерации IMGT описана в Lefranc et al., Dev. Сотр. Immunol., 29, 185-203 (2005). В данном документе используется схема нумерации IMGT, если не указано иное.

Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные домены, включая определяющие комплементарность области (CDR) антитела, происходящего из одного вида, предпочтительно антитела грызуна или человека, тогда как константные домены молекулы антитела происходят из антител собачьих.

В контексте данного документа термин «канинизированное антитело» относится к формам рекомбинантных антител, которые содержат последовательности из антител как собачьих, так и отличных от собачьих животных (например, мышиных). В общем случае, канинизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного или нескольких, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таковым иммуноглобулина отличного от собачьих животного, и все или практически все каркасные (FR) области (и, как правило, все или практически все остальные каркасные области) представляют собой области последовательности иммуноглобулина собачьих. Канинизированное антитело может содержать три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела мышиных или человека вместе с каркасной областью собачьих или модифицированной каркасной областью собачьих. Модифицированная каркасная область собачьих содержит одно или несколько аминокислотных изменений, которые могут дополнительно оптимизировать эффективность канинизированного антитела, например, для повышения связывания с его мишенью. Последовательности отличного от собачьих животного, например, гипервариабельных петель, можно дополнительно сравнить с последовательностями собачьих и изменить как можно больше остатков, чтобы они были как можно более похожими на аутентичные последовательности собачьих.

Напротив, полностью собачьи антитела по данному изобретению имеют вариабельные области собачьих и не включают полные или частичные CDR или FR других видов. Предпочтительно полностью собачьи антитела, как описано в данном документе, были получены из трансгенных мышей, содержащих последовательности иммуноглобулинов собачьих. Антитела, полученные у таких иммунизированных мышей, вырабатываются посредством in vivo В-клеточной передачи сигналов и вырабатываются с возможностью естественного созревания аффинности, включая in vivo V(D)J-рекомбинацию, in vivo разнообразие J-сегментов, in vivo спаривание тяжелых и легких цепей и in vivo гипермутацию. При получении полностью собачьих антител таким путем, вырабатываются антитела с оптимальными свойствами в отношении разрабатываемости, сводя к минимуму длительную оптимизацию перед масштабным производством. Предпочтительно такие полностью собачьи антитела характеризуются наименьшим возможным риском иммуногенности при введении пациенту-животному, что, в свою очередь, облегчает режим повторного дозирования. Учитывая, что конструирование mAb ex vivo сопряжено с риском возникновения проблем в разработке, иммуногенности и сниженной аффинности (как описано выше), полностью собачьи антитела по данному изобретению, следовательно, с наибольшей вероятностью будут эффективными вариантами терапии в клиническом контексте. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения термин антитело собачьих относится к полностью собачьему антителу.

Термин «моноклональное антитело» в контексте данного документа относится к антителу, полученному из популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирований, добавления углеводов), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против одного антигенного сайта. В отличие от фракций поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Помимо своей специфичности, моноклональные антитела имеют преимущество в том, что они синтезируются гибридомной культурой, неконтаминированной другими иммуноглобулинами.

Термин «антигенсвязывающий сайт» относится к части антитела или фрагмента антитела, которая содержит область, специфически связывающуюся с антигеном. Антигенсвязывающий сайт может обеспечиваться одним или несколькими вариабельными доменами антитела. Антигенсвязывающий сайт, как правило, содержится в пределах ассоциированных V_H и V_L антитела или фрагмента антитела.

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту на поверхности антигена, с которым специфически связывается иммуноглобулин, антитело или фрагмент антитела. Обычно антиген имеет несколько или множество разных эпитопов и реагирует с множеством разных антител. Термин, в частности, включает линейные эпитопы и конформационные эпитопы. Эпитопы в пределах антигенов белка могут быть образованы как непрерывными аминокислотами (как правило, линейный эпитоп), так и прерывающимися аминокислотами, расположенными рядом благодаря укладке белка в третичную структуру (как правило, конформационный эпитоп). Эпитопы, образованные из непрерывных аминокислот, как правило, но не всегда, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные благодаря укладке в третичную структуру, как правило, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, какие эпитопы связываются данным антителом или фрагментом антитела (т.е. картирование эпитопов с помощью аланин-сканирующего мутагенеза или Pepscan) хорошо известны в данной области техники и включают, например, анализы на основе иммуноблоттинга и иммунопреципитации, где перекрывающиеся или смежные пептиды тестируют в отношении реактивности с данным антителом или фрагментом антитела. Антитело связывает «по существу тот же эпитоп», что и эталонное антитело, если два антитела распознают идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами определения того, связываются ли два антитела с идентичными или пространственно перекрывающимися эпитопами, являются анализы конкуренции, которые могут быть адаптированы в разных форматах, с использованием либо меченого антигена, либо меченого антитела.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть, как описано в данном документе, связывают эпитоп, который содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-19, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ITISHFFKMENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 302, аминокислоты №141-159 в Seq ID NO. 2). В одном варианте реализации изобретения эпитоп содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO: 2).

В одном варианте реализации изобретения эпитоп определяют с помощью сайт-направленного мутагенеза, как показано в примерах, например, с использованием аланинового сканирования. В одном варианте реализации изобретения эпитоп представляет собой линейный эпитоп.В одном варианте реализации изобретения эпитоп представляет собой конформационный эпитоп.В одном варианте реализации изобретения эпитоп включает линейный эпитоп в составе крупной петли. В одном варианте реализации изобретения эпитоп дополнительно включает конформационный эпитоп в составе малой петли. В одном варианте реализации изобретения антитело представляет собой РМХ003 или его антигенсвязывающую часть или антитело с по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, как описано в данном документе.

Согласно другому аспекту данного изобретения, данное изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающей части, связывающей эпитоп, который содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-19, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ITISHFFKMENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 302, аминокислоты №141-159 в Seq ID NO. 2). В одном варианте реализации изобретения эпитоп содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO. 2). Например, антитело или его антигенсвязывающая часть могут иметь последовательности, как описано в данном документе.

Данное изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающей части, которые конкурируют с антителом или его антигенсвязывающей частью, как описано в данном документе.

Протеолитическое расщепление антител приводит к высвобождению разных фрагментов, называемых Fv (фрагмент вариабельной области), Fab (антигенсвязывающий фрагмент) и Fc (кристаллизующийся фрагмент). Fc-фрагмент содержит карбокси-концевые части обоих Н-цепей, удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями. Константные домены Fc-фрагмента ответственны за опосредование эффекторных функций антитела.

Данное изобретение распространяется на антигенсвязывающие части или антигенсвязывающие фрагменты антитела. Термины «связывающая часть» и «фрагмент» в данном документе используются взаимозаменяемо. Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, например, F(ab')2, Fab, Fv, scFv, тяжелую цепь, легкую цепь, вариабельный домен тяжелой (V_H) цепи, вариабельный домен легкой (V_L) цепи и т.п. Функциональные фрагменты полноразмерного антитела сохраняют целевую специфичность полного антитела. Рекомбинантные функциональные фрагменты антитела, такие как Fab (фрагмент, антитело), scFv (одноцепочечные вариабельные фрагменты) и однодоменные антитела (dAb), следовательно, были использованы для разработки терапевтических средств как альтернатива терапевтическим средствам на основе mAb.

Данное изобретение также распространяется на миметики антител, которые содержат последовательность, как описано в данном документе.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Этот фрагмент состоит из димера из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной нековалентной ассоциации. В результате сворачивания этих двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (по 3 петли из Н- и L-цепи), аминокислотные остатки которых участвуют в связывании антигена и обеспечивают антигенсвязывающую специфичность антитела. При этом даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфические в отношении антигена), обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем целый сайт связывания.

«Одноцепочечный Fv», также сокращенно «sFv» или «scFv», представляет собой scFv-фрагмент антитела (~25 кДа), который состоит из двух вариабельных доменов, V_H и V_L, соединенных с образованием одной полипептидной цепи. Естественно, V_H- и V_L-домены связаны нековалентно посредством гидрофобных взаимодействий и имеют тенденцию к диссоциации. Однако могут быть сконструированы стабильные фрагменты с помощью соединения доменов гидрофильным гибким линкером для создания одноцепочечного Fv (scFv).

Наименьший антигенсвязывающий фрагмент представляет собой единичный вариабельный фрагмент, а именно вариабельный домен тяжелой (V_H) или вариабельный домен легкой (V_L) цепи. V_H- и V_L-домены соответственно способны связываться с антигеном. Связывание с партнером легкой цепи/тяжелой цепи соответственно или присутствие других частей полного антитела не требуется для связывания с мишенью. Антигенсвязывающий элемент антитела, уменьшенный до размера одного домена (соответствующего V_H- или V_L-домену), обычно называется «однодоменным антителом» или «единичным вариабельным доменом иммуноглобулина». Однодоменное антитело (~12-15 кДа) имеет, таким образом, либо V_H-, либо V_L-домен, т.е. не имеет других частей полного антитела. Термин «dAb», касательно «доменного антитела», обычно относится к полипептиду единичного вариабельного домена иммуноглобулина (V_H, V_HH или V_L), который специфически связывает антиген.

Термин «выделенный» относится к компоненту, выделенному из его естественного окружения. Например, термин «выделенный» относится к антителу или его фрагменту, которые практически не содержат других антител или фрагментов антител. Более того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

В контексте данного документа термин «гомология» или «идентичность» обычно относится к процентной доле аминокислотных остатков в последовательности, которые являются идентичными остаткам эталонного полипептида, с которым ее сравнивают, после выравнивания последовательностей и, в некоторых вариантах реализации изобретения, после введения гэпов, при необходимости, с достижением максимальной процентной гомологии, и не учитывая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Таким образом, процентная гомология между двумя аминокислотными последовательностями эквивалентна процентной идентичности между двумя последовательностями. Ни N- или С-концевые удлинения, ни метки или вставки не должны рассматриваться как снижающие идентичность или гомологию. Способы и компьютерные программы для выравнивания являются хорошо известными. Процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями можно определять с использованием хорошо известных математических алгоритмов.

Под «аминокислотой» в данном документе подразумевается одна из 20 встречающихся в природе аминокислот или любые искусственные аналоги, которые могут присутствовать в специфическом определенном положении. Аминокислота охватывает как встречающиеся в природе, так и синтетические аминокислоты. Хотя в большинстве случаев, когда белок необходимо получить рекомбинантно, используются только встречающиеся в природе аминокислоты.

В контексте данного документа «замена аминокислотного остатка» другим аминокислотным остатком в аминокислотной последовательности гетеродимерного белка или полипептида, как описано в данном документе (например, антитела), является эквивалентной «замещению аминокислотного остатка» другим аминокислотным остатком, и означает, что конкретный аминокислотный остаток в специфическом положении в исходной (например, дикого типа/зародышевой линии) аминокислотной последовательности был замещен (или заменен) отличным аминокислотным остатком. Это можно сделать, используя стандартные методы, доступные специалисту в данной области техники, например, с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Аминокислоты изменены по сравнению с нативной последовательностью (дикого типа/зародышевой линии), обнаруженной в природе у дикого типа (wt), но могут быть созданы в молекулах IgG, которые содержат другие изменения по сравнению с нативной последовательностью. Под «диким типом», или «WT», или «нативным», в данном документе подразумевается аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, которая обнаружена в природе, включая аллельные варианты. Белок, полипептид, антитело или иммуноглобулин WT имеют аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была специально модифицирована.

Антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с данным изобретением обладают одним или несколькими из следующих свойств:

a) специфически связываются с CD20 собачьих;

b) связываются с CD20 собачьих с KD, как измерено в примерах, и, например, как показано на фигурах;

c) демонстрируют уничтожение клеток, как, например, посредством CDC и/или ADCC, в линиях клеток лимфомы собачьих, экспрессирующих CD20, как измерено в примерах;

d) способствуют антителозависимому клеточному фагоцитозу (ADCP);

e) способны эффективно истощать CD20-положительные В-клетки в тканях собачьих;

f) способны связываться с клетками, экспрессирующими CD20 собачьих;

g) способны истощать клетки, экспрессирующие CD20 собачьих, предпочтительно путем прямого уничтожения клеток посредством апоптоза;

h) обеспечивают надлежащую стабильность, как показано в примерах;

i) связывают эпитоп, который содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO. 2), например, ITISHFFKMENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 302, аминокислоты №141-159в Seq ID NO. 2);

j) обладают более сильной связывающей способностью (в 5-10 раз выше) с CD20 собачьих, по сравнению с типичными антителами для тестирования 1Е4 и 4Е1-7, например, как показано в примерах;

k) обладают более сильной ADCC- и/или CDC-активностью, по сравнению с типичными антителами для тестирования 1Е4 и 4Е1-7, например, как показано в примерах и в таблице 4 и/или

l) более эффективны в уничтожении В-клеток в цельной крови собачьих, по сравнению с типичными антителами для тестирования, mAb 1Е4 и 4Е1-7, например, как показано в примерах.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с данным изобретением обладают одним или несколькими из вышеуказанных свойств и необязательно одним или несколькими из следующих свойств:

a) обладают CDC-активностью со значением ЕС50 менее 20 нМ;

b) обладают ADCC-активностью со значением ЕС50 менее 0,3 нМ;

c) характеризуются выходом транзиентной экспрессии более 100 мкг/мл;

d) имеют Tml, определенную согласно Uncle, выше 58°С;

e) обеспечивают уничтожение клеток in vivo у собаки в дозе от около 0,5 мг/кг до 2,5 мг/кг;

f) поддерживают истощение В-клеток in vivo у собаки на низком уровне в течение по меньшей мере 15 суток и/или

g) связывают эпитоп, который содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO. 2), например, ITISHFFKMENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 302, аминокислоты №141-159в Seq ID NO. 2).

Эти свойства можно определять с помощью способов, известных в данной области техники, как, например, способов, описанных в примерах, включая in vivo исследования в мышиных моделях или у собак.

В частности, авторы изобретения обнаружили, что антитела и их антигенсвязывающие части демонстрируют как CDC-, так и ADCC-активность, например, как продемонстрировано уничтожением клеток в линии клеток лимфомы собачьих, экспрессирующих CD20, как измерено в примерах.

В одном аспекте, данное изобретение относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связывают CD20 собачьих, причем указанное антитело содержит

a) последовательность CDR1 тяжелой цепи (НС), содержащую или состоящую из SEQ ID No. 27, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ней по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательностей,

b) последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 28, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ней по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательностей,

c) последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 29, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ней по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательностей,

d) последовательность CDR1 легкой цепи (LC), содержащую или состоящую из SEQ ID No. 30, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ней по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательностей,

e) последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 31, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ней по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательностей, и

f) последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 32, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ней по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% идентичность последовательностей.

Данное изобретение относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связывают CD20 собачьих, причем указанное антитело содержит

a) последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 27

b) последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 28

c) последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 29

d) последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 30,

e) последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 31, и

f) последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 32,

или выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части с CDR, как описано выше, но которые имеют одну или несколько CDR, которые имеют 1, 2, 3 или 4 аминокислотных замены по сравнению с последовательностью CDR, упомянутой выше.

Таким образом, данное изобретение относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связывают CD20 собачьих, причем указанное антитело содержит

a) последовательность CDR1 тяжелой цепи (НС), содержащую или состоящую из SEQ ID No. 27, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 27,

d) последовательность CDR1 легкой цепи (LC), содержащую или состоящую из SEQ ID No. 30, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID No. 30,

f) последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 32, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 32.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 7, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 8, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 9, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 10, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 11, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 12.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 17, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 18, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 19, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID No. 20, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 21, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 22.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую SEQ ID No. 37, последовательность CDR2 НС, содержащую SEQ ID No. 38, последовательность CDR3 НС, содержащую SEQ ID No. 39, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID No. 40, последовательность CDR2 LC, содержащую SEQ ID No. 41, и последовательность CDR3 LC, содержащую SEQ ID No. 42.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 47, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 48, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 49, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 50, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 51, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 52.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 82, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 83, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 84, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 85, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 86, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 87.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 92, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 93, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 94, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 95, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 96, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 97.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 102, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 103, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 104, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 105, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 106, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 107.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 112, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 113, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 114, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 115, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 116, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 117.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 122, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 123, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 124, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 125, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 126, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 127.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 132, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 133, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 134, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 135, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 136, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 137.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 142, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 143, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 144, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 145, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 146, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 147.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 152, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 153, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 154, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 155, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 156, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 157.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 162, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 163, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 164, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 165, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 166, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 167.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 172, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 173, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 174, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 175, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 176, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 177.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 182, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 183, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 184, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 185, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 186, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 187.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 192, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 193, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 194, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 195, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 196, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 197.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 202, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 203, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 204, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 205, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 206, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 207.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 212, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 213, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 214, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 215, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 216, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 217.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 222, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 223, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 224, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 225, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 226, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 227.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 232, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 233, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 234, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 235, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 236, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 237.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи (НС), содержащую SEQ ID NO. 24, или последовательность с по меньшей мере 75%, 80%, 85% или 90% идентичностью последовательностей с ней, и последовательность вариабельной области легкой цепи (LC), содержащую SEQ ID NO. 26, или последовательность с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательностей с ней. В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи (НС), содержащую SEQ ID NO. 24, и последовательность вариабельной области легкой цепи (LC), содержащую SEQ ID NO. 26, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 26, где последовательность NVT в FR1 вариабельной области LC была модифицирована, например, вариабельной области LC с 1, 2 или 3 аминокислотных модификациями в FR1, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую FR1, имеющую SEQ ID NO. 60, 61, 62, 63, 64 или 65, как описано выше, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 53, 54, 55, 56, 57 или 58.

a) последовательность вариабельной области НС, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 4, и последовательность вариабельной области LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 6;

b) последовательность вариабельной области НС, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 14, и последовательность вариабельной области LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 16;

c) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 34, и последовательность вариабельной области LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 36;

d) последовательность вариабельной области НС, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 44, и последовательность вариабельной области LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO. 46;

e) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 79, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 81, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 238;

f) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 89, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 91, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 239;

g) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 99, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 101, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 240;

h) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 109, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 111, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 241;

j) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 129, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 131, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 242;

k) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 139, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 141, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 243;

l) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 149, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 151, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 244;

m) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 159, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 161, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 245;

о) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 179, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 181, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 246;

р) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 189, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 191, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 247;

q) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 199, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 201, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 248;

r) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 209, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 211, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 249;

t) последовательность вариабельной области НС, содержащую SEQ ID NO. 229, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 231, или последовательность вариабельной области LC, где последовательность NVT, как описано ниже, была модифицирована, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO. 250.

В одном варианте реализации изобретения антигенсвязывающая часть представляет собой F(ab')2, Fab, Fv, scFv, тяжелую цепь, легкую цепь, вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) или вариабельный домен легкой цепи (V_L).

В другом варианте реализации изобретения антитело или антигенсвязывающая часть содержат последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 27, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 28, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 29, последовательность LCDR1, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 30, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 31, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 32. Антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 5 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74) и 1 аминокислотное изменение в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76).

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 7, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 8, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 9, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 10, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 11, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 12. Антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 2 аминокислотных изменения в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74) и 3 аминокислотных изменения в последовательности вариабельной области легкой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 76).

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 17, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 18, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 19, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID No. 20, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 21, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 22. Антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 10 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и не имеют аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76).

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую SEQ ID No. 37, последовательность CDR2 НС, содержащую SEQ ID No. 38, последовательность CDR3 НС, содержащую SEQ ID No. 39, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID No. 40, последовательность CDR2 LC, содержащую SEQ ID No. 41, и последовательность CDR3 LC, содержащую SEQ ID No. 42. Антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 12 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и не имеют аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76).

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть имеют последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 47, последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 48, последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 49, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 50, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 51, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 52. Антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 4 аминокислотных изменения в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и не имеют аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76).

В одном варианте реализации изобретения антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 1-10 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74). Например, антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74). В одном варианте реализации изобретения антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые имеют 1-10 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области легкой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 76). Например, антитело или антигенсвязывающая часть имеют каркасные области, которые могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений в последовательности вариабельной области легкой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 76).

Данное изобретение также относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связывает CD20 собачьих, причем указанное антитело содержит

a) последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 112, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2 или 3 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 112,

b) последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 113, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных различий по сравнению с SEQ ID No. 113,

c) последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 114, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2 или 3 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 114,

d) последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 115, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID No. 124,

e) последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 116, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 116, и

f) последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 117, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 или 2 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 117.

а) последовательность CDR1 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 122, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2 или 3 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 122,

b) последовательность CDR2 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 123, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2, 3 или 4 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 123,

c) последовательность CDR3 НС, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 124, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2, 3 или 4 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 124,

d) последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 125, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID No. 125,

e) последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 126, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1 аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID No. 126, и

1) последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID No. 127, или аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2 или 3 аминокислотных различия по сравнению с SEQ ID No. 127.

Аминокислотные изменения в контексте данного документа выбраны из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В одном варианте реализации изобретения аминокислотное изменение представляет собой аминокислотную замену.

В одном варианте реализации изобретения антитело представляет собой РМХ001, РМХ002, РМХ003, РМХ004, РМХ005, РМХ 006, РМХ 007, РМХ 008, РМХ 009, РМХ 010, РМХ 011, РМХ066, РМХ067, РМХ068, РМХ069, РМХ070, РМХ071, РМХ072, РМХ073, РМХ074, РМХ075, РМХ076, РМХ077, РМХ078, РМХ079, РМХ080, РМХ081, РМХ112, РМХ113, РМХ114, РМХ115, РМХ116, РМХ117, РМХ118, РМХ119, РМХ120, РМХ121, РМХ 122, РМХ 123 или РМХ 124, как показано в примерах и информации о последовательностях. В одном варианте реализации изобретения антитело выбрано из РМХ001, РМХ002, РМХ003, РМХ004, РМХ005, РМХ066, РМХ067, РМХ068, РМХ069, РМХ070, РМХ071, РМХ072, РМХ073, РМХ074, РМХ075, РМХ076, РМХ077, РМХ078, РМХ079, РМХ080 или РМХ081. В одном варианте реализации изобретения антитело выбрано из РМХ003, РМХ066, РМХ069, РМХ070, РМХ078 или РМХ081. В одном варианте реализации изобретения антитело выбрано из РМХ010, РМХ112, РМХ115, РМХ122 или РМХ 124. В одном варианте реализации изобретения антитело выбрано из РМХ069, РМХ070 или РМХ115.

Таким образом, в одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 4), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 5), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 6). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 2 аминокислотных изменения по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74) и 3 аминокислотных изменения в последовательности вариабельной области легкой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 76). Ниже представлены последовательности CDR: CDR1 (SEQ ID NO: 7), CDR2 (SEQ ID NO: 8) и CDR3 (SEQ ID NO: 9) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 11) и CDR3 (SEQ ID NO: 12) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 14), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 15), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 16). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 10 аминокислотных изменений по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76) аминокислотные изменения отсутствуют.CDR представляют собой следующее: CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) и CDR3 (SEQ ID NO: 19) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 21) и CDR3 (SEQ ID NO: 22) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 23), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 24), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 25), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 26). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 5 аминокислотных изменений по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74) и 1 аминокислотное изменение в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76). CDR представляют собой следующее: CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 28) и CDR3 (SEQ ID NO: 29) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 30), CDR2 (SEQ ID NO: 31) и CDR3 (SEQ ID NO: 32) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 33), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 34), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 35), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 36). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 12 аминокислотных изменений по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76) аминокислотные изменения отсутствуют.CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 38) и CDR3 (SEQ ID NO: 39) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 40), CDR2 (SEQ ID NO: 41) и CDR3 (SEQ ID NO: 42) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 43), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 44), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 45), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 46). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 4 аминокислотных изменения по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76) аминокислотные изменения отсутствуют.CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 47), CDR2 (SEQ ID NO: 48) и CDR3 (SEQ ID NO: 49) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 50), CDR2 (SEQ ID NO: 51) и CDR3 (SEQ ID NO: 52) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 78), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 79), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 80), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 81). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83) и CDR3 (SEQ ID NO: 84) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 85), CDR2 (SEQ ID NO: 86) и CDR3 (SEQ ID NO: 87) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 88), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 89), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 90), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 91). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 92), CDR2 (SEQ ID NO: 93) и CDR3 (SEQ ID NO: 94) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 95), CDR2 (SEQ ID NO: 96) и CDR3 (SEQ ID NO: 97) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 98), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 99), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 100), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 101). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 102), CDR2 (SEQ ID NO: 103) и CDR3 (SEQ ID NO: 104) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 105), CDR2 (SEQ ID NO: 106) и CDR3 (SEQ ID NO: 107) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 108), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 109), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 110), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 111). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 112), CDR2 (SEQ ID NO: 113) и CDR3 (SEQ ID NO: 114) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 115), CDR2 (SEQ ID NO: 116) и CDR3 (SEQ ID NO: 117) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 118), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 119), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 120), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 121). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) и CDR3 (SEQ ID NO: 124) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 125), CDR2 (SEQ ID NO: 126) и CDR3 (SEQ ID NO: 127) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 128), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 129), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 130), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 131). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 132), CDR2 (SEQ ID NO: 133) и CDR3 (SEQ ID NO: 134) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 135), CDR2 (SEQ ID NO: 136) и CDR3 (SEQ ID NO: 137) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 138), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 139), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 140), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 141). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 142), CDR2 (SEQ ID NO: 143) и CDR3 (SEQ ID NO: 144) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 145), CDR2 (SEQ ID NO: 146) и CDR3 (SEQ ID NO: 147) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 148), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 149), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 150), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 151). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 152), CDR2 (SEQ ID NO: 153) и CDR3 (SEQ ID NO: 154) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 155), CDR2 (SEQ ID NO: 156) и CDR3 (SEQ ID NO: 157) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 158), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 159), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 160), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 161). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 162), CDR2 (SEQ ID NO: 163) и CDR3 (SEQ ID NO: 164) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 165), CDR2 (SEQ ID NO: 166) и CDR3 (SEQ ID NO: 167) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 168), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 169), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 170), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 171). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 172), CDR2 (SEQ ID NO: 173) и CDR3 (SEQ ID NO: 174) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 175), CDR2 (SEQ ID NO: 176) и CDR3 (SEQ ID NO: 177) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 178), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 179), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 180), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 181). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 182), CDR2 (SEQ ID NO: 183) и CDR3 (SEQ ID NO: 184) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 185), CDR2 (SEQ ID NO: 186) и CDR3 (SEQ ID NO: 187) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 188), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 189), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 190), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 191). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 192), CDR2 (SEQ ID NO: 193) и CDR3 (SEQ ID NO: 194) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 195), CDR2 (SEQ ID NO: 196) и CDR3 (SEQ ID NO: 197) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 198), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 199), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 200), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 201). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 202), CDR2 (SEQ ID NO: 203) и CDR3 (SEQ ID NO: 204) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 205), CDR2 (SEQ ID NO: 206) и CDR3 (SEQ ID NO: 207) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 208), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 209), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 210), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 211). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 212), CDR2 (SEQ ID NO: 213) и CDR3 (SEQ ID NO: 214) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 215), CDR2 (SEQ ID NO: 216) и CDR3 (SEQ ID NO: 217) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 218), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 219), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 220), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 221). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 222), CDR2 (SEQ ID NO: 223) и CDR3 (SEQ ID NO: 224) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 225), CDR2 (SEQ ID NO: 226) и CDR3 (SEQ ID NO: 227) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 228), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 229), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 230), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 231). CDR представляют собой CDR1 (SEQ ID NO: 232), CDR2 (SEQ ID NO: 233) и CDR3 (SEQ ID NO: 234) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 235), CDR2 (SEQ ID NO: 236) и CDR3 (SEQ ID NO: 237) вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть содержат Fc-область, например, Fc-область собачьих, например, Fc-область IgGB собачьих.

Описанные в данном документе последовательности вариабельной области, включая без ограничения аминокислотные и нуклеотидные последовательности, показанные в таблице 2 (и/или их фрагменты), можно использовать в комбинации с одной или несколькими аминокислотными последовательностями и/или нуклеотидными последовательностями, кодирующими одну или несколько константных цепей (и/или их фрагмент) молекулы антитела. К примеру, аминокислотные последовательности вариабельной области, показанные в таблице 2, могут быть соединены с константными областями любой молекулы антитела того же вида, от которого была получена аминокислотная последовательность вариабельной области, или отличающегося вида (например, человека, козы, крысы, овцы, курицы). Предпочтительно аминокислотные последовательности вариабельной области, показанные в таблице 2, соединяют с константными областями антитела собачьих, и они могут представлять собой константную область из любого из IgG А, В, С или D собачьих. В одном варианте реализации изобретения константная область представляет собой константную область IgG В собачьих. Можно использовать константные области IGGB собаки (SEQ ID NO: 66), IGK собаки (SEQ ID NO: 73) или IGLC5 собаки (SEQ ID NO: 67).

Также в объем данного изобретения входят варианты антител и антигенсвязывающих частей, как описано выше.

Вариант антитела или его антигенсвязывающей части, как описано в данном документе, имеет по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательностей с молекулой, не являющейся вариантом. В одном варианте реализации изобретения идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 95%. В одном варианте реализации изобретения модификация представляет собой консервативную модификацию последовательности.

Подразумевается, что в контексте данного документа термин «консервативные модификации последовательности» относится к аминокислотным модификациям, которые значимо не влияют или не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело или его антигенсвязывающую часть по данному изобретению с помощью стандартных методик, известных в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком с подобной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков с подобными боковыми цепями были определены в данной области техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в пределах областей CDR антитела по данному изобретению можно замещать другими аминокислотными остатками из семейства с аналогичной боковой цепью, и измененное антитело можно тестировать в отношении сохраненной функции (т.е. связывания CD20) с использованием функциональных анализов, описанных в данном документе.

Таким образом, эти аминокислотные изменения, как правило, можно выполнять без изменения биологической активности, функции или другого требуемого свойства полипептида, такого как его аффинность или его специфичность в отношении антигена. В целом, единичные аминокислотные замены в несущественных областях полипептида практически не изменяют биологическую активность. Кроме того, замены аминокислот, сходных по структуре или функциям, с меньшей вероятностью нарушат биологическую активность полипептидов. Сокращения для аминокислотных остатков, которые составляют полипептиды и пептиды, описанные в данном документе, и консервативные замены для этих аминокислотных остатков показаны в таблице 1 ниже.

В некоторых вариантах реализации данное изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, которые являются вариантом антитела или его антигенсвязывающей части по сравнению с последовательностью, описанной в данном документе, например, выбранной из SEQ ID NO. 3-65 или SEQ ID NO. 78-237, который содержит одну или несколько модификаций последовательности и имеет улучшения в отношении одного или нескольких свойств, таких как аффинность связывания, специфичность, термостабильность, уровень экспрессии, эффекторная функция, гликозилирование, сниженная иммуногенность или растворимость, по сравнению с немодифицированным антителом или его фрагментом.

Подходящие способы определения свойств, которые могут указывать на то, что антитело может быть успешно разработано в масштабе, включают первую очистку с использованием хроматографии, такой как аффинная хроматография (белок A: MabSelect Sure LX), анионообменная хроматография (Capto Q), катионообменная хроматография (Capto S) и замена буфера (G-25 Fine), с последующей оценкой того, остается ли антитело интактным (например, с использованием SDS-PAGE-анализа для определения молекулярной массы, HPLC-SEC для расчета % мономеров, оценки агрегации и исследований термостабильности (Tm)).

Например, можно удалить консенсусную последовательность аспарагин-связанного гликозилирования белков. Каркасная область 1 (FR1) легкой цепи РМХ003 (SEQ ID NO: 26) содержит сиквон NVT, который является консенсусной последовательностью аспарагин-связанного гликозилирования белков. Для удаления гликанов, связанных с этим сайтом, сиквон NVT в FR1 mAb РМХ003 подвергали мутации с превращением в QVT для mAb РМХ006, AVT для mAb РМХ007, EVT для mAb РМХ008, NVA для mAb РМХ009, SVT для mAb РМХ010 и TVT для mAb РМХ011. Такие модификации входят в объем данного изобретения.

Образующиеся в результате аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи mAb РМХ006 (SEQ ID NO: 53), mAb PMX007 (SEQ ID NO: 54), mAb PMX008 (SEQ ID NO: 55), mAb PMX009 (SEQ ID NO: 56), mAb PMX010 (SEQ ID NO: 57), mAb PMX011 (SEQ ID NO: 58) и последовательности FR1 PMX003 (SEQ ID NO: 59), mAb PMX006 (SEQ ID NO: 60), mAb PMX007 (SEQ ID NO: 61), mAb PMX008 (SEQ ID NO: 62), mAb PMX009 (SEQ ID NO: 63), mAb PMX010 (SEQ ID NO: 64), mAb PMX011 (SEQ ID NO: 65) входят в объем данного изобретения и приведены в таблице 2 под названием Последовательности. Их можно использовать с тяжелой цепью РМХ003 вместо SEQ ID NO: 26. Последовательность FR1 LC для РМХ003 показана в SEQ ID NO. 59, модифицированные последовательности FR1 LC представлены в SEQ ID No. 60, 61, 62, 63, 64 и 65.

Сиквон NVT находится в положении остатков 11-13 FR1 легкой цепи РМХ001-РМХ005 (SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:46) и PMX066-PMX0081 (SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:91, SEQ ID N0:101, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:171, SEQ IDNO:181, SEQ ID NO:191, SEQ ID N0:201, SEQ ID NO:211, SEQ IDNO:221, SEQ ID NO:231). Сиквон NVT, находящийся в положении остатков 11-13 FR1 легкой цепи РМХ001-РМХ005 или РМХ066-РМХ081, можно подвергать мутации с изменением на последовательность, выбранную из: QVT, AVT, EVT, NVA, SVT, TVT. В одном варианте реализации изобретения сиквон NVT, находящийся в положении остатков 11-13 FR1 легкой цепи РМХ001-РМХ005 или РМХ066-РМХ081, подвергают мутации с изменением на SVT.

Каркасная область 1 (FR1) легкой цепи РМХ066 (SEQ Ш NO: 81), РМХ067 (SEQ ID NO:91), PMX068(SEQIDNO: 101), PMX069 (SEQ ID NO: 111), PMX071 (SEQ ID NO: 131), PMX072 (SEQ ID NO: 141), PMX073 (SEQ ID NO: 151), PMX074 (SEQ ID NO: 161), PMX076 (SEQ ID NO: 181), PMX077 (SEQ ID NO: 191), PMX078 (SEQ ID NO: 201), PMX079 (SEQ ID NO: 211), PMX081 (SEQ ID NO: 231) содержит сиквон NVT, который является консенсусной последовательностью аспарагин-связанного гликозилирования белков. Для удаления гликанов, связанных с этим сайтом, сиквоны NVT в FR1 mAb РМХ066, РМХ067, РМХ068, РМХ069, РМХ071, РМХ072, РМХ073, РМХ074, РМХ076, РМХ077, РМХ078, РМХ079 и РМХ081 подвергали мутации с изменением на SVT для получения РМХ112 (SEQ ID NO: 238), РМХ113 (SEQ ID NO: 239), PMX114 (SEQ ID NO: 240), PMX115 (SEQ ID NO: 241), PMX116 (SEQ ID NO: 242), PMX117 (SEQ ID NO: 243), PMX118 (SEQ ID NO: 244), PMX119 (SEQ ID NO: 245), PMX120 (SEQ ID NO: 246), PMX121 (SEQ ID NO: 247), PMX122 (SEQ ID NO: 248), PMX123 (SEQ ID NO: 249) и PMX124 (SEQ ID NO: 250) соответственно. Такие модификации входят в объем данного изобретения, при этом образующуюся легкую цепь можно использовать с их соответствующей тяжелой цепью, например, можно использовать НС РМХ066 (SEQ ID NO: 79) с модифицированной LC (SEQ ID NO: 238), и так далее.

Образующиеся в результате аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи РМХ112 mAb (SEQ ID NO: 238), PMX113 mAb (SEQ ID NO: 239), PMX114 mAb (SEQ ID NO: 240), PMX115 mAb (SEQ ID NO: 241), PMX116 mAb (SEQ ID NO: 242), PMX117 mAb (SEQ ID NO: 243), PMX118 mAb (SEQ ID NO: 244), PMX119 mAb (SEQ ID NO: 245), PMX120 mAb (SEQ ID NO: 246), PMX121 mAb (SEQ ID NO: 247), PMX122 mAb (SEQ ID NO: 248), PMX123 mAb (SEQ ID NO: 249) и PMX124 mAb (SEQ ID NO: 250) входят в объем данного изобретения и приведены в таблице под названием Последовательности.

Специалисту в данной области техники будет известно, что существуют разные способы идентификации, получения и оптимизации антигенсвязывающих молекул, как описано в данном документе, включая экспрессионные библиотеки in vitro и in vivo. Это дополнительно описано в примерах. Можно использовать известные в данной области техники методики, такие как дисплей (например, рибосомальный и/или фаговый дисплей) и/или мутагенез (например, мутагенез с внесением ошибок). Данное изобретение, следовательно, также включает оптимизированные по последовательности варианты антител, описанных в данном документе.

В одном варианте реализации изобретения модификации можно выполнять для снижения иммуногенности антитела. Например, один из подходов заключается в возврате одного или нескольких остатков каркасной области к соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подвергалось соматической мутации, может содержать остатки каркасной области, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой происходит антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых происходит антитело. В одном варианте реализации изобретения все каркасные последовательности являются последовательностями зародышевой линии.

Чтобы вернуть один или несколько аминокислотных остатков в последовательности каркасной области в их конфигурацию зародышевой линии, соматические мутации можно подвергать «обратной мутации» к последовательности зародышевой линии, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза.

Другой тип модификации каркасной области включает мутирование одного или нескольких остатков в пределах каркасной области, или даже в пределах одной или нескольких областей CDR, с целью удаления Т-клеточных эпитопов, чтобы тем самым снизить возможную иммуногенность антитела.

В некоторых вариантах реализации изобретения антигенсвязывающие белки, их фрагменты и производные, и слитые белки по данному изобретению подвергаются посттрансляционным модификациям, например, без ограничения глутамин может быть циклизован или превращен в пироглутаминовую кислоту; дополнительно, или в качестве альтернативы, аминокислоты могут подвергаться дезамидированию, изомеризации, гликированию и/или окислению. Полипептиды по данному изобретению могут подвергаться дополнительной посттрансляционной модификации, включая гликозилирование, например, N-сцепленное или О-сцепленное гликозилирование, по сайтам, которые хорошо известны в данной области техники. Изменения можно выполнять в аминокислотной последовательности полипептида, чтобы предотвратить или свести к минимуму такие изменения или содействовать им в случаях, когда такой процессинг полезен. Полипептиды по данному изобретению включают полипептиды, которые были модифицированы, например, для следующего: (1) снижение чувствительности к протеолизу, (2) снижение чувствительности к окислению, (3) изменение аффинности связывания для образования белковых комплексов, (4) изменение показателей аффинности связывания и (4) придание или модификация других физико-химических или функциональных свойств.

Таким образом, в еще одном варианте реализации изобретения модифицируют гликозилирование. Например, можно получать агликозилированное антитело (т.е. антитело, которое не подвергается гликозилированию). В одном варианте реализации изобретения аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи агликозилированного антитела содержат SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250. Последовательности FR1 представлены как SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64 или SEQ ID NO: 65.

Гликозилирование также можно изменять, например, с целью повышения аффинности антитела к антигену. Такие модификации углеводами можно осуществлять, например, путем изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, можно выполнять одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или нескольких сайтов гликозилирования в каркасной последовательности вариабельной области, с целью устранения, тем самым, гликозилирования по этому сайту. Такое агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену.

В некоторых вариантах применения связывающие средства могут связывать CD20 собачьих, но имеют измененную способность связывать Fc-рецепторы по сравнению со стандартными связывающими средствами. В одном примере связывающие средства представляют собой антитела, которые имеют модифицированные паттерны гликозилирования. Молекулы IgG, например, как правило, содержат N-сцепленные олигосахариды, например, фукозу.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть являются а-фукозилированными. В иммунотерапии рака действие антител может основываться на Fc-опосредованной иммунной эффекторной функции, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), в качестве основного способа действия для истощения опухолевых клеток. Хорошо известно, что эта эффекторная функция модулируется N-сцепленным гликозилированием в Fc-области антитела. В частности, было показано, что отсутствие коровой фукозы на N-гликане Fc повышает аффинность связывания Fc IgG1 в отношении FcγRIIIa, присутствующего на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, и приводит к усиленной ADCC-активности. Следовательно, а-фукозилированные антитела могут иметь преимущество в улучшении терапевтической эффективности, и отсутствие/удаление фукозы усиливает способность антитела взаимодействовать с Fc-рецепторами. Антитела этого типа могут называться «а-фукозилированными». Такие антитела можно получать с использованием методик, описанных в данном документе, и/или они могут быть известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, может экспрессироваться в линии клеток, которая имеет модифицированные способности в отношении гликозилирования (например, удаленная, модифицированная фукозилтрансфераза или меньшее ее количество) и не может присоединять типичные остатки фукозы.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть обладают CDC-активностью со значением ЕС50 в диапазоне 0,9-4,5 мкг/мл (6-30 нМ), например, менее 20 нМ.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть обладают ADCC-активностью со значением ЕС50 менее 0,3 нМ, например, 0,013 мкг/мл (0,09 нМ).

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с данным изобретением обладают одним или несколькими из следующих свойств:

d) имеют Tm1, определенную согласно Uncle, выше 58°С и/или

e) обеспечивают уничтожение клеток in vivo у собаки в дозе от около 0,5 мг/кг до 2,5 мг/кг

g) связывают эпитоп, который содержит один или несколько аминокислотных остатков, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10, из следующих аминокислотных остатков, или состоит из следующих аминокислотных остатков: ENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO: 2), например, ITISHFFKMENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 302, аминокислоты №141-159 в Seq ID NO: 2).

ADCC- и CDC-активность можно измерять, как описано в примерах.

В одном варианте реализации изобретения антитело и его антигенсвязывающая часть демонстрируют как CDC-, так и ADCC-активность, например, как продемонстрировано уничтожением клеток в линии клеток лимфомы собачьих, экспрессирующих CD20, как измерено в примерах.

В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть обладают одним или несколькими из свойств, как изложено выше, и имеют CDR НС и CDR LC и/или CDR НС и LC РМХ069, РМХ115 или РМХ070. В одном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть выбраны из РМХ069, РМХ115 или РМХ070.

В одном варианте реализации изобретения антитело представляет собой антитело, описанное в таблице 4, или его антигенсвязывающую часть, и имеет значение ЕС50 для ADCC или CDC, как показано в этой таблице. Значения ЕС50 можно измерять, как описано в примерах.

В одном варианте реализации изобретения Fc-часть антитела может быть модифицированной.

В одном варианте реализации изобретения одна или несколько замен в варианте находятся в области CDR1, 2 и/или 3. Например, в области CDR1, 2 и/или 3 могут находиться 1, 2, 3, 4, 5 или больше аминокислотных замен. В другом примере, могут иметь место 1 или 2 аминокислотные делеции.

В одном варианте реализации изобретения в каркасной области находятся одна или несколько замен. Например, в каркасной области вариабельной области НС и/или вариабельной области LC могут находиться 1-20, например, 1-10, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен.

Антитела по данному изобретению предпочтительно имеют значения KD, IC50 и/или ЕС50, например, KD, как дополнительно описано в данном документе в примерах. Соответственно, значение KD является достаточным для того, чтобы антитела оказывали требуемый биологический эффект.Например, KD может составлять от по меньшей мере около 10 пМ до 100 мкМ, от около 100 пМ до 10 нМ или выше. Значение ЕС50 может быть таким, как представлено в таблице 4, например, от 0,12 до 0,89 нМ. Значения KD, IC50 и/или ЕС50 можно измерять, как описано в примерах.

Термин «KD» относится к «равновесной константе диссоциации» и относится к значению, полученному при титровании в равновесном состоянии или путем деления константы скорости диссоциации (Koff) на константу скорости ассоциации (Kon). «KA» относится к константе аффинности. Константу скорости ассоциации, константу скорости ассоциации и равновесную константу диссоциации используют для представления аффинности связывания антитела с антигеном. Способы определения констант скорости ассоциации и диссоциации хорошо известны в данной области техники. Использование методик, основанных на флуоресценции, обеспечивает высокую чувствительность и возможность исследовать образцы в физиологических буферах в равновесном состоянии. Можно использовать другие экспериментальные подходы и инструменты, такие как анализ BIAcore® SPR. Данное изобретение также относится к выделенному антителу собачьих или его антигенсвязывающей части, которые связываются с CD20 собачьих, конкурирующим с антителом или его антигенсвязывающей частью, как описано выше. Антитела, фрагменты антител или миметики антител, которые связываются с тем же или рядом с тем же эпитопом или перекрывающимся эпитопом на CD20 собачьих, что и любое из антител к CD20 по данному изобретению, обладают способностью к перекрестному конкурированию за связывание с CD20 с любым из антител по данному изобретению. Антитела по данному изобретению, таким образом, можно использовать в качестве эталонного антитела для оценки такой перекрестной реактивности. Такие перекрестно конкурирующие антитела можно идентифицировать на основе их способности перекрестно конкурировать с антителом, описанным в данном документе, в стандартных анализах на основе связывания CD20. Например, для демонстрации перекрестной конкуренции с антителами можно использовать анализ BIAcore®, ELISA-анализы или проточную цитометрию.

Последовательности нуклеиновых кислот, векторы и клетки-хозяева

Данное изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность антитела или его антигенсвязывающей части, как описано в данном документе, например, вариабельной области НС или вариабельной области LC. Иллюстративные последовательности описаны в таблице 2. В одном варианте реализации изобретения указанная нуклеиновая кислота выбрана из SEQ ID NO. 3, 5, 13, 15, 23, 25, 33, 35, 43, 45, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118, 120, 128, 130, 138, 140, 148, 150, 158, 160, 168, 170, 178, 180, 188, 190, 198, 200, 208, 210, 218, 220, 228, 230, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270,271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 или 301, или нуклеиновой кислоты, имеющей с ней по меньшей мере 75%, 80% или 90% гомологии последовательностей. В одном варианте реализации изобретения указанная последовательность нуклеиновой кислоты связана линкером со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. В одном варианте реализации изобретения указанная вторая нуклеиновая кислота кодирует дополнительный терапевтический компонент.В одном варианте реализации изобретения указанный линкер представляет собой линкер из нуклеиновой кислоты. Иллюстративная нуклеиновая кислота показана ниже. Однако специалисту в данной области техники будет понятно, что ввиду вырожденности генетического кода предполагаются и другие последовательности.

Кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности также находятся в пределах объема данного изобретения, включая SEQ ID NO. 68 и 69.

Нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может содержать ДНК или РНК и могут быть полностью или частично синтетическими или полученными рекомбинантным путем. Упоминание нуклеотидной последовательности, изложенной в данном документе, охватывает молекулу ДНК с указанной последовательностью, и охватывает молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой U заменена на Т, если контекст не требует иного.

Кроме того, данное изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как определено выше. Конструкция может быть в форме плазмиды, вектора, кассеты транскрипции или экспрессии.

Данное изобретение также относится к вектору, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CD20-связывающие молекулы, как описано в данном документе. Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекуле ДНК, происходящей, например, из плазмиды, бактериофага или вируса, в которую может быть вставлена или клонирована последовательность нуклеиновой кислоты. Вектор предпочтительно содержит один или несколько уникальных сайтов рестрикции и может быть способным к автономной репликации в определенной клетке-хозяине, включая целевую клетку или ткань или прогениторную клетку или включающую ее ткань, или может интегрироваться в геном определенного хозяина, так что клонированная последовательность является воспроизводимой. Соответственно, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный элемент, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, линейную или замкнутую кольцевую плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства, обеспечивающие саморепликацию. В альтернативном варианте, вектор может быть таким, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(хромосомами), в которую(которые) он был интегрирован. Векторная система может содержать один вектор или плазмиду, два или более векторов или плазмид, которые содержат общую ДНК, подлежащую введению в геном клетки-хозяина, или транспозон. Выбор вектора, как правило, будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую этот вектор должен быть введен. Вектор также может включать селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотикам, который можно использовать для селекции подходящих трансформантов. Примеры таких генов устойчивости хорошо известны специалистам в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), как, например, таковые, описанные в WO 2021176362.

В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота может также содержать лидерную последовательность. В другой варианте реализации изобретения она не содержит лидерную последовательность. Можно использовать любые подходящие лидерные последовательности, включая лидерную последовательность нативного иммуноглобулина зародышевой линии, такую как SEQ ID NO: 71 для тяжелой цепи, SEQ ID NO: 72 для легкой цепи РМХ001-РМХ005 и РМХ066-РМХ081 mAb, или другие, такие как лидерная последовательность Campath (SEQ ID NO: 70) (см. US 8,362,208 B2), которые могут быть выбраны для усиления экспрессии белка.

В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота может также содержать сигнальный пептид, т.е. короткую аминокислотную последовательность (13-36 аминокислот) на N-конце секреторного белка (такого как иммуноглобулин), которая опосредует транслокацию белка, предназначенного для секреции через первую мембрану секреторного пути. Эта последовательность отсутствует в зрелом белке, отщепляясь в рамках котрансляционного события, при этом она опосредует секрецию и правильную экспрессию белка. Подходящие сигнальные последовательности можно использовать для оптимизации экспрессии рекомбинантного белка.

Данное изобретение также относится к выделенной рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновой кислоты, как описано выше. Клетки-хозяева, пригодные в данном изобретении, представляют собой клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, и включают без ограничения микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, векторами экспрессии на основе плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие антитело последовательности; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами для экспрессии в дрожжевых клетках, содержащими кодирующие антитело последовательности; системы на основе клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными векторами экспрессии на основе вирусов (например, Baculovirus), содержащими кодирующие антитело последовательности; системы на основе клеток растений, инфицированных рекомбинантными векторами экспрессии на основе вирусов (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV), или трансформированных рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Ti-плазмидой), содержащими кодирующие антитело последовательности; или системы на основе клеток млекопитающих (например, клеток COS, СНО, BHK, 293, 3Т3), несущих рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор гена металлотионеина), или вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор гена 7.5К вируса осповакцины).

Прокариоты, пригодные в качестве клеток-хозяев согласно данному изобретению, включают грамотрицательные или грамположительные организмы, такие как Е. coli, В. subtilis, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia и Shigella, а также Bacilli, Pseudomonas и Streptomyces. Одним из хозяев для клонирования является Е. coli 294 (АТСС 31446), хотя подходящими являются и другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli Х1776 (АТСС 31537) и Е. coli W3110 (АТСС 27325). В одном варианте реализации изобретения представлен способ получения антитела к CD20, как описано в данном документе, причем способ включает культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего антитело, и выделение антитела.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, можно использовать для введения антитела индивидууму с целью получения кодируемого ими белка in vivo и опосредования терапевтического эффекта. Доставка полинуклеотидов в организм субъекта может быть прямой, так что полинуклеотиды или векторы экспрессии вводятся индивидууму, например, путем введения мРНК или ДНК непосредственно в клетки, например, мышечные клетки. Также предусматривается непрямое введение, при котором до введения клетки трансформируют полинуклеотидами in vitro. Векторы на основе вирусов, таких как дефектные или аттенуированные вирусы, также можно использовать.

В одном варианте реализации изобретения представлен способ получения антитела к CD20, как описано в данном документе, причем способ включает культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего антитело, и выделение антитела.

Данное изобретение также относится к гетерологичному анализу или системе экспрессии, содержащей CD20 собачьих и линию клеток, происходящих из отличающегося вида, например, линию клеток человека, такую как НЕК.

Анализ включает приведение CD20 собачьих в контакт с линией клеток, происходящих из отличающегося вида, например, линией клеток отличающегося млекопитающего, например, линией клеток грызуна или линией клеток человека, такой как НЕК. Например, линию клеток трансфицируют CD20 собачьих, так что она экспрессирует CD20 собачьих, стабильно или транзиентно.

Иммуноконъюгаты и другие связывающие средства

Данное изобретение относится к иммуноконъюгатам и другим связывающим средствам, содержащим антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с данным изобретением. Например, антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с данным изобретением могут быть конъюгированы с терапевтическим компонентом или нетерапевтическим компонентом.

В одном варианте реализации изобретения терапевтический компонент представляет собой связывающую молекулу, которая связывается с целевым представляющим интерес антигеном, например, выбранную из антитела или фрагмента антитела (например, Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) или однодоменное антитело, например, V_H- или Унн-домен) или белок-миметик антитела.

В одном варианте реализации изобретения белки или полипептиды, которые содержат антитело или его антигенсвязывающую часть, которые связываются с CD20, как описано в данном документе, и второй компонент, представляют собой слитые белки. В одном варианте реализации изобретения белки или полипептиды, которые содержат антитело или его антигенсвязывающую часть, которые связываются с CD20, как описано в данном документе, и второй компонент, представляют собой конъюгаты с лекарственным средством.

В контексте данного документа «конъюгат» относится к композиции, содержащей антитело, которое связывается с CD20, как описано в данном документе, которое связано/конъюгировано с лекарственным средством.

Такие конъюгаты включают «конъюгаты с лекарственным средством», которые содержат антитело, которое связывается с CD20, с которым ковалентно связано лекарственное средство, и «нековалентно связанные конъюгаты с лекарственным средством», которые содержат антитело, которое связывается с CD20, с которым нековалентно связано лекарственное средство.

В контексте данного документа «конъюгат с лекарственным средством» относится к композиции, содержащей антитело, с которым ковалентно связано лекарственное средство. Лекарственное средство может быть ковалентно связано с фрагментом антитела прямо или опосредованно через подходящий линкерный компонент.Лекарственное средство может быть связано с антителом в любом подходящем положении, как, например, на амино-конце, карбоксильном конце или через подходящие боковые цепи аминокислот.

В одном варианте реализации изобретения антитело связано со вторым компонентом с помощью пептидного линкера или другого подходящего линкера для соединения двух компонентов.

Термин «пептидный линкер» относится к пептиду, содержащему одну или несколько аминокислот. Пептидный линкер содержит 1-50, например, 1-20 аминокислот.Пептидные линкеры известны в данной области техники, и их неограничивающие примеры описаны в данном документе. Подходящие неиммуногенные линкерные пептиды представляют собой, например, линкеры, которые включают G- и/или S-остатки, пептидные линкеры (G4S)n, (SG4)n или G4(SG4)n, причем «n» обычно является числом от 1 до 10, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.

Связывающее средство может быть полиспецифическим, например, биспецифическим.

В одном варианте реализации изобретения связывающая молекула является биспецифической. Таким образом, в одном аспекте данное изобретение относится к биспецифической молекуле, содержащей антитело, описанное в данном документе, соединенное со вторым компонентом, имеющим специфичность, отличающуюся от таковой указанного антитела. Таким образом, второе антитело связывается с отличающимся целевым антигеном, например, представляющей интерес мишенью.

В одном варианте реализации изобретения связывающая молекула, например, белок или конструкция, является полиспецифической и содержит дополнительный, т.е. третий, четвертый и т.д. компонент.

Терапевтический компонент также может быть выбран из компонента, увеличивающего период полувыведения, цитотоксина или радиоизотопа.

Нетерапевтический компонент может быть выбран из метки, липосомы или наночастицы. Метка является выявляемой или функциональной. Метка может представлять собой любую молекулу, которая генерирует или может быть индуцирована для генерации сигнала, включая без ограничения флуорофоры, флуоресцирующие вещества, радиоактивные метки, ферменты, хемилюминесцентные вещества, активную в отношении ядерно-магнитного резонанса метку или фотосенсибилизаторы. Таким образом, связывание можно выявлять и/или измерять путем выявления флуоресценции или люминесценции, радиоактивности, ферментативной активности или светопоглощения.

В соответствии с данным изобретением антитела и антигенсвязывающая часть, которые связаны с одним компонентом, могут дополнительно быть связаны с другим компонентом. Например, они могут быть связаны с терапевтическим компонентом, и дополнительная связь с нетерапевтическим компонентом может обеспечиваться посредством либо антитела, либо компонента.

В одном варианте реализации изобретения связывающее средство или антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с данным изобретением могут содержать компонент, увеличивающий период полувыведения. Он может быть выбран из антитела или его антигенсвязывающей части, которые связывают сывороточный альбумин собачьих. В альтернативном варианте, увеличенный период полувыведения может обеспечиваться за счет пегилирования.

Используемый термин «период полувыведения» обычно может относиться к времени, необходимому для снижения концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида в сыворотке крови на 50%, in vivo, например, вследствие деградации последовательности или соединения и/или клиренса или секвестрации последовательности или соединения естественными механизмами. Период полувыведения аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по данному изобретению in vivo можно определять любым известным способом per se, как, например, с помощью фармакокинетического анализа. Подходящие методики будут известны специалисту в данной области техники. Период полувыведения может быть выражен с использованием таких параметров, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под кривой (AUC). Параметры периода полувыведения (t-альфа и t-бета) и AUC можно определять из кривой зависимости концентрации конъюгата или слитой молекулы в сыворотке крови от времени. Таким образом, термин «период полувыведения» в контексте данного документа, в частности, относится к t1/2-бета или периоду полувыведения в конечной фазе (при котором t1/2-альфа и/или AUC или оба могут не учитываться).

Например, в первой фазе (альфа-фазе) композиция лекарственного средства (например, конъюгат с лекарственным средством, нековалентно связанный конъюгат с лекарственным средством, лекарственное средство на основе слитых молекул) в основном распределяется у пациента с некоторой элиминацией. Вторая фаза (бета-фаза) является конечной фазой, в которой композиция лекарственного средства (например, конъюгат с лекарственным средством, нековалентно связанный конъюгат с лекарственным средством, лекарственное средство на основе слитых молекул) подверглась распределению и ее концентрация в сыворотке крови снижается по мере того, как композиция лекарственного средства выводится из организма пациента. Период полувыведения t-альфа является периодом полувыведения в первой фазе, а период полувыведения t-бета является периодом полувыведения во второй фазе.

Фармацевтическая композиция

В другом аспекте представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент, как описано в данном документе, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтическая композиция» в контексте данного документа относится к композиции, которую используют для лечения животного-компаньона, то есть для ветеринарного применения, т.е. ветеринарной композиции. В предпочтительных вариантах реализации изобретения подлежащим лечению животным является собака.

Фармацевтическая композиция необязательно может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Антитела, белок или конструкцию или фармацевтическую композицию можно вводить любым подходящим путем, включая без ограничения пероральное, местное, парентеральное, сублингвальное, ректальное, вагинальное, глазное, интраназальное, легочное, внутрикожное, интравитреальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное, интрацеребральное, трансдермальное, трансмукозальное введение, введение путем ингаляции, или местное введение, в частности, в уши, нос, глаза или нанесение на кожу, или путем ингаляции.

Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интраназальное, ректальное, интравезикальное, внутрикожное, местное или подкожное введение. Предпочтительно композиции вводят парентерально.

Фармацевтически приемлемый носитель или основа могут быть в виде частиц, так что композиции находятся, например, в форме таблеток или порошка. Термин «носитель» относится к разбавителю, вспомогательному веществу или эксципиенту, с которым вводят конъюгат лекарственного средства и антитела по данному изобретению. Такими фармацевтическими носителями могут быть жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Носители могут представлять собой физиологический раствор, гуммиарабик, желатин, крахмальную пасту, тальк, кератин, коллоидный диоксид кремния, мочевину и тому подобное. Кроме того, можно использовать вспомогательные, стабилизирующие, загущающие, смазывающие и красящие средства. В одном варианте реализации изобретения, при введении животному, антитело по данному изобретению или композиции и фармацевтически приемлемые носители являются стерильными. Вода является предпочтительным носителем, если конъюгаты лекарственного средства и антитела по данному изобретению вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические носители также включают в себя эксципиенты, такие как крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерола, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и тому подобное. Композиции по данному изобретению, при необходимости, могут также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих средств, или средств, поддерживающих рН в определенном диапазоне.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может находиться в форме жидкости, например, раствора, эмульсии или суспензии. Жидкость может быть пригодной для доставки путем инъекции, инфузии (например, IV инфузии) или подкожно. Если предполагается пероральное введение, композиция предпочтительно находится в твердой или жидкой форме, где полутвердые, полужидкие, суспензионные и гелевые формы включены в формы, рассматриваемые в данном документе как твердые или жидкие.

Как твердая композиция для перорального введения, композиция может быть составлена в виде порошка, гранулы, прессованной таблетки, пилюли, капсулы, жевательной резинки, капсулы-имплантата или подобной формы. Такая твердая композиция, как правило, содержит один или несколько инертных разбавителей. Кроме того, может присутствовать одно или несколько из следующего: связующие, такие как карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза или желатин; эксципиенты, такие как крахмал, лактоза или декстрины, средства для улучшения распадаемости таблеток, такие как альгиновая кислота, альгинат натрия, кукурузный крахмал и т.д.; смазывающие средства, такие как стеарат магния; средства, способствующие скольжению, такие как коллоидный диоксид кремния; подсластители, такие как сахароза или сахарин; вкусоароматическая добавка, такая как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновая вкусоароматическая добавка; и краситель. Если композиция находится в форме капсулы (например, желатиновой капсулы), она может содержать, помимо веществ вышеупомянутого типа, жидкий носитель, такой как полиэтиленгликоль, циклодекстрин или жирная кислота.

Композиция может находиться в форме жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. Жидкость может быть пригодной для перорального введения или для доставки путем инъекции. Если предполагается пероральное введение, композиция может содержать одно или несколько из подсластителя, консервантов, красящего вещества/красителя и вкусовой добавки. В композицию для введения путем инъекции также может быть включено одно или несколько из поверхностно-активного вещества, консерванта, смачивающего средства, диспергирующего средства, суспендирующего средства, буфера, стабилизатора и изотонического средства.

Композиции могут иметь форму одной или нескольких дозированных единиц. В конкретных вариантах реализации изобретения желательным может быть введение композиции местно на участок, который нужно вылечить, или внутривенная инъекция или инфузия.

Способы лечения заболевания

Данное изобретение дополнительно распространяется на способы лечения заболевания, введения фармацевтической композиции или состава, описанных в данном документе, или антитела или антигенсвязывающей части по данному изобретению. Также предусматривается фармацевтическая композиция или состав, описанные в данном документе, или связывающая молекула или слитый белок, которые содержат антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано в данном документе, для лечения заболевания.

В частности, данное изобретение относится к способу лечения состояния, опосредованного В-клетками, у нуждающегося в этом субъекта, являющегося представителем собачьих, включающему введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части, как описано в данном документе.

Одним из аспектов данного изобретения также являются антитело или его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция, как описано в данном документе, для лечения состояния, опосредованного В-клетками, у субъекта, являющегося представителем собачьих.

Например, антитело или его антигенсвязывающую часть можно использовать для истощения клеток В-клеточной лимфомы в крови и/или тканях собачьих. Состояние, опосредованное В-клетками, выбрано из В-клеточной лимфомы (например, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы из клеток мантийной зоны, лимфомы Беркитта, медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны (NMZL), лимфомы маргинальной зоны селезенки (SMZL), внутрисосудистой В-крупноклеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза), лейкоза или иммуноопосредованного заболевания. Иммуноопосредованное заболевание может представлять собой аутоиммунное заболевание. Один из примеров может включать без ограничения аутоиммунную гемолитическую анемию, иммунопосредованную тромбоцитопению, аутоиммунные формы пузырчатки, иммуноопосредованный артрит и атопический дерматит, ревматоидный артрит, системную красную волчанку (SLE), синдром Шегрена, васкулит, рассеянный склероз, диффузный токсический зоб, идиопатическую тромбоцитопению, дерматомиозит, иммуноопосредованную тромбоцитопению, полимиозит, пузырчатку, иммуноопосредованную гемолитическую анемию и буллезный пемфигоид.

Количество терапевтического средства, которое является эффективным/активным для лечения конкретного нарушения или состояния, будет зависеть от природы нарушения или состояния, и его можно определять с помощью стандартных клинических методов. Кроме того, для идентификации оптимальных диапазонов дозировки необязательно можно использовать in vitro или in vivo анализы. Точная доза, которая будет использоваться в композициях, будет также зависеть от пути введения и серьезности заболевания или нарушения, и ее следует выбирать в соответствии с мнением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента. Следует учитывать такие факторы, как возраст, масса тела, пол, диета, время введения, скорость выведения, состояние хозяина, комбинации лекарственных средств, аллергические реакции и тяжесть заболевания.

Как правило, количество антитела или его фрагмента по данному изобретению составляет по меньшей мере около 0,01% по массе композиции. Если предполагается пероральное введение, это количество может варьироваться в пределах от около 0,1% до около 80% по массе композиции. Предпочтительно пероральные композиции могут содержать от около 4% до около 50% антитела или его фрагмента по данному изобретению по массе композиции.

Предпочтительные композиции по данному изобретению готовят так, чтобы единица дозы для парентерального применения содержала от около 0,01% до около 2% по массе антитела или его фрагмента по данному изобретению.

В случае введения путем инъекции, такой как внутривенная или подкожная инъекция, композиция может содержать, как правило, от около 0,01 мг/кг до около 250 мг/кг, например, от 0,1 мг/кг до около 250 мг/кг массы тела субъекта, например, от около 0,1 мг/кг до около 20 мг/кг массы тела животного, и более предпочтительно от около 1 мг/кг до около 10 мг/кг массы тела животного, хотя менее 0,1 мг/кг также предусматривается. В одном варианте реализации изобретения композицию вводят в дозе от около 0,5 до 30 мг/кг, например, от около 5 до 25 мг/кг, от около 10 до 20 мг/кг, от около 0,5 до 5 мг/кг, от около 0,5 до 2,5 мг/кг, от около 0,5 до 2,0 мг/кг или около 2 или 3 мг/кг.В одном варианте реализации изобретения композицию вводят в дозе от 2 до 50 мг/мл. В одном варианте реализации изобретения композицию вводят в дозе от 0,5 мг/мл до 2,5 мг/мл или от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл. Схема дозирования может варьироваться, например, от одного раза в неделю до одного раза каждые 2, 3, 4 недели или до 8 недель между дозами. В одном варианте реализации изобретения композицию вводят в дозе от 0,5 мг/мл до 2,5 мг/мл каждые три-четыре недели, например, 0,5 мг/мл или 2,5 мг/мл каждые три-четыре недели. Предпочтительно дозу выбирают так, чтобы обеспечить длительное истощение CD20-положительных клеток с обеспечением интервала между дозами в три-четыре недели. Можно вводить многократные дозы, предпочтительно вплоть до около 6 или более повторных доз.

В одном варианте реализации изобретения после лечения у субъекта наблюдается по меньшей мере 7 суток, или по меньшей мере 14 суток, или по меньшей мере 21 сутки, или по меньшей мере 28 суток, или по меньшей мере 40 суток, или по меньшей мере 50 суток, или по меньшей мере 60 суток без прогрессирования заболевания. В одном варианте реализации изобретения после лечения у субъекта наблюдается по меньшей мере 7 суток, или по меньшей мере 14 суток, или по меньшей мере 21 сутки, или по меньшей мере 28 суток, или по меньшей мере 40 суток, или по меньшей мере 50 суток, или по меньшей мере 60 суток без прогрессирования заболевания.

В одном варианте реализации изобретения число суток выживания, число суток без заболевания или число суток без прогрессирования заболевания составляет по меньшей мере 2 месяца, или по меньшей мере 3 месяца, или по меньшей мере 4 месяца, например, по меньшей мере 5 месяцев, как, например, по меньшей мере 6 месяцев.

В одном варианте реализации изобретения число суток выживания, число суток без заболевания или число суток без прогрессирования заболевания составляет по меньшей мере 9 месяцев, 200 суток, 300 суток или 3 года или больше. В одном варианте реализации изобретения оно составляет по меньшей мере один, два, три года или более. Данное изобретение относится к способам лечения или предупреждения CD20-опосредованных заболеваний или нарушений у животного-компаньона, например, собаки, включающим введение эффективного количества антитела или фрагмента по данному изобретению нуждающемуся в этом животному.

В контексте данного документа «лечить», «лечение» или «осуществление лечения» означает ингибирование или ослабление тяжести заболевания или нарушения. Например, лечение может включать отсрочку развития симптомов, связанных с заболеванием или нарушением, и/или снижение тяжести таких симптомов, которые будут наблюдаться или, как ожидается, разовьются при указанном заболевании. Термины включают ослабление имеющихся симптомов, предупреждение дополнительных симптомов и ослабление или предупреждение лежащих в основе причин таких симптомов. Таким образом, термины обозначают, что положительный результат достигается, по меньшей мере, у некоторых млекопитающих, например, подвергающихся лечению пациентов, являющихся представителями собачьих. Многие методы лечения эффективны для некоторых, но не для всех пациентов, проходящих лечение. При лечении форм В-клеточной лимфомы, например, ослабление симптомов можно оценивать путем измерения лимфатических узлов после лечения и наблюдения за уменьшением размера лимфатических узлов как признаком успешного лечения.

Термин «субъект» или «пациент» относится к собаке, которая является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Во избежание сомнений, лечение людей исключено.

Молекулы или фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить в качестве единственного активного ингредиента или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, например, препаратом для терапии рака. Терапевтическое средство представляет собой соединение или молекулу, которые являются пригодными для лечения заболевания. Примеры терапевтических средств включают антитела, фрагменты антител, лекарственные средства, токсины, нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, проапоптические средства, антиангиогенные средства, соединения бора, фотоактивные средства или красители, радиоизотопы, иммунодепрессант или иммуномодулирующее средство, такое как цитокин или хемокин. В одном примере молекулы или фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить в комбинации с многокомпонентной химиотерапией на основе протокола CHOP, включающей несколько инъекционных и пероральных лекарственных средств (L-аспарагиназа, винкристин, Cytoxan, преднизон и доксорубицин), вводимых примерно еженедельно в течение нескольких месяцев. Введение может осуществляться одновременно, до или после введения соединения по данному изобретению.

Данное изобретение также относится к способу ингибирования роста опухоли или метастазирования, включающему приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающей части или фармацевтической композиции, как описано в данном документе. Способ может выполняться in vitro, in vivo или ex vivo.

Данное изобретение также относится к способу уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CD20, включающему приведение клетки в контакт с антителом или фармацевтической композицией, как описано в данном документе, вследствие чего происходит уничтожение клетки, экспрессирующей CD20. Опухолевая клетка представляет собой опухолевую клетку собачьих. Способ может выполняться in vitro, in vivo или ex vivo.

Также представлены способы устранения клеток, экспрессирующих CD20 собачьих, с использованием антитела или фармацевтической композиции, как описано в данном документе. Способ может выполняться in vitro, in vivo или ex vivo.

Набор

В другом аспекте данное изобретение относится к набору для лечения или предупреждения заболевания, например, как перечислено в данном документе, или иммунного ответа и/или для выявления CD20 для диагностики, прогнозирования или мониторинга заболевания, содержащему антитело по данному изобретению и необязательно инструкции по применению. Такой набор может содержать другие компоненты, упаковку, инструкции или материал для содействия выявлению белка CD20. Набор может включать меченое антитело, которое связывается с CD20, или связывающую молекулу, содержащую антитело, которое связывается с CD20, и одно или несколько соединений для выявления метки.

Способы получения антител

Описанное в данном документе антитело можно получать у трансгенного млекопитающего, например, грызуна, в организме которого экспрессируются антитела собачьих при стимуляции антигеном CD20. Такие грызуны описаны в WO20018/189520 и WO2020/074874.

Таким образом, антитело или фрагмент, описанные в данном документе, можно получать у млекопитающего, например, грызуна, например, трансгенного животного, в организме которого экспрессируются антитела при стимуляции антигеном CD20 собачьих. У трансгенного грызуна, например, мыши, может наблюдаться сниженная способность к экспрессии эндогенных генов антител. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения у грызуна наблюдается сниженная способность к экспрессии эндогенных генов легких и/или тяжелых цепей антитела. Следовательно, у грызуна, например, мыши, могут содержаться модификации для нарушения экспрессии эндогенных генов легких каппа- и лямбда-цепей и/или тяжелых цепей антитела, так что функциональные легкие и/или тяжелые цепи мыши не продуцируются, например, как дополнительно объясняется ниже. Такие трансгенные грызуны описаны в данной области техники и дополнительно обсуждаются в примерах ниже.

Также в объем данного изобретения входит способ получения антител собачьих, способных связывать CD20, причем указанный способ включает

a) иммунизацию трансгенного грызуна, например, мыши, антигеном CD20, причем в организме указанного грызуна экспрессируется конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая неперестроенные V-, D- и J-гены собачьих,

b) выделение антител собачьих.

Также в объем данного изобретения входит способ получения антител, способных связывать CD20 собачьих, причем указанный способ включает

b) получение библиотеки последовательностей, содержащей последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, от указанного грызуна, например, мыши, и

c) выделение антител, содержащих последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, из указанных библиотек.

Дополнительные этапы могут включать идентификацию антитела, которое связывается с CD20, например, с использованием функциональных анализов, как показано в примерах.

Способы подготовки или получения полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, описанных в данном документе, с использованием in vitro экспрессионных библиотек, могут включать следующие этапы:

a) обеспечение набора, совокупности или библиотеки последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотные последовательности; и

b) скрининг указанного набора, совокупности или библиотеки в отношении аминокислотных последовательностей, которые могут связываться с/иметь аффинность в отношении CD20, и

c) выделение аминокислотной(аминокислотных) последовательности(последовательностей), которая(которые) (может)могут связываться с/иметь аффинность в отношении CD20

В вышеупомянутом способе набор, совокупность или библиотека аминокислотных последовательностей могут быть представлены на фаге, фагмиде, рибосоме или подходящем микроорганизме (например, дрожжах), например, для облегчения скрининга. Подходящие способы, методики и организмы-хозяева для дисплея и скрининга (набора, совокупности или библиотеки) аминокислотных последовательностей будут известны специалисту в данной области техники (см., например, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1-е издание (October 28, 1996) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty). Библиотеки, например, фаговые библиотеки, получают путем выделения клетки или ткани, экспрессирующей антигенспецифическое антитело или его фрагмент, клонирования последовательности мРНК, кодирующей антитело или его фрагмент, происходящей из выделенной клетки или ткани, и обеспечения экспрессии кодируемого белка с использованием библиотеки. Последовательности могут экспрессироваться в бактериальной, дрожжевой или других экспрессионных системах.

Другой аспект также относится к выделенному антителу, полученному или получаемому с помощью способа, описанного выше.

Другие способы и варианты применения

В другом аспекте антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано в данном документе, используют для нетерапевтических целей, таких как диагностические тесты и анализы. Таким образом, данное изобретение также относится к способу выявления клетки собачьих, экспрессирующей CD20 собачьих, или выявления белка CD20 собачьих в биологическом образце от субъекта, являющегося представителем собачьих, включающему приведение биологического образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающей частью, как описано в данном документе, причем указанные антитело или его антигенсвязывающая часть связаны с выявляемой меткой. Биологический образец может представлять собой биоптат, образец ткани, крови, сыворотки крови, плазмы крови или лимфатической жидкости.

В определенных вариантах реализации изобретения способ может включать сравнение величины связывания в тестируемом биологическом образце с величиной связывания в контрольном биологическом образце, причем повышенное связывание с тестируемым биологическим образцом по сравнению с контрольным биологическим образцом может указывать на присутствие одной или нескольких клеток лимфомы в тестируемом биологическом образце. В некоторых вариантах реализации изобретения биологический образец представляет собой кровь или отобранный шприцем аспират собачьих. Эти способы также представлены в in vivo и/или in vitro формате.

Модификации антител для диагностических целей хорошо известны в данной области техники. Например, антитела можно модифицировать лигандной группой, такой как биотин, или выявляемой маркерной группой, такой как флуоресцентная группа, радиоизотоп или фермент.Соединения по данному изобретению можно использовать для диагностических целей и, например, метить с использованием стандартных методик. Подходящие выявляемые метки включают без ограничения флуорофоры, хромофоры, атомы радиоактивных элементов, электронноплотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие партнеров по специфическому связыванию.

В другом аспекте антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано в данном документе, используют при выделении и/или идентификации клеток, экспрессирующих CD20 собачьих, или клеток, которые содержат белок клеточной поверхности, который реагирует с такими связывающими средствами (например, В-клеток, клеток В-клеточной лимфомы, CD20 собачьих).

Антитело или его антигенсвязывающую часть, как описано в данном документе, также можно использовать в анализе определения уровня экспрессии CD20. Затем можно определять корреляцию уровня экспрессии с исходными (например, контрольными) уровнями для определения того, имеется ли у пациента конкретное заболевание, прогноза у пациента, или того, является ли конкретная схема лечения эффективной.

Если в данном документе не указано иное, подразумевается, что научные и технические термины, используемые в связи с данным изобретением, имеют значения, которые являются общеизвестными для специалистов в данной области техники. Хотя предшествующее описание обеспечивает общее описание предмета изобретения, охватываемого объемом данного изобретения, включая способы получения и применения данного изобретения, а также его лучший вариант реализации, следующие примеры представлены для дополнительной помощи специалистам в данной области техники в реализации данного изобретения на практике. Однако специалистам в данной области техники будет понятно, что особенности этих примеров не следует рассматривать как ограничивающие данное изобретение, объем которого следует понимать из формулы изобретения и ее эквивалентов, прилагаемой к данному описанию. Различные дополнительные аспекты и варианты реализации данного изобретения будут понятны специалистам в данной области техники с учетом данного описания.

Все документы, упоминаемые в данном описании, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме, включая ссылки на номера доступа для генов, научные публикации и ссылки на патентные публикации.

Выражение «и/или» при применении в данном документе следует рассматривать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов с другим или без него. Например, «А и/или В» следует понимать как конкретное описание каждого из (i) A, (ii) В и (iii) А и В, так же, как если бы каждое из них было изложено в данном документе по отдельности. Если контекст не требует иного, описания и определения признаков, изложенных выше, не ограничиваются каким-либо конкретным аспектом или вариантом реализации данного изобретения, и в равной степени применимы ко всем описанным аспектам и вариантам реализации изобретения.

Изобретение далее иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: клонирование CD20 собачьих

Поиск для эталонного генома боксера CAMFAM_3.1 выполняли с использованием поискового портала UCSC Genome Browser. Геномная последовательность для CD20 (MS4A1) была загружена вместе с последовательностью мРНК АВ210085.1. С использованием этих данных о последовательностях, были сконструированы праймеры для обеспечения амплификации CD20 из кДНК с добавленной последовательностью для обеспечения «бесшовного» клонирования. Это позволило подтвердить последовательность CD20 в крови собаки и провести «бесшовное» клонирование в клонирующий вектор piggyBac.

Выделение мРНК CD20 собачьих и получение кДНК

Цельную кровь бигля предоставила компания Envigo RMS (Алконбери, Хантингдон, Великобритания), и РВМС были выделены в градиенте плотности Ficoll. Вкратце, 10 мл цельной крови разбавляли 25 мл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) и наслаивали на 15 мл Ficoll Paque Plus (Sigma Aldrich) перед центрифугированием при 800 rcf в течение 10 мин., комнатная температура, с медленным ускорением и без торможения. Интерфазное кольцо собирали в PBS. Общую РНК выделяли из РВМС с помощью набора QIAGEN RNeasy Mini (Qiagen, Хильден, Германия) и стандартных процедур, с расщеплением ДНКазой на колонке. Получение кДНК осуществляли с использованием системы для синтеза первой цепи Superscript™ IV, в соответствии со стандартными процедурами, и заякоренных олиго-dT-праймеров (ThermoFisher, Массачусетс, США).

Нуклеотидная и аминокислотная последовательности полноразмерного CD20 собачьих для клеточной экспрессии показаны ниже:

НУКЛЕОТИДНАЯ:

БЕЛКОВАЯ:

Пример 2: экспрессия CD20 собачьих

Клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293 выращивали на круглых чашках для тканевых культур диаметром 90 мм в виде монослоев в DMEM/F12 (Life Technologies), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FBS; Sigma Aldrich), при 37°С, с 5% СО₂. Клетки HEK293 котрансфицировали кДНК CD20 и транспозазой PiggyBac с использованием полиэтиленимина (PEI МАХ: 40 кДа, Polysciences Inc., Эппельхайм, Германия). 30 мкл PEI МАХ (1 мг мл^-1), 5 мкг кДНК и 1 мл DMEM/ F12 инкубировали в течение 10 мин. при комнатной температуре, в чашку на 90 мм по каплям добавляли клетки НЕК293 70 - 80% конфлюентности и инкубировали в течение 2 суток перед применением. Через 48 часов стабильно трансфицированные клетки подвергали селекции с использованием подходящего антибиотика.

Эмбриональные фибробласты мыши (MEF) выращивали на круглых чашках для тканевых культур диаметром 90 мм в виде монослоев в DMEM с высоким содержанием глюкозы (Life Technologies), дополненной 10% FBS, 1 мМ пируватом натрия (Sigma-Aldrich), 0,5 мМ р-меркаптоэтанолом (Gibco) и 1% MEM с заменимыми аминокислотами (Sigma-Aldrich) при 37°С, с 5% СО₂. Клетки трансфицировали кДНК CD20 и транспозазой PiggyBac с использованием Lipofectamine LTX с реагентом PLUS™ (ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкциями, рекомендуемыми производителем. Через 48 часов стабильно трансфицированные клетки подвергали селекции с использованием подходящего антибиотика.

Клетки MDCK II (клетки почки собаки Мадина-Дарби) выращивали во флаконах для тканевых культур с обработанной поверхностью (Т25/Т75/Т175) в виде монослоев в DMEM с высоким содержанием глюкозы (Life Technologies), дополненной 10% FBS и 1% MEM с заменимыми аминокислотами (Sigma-Aldrich) при 37°С, с 5% CO₂. Клетки MDCK II котрансфицировали кДНК CD20 дикого типа или мутантного CD20 собачьих и транспозазой PiggyBac с использованием реагента Lipofectamine™ LTX с реагентом PLUS™ (ThermoFisher Scientific), следуя рекомендуемому протоколу.

Пример 3: иммунизация в мышиной модели с использованием ДНК и MEF

Мышей Ку9™, по существу, как описано, например, в WO 2018/189520 и WO 2020/074874, иммунизировали. Трансгенные мыши были модифицированы путем вставки репертуара генов вариабельных областей иммуноглобулина собаки в соответствующие локусы генома мыши. Это позволяет получать антитела, которые содержат вариабельную область антитела, образующуюся в результате экспрессии ДНК собачьих у мыши, в комбинации с константной областью мыши (для тяжелой цепи и каппа-цепи) или константной областью собаки (для лямбда-цепи). Информация, касающаяся нуклеиновой кислоты или кодируемой ею вариабельной области таких химерных цепей антитела, может быть использована для создания полностью собачьих антител.

Что касается ДНК-иммунизации, выполняли схему примирования и стимуляции с использованием гидродинамической инъекции в хвостовую вену (HTVI), и собирали ткани. Что касается клеточной иммунизации, выполняли схему примирования и стимуляции с использованием клеток MEF, стабильно экспрессирующих CD20, и собирали ткани. Дополнительную схему иммунизации выполняли с использованием HTVI ДНК-иммунизации для примирования в сочетании со стимуляцией CD20-экспрессирующими клетками MEF.

Определение титров в сыворотке крови:

У мышей брали кровь перед иммунизацией и через 10 суток после каждой последующей стимуляции. Сыворотку отделяли от коагулированной крови путем центрифугирования в пробирках Microvette 200 Z-Gel (Starstedt AG & Co. KG, Германия) и оценивали титры антител к CD20 собачьих с помощью проточной цитометрии. Сыворотку серийно разводили 1:10 в буфере для FACS (PBS + 3% FBS) и добавляли к клеткам, стабильно экспрессирующим CD20 собачьих, или контрольным CD20-отрицательным клеткам собачьих. Антитела мыши к CD20 собачьих выявляли с помощью либо ВВ700-конъюгированных (BD Horizon Brilliant™ Blue 700, BD Biosciences), либо FITC-конъюгированных вторичных моноклональных антител к изотипам IgG1, IgG2a, IgG2b (BD OptiBuild™, Becton Dickinson). Данные были получены с использованием проточного цитометра BD Accuri С6 Flow (Becton Dickinson, Нью-Джерси, США) или Beckman Coulter CytoFLEX. Сыворотку до иммунизации использовали для определения фона. Титры антител определяли как наиболее высокое разведение, которое показывало положительный сигнал выше фонового. На Фиг. 1 показаны титры антител 5 иммунизированных мышей Ку9.

Пример 4: выделение продуцирующих антитела клеток, секвенирование, отбор и модификация последовательностей антител

Выделение ткани: У мышей брали селезенки, лимфатические узлы и костный мозг.Спленоциты получали путем нарезания селезенки на кусочки и растирания их через клеточный фильтр на 40 мкм (Falcon), при этом промывали их RPMI-1640 (Lonza, Базель, Швейцария) + 10% FBS на льду. Аналогичный способ использовали для лимфоцитов из лимфатических узлов, при этом клетки селезенки и лимфатических узлов обычно объединяли. Костный мозг собирали из бедренной кости и большой берцовой кости путем промывания костного мозга RPMI-1640 с использованием иглы 25 калибра через клеточный фильтр на 40 мкм, предварительно смоченный RPMI-1640. Клетки всех типов осаждали при 300 g в течение 5 мин и либо прямо использовали для сортировки с помощью проточной цитометрии, либо ресуспендировали в FBS + 10% диметилсульфоксид (DMSO) перед замораживанием при -150°С.

Сортировка клеток: Как правило, антигенспецифические В-клетки селезенки можно захватывать с помощью меченых антигенных белковых зондов (например, внеклеточный домен) или антиген-VLP, поскольку они преимущественно экспрессируют транс мембранные антитела на поверхности клетки. С другой стороны, считается, что антигенспецифические лимфобласты или плазматические клетки менее легко метятся белковыми зондами или VLP из-за их доминантной экспрессии секретируемых антител. Следовательно, лимфобласты и плазматические клетки, выделенные из образца лимфатических узлов селезенки или костного мозга, были переведены на следующий этап восстановления последовательности антител без использования антигенных зондов для выделения антигенспецифической субпопуляции этих популяций. Коэкспрессию CD138 и CD267 (TACI) на клеточной поверхности использовали для идентификации популяции лимфобластов и плазматических клеток. Для сортировки лимфобластов и плазматических клеток из общего пула для иммунопрофилирования единичных клеток с помощью системы 10Х Genomics Chromium использовали набор для обогащения СВ138-плазматических клеток (Miltenyi biotech, Великобритания) для обогащения в отношении этих редких клеток. Перед сортировкой антигенспецифических клеток из клеток селезенки и лимфатических узлов проводили обогащение в отношении В-клеток с использованием набора для выделения общих В-клеток в соответствии с инструкциями производителя (StemCell Technologies, Великобритания) или с использованием собственного коктейля биотинилированных антител и Rapidspheres со стрептавидином (StemCell Technologies, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя.

Маркеры, включая CD19, IgM, IgA, IgD, CD138 и CD267 (TACI), затем использовали для идентификации В-клеток с переключенным изотипом, обогащенных клетками, которые отвечают на иммунизацию. В пределах этой популяции антигенспецифические клетки можно захватывать с помощью окрашивания мечеными белковыми зондами или VLP, которые экспрессируют целевой антиген на их поверхности, и проведения проточной цитометрии. VLP получают из клеток НЕК, стабильно трансфицированных CD20, и белка gag ретровируса, слитого с EGFP; экспрессия gag обеспечивает отпочкование VLP из клеток, a EGFP метит VLP для выявления по флуоресценции. Поверхностные антигены на VLP напрямую экспрессируются из рекомбинантных клеток без какого-либо этапа очистки или модификации, и присутствуют в нативной форме. Другие линии клеток млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или эмбриональные фибробласты мыши (MEF), также можно использовать для продукции VLP. Маркеры для идентификации нежелательных популяций клеток и мертвых клеток (F4/80; Ly-6C/G; CD8a; CD4; CD11c; 7AAD или zombie-NIR/FVD EF780) включены во все панели окрашивания для исключения этих клеток из процедуры сортировки.

Секвенирование нового поколения и отбор кандидатов:

Сортированные клетки получают для профилирования антител с использованием системы для иммунопрофилирования единичных клеток 10Х Genomics Chromium и набора V(D)J (10X Genomics) в соответствии с инструкциями производителя. В случае 10Х, используются различные инструменты платформы Illumina, в соответствии с инструкциями от 10Х Genomics. Последовательности анализируют с использованием специальных инструментов на основе программного обеспечения pRESTO/Change-O (Йельский университет)/IgBlast (NCBI, США)/Епс1опе (10Х Genomics) для прогнозирования последовательности зародышевой линии и гипермутации.

Вариабельная область иммуноглобулина содержит VDJ-область нуклеотидной последовательности иммуноглобулина для генов тяжелых цепей и VJ-область нуклеотидной последовательности иммуноглобулина для Igκ и Igλ Внутри клонального семейства существуют подсемейства с общими мутациями в сегментах V(D)J, которые возникают во время рекомбинации генов иммуноглобулинов и соматических гипермутаций. Различные клональные семейства, которые демонстрируют уникальное использование сегмента V(D)J, обычно обладают разными характеристиками связывания. В ходе рекомбинации и гипермутации отбираются клетки, антитела которых обладают более высокой аффинностью в отношении антигена. Аффинность обычно повышается за счет дополнительных мутаций; например, кластерное семейство показано на Фиг. 6 WO2015/040401.

Клональное семейство обычно определяется родственными последовательностями V(D)J тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина двух или более клональных клеток. Родственные последовательности V(D)J иммуноглобулина можно идентифицировать по совместному использованию ими генных сегментов V и J. Пример анализа последовательностей антител в случае подвергнутых сортировке Ag-специфических единичных В-клеток показан на Фиг. 5 WO2015/040401, и показаны последовательности антител, образованные в результате использования семейства V-генов тяжелой цепи, и подвергнутые кластеризации с получением представленных филогенетических деревьев. На основе таких филогенетических деревьев были отобраны клоны-кандидаты.

К примеру, все из mAb РМХ001, РМХ002, РМХ003, РМХ004 и РМХ005 к CD20 собачьих кодируются одним и тем же V-геном тяжелой цепи (cIGHV3-5), J-геном тяжелой цепи (cIGHJ4, с последовательностью зародышевой линии, представленной SEQ ID NO: 75), V-геном легкой цепи (cIGLV3-3) и J-геном легкой цепи (cIGLJ3, с последовательностью зародышевой линии, представленной SEQ ID NO: 77). Последовательности вариабельной области РМХ001 впервые были идентифицированы у иммунизированной CD20 собачьих мыши Ку9. Указанное антитело имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 4), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 5), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 6). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 2 аминокислотных изменения по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74) и 3 аминокислотных изменения в последовательности вариабельной области легкой цепи по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 76). CDR1 (SEQ ID NO: 7), CDR2 (SEQ ID NO: 8) и CDR3 (SEQ ID NO: 9) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 11) и CDR3 (SEQ ID NO: 12) вариабельной области легкой цепи спрогнозированы с использованием IMGT V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input). Длина CDR3-областей тяжелой цепи и легкой цепи mAb РМХ составляет 5аа и 9аа соответственно.

Расширение списка «хитов» для mAb РМХ001 позднее осуществляли у всех иммунизированных CD20 собачьих мышей, и кандидаты, которые имеют одинаковое использование гена VJ и длину CDR3 как для тяжелых, так и для легких цепей, были отобраны для дальнейшего скрининга. Могут возникать дополнительные мутации в последовательностях, по сравнению с mAb РМХ001. К примеру, mAb РМХ002, РМХ003, РМХ004 и РМХ005 были выбраны из других когорт иммунизации и, следовательно, от других мышей, у которых было идентифицировано mAb РМХ001. Это показывает конвергентный отбор успешной перестройки генов.

mAb РМХ002 имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 14), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 15), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 16). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 10 аминокислотных изменений по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76) аминокислотные изменения отсутствуют.CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) и CDR3 (SEQ ID NO: 19) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 21) и CDR3 (SEQ ID NO: 22) вариабельной области легкой цепи спрогнозированы с использованием IMGT V-QUEST.

mAb РМХООЗ имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 23), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 24), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 25), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 26). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 5 аминокислотных изменений по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74) и 1 аминокислотное изменение в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76). CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 28) и CDR3 (SEQ ID NO: 29) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 30), CDR2 (SEQ ID NO: 31) и CDR3 (SEQ ID NO: 32) вариабельной области легкой цепи спрогнозированы с использованием IMGT V-QUEST.

mAb РМХ004 имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 33), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 34), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 35), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 36). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 12 аминокислотных изменений по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76) аминокислотные изменения отсутствуют.CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 38) и CDR3 (SEQ ID NO: 39) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ ID NO: 40), CDR2 (SEQ ID NO: 41) и CDR3 (SEQ ID NO: 42) вариабельной области легкой цепи спрогнозированы с использованием IMGT V-QUEST.

mAb РМХ005 имеет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 43), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 44), и нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 45), которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 46). В последовательности вариабельной области тяжелой цепи имеются 4 аминокислотных изменения по сравнению с последовательностью зародышевой линии (SEQ ID NO: 74), и в последовательности вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76) аминокислотные изменения отсутствуют.CDR1 (SEQ ID NO: 47), CDR2 (SEQ ID NO: 48) и CDR3 (SEQ ID NO: 49) вариабельной области тяжелой цепи и CDR1 (SEQ Ш NO: 50), CDR2 (SEQ ID NO: 51) и CDR3 (SEQ ID NO: 52) вариабельной области легкой цепи спрогнозированы с использованием IMGT V-QUEST.

На Фиг. 2 показаны результаты выравнивания последовательностей антитела РМХ.

Модификация последовательностей

Каркасная область 1 (FR1) легкой цепи РМХ003 (SEQ ID NO: 26) содержит сиквон NVT, который является консенсусной последовательностью аспарагин-связанного гликозилирования белков. /Для удаления гликанов, связанных с этим сайтом, сиквон NVT в FR1 mAb РМХ003 подвергали мутации с превращением в QVT для mAb РМХ006, AVT для mAb РМХ007, EVT для mAb РМХ008, NVA для mAb РМХ009, SVT для mAb РМХ010 и TVT для mAbPMX011.

Образующиеся в результате аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи mAb РМХ006 (SEQ ID NO: 53), mAb PMX007 (SEQ ID NO: 54), mAb PMX008 (SEQ ID NO: 55), mAb PMX009 (SEQ ID NO: 56), mAb PMX010 (SEQ ID NO: 57), mAb PMX011 (SEQ ID NO: 58) и последовательности FR1 PMX003 (SEQ ID NO: 59), mAb PMX006 (SEQ ID NO: 60), mAb PMX007 (SEQ ID NO: 61), mAb PMX008 (SEQ ID NO: 62), mAb PMX009 (SEQ ID NO: 63), mAb PMX010 (SEQ ID NO: 64), mAb PMX011 (SEQ ID NO: 65) приведены в таблице под названием Последовательности.

Каркасная область 1 (FR1) легкой цепи РМХ066 (SEQ ID NO: 81), РМХ0067 (SEQ ID NO: 91), PMX068 (SEQ ID NO: 101), PMX0069 (SEQ ID NO: 111), PMX071 (SEQ ID NO: 131), PMX072 (SEQ ID NO: 141), PMX073 (SEQ ID NO: 151), PMX074 (SEQ ID NO: 161), PMX076 (SEQ ID NO: 181), PMX077 (SEQ ID NO: 191), PMX078 (SEQ ID NO: 201), PMX079 (SEQ ID NO: 211), PMX081 (SEQ ID NO: 231) содержит сиквон NVT. Для удаления гликанов, связанных с этим сайтом, сиквон NVT в FR1 mAb РМХ066, РМХ0067, РМХ068, РМХ0069, РМХ071, РМХ072, РМХ073, РМХ074, РМХ076, РМХ077, РМХ078, РМХ079, РМХ081 подвергали мутации с изменением на SVT для получения в результате аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи РМХ 112 (SEQ ID NO: 238), РМХ113 (SEQ ID NO: 239), PMX114 (SEQ ID NO: 240), PMX115 (SEQ ID NO: 241), PMX116 (SEQ ID NO: 242), PMX117 (SEQ ID NO: 243), PMX118 (SEQ ID NO: 244), PMX119 (SEQ ID NO: 245), PMX120 (SEQ ID NO: 246), PMX121 (SEQ ID NO: 247), PMX122 (SEQ ID NO: 248), PMX123 (SEQ ID NO: 249) и PMX124 (SEQ ID NO: 250) соответственно.

Последовательности приведены в таблице 2. Ряд антител содержит встречающиеся в природе мотивы последовательностей, которые не приводят к связыванию гликана с антителом. Например, РМХ070 и РМХ075 содержат мотив последовательности SVT в FR1 легкой цепи, РМХ080 содержит мотив последовательности TVT в FR1 легкой цепи.

Пример 5: получение моноклональных антител из единичных клеток

Последовательность V(D)J тяжелой цепи и легкой цепи выбранных клонов-кандидатов синтезируют и клонируют в векторы экспрессии, содержащие геномные последовательности константной области IgG собаки и константных областей IGK или IGL собаки соответственно. К примеру, последовательности вариабельной области РМХ001-РМХ005 клонировали в векторы, которые кодируют константные области IGGB собаки (SEQ ID NO: 66) и IGLC5 собаки (SEQ ID NO: 67). Векторами экспрессии, кодирующими тяжелую цепь и легкую цепь, котрансфицировали подходящую линию клеток млекопитающих, такую как клетки СНО, для получения стабильной экспрессии. Таким образом получали антитела с полностью собачьими последовательностями.

Для содействия экспрессии в клетках СНО осуществляли оптимизацию кодонов, например, в отношении нуклеотидных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 68) и вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 69) mAb РМХ003. Лидерную последовательность Campath (SEQ ID NO: 70) (см. US 8,362.208 B2) можно вводить для замещения нативной лидерной последовательности (SEQ ID NO: 71 для тяжелой цепи, SEQ ID NO: 72 для легкой цепи) mAb РМХ001-РМХ005.

Моноклональные антитела 1Е4 и 4Е1-7 также экспрессировались. Нуклеотидная последовательность 1Е4 была получена на основании WO2013063186. Аминокислотная последовательность 4Е1-7 была получена на основании Mizuno et al. Scientific Reports, 10, Article 11476 (2020) (https://doi.org/10.1038/s41598-020-68470-9). Вариабельные области обоих антител клонировали в векторы, которые кодируют константные области IGGB собаки (SEQ ID NO: 66) и IGK собаки (SEQ ID NO: 73). Контрольное mAb ритуксимаб-cIGGB получали путем синтеза последовательностей вариабельной области (см. US 5,736,137) и клонировали в векторы, которые кодируют константные области IGGB собаки (SEQ ID NO: 66) и IGLC5 собаки (SEQ ID NO: 67).

Коровая фукоза на N-сцепленных гликанах, связанных с Fc-частью антител, может повлиять на связывание Fc-рецепторов с Fc-областью антител и, следовательно, снизить ADCC-активность. Для усиления ADCC-активности в отношении уничтожения клеток были получены нокаутные (KO) по Fut8 клетки СНО в объединенном формате путем делеции экзона 2 кодирующего Fut8 гена, как описано в Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5;87(5):614-22. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15352059/). КО клетки отбирали по фенотипу с использованием LCA-окрашивания.

Для продукции антител 6×10⁶ отобранных клеток СНО или нокаутных по Fut8 клеток СНО высевали в 3 мл культуральной среды и инкубировали при 32°С, 8% СО₂, со встряхиванием при 200 об/мин. На 1-е, 4-е, 7-е и 10-е сутки в среду добавляли 4% HyClone Cell Boost 7а + 0,4% HyClone Cell Boost 7b + 1% глюкоза. Супернатанты культур собирали на 12-е сутки и определяли концентрацию IgG, используя метод поверхностного плазмонного резонанса (Biacore 8K, Cytiva Life Sciences).

Пример 6: анализы связывания

Анализ на основе проточной цитометрии:

Клетки HEK293 или клетки MDCK II стабильно трансфицировали вектором, кодирующим полноразмерную кДНК CD20 собачьих. Связывание антител с этими клетками оценивали с использованием проточной цитометрии. Вкратце, 1-2 × 10⁵ экспрессирующих CD20 собачьих клеток инкубировали с mAb-кандидатами в течение 1 часа при +4°С, при фиксированной концентрации 1 мкг/мл или 10 мкг/мл для анализов связывания, и с диапазоном концентраций (12-точечное серийное разведение 1:2 антител, начиная с 30 мкг/мл, т.е. 200 нМ) для определения аффинности, с последующей инкубацией с 5 мкг/мл FITC-конъюгированного вторичного антитела к IgG собачьих (Bethyl Laboratories) в течение 1 часа при +4°С. Клетки, инкубированные с FITC-конъюгированным вторичным антителом к IgG собачьих и без первичного антитела к CD20 собачьих или с первичным антителом в качестве изотипического контроля, использовали как отрицательные контроли. Данные получали на проточном цитометре либо Beckman Coulter CytoFLEX, либо BD Accuri C6 Plus, и анализировали их с использованием программного обеспечения FlowJo. Для определения аффинности окрашенные клетки промывали и фиксировали 1% параформальдегидом/3%РВ8/РВ8 в течение 15 мин. После инкубации с антителами-кандидатами их снова фиксировали в течение 24 ч после инкубации со вторичным антителом перед получением данных на проточном цитометре. Графики с использованием средних значений интенсивности флуоресценции (MFI) канала FITC в зависимости от концентрации антитела были построены в GraphPad Prism (Фиг. 3D). Кажущаяся аффинность (Kd) связывания антител-кандидатов с CD20 собачьих на клеточной поверхности определяли как концентрацию при 50% окрашивании CD20-экспрессирующих клеток, т.е. ЕС50 связывания, с использованием уравнения log(agonist) vs response - Variable slope (four parameters).

Результаты анализов связывания показаны на Фиг. 3А-С. Указанные результаты показывают, что антитела РМХ характеризовались более сильной связывающей способностью в отношении CD20 собачьих, чем тестируемые антитела 1Е4 и 4Е1-7, в одной точке концентрации (10 мкг/мл), за исключением РМХ002, которое было эквивалентно антителу 4Е1-7.

ELISA-анализ:

Большая петля внеклеточного домена (ECD) белка CD20 собачьих, как описано ниже, экспрессируется в клетках СНО и секретируется во внеклеточное пространство под контролем промотора CAG, перед очисткой с использованием колонки с белком А.

Белком ECD CD20 покрывают планшет для анализа. Антитела добавляют в диапазоне концентраций и определяют связывающую способность с использованием ELISA.

SPR-анализ:

Аффинность (K_d) mAb к CD20 собачьих можно измерять с помощью SPR с использованием рекомбинантного меченого Fc мыши внеклеточного домена CD20.

Рекомбинантный внеклеточный домен (ECD) (большая петля) CD20 под названием dCD20LL-Fc (см. WO2013/063186, страница 37, SEQ ID NO:62) экспрессируется в секретируемой форме с Fc IgG2a в качестве метки в стабильных клетках СНО, и его очищают из осветленного супернатанта с использованием хроматографии с применением белка А. Кажущуюся Kd, соответствующую бивалентной авидности взаимодействия, получают путем сочетания по аминогруппе 100-150 ОЕ dCD20LL-Fc на проточной ячейке 2 чипа СМ5 с активацией/инактивацией NHS/EDC, применяемой к проточной ячейке 1. Трехкратные разведения в концентрациях от 200 нМ до 0,1 нМ кандидатного IgG выполняют в буфере HBS-EP+ и наносят на поверхность чипа в течение 180 с при 30 мкл/мин. Диссоциацию отслеживают в течение 600 с при 30 мкл/мин, перед регенерацией поверхности с помощью 60-секундного импульса 10 мМ глицин-HCl, уровень рН 2,0. Одновалентный K_d, соответствующий аффинности одновалентного связывания, получают путем повтора вышеприведенного протокола с использованием Fab-фрагмента антитела-кандидата, полученного в результате расщепления папаином (или SpeB) полноразмерного IgG. Эксперименты проводят в подвижном буфере HBS-EP+ при 25°С. Все SPR-эксперименты осуществляют на приборе Biacore 8K, и данные анализируют путем аппроксимации данных к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore Insight Evaluation.

Пример 7: функциональные анализы

Активность в виде комплементзависимой цитотоксичности (CDC)

Линию опухолевых клеток лимфомы собачьих CLBL-1 (Венский университет ветеринарной медицины), которые естественным образом экспрессирует CD20 собачьих, использовали в качестве целевой линии клеток для CDC-анализа. 10000 клеток CLBL-1 на лунку 96-луночного планшета (белого с прозрачным дном) инкубировали с титрованием (11-точечное разведение 1:3, начиная с 10 мкг/мл) антитела к CD20 собачьих и собачьей сывороткой крови, содержащей комплемент (BioIVT), в конечном разведении 1:4, в течение 2 часов при 37°С, 5% CO₂. Анализ проводили с использованием среды (RPMI + 1% L-глутамин + 20% фетальная телячья сыворотка), полученной с использованием термоинактивированной сыворотки крови, так что единственным источником комплемента была собачья сыворотка крови, содержащая комплемент.Химерное антитело ритуксимаб-cIGGB использовали в качестве отрицательного изотипического контроля.

Затем живые клетки определяли количественно с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTitre-Glo® (Promega), следуя протоколу анализа. В этом анализе в качестве показателя жизнеспособности клеток используется содержание АТФ в живых клетках. Люминесценцию измеряли на CLARIOstar (BMG Labtech). Данные анализировали с использованием программного обеспечения MARS (BMG Labtech), и число оставшихся живых клеток использовали для расчета процентной доли уничтожения в присутствии антител с использованием Microsoft Excel, используя лунки без антитела в качестве исходного уровня. Графики были построены в GraphPad Prism.

На Фиг. 4 показана CDC-активность, которую наблюдали в случае РМХ003 как в нативной, так и а-фукозилированной форме. В случае нативной и а-фукозилированной формы тестируемых антител 1Е4 и 4Е1-7 в аналогичных условиях проведения эксперимента с использованием собачьей сыворотки крови, содержащей комплемент, CDC активность не наблюдалась. В таблице 4 представлена CDC-активность для антител РМХ066-РМХ081.

Активность в виде антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC)

Линию клеток собачьих, такую как линия клеток MDCK II (АТСС), стабильно трансфицировали конструкцией, кодирующей белок CD20 собачьих и, конструкцией, экспрессирующей флуоресцентный белок (например, GFP). Либо линию клеток MDCK II, экспрессирующую флуоресцентный белок, но не антиген, либо антитело в качестве изотипического контроля, использовали как отрицательный контроль для эксперимента.

Мононуклеарные клетки периферической крови собачьих (РВМС, Envigo) использовали в качестве источника эффекторных клеток. РВМС выделяли из свежезабранной цельной крови с помощью антикоагулянта гепарина натрия с использованием центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus (Cytiva, GE17-1440-02), следуя рекомендуемому протоколу. РВМС ресуспендировали в среде (среда РВМС = RPMI + 10% термоинактивированная фетальная телячья сыворотка + 1% пенициллин-стрептомицин + 1% заменимые аминокислоты + 1% L-глутамин + 1% пируват натрия + 2% HEPES), дополненной 50 нг/мл рекомбинантного IL-2 собачьих (R&D systems), и инкубировали в течение 24 часов при 37°С перед использованием в ADCC-анализе.

Для оценки ADCC-активности 10000 клеток MDCK II культивировали совместно с РВМС при соотношении эффектор:мишень 35:1 и титрованием антител (11-точечное разведение 1:3, начиная с 10 мкг/мл антитела), в течение 24 ч при 37°С, в смеси 1:1 среды для MDCK II (DMEM + 1% L-глутамин + 10% фетальная телячья сыворотка) и среды для РВМС.Антитело ритуксимаб-cIGGB использовали в качестве отрицательного (изотипического) контроля.

Сигнал GFP, пропорциональный числу живых клеток в лунке, использовали как показатель числа живых клеток, остающихся в лунке к концу инкубации на протяжении 24 ч. Сигнал GFP измеряли на CLARIOstar (BMG Labtech). Данные анализировали с использованием программного обеспечения MARS (BMG Labtech), и процентную долю уничтожения в присутствии антител рассчитывали с использованием Microsoft Excel, используя лунки без антитела в качестве исходного уровня. Графики были построены с помощью GraphPad Prism.

На Фиг. 5 показана ADCC-активность, которую наблюдали в присутствии антител РМХ. Антитело РМХ003 показывает более сильную ADCC-активность, чем тестируемые антитела 1Е4 и 4Е1-7, как в нативной, так и а-фукозилированной форме. В таблице 4 представлена ADCC-активность, наблюдаемая для антител РМХ066-РМХ081.

Активность в виде антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP)

Подходящий способ измерения ADCP-активности описан в Ito et al. Leuk Lymphoma. 2015 January; 56(1): 219-225.

Активность в виде прямого уничтожения/анализ апоптоза

Прямое уничтожение можно измерять, как описано в Mizuno et al. Scientific Reports, 10, Article 11476 (2020).

Пример 8: ex vivo - анализ цельной крови

Для оценки эффективности истощения В-клеток в ex vivo моделях на собаках 100 мкл свежезабранной цельной крови собаки собирали с помощью гепарина и разбавляли 200 мкл RPMI1640 + 10% термоинактивированная фетальная телячья сыворотка + 1% пенициллин/стрептомицин/Е-глутамин + 1% заменимые аминокислоты + 1% пируват натрия + 2% буфер HEPES. Разбавленную кровь инкубировали с 10 мкг/мл антител к CD20 собачьих в течение 2 часов, 24 часов и 96 часов при 37°С. После инкубации образцы инкубировали с раствором Versalyse (Beckman Coulter) в течение 15 минут при комнатной температуре для лизиса красных кровяных телец (RBC). После промывки образцы окрашивали антителом к CD21 собачьих и антителом к CD8 собачьих (оба от BioRad), и анализировали число CD21+ В-клеток и CD8+ Т-клеток на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter). Процентную долю истощения В-клеток рассчитывали исходя из снижения соотношения CD21+ В-клеток и CD8+ Т-клеток по сравнению с контролем без антитела. Результаты на Фиг. 6А-В показывают, что mAb РМХ003 обеспечивало более эффективное уничтожение В-клеток в цельной крови собачьих по сравнению с mAb 1Е4 и 4Е1-7. В таблице 4 представлена специфическая активность в виде истощения В-клеток ех vivo, наблюдаемая для антител РМХ066-РМХ081.

Пример 9: in vivo анализы

Модель опухоли у м ышей

Сингенную модель опухоли у мышей создавали для оценки эффективности антител к CD20 собачьих в уничтожении опухоли in vivo. Геномные последовательности клеток 129Sv ES мыши модифицируют с замещением CD20-кодирующей области мыши CD20-кодирующей областью собаки путем гомологичной рекомбинации. Направленный вектор содержит последовательность геномной ДНК CD20-кодирующей области собаки, фланкированную с обеих сторон геномными последовательностями мыши размером 4-4,5 т.п.о. После микроинъекции и трансмиссии зародышевой линии полученных таким образом мышей скрещивают с мышами Balb/c с получением гетерозиготного по mCD20/dCD20 потомства со смешанным генетическим фоном.

Линию клеток лимфомы мыши А20 генетического фона Balb/c также модифицируют для экспрессии CD20 собаки. CD20-кодирующую область мыши замещают CD20-кодирующей последовательностью собаки путем трансфекции линии клеток А20 линеаризованным направленным вектором для клеток ES.

Для оценки эффективности уничтожения опухоли у мышей, 1 миллион клеток А20 собаки с нокином CD20 (в 100 мкл PBS) подкожно трансплантировали гетерозиготным по mCD20/dCD20 мышам (возрастом 6-8 недель). Химерные антитела к CD20 собачьих mIGG2a (150 мкг в 500 мкл PBS) или только PBS путем внутрибрюшинной инъекции вводили один раз на 0-е сутки. Размер опухоли измеряют каждые сутки, и мышей умерщвляют при достижении гуманных конечных точек.

Исследования на собаках in vivo

В исследовании 1 на собаках, двенадцать здоровых самцов бигля (три собаки на группу исследуемого лекарственного средства), возрастом 2-3 года и массой 8-11 кг, были выведены в Avogadro LS, Франция. Перед исследованием у всех них было подтверждено отсутствие заболеваний или других клинических отклонений. Нативный формат антитела РМХ003 получали в клетках СНО, и вводили его двум группам исследуемого лекарственного средства, при этом одна группа получала 0,5 мг/кг антитела, а другая группа получала 2,5 мг/кг антитела. А-фукозилированную версию антитела РМХ003 получали в результате экспрессии его в клетках Fut8 KO СНО, и вводили его одной группе исследуемого лекарственного средства при 0,5 мг/кг. Контрольная группа получала изотипический контроль, ритуксимаб-cIGGB, при 2,5 мг/кг.Все антитела вводили на 0-е сутки в виде однократной внутривенной инфузии на протяжении 30 минут. Процентную долю CD21+ В-клеток отслеживали и анализировали на следующие сутки после введения антитела: сутки 0 (до введения дозы), 1, 2, 5, 7, 15, 27 и 43. 0,5 мл свежезабранной крови с антикоагулянтом K3EDTA фиксировали 1 мл 1х раствора для лизиса/фиксации RBC (BioLegend) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, а затем разбавляли 18 мл 1x PBS. Подвергнутые фиксации и разбавленные образцы крови хранились при температуре +4°С на протяжении всего периода хранения и отправки в Великобританию. Анализ образцов осуществляли в пределах 48 часов от забора крови. В случае каждого образца клетки осаждали при 400 g в течение 5 мин, осадки клеток ресуспендировали в 0,5 мл буфера, и 50 мкл клеток использовали для окрашивания каждого технического повтора. В случае каждого повтора клетки окрашивали АЕ647-конъюгированным антителом к CD21 собачьих (BioRad, 1:10) и РЕ-конъюгированным антителом к CD8 собачьих (BioRad, 1:50). Данные получали с использованием Beckman Coulter CytoFLEX путем установки порога DAPI для исключения дебриса и безъядерных клеток. Процентную долю CD21+ В-клеток и CD8+ Т-клеток в популяции лимфоцитов анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Истощение В-клеток определяли путем сравнения процентной доли CD21+ В-клеток в сутки оценки после введения антитела с процентной долей на 0-е сутки (исходный уровень) для каждой собаки. Процентную долю CD8+ Т-клеток также оценивали, и она служила внутренним контролем. На Фиг. 7А-В показаны результаты истощения В-клеток у здоровых биглей, которым вводили РМХ и контрольные антитела. Истощение наблюдали при введении РМХ003 в нативной и а-фукозилированной форме. А-фукозилированная форма была более эффективной, чем нативная форма. РМХ003 показало уничтожение В-клеток при намного более низкой дозе, по сравнению с таковым в исследовании на собаках с использованием 1Е4 (Rue et al. Veterinary Immunology and Immunopathology 164(2015), 148-159. Кроме того, истощение В-клеток поддерживалось на низком уровне в течение по меньшей мере 15 суток, что дольше, чем наблюдалось в исследовании на собаках для 4Е1-7 (Mizuno et al.).

В исследовании 2 на собаках, пятнадцать здоровых самцов бигля (три собаки на группу исследуемого лекарственного средства), возрастом 2-3 года и массой 8-11 кг, были выведены в Avogadro LS, Франция. Перед исследованием у всех них было подтверждено отсутствие заболеваний или других клинических отклонений. Нативный формат антител РМХ070 и РМХ115 получали в клетках СНО, и вводили их двум группам исследуемого лекарственного средства на антитело, при этом одна группа получала 0,5 мг/кг антитела, а другая группа получала 2 мг/кг антитела. Контрольная группа получала изотипический контроль, ритуксимаб-cIGGB, при 2 мг/кг. Все антитела вводили на 0-е сутки в виде однократной внутривенной инфузии на протяжении 30 минут.Процентную долю CD21+ В-клеток отслеживали и анализировали на следующие сутки после введения антитела: сутки 0 (до введения дозы), 1, 4, 7, 14, 21 и 28. 1 мл свежезабранной крови с антикоагулянтом K3EDTA фиксировали 2 мл 1х раствора для лизиса/фиксации RBC (BioLegend) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, а затем разбавляли 12 мл lx PBS. Подвергнутые фиксации и разбавленные образцы крови хранились при температуре +4°С на протяжении всего периода хранения и отправки в Великобританию. Анализ образцов осуществляли в пределах 48-72 часов от забора крови. В случае каждого образца клетки осаждали при 400 g в течение 5 мин, осадки клеток ресуспендировали в 1 мл буфера, и 50 мкл клеток использовали для окрашивания каждого технического повтора. В случае каждого повтора клетки окрашивали АЕ647-конъюгированным антителом к CD21 собачьих (BioRad, 1:10) и РЕ-конъюгированным антителом к CD8 собачьих (BioRad, 1:50). Данные получали с использованием Beckman Coulter CytoFLEX путем установки порога DAPI для исключения дебриса и безъядерных клеток. Процентную долю CD21+ В-клеток и CD8+ Т-клеток в популяции лимфоцитов анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Истощение В-клеток определяли путем сравнения процентной доли CD21+ В-клеток в сутки оценки после введения антитела с процентной долей на 0-е сутки (исходный уровень) для каждой собаки. Процентную долю CD8+ Т-клеток также оценивали, и она служила внутренним контролем. На Фиг. 7С показаны результаты истощения В-клеток у здоровых биглей, которым вводили РМХ и контрольные антитела. Истощение наблюдали для РМХ070 и РМХ115 при дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг, и оно было сопоставимо с истощением, наблюдаемым в случае а-фукозилированной формы РМХ003.

Для фармакокинетического анализа отслеживали концентрацию mAb в качестве лекарственного средства в плазме крови, и анализ проводили в следующие моменты времени после введения антитела: до введения дозы, Т2 ч, Т6ч, Т24 ч, Т48 ч, Т72 ч, Т120 ч, Т168 ч, Т360ч, D27 и D43 в исследовании на собаках 1, и до введения дозы, Т2 ч, Т6ч, Т24 ч, D4, D7, D14, D21 и D28 в исследовании на собаках 2. Свежесобранную кровь с антикоагулянтом литий-гепарином помещали на лед сразу же после забора крови. Пробирки с кровью центрифугировали при 2500 g в течение 10 мин при +5°С. Плазму крови собирали в полипропиленовые пробирки и держали на льду до хранения при -20°С. Плазму крови держали в замороженном виде до проведения анализа с помощью ELISA. Концентрацию mAb оценивают с помощью ELIS А с использованием антиидиотипических поликлональных антител к mAb РМХ в качестве захватывающих антител и антител к Fc собачьих-HRP (Sigma) или Fc собачьих-биотин (Sigma) плюс стрептавидин-HRP (BioLegend) в качестве детектирующего антитела. Антиидиотипические поликлональные или моноклональные антитела к mAb РМХ получены в GenScript путем иммунизации кроликов Fab-фрагментами РМХ, получения линии клеток гибридомы и отбора антиидиотипических антител, которые связываются с mAb РМХ, с последующим удалением любых характеризующихся перекрестной реактивностью антител, которые связывают антитело в качестве изотипического контроля.

Для оценки иммуногенности оценивают концентрацию антител к лекарственному средству (ADA) в замороженной плазме крови с помощью ELISA после диссоциации под действием кислоты любых предварительно образованных комплексов между антителами-кандидатами РМХ и антителами к лекарственному средству. Получают химерные версии антител-кандидатов, например, PMX-Fc мыши или PMX-Fc человека, и соответствующую фракцию метят биотином. Наличие и концентрацию антител к лекарственному средству определяют с использованием ELISA-анализа формата «сэндвич», в котором немеченое химерное антитело используют в качестве захватывающего реагента, а меченное биотином химерное антитело, вместе со стрептавидином-HRP, используют для выявления. Антиидиотипические поликлональные антитела, полученные для вышеописанного фармакокинетического анализа, используют в качестве положительного контроля и для построения калибровочной кривой.

Пример 10: картирование эпитопа

Картирование эпитопа проводили для идентификации сайта на антигене CD20 собачьих, с которым специфически связываются антитела. С использованием сайт-направленного мутагенеза, векторы, экспрессирующие химерный CD20 собаки-человека, получали путем разделения внеклеточного домена CD20 собачьих на 9 областей и замещения каждой области в последовательности собаки эквивалентным местоположением в последовательности человека (Фиг. 8А). Аналогичную стратегию использовали для получения химерного CD20 собаки-мыши (Фиг. 8В). Мутантная полноразмерная кДНК экспрессировалась в клетках MDCK, как описано в примере 2. С помощью сравнения связывания РМХ003, РМХ115 и РМХ070 с этими химерными мутантами со связыванием с CD20 дикого типа, была идентифицирована последовательность ITISHFFKMENLNLIKAPM (SEQ ID NO. 303) в качестве эпитопа РМХ003, РМХ115 и РМХ070, поскольку мутация в этом положении приводила к сниженному связыванию в анализе с использованием проточной цитометрии (Фиг. 9). «ENLNLIKAPM» (SEQ ID NO. 303, аминокислоты №150-159 в Seq ID NO: 2), была идентифицирована как коровый эпитоп в пределах этой последовательности. Этот эпитоп отличается от «DIHNCD», который был описан как эпитоп антитела сравнения 1Е4. Другой стратегией для исследования эпитопа является аланиновое сканирование, при котором единичные мутации с заменой на аланин вводят по каждому остатку в малой петле и каждому второму остатку в большой петле (Фиг. 8С).

Пример 11: критерии разрабатываемости

Существует несколько аспектов определения характеристик антител, включая следующее: 1) Уровень транзиентной экспрессии в ходе продукции антител в малом масштабе, который коррелирует с конечным уровнем стабильной экспрессии, который влияет на COGS (себестоимость реализованной продукции). 2) Термостабильность, которая коррелирует с рядом свойств, включая склонность к агрегированию, и совместимость с составами с более высокими концентрациями. Термостабильность может быть отражена значением Tml, которое представляет собой температуру, при которой разворачиванию подвергается 50% белков, и Tagg, которое представляет собой температуру агрегации. Значения Tm1 и Tagg антител с наилучшими характеристиками измеряли с использованием платформы для скрининга стабильности белков UNcle (Unchained Labs). 3) Размер и чистота. Фрагментация и агрегация могут привести к проблемам с эффективностью или иммуногенностью in vivo. Размер антител определяли на гелях для SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. HPLC-SEC показала, что каждый продукт-кандидат на более чем 95% состоит из мономеров. Диаметр частиц определяли с помощью прибора UNcle, что позволило обнаружить потенциальные проблемы, связанные с агрегацией. Параметры разрабатываемости антител РМХ003, РМХ066, РМХ067, РМХ069, РМХ070, РМХ071, РМХ072, РМХ073, РМХ074, РМХ075, РМХ076, РМХ077, РМХ078, РМХ079, РМХ080, РМХ081, РМХ112, РМХ115, РМХ122 и РМХ124 показаны в таблице 5.

Пример 12: анализ дегликозилированных антител

В дополнение к вышеизложенному, проводили прогнозирование уязвимых сайтов в последовательностях с использованием анализа последовательностей in silico. Мотив N-сцепленного гликозилирования (NVT) идентифицировали в каркасной области 1 (FR1) легкой цепи в mAb РМХ003, а также в других 12 mAb из панели молекул с наилучшими характеристиками (за исключением РМХ070, РМХ075 и РМХ080). Для снижения уязвимости путем предупреждения гликозилирования в этом положении, сиквон NVT в FR1 легкой цепи РМХ003 подвергали мутации с изменением на QVT (РМХ006), AVT (РМХ007), EVT (РМХ008), NVA (РМХ009), SVT (РМХ010) и TVT (РМХ011). Дегликозилирование наблюдали путем сравнения размера легкой цепи мутантных антител с исходным mAb РМХ003 на геле для SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. После этого проводили оценку связывания и функциональных характеристик с целью оценки влияния этих мутаций. Анализ с помощью проточной цитометрии позволил выявить, что связывающая способность с клетками, экспрессирующими CD20 собачьих, оставалась неизмененной, за исключением мутантов QVT и AVT, для которых показатели были несколько снижены (Фиг. 3В). Аналогично, эти мутации не оказывали существенного влияния на эффективность уничтожения в ADCC-анализе in vitro (Фиг. 5D и 5Е) и анализе с использованием цельной крови ex vivo (Фиг. 6С). Следовательно, можно модифицировать мотив NVT для дегликозилирования без ущерба для связывающей и функциональной активности.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PetMedix Ltd

<120> АНТИТЕЛА К CD20 СОБАЧЬИХ

<130> P38561WO1

<150> GB 2108677.2

<151> 2021-06-17

<150> GB 2202635.5

<151> 2022-02-25

<160> 365

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 894

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 1

atgacaacac ccagaaattc aatgagtgga actctcccgg tagatcctat gaaaagccct 60

actgccatgt atcctgttca aaaaataatt cccaaaagga tgccttcagt ggtgggccct 120

acacaaaact tcttcatgag ggaatctaag acactggggg ctgtccagat tatgaatggg 180

ctcttccaca ttgccctagg cagcctcctg atgattcaca cggatgtcta tgcgcccatc 240

tgtataacta tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt tcatcatttc tggatcactc 300

ctggcagcag cggacaaaaa ccccaggaag agtttggtca aaggaaaaat gataatgaac 360

tcattgagcc tctttgctgc tatttctgga ataatttttt tgatcatgga catatttaat 420

attaccattt cccatttttt taaaatggag aatttgaatc ttattaaagc tcccatgcca 480

tatgttgaca tacacaactg tgacccagct aacccctctg agaaaaactc tttatctata 540

caatattgtg gcagcatacg atctgttttc ttgggcgttt ttgctgtgat ggtgatcttt 600

acctttttcc agaaacttgt gacagctggc attgttgaga atgaatggaa aaaactgtgc 660

tctaaaccta aatctgatgt agttgttctg ttagctgctg aagaaaaaaa agaacagccg 720

attgaaacaa cagaagaaat ggttgagctg actgaaatag cttcccaacc aaagaaagaa 780

gaagacattg aaattattcc agtccaagaa gaagaagagg aactggaaat aaactttgca 840

gaacctcccc aggagcagga atcttcacca atagaaaacg acagcatccc ttaa 894

<210> 2

<211> 297

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 2

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Met Ser Gly Thr Leu Pro Val Asp Pro

1 5 10 15

Met Lys Ser Pro Thr Ala Met Tyr Pro Val Gln Lys Ile Ile Pro Lys

20 25 30

Arg Met Pro Ser Val Val Gly Pro Thr Gln Asn Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Ser Leu Leu Met Ile His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Ile Thr Met Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Phe Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Ala Asp Lys Asn Pro Arg Lys Ser Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Ile Ile Phe Leu Ile Met Asp Ile Phe Asn Ile Thr Ile Ser

130 135 140

His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile Lys Ala Pro Met Pro

145 150 155 160

Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg Ser Val Phe Leu Gly

180 185 190

Val Phe Ala Val Met Val Ile Phe Thr Phe Phe Gln Lys Leu Val Thr

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Lys Leu Cys Ser Lys Pro Lys

210 215 220

Ser Asp Val Val Val Leu Leu Ala Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Pro

225 230 235 240

Ile Glu Thr Thr Glu Glu Met Val Glu Leu Thr Glu Ile Ala Ser Gln

245 250 255

Pro Lys Lys Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Val Gln Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Leu Glu Ile Asn Phe Ala Glu Pro Pro Gln Glu Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ile Pro

290 295

<210> 3

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 3

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agctaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaatagtg gtggaagtag cacaacctat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa aacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgttc gacttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 4

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 5

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 5

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaga aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat accaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg gtaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 6

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 6

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Arg Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 7

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr His

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 8

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 9

Ser Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 10

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 11

Tyr Asp Thr

1

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 12

Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

1 5

<210> 13

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 13

gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggaat catcttcagt aactaccaca tgagctgggt ccgccaggtt 120

ccagggaagg gacttcagtg ggtcgcatac attaacagtg gtggaagtac tataaactat 180

gcagacggtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag aggcgaggac acggccgtgt attactgtac gacttatgac 300

tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 14

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Gly Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 15

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 15

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ttaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 16

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 16

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 17

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 17

Gly Ile Ile Phe Ser Asn Tyr His

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 18

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ile

1 5

<210> 19

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 19

Thr Thr Tyr Asp Ser

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 20

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 21

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 21

Tyr Asp Ser

1

<210> 22

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 22

Gln Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

1 5

<210> 23

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 23

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggaat caccttcagt aggtaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcaatg ggtcgcatac attaacagtg gtggaagtag cacaagctat 180

ccagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatgg acagcctgag agccgaggac acggccctgt attactgtac gacctttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 24

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 25

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 25

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaaactgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agcaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 26

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 26

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 27

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 27

Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 28

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 29

Thr Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 30

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 31

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 31

Tyr Asp Ser

1

<210> 32

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 32

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 33

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 33

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggagag ctggtgaagc ctggggggtc cctgagagtt 60

tcctgtgtgg cctctggaat caccttcagt cgctaccaca tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gacttcagtg ggtcgcattc attaacactg atagaagtag cccaaaatat 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccattt attactgtac gagttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcaa 337

<210> 34

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Asn Thr Asp Arg Ser Ser Pro Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 35

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 35

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agtagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 36

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 36

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 37

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 37

Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 38

Ile Asn Thr Asp Arg Ser Ser Pro

1 5

<210> 39

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 39

Thr Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 40

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 40

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 41

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 41

Tyr Asp Ser

1

<210> 42

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 42

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 43

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 43

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aggtaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaacagtg gtggaagtga ctcagactat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtac gagtctggac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 44

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asp Ser Asp Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 45

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 45

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg tcaggtgtgg gacaggagtg gtaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 46

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 46

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Ser Gly Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 47

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 47

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 48

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asp Ser

1 5

<210> 49

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 49

Thr Ser Leu Asp Tyr

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 50

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 51

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 51

Tyr Asp Ser

1

<210> 52

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 52

Gln Val Trp Asp Arg Ser Gly Asn Val

1 5

<210> 53

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 53

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Gln Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 54

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 54

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ala Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 55

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 55

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Glu Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 56

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 56

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Ala Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 57

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 57

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 58

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 58

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Thr Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 59

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 59

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 60

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 60

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Gln Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 61

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 61

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ala Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 62

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 62

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Glu Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 63

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 63

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Ala Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 64

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 64

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 65

<211> 25

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 65

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Thr Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp

20 25

<210> 66

<211> 335

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 66

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys

100 105 110

Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln

145 150 155 160

Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys

195 200 205

Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser

225 230 235 240

Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys

245 250 255

Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln

260 265 270

Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg

290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu

305 310 315 320

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 67

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 67

Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

100 105

<210> 68

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 68

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgac ctggtgaagc ctggcggcag cctgagactg 60

agctgcgtgg caagcggcat caccttcagc agataccaca tgagctgggt gagacaagcc 120

cctggcaagg gcctgcagtg ggtggcctac atcaacagcg gcggcagcag cacaagctac 180

cctgacgccg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatgg acagcctgag agccgaggac accgccctgt actactgcac caccttcgac 300

tactggggcc aaggcaccct ggtgaccgtg agcagcg 337

<210> 69

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 69

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag aacgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggcggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 70

<211> 19

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 70

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 71

<211> 19

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 71

Met Glu Ser Ala Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Gly

<210> 72

<211> 19

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 72

Met Ala Trp Thr His Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Thr Gly

1 5 10 15

Ser Val Ala

<210> 73

<211> 110

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 73

Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp

1 5 10 15

Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln

35 40 45

Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser

65 70 75 80

His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr

85 90 95

Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp

100 105 110

<210> 74

<211> 98

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser

<210> 75

<211> 15

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 75

Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 15

<210> 76

<211> 96

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 76

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala

85 90 95

<210> 77

<211> 12

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 77

Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 78

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 78

atggagtctg cgttcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgcg 60

gtgcagctgg tggagtcagg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggaatcac cttcagtagg taccacatga gttgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacatt aatagtggtg gaagtgccac aagttataca 240

gacgctgtga agggccgatt cagcatctcc agagacaacg gcaaaaacac gctttatctt 300

cagatgaata gcctgagagt cgaggactcg gccgtctatt actgtacgac ccttgacctc 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 79

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 79

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ala Thr Ser Tyr Thr Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 80

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 80

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgatagc cgcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca acggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgtca gatgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 81

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 81

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Met Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 82

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 82

Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 83

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 83

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ala Thr

1 5

<210> 84

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 84

Thr Thr Leu Asp Leu

1 5

<210> 85

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 85

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 86

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 86

Tyr Asp Ser

1

<210> 87

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 87

Gln Met Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 88

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 88

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

atacaactgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggattcac cttcagtcgc taccacatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatatatt aacactggtg gaagtaacac aaactatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtacgac ccttgactcc 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 89

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 89

Glu Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Thr Gly Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 90

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 90

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc attcaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtat tgattatcta ttatgatagt agaaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agtagtgtta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 91

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 91

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Phe Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 92

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 92

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 93

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 93

Ile Asn Thr Gly Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 94

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 94

Thr Thr Leu Asp Ser

1 5

<210> 95

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 95

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 96

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 96

Tyr Asp Ser

1

<210> 97

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 97

Gln Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

1 5

<210> 98

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 98

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgaa 60

ctacagctgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ccggattcac cttcagtaga tactacttga actgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcattcatt accagtggtg gcagtagcac aaactatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac actgtatctt 300

cagatgaata gcctgagagc cgaggacacg gccgtttatt actgtacgag cttcgactcc 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 99

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 99

Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 100

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 100

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac taattatcta ttatgatagc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 101

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 101

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 102

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 102

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 103

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 103

Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 104

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 104

Thr Ser Phe Asp Ser

1 5

<210> 105

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 105

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 106

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 106

Tyr Asp Ser

1

<210> 107

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 107

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 108

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 108

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

atgcagctgg tggaatctgg gggagccctg gtgaagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgtggcct ctggattcac ctttaggaga taccacatga gttgggtccg ccaggctcca 180

ggacaggggc ttcagtgggt cgcatacatt gacagtgatg gaagtcctac aagttatgga 240

gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaatac gctatttctt 300

cagatgaaca gtctgagagt cgacgacacg gccgtatatt actgtacgac tcttgactac 360

tggggccggg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 109

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 109

Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 110

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 110

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacaggtgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aggtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctctac tgattatcta ttatgatacc aggaggccga cagggatccc tgagcgcttc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcagggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtggta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcatcg 376

<210> 111

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 111

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Val Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Leu Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Ile

100 105

<210> 112

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 112

Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr His

1 5

<210> 113

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 113

Ile Asp Ser Asp Gly Ser Pro Thr

1 5

<210> 114

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 114

Thr Thr Leu Asp Tyr

1 5

<210> 115

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 115

Asn Ile Gly Gly Lys Ser

1 5

<210> 116

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 116

Tyr Asp Thr

1

<210> 117

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 117

Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

1 5

<210> 118

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 118

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

atgcaactgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggattcac cttcagtcgc taccacatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacatt aatagtggtg gaagtcccac aaactatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac actatatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtacgac ctacgaccag 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 119

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 119

Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Pro Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 120

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 120

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaagt gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgatagc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac accagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 121

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 121

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 122

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 122

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 123

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 123

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Pro Thr

1 5

<210> 124

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 124

Thr Thr Tyr Asp Gln

1 5

<210> 125

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 125

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 126

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 126

Tyr Asp Ser

1

<210> 127

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 127

Gln Val Trp Asp Thr Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 128

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 128

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcacctgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggaatcac cttcaataga tattatatga actgggtccg ccagactcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacata gacagtggtg gaagtcccac aacctatgca 240

gacgctgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gttgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtacgag ttttgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 129

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 129

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Asn Arg Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 130

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 130

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctatac tgattatcta ttatgatacc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 131

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 131

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 132

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 132

Gly Ile Thr Phe Asn Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 133

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 133

Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Thr

1 5

<210> 134

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 134

Thr Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 135

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 135

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 136

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 136

Tyr Asp Thr

1

<210> 137

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 137

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 138

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 138

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggattcac cttcagtagg taccacatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcattcatt aacactggta gaagtagcac aaactatgca 240

gacgctgtgg cgggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgttcgac cctcgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 139

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 139

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Asn Thr Gly Arg Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Ala Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 140

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 140

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgatagc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 141

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 141

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 142

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 142

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 143

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 143

Ile Asn Thr Gly Arg Ser Ser Thr

1 5

<210> 144

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 144

Ser Thr Leu Asp Tyr

1 5

<210> 145

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 145

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 146

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 146

Tyr Asp Ser

1

<210> 147

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 147

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 148

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 148

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgaa 60

gtacagctgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ccggattcac cttcagtaga tactacatga actgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcattcatt accagtggtg gaagtagcac aagctatgga 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtacgag cttcgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 149

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 149

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Gly Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 150

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 150

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgctagc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 151

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 151

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Ala Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 152

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 152

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 153

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 153

Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 154

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 154

Thr Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 155

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 155

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 156

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 156

Tyr Ala Ser

1

<210> 157

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 157

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 158

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 158

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcattattt taaaaggtgt ccagggcgag 60

gtgcagttgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggattcac cttcagtagg tattacatga cctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacatt aacagtgata gaagaagcac aacctatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaaaaacac gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtacgac ccttgaatat 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 159

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 159

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Asp Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 160

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 160

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggctc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgatagc cgcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca acggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 161

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 161

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 162

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 162

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 163

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 163

Ile Asn Ser Asp Arg Arg Ser Thr

1 5

<210> 164

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 164

Thr Thr Leu Glu Tyr

1 5

<210> 165

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 165

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 166

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 166

Tyr Asp Ser

1

<210> 167

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 167

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 168

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 168

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcagttgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagccgg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ccggaatcac cttcagtaga tatcacatga gctgggtccg ccaggctccg 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcattcatt aacactggta gaagtagcac aaactatgcg 240

gacgctgtgg cgggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctt 300

caaatgaacg gcctgacagt cgaggacacg gccgtgtatt actgttcgac cctcgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 169

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 169

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Asn Thr Gly Arg Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Ala Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 170

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 170

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacagattc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaagt gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctatac tgattatcta ttatgataac aacaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca cgtgtgggac agcagtgtta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 171

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 171

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 172

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 172

Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 173

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 173

Ile Asn Thr Gly Arg Ser Ser Thr

1 5

<210> 174

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 174

Ser Thr Leu Asp Tyr

1 5

<210> 175

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 175

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 176

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 176

Tyr Asp Asn

1

<210> 177

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 177

His Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

1 5

<210> 178

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 178

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgaa 60

gttcaactgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggaatcac cttcagtagg tactacatga actgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacatt gacagtggtg gaagtcccac aacctatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaaagc gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtacgag ttttgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 179

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 179

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 180

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 180

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtcctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgatagc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact atttctgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 181

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 181

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 182

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 182

Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 183

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 183

Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Thr

1 5

<210> 184

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 184

Thr Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 185

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 185

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 186

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 186

Tyr Asp Ser

1

<210> 187

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 187

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 188

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 188

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggaatcac cttcagtaga tattatatga actgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacata aacagtggtg gaagtcccac aacctatgca 240

gacgctgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gttgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtacgag ttttgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 189

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 189

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Pro Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 190

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 190

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctatac tgattatcta ttatgatacc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 191

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 191

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 192

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 192

Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 193

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 193

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Pro Thr

1 5

<210> 194

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 194

Thr Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 195

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 195

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 196

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 196

Tyr Asp Thr

1

<210> 197

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 197

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 198

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 198

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcacaattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcaactgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggactcac cttcagtagg taccacatga gctggatccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatacatt agcagtggtg gaagtagcac aaactatgca 240

ggctctgtga agggccgatt caccgtctcc agagacaacg ccaagaacac tctgtatctt 300

cagatgaaca gtctgagagc cgaagacacg gccgtctatt actgtacgag tcttgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 199

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 199

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 200

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 200

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtac tgattatcta ttatgatagt aggaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtgata atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 201

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 201

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Asp Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 202

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 202

Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 203

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 203

Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 204

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 204

Thr Ser Leu Asp Tyr

1 5

<210> 205

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 205

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 206

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 206

Tyr Asp Ser

1

<210> 207

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 207

Gln Val Trp Asp Ser Ser Asp Asn Val

1 5

<210> 208

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 208

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagccgg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggactcac cttcagtaga taccacatga gttgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcattcatt aacagtggta gaagtgacac aacctatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtttatt actgtacgac ttttgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 209

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 209

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Asn Ser Gly Arg Ser Asp Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 210

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 210

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggtta tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgcac tgattatcta ttatgatagc agcaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agtagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 211

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 211

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ala Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 212

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 212

Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr His

1 5

<210> 213

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 213

Ile Asn Ser Gly Arg Ser Asp Thr

1 5

<210> 214

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 214

Thr Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 215

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 215

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 216

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 216

Tyr Asp Ser

1

<210> 217

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 217

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 218

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 218

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctc gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcagttgg tggagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggattaac cttcagtaga tattacatga actgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcatatatt gatagtggtg gaagtcccac aaactatgca 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac actgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt attgttcgag ttttgactac 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 219

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 219

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 220

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 220

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtggtga cacagctgcc atccaatact gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctgtgc tgattatcta ttatgatagc aggaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agtagtgcta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 221

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 221

Ser Tyr Val Val Thr Gln Leu Pro Ser Asn Thr Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 222

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 222

Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 223

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 223

Ile Asp Ser Gly Gly Ser Pro Thr

1 5

<210> 224

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 224

Ser Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 225

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 225

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 226

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 226

Tyr Asp Ser

1

<210> 227

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 227

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

1 5

<210> 228

<211> 394

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 228

atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg gggagacctg gtgaagcctg gggggtccct gagactttcc 120

tgtgtggcct ctggatacac cttcactagg tatcacatga gttgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc ttcagtgggt cgcattcatt aatagtgatg gaactggtat aacctatgga 240

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac gctgtatctt 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccatctatt actgtacgac ttttgactcc 360

tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 394

<210> 229

<211> 112

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 229

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Asn Ser Asp Gly Thr Gly Ile Thr Tyr Gly Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 230

<211> 376

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 230

atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60

tatgtgctga cacagctgcc atccaaaaat gtgaccctga agcagccggc ccacatcacc 120

tgtgggggag acaacattgg aagtaaaagt gttcactggt accagcagaa gctgggccag 180

gcccctatac tgattatcta ttatgatagc aggaggccga cagggatccc tgagcgattc 240

tccggcgcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcggggccct ggccgaggac 300

gaggctgact attactgcca ggtgtgggac agcagtggta atgtgttcgg cggaggcacc 360

catctgaccg tcctcg 376

<210> 231

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 231

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 232

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 232

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr His

1 5

<210> 233

<211> 8

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 233

Ile Asn Ser Asp Gly Thr Gly Ile

1 5

<210> 234

<211> 5

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 234

Thr Thr Phe Asp Ser

1 5

<210> 235

<211> 6

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 235

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 236

<211> 3

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 236

Tyr Asp Ser

1

<210> 237

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 237

Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

1 5

<210> 238

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 238

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Met Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 239

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 239

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Phe Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Val Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 240

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 240

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 241

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 241

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Val Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Leu Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Ile

100 105

<210> 242

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 242

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 243

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 243

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 244

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 244

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Ala Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 245

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 245

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 246

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 246

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 247

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 247

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 248

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 248

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Asp Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 249

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 249

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ala Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 250

<211> 106

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 250

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Gly Asn Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 251

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 251

gcggtgcagc tggtggagtc agggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggaat caccttcagt aggtaccaca tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaatagtg gtggaagtgc cacaagttat 180

acagacgctg tgaagggccg attcagcatc tccagagaca acggcaaaaa cacgctttat 240

cttcagatga atagcctgag agtcgaggac tcggccgtct attactgtac gacccttgac 300

ctctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 252

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 252

gagatacaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt cgctaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatat attaacactg gtggaagtaa cacaaactat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac gacccttgac 300

tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 253

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 253

gaactacagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctccggatt caccttcagt agatactact tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcattc attaccagtg gtggcagtag cacaaactat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacactgtat 240

cttcagatga atagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtac gagcttcgac 300

tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 254

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 254

gagatgcagc tggtggaatc tgggggagcc ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtgg cctctggatt cacctttagg agataccaca tgagttgggt ccgccaggct 120

ccaggacagg ggcttcagtg ggtcgcatac attgacagtg atggaagtcc tacaagttat 180

ggagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacgctattt 240

cttcagatga acagtctgag agtcgacgac acggccgtat attactgtac gactcttgac 300

tactggggcc ggggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 255

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 255

gagatgcaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt cgctaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaatagtg gtggaagtcc cacaaactat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacactatat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac gacctacgac 300

cagtggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 256

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 256

gaggtgcacc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggaat caccttcaat agatattata tgaactgggt ccgccagact 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac atagacagtg gtggaagtcc cacaacctat 180

gcagacgctg taaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgttgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gagttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 257

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 257

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aggtaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcattc attaacactg gtagaagtag cacaaactat 180

gcagacgctg tggcgggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgttc gaccctcgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 258

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 258

gaagtacagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctccggatt caccttcagt agatactaca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcattc attaccagtg gtggaagtag cacaagctat 180

ggagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac gagcttcgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 259

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 259

gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aggtattaca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaacagtg atagaagaag cacaacctat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaaaaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gacccttgaa 300

tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 260

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 260

gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc cgggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctccggaat caccttcagt agatatcaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccggggaagg ggcttcagtg ggtcgcattc attaacactg gtagaagtag cacaaactat 180

gcggacgctg tggcgggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcaaatga acggcctgac agtcgaggac acggccgtgt attactgttc gaccctcgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 261

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 261

gaagttcaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggaat caccttcagt aggtactaca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attgacagtg gtggaagtcc cacaacctat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa agcgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gagttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 262

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 262

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggaat caccttcagt agatattata tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac ataaacagtg gtggaagtcc cacaacctat 180

gcagacgctg taaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgttgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtac gagttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 263

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 263

gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggact caccttcagt aggtaccaca tgagctggat ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attagcagtg gtggaagtag cacaaactat 180

gcaggctctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa cactctgtat 240

cttcagatga acagtctgag agccgaagac acggccgtct attactgtac gagtcttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 264

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 264

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc cgggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggact caccttcagt agataccaca tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcattc attaacagtg gtagaagtga cacaacctat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtac gacttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 265

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 265

gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggatt aaccttcagt agatattaca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatat attgatagtg gtggaagtcc cacaaactat 180

gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacactgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attattgttc gagttttgac 300

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 266

<211> 337

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 266

gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60

tcctgtgtgg cctctggata caccttcact aggtatcaca tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcattc attaatagtg atggaactgg tataacctat 180

ggagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacgctgtat 240

cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccatct attactgtac gacttttgac 300

tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcag 337

<210> 267

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 267

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agccgcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcaacggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg tcagatgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 268

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 268

tcctatgtgc tgacacagct gccattcaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tattgattat ctattatgat agtagaaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagtagtg ttaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 269

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 269

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactaattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 270

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 270

tcctatgtgc tgacacaggt gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaggtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctc tactgattat ctattatgat accaggaggc cgacagggat ccctgagcgc 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcagggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg gtaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcatcg 319

<210> 271

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 271

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa agtgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacaccagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 272

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 272

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggccccta tactgattat ctattatgat accagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 273

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 273

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 274

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 274

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgct agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 275

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 275

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agccgcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcaacggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 276

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 276

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa agtgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggccccta tactgattat ctattatgat aacaacaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccacgtgtgg gacagcagtg ttaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 277

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 277

tcctatgtcc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actatttctg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 278

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 278

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggccccta tactgattat ctattatgat accagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 279

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 279

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tactgattat ctattatgat agtaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ataatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 280

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 280

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg cactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagtagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 281

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 281

tcctatgtgg tgacacagct gccatccaat actgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggcccctg tgctgattat ctattatgat agcaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagtagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 282

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 282

tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60

acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120

caggccccta tactgattat ctattatgat agcaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180

ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240

gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg gtaatgtgtt cggcggaggc 300

acccatctga ccgtcctcg 319

<210> 283

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 283

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag caagtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 284

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 284

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag gccgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 285

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 285

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaaa gaggtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 286

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 286

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag aacgtggccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 287

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 287

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag tccgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 288

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 288

agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag accgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60

acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120

caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240

gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300

acccacctga ccgtgctgg 319

<210> 289

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 289

tcttacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccaggcggc ccaccggaat ccctgagagg 180

ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tcaacggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcagatgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 290

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 290

tcctacgtgc tgacacagct gccattcaag agcgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggctctaag tccgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tctaggcggc ccaccggcat ccctgagagg 180

ttcagcggcg ccaactctgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg tgaacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 291

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 291

agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 292

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 292

tcctacgtgc tgacacaggt gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggaggcaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccc tgctgatcat ctactatgat acaaggcggc ccaccggcat ccctgagaga 180

ttcagcggcg ccaactctgg caataccgct acactgacca tctctcgcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg gaaacgtgtt cggaggagga 300

acacacctga ccgtgatcg 319

<210> 293

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 293

tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctccca tcctgatcat ctactatgat acatctaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctccggag ctaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 294

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 294

agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 295

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 295

agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctggga 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgct tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gattcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 296

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 296

tcttacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccaggcggc ccaccggaat ccctgagagg 180

ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tcaacggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 297

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 297

agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attacttctg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 298

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 298

tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctccca tcctgatcat ctactatgat acatctaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctccggag ctaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 299

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 299

tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tctaggcggc ccaccggcat ccctgagagg 180

ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg ataacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 300

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 300

agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctggga 120

caggctcccg ctctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180

ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 301

<211> 319

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 301

tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60

acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120

caggctccca tcctgatcat ctactatgat tctaggcggc ccaccggcat ccctgagagg 180

ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240

gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg gaaacgtgtt cggaggagga 300

acacacctga ccgtgctgg 319

<210> 302

<211> 19

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 302

Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile Lys

1 5 10 15

Ala Pro Met

<210> 303

<211> 10

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 303

Glu Asn Leu Asn Leu Ile Lys Ala Pro Met

1 5 10

<210> 304

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 304

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 305

<211> 50

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 305

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 306

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 306

Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 307

<211> 50

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 307

Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile

1 5 10 15

Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln

35 40 45

Ser Leu

50

<210> 308

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 308

Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 309

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 309

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 310

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH03

<400> 310

Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 311

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH04

<400> 311

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 312

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH05

<400> 312

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Arg Ala His Thr Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 313

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH06

<400> 313

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 314

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH07

<400> 314

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Glu Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 315

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH08

<400> 315

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 316

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DH09

<400> 316

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln

35 40 45

Ser Leu

50

<210> 317

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 317

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 318

<211> 50

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 318

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 319

<211> 9

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 319

Pro Thr Gly Val Phe Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 320

<211> 50

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 320

Asn Met Thr Leu Ser His Phe Leu Lys Met Arg Arg Leu Glu Leu Ile

1 5 10 15

Gln Thr Ser Lys Pro Tyr Val Asp Ile Tyr Asp Cys Glu Pro Ser Asn

20 25 30

Ser Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Asn Ser Ile Gln

35 40 45

Ser Val

50

<210> 321

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM01

<400> 321

Pro Thr Gly Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 322

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM02

<400> 322

His Thr Asp Val Phe Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 323

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM03

<400> 323

Asn Met Thr Leu Ser His Phe Leu Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 324

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM04

<400> 324

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Arg Arg Leu Glu Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 325

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM05

<400> 325

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Gln Thr Ser Lys Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 326

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM06

<400> 326

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile Tyr Asp Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 327

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM07

<400> 327

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Glu Pro Ser Asn

20 25 30

Ser Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 328

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM08

<400> 328

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 329

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DM09

<400> 329

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Asn Ser Ile Gln

35 40 45

Ser Val

50

<210> 330

<211> 9

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 330

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 331

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S01

<400> 331

Ala Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 332

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S02

<400> 332

His Ala Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 333

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S03

<400> 333

His Thr Ala Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 334

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S04

<400> 334

His Thr Asp Ala Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 335

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S05

<400> 335

His Thr Asp Val Ala Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 336

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S06

<400> 336

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys

1 5

<210> 337

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S07

<400> 337

His Thr Asp Val Tyr Ala Ala Ile Cys

1 5

<210> 338

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S08

<400> 338

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ala Cys

1 5

<210> 339

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> S09

<400> 339

His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Ala

1 5

<210> 340

<211> 50

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 340

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 341

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L01

<400> 341

Ala Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 342

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L02

<400> 342

Asn Ile Ala Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 343

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L03

<400> 343

Asn Ile Thr Ile Ala His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 344

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L04

<400> 344

Asn Ile Thr Ile Ser His Ala Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 345

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L05

<400> 345

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Ala Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 346

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L06

<400> 346

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Ala Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 347

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L07

<400> 347

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Ala Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 348

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L08

<400> 348

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Ala Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 349

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L09

<400> 349

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Ala Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 350

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L10

<400> 350

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Ala Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 351

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L11

<400> 351

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Ala Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 352

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L12

<400> 352

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Ala Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 353

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L13

<400> 353

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ala His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 354

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L14

<400> 354

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Ala Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 355

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L15

<400> 355

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Ala Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 356

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L16

<400> 356

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 357

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L17

<400> 357

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Ala Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 358

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L18

<400> 358

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Ala Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 359

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L19

<400> 359

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Ala Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 360

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L20

<400> 360

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Ala Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 361

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L21

<400> 361

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ala Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 362

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L22

<400> 362

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Ala Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 363

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L23

<400> 363

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Ala Ser Ile Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 364

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L24

<400> 364

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ala Arg

35 40 45

Ser Val

50

<210> 365

<211> 50

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L25

<400> 365

Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile

1 5 10 15

Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg

35 40 45

Ala Val

50

<---

Claims

1. Выделенное антитело собачьих или его антигенсвязывающая часть, специфически связывающие CD20 собачьих, причем указанное антитело или его антигенсвязывающая часть имеют одну из следующих совокупностей CDR:

i) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 7, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 8, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 9, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 10, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 11, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 12,

ii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 17, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 18, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 19, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID NO: 20, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 21, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 22,

iii) последовательность CDR1 HC, содержащую SEQ ID NO: 37, последовательность CDR2 HC, содержащую SEQ ID NO: 38, последовательность CDR3 HC, содержащую SEQ ID NO: 39, последовательность CDR1 LC, содержащую SEQ ID NO: 40, последовательность CDR2 LC, содержащую SEQ ID NO: 41, и последовательность CDR3 LC, содержащую SEQ ID NO: 42,

iv) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 47, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 48, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 49, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 50, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 51, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 52,

v) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 82, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 83, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 84, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 85, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 86, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 87,

vi) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 92, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 93, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 94, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 95, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 96, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 97,

vii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 102, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 103, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 104, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 105, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 106, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 107,

viii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 112, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 113, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 114, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 115, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 116, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 117,

ix) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 122, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 123, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 124, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 125, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 126, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 127,

x) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 132, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 133, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 134, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 135, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 136, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 137,

xi) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 142, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 143, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 144, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 145, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 146, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 147,

xii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 152, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 153, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 154, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 155, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 156, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 157,

xiii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 162, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 163, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 164, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 165, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 166, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 167,

xiv) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 172, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 173, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 174, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 175, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 176, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 177,

xv) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 182, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 183, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 184, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 185, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 186, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 187,

xvi) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 192, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 193, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 194, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 195, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 196, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 197,

xvii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 202, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 203, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 204, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 205, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 206, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 207,

xviii) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 212, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 213, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 214, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 215, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 216, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 217,

xix) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 222, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 223, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 224, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 225, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 226, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 227, или

xx) последовательность CDR1 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 232, последовательность CDR2 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 233, последовательность CDR3 HC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 234, последовательность CDR1 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 235, последовательность CDR2 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 236, и последовательность CDR3 LC, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 237.

2. Антитело или его антигенсвязывающая часть по предшествующему пункту, отличающиеся тем, что они содержат последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 24, или последовательность с по меньшей мере 75%, 80%, 85% или 90% идентичностью последовательностей с ней, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 26, или последовательность с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательностей с ней, например, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57 или 58.

3. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 2, отличающиеся тем, что они имеют

a) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 4, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 6;

b) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 14, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 16;

c) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 34, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 36;

d) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 44, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 46;

e) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 79, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 81, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 238;

f) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 89, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 91, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 239;

g) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 99, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 101, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 240;

h) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 109, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 111, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 241;

i) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 119, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 121;

j) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 129, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 131, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 242;

k) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 139, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 141, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 243;

l) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 149, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 151, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 244;

m) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 159, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 161, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 245;

n) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 169, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 171;

o) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 179, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 181, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 246;

p) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 189, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 191, или последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 247;

q) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 199, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 201, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 248;

r) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 209, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 211, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 249;

s) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 219, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 221; или

t) последовательность вариабельной области HC, содержащую SEQ ID NO: 229, и последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 231, последовательность вариабельной области LC, содержащую SEQ ID NO: 250.

4. Антитело или его антигенсвязывающая часть по предшествующему пункту, отличающиеся тем, что антигенсвязывающая часть представляет собой scFv или Fv.

5. Конъюгат, специфически связывающий CD20 собачьих, содержащий антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из предшествующих пунктов, где указанные антитело или его антигенсвязывающая часть конъюгированы с терапевтическим компонентом.

6. Конъюгат по п. 5, отличающийся тем, что указанный терапевтический компонент представляет собой второе антитело или его антигенсвязывающую часть.

7. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что указанное второе антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с отличающейся мишенью.

8. Конъюгат по предшествующему пункту, отличающийся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающая часть конъюгированы с дополнительным компонентом, выбранным из компонента, увеличивающего период полувыведения, метки, цитотоксина, липосомы, наночастицы или радиоизотопа.

9. Конъюгат по предшествующему пункту, отличающийся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающая часть являются a-фукозилированными.

10. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, опосредованного B-клетками, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-4.

11. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп. 1-4 или фармацевтическая композиция по п. 10 для использования в лечении заболевания.

12. Способ лечения состояния, опосредованного B-клетками, у нуждающегося в этом субъекта, являющегося представителем собачьих, включающий введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-4 или фармацевтической композиции по п. 10.

13. Антитело или его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция по п. 11, отличающиеся тем, что заболевание представляет собой заболевание, опосредованное B-клетками, например, B-клеточную лимфому, лейкоз или иммуноопосредованное заболевание.

14. Антитело или его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция по п. 11 или 13, дополнительно включающие отдельное введение субъекту другого терапевтического средства.

15. Антитело или его антигенсвязывающая часть или фармацевтическая композиция по п. 14, отличающиеся тем, что терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое средство или радиотоксичное средство, иммунодепрессант или иммуномодулирующее средство, такое как цитокин или хемокин.

16. Способ по п. 12, отличающиеся тем, что заболевание представляет собой заболевание, опосредованное B-клетками, например, B-клеточную лимфому, лейкоз или иммуноопосредованное заболевание.

17. Способ по п. 12 или 16, дополнительно включающий отдельное введение субъекту другого терапевтического средства.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое средство или радиотоксичное средство, иммунодепрессант или иммуномодулирующее средство, такое как цитокин или хемокин.

19. Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-4.

20. Нуклеиновая кислота по п. 19, содержащая последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 5, 13, 15, 23, 25, 33, 35, 43, 45, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118, 120, 128, 130, 138, 140, 148, 150, 158, 160, 168, 170, 178, 180, 188, 190, 198, 200, 208, 210, 218, 220, 228, 230, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270,271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 или 301.

21. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 19, 20.

22. Клетка-хозяин для продуцирования антитела, специфически связывающего CD20 собачьих, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 19, 20 или вектор по п. 21.

23. Набор для лечения или предупреждения состояния, опосредованного В-клетками, содержащий антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-4 или фармацевтическую композицию по п. 10 и инструкции по применению.

24. Набор для диагностики состояния, опосредованного В-клетками, содержащий антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-4 и материал для содействия выявлению белка CD20.

25. Набор по п. 24, дополнительно содержащий реагент для выявления антитела или его антигенсвязывающей части.

26. Способ получения антитела собачьих, которое связывает CD20, включающий культивирование выделенной клетки-хозяина по п. 22 и извлечение указанного антитела.

27. Способ выявления белка CD20 или внеклеточного домена белка CD20 в биологическом образце от субъекта, являющегося представителем собачьих, включающий приведение биологического образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп. 1-4, причем указанное антитело или его антигенсвязывающая часть связаны с выявляемой меткой.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой биоптат, образец ткани, крови, сыворотки крови, плазмы крови или лимфатической жидкости.

29. Способ ингибирования роста опухоли или метастазирования, включающий приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-4 или фармацевтической композиции по п. 10.

30. Способ уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CD20, включающий приведение клетки в контакт с антителом по любому из пп. 1-4 или фармацевтической композицией по п. 10, вследствие чего происходит уничтожение клетки, экспрессирующей CD20.

31. Способ по п. 29, отличающийся тем, что опухолевая клетка представляет собой опухолевую клетку собачьих.