RU2838680C1 - Антитела против рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR1) человека - Google Patents
Антитела против рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR1) человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2838680C1 RU2838680C1 RU2023135666A RU2023135666A RU2838680C1 RU 2838680 C1 RU2838680 C1 RU 2838680C1 RU 2023135666 A RU2023135666 A RU 2023135666A RU 2023135666 A RU2023135666 A RU 2023135666A RU 2838680 C1 RU2838680 C1 RU 2838680C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- tshk14
- vegfr
- Prior art date
Links
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 title abstract description 32
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 title abstract 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 12
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 6
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 6
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101000851017 Mus musculus Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000005658 nuclear physics Effects 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000408710 Hansa Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии. Предложено моноклональное антитело, специфически связывающееся с рецептором фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR-1) человека с высокой аффинностью. Изобретение обеспечивает подавление роста опухолевых клеток кишечника и возможность использования антител в доклинических исследованиях для лечения рака кишечника человека. 5 ил., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к моноклональным антителам, способным специфически связываться с рецептором фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR-1) человека, а именно к мышиным моноклональном антителам против VEGFR-1.
Моноклональные антитела (МАТ) к VEGFR-1 представляют собой перспективный класс биологически активных веществ, выступающих в качестве эффективных инструментов в лечении различных заболеваний, особенно онкологических, благодаря своей способности регулировать сигнальные пути, вовлеченные в ангиогенез и иммунный ответ.
VEGFR-1 играет критическую роль в опухоль-ассоциированном ангиогенезе, обнаруживается на поверхности самих опухолевых клеток и других клеток опухолевого микроокружения [Melincovici C.S., А.В., S., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - key factor in normal and pathological angiogenesis. Rom J Morphol Embryol. 2018. V. 59. №2. R 455]. Экспрессия VEGFR-1 в опухолевых клетках и сосудистой ткани сопряжена с негативным прогнозом для пациентов, что подчеркивает важность воздействия на данный рецептор с помощью новых терапевтических стратегий. Блокирование данного рецептора приводит к подавлению пролиферации и усилению апоптоза опухолевых клеток, уменьшению васкуляризации опухоли, ингибированию выработки иммуносупрессивных цитокинов опухоль-ассоциированными макрофагами, подавлению инвазии и метастазирования опухоли [Mabeta P, Steenkamp V. The VEGF/VEGFR Axis Revisited: Implications for Cancer Therapy. Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. №24. P. 15585. DOI: 10.3390/ijms232415585].
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является расширение спектра моноклональных антител, против VEGFR-1.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание нового моноклонального антитела мыши против рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR1), которое специфически и с высокой аффинностью (Kd=4.02⋅10-12 М) связывается с VEGFR-1 человека, обеспечивая подавление роста опухолевых клеток кишечника.
Поставленная задача решается созданием моноклонального антитела мыши способного специфически связываться с рецептором фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR-1) человека, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1, вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 и гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей с последовательностями SEQ ID NO: 3-8.
В настоящем изобретении технический результат достигался получением нового моноклонального мышиного антитела (МАТ) ТШК14, распознающего VEGFR-1 человека, связанного с мембраной опухолевой клетки, при этом также обладающего специфичностью к VEGFR-1 мыши, что позволяет использовать его в доклинических исследованиях. При этом, полученное антитело изотипа IgG2a связывается с опухолевыми клетками человека, имеет высокую аффинность (KD==4.02⋅10-12 М) к VEGFR-1, а также обладает выраженным противоопухолевым эффектом в опытах на клеточных и животных моделях.
Способ получения антител
Технология получения мышиных антител включала в себя иммунизацию мышей антигеном рекомбинантного белка VEGFR-1 человека, получение и отбор позитивных гибридомных клонов - продуцентов моноклональных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), наработку антител в асцитах мышей, выделение и очистку антител на белок А-сефарозе и разноплановые исследования полученных антител. Нуклеотидные последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей полученного мышиного моноклонального антитела были изучены с помощью генетического секвенирования.
Заявленное изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
- на Фиг. 1 показаны результаты электрофореза моноклонального антитела ТШК14., где А - не восстанавливающие условия, Б - восстанавливающие условия, 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 - моноклональное антитело ТШК14;
- на Фиг. 2 показаны результаты иммуноферментного анализа (ИФА) моноклонального антитела ТШК14 к антигену-мишени VEGFR-1 человека (А) и мыши (Б);
- на Фиг. 3 показаны данные проточной цитометрии при визуализации VEGFR-1 с помощью МАТ ТШК14 и коммерческими МАТ (#BF0131 FLT1 Antibody) на поверхности клеток линий рака кишечника человека Hutu-80 (А) и LoVo (Б);
- на Фиг. 4 представлен анализ пролиферативной активности клеток линий рака кишечника человека Hutu-80 (А) и рака кишечника мыши СТ-26 (Б) при инкубации в присутствии МАТ ТШК14 к VEGFR-1 человека в концентрациях 0 мг/мл (контроль) и 0,8 мг/мл (ТШК14);
- на Фиг. 5 представлены результаты измерений размеров опухолевого узла (А) и кривые выживаемости животных (Б) после прививки клеток аденокарциномы мыши СТ-26 при применении МАТ ТШК14 в качестве терапевтического средства:
Группа 1 - мыши после введения клеток аденокарциномы мыши СТ-26;
Группа 2 - мыши после введения клеток аденокарциномы мыши СТ-26 и терапии МАТ ТШК14 в количестве 1,0 мг/мышь;
Группа 3 - мыши после введения клеток аденокарциномы мыши СТ-26 и терапии МАТ ТШК14 в количестве 3,5 мг/мышь.
Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами.
Пример 1.1. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела мыши к белку VEGFR-1 человека.
На первом этапе была проведена иммунизация шести мышей Balb/c препаратом рекомбинантного VEGFR-1 человека (Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, RPB818Hu01, Cloud-Clone Corp.). Мыши иммунизировались в апоневроз задних конечностей в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Для иммунизации раствор препарата смешивали с равным объемом ПАФ (100 мкл/мышь) из расчета 20 мкг антигена на мышь. Через 2 недели после первой иммунизации все мыши были повторно иммунизированы раствором препарата рекомбинантного VEGFR-1 человека в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (1:1), в объеме 100 мкл/мышь, в апоневроз задних конечностей, из расчета 20 мкг антигена на мышь. На четвертый день после последней иммунизации у наркотизированных и умерщвленных животных забирали лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов для гибридизации с миеломой SP2/0. Полученные лимфоциты смешивали с клетками миеломы в соотношении 1:1. Гибридизацию проводили по методу Мильштейна-Келлера [Kohler G. and Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature, 1975, 256 (5517): 495-497] инкубацией клеток в 50% растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) (молекулярная масса 1500 Да) в течение 1,5 мин, после чего к суспензии последовательно с интервалом 1 мин добавляли среду RPMI-1640 объемами, равными первоначальному объему раствора ПЭГ. После гибридизации клетки дважды отмывали культуральной средой и высевали в 96-луночные культуральные планшеты с суточными перитонеальными макрофагами, вносили гибридные клетки в количестве 1,5×105 клеток на лунку. Селекцию гибридов проводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 104 М гипоксантина, 4×10-7 М аминоптерина и 1,6×10-5М тимидина. Итого в гибридизации были использованы 50 млн. лимфоцитов и 50 млн. клеток SP2/0, которые после гибридизации рассевали на 10 плат. Через 10 дней платы исследовали под микроскопом. В платах с гибридными клетками было от 1 до 4 клонов, поэтому платы скринировали целиком. Скрининг позитивных клонов, секретирующих моноклональные антитела (МАТ) проводили методом непрямого твердофазного иммунноферментного анализа (ИФА), регистрируя связывание антител с антигеном, иммобилизованным в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью. Для иммобилизации антигена в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили антиген VEGFR-1 (Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, RPB818Hu01, Cloud-Clone Corp.) в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный на 0,01 М карбонатном буферном растворе, рН 9,6 в объеме 100 мкл (Буфер А) и выдерживали при комнатной температуре в течение 16 ч. Лунки планшета отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и вносили в них супернатант культуральной жидкости гибридных клеток в объеме 50 мкл и 100 мкл ЗФР-Т. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч. После этого лунки планшета трижды отмывали раствором ЗФР-Т и добавляли в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч, затем пятикратно отмывали раствором ЗФР-Т, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). Клоны клеток, продуцирующие моноклональные антитела к препарату рекомбинантного VEGFR-1 человека, отбирали на основании положительной иммуноферментной реакции, которая проявлялась в виде окрашивания продукта хромогена - ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Планшеты сканировали на планшетном ридере, измеряя поглощение при 450 нм.
Отобранные положительные клоны многократно клонировали методом конечных разбавлений с отбором наиболее продуктивных и стабильных клонов. Клетки высевали в ячейки планшетов, содержащие перитонеальные макрофаги нормальных мышей (фидер), в концентрациях приблизительно 2 клетки на ячейку с тем расчетом, чтобы в большинстве ячеек вырос единственный клон. Полученные одиночные клоны скринировали посредством ИФА, алгоритм проведения скрининга был аналогичным алгоритму первичного скринига клонов. Если все клоны каждого типа антител оказывались положительными, то клетки любого положительного клона нарабатывали в культуральных флаконах путем культивирования при температуре плюс 370С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. В качестве среды для культивирования использовали RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводили до получения необходимого количества клеток для введения в мышей (с целью наработки антител в асцитах) и для криоконсервации, из расчета 2 млн на мышьи 5 млн на ампулу. На 10 день после посева на клонирование платы с клетками клонов исследовали под микроскопом и отмечали лунки, в которых присутствовал только один клон. Культуральные жидкости одиночных клонов отбирали для анализа методом ИФА. В результате была отобрана гибридома, продуцирующая МАТ к рекомбинантному VEGFR-1 человека, которая была обозначена как: ТШК14.
Пример 1.2. Изотипирование МАТ ТШК14
Для клона ТШК14 было проведено изотипирование, с целью установления класса иммуноглобулинов. Изотипирование проводили методом непрямого твердофазного ИФА с использованием набора реактивов Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (SigmaAldrich, кат. № ISO2-1KT), регистрируя связывание антител с антигеном, иммобилизованным в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью. Для иммобилизации антигена в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили антиген VEGFR-1 в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный на 0,01 М карбонатном буферном растворе, рН 9,6 в объеме 100 мкл (БуферА) и выдерживали при комнатной температуре в течение 16 ч. Лунки планшета отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и вносили в них супернатант культуральной жидкости гибридных клеток в объеме 50 мкл и 100 мкл (ЗФР-Т). Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч. После этого лунки планшета вновь трижды отмывали раствором ЗФР-Т и добавляли в лунки антитела против изотипов иммуноглобулинов мыши IgG1, IgG2a IgG2b, IgG3, IgGM, IgGA, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч, затем пятикратно отмывали раствором ЗФР-Т, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). Изотип иммуноглобулинов, продуцируемых клоном, определяли на основании положительной иммуноферментной реакции на антитела к определенному анти-изотипическому антителу, которая проявлялась в виде окрашивания продукта хромогена - ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Планшеты сканировали на планшетном ридере, измеряя поглощение при 450 нм. В результате изотипирования полученных моноклональных антител было выявлено, что МАТ ТШК14 представляют собой изотип IgG2a.
Пример 1.3. Наработка моноклональных антител.
Наработку моноклональных антител ТШК14 для изучения их свойств осуществляли в организме инбредных мышей линии BALB/c, которым до введения клеток гибридомы внутрибрюшинно (в/бр) вводили 0,5 мл 14-тетраметиленпентадекана (пристана). Через 14 дней этим животным также в/бр вводили прививочную дозу 2×106 гибридных клеток на мышь. Через 10 дней после этого мышей переводили на питьевую диету физиологическим раствором и в течение последующих 2-8 дней наблюдали за ростом объема брюшной полости с асцитической жидкостью. При достижении брюшной полостью заметного объема асцитическую жидкость (объемом 3-5 мл), содержащую моноклональные антитела, отбирали и определяли в ней титр антител методом ИФА. Продукция МАТ в асцитических жидкостях мышей варьировала от 1 до 2 мг/мл.
Пример 1.4. Выделение и очистка моноклональных антител.
Полученную асцитическую жидкость осветляли центрифугированием (30 мин, 20000 об/мин), после чего моноклональные антитела выделяли из супернатанта осаждением сульфатом аммония, и затем очищали методами аффинной хроматографии с использованием сорбента с белком А. Осаждение сульфатом аммония проводили добавлением к супернатанту порошка NH2SO4 до концентрации 45% от насыщения. Для формирования осадка раствор оставляли в холодильнике (плюс 2-6°С) на ночь. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин, 10000 об/мин), растворяли в минимальном растворе 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФСБ) и затем диализовали приблизительно 16 часов при плюс 2-6°С против 1,5 М глицина с 3 М NaCl, рН 8,6. Диализат с помощью насоса наносили со скоростью 1 мл/мин на колонку (10×50 мм), заполненную 5 мл сорбента с белком А и уравновешенную тем же буферным раствором. После сорбции сорбент промывали 50 мл этого же буферного раствора. Элюцию проводили 20 мл 20 мМ натрий-цитратного буферного раствора, рН 4,0 для элюции антител с изотипом IgG2. Элюат, содержащий антитела, собирали в емкость, контролируя процесс выхода белка с колонки с помощью УФ детектора хроматографа. Далее антитела концентрировали осаждением сульфатом аммония. Осаждение сульфатом аммония проводили добавлением к супернатанту порошка NH2SO4 до концентрации 45% от насыщения. Для формирования осадка раствор оставляли в холодильнике (плюс 2-6°С) на ночь. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин, 10000 об/мин), растворяли в минимальном растворе 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФСБ) и затем диализовали приблизительно 16 часов при плюс 2-6°С против 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2. После диализа определяли содержание белка методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм, используя молярный коэффициент экстинкции для мышиных IgG.
Пример 1.5. Оценка чистоты полученного препарата МАТ ТШК14.
Оценку чистоты и гомогенности полученных препаратов антител проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях. По данным электрофореза в не восстанавливающих условиях препарат МАТ ТШК14 демонстрирует одну мажорную зону, молекулярного веса более 160 кДа, что соответствует молекулярному весу иммуноглобулинов и свидетельствует о чистоте препарата. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях свидетельствует о том, что антитело ТШК14 характеризуется типичным для иммуноглобулинов класса G наличием двух цепей - тяжелой и легкой, с молекулярными массами около 50 и 25 кДа соответственно (Фиг. 1).
Пример 2. Исследование свойств моноклональных антител ТШК14. Оценка эффективности связывания моноклонального антитела ТШК14 к рекомбинантному антигену VEGFR-1
Для определения связывания моноклональных антител ТШК14 к антигену-мишени VEGFR-1 применяли твердофазный вариант иммуноферментного анализа. В качестве твердой фазы использовали полистироловые 96-ти луночные планшеты Corning (Costar). В качестве антигена для иммобилизации твердой фазы использовали рекомбинантные белки VEGFR-1 человека (RPB818Hu01, Cloud-Clone Corp.) и мыши (Mus musculus, Ser27~Val329, Cloud-Clone Corp. RPB818Mu01) в концентрации 2,5 мкг/мл. Адсорбцию антигена проводили в 20 мМ боратном буфере с рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl, в течение 20 часов во влажной камере при +4°С. Моноклональные антитела ТШК14 наносили в 100 мкл промывочного буфера (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,05% Tween-20), содержащего 1 мг/мл БСА с последовательным разбавлением антител в 2 раза, начиная со стартовой концентрации 2 мкг/мл. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании. По окончании инкубации проводили отмывку не связавшихся с антигеном антител промывочным буфером и вносили в лунки раствор конъюгированных с пероксидазой хрена иммуноглобулинов козы к иммуноглобулинам мыши (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:20.000. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании. По окончании инкубации проводили отмывку не связавшихся антител промывочным буфером. Проявление связавшихся вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, проводили с помощью раствора 3,3`,5,5`-тетраметилбензидина (ТМБ). Реакцию останавливали добавлением 1М серной кислоты при этом ТМБ приобретает желтый цвет с максимальной поглощающей способностью при 450 нм. Количество преобразованного ТМВ детектировали с помощью планшетного ридера EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer, USA) при длине волны 450 нм. Полученные результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.4.0., фиттируя зависимость оптической плотности при длине волны 450 нм (OD450) от концентрации МАТ кривой Михаэлиса-Ментена [https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/curve-fitting/reg_michaelis_menten_enzyme.htm] и определяя константу связывания Km как концентрацию МАТ, необходимую для достижения половинной максимальной OD450.
Иммуноферментный анализ показал, что моноклональное антитело ТШК14 против человеческого VEGFR-1 обладает связывающей активностью (аффинность) с человеческим VEGFR-1 (Km<0,5 мкМ), при этом также демонстрирует связывающую активность с мышиным антигеном VEGFR-1 (Km<5 мкМ). Результаты исследований приведены на Фиг. 2.
Для определения константы связывания Kd моноклонального антитела ТШК14 с человеческим и мышиными антигенами VEGFR-1 проводили измерение параметров взаимодействия полученных МАТ ТШК14 с VEGFR-1 методом биослойной интерферометрии (BLI) на приборе Octet® RED 96 Forte Bio (Sartorius) с использованием сенсоров Octet® Anti-Mouse IgG Fc Capture (АМС) и двух рекомбинантных белков VEGFR-1: рекомбинантный VEGFR-1 человека (RPB818Hu01, Cloud-Clone Corp.) и рекомбинантный мышиный VEGFR-1 (RPB818Mu01, Cloud-Clone Corp.). По результатам измерения кинетических свойств связывания антитела ТШК14 с человеческим и мышиным рекомбинантными антигенами VEGFR-1 была определена Kd=4.02⋅10-12 М и Kd=5.85⋅10-9 М соответственно.
Пример 3. Исследование свойств моноклональных антител ТШК14
Анализ связывания антител ТШК14 с нативным антигеном VEGFR-1 на поверхности опухолевых клеток производили методом проточной цитометрии.
Для этого клетки линий рака кишечника человека Hutu-80 и LoVo, фиксировали 4% формальдегидом. Далее клетки инкубировали с МАТ ТШК14 или коммерческими MAT (#BF0131 FLT1 Antibody, Affinity Biosciences) в количестве 2 мкг на 10Е6 клеток. Окрашивали вторичными антителами anti-mouse-Alexa488 (17с01220, Hansa BioMedLife Science, Эстония, 1нг/мл) 1 ч, 4°С и визуализировали на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter, США) при лазере 480 нм, накапливая 20000 событий.
На Фиг. 3 показаны данные проточной цитометрии при визуализации VEGFR-1 МАТ ТШК14 и коммерческими MAT (#BF0131 FLT1 Antibody, Affinity Biosciences) на поверхности клеток линий рака кишечника человека Hutu-80 (Фиг. 3А) и LoVo (Фиг. 3Б). Полученные цитограммы распределения интенсивности флюоресценции клеток фактически совпадают для тестируемых МАТ ТШК14 и коммерчески доступных для научных исследований антител к VEGFR-1 человека (#BF0131 FLT1 Antibody, Affinity Biosciences). Таким образом, результаты приведенные на Фиг. 3 свидетельствуют о том, что тестируемые антитела специфически связались с антигенными детерминантами на поверхности исследуемых клеток, кроме того, эффективность связывания нативного рецептора VEGFR-1 моноклональными антителами ТШК14 не уступает коммерчески доступным моноклональным антителам (#BF0131 FLT1 Antibody, Affinity Biosciences).
Пример 4: Оценка антипролиферативного действия МАТ ТШК14 на клеточных моделях
Чтобы оценить рост клеток линий рака кишечника человека и мыши при блокировании VEGFR-1 моноклональными антителами ТШК14 пролиферация клеточных линий Hutu-80 (рак кишечника, человек) и СТ-26 (рак кишечника, мышь) была проанализирована с использованием инструмента xCELLigence DP (ACEA Biosciences), позволяющего детектировать клеточный индекс в режиме реального времени. Представленные на Фиг. 4 графики роста клеток в отсутствии или присутствии антител ТШК14 в культуральной среде демонстрируют, что использование антител ТШК14 значительно подавляет рост опухолевых клеток обеих тестированных линий. Таким образом, полученные МАТ ТШК14 ингибируют клеточный ответ, который следует за связыванием лигандов VEGF-A и/или P1GF с рецептором, замедляя темп пролиферации ряда опухолевых клеток кишечника in vitro. Результаты указывают на перспективность использования терапевтического блокирования мишени VEGFR-1 для лечения рака кишечника человека [Dakowicz D., Zajkowska М., Mroczko В. Relationship between VEGF Family Members, Their Receptors and Cell Death in the Neoplastic Transformation of Colorectal Cancer. Int J Mol Sci. 2022. V. 23. №6. P. 3375. DOI: 10.3390/ijms23063375].
Пример 5: Противоопухолевое действие MAT ТШК14 на моделях животных
С целью оценки противоопухолевого действия антитела ТШК14 мышам линии Balb/DBA подкожно вводили клетки СТ-26 (рак кишечника, мышь) из культуры в количестве 5x10E5 клеток на мышь в объеме 0,1 мл. Мышей после инъекции опухоли разбивали на три группы по 6 животных в группе. Двум разным группам животных на третий день после инъекции опухолевых клеток и далее с частотой раз в три дня внутривенно вводили мАТ ТШК14 в количестве 1,0 мг/мышь или 3,5 мг/мышь в объеме 0,1 мл физиологического раствора. Контрольной группе животных вводили только физиологический раствор в том же режиме. Эффективность действия МАТ ТШК14 оценивалась по размеру опухолевого узла, измеряемого на 25 день наблюдений, а также по выживаемости животных. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 5. Так средний объем опухоли на 25 день терапии в составил: а) в группе контроля, не получавшей лечения - 8,5 см3; б) в группе, получавшей системное введение МАТ ТШК14 (1 мг/мышь) - 5,7 см3; в) группе, получавшей системное введение МАТ ТШК14 (3.5 мг/мышь) средний объем опухолевого узла был в 2 раза меньше чем в контрольной группе и составлял 3,7 см3 (Фиг. 5А). Таким образом, системное введение МАТ ТШК14 в дозе 1 мг/мышь и 3.5 мг/мышь каждые 3 дня приводило к статистически значимому (р<0.05) подавлению роста опухолевых трансплантатов СТ-26 (Фиг. 5А). Средняя продолжительность жизни после прививки опухолевых клеток составила: а) в группе контроля, не получавшей лечения - 23 дня; б) в группе, получавшей системное введение МАТ ТШК14 (1 мг/мышь) - 37 дней; в) МАТ ТШК14 (3.5 мг/мышь) - 32 дня (Фиг. 5Б). Таким образом, полученные в МАТ ТШК14 к рецептору VEGFR-1 уменьшают темп роста опухолевого узла in vivo и продлевают выживаемость мышей с перевитыми клетками карциномы кишечника СТ-26. Полученные данные свидетельствуют о том, что МАТ ТШК14 обладают выраженным противоопухолевым эффектом.
Пример 6. Определение нуклеотидных последовательностей и анализ генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела ТШК14
Рибонуклеиновую кислоту (РНК) из клеток клона ТШК14 выделяли с помощью набора GeneJET RNA Purification kit (Thermo scientific, Lithuania) и затем на матрице данной РНК методом обратной транскрипции получали к ДНК с помощью праймера oligo(dT)18 и обратной транскриптазы MMLV (ЗАО «Евроген», Росссия) по инструкции изготовителя. Далее с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием известных наборов праймеров и высокоточной смеси ДНК- полимераз High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo scientific, Lithuania) получали фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антитела. ПЦР-продукты вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полосы продуктов ожидаемого размера в районе 450 пар оснований вырезали из геля, элюировали с помощью набора реагентов для выделения ДНК из агарозного геля (ЗАО «Евроген», Россия). После этого полученные ПЦР-продукты анализировали секвенированием. Секвенирование проводили на капиллярном секвенаторе АВ3500 (Applied Biosystems, США) с помощью коммерческого набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), очистку образцов перед анализом проводили с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США).
Найденные последовательности полученных фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела ТШК14 представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно.
Функциональный и структурный анализ вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепи исследуемого антитела, проведенный с помощью инструмента IMGT/V-QUEST и базы данных IMGT [www.imgt.org], показал расположение рамочных и образующих комплементарность участков (CDR-участков). Найденные последовательности CDR-участков представлены в SEQ ID NO: 3-8.
Таким образом, заявляемые антитела против рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 человека (VEGFR-1), являются новыми моноклональными мышиными антителами МАТ ТШК14 с полученной аминокислотной последовательностью, имеющими изотип IgG2a и обладающими при этом специфичностью и высокой аффинностью к VEGFR-1 человека (KD=4.02⋅10-12 M) и мыши (Kd=5.85⋅10-9 М), обеспечивая подавление роста опухолевых клеток и возможность использования изобретения в доклинических исследованиях для лечения рака кишечника человека
Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение №075-15-2021-1360 от 12.10.2021.
--->
<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-
//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2024-11-09" softwareVersion="2.3.0"
softwareName="WIPO Sequence" fileName="ТШК14.xml" dtdVersion="V1_3"
originalFreeTextLanguageCode="ru">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023135666/10(077961)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-12-28</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова Национального
исследовательского центра «Курчатовский институт»</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P.
Konstantinov of National Research Centre "Kurchatov Institute" (NRC "Kurchatov
Institute" - PNPI)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Антитела против рецептора фактора роста
эндотелия сосудов 1 человека (VEGFR-1)</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>333</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..333</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagatatcct
Gcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgagtggattgg
Agagattttacctggaagtggtagtactaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctcc
Aacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagaataagctggggccaag
ggactctggtcactgtctctgca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>336</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..336</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcatgcctccatct
Cttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctcc
Aaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttc
Acactcaagatcagcagagtggaggctgcggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccattcacgttcg
gctcggggacaaagttggaaataaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GYTFSSYW</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ILPGSGST</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>4</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..4</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ARIS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QSIVHSNGNTY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length/>
<INSDSeq_moltype/>
<INSDSeq_division/>
<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier><INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>FQGSHVPFT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Моноклональное антитело, специфически связывающееся с рецептором фактора роста эндотелия сосудов 1 VEGFR-1 человека, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 1, вариабельный домен легкой цепи, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 2, и гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей с последовательностями SEQ ID NO: 3-8.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2838680C1 true RU2838680C1 (ru) | 2025-04-22 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8143025B2 (en) * | 2004-11-18 | 2012-03-27 | Imclone Llc | Antibodies against vascular endothelial growth factor receptor-1 |
| RU2670052C1 (ru) * | 2014-11-04 | 2018-10-17 | Циндао Хайланьшэнь Биотекнолоджи Ко., Лтд | Антигенный полипептид для выявления в плазме крови иммунного маркера - аутоантитела к vegfr1 и его применение |
| RU2788949C1 (ru) * | 2019-12-06 | 2023-01-26 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Белковые композиции против vegf и способы их получения |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8143025B2 (en) * | 2004-11-18 | 2012-03-27 | Imclone Llc | Antibodies against vascular endothelial growth factor receptor-1 |
| RU2670052C1 (ru) * | 2014-11-04 | 2018-10-17 | Циндао Хайланьшэнь Биотекнолоджи Ко., Лтд | Антигенный полипептид для выявления в плазме крови иммунного маркера - аутоантитела к vegfr1 и его применение |
| RU2788949C1 (ru) * | 2019-12-06 | 2023-01-26 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Белковые композиции против vegf и способы их получения |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAN WU et al., Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Antagonist Antibody as a Therapeutic Agent for Cancer, Clin. Cancer Res., 2006, vol.12(21), pp.6573-6584. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106084052B (zh) | 抗cd47单克隆抗体及其应用 | |
| JP2022509930A (ja) | 抗ｃｄ７３抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの使用 | |
| JPH09294584A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナール抗体 | |
| JP2022513383A (ja) | 二重特異性抗体及びその作製方法と使用 | |
| CN109438576A (zh) | 一种抗人cd47单克隆抗体的制备及其应用 | |
| CN108178799B (zh) | 一种抗ca125糖类抗原的纳米抗体及其应用 | |
| CN117396515A (zh) | 抗msln抗体及其应用 | |
| CN113508139A (zh) | 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途 | |
| CN112094348A (zh) | 抗人Tim3抗体或其功能性片段及其应用 | |
| JP2023553205A (ja) | Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇＩＩタグに特異的に結合する抗体およびその使用 | |
| CN112094346B (zh) | 可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白cd142的单克隆抗体 | |
| RU2838680C1 (ru) | Антитела против рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR1) человека | |
| JPH0246297A (ja) | モノクローナル抗体、抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の製造法 | |
| RU2823309C1 (ru) | Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека | |
| CN116162162B (zh) | 一种大鼠抗小鼠cd137抗体或其功能性片段、工具抗体及其应用 | |
| CN119930822A (zh) | 抗cd47单克隆抗体 | |
| RU2640259C2 (ru) | Антитело МАТ40, которое связывается с доменом I экстраклеточной части рецептора эпидермального фактора роста HER2/CD340, и его применение для лечения рака | |
| CN106957367B (zh) | 抗idh1 r132h抗体及其制备方法和用途 | |
| US12344669B2 (en) | Anti-CD47 monoclonal antibody and use thereof | |
| RU2761876C1 (ru) | Гуманизированное антитело 5d3hu, связывающееся с опухолевым антигеном prame, фрагменты днк, кодирующие указанное антитело и антигенсвязывающий фрагмент антитела | |
| CN113597432A (zh) | 抗EpCAM抗体及其应用 | |
| RU2499000C1 (ru) | ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ЛЕГКОЙ И ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ МЫШИНОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА (ФНО-α) ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ), АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ (Fab) ПРОТИВ ФНО-α ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЕ ДОМЕНЫ (ВАРИАНТЫ) | |
| RU2584582C1 (ru) | Моноклональное антитело сс3-4 к конформационному эпитопу с3 человека, штамм гибридной днк мыши рккк(п)764д - продуцент моноклонального антитела сс3-4 | |
| Mohr et al. | Immunosorption techniques: fundamentals and applications | |
| RU2737466C1 (ru) | Гуманизированное нейтрализующее антитело к интерферону-бета человека |