RU2829508C2 - Гуманизованное антитело против pd-1 или его антигенсвязывающий фрагмент и их применение - Google Patents
Гуманизованное антитело против pd-1 или его антигенсвязывающий фрагмент и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2829508C2 RU2829508C2 RU2024100349A RU2024100349A RU2829508C2 RU 2829508 C2 RU2829508 C2 RU 2829508C2 RU 2024100349 A RU2024100349 A RU 2024100349A RU 2024100349 A RU2024100349 A RU 2024100349A RU 2829508 C2 RU2829508 C2 RU 2829508C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- binding fragment
- seq
- cells
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 35
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 23
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 22
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 14
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 13
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 12
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 11
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 10
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 9
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 9
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 8
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- VYMJAWXRWHJIMS-LKTVYLICSA-N Ala-Tyr-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N VYMJAWXRWHJIMS-LKTVYLICSA-N 0.000 description 4
- GMUOCGCDOYYWPD-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GMUOCGCDOYYWPD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- XXAMCEGRCZQGEM-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XXAMCEGRCZQGEM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- ICDIMQAMJGDHSE-GUBZILKMSA-N Gln-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ICDIMQAMJGDHSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 4
- MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 4
- GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 4
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 4
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 4
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- YFXXRYFWJFQAFW-JHYOHUSXSA-N Phe-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O YFXXRYFWJFQAFW-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 4
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 4
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 4
- FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 4
- JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N Tyr-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- KZOZXAYPVKKDIO-UFYCRDLUSA-N Tyr-Met-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KZOZXAYPVKKDIO-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 4
- NUQZCPSZHGIYTA-HKUYNNGSSA-N Tyr-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N NUQZCPSZHGIYTA-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 4
- OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 4
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 4
- 101150107276 hpd-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- RTFWCVDISAMGEQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RTFWCVDISAMGEQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 3
- XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N Gln-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 3
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 3
- UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N Glu-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 3
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 3
- WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N Ile-Thr-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N 0.000 description 3
- GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N Ile-Tyr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 3
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N Met-Glu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 3
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N Trp-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N 0.000 description 3
- MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 3
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- UJMCYJKPDFQLHX-XGEHTFHBSA-N Val-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O UJMCYJKPDFQLHX-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 3
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- 108010081404 acein-2 Proteins 0.000 description 3
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- JPPLRQVZMZFOSX-UWJYBYFXSA-N Asn-Tyr-Ala Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JPPLRQVZMZFOSX-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 102000043850 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Human genes 0.000 description 2
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 2
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 102000046699 human CD14 Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 229940121497 sintilimab Drugs 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- ISCYZXFOCXWUJU-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ISCYZXFOCXWUJU-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OERMIMJQPQUIPK-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OERMIMJQPQUIPK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N Asp-Arg-Val Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- KYQNAIMCTRZLNP-QSFUFRPTSA-N Asp-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KYQNAIMCTRZLNP-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- RGXXLQWXBFNXTG-CIUDSAMLSA-N Gln-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RGXXLQWXBFNXTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XOKGKOQWADCLFQ-GARJFASQSA-N Gln-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O XOKGKOQWADCLFQ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- IKFZXRLDMYWNBU-YUMQZZPRSA-N Gln-Gly-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IKFZXRLDMYWNBU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ILKYYKRAULNYMS-JYJNAYRXSA-N Gln-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ILKYYKRAULNYMS-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- PABFFPWEJMEVEC-JGVFFNPUSA-N Gly-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O PABFFPWEJMEVEC-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Phe Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- DGKBSGNCMCLDSL-BYULHYEWSA-N Gly-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN DGKBSGNCMCLDSL-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- OXKYZSRZKBTVEY-ZPFDUUQYSA-N Leu-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O OXKYZSRZKBTVEY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- KAFOIVJDVSZUMD-DCAQKATOSA-N Leu-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KAFOIVJDVSZUMD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KAFOIVJDVSZUMD-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Gln Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O KAFOIVJDVSZUMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZUGVARDEGWMMLK-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZUGVARDEGWMMLK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N Lys-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- MEQLGHAMAUPOSJ-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MEQLGHAMAUPOSJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N Met-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N Pro-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N Pro-Val-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- LLSLRQOEAFCZLW-NRPADANISA-N Ser-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LLSLRQOEAFCZLW-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N Thr-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 1
- YXONONCLMLHWJX-SZMVWBNQSA-N Trp-Glu-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YXONONCLMLHWJX-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- UOXPLPBMEPLZBW-WDSOQIARSA-N Trp-Val-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 UOXPLPBMEPLZBW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033019 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710116241 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LCHZBEUVGAVMKS-RHYQMDGZSA-N Val-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(O)=O LCHZBEUVGAVMKS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- USXYVSTVPHELAF-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O USXYVSTVPHELAF-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010057952 lysyl-phenylalanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000002740 oral squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к гуманизованному антителу против PD-1 и его антигенсвязывающему фрагменту, а также к композиции, его содержащей. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело или его фрагмент, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения заболевания или состояния, опосредованного PD-1. 7 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 12 табл., 16 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данная заявка относится к области биомедицинской технологии. Более конкретно, она касается гуманизованного антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента и их применения.
Уровень техники
Фактор запрограммированной смерти-1 (PD1) является представителем семейства CD28 и экспрессируется на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках. PD1 человека кодируется геном Pdcd1, расположенным на участке 2q37.3, имеет общую длину 9,6 т.н., состоит из 5 экзонов и 4 интронов и содержит промотор в 663 п.н. перед ним. PD1 представляет собой трансмембранный белок I-го типа в 55 кДа. Его молекулярная структура состоит из внеклеточной области, трансмембранной области и внутриклеточной области. Внеклеточная область содержит один вариабельный домен иммуноглобулина (IgV), а внутриклеточная область содержит ингибирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM) и мотив переключения иммунорецептора на основе тирозина (ITSM). Аминокислотная последовательность внеклеточной области PD-1 на 24% гомологична последовательности CTLA-4 и на 28% гомологична CD28. После активации T-клеток PD-1 в основном собирает тирозиновые фосфолипазы SHP2 через ITIM, что ведет к дефосфорилированию нижележащих эффекторных молекул.
PD-1 имеет два лиганда: PD-L1 и PD-L2. Оба они являются гомологами B7. Ген PDL расположен на участке 9P24.2 хромосом человека и имеет длину в 42 т.н. И PD-L1, и PD-L2 имеют молекулярную структуру, содержащую один домен типа вариабельного домена иммуноглобулина, один домен типа константной области, одну трансмембранную область и один короткий цитоплазматический хвост.
PD-1 при связывании с PD-L1 и PD-L2 может подавлять активацию T-клеток. PD-L1 экспрессируется на поверхности различных опухолевых клеток, в том числе рака легких, рака желудка, рака печени, рака пищевода, рака почек, рака яичников, рака шейки матки, рака молочной железы, рака кожи, рака толстой кишки, рака мочевого пузыря, глиального рака, рака головы и шеи и плоскоклеточной карциномы полости рта. Кроме того, на периферии этих раковых опухолей обнаруживается большое количество T-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1. Статистика клинических результатов показывает, что высокий уровень экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках связан с плохим прогнозом у больных раком.
Сущность изобретения
Техническая проблема, которую должна решить заявка, заключается в преодолении дефектов и недостатков существующих антител с низкой аффинностью связывания и низкой специфичностью к PD-1 путем получения гуманизованного антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента и их применения.
Целью данной заявки является получение гуманизованного антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело включает область CDR легкой цепи и область CDR тяжелой цепи. Область CDR тяжелой цепи состоит из HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Область CDR легкой цепи состоит из LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 представлены последовательно в SEQIDNO: 8-10, а аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 представлены последовательно в SEQIDNO: 11-13. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в любой из SEQIDNO:3-5.
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в любой из SEQIDNO:6-7.
Заявка также касается нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции, относящейся к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.
Заявка также касается применения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и соответствующей им нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции при получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованных PD-1.
Заявка также касается способа лечения опосредованных PD-1 заболевания или состояния, который включает введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клеток или фармацевтической композиции.
Заявка также касается антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клеток или фармацевтической композициидля лечения.
Заявка также касается антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клеток или фармацевтической композициидля лечения опосредованных PD-1 заболевания или состояния.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлен график, показывающий влияние различных концентраций PD-1-112-C2 на секрецию ИЛ-2/ИНФ-γ.
На фиг. 2 представлен график, показывающий влияние различных концентраций PD-1-112-C2 на пролиферацию T-клеток и секрецию ими цитокина ИЛ-2.
На фиг. 3 представлен график, показывающий влияние различных концентраций PD-1-112-C2 на пролиферацию T-клеток и секрецию ими цитокина ИНФ-γ.
На фиг. 4 представлен график, показывающий влияние гуманизованного антитела c53 против PD-1 на объем опухолей.
На фиг. 5 представлен график, показывающий влияние гуманизованного антитела c53 против PD-1 на выживаемость мышей.
Раскрытие сущности изобретения
Далее настоящее изобретение будет объяснено на конкретных примерах, но эти примеры не ограничивают настоящее изобретение никоим образом. Если не указано иначе, реагенты, методы и устройства, используемые в заявке, представляют собой стандартные для данной области техники реагенты, методы и устройства.
Если не указано иначе, реагенты и материалы, используемые в следующих примерах, коммерчески доступны.
Данная заявка касается гуманизованного антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело включает области CDR легкой цепи и области CDR тяжелой цепи. Области CDR тяжелой цепи состоят из HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Области CDR легкой цепи состоят из LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 представлены последовательно в SEQIDNO:8-10, а аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 представлены последовательно в SEQIDNO: 11-13. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в любой из SEQIDNO: 3-5. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в любой из SEQIDNO: 6-7.
В данной заявке области CDR идентифицируют по системе нумерации Кабата, но области CDR, идентифицированные другими способами, также входят в заявленный объем заявки.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 3, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 6, или же аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 4, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 7, или же аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 5, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 7.
В некоторых воплощениях антитело содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, причем константная область тяжелой цепи представляет собой любой один или несколько из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE или IgM; а константная область легкой цепи представляет собой κ- или λ-цепь.
В некоторых воплощениях вид источника константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи выбран из человека, мыши или обезьяны.
В некоторых воплощениях антитело представляет собой химерное антитело или полиспецифичное антитело (например, биспецифичное антитело).
В данной заявке термин “полиспецифичное антитело” означает такой антигенсвязывающий белок или такое антитело, которое нацелено более чем на один антиген или эпитоп.
В данной заявке термин “биспецифичное антитело” означает полиспецифичный антигенсвязывающий белок или полиспецифичное антитело, которые могут быть получены различными способами, включая, без ограничения, слияние гибридом или соединение Fab′-фрагментов. Например, см. Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Два сайта связывания биспецифичного антигенсвязывающего белка или антитела должны связываться с двумя разными эпитопами, присутствующими на одном и том же или на разных белках-мишенях.
В данной заявке термин “специфическое связывание” и подобные выражения относятся к связыванию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с эпитопом заданного антигена. Обычно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с аффинностью (KD) примерно менее 10-6 М, например, примерно менее 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М либо меньше. KD означает соотношение скорости диссоциации и скорости ассоциации (koff/kon), величина которых может быть измерена методом, известным специалистам в данной области.
В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любой один или несколько из F(ab′)2, Fab, scFv, Fv и однодоменных антител.
В данной заявке термин “F(ab′)2” охватывает две легкие цепи и две тяжелые цепи, которые содержат часть константной области между доменами CH1 и CH2, образуя межцепочечную дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями. Таким образом, фрагмент F(ab′)2 состоит из двух Fab′-фрагментов, удерживаемых вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями.
В данной заявке термин “Fab” охватывает одну легкую цепь, участок CH1 и вариабельную область одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.
В данной заявке термин “scFv” означает такую молекулу Fv, в которой вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединяются гибким линкером с образованием единой полипептидной цепи (которая образует антигенсвязывающую область) (например, см., Birdetal., Science, 242:423-426 (1988); и Hustonetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5879-5883 (1988)).
В данной заявке термин “Fv” охватывает вариабельные области тяжелой и легкой цепи, но не содержит константной области.
В данной заявке термин “однодоменное антитело” охватывает только одну вариабельную область тяжелой цепи (VHH) и два обычных участка CH2 и CH3, но они не так легко связываются друг с другом, как искусственно созданное одноцепочечное антитело (scFv), и даже объединяются в блоки. Более важно то, что структура VHH, клонированная и экспрессированная отдельно, обладает структурной стабильностью и антигенсвязывающей активностью, сравнимой с исходной тяжелой цепью антитела, и представляет собой наименьшую известную единицу, способную связываться с целевым антигеном.
Заявка также касается нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизованное антитело против PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота включает: первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В данной заявке нуклеиновая кислота обычно представлена РНК или ДНК, причем молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно это двухцепочечная ДНК. Нуклеиновая кислота является “функционально связанной”, когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор или энхансер влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. ДНК предпочтительно используется тогда, когда нуклеиновая кислота лигирована в вектор. Более того, поскольку антитело является мембранным белком, то нуклеиновая кислота обычно несет последовательность сигнального пептида.
Заявка также касается вектора, несущего нуклеиновую кислоту.
В данной заявке термин “вектор” означает носитель нуклеиновой кислоты, в который может быть вставлен полинуклеотид. Если вектор может обеспечить экспрессию белка, кодируемого вставленным полинуклеотидом, такой вектор называется экспрессирующим вектором. Вектор может быть введен в клетки хозяина посредством трансформации, трансдукции или трансфекции с тем, чтобы элемент генетического материала, переносимый вектором, мог экспрессироваться в клетке-хозяине. Векторы хорошо известны специалистам в данной области, включают, без ограничения: плазмиды; фагемиды; космиды; искусственные хромосомы, к примеру, искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), искусственные бактериальные хромосомы (BAC) или искусственные хромосомы, полученные из P1 (PAC); фаги, к примеру, фаг λ или M13, и вирусы животных и т.п. Вирусы животных, которые можно использовать в качестве вектора, включают, без ограничения, ретровирусы (в том числе и лентивирусы), аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы (например, вирус простого герпеса), поксвирусы, бакуловирусы, папилломавирусы, паповавирусы (например, SV40).
Заявка также касается клеток, несущих нуклеиновую кислоту, содержащих вектор или способных экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Заявка также касается фармацевтической композиции, включающей указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор или клетку.
В данной заявке термин “фармацевтическая композиция” означает такую форму, которая обеспечивает эффективную биологическую активность активного ингредиента и не содержит дополнительных ингредиентов, неприемлемо токсичных для субъекта, которому будет вводиться композиция.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
В данной заявке термин “фармацевтически приемлемый носитель” может охватывать всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные средства и противогрибковые средства, вещества для изотонизации и замедляющие всасывание вещества и т.п., которые физиологически совместимы и применяются для увеличения срока годности или эффективности антитела.
Кроме того, применение указанных антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции при получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного PD-1, также должно входить в заявленный объем этой заявки.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция или лекарственное средство находится в форме, подходящей для инъекций.
В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция или лекарственное средство находится в форме, подходящей для введения посредством подкожной инъекции, внутрикожной инъекции, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции или инъекционное введение в очаг поражения.
Данная заявка имеет следующие полезные эффекты.
Гуманизованное антитело против PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в заявке, могут связываться с клетками CHO-hPD1, клетками CHO-cyno и активированными РВМС с высокой аффинностью. У них значительно улучшена аффинность по сравнению с положительным контролем. Они могут эффективно и специфически связываться с PD-1 и эффективно блокировать связывание лигандов PD-L1/PD-L2 с CHO-hPD1. При MLR они могут блокировать связывание PD-1 с лигандами и ингибировать сигнальный путь PD-1, тем самым способствуя пролиферации T-клеток и секреции цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ. Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и соответствующая нуклеиновая кислота, вектор, клетки или фармацевтическая композиция имеют широкие перспективы для применения при получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного PD-1.
Примеры
Пример 1. Получение антител против PD-1
1. Иммуноген
Искусственно синтезировали последовательность PD-1 человека (NCBINP 005009) и использовали верхний праймер: 5′-CCGCAAGCTTGCCGCCACCATG-3′ (SEQIDNO:1) и нижний праймер: 5′-CCGGAATTCTCATTAATGGTGATGGTGATGATGCTGGAACTGGCCGGCAGGTC-3′ (SEQIDNO:2) для ПЦР-амплификации внеклеточного конца последовательности PD-1 человека. Затем внеклеточный конец отщепляли с помощью HindIII и EcoRI и клонировали в эукариотическую систему экспрессии pCDNA3.4A, получая плазмиду. Этой плазмидой трансфецировали клетки 293, собирали супернатант и проводили очистку, получая рекомбинантный белок PD-1 человека (hPD-1).
2. Иммунизация животных
Смешивали 125 мкг рекомбинантного белка hPD-1 при концентрации 1,23 мг/мл в качестве антигена с эквивалентным количеством адъюванта Фрейнда (Sigma-AldrichF5881) в качестве иммунного адъюванта, отбирали пять 6-недельных мышей BALb/C и подвергали подкожной иммунизации, при этом количество вводимого антигена составляло 25 мкг на мышь. После первичной иммунизации раз в неделю проводили повторную (бустерную) иммунизацию при той же дозе. После в совокупности 5 иммунизаций определяли иммунный ответ путем сбора хвостовой крови у мышей. Проводили слияние при помощи FACS-скрининга (как описано ниже), используя мышей с достаточными титрами иммуноглобулина против hPD-1. Через 3 дня после внутрибрюшинной бустерной иммунизации антигеном мышей забивали и извлекали селезенку для слияния клеток.
3. Отбор мышей BALb/C, вырабатывающих антитела против hPD-1
Для отбора мышей BALb/C, вырабатывающих антитела против hPD-1, тестировали сыворотки иммунизированных мышей методом FACS. Разведения сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантным белком hPD-1, инкубировали с трансфецированными hPD1 клетками CHO при 4°C в течение 30 минут, промывали 3 раза ФСБ, а затем добавляли 0,4 мкг/мл козьего конъюгированного с фикоэритрином (PE) антитела против IgG мыши (Biolegend 405307) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. После 3-кратной промывки ФСБ образцы помещали в проточный цитометр фирмы BeckmanCoulter (CytoFLEXA00-1-1102) для проверки того, могут ли они связываться с клетками CHO, трансфицированными hPD1, и отбора мышей BALb/C, вырабатывающих антитела против hPD-1, а затем проводили слияние клеток.
4. Получение гибридом, вырабатывающих мышиные моноклональные антитела против hPD-1
Спленоциты из иммунизированных мышей BALb/c сливали с клетками мышиной миеломы, а затем полученные гибридомы подвергали скринингу на наличие антигенспецифичных антител. Суспензии отдельных клеток из спленоцитов иммунизированных мышей подвергали слиянию с одной пятой клеток мышиной миеломы (SP2/0, ATCCCRL1581), не секретирующих иммуноглобулины, с помощью PEG 1500 (Roche 10783641001). Слившиеся клетки высеивали в 96-луночный планшет для культивирования клеток примерно по 1×105 клеток на лунку, помещали планшет в инкубатор (PanasonicMCO-18AIC) и проводили культивирование при 37°C и 5% CO2. Затем проводили культивирование в селективной среде HAT, то есть среде 1640, содержащей два антибиотика: пенициллин и стрептомицин (Gibco 15140122), 1×HAT (SigmaCRLP-7185) и 20% фетальной телячьей сыворотки (RoyacelRY-F11-01), в течение 1 недели. Через 1 неделю среду HAT заменяли средой HT (среда 1640, содержащая два антибиотика: пенициллин и стрептомицин (Gibco 15140122), 1×HT (Gibco 11067030) и 20% фетальной телячьей сыворотки (RoyacelRY-F11-01) для культивирования, а затем тестировали супернатанты клеточных культур из планшета со слияниями методом FACS для отбора гибридом, секретирующих антитела, способные связываться с белком hPD-1. Гибридомы, секретирующие антитела, способные связываться с белком hPD-1, пересеивали и снова подвергали скринингу. Гибридомы с положительными результатами скрининга на антитела, связывающиеся с белком hPD-1, субклонировали по меньшей мере дважды методом предельного разведения. Затем культивировали стабильные субклоны invitro и получали небольшое количество антител для дальнейшего анализа. Клон гибридомы PD1-112-C2 был выбран для дальнейшего анализа.
Пример 2. Характеристика аффинности мышиного моноклонального антитела против PD-1
Стандартными методами получали клеточную линию CHO (клетки яичников китайского хомячка) (CHO-hPD1), экспрессирующую рекомбинантный PD-1 человека на поверхности клеток, клеточную линию CHO (CHO-cynoPD1), экспрессирующую PD-1 обезьяны (Uniprot: B0LAJ2) на поверхности клеток, и клеточную линию CHO (CHO-mousePD1), экспрессирующую PD-1 мыши (Uniprot: Q02242) на поверхности клеток, по рекомбинантной технологии. Эти линии клеток будут использоваться при проточной цитометрии (FCM) для определения характеристик связывания мышиного моноклонального антитела PD-1-112C2 против PD-1.
Для оценки связывания мышиного моноклонального антитела против PD-1 с клетками CHO-hPD1 в 96-луночный планшет вносили по 2×105 клеток CHO-hPD1 и добавляли серийные разведения мышиного моноклонального антитела против PD-1 (3-кратные серийные разведения при начальной концентрации 10 мкг/мл) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки 1 раз промывали буфером (ФСЮ, содержащим 3% БСА), а затем добавляли меченное PE флуоресцентное вторичное антитело против IgG мыши (Fc) Ab (Biolegend), инкубировали при 4°C в течение 30 минут, после чего промывали 1 раз буфером и ресуспендировали в ФСБ. После этого суспензии клеток подвергали анализу методом проточной цитометрии на CytoFlex (проточном цитометре Beckman) и измеряли количество антител, связавшихся с клетками, по средней интенсивности флуоресценции (MFI) окрашивания. Такой же метод применяли для оценки связывания мышиного моноклонального антитела против PD-1 с клетками CHO-cyno и с клетками CHO-mousePD1 (иногда в заявке они сокращенно называются “CHO-mPD1”).
Результаты представлены в таблице 1. Эти данные показывают, что каждое мышиное моноклональное антитело PD-1-112-C2 против PD-1 способно связываться с высокой аффинностью как с клетками CHO-hPD1, так и с клетками CHO-cyno; тогда как все мышиные моноклональные антитела не связывались с клетками CHO-mousePD1.
Пример 3. Связывание антитела против PD-1 с активированными РВМС
При стимуляции ФГА (Sigma) свежих мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК) активировались и пролиферировали лимфоциты, достигая наибольшего уровня по экспрессии PD1 на третий день, и поэтому их можно было использовать для эксперимента по связыванию антител к PD-1 с PD1, который экспрессировался естественным образом в активированных лимфоцитах.
После получения из свежей периферической крови человека центрифугированием в градиенте среды для разделения лимфатических клеток доводили МКПК до плотности 1 ×106 клеток/мл и инокулировали в T75, а затем добавляли ФГА-L (Sigma) в конечной концентрации 1 мкг/мл для стимулирования пролиферации лимфоцитов. После инкубации при 37°C и 5% CO2 в течение 3 дней клеточную суспензию извлекали и центрифугировали. Супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в буфере (ФСБ, содержащий 3% БСА) и вносили в 96-луночный U-образный планшет по 2×105 на лунку, а затем добавляли в общей сложности 10 серийных разведений антител против PD1 при 3-кратных серийных разведениях, начиная с 30 мкг/мл, инкубировали при 4°C в течение 30 минут и центрифугировали при 300 g в течение 5 минут. Клетки промывали 1 раз буфером, добавляли меченное PE флуоресцентное козье антитело против IgG человека (Biolegend) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки центрифугировали и промывали один раз, а затем ресуспендировали в ФСБ и проводили анализ на проточном цитометре CytoFlex для определения количества антител, связавшихся с МКПК.
Результаты представлены в таблице 1, причем антитело против PD1 способно было связываться с активированными лимфоцитами с высокой аффинностью.
Пример 4. Специфичность связывания мышиного моноклонального антитела против PD1
Проводили связывание мышиного моноклонального антитела против PD1 с четырьмя различными белками, представителями семейства CD28, для проверки специфичности антитела при связывании с PD-1. По стандартному методу ELISA на планшете для ELISA иммобилизировали PD-1, CD28, CTLA-4 и ICOS (ACRO) при концентрации в 1 мкг/мл и добавляли мышиное моноклональное антитело против PD-1 человека в концентрации 10 мкг/мл. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) антитело против IgG мыши (Sigma). После проявления с помощью ТМБ и остановки реакции проводили считывание значений OD450 на считывающем устройстве.
Результаты представлены в таблице 2. Каждое мышиное моноклональное антитело PD-1-112C2 против PD-1 было способно специфически связываться с PD-1, но не с другими представителями семейства CD28.
Пример 5. Определение аффинности мышиного моноклонального антитела против PD1 человека методом биослойной интерферометрии (BLI)
Определение аффинности на ForteBio (OctetQke). На биосенсор HISIK наносили рекомбинантный белок PD-1-his (ACRO) в концентрации 5 мкг/мл на 120 секунд, а затем заполненный сенсор уравновешивали в стандартном буфере (ФСБТ, ФСБ + 0,02% Твин 20) в течение 120 секунд, после чего переносили сенсор в одно разведение мышиного моноклонального антитела против PD-1 и оставляли на 180 секунд для измерения скорости ассоциации, а затем переносили в стандартный буфер на 20 минут для измерения скорости диссоциации. Наконец, проводили анализ с использованием кинетической модели.
Результаты обработки данных представлены в таблице 3.
Пример 6. Блокирование связывания лиганда PD-L1/PD-L2 с CHO-hPD1 мышиным моноклональным антителом против PD-1
На проточном цитометре анализировали способность мышиного моноклонального антитела против PD-1 блокировать связывание лигандов с PD-1, стабильно экспрессированным на поверхности трансфецированных клеток CHO. Белки лигандов, используемые в эксперименте, представляли собой слитые белки рекомбинантного внеклеточного сегмента PD-L1/PD-L2, соединенные с Fc-сегментом IgG человека: PD-L1-hFc (ACRO) и PD-L2-hFc (ACRO).
Клетки CHO-PD1 ресуспендировали в буфере (ФСБ, содержащем 3% БСА) и доводили до плотности 2×106 клеток/мл. Суспензию клеток вносили в 96-луночный U-образный планшет по 100 мкл на лунку и центрифугировали при 300 g в течение 5 минут, а затем отбрасывали супернатант.
Последующий процесс можно разделить на два режима блокирования: режим 1, при котором в лунки, содержащие клетки, добавляли PD-L1-hFc/PD-L2-hFc в концентрации 3 мкг/мл, инкубировали при 4°C в течение 30 минут, а затем добавляли в общей сложности 10 серийных разведений мышиных моноклональных антител против PD-1 при 3-кратных серийных разведениях, начиная с 30 мкг/мл, и инкубировали при 4°C в течение 30 минут; и режим 2, при котором в лунки, содержащие клетки, добавляли в общей сложности 10 серийных разведений мышиных моноклональных антител против PD-1 при 3-кратных серийных разведениях, начиная с 30 мкг/мл, инкубировали при 4°C в течение 30 минут, а затем добавляли белок PD-L1-hFc/PD-L2-hFc в концентрации 3 мкг/мл и инкубировали при 4°C в течение 30 минут.
Клетки центрифугировали при 300 g в течение 5 минут, промывали 1 раз буфером, добавляли меченное PE флуоресцентное козье антитело против IgG человека (Biolegend) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки центрифугировали и промывали 1 раз, а затем ресуспендировали в ФСБ и проводили анализ на проточном цитометре CytoFlex для определения количества белка лиганда, связавшегося с клетками, и расчета значения IC50 антитела к PD-1 при блокировании связывания.
Результаты представлены в таблице 4. Мышиное моноклональное антитело PD-1-112-C2 против PD-1 было способно эффективно блокировать связывание PD-L1/PD-L2 с клетками CHO-PD1 в обоих режимах.
Пример 7. Влияние антитела против PD-1 на высвобождение цитокинов из стимулируемых SEB клеток МКПК
В этом примере определяли влияние на секрецию цитокинов в присутствии или в отсутствие антитела против PD-1 при стимуляции культивируемых в течение ночи мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) добавлением энтеротоксина BStaphylococcusaureus (SEB) в качестве суперантигена.
Свежие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) ресуспендировали в среде X-VIVO 15 (LONZA), содержащей 10% БСА, а затем вносили в культуральную колбу T25 и инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение ночи для культивирования. На следующий день отбирали суспендированные клетки, центрифугировали, а затем ресуспендировали в свежей среде X-VIVO (содержащей 10% БСА) и добавляли SEB в качестве суперантигена (ToxinTechnology) в конечной концентрации 200 нг/мл, а затем вносили в 96-луночный планшет по 1×105 клеток на лунку и при этом добавляли различные концентрации антител против PD-1. Кроме того, ставили две лунки с антителами для контроля на изотип (одна с антителом для контроля на изотип mIgG1 (Biolegend); другая с антителом для контроля на изотип hIgG4 (Biolegend)), а также контрольные лунки без антител. Через 3 дня из лунок отбирали образцы и измеряли уровни ИЛ-2/ИНФ-γ с помощью набора IL2/ИНФ-γ HumanUncoatedELISAKit (eBioscience).
Результаты по влиянию различных концентраций PD-1-112-C2 на секрецию ИЛ-2/ИНФ-γ представлены на фиг. 1. Антитело против PD-1 улучшает секрецию ИЛ-2/ИНФ-γ в зависимости от концентрации. Эти результаты показывают, что в МКПК при стимуляции SEB в качестве суперантигена антитело PD-1-112-C2 против PD-1 было способно еще больше усиливать секрецию цитокинов T-клетками.
Пример 8. Влияние антитела против PD-1 на смешанную лимфоцитарную реакцию
При смешанной лимфоцитарной реакции (MLR) в присутствии или в отсутствие антитела против PD-1 может проявляться пролиферация T-клеток и уровень цитокинов, секретируемых T-клетками, характерный для ситуации, когда блокируется передача сигналов PD1.
Из свежих МКПК выделяли моноциты CD14+ с помощью микрошариков с CD14 человека (Miltenyi), индуцировали их в присутствии ГМ-КСФ/ИЛ-4 в течение 6 дней, затем добавляли ФНО-α и индуцировали созревание клеток ДК через 3 дня. В день эксперимента очищали T-клетки из МКПК с помощью набора для обогащения T-клеток человека EasySep™ (StemCell). Смешивали 1×105 T-клеток с 1×104 клеток ДК и проводили культивирование, а к смешанным клеткам добавляли различные серийные разведения антител против PD-1. Кроме того, ставили две лунки с антителами для контроля на изотип (одна с антителом для контроля на изотип mIgG1 (Biolegend); другая с антителом для контроля на изотип hIgG4 (Biolegend)), а также контрольные лунки без антител. Через 3 дня из смешанной культуры отбирали супернатанты и определяли ИЛ-2, а еще через 2 дня культивирования отбирали супернатанты и определяли ИНФ-γ.
Результаты по влиянию различных концентраций PD-1-112-C2 на пролиферацию T-клеток и секрецию цитокина ИЛ-2 T-клетками представлены на фиг. 2. Результаты по влиянию различных концентраций PD-1-112-C2 на пролиферацию T-клеток и секрецию цитокина ИНФ-γ T-клетками представлены на фиг. 3. Результаты на фиг. 2 и 3 показывают, что в эксперименте по MLR антитело PD-1-112-C2 против PD-1 способно было блокировать связывание PD1 с лигандом в зависимости от концентрации антитела и ингибировать сигнальный путь PD1, тем самым усиливая пролиферацию T-клеток и стимулируя секрецию цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ T-клетками.
Пример 9. Гуманизация мышиного моноклонального антитела против PD-1
Мышиное моноклональное антитело PD-1-112-C2 против PD-1, полученное выше (аминокислотные последовательности его HCDR1, HCDR2 и HCDR3 представлены последовательно в SEQIDNO: 8-10, а аминокислотные последовательности его LCDR1, LCDR2 и LCDR3 представлены последовательно в SEQIDNO: 11-13, последовательность вариабельной области его тяжелой цепи представлена в SEQIDNO: 14, а последовательность вариабельной области его легкой цепи представлена в SEQIDNO: 15), подвергали гуманизации, а конкретный метод заключался в следующем.
Искусственно синтезировали последовательность PD-1 человека (NCBINP 005009) и клонировали её в эукариотическую систему экспрессии pCDNA3.4A. Этой плазмидой трансфицировали клетки 293, собирали супернатанты и проводили очистку, получая рекомбинантный белок PD-1 человека. Полученным рекомбинантным белком PD-1 человека подкожно иммунизировали самок мышей BALb/C. Спленоциты от иммунизированных мышей BALb/c сливали с клетками мышиной миеломы, а затем полученные гибридомы подвергали скринингу на наличие антигенспецифичных антител. Гибридомы с положительными результатами скрининга на антитела, связывающиеся с белком hPD-1, субклонировали по меньшей мере дважды методом предельного разведения, а затем культивировали стабильные субклоны invitro для получения небольшого количества антител, которые подвергали дальнейшему скринингу для получения клонов PD-1-112-C2.
| SEQ ID NO: 8: | TYYMY. |
| SEQ ID NO: 9: | GINPSNGGTNFNEKFKS. |
| SEQ ID NO: 10: | RDSNYDGGFDY. |
| SEQ ID NO: 11: | RASKSVSTSGYSYMH. |
| SEQ ID NO: 12: | LAYHLES. |
| SEQ ID NO: 13: | QHSWELPIT. |
SEQ ID NO: 14:
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYYMYWVKQRPGQGLEWIGGINPSNGGTNFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTTLTVSS.
SEQ ID NO: 15:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLAYHLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSWELPITFGSGTKLEIKR.
Обращаясь к SEQIDNO: 14 и SEQIDNO: 15: гуманизованные матрицы, которые лучше всего соответствуют их участкам не, являющимися CDR, были выбраны из базы данных Germline. Матрица для тяжелой цепи антитела - IGHV1, а матрица для легкой цепи антитела - IGKV1. В соответствии с принципом повышения структурной стабильности без влияния на структурную стабильность антитела, без влияния на связывание антитела с антигеном, без введения сайтов модификации белка типа гликозилирования и фосфорилирования и без введения таких сайтов, которые легко окисляются или аминируются, гуманизованную последовательность тяжелой цепи составляли в виде VH1-5, а гуманизованную последовательность легкой цепи составляли в виде VL1-3, и, при этом, принимая IGKV7-3*01 с наибольшей гомологией в качестве другого набора гуманизованных матриц для легкой цепи, была составлена гуманизованная последовательность VL-4. Для получения гуманизованных антител форма образования пары легкой и тяжелой цепей была составлена в виде IGHV1/IGKV2 в качестве общей формы образования пар.
Гены синтезировали в соответствии с аминокислотной последовательностью каждой легкой и тяжелой цепи гуманизированных антител и подвергали расщеплению двумя ферментами: HindIII (NEB) и EcoRI (NEB). Затем фрагменты генов вставляли в экспрессирующий вектор pDNA3.4A (Invitrogen) по сайтам расщепления ферментами HindIII/EcoRI (NEB) с помощью ДНК-лигазы T4 (TAKARA 2011A). Экспрессирующим вектором трансфицировали клетки HEK293 (LifeTechnologies, кат. № 11625019) с помощью реагента для трансфекции полиэтиленимина (PEI) (PolyscienceInc., кат. № 23966) в соотношении 1:2, которые помещали в инкубатор с CO2 и культивировали в течение 5-7 дней. Экспрессированные антитела выделяли центрифугированием, а затем очищали стандартным методом, получая гуманизованные антитела против PD-1 (c11, c21, c31, c41, c51, c12, c22, c32, c42, c52, c43, c53, c44, c54) по настоящей заявке, причем аминокислотные последовательности 3 клонов гуманизованных антител против PD-1 (c22, c43, c53) представлены в таблице 5.
SEQ ID NO:3:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKSRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTTVTVSS.
SEQ ID NO:4:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNGGTNYAEKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTTVTVSS.
SEQ ID NO:5:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNYAQKFQGRATMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTTVTVSS.
SEQ ID NO:6:
DIQLTQSPSSLSASVGDRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAYHLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQHSWELPITFGQGTKLEIKR.
SEQ ID NO: 7:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAYHLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWELPITFGQGTKLEIKR.
Пример 10. Характеристика аффинности гуманизованных антител против PD-1
1. Экспериментальный метод
По рекомбинантной технологии получали клеточные линии CHO (клетки яичников китайского хомячка), CHO-hPD1, способные экспрессировать рекомбинантный PD-1 человека на поверхности клеток, и клеточные линии CHO, CHO-cynoPD1, способные экспрессировать PD-1 обезьяны на поверхности клеток. Эти две линии клеток будут использоваться при проточной цитометрии (FCM) для определения характеристик связывания гуманизованных моноклональных антител-кандидатов против PD-1 (c22, c43, c53). Конкретный метод заключался в следующем.
Для оценки связывания гуманизованных антител с CHO-hPD1 в 96-луночный планшет вносили по 2×105 клеток CHO-hPD1, добавляли серийные разведения гуманизованных антител (3-кратные серийные разведения при начальной концентрации 30 мкг/мл) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки 1 раз промывали буфером (ФСБ, содержащим 3% БСА), а затем добавляли меченное PE флуоресцентное вторичное антитело против IgG человека (Fc) Ab (Biolegend), инкубировали при 4°C в течение 30 минут, после чего промывали 1 раз буфером и ресуспендировали в ФСБ. После этого суспензии клеток подвергали анализу методом проточной цитометрии на CytoFlex (проточном цитометре Beckman) и измеряли количество антител, связавшихся с клетками, по средней интенсивности флуоресценции (MFI) окрашивания. Такой же метод применялся для оценки связывания гуманизованных антител с клетками CHO-cyno.
2. Экспериментальные результаты
Характеристики аффинности гуманизованных антител против PD-1 представлены в таблице 6, и результаты показывают, что гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке способны связываться с высокой аффинностью как с клетками CHO-hPD1, так и с клетками CHO-cynoPD1.
Пример 11. Связывание гуманизованных антител против PD-1 с активированными МКПК
1. Экспериментальный метод
При стимуляции ФГА (Sigma) свежих мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК) лимфоциты активировались и пролиферировали, достигая наибольшего уровня по экспрессии PD1 на третий день, поэтому их можно было использовать для эксперимента по связыванию гуманизованных антител против PD-1 (c22, c43, c53) с PD1, который экспрессируется естественным образом в активированных лимфоцитах. Конкретный метод заключался в следующем.
После получения из свежей периферической крови человека центрифугированием в градиенте среды для разделения лимфатических клеток доводили МКПК до плотности 1 ×106 клеток/мл и инокулировали в T75, а затем добавляли ФГА-L (Sigma) в конечной концентрации 1 мкг/мл для стимулирования пролиферации лимфоцитов. После инкубации при 37°C и 5% CO2 в течение 3 дней клеточную суспензию извлекали и центрифугировали. Супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в буфере (ФСБ, содержащий 3% БСА) и вносили в 96-луночный U-образный планшет по 2×105 на лунку, а затем добавляли различные серийные разведения гуманизованных антител, инкубировали при 4°C в течение 30 минут и центрифугировали при 300 g в течение 5 минут. Клетки промывали 1 раз буфером, добавляли меченное PE флуоресцентное козье антитело против IgG человека (Biolegend) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Затем клетки центрифугировали и промывали 1 раз, а затем ресуспендировали в ФСБ и проводили анализ на проточном цитометре CytoFlex для определения количества антител, связавшихся с МКПК.
2. Экспериментальные результаты
Результаты по определению способности к связыванию гуманизированных антител против PD-1 с активированными МКПК представлены в таблице 6, причем результаты показывают, что гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке способны связываться с активированными лимфоцитами с высокой аффинностью.
По сравнению с мышиным моноклональным антителом PD1-112-C2 против PD-1 (таблица 1) из примеров 2 и 3, гуманизованные антитела против PD-1 (c22, c43, c53) по настоящей заявке обладали сравнимой способностью к связыванию с клетками CHO-hPD1, клетками CHO-cyno и активированными МКПК.
Пример 12. Специфичность связывания гуманизованных антител против PD-1
1. Экспериментальный метод
Проводили связывание гуманизованных антител против PD-1 (c22, c43, c53) по настоящей заявке с четырьмя различными белками-представителями семейства CD28 для проверки специфичности гуманизованных антител против PD-1 при связывании с PD-1. По стандартному методу ELISA на планшете для ELISA иммобилизировали PD-1 (Acro), CD28 (Acro), CTLA-4 (Acro) и ICOS (Acro), соответственно, при концентрации в 1 мкг/мл и добавляли гуманизованное антитело в концентрации 10 мкг/мл. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) антитело против IgG человека (F). После проявления с помощью ТМБ и остановки реакции проводили считывание значений OD450 на считывающем устройстве.
2. Экспериментальные результаты
Результаты по специфичности связывания гуманизованных антител против PD-1 представлены в таблице 7, причем эти результатыпоказывают, что гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке способны были специфически связываться с PD-1, но не с другими представителями семейства CD28.
Пример 13. Определение аффинности гуманизованных антител против PD-1
1. Экспериментальный метод
Определение аффинности на ForteBio (OctetQke). На биосенсор HISIK наносили рекомбинантный белок PD-1-his в концентрации 5 мкг/мл на 120 секунд, а затем заполненный сенсор уравновешивали в стандартном буфере (ФСБТ, ФСБ + 0,02% Твин 20) в течение 120 секунд, после чего переносили сенсор в одно разведение гуманизованного антитела против PD-1 (c22, c43, c53) и оставляли на 180 секунд для измерения скорости ассоциации, а затем переносили в стандартный буфер на 20 минут для измерения скорости диссоциации. Наконец, проводили анализ с использованием кинетической модели, а также проводили обработку данных. В качестве положительного контроля использовали Opdivo (ABA0333).
2. Экспериментальные результаты
Результаты по определению аффинности гуманизованных антител против PD-1 представлены в таблице 8, и они показывают, что все гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке способны были связываться с PD-1 с высокой аффинностью.
По сравнению с мышиным моноклональным антителом PD-1-112-C2 против PD-1 (таблица 3) из примера 5, гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке обладали сравнимой аффинностью, а по сравнению с положительным контролем Opdivo (таблица 3) аффинность гуманизованных антител против PD-1 по настоящей заявке значительно улучшалась.
Пример 14. Блокирование связывания лиганда PD-L1/PD-L2 с CHO-hPD1 гуманизованными антителами против PD-1
1. Экспериментальный метод
На проточном цитометре анализировали способность гуманизированных антител против PD-1 блокировать связывание лигандов с трансфецированными клетками CHO, способными стабильно экспрессировать PD-1 на своей поверхности. Белки лигандов, используемые в эксперименте, представляли собой слитые белки рекомбинантного внеклеточного сегмента PD-L1/PD-L2, соединенные с Fc-сегментом IgG1 мыши: PD-L1-mFc и PD-L2-mFc. Белками лигандов в эксперименте служили два рекомбинантных слитых белка: PD-L1-mFc и PD-L2-mFc, которые образовались при соединении внеклеточных сегментов PD-L1/PD-L2 с Fc-сегментом IgG1 мыши.
Клетки CHO-PD1 ресуспендировали в буфере (ФСБ, содержащем 3% БСА) и доводили до плотности 2×106 клеток/мл. Суспензию клеток вносили в 96-луночный U-образный планшет по 100 мкл на лунку и центрифугировали при 300 g в течение 5 минут, а затем отбрасывали супернатант. В лунки, содержащие клетки, добавляли PD-L1-mFc/PD-L2-mFc в концентрации 0,2 мкг/мл, инкубировали при 4°C в течение 30 минут, а затем добавляли серийные разведения гуманизованных антител против PD-1 (c22, c43, c53) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут.
Клетки центрифугировали при 300 g в течение 5 минут, промывали 1 раз буфером, добавляли меченное PE флуоресцентное козье антитело против IgG мыши (Biolegend) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки центрифугировали и промывали 1 раз, а затем ресуспендировали в ФСБ и проводили анализ на проточном цитометре CytoFlex для определения количества белка лиганда, связавшегося с клетками, и расчета значения IC50 антитела к PD-1 при блокировании связывания.
2. Экспериментальные результаты
Результаты по определению аффинности гуманизованных антител против PD-1 представлены в таблице 9, и эти результаты показывают, что все гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке способны были эффективно блокировать связывание PD-L1/PD-L2 с клетками CHO-PD1.
Пример 15. Влияние гуманизованных антител против PD-1 на смешанную лимфоцитарную реакцию
1. Экспериментальный метод
При смешанной лимфоцитарной реакции (MLR) в присутствии или в отсутствие гуманизованных антител против PD-1 может проявляться пролиферация T-клеток и уровень цитокинов, секретируемых T-клетками, характерный для ситуации, когда блокируется передача сигналов PD1. Конкретный метод заключался в следующем.
Из свежих МКПК выделяли моноциты CD14+ с помощью микрошариков с CD14 человека (Miltenyi), индуцировали их в присутствии ГМ-КСФ/ИЛ-4 в течение 6 дней, затем добавляли TNF-α и индуцировали созревание клеток ДК через 3 дня. В день эксперимента очищали T-клетки из МКПК с помощью набора для обогащения T-клеток человека EasySep™ (StemCell). Смешивали по 1×105 T-клеток с 1×104 клеток ДК на лунку и проводили культивирование, а к смешанным клеткам добавляли различные серийные разведения гуманизованных антител против PD-1 (c22, c43, c53). Кроме того, ставили одну лунку с антителом для контроля на изотип и контрольную лунку без антител. Через 3 дня из смешанной культуры отбирали супернатанты и определяли ИЛ-2, а еще через 2 дня культивирования отбирали супернатанты и определяли ИНФ-γ.
2. Экспериментальные результаты
Результаты по влиянию гуманизованных антител против PD-1 на смешанную лимфоцитарную реакцию представлены в таблице 10. Эти результаты показывают, что в эксперименте по MLR гуманизованные антитела против PD-1 по настоящей заявке способны блокировать связывание PD1 с лигандом и ингибировать сигнальный путь PD1, тем самым усиливая пролиферацию T-клеток и стимулируя секрецию цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-γ T-клетками.
Пример 16. Оценка противоопухолевого действия гуманизованного антитела против PD-1 invivo на раковых клетках толстой кишки мыши
1. Экспериментальный метод
Цель эксперимента: определить противоопухолевое действие гуманизованного антитела против PD-1 (c53) invivo против раковых клеток толстой кишки мышей (клеток MC38), в группе контроля на изотип (Isotype) и в группе положительного контроля (Sintilimab) одновременно.
Экспериментальные материалы: 6-8-недельные самки мышей с внедренным геном hPD1 Knock-in (на фоне C57BL/6, источник: BeijingVitalstarBiotechnologyCo., Ltd.); клетки MC38 (NationalInfrastructureofCellLineResources); БСА (Gibco, 10091-148), 0,25% трипсин-ЭДТА (Gibco, 25200056), ДМСО (Sigma, D2650), фосфатно-солевой буфер Дюльбекко (Hyclone, SH30028.02), пенициллин-стрептомицин (Gibco, 15140122), среда DMEM с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965084), фетальная телячья сыворотка (Gibco) и глутамин (Gibco).
Приборы и оборудование: электронные весы (ShanghaiSunnyHengpingScientificInstrumentCo., Ltd., JA12002), штангенциркуль (ShanghaiMenetIndustrialCo., Ltd., MNT-150T), микроскоп (ChongqingOptecInstrumentCo., Ltd., BDS200), медицинская центрифуга (HunanXiangyiLaboratoryInstrumentDevelopmentCo., Ltd., L530R), водяная баня с постоянной температурой и цифровым дисплеем (PrecisionMachineryCo., Ltd., HH-S), инкубатор с углекислым газом (PanasonicHealthcareCo., Ltd., Япония, MCO-18AC), двойной сверхчистый рабочий стол вертикального типа (WuxiYichunPurificationEquipmentCo., Ltd., SW-CJ-VS2).
Экспериментальные операции
Культивирование клеток: клетки MC38 культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (1:1).
Инокуляция: собирали клетки MC38 в логарифмической фазе роста и доводили до концентрации 3×106 клеток/мл. Отбирали 40 самок мышей hPD1 и инокулировали им подкожно клетки MC38 в объеме 0,1 мл на мышь, т.е. 3×105 клеток на мышь.
Введение: день инокуляции регистрировали как день 0 (D0). На 7-й день мышей случайным образом разбивали на 3 группы в зависимости от объема опухолей, по 8 мышей в каждой группе, и начинали введение (вводимая доза, способ и частота введения клеток модели опухоли MC38 представлены в таблице 11).
Регистрация данных: измерение и запись объема опухолей начинали в D7, а затем два раза в неделю штангенциркулем измеряли длину и ширину опухолей. Объем опухолей рассчитывали по формуле: (1/2)×длина×(ширина)2. Когда мыши достигали конечной точки эксперимента (объем опухолей превышал 2000 мм3, достигая конечной точки с точки зрения гуманности), мышей забивали путем смещения шейных позвонков и регистрировали кривую выживаемости.
2. Экспериментальные результаты
Результаты по влиянию гуманизованного антитела против PD-1 на объем опухолей представлены в таблице 12 и на фиг. 4. Видно, что по сравнению с группой изотипа гуманизованное антитело против PD-1 (c53) оказывало значительный ингибирующий эффект на рост опухолей на модели опухолей MC38 (TGI = 104,44%, у 7 мышей было полное устранение опухолей), что сравнимо с противоопухолевым эффектом в группе синтилимаба (TGI = 105,81%, 7 мышей были полностью свободны от опухолей).
Результаты по влиянию гуманизованного антитела против PD-1 на выживаемость мышей представлены на фиг. 5. Видно, что по сравнению с группой изотипа гуманизованное антитело против PD-1 (c53) явно повышало выживаемость мышей.
Приведенные выше результаты показывают, что гуманизованное антитело против PD-1 (c53), представленное в настоящей заявке, способно значительно ингибировать рост клеток MC38, эффективно повышать выживаемость мышей и оказывать значительный лечебный эффект при лечении рака толстой кишки у мышей.
Вышеприведенные воплощения являются предпочтительными воплощениями настоящей заявки. Однако реализация настоящей заявки не ограничивается приведенными выше воплощениями. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения, произведенные без отхода от духовной сущности и принципа настоящей заявки, должны быть эквивалентным способом замены, и все они включены в заявленный объем настоящей заявки.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> Guangdong Fapon Biopharma Inc.
<120> ANTI-PD-1 HUMANIZED ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF
AND APPLICATION THEREOF
<130> PN214664FPSW
<150> CN202110654827.4
<151> 2021-06-11
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 1
ccgcaagctt gccgccacca tg 22
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 2
ccggaattct cattaatggt gatggtgatg atgctggaac tggccggcag gtc 53
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c22 VH
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c43 VH
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c53 VH
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c22 VL
<400> 6
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Tyr His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Leu Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c43/c53 VL
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Tyr His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Leu Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1
<400> 8
Thr Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2
<400> 9
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3
<400> 10
Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR1
<400> 11
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR2
<400> 12
Leu Ala Tyr His Leu Glu Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3
<400> 13
Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Ile Thr
1 5
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region
<400> 15
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Tyr His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Leu Pro Ile Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<---
Claims (15)
1. Гуманизованное антитело против PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие область CDR легкой цепи и область CDR тяжелой цепи, причем область CDR тяжелой цепи состоит из HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а область CDR легкой цепи состоит из LCDR1, LCDR2 и LCDR3, аминокислотные последовательности HCDR1 и HCDR3 представлены последовательно в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10, а аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 представлены последовательно в SEQ ID NO: 11-13, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в любой из SEQ ID NO: 3-5.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в любой из SEQ ID NO: 6-7.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 3, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 6, или
аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 4, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 7, или
аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 5, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 7.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, при этом антитело содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, причем константная область тяжелой цепи представляет собой любой один или несколько из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE или IgM; а константная область легкой цепи представляет собой κ- или λ-цепь.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, при этом антитело представляет собой химерное антитело, а антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любой один или несколько из F(ab′)2, Fab, scFv, Fv и однодоменного антитела.
6. Нуклеиновая кислота, кодирующая гуманизованное антитело против PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5.
7. Нуклеиновая кислота по п. 6, которая включает: первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
8. Вектор, несущий нуклеиновую кислоту по п. 6 или 7, где вектор является экспрессирующим вектором.
9. Клетка, экспрессирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из п.п. 1-5, где указанная клетка включает нуклеиновую кислоту по п. 6 или 7 или вектор по п. 8.
10. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, опосредованного PD-1, включающая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, нуклеиновую кислоту по п. 6 или 7, вектор по п. 8 или клетку по п. 9 и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
11. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, нуклеиновой кислоты по п. 6 или 7, вектора по п. 8, клетки по п. 9 или фармацевтической композиции по п. 10 при получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного PD-1.
12. Способ лечения заболевания или состояния, опосредованного PD-1, включающий:
введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, нуклеиновой кислоты по п. 6 или 7, вектора по п. 8, клетки по п. 9 или фармацевтической композиции по п. 10.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110654827.4 | 2021-06-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2024100349A RU2024100349A (ru) | 2024-01-17 |
| RU2829508C2 true RU2829508C2 (ru) | 2024-10-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010029434A1 (en) * | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Isis Innovation Limited | Pd-1 specific antibodies and uses thereof |
| RU2656181C1 (ru) * | 2016-07-13 | 2018-05-31 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Анти-pd-1-антитела, способ их получения и способ применения |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010029434A1 (en) * | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Isis Innovation Limited | Pd-1 specific antibodies and uses thereof |
| RU2656181C1 (ru) * | 2016-07-13 | 2018-05-31 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Анти-pd-1-антитела, способ их получения и способ применения |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HUI ZHOU et al., Safety and Efficacy of Anti-PD-1 Monoclonal Antibodies in Patients With Relapsed or Refractory Lymphoma: A Meta-Analysis of Prospective Clinic Trails, Front Pharmacol, 2019; 10: 387. MINGZHU WANG et al., Identification of a monoclonal antibody that targets PD-1 in a manner requiring PD-1 Asn58 glycosylation, Communications Biology, 2019, volume 2, Article number: 392. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12234286B2 (en) | Anti-TIGIT antibodies and their use as therapeutics and diagnostics | |
| RU2739610C1 (ru) | Антитело против PD-1 и его применение | |
| TWI866043B (zh) | 細胞毒性t淋巴球相關蛋白4(ctla-4)之新穎單株抗體 | |
| US20250019436A1 (en) | Bispecific Antibody against TIGIT and PD-L1, and Pharmaceutical Composition Thereof and Use Thereof | |
| JP7745657B2 (ja) | 抗ｐｄ－１ヒト化抗体又はその抗原結合性断片及びその使用 | |
| RU2829508C2 (ru) | Гуманизованное антитело против pd-1 или его антигенсвязывающий фрагмент и их применение | |
| CN115466329B (zh) | 一种抗pd-1人源化抗体及其应用 | |
| EP4620974A1 (en) | Anti-afp/hla02 tcr-like antibody and use thereof | |
| WO2024082178A1 (zh) | 靶向cd19和cd22的双特异性嵌合抗原受体 | |
| WO2023016554A1 (zh) | 靶向cd22的抗原结合蛋白及其用途 | |
| JP2025542097A (ja) | 抗ａｆｐ／ｈｌａ０２ ｔｃｒ様抗体及びその使用 | |
| HK40031598B (zh) | 抗tigit抗体及其作为治疗和诊断的用途 |