RU2825400C1 - METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OMP25d-OMP19-OMP10his - Google Patents
METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OMP25d-OMP19-OMP10his Download PDFInfo
- Publication number
- RU2825400C1 RU2825400C1 RU2024100169A RU2024100169A RU2825400C1 RU 2825400 C1 RU2825400 C1 RU 2825400C1 RU 2024100169 A RU2024100169 A RU 2024100169A RU 2024100169 A RU2024100169 A RU 2024100169A RU 2825400 C1 RU2825400 C1 RU 2825400C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sdwp
- omp25d
- omp19
- protein
- omp10his
- Prior art date
Links
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 60
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 abstract 1
- 101150018410 omp10 gene Proteins 0.000 description 20
- 101150095684 omp19 gene Proteins 0.000 description 20
- 101100190851 Chlamydia pneumoniae pmp9 gene Proteins 0.000 description 19
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 101150048507 SYNJ2BP gene Proteins 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 241000589568 Brucella ovis Species 0.000 description 4
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- 241000164109 Brucella abortus 544 Species 0.000 description 3
- 102100035581 Synaptojanin-2-binding protein Human genes 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 101150109940 omp25 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150004747 omp31 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010036162 GATC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 101150063378 OMP gene Proteins 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 101150028926 bp26 gene Proteins 0.000 description 2
- 229960005203 brucella antigen Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 108010068996 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 description 1
- 241000508772 Brucella sp. Species 0.000 description 1
- 101100366043 Caenorhabditis elegans sms-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 101150077062 pal gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биофармакологии, к областям получения и производства иммунобиологических препаратов, медицинской микробиологии, созданию фармакологических и вакцинных композиций, биотехнологиям продукции рекомбинантных белков, и касается разработки нового способа получения рекомбинантного химерного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающего три белка Brucellaabortus, перспективного для использования в составе вакцины против бруцеллезной инфекции.The invention relates to biotechnology, specifically to biopharmacology, to the fields of obtaining and producing immunobiological preparations, medical microbiology, creating pharmacological and vaccine compositions, biotechnology for producing recombinant proteins, and concerns the development of a new method for obtaining a recombinant chimeric protein OMP25d-OMP19-OMP10His, including three Brucella abortus proteins, promising for use in a vaccine against brucellosis infection.
Основной сферой применения предлагаемого способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His являются биомедицина, создание медицинских профилактических препаратов, лабораторные биологические и медицинские исследования, создание субъединичных вакцин и вакцинных штаммов для профилактики бруцеллеза.The main area of application of the proposed method for obtaining the recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His is biomedicine, the creation of medical prophylactic drugs, laboratory biological and medical research, the creation of subunit vaccines and vaccine strains for the prevention of brucellosis.
Бруцеллез - это широко распространенное в мире зоонозное заболевание, поражающее как животных, так и человека. Специфическая профилактика является одной из мер по борьбе с распространением данной инфекции. В России, в отличие от большинства стран мира, проводится вакцинация людей против бруцеллеза с помощью штамма Brucellaabortus 19ВА, однако, она применяется только у определенной категории лиц в случае угрозы заражения B. melitensis. Ограниченное применение данной вакцины связано с риском возникновения побочных эффектов, обусловленных остаточными вирулентностью и реактогенностью живого вакцинного штамма. Поэтому совершенствование специфической профилактики бруцеллеза остается актуальной задачей (Коршенко В.А., Щипелева И.А., Кретенчук О.Ф., Марковская Е.И. Прошлое, настоящее, перспективы и проблемы совершенствования специфической профилактики бруцеллёза. Медицинский вестник Юга России. – 2021. – V.12(3). – PP.12-21. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2021-12-3-12-21).Brucellosis is a widespread zoonotic disease in the world, affecting both animals and humans. Specific prevention is one of the measures to combat the spread of this infection. In Russia, unlike most countries in the world, people are vaccinated against brucellosis using the Brucella abortus 19BA strain, however, it is used only in a certain category of people in the event of a threat of infection with B. melitensis . The limited use of this vaccine is associated with the risk of side effects caused by residual virulence and reactogenicity of the live vaccine strain. Therefore, improving the specific prevention of brucellosis remains an urgent task (Korshenko V.A., Shchipeleva I.A., Kretenchuk O.F., Markovskaya E.I. Past, present, prospects and problems of improving the specific prevention of brucellosis. Medical Bulletin of the South of Russia. - 2021. - V.12(3). - PP.12-21. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2021-12-3-12-21).
Субъединичные и ДНК-вакцины, основанные на иммуногенности иммунодоминантных бруцеллезных белков, могут обладать рядом преимуществ по сравнению с традиционными живыми вакцинами, такими как безопасность, отсутствие «балластных» белков и нуклеиновых кислот, повышающих реактогенность и аллергенность препарата, простота производства, транспортировки и использования, легкая масштабируемость, возможность комбинирования с белковыми вакцинами, направленными на защиту от других патогенов. Однако применение моновалентных субъединичных вакцин не может обеспечить достаточного уровня протективности. Одним из вариантов решения данной проблемы, наряду с применением адъювантов, является использование коктейля из антигенов, например, в виде слитых белков, состоящих из нескольких иммуногенных белков бруцелл. Subunit and DNA vaccines based on the immunogenicity of immunodominant brucellosis proteins may have a number of advantages over traditional live vaccines, such as safety, the absence of "ballast" proteins and nucleic acids that increase the reactogenicity and allergenicity of the drug, ease of production, transportation and use, easy scalability, the possibility of combining with protein vaccines aimed at protecting against other pathogens. However, the use of monovalent subunit vaccines cannot provide a sufficient level of protection. One of the options for solving this problem, along with the use of adjuvants, is the use of a cocktail of antigens, for example, in the form of fusion proteins consisting of several immunogenic Brucella proteins.
На данный момент изучен вакцинный потенциал большого количества как единичных антигенов (OMP2b, OMP10, OMP16, OMP19, OMP28, OMP25, OMP31, L7/L12, P39, так и их комбинаций (rL7/L12-TOmp31, rOmp10-rOmp19-rOmp28, rOmp31+rTF, в том числе слитых белков бруцелл Omp10-Omp28-L7/L12 (Zhu L, Wang Q., Wang Y., Xu Y., Peng D., Huang H., Hu L., Wei K., Zhu R. / Comparison of Immune Effects Between Brucella Recombinant Omp10-Omp28-L7/L12 Proteins Expressed in Eukaryotic and Prokaryotic Systems. // Front Vet Sci. - 2020. - V.18; 7. - P.576. DOI: 10.3389/fvets.2020.00576), L7/L12-TOmp31-SOmp2b (Golshani M., Rafati S., Jahanian-Najafabadi A., Nejati-Moheimani M., Siadat S.D., et al. / In silico design, cloning and high-level expression of L7/L12-TOmp31 fusion protein of Brucella antigens. // Res Pharm Sci. – 2015. - V.10(5). PP.436-45), L7/L12-OMP22-OMP25-OMP31 (Li Z., Wang S., Wei S., Yang G., Zhang C., et al. Immunization with a combination of recombinant Brucella abortus proteins induces T helper immune response and confers protection against wild-type challenge in BALB/c mice. // Microb Biotechnol. - 2022. - V.15(6). - PP.1811-1823. DOI: 10.1111/1751-7915.14015), L7/L12-Omp25 (Gupta S., Mohan S., Somani V.K., Aggarwal S., Bhatnagar R. Simultaneous Immunization with Omp25 and L7/L12 Provides Protection against Brucellosis in Mice. Pathogens. - 2020. - V.24; 9(2). -P.152. DOI: 10.3390/pathogens9020152), Adk-SecB (Huy T.X.N., Bernardo Reyes A.W., Vu S.H., Arayan L.T., Hop H.T., et al. Immunogenicity and protective response induced by recombinant Brucella abortus proteins Adk, SecB and combination of these two recombinant proteins against a virulent strain B. abortus 544 infections in BALB/c mice. Microb Pathog. - 2020. - V.143. - P.104137. DOI: 10.1016/j.micpath.2020.104137), L7/L12-Omp25 (Paul S., Peddayelachagiri B.V., Nagaraj S., Konduru B., Batra H.V. / Protective and therapeutic efficacy study of divalent fusion protein rL7/L12-Omp25 against B. abortus 544 in presence of IFNγ. // Appl Microbiol Biotechnol. - 2018 - V.102(20). - PP 8895-8907. DOI: 10.1007/s00253-018-9314-9), L7/L12-SOmp2b (Golshani M., Ghasemian M., Gheibi N., Bouzari S./ In silico Design, and In vitro Expression of a Fusion Protein Encoding Brucella abortus L7/L12 and SOmp2b Antigens. // Adv Biomed Res. - 2018. - V.16; 7. - P21. DOI: 10.4103/abr.abr_10_17), которые показали хорошую иммунореактивность и протективность на мышах, однако, недостаточную для замены существующих методов специфической профилактики бруцеллеза.To date, the vaccine potential of a large number of both single antigens (OMP2b, OMP10, OMP16, OMP19, OMP28, OMP25, OMP31, L7/L12, P39) and their combinations (rL7/L12-TOmp31, rOmp10-rOmp19-rOmp28, rOmp31+rTF, including fusion proteins of Brucella Omp10-Omp28-L7/L12 (Zhu L, Wang Q., Wang Y., Xu Y., Peng D., Huang H., Hu L., Wei K., Zhu R. / Comparison of Immune Effects Between Brucella Recombinant Omp10-Omp28-L7/L12 Proteins Expressed in Eukaryotic and Prokaryotic Systems. // Front Vet Sci. - 2020. - V.18; 7. - P.576. DOI: 10.3389/fvets.2020.00576), L7/L12-TOmp31-SOmp2b (Golshani M., Rafati S., Jahanian-Najafabadi A., Nejati-Moheimani M., Siadat SD, et al. / In silico design, cloning and high-level expression of L7/L12-TOmp31 fusion protein of Brucella antigen s. // Res Pharm Sci. - 2015. - V.10(5). induces T helper immune response and confers protection against wild-type challenge in BALB/c mice. // Microb Biotechnol. - 2022. - V.15(6). - PP.1811-1823. DOI: 10.1111/1751-7915.14015), L7/L12-Omp25 (Gupta S., Mohan S., Somani VK, Aggarwal S., Bhatnagar R. Simultaneous Immunization with Omp25 and L7/L12 Provides Protection against Brucellosis in Mice. Pathogens. - 2020. - V.24; 9(2). .152. DOI: 10.3390/pathogens9020152), Adk-SecB (Huy TXN, Bernardo Reyes AW, Vu SH, Arayan LT, Hop HT, et al. Immunogenicity and protective response induced by recombinant Brucella abortus proteins Adk, SecB and combination of these two recombinant proteins against a virulent strain B. abortus 544 infections in BALB/c mice. Microb Pathog. - 2020. - V.143. - P.104137. DOI: 10.1016/j.micpath.2020.104137), L7/L12-Omp25 (Paul S., Peddayelachagiri BV, Nagaraj S., Konduru B., Batra HV / Protective and therapeutic efficacy study of divalent fusion protein rL7/L12-Omp25 against B. abortus 544 in the presence of IFNγ. // Appl Microbiol Biotechnol. - 2018 - V.102(20). - PP 8895-8907. DOI: 10.1007/s00253-018-9314-9), L7/L12-SOmp2b (Golshani M., Ghasemian M., Gheibi N., Bouzari S ./ In silico Design, and In vitro Expression of a Fusion Protein Encoding Brucella abortus L7/L12 and SOmp2b Antigens. // Adv Biomed Res. - 2018. - V.16; 7. - P21. DOI: 10.4103/abr.abr_10_17), which showed good immunoreactivity and protective activity in mice, however, insufficient to replace existing methods of specific prevention of brucellosis.
Выбор антигенного состава, кодируемого предлагаемой генно-инженерной конструкцией, обусловлен тем, что белки наружной мембраны OMP25d, OMP19 и OMP10 Brucella spp. - протеины, экспонированные на поверхности микробной клетки, высоко консервативны, экспрессируются у представителей всех биоваров шести патогенных видов бруцелл и связаны с вирулентностью (Martín-Martín A.I., Caro-Hernández .P, Orduña A., Vizcaíno N., Fernández-Lago L. / Importance of the Omp25/Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B. ovis in murine macrophages and HeLa cells. // Microbes Infect. -2008. V.10(6). - PP.706-10. DOI: 10.1016/j.micinf.2008.02.013). Показано, что белки OMP10 и OMP19 стимулируют у мышей продукцию IgG антител, а также индуцируют провоспалительный иммунный ответ в клетках человеческой моноцитарной клеточной линии (Im Y.B, Park W.B., Jung M., Kim S., Yoo H.S. / Comparative Analysis of Immune Responses to Outer Membrane Antigens OMP10, OMP19, and OMP28 of Brucella abortus. // Jpn J Infect Dis. -2018. - V.24; 71(3). - PP.197-204. DOI: 10.7883/yoken.JJID.2017.019). Была изучена возможность использования OMP19 в качестве адъюванта в связи с его высокой иммуногенностью Risso G.S., Carabajal M.V., Bruno L.A., Ibañez A.E., Coria L.M., Pasquevich K.A., Lee S.J., McSorley S.J., Briones G., Cassataro J. / U-Omp19 from Brucella abortus Is a Useful Adjuvant for Vaccine Formulations against Salmonella Infection in Mice. // Front Immunol. - 2017 - V.17; 8. - PP171. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00171). Кроме того, установлено, что in vitro белки OMP10 и OMP19 участвуют в регуляции созревания и презентации антигена мышиными дендритными клетками (Yang N., Tong Z., Wang Z., et al. / Brucella outer membrane proteins to control maturation and antigen presentation of mouse dendritic cells. // bioRxiv; - 2021. DOI: 10.1101/2021.03.05.434055). OMP25d относится к семейству высококонсервативных белков наружной мембраны OMP25/OMP31, которое включает семь гомологов (OMP25, OMP25b, OMP25c, OMP25d, OMP31, OMB31b и OMP22) играет важную роль в поддержании целостности клеточной оболочки бруцелл (Roop R.M. 2nd, Barton I.S., Hopersberger D., Martin D.W. / Uncovering the Hidden Credentials of Brucella Virulence. // Microbiol Mol Biol Rev. - 2021. - V.10; 85(1). - PPe00021-19. DOI: 10.1128/MMBR.00021-19). Было показано, что инактивация гена omp25d у B. ovis PA приводит к значительному снижению вирулентности патогенна у мышей, а также, что OMP25d непосредственно вовлечен в проникновение и выживание B. ovis PA внутри клеток хозяина (Caro-Hernández P., Fernández-Lago L., de Miguel M.J., Martín-Martín A.I., Cloeckaert A., Grilló M.J., Vizcaíno N. / Role of the Omp25/Omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis. // Infect Immun. 2007 - V.75(8). - PP4050-61. DOI: 10.1128/IAI.00486-07). В частности, в формирование репликативной фагосомы (бруцелласомы), необходимой для правильного внутриклеточного размножения. В недавнем исследовании было показано, что транскрипционный фактор ArsR6, который активируется в условиях теплового, оксидативного и осмотического стресса и регулирует поддержание бактериального внутриклеточного гомеостаза Cu/Ni в клетках хозяина, также модулирует экспрессию гена omp25d (Zhi F., Zhou D., Chen J., Fang J., Zheng W., Li J., Hao M., Shi Y., Jin Y., Wang A. / An ArsR Transcriptional Regulator Facilitates Brucella sp. Survival via Regulating Self and Outer Membrane Protein. // Int J Mol Sci. - 2021. - V.22(19). - P10860. DOI: 10.3390/ijms221910860).The choice of the antigen composition encoded by the proposed genetically engineered construct is due to the fact that the outer membrane proteins OMP25d, OMP19 and OMP10 of Brucella spp. - proteins exposed on the surface of the microbial cell are highly conserved, expressed in representatives of all biovars of six pathogenic species of Brucella and are associated with virulence (Martín-Martín AI, Caro-Hernández .P, Orduña A., Vizcaíno N., Fernández-Lago L. / Importance of the Omp25/Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B. ovis in murine macrophages and HeLa cells. // Microbes Infect. - 2008. V.10(6). - PP.706-10. DOI: 10.1016/j.micinf.2008.02.013). It has been shown that OMP10 and OMP19 proteins stimulate the production of IgG antibodies in mice and induce a proinflammatory immune response in human monocytic cell lines (Im YB, Park WB, Jung M., Kim S., Yoo HS / Comparative Analysis of Immune Responses to Outer Membrane Antigens OMP10, OMP19, and OMP28 of Brucella abortus. // Jpn J Infect Dis. - 2018. - V.24; 71(3). - PP.197-204. DOI: 10.7883/yoken.JJID.2017.019). The possibility of using OMP19 as an adjuvant was studied due to its high immunogenicity Risso GS, Carabajal MV, Bruno LA, Ibañez AE, Coria LM, Pasquevich KA, Lee SJ, McSorley SJ, Briones G., Cassataro J. / U-Omp19 from Brucella abortus Is a Useful Adjuvant for Vaccine Formulations against Salmonella Infection in Mice. // Front Immunol. - 2017 - V.17; 8. - PP171. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00171). In addition, it was found that in vitro the proteins OMP10 and OMP19 are involved in the regulation of maturation and antigen presentation by mouse dendritic cells (Yang N., Tong Z., Wang Z., et al. / Brucella outer membrane proteins to control maturation and antigen presentation of mouse dendritic cells. // bioRxiv; - 2021. DOI: 10.1101/2021.03.05.434055). OMP25d belongs to the OMP25/OMP31 family of highly conserved outer membrane proteins, which includes seven homologues (OMP25, OMP25b, OMP25c, OMP25d, OMP31, OMB31b, and OMP22) and plays an important role in maintaining the integrity of the Brucella cell membrane (Roop RM 2nd, Barton IS, Hopersberger D., Martin DW / Uncovering the Hidden Credentials of Brucella Virulence. // Microbiol Mol Biol Rev. - 2021. - V.10; 85(1). - PPe00021-19. DOI: 10.1128/MMBR.00021-19). It was shown that inactivation of the omp25d gene in B. ovis PA leads to a significant decrease in the virulence of the pathogen in mice, and that OMP25d is directly involved in the penetration and survival of B. ovis PA inside host cells (Caro-Hernández P., Fernández-Lago L., de Miguel MJ, Martín-Martín AI, Cloeckaert A., Grilló MJ, Vizcaíno N. / Role of the Omp25/Omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis. // Infect Immun. 2007 - V.75(8). - PP4050-61. DOI: 10.1128/IAI.00486-07). In particular, in the formation of the replicative phagosome (brucellasome), necessary for proper intracellular reproduction. A recent study showed that the transcription factor ArsR6, which is activated under thermal, oxidative and osmotic stress conditions and regulates the maintenance of bacterial intracellular Cu/Ni homeostasis in host cells, also modulates the expression of the omp25d gene (Zhi F., Zhou D., Chen J., Fang J., Zheng W., Li J., Hao M., Shi Y., Jin Y., Wang A. / An ArsR Transcriptional Regulator Facilitates Brucella sp. Survival via Regulating Self and Outer Membrane Protein. // Int J Mol Sci. - 2021. - V.22(19). - P10860. DOI: 10.3390/ijms221910860).
На данный момент не найдено публикаций о клонировании данного бруцеллезного белка и оценки его вакцинного потенциала.At present, no publications have been found on the cloning of this brucellosis protein and the assessment of its vaccine potential.
Известен способ получения рекомбинантных антигенов для создания бруцеллезной вакцины на основе системы экспрессии Escherichia coli и оценки их вакцинного потенциала (Akbari R., Sekhavati M.H., Bahrami A., Majidzadeh Heravi R., Yousefi S. / Production of Brucella lumazine Synthase Recombinant Protein to Design a Subunit Vaccine against Undulant Fever // Arch Razi Inst. - 2019. - V.74(1). - P.1-6. DOI: 10.22092/ari.2019.117997. Abdollahi A., Mansouri S., Amani J., Fasihi-Ramandi M., Ranjbar R., et al. / A Recombinant Chimera Protein as a Novel Brucella Subunit Vaccine: Protective Efficacy and Induced Immune Response in BALB/c Mice. // Jundishapur J Microbiol. - 2018. - V.11(1). - Р.e12776. https://doi.org/10.5812/jjm.12776. Yousefi S., Abbassi-Daloii T., Sekhavati M.H., Tahmoorespur M. / Evaluation of immune responses induced by polymeric OMP25-BLS Brucella antigen. // Microb Pathog. – 2018. – V.115. - P.50-56. DOI: 10.1016/j.micpath.2017.12.045.). Однако несмотря на многолетние исследования, до сих пор ни один из препаратов на основе рекомбинантных бруцеллезных белков не прошел клинические испытания. A method for producing recombinant antigens for creating a brucellosis vaccine based on the Escherichia coli expression system and assessing their vaccine potential is known (Akbari R., Sekhavati MH, Bahrami A., Majidzadeh Heravi R., Yousefi S. / Production of Brucella lumazine Synthase Recombinant Protein to Design a Subunit Vaccine against Undulant Fever // Arch Razi Inst. - 2019. - V.74(1). - P.1-6. DOI: 10.22092/ari.2019.117997. Abdollahi A., Mansouri S., Amani J., Fasihi-Ramandi M., Ranjbar R., et al. / A Recombinant Chimera Protein as a Novel Brucella Subunit Vaccine: Protective Efficacy and Induced Immune Response in BALB/c Mice. // Jundishapur J Microbiol. - 2018. - V.11(1). - P.e12776. https://doi.org/10.5812/jjm.12776. Yousefi S., Abbassi-Daloii T., Sekhavati MH, Tahmoorespur M. / Evaluation of immune responses induced by polymeric OMP25-BLS Brucella antigen. // Microb Pathog. – 2018. – V.115. - P.50-56. DOI: 10.1016/j.micpath.2017.12.045.). However, despite many years of research, none of the drugs based on recombinant brucellosis proteins has passed clinical trials.
Изобретение решает задачу создания способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, который может быть использован в качестве компонента вакцин против бруцеллеза.The invention solves the problem of creating a method for producing a recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His, which can be used as a component of vaccines against brucellosis.
Поставленная задача решается путем разработки способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающего создание генетической конструкции, размером 1524 н.п., включающей гены белков OMP25d, OMP19, OMP10 без сигнальных пептидов, последовательности линкеров, гистидинового тага, конструирование плазмиды pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 6871 п.н., трансформацию клеток E. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, культивирование полученного штамма E. coli BL21(DE3)/ pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His при температуре 37 °С в течение 4 часов при температуре 37 °С, получение фракции телец включения бактерий-продуцентов, очистку белка OMP25d-OMP19-OMP10His металл-хелатной хроматографией из телец включения в денатурирующих условиях.The stated problem is solved by developing a method for obtaining a recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His, including the creation of a genetic construct, 1524 bp in size, including the genes of the proteins OMP25d, OMP19, OMP10 without signal peptides, linker sequences, a histidine tag, construction of the plasmid pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 6871 bp, transformation of E. coli BL21(DE3) cells with the recombinant plasmid pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, culturing the resulting E. coli BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His strain at 37 °C for 4 hours at 37 °C, obtaining the inclusion body fraction of producer bacteria, purifying the OMP25d-OMP19-OMP10His protein by metal chelate chromatography from inclusion bodies under denaturing conditions.
Техническим результатом изобретения является способ продукции и очистки из телец включения бактерий гомогенного рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His с чистотой 98%, содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг и выходом 0,2 г с литра бактериальной культуры, применимый для получения больших количеств данного белка, пригодного для использования в биотехнологии и фармакологии при разработке и производстве вакцинных препаратов.The technical result of the invention is a method for producing and purifying from bacterial inclusion bodies a homogeneous recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His with a purity of 98%, a bacterial endotoxin content of no more than 5 IU/mg and a yield of 0.2 g per liter of bacterial culture, applicable for obtaining large quantities of this protein, suitable for use in biotechnology and pharmacology in the development and production of vaccine preparations.
Технический результат изобретения достигается за счет получения генов бруцеллезных белков OMP25d, OMP19, OMP10 при помощи ПЦР с геномной ДНК штамма B. abortus 544 с использованием специфических праймеров, кодирующих сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции NdeI, XhoI.The technical result of the invention is achieved by obtaining genes of brucellosis proteins OMP25d, OMP19, OMP10 using PCR with genomic DNA of strain B. abortus 544 using specific primers encoding cleavage sites by restriction endonucleases NdeI, XhoI.
Технический результат изобретения достигается за счет получения последовательности ДНК, определяющей синтез белка OMP25d-OMP19-OMP10His за счет соединения генов трех белков и линкеров при помощи СОЭ-ПЦР с использованием специфических праймеров.The technical result of the invention is achieved by obtaining a DNA sequence that determines the synthesis of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein by connecting the genes of three proteins and linkers using ESR-PCR using specific primers.
Также технический результат изобретения достигается за счет конструирования плазмиды pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, содержащей промоторную последовательность ДНК бактериофага T7, ген устойчивости к антибиотику, последовательность ДНК, кодирующую белок OMP25d-OMP19-OMP10His, и синтетическую последовательность шести гистидинов для очистки белка металл-хелатной хроматографией.The technical result of the invention is also achieved by constructing the plasmid pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, containing the promoter sequence of DNA of the bacteriophage T7, the antibiotic resistance gene, the DNA sequence encoding the protein OMP25d-OMP19-OMP10His, and the synthetic sequence of six histidines for protein purification by metal chelate chromatography.
Также технический результат изобретения достигается за счет получения штамма BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His на основе штамма E.coli BL21(DE3), трансформированного плазмидой pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, экспрессирующей белок OMP25d-OMP19-OMP10His.The technical result of the invention is also achieved by obtaining the BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His strain based on the E. coli BL21(DE3) strain transformed with the pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His plasmid expressing the OMP25d-OMP19-OMP10His protein.
Также технический результат изобретения достигается за счет продукции рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His в бактериях E. coli штамма BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His в течение 4 часов при температуре 37 °C, что обеспечивает накопление рекомбинантного белка в цитоплазме бактерий преимущественно в тельцах включения.The technical result of the invention is also achieved by producing the recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His in E. coli bacteria of the BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His strain for 4 hours at a temperature of 37 °C, which ensures the accumulation of the recombinant protein in the cytoplasm of the bacteria mainly in inclusion bodies.
Также технический результат изобретения достигается получением цитоплазматической фракции бактериальных белков за счет процедуры ультразвуковой дезинтеграции бактерий и обработки лизоцимом, что приводит к разрушению клеточной стенки и разделению цитоплазмы и сферопластов бактерий.The technical result of the invention is also achieved by obtaining a cytoplasmic fraction of bacterial proteins through the procedure of ultrasonic disintegration of bacteria and treatment with lysozyme, which leads to the destruction of the cell wall and the separation of the cytoplasm and spheroplasts of bacteria.
Также технический результат изобретения достигается благодаря схеме очистки белка OMP25d-OMP19-OMP10His с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке c иммобилизованным бивалентным металлом в денатурирующих условиях, позволяющей получить гомогенный белок, характеризующийся 98% чистотой по данным электрофореза и денситометрии и содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг белка.The technical result of the invention is also achieved thanks to a scheme for purifying the OMP25d-OMP19-OMP10His protein using metal-chelate chromatography on a column with an immobilized bivalent metal under denaturing conditions, which makes it possible to obtain a homogeneous protein characterized by 98% purity according to electrophoresis and densitometry data and a bacterial endotoxin content of no more than 5 IU/mg protein.
Отличием предлагаемого способа является высокий выход растворимого рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His (0,2 г с литра бактериальной культуры), достигаемый за счет особенностей конструирования продуцента BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, сохранение белка в растворимой стабильной форме после диализа из раствора с денатурирующим агентом 6М мочевины в раствор с ФСБ, pH=7,4, а также после замораживания.The distinctive feature of the proposed method is the high yield of soluble recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His (0.2 g per liter of bacterial culture), achieved due to the design features of the producer BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, preservation of the protein in a soluble stable form after dialysis from a solution with a denaturing agent 6 M urea into a solution with PBS, pH = 7.4, and also after freezing.
Существенным достоинством предлагаемого способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His является низкий уровень содержания бактериального эндотоксина в конечном препарате (5 IU/мг белка), допустимый для применения в инъекциях как по российским, так и по международным стандартам (XII издание Государственной фармакопеи Российской Федерации; Международная фармакопея ВОЗ, документ QAS/11.452 FINAL, июль 2012 г.). Таким образом, полученный по данному способу рекомбинантный белок OMP25d-OMP19-OMP10His пригоден для разработки и производства вакцин.A significant advantage of the proposed method for obtaining the recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His is the low level of bacterial endotoxin in the final product (5 IU/mg protein), which is acceptable for use in injections according to both Russian and international standards (12th edition of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation; International Pharmacopoeia of WHO, document QAS/11.452 FINAL, July 2012). Thus, the recombinant protein OMP25d-OMP19-OMP10His obtained by this method is suitable for the development and production of vaccines.
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:The invention is illustrated by the following graphic materials:
фиг. 1. Схема организации рекомбинантной плазмиды pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, где: OMP – клонированный фрагмент, включающий гены белков OMP25d, OMP19, OMP10 и линкеров; 6хHis - участок полигистидинового тага; NdeI и XhoI - уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, использованные при создании данной конструкции; T7 – промотор, присутствующий в рекомбинантной плазмиде; lacI – ген β-лактамазы, обеспечивающий трансформированным бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину.Fig. 1. Scheme of organization of recombinant plasmid pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, where: OMP is a cloned fragment including genes of proteins OMP25d, OMP19, OMP10 and linkers; 6xHis is a region of polyhistidine tag; NdeI and XhoI are unique restriction endonuclease sites used in creation of this construct; T7 is a promoter present in the recombinant plasmid; lacI is a β-lactamase gene providing transformed bacterial cells with resistance to ampicillin.
фиг. 2. Электрофоретический анализ ДНК, где маркер - ThermoScientific™ O'GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, 1 - pET32b, 2 - ген белка OMP25d-OMP19-OMP10His, 3 - pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 4 - ген omp25d, 4 - ген omp19, 5 - ген omp10.fig. 2. Electrophoretic DNA analysis, where the marker is ThermoScientific™ O'GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, 1 - pET32b, 2 - OMP25d-OMP19-OMP10His protein gene, 3 - pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966 502.1-His, 4 - omp25d gene, 4 - omp19 gene, 5 - omp10 gene.
фиг. 3. Трехмерная модель белка OMP25d-OMP19-OMP10His, где А, Б - представление модели белка в виде ленточной и сферической структур, соответственно, выделенных цветами радуги в направлении от N-конца аминокислотной последовательности (красный) к С-концу (фиолетовый).Fig. 3. Three-dimensional model of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein, where A, B are representations of the protein model as ribbon and spherical structures, respectively, highlighted in rainbow colors in the direction from the N-terminus of the amino acid sequence (red) to the C-terminus (purple).
фиг. 4. Электрофоретический анализ белка OMP25d-OMP19-OMP10His во время экспрессии, после очистки и диализа, где: Маркер ММ - маркер молекулярной массы белка PageRuler™ unstained Protein Ladder SM0661, Маркер 2 - маркер молекулярной массы белка окрашенный G2058-250UL, К - контроль штамм E. coli BL21(DE3), 0 ч - образец из осадка клеток до индукции, 4 ч - образец через 4 часа индукции 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ) при 37°С.Fig. 4. Electrophoretic analysis of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein during expression, after purification and dialysis, where: Marker MM is the molecular weight marker of the protein PageRuler™ unstained Protein Ladder SM0661, Marker 2 is the molecular weight marker of the protein stained G2058-250UL, K is the control strain E. coli BL21(DE3), 0 h is the sample from the cell pellet before induction, 4 h is the sample after 4 hours of induction with 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) at 37°C.
Изобретение осуществляют следующим образом:The invention is implemented as follows:
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют подробные примеры его конкретного выполнения со ссылками на прилагаемые таблицы и фигуры.For a better understanding of the essence of the invention, detailed examples of its specific implementation follow below with references to the attached tables and figures.
Пример 1.Example 1.
Создание нуклеотидных последовательностей гена белка OMP25d-OMP19-OMP10HisCreation of nucleotide sequences of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein gene
С помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - базовый инструмент поиска местного выравнивания) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) проводят анализ нуклеотидных последовательностей геномов 20 штаммов бруцелл, находящихся в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», и выявляют идентичность нуклеотидных последовательностей генов белков OMP25d, OMP19, OMP10 во всех штаммах. С помощью программы SignalP-6.0. (https://services.healthtech.dtu.dk/) устанавливают нуклеотидные последовательности лидерных пептидов в обоих генах белков. На основании вышеуказанных данных составляют нуклеотидную последовательность гена слитого белка из генов белков без участков, кодирующих лидерные пептиды, и 2 линкерами между ними. Схема организации гена белка OMP25d-OMP19-OMP10His представлена в таблице 1.Using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), we analyze the nucleotide sequences of the genomes of 20 Brucella strains from the State Collection of Pathogenic Microorganisms and Cell Cultures "GKPM-Obolensk" and reveal the identity of the nucleotide sequences of the OMP25d, OMP19, OMP10 protein genes in all strains. Using the SignalP-6.0 program (https://services.healthtech.dtu.dk/), we establish the nucleotide sequences of the leader peptides in both protein genes. Based on the above data, we compile a nucleotide sequence of the fusion protein gene from the protein genes without the regions encoding the leader peptides and with 2 linkers between them. The organization scheme of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein gene is presented in Table 1.
Пример 2.Example 2.
Коструирование плазмиды.Plasmid coarsening.
Плазмиду pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His конструируют в результате следующих манипуляций: амплификация генов белков ОМР25d (с участком, кодирующем линкер (696 н.п.)) OMP19 (471 н.п.), OMP10 (с участком, кодирующем линкер (381 н.п.)) без участков, кодирующих сигнальные последовательности, в ПЦР на матрице суммарной ДНК штамма B. abortus 544 с использованием праймеров Forward ОМР25d и Reverse ОМР25d (включает последовательность линкера), Forward OMP19 и Reverse ОМР19, а также Forward OMP10 (включает последовательность линкера) и Reverse ОМР10, где Plasmid pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His was constructed as a result of the following manipulations: amplification of the genes for the proteins OMP25d (with a region encoding a linker (696 bp)) OMP19 (471 bp), OMP10 (with a region encoding a linker (381 bp)) without regions encoding signal sequences, in PCR on the template of total DNA of the B. abortus 544 strain using the primers Forward OMP25d and Reverse OMP25d (includes a linker sequence), Forward OMP19 and Reverse OMP19, as well as Forward OMP10 (includes a linker sequence) and Reverse OMP10, where
Forward OMP25dForward OMP25d
5`- ggaattccatatggcggatgccattgttgcg -3`5`- ggaattccatatggcggatgccattgttgcg -3`
Reverse OMP25dReverse OMP25d
5`- gcctcggcgttgcctataagttcgaagctgctgcaaaagaagctgctgcaaa5`- gcctcggcgttgcctataagttcgaagctgctgcaaaagaagctgctgcaaa
agaagctgctgcaaaatgccaaagctcccggcttgg-3`agaagctgctgcaaaatgccaaagctcccggcttgg-3`
Forward OMP19Forward OMP19
5`- ggaattccatatgtgccaaagctcccggcttggtaat -3`5`- ggaattccatatgtgccaaagctcccggcttggtaat -3`
Reverse OMP19Reverse OMP19
5`- cccgctcgaggcgcgacagcgtcacggc -3`5`- cccgctcgaggcgcgacagcgtcacggc -3`
Forward OMP10Forward OMP10
5`- gccgtgacgctgtcgcgcggctccgctggctccgctgctggttctggcgagttctgcgaaacaacaggcccgggc -3`5`- gccgtgacgctgtcgcgcggctccgctggctccgctgctggttctggcgagttctgcgaaacaacaggcccgggc -3`
Reverse OMP10Reverse OMP10
5`- cccgctcgaggccggcgttgcggcgggt -3`.5`- cccgctcgaggccggcgttgcggcgggt -3`.
Затем проводят амплификацию гена слитого белка (omp) (1524 н.п.) в реакции СОЭ-ПЦР, где в качестве матрицы используют эквимолярные количества ДНК генов белков OMP25d (696 н.п.), OMP19 (471 н.п.) и OMP10 (381 н.п.), рестрикцию ПЦР-фрагмента гена omp эндонуклеазами NdeI и XhoI, лигирование его с рестрицированной эндонуклеазами NdeI и XhoI векторной ДНК, под контроль T7lac-промотора в векторе pET32b(+), трансформацию клеток E. coli DH5α; селекцию на среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, наращивание и выделение плазмиды, контроль вставки целевой ДНК в плазмиде с помощью ПЦР. Схема организации плазмиды представлена на фиг. 1. Электрофоретический анализ генов и плазмид представлен на фиг. 2.Then, the fusion protein gene (omp) (1524 bp) is amplified in the ESR-PCR reaction, where equimolar amounts of DNA from the OMP25d (696 bp), OMP19 (471 bp), and OMP10 (381 bp) protein genes are used as a template, the PCR fragment of the omp gene is restricted with NdeI and XhoI endonucleases, it is ligated with the vector DNA restricted with NdeI and XhoI endonucleases, under the control of the T7lac promoter in the pET32b(+) vector, transformation of E. coli DH5α cells is performed; selection on a medium containing 100 μg/ml ampicillin, plasmid growth and isolation, and control of the target DNA insertion into the plasmid is performed using PCR. The plasmid organization scheme is shown in Fig. 1. Electrophoretic analysis of genes and plasmids is shown in Fig. 2.
Пример 3.Example 3.
Секвенирование генов, аминокислотный состав белков, конструирование трехмерной модели белка.Gene sequencing, amino acid composition of proteins, construction of a three-dimensional protein model.
Для определения нуклеотидной последовательности гена слитого белка (omp), включающего гены белков OMP25d, OMP19 и OMP10, разделенных участком, кодирующем линкер, используют прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК. Определяют нуклеотидную последовательность гена omp. Секвенирование проводят на приборе ABI Applied Biosistems c использованием олигонуклеотидов, комплементарных последовательности нуклеотидов генов omp25d (Forward primer), omp10 (Reverse primer). На основании полученного результата определяют аминокислотную последовательность слитого белка OMP25d-OMP19-OMP10His с помощью компьютерной программы Translate (https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html). Аминокислотный состав белка представлен в таблице 2. Данные об аминокислотной последовательности слитого белка OMP25d-OMP19-OMP10His вносят в программу расчета трехмерной модели белка I-TASSER-MTD (https://zhanggroup.org/I-TASSER-MTD/). Уточнение структуры полученной модели слитого белка, а затем прогноз физико-химических и иммуногенных белка проводят с помощью методов обратной вакцинологии Bibi et al., 2021. Модель слитого белка представлена на фиг. 3.To determine the nucleotide sequence of the fusion protein gene ( omp ), including the genes of the OMP25d, OMP19 and OMP10 proteins separated by a region encoding a linker, a direct sequencing method is used without preliminary cloning of genomic DNA fragments. The nucleotide sequence of the omp gene is determined. Sequencing is performed on an ABI Applied Biosistems device using oligonucleotides complementary to the nucleotide sequence of the omp25d (Forward primer) and omp10 (Reverse primer) genes. Based on the result obtained, the amino acid sequence of the OMP25d-OMP19-OMP10His fusion protein is determined using the Translate computer program (https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html). The amino acid composition of the protein is presented in Table 2. Data on the amino acid sequence of the OMP25d-OMP19-OMP10His fusion protein are entered into the I-TASSER-MTD three-dimensional protein model calculation program (https://zhanggroup.org/I-TASSER-MTD/). The structure of the resulting fusion protein model is refined, and then the physicochemical and immunogenic properties of the protein are predicted using the reverse vaccinology methods of Bibi et al., 2021. The fusion protein model is shown in Fig. 3.
Табл. 2. Аминокислотные последовательности белков Table 2. Amino acid sequences of proteins
Пример 4Example 4
Получение штамма-продуцента белка OMP25d-OMP19-OMP10HisObtaining a strain producing the OMP25d-OMP19-OMP10His protein
Штамм-продуцент иммуногенного полипептида OMP25d-OMP19-OMP10His конструируют на основе протеазо-дефицитного штамма E. coli BL21(DE3) [F− ompThsdSB (rB− mB−) galdcm (DE3)], несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора (Novagen, США). Штамм получают в результате следующих манипуляций:The strain producing the immunogenic polypeptide OMP25d-OMP19-OMP10His is constructed on the basis of the protease-deficient strain E. coli BL21(DE3) [F− ompThsdSB (rB− mB−) galdcm (DE3)] , carrying the T7 RNA polymerase gene under the control of the lacUV5 promoter (Novagen, USA). The strain is obtained as a result of the following manipulations:
амплификации генов OMP25d, ОМР19, ОМР10 методом ПЦР, amplification of genes OMP25d, OMP19, OMP10 by PCR,
создание слитой конструкции с помощью метода СОЭ-ПЦР,creation of a fusion structure using the ESR-PCR method,
клонирования ПЦР-фрагмента в вектор pET32b(+), cloning of the PCR fragment into the pET32b(+) vector,
трансформации клеток реципиентного штамма. transformation of recipient strain cells.
В качестве матрицы в ПЦР используют ДНК штамма B. abortus 544. The DNA of the B. abortus 544 strain is used as a matrix in PCR.
Клетки E. coli трансформируют рекомбинантной плазмидой pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His и отбирают клоны с фенотипом ApR на селективной среде с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм получил название E. coli BL21(DE3) /pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His депонирован в ГКПМ-Оболенск с инв. № B-10100, свидетельства №444 от 5.09.2022. E. coli cells are transformed with the recombinant plasmid pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His and clones with the Ap R phenotype are selected on a selective medium with ampicillin (100 μg / ml). The strain was named E. coli BL21 (DE3) / pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His deposited in the State Comprehensive Plant of Microorganisms-Obolensk with inv. No. B-10100, certificate No. 444 dated 09/05/2022.
Пример 5.Example 5.
Выделение и очистка белка OMP25d-OMP19-OMP10His.Isolation and purification of OMP25d-OMP19-OMP10His protein.
Культуру E. coli выращивают при температуре 37°C в жидкой или на агаризованной среде Luria-Bertani (LB) c 100 мкг/мл ампициллина. Для выделения белка OMP25d-OMP19-OMP10His клетки E. coli BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His выращивают при температуре 37 °C в жидкой среде LB с антибиотиком и 1 мМ ИПТГ в лабораторном ферментере New Brunsuik Scientific с рабочим объемом 2 л в течение 4 ч. Клеточную суспензию центрифугируют 2800 g 15 мин, клетки ресуспендируют в буфере нанесения (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 6M мочевина, 10 мМ имидазол), вносят ФМСФ до 1 мМ, обрабатывали ДНКазой I (10000 ед./мл), лизоцимом (20 мг/мл) и озвучивают на дезинтеграторе UDM-10 («Techpan», Польша) при 44 кГц, 1,8 кВт, 10 раз по 30 с, при температуре 0 °С. Лизат клеток центрифугируют 37000 g 15мин. Наличие белка в лизате культуры клеток подтверждали ДСН - электрофорезом в 12% ПААГ, а присутствие полигистидинового тага – в иммуноблоте. Супернатант после центрифугирования лизата клеток наносят на колонку с 5 мл иминодиуксусной сефарозы (Iminodiacetic acid Sepharose, Sigma-Aldridge, Германия), предварительно насыщенной ионами никеля и уравновешенной буфером нанесения. Колонку промывают 10 объемами буфера нанесения, 3 объемами буфера с 30 мМ имидазола (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 8 M мочевина, 30 мМ имидазол), затем элюируют белок элюирующим буфером (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 250 мМ имидазол, 8 M мочевина, 500мМ NaCl). Белки диализуют против фосфатного буфера (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, рН=7,4) с добавлением ФМСФ до 1мМ в течение 16 часов при комнатной температуре. Препарат белка хранят в аликвотах при температуре -70 °С. Электрофоретический анализ экспрессии белка OMP25d-OMP19-OMP10His представлен на фиг. 4.The E. coli culture is grown at a temperature of 37°C in liquid or agar Luria - Bertani (LB) medium with 100 μg/ml ampicillin. To isolate the OMP25d-OMP19-OMP10His protein , E. coli BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His cells were grown at 37 °C in liquid LB medium with antibiotic and 1 mM IPTG in a New Brunswick Scientific laboratory fermenter with a working volume of 2 L for 4 h. The cell suspension was centrifuged at 2800 g for 15 min, the cells were resuspended in loading buffer (50 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 500 mM NaCl, 6 M urea, 10 mM imidazole), PMSF was added to 1 mM, and the mixture was treated with DNase I (10,000 units/ml), lysozyme (20 mg/ml) and sonicated on a UDM-10 disintegrator (Techpan, Poland) at 44 kHz, 1.8 kW, 10 times for 30 sec, at a temperature of 0 °C. The cell lysate is centrifuged at 37,000 g for 15 min. The presence of protein in the cell culture lysate was confirmed by SDS-electrophoresis in 12% PAGE, and the presence of polyhistidine tag was confirmed in immunoblot. The supernatant after centrifugation of the cell lysate is applied to a column with 5 ml of iminodiacetic acid Sepharose (Sigma-Aldridge, Germany), pre-saturated with nickel ions and equilibrated with the loading buffer. The column is washed with 10 volumes of loading buffer, 3 volumes of buffer with 30 mM imidazole (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 8 M urea, 30 mM imidazole), then the protein is eluted with elution buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 250 mM imidazole, 8 M urea, 500 mM NaCl). Proteins are dialyzed against phosphate buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4) with the addition of PMSF to 1 mM for 16 hours at room temperature. The protein preparation is stored in aliquots at -70 °C. Electrophoretic analysis of OMP25d-OMP19-OMP10His protein expression is shown in Fig. 4.
Пример 6.Example 6.
Валидация препарата рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His для применения при разработке вакцин.Validation of the recombinant protein preparation OMP25d-OMP19-OMP10His for use in vaccine development.
Измерение концентрации белка в полученном препарате проводят по методу Брэдфорд с использованием набора QuickStart™ Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США). Выход рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10Hisсоставляет 0,2 г с литра бактериальной культуры. Чистоту полученного белкового препарата анализируют электрофорезом в 10% денатурирующем ПААГ. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Typhoon FLA9500 (GE Healthcare, США). Чистота полученного препарата OMP25d-OMP19-OMP10His по данным денситометрии составляет 98%. Гомогенность препарата белка OMP25d-OMP19-OMP10His тестируют при помощи хроматографии высокого давления HPLC-SEC. HPLC-SEC проводят с использованием колонки Waters Bio Suite High Resolution. 100 мкг белка наносят на колонку в буфере, содержащем 100 мМ фосфата натрия, рН 6.5. Единственный пик на хроматограмме свидетельствует о гомогенности препарата белка OMP25d-OMP19-OMP10His и отсутствии контаминаций. Содержание эндотоксина в конечном препарате белка OMP25d-OMP19-OMP10His определяют при помощи ЛАЛ-теста (Charles River Endosafe, США), оно составляет менее 5 IU/мг.The protein concentration in the obtained preparation is measured by the Bradford method using the QuickStart™ Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, USA). The yield of the recombinant OMP25d-OMP19-OMP10His protein is 0.2 g per liter of bacterial culture. The purity of the obtained protein preparation is analyzed by electrophoresis in 10% denaturing PAGE. After electrophoresis, the gel is stained with Coomassie R-250 using the standard method and scanned using a Typhoon FLA9500 densitometer (GE Healthcare, USA). The purity of the obtained OMP25d-OMP19-OMP10His preparation according to densitometry data is 98%. The homogeneity of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein preparation is tested using high-pressure chromatography HPLC-SEC. HPLC-SEC is performed using a Waters Bio Suite High Resolution column. 100 μg of protein is applied to the column in a buffer containing 100 mM sodium phosphate, pH 6.5. A single peak on the chromatogram indicates the homogeneity of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein preparation and the absence of contamination. The endotoxin content in the final OMP25d-OMP19-OMP10His protein preparation is determined using the LAL test (Charles River Endosafe, USA), it is less than 5 IU/mg.
Таким образом, проведены генетические манипуляции с генами бруцеллезных белков для создания слитого целевого белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающего аминокислотные последовательности трех белков, разделенные линкерами. Сконструирована генетическая конструкция, которая обеспечивает экспрессию белка OMP25d-OMP19-OMP10His в экспрессионной системе E. coli. Создан продуцент белка OMP25d-OMP19-OMP10His, пригодный для получения препаративных количеств антигена для использования в составе субъединичной бруцеллезной вакцины. С помощью методов обратной вакцинологии составлен прогноз высокой иммуногенности слитого белка при применении in vivo. Thus, genetic manipulations with the genes of brucellosis proteins were carried out to create a fused target protein OMP25d-OMP19-OMP10His, including amino acid sequences of three proteins separated by linkers. A genetic construct was constructed that provides expression of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein in the E. coli expression system. A producer of the OMP25d-OMP19-OMP10His protein was created, suitable for obtaining preparative amounts of antigen for use in the subunit brucellosis vaccine. Using reverse vaccinology methods, a prediction of high immunogenicity of the fusion protein when used in vivo was made.
Проверка предложенного способа на соответствие его критерию "изобретательский уровень" показала, что ни в научной, ни в патентной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения.A check of the proposed method for its compliance with the criterion of “inventive step” showed that neither the scientific nor the patent literature contained the set of features specified in the distinguishing part of the invention formula.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2825400C1 true RU2825400C1 (en) | 2024-08-26 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2652890C1 (en) * | 2016-11-21 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина " Минздрава России) | Method for production of the recombinant human protein gage1 |
| CN111978410A (en) * | 2020-08-04 | 2020-11-24 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | Fusion protein of brucella outer membrane protein OMP25 and periplasmic protein BP26 as well as expression and application thereof |
| RU2761637C1 (en) * | 2020-12-30 | 2021-12-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | ESCHERICHIA coli BL21(DE3)/ pET32 v 11-Cre CELL STRAIN PRODUCING SITE-SPECIFIC Cre RECOMBINASE |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2652890C1 (en) * | 2016-11-21 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина " Минздрава России) | Method for production of the recombinant human protein gage1 |
| CN111978410A (en) * | 2020-08-04 | 2020-11-24 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | Fusion protein of brucella outer membrane protein OMP25 and periplasmic protein BP26 as well as expression and application thereof |
| RU2761637C1 (en) * | 2020-12-30 | 2021-12-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | ESCHERICHIA coli BL21(DE3)/ pET32 v 11-Cre CELL STRAIN PRODUCING SITE-SPECIFIC Cre RECOMBINASE |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Donghao Shi et al. Bioinformatics analysis of Omp19 and Omp25 proteins for designing multi-epitope vaccines against Brucella / Medicine, 2023, V. 102, N. 11, pp. e33182 (1-10). Soheil Yousefi et al. Cloning, expression and molecular analysis of Iranian Brucella melitensis Omp25 gene for designing a subunit vaccine / Research in Pharmaceutical Sciences, 2016, V. 11, N. 5, pp. 412-418. * |
| Дятлова В.И. Применение методов обратной вакцинологии для разработки новых вакцин против бруцеллеза / Бактериология, 2021, Т. 6, N. 4, с. 16-29. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2574632A1 (en) | A mycobacterium tuberculosis fusion protein and uses thereof | |
| US11020468B2 (en) | Compositions, methods and therapies for administering antigen peptide | |
| EP3299384B1 (en) | Truncated rotavirus vp4 protein and application thereof | |
| CN108330142B (en) | Mermaid photorhabditis hemolysin Hly with immune protection effectchProtein | |
| US11136354B2 (en) | Protective anti-ZIKV vaccine without inducing cross-reactions with dengue | |
| BRPI1003750A2 (en) | recombinant microorganisms, methods of preparation of vaccine strains, antigens, vectorized vaccine compositions, their uses, antibodies, diagnostic kit and methods of treatment and / or prophylaxis | |
| CN108671227B (en) | Broad-spectrum multi-subunit vaccine for preventing streptococcus suis infection | |
| RU2825400C1 (en) | METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OMP25d-OMP19-OMP10his | |
| CN108410784B (en) | Streptococcus suis delta CPS/SsnA-mSly (P353L) -SC19 engineering bacteria and application thereof in vaccines | |
| CN114437235B (en) | Recombinant fusion protein of streptococcus equi subspecies 8 proteins, and preparation method and application thereof | |
| EP4238983A1 (en) | Vaccine composition for prevention or treatment of sars-coronavirus-2 infection | |
| Kazemi-Roudsari et al. | Design of an oral vaccine using Lactococcus lactis against brucellosis: an in vitro and in vivo study | |
| US20150238590A1 (en) | Use of the salmonella spp type iii secretion proteins as a protective vaccination | |
| Liu et al. | Construction and characterization of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing the babA2/ureI fusion gene of Helicobacter pylori | |
| CN116589538B (en) | Seven-component antigen African swine fever subunit vaccine | |
| CN116747296B (en) | Eleven-component antigen African swine fever subunit vaccine | |
| CN116589539B (en) | Nine-component antigen African swine fever subunit vaccine | |
| JP6216371B2 (en) | Salmonella TyphiTy21a expressing Yersinia pestis F1-V fusion protein and uses thereof | |
| RU2455024C1 (en) | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine | |
| CN105907776A (en) | Subunit vaccine capable of inducing immune response to porcine reproductie and respiratou syndrome virus | |
| CN105749265B (en) | Bivalent anthrax vaccine | |
| Kiekens et al. | Advances in Chlamydia trachomatis Vaccination: Unveiling the Potential of Major Outer Membrane Protein Derivative Constructs | |
| Chuekwon et al. | Immune Response to the Dual Antigen Vaccine of Actinobacillus pleuropneumoniae in a Mouse Model | |
| Kazemi et al. | Immunization of BALB/c mice with BAB1-0278: An initial investigation of a novel potential vaccine for brucellosis based on Lactococcus Lactis vector | |
| CN115737792A (en) | Echinococcus canadensis subunit vaccine and preparation method and application thereof |