RU2821044C1 - Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма "SAT-1/Кения/2017" с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА - Google Patents
Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма "SAT-1/Кения/2017" с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821044C1 RU2821044C1 RU2023128079A RU2023128079A RU2821044C1 RU 2821044 C1 RU2821044 C1 RU 2821044C1 RU 2023128079 A RU2023128079 A RU 2023128079A RU 2023128079 A RU2023128079 A RU 2023128079A RU 2821044 C1 RU2821044 C1 RU 2821044C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- foot
- sat
- mouth disease
- disease virus
- kenya
- Prior art date
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 155
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 108091006503 SLC26A1 Proteins 0.000 title description 2
- 101710140501 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 1 Proteins 0.000 claims abstract description 170
- 101710144481 Sulfate anion transporter 1 Proteins 0.000 claims abstract description 167
- 102100030100 Sulfate anion transporter 1 Human genes 0.000 claims abstract description 167
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 63
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 56
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 11
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 10
- 244000309466 calf Species 0.000 claims abstract description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 9
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 abstract description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 101710173681 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 2 Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 abstract description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 27
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- XNKICCFGYSXSAI-UHFFFAOYSA-N 1,1-diphenylpropan-2-amine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C(N)C)C1=CC=CC=C1 XNKICCFGYSXSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 244000309732 Foot-and-mouth disease virus serotype SAT1 Species 0.000 description 5
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000710211 Foot-and-mouth disease virus - type SAT 1 Species 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023920 Histone H1t Human genes 0.000 description 2
- 101000905044 Homo sapiens Histone H1t Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- -1 freon Chemical compound 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241001250090 Capra ibex Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001144416 Picornavirales Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L disodium;2-hydroxy-3-[4-[4-[(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)amino]-3-methylphenyl]-2-methylanilino]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)=CC=2)=C1 BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая: иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:8000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции от 50% до 74,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:4000; неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,6; 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,7 %-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты. Преимуществом разработанной тест-системы является продолжительный срок хранения (не менее 5 лет) за счет получения лиофильно высушенных иммуноспецифических составляющих. Предложенная тест-система является первой в Российской Федерации, современной, специфической и чувствительной, предназначенной для количественного определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в широком диапазоне 1:16 - 1:4096 для последующего анализа иммунного статуса животных в отношении ящура. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента и Ближнего Востока. Созданная тест-система направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного генотипа вируса ящура, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения изолятов вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/2017». 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
По данным Международного эпизоотического бюро в последние годы отмечается ухудшение эпизоотической ситуации по ящуру в мире. Крупные вспышки ящура были зарегистрированы в Монголии, Северной и Южной Корее, Японии, Тайване, Афганистане, Индии, Китае, Киргизии, Таджикистане, Казахстане, Турции. Имеется тенденция к осложнению эпизоотической ситуации на территории Российской Федерации. Наиболее подвержены инфекции молодые парнокопытные сельскохозяйственные животные (крупный рогатый скот, свиньи, козы, овцы, олени). Животноводству ящур наносит большой экономический ущерб. За считанные часы от одного больного животного могут заразиться сотни. Больные животные подлежат уничтожению.
Ящур вызывается вирусом со следующей таксономией: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus [1].
Геном вируса ящура представлен молекулой РНК длиной нуклеиновой кислоты около 8400-8500 н.о. и положительным смыслом [1, 2]. При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (главный иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP1-VP2-VP3-VP4 [1].
Существует 7 серотипов ящура: O, A, C, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Серотип SAT-1 является весьма разнообразным, в его пределах выделяют 13 топотипов. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP1), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2]. Антитела против одного генотипа в пределах серотипа SAT-1 не обеспечивают иммунную защиту против другого генотипа.
В РНК-содержащих вирусах, вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [3, 4, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [7].
Наличие семи серотипов и множества подтипов и вариантов усложняют лабораторную диагностику ящура и борьбу с ним. Появление новых вариантов неизбежно вызвано продолжающейся циркуляцией вируса в полевых условиях и квазивидовым характером РНК-генома [8]. Большая часть этих вариаций происходит в кодирующей капсид области генома (область полипептида P1) и приводит к антигенной вариации.
Наиболее вариабельным является белок VP1 вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [9]. Участок поверхностного белка VP1 в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [10, 11]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [10].
Для вируса ящура серотипа SAT-1 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERП ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам при специфической профилактике ящура с применением культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-1.
На территории Восточной Африки, в частности, в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура серотипа SAT-1 имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территорий сопредельных стран. С увеличением торгово-экономических связей со странами Африканского континента, в частности, с Восточной Африкой, имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации.
Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-1, в частности, II (SAT-1 RV 11 37), III (SAT-1 BOT 1 68), IV (SAT-1 UGA BUFF 21 70), V (SAT-1 NIG 11 75), VI (SAT-1 SUD 3 76), VII (SAT-1 UGA 13 74), VIII (SAT-1 UGA 1 97), IX (SAT-1 ETH 3 2007), X (SAT-1/X), XI (SAT-1 TCH 1/72), XII (SAT-1/ANG/9/74), XIII (SAT 1 MOZP132010 B16). В последние годы, начиная с 2012 г. стали широко распространяться изоляты вируса ящура серотипа SAT-1 топотипа NWZ. В частности, вспышки ящура данного генотипа фиксировались в Кении, Танзании, Уганде, Эфиопии [9-11].
Известны производственные штаммы вируса ящура типа SАT-1, которые применяются или применялись в мире для производства средств специфической профилактики ящура:
- штамм «SAT-1 ZIM 23 2003» (генотип SAT-1/I),
- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),
- штамм «SAT-1 BOT 1 68» (генотип SAT-1/III),
- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),
- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),
- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),
- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),
- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),
- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),
- штамм «SAT-1/NIG/2015» (генотип X),
- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),
- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII),
- штамм «SAT 1 MOZP132010 B16» (генотип XIII).
Изолят «SAT-1 / KEN / 8 / 2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории населенного пункта Subukia в регионе Nakuru Республики Кения в 2017 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2021 г. В результате научно-исследовательской работы путем адаптации изолята к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30 и в организме крупного рогатого скота был получен штамм «SAT-1/Кения/2017». Штамм «SAT-1/Кения/2017» депонирован в Всероссийской коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №451 - деп/23-1-ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу NWZ (Northwest Zimbabwe) серотипа SAT-1 вируса ящура (фиг. 1), который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-1, в том числе штамма «SAT-1 ZIM 23 2003» (генотип SAT-1/I (NWZ)).
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с распространением в мире генотипа SAT-1/NWZ (штамм «SAT-1/Кения/2017») вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработана вакцина, в состав которой входит антиген вируса ящура данного генотипа. В результате возникает необходимость создания диагностической тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [12 - 19]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). РМН считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции, 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием CO2-инкубатора и другого оборудования, 3) использование не инактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.
В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [20]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.
Особым способом проведения ИФА является «сэндвич»-вариант, который обычно предполагает применение пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность реакции; 2) подходит для скринингового анализа полевых образцов разной степени очистки; 3) высокая чувствительность реакции.
В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. Особое внимание уделяют жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической реакции микронейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.
На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа SAT-1 - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).
Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [21]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2017 года (период, когда появился производственный штамм «SAT-1/Кения/2017») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма
«SAT-1/Кения/2017» ниже 32%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
«SAT-1/Кения/2017» ниже 32%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа SAT-1 [22].
Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:
Компонент 1 - Планшеты иммунологические.
Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.
Компонент 3 - Буфер для разведения (5x).
Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.
Компонент 5 - Деминерализованная вода.
Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).
Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).
Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).
Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).
Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).
Компонент 11 - Субстрат хромогена (TMB).
Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.
Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа SAT-1, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных штаммов серотипа SAT-1, кроме «SAT-1/Кения/2017». Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP1 вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен для данного штамма. Таким образом, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 40%. Исходя из этого требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма удалена от реакции микронейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.
В прототипном варианте используются контрольные сыворотки крови животных в жидком виде, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и создает риски контаминации микроорганизмами.
Прототипная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.
В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.
Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе наиболее близкого прототипа, для проведения точного количественного анализа уровня гуморального иммунитета животных после введения противоящурных вакцин, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» генотипа SAT-1/NWZ, актуальной является разработка тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.
В РФ на сегодняшний день существуют следующие тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА: 1) тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации [23]; 2) тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2047/Саудовская Аравия/2008» генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации [24]; 3) способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму «О №2311/Забайкальский/2016» генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА [25]; 4) тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура «А №2205/G-IV» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [26]. При этом в настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Целью изобретения является создание тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:
1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;
2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;
3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;
4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции 75-100%;
5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции от 50,0% до 74,9%;
6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вируса ящура;
7) блокирующая сыворотка крови;
8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,6), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,7%-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты (CH3(CH2)11OSO3Na).
Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции микронейтрализации в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты полных частиц вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. Сенсибилизированные лунки обрабатывают с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической тест-системы, предназначенной для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 1500 раз инактивированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность количественно определять гуморальный иммунитет против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 60% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент с протектором (3,0% хлорида натрия) остается стабильным не менее 5 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» составляет 1:4000.
В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела лабораторных животных, соответственно, высокоспецифичные по отношению к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента с протектором (3,0% хлорида натрия), что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 5 лет и с активностью не менее 1:8000 и 1:4000, соответственно.
В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, сильноположительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 5 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:5000, для контроля 2 - не менее 1:5000. Данная активность удобна для получения большого объема контролей в рабочем нативном состоянии для проведения оператором ИФА.
В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется 1% раствор бычьего сывороточного альбумина, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде с протектором (3,0% хлорида натрия), что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 5 лет.
В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям оптической плотности и уровню антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки, что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты количественного определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:4000.
Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносят в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «SAT-1/Кения/2017». Наличие антител к структурным белкам вируса ящура данного штамма в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против иммуноглобулинов G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания учитывают с помощью спектрофотометра-ридера, и она обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Седиментационный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
Фиг. 2 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 - антиген вируса ящура.
Фиг. 3 - Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP1 штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VР1 штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура.
На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объёма деионизированной водой.
Проводят приготовление рабочих растворов.
Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,6.
Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% Tween-20 с водородным показателем 7,5-7,7. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.
Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 0,7% раствора бычьего сывороточного альбумина.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» представлены ниже.
1. Иммобилизация антител кролика против антигена вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» готовят в разведении 1:8000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 ч при температуре (2-4)°С.
2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.
3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 11,0; 12,0 log2 SN50 (1:16-1:4096) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см3 (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см3 (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см3 (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной сыворотка считается при уровне гуморального иммунитета ≥ 5,0 log2 SN50 (≥1:32).
В качестве контроля 1 используют сильноположительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» - процент ингибиции (PI) 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» - PI = 50,0-74,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - процент ингибиции < 50%.
Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см3 рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:4000. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-4)°С.
4. Улавливание антигена. В промытые сенсибилизированные лунки планшета вносят по 0,05 см3 смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.
5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.
6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см3 раствора №3, вносят по 0,05 см3 рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.
7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.
8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 рабочего разведения конъюгата (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.
9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.
10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 диаммониевой соли 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), закрывают крышкой и выдерживают 15 минут при температуре (20±2)°С.
11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см3 0,7%-ного раствора натриевой соли лаурилсерной кислоты (CH3(CH2)11OSO3Na).
12. Определение значения экстинкции и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Сразу после остановки реакции измеряют значение декадного коэффициента экстинкции (ε) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 410 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ε переводят в значение процента ингибиции (J, %) по формуле:
J (%) = (1- (εсыворотки - εКК)/(εКА - εКК)) × 100,
где, εсыворотки - среднее значение декадного коэффициента экстинкции смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;
εКА - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля антигена;
εКК - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля конъюгата.
Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:
- разница между значениями ε КА и ε КК не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);
- контроль 1 имеет значение J>75%;
- контроль 2 имеет значение J в пределах 50,0-74,9%;
- контроль 3 имеет значение J<50%.
Сыворотки крови, для которых значение J≥50%, считают положительными, содержащими антитела к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Значение процента ингибиции <50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным. Исходя из полученных данных, берут последнее разведение сыворотки, для которого значение J составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против структурных белков вируса ящура, вызванного вирусом штамма «SAT-1/Кения/2017» и выражают в log2 SN50.
В результате проведенных исследований были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:4000, сенсибилизирующих антител - 1:8000, антивидового конъюгата - 1:4000; антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» - 1:4000, контроля 1 - 1:5000, контроля 2 - 1:5000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» и проведен сравнительный анализ с результатами реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].
Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в разведениях, указанных выше.
Контроль суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» на специфичность.
Специфичность суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP1, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «SAT-1/Кения/2017» к генотипу SAT-1/NWZ. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» составила 2,05 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 1,48 мкг/мл (71%). Данное содержание полных вирусных частиц (146S компонент) достаточно для проведения дальнейших работ по концентрированию и получению готового лиофильно высушенного антигена для изготовления тест-системы.
Морфологические признаки.
Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу SAT-1, генотипу SAT-1/NWZ и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку, которая состоит из 32 капсомеров с кубическим типом симметрии.
Антигенные свойства.
По своим антигенным свойствам штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РМН и ИФА. При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении не менее 1:4000.
Антигенное родство (r1) штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие штаммы вируса ящура, представленные выше. Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, против 102 ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [2].
Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом:
при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;
при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.
Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-1/Кения/2017» составили r1 от 0,02 до 0,23, а именно
для штамма «SAT-1 ZIM 23 2003» (генотип SAT-1/NWZ) - 0,23,
для «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II) - 0,22,
для «SAT-1 BOT 1 68» (генотип SAT-1/III) - 0,20,
для «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV) - 0,19,
для «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V) - 0,05,
для «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI) - 0,11,
для «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII) - 0,10,
для «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII) - 0,15,
для «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX) - 0,12,
для «SAT-1/NIG/2015» (генотип X) - 0,06,
для «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI) - 0,02,
для «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII) - 0,07,
для «SAT 1 MOZP132010 B16» (генотип XIII) - 0,21.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-1.
Гено- и хемотаксономическая характеристики
Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура является РНК(+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×106 Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, особо выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации вирусной РНК.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при pH 7,44-7,64. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,0°С).
Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.
Биотехнологические характеристики
Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).
При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.
Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
Для получения антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» для изготовления тест-системы проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД50/см3. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью 0,030% 1,2-аминоэтилэтиленимина и осветляли 0,020% полигексаметиленгуанидином.
Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 2-4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе, концентрируя в 1500 раз (1/1500 от первоначального объёма).
К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», необходимого для получения антигена как одного из важнейших специфических компонентов ИФА и иммунизации животных.
Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 40 и 30%. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 40-30%-м слое сахарозы, которые отбирали и переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 30000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Пики наблюдали для фракций №№ 2-6 (оптическая плотность составила ≥2,000 у.е.). Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 3), который подтвердил, степень чистоты полученного антигена.
Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-28 R VG (в соотношении адъювант/антиген = 65/35 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см3. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (2-4)°С.
Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».
Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.
Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.
Полученные образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.
Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для детекторных антител - 1:4000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log2 SN50. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:8000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log2 SN50). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:8000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log2 SN50. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log2 SN50). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.
Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:3000, 1:4000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:8000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log2 SN50. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log2 SN50). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.
При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.
Таким образом, в ходе лабораторных испытаний определено, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:4000, 1:8000, 1:4000, соответственно.
Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными моновалентными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Определены значения уровня гуморального иммунитета с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).
Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Для исследования представленной тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 456 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Уровень антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 5,5-12,0 log2 SN50. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 456 образцов сывороток крови 453 определены в качестве положительных, а 3 - в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:16).
Для исследования специфичности метода тестировали 250 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 250 отрицательных проб - все определены в качестве отрицательных.
Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,10-99,87%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,54-100,00%, k-критерий - 0,991; общая точность (DAc) - 98,77-99,91%.
Таким образом предлагаемая «Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента, а также в странах Ближнего Востока. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и, тем самым, на защиту территории России и других стран.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА»:
1. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R. [et al.] // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.
2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.
3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.
4. Brooksby, J. B. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.
5. Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959,
6. Grubman, M. J. 1980. The 5′ end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp. Arch. Virol. 63:311-315.
7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, C. M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J. I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.
8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.
9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.
10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong H.K., Ho K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.
11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson T., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.
12. King, A. M., D. McCahon, K. Saunders, J. W. Newman, and W. R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.
13. Tosh, C., D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.
14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/
15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.
16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson T., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP0 cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.
17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.
18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.
19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.
20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.
21. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_ upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis__Brocchi_.pdf (Дата обращения: 14.08.2023).
22. Наборы для определения антител к антигену вируса ящура (FMDV) PrioCHECK. URL: vetprofilab.ru/f/rus_priochek_fmdv.pdf (Дата обращения: 24.03.2023).
23. Патент РФ № 2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022108324 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.
24. Патент РФ № 2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022119118 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Оковытая Т.В., Борисов А.В., Воеводина М.Э.
25. Патент РФ № 2796393, 23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022113420 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.
26. Патент РФ № 2798510, 23.06.2023. Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура А №2205/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022122687 / Доронин М.И., Луговская Н.Н., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Борисов А.В., Воеводина М.Э.
| Таблица 5 Корреляция результатов анализа сывороток крови животных с применением тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА (предлагаемое изобретение) и в реакции микронейтрализации |
||||
| № п/п | Характеристика пробы | Уровень гуморального иммунитета | Степень корреляции, % | |
| в ИФА (предлагаемое изобретение) | в РМН, log 2 SN 50 | |||
| 1 | Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 14 ДПВ |
1:128 | 7,0 | 100% |
| 2 | Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ |
1:128 | 7,0 | 100% |
| 3 | Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ |
1:362 | 8,5 | 100% |
| 4 | Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 14 ДПВ |
1:64 | 6,0 | 100% |
| 5 | Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ |
1:362 | 8,5 | 100% |
| 6 | Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ |
1:512 | 9,0 | 100% |
| 7 | Сыворотка 3 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 14 ДПВ |
1:32 | 5,0 | 100% |
| 8 | Сыворотка 4 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ |
1:512 | 9,0 | 100% |
| 9 | Сыворотка 5 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ |
1:128 | 7,0 | 100% |
| 10 | Сыворотка 6 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ |
1:181 | 7,5 | 100% |
| 11 | Сыворотка 7 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ |
1:512 | 9,0 | 100% |
| 12 | Сыворотка 8 КРС против ВЯ штамма «SAT-1/Кения/2017», 35 ДПВ |
1:2048 | 11,0 | 100% |
| 13 | КА | ОП=1,125 | - | соответствует |
| 14 | КК | ОП=0,039 | - | соответствует |
| 15 | К1 (PI > 75%) | PI = 97,20% | - | соответствует |
| 16 | К2 (50%<PI < 75%) | PI = 65,66% | - | соответствует |
| 17 | К3 (PI<50%) | PI = 7,56% | - | соответствует |
Примечание: условие: ОПКА - ОП КК>0,400
КА - контроль антигена,
КК - контроль конъюгата,
К1 - положительный контроль-1,
К2 - положительный контроль-2,
К3 - отрицательный контроль-3,
ДПВ - день после вакцинации, ВЯ - вирус ящура.
Claims (4)
1. Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:
- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:8000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции от 50% до 74,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:4000;
- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,6; 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,7 %-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты.
2. Тест-система по п. 1 является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в диапазоне 1:16 - 1:4096 или 4,0-12,0 log2 SN50.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821044C1 true RU2821044C1 (ru) | 2024-06-17 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100430935B1 (ko) * | 2001-12-21 | 2004-05-14 | 대한민국 | 대장균 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 |
| RU2791614C1 (ru) * | 2022-07-12 | 2023-03-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О N2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100430935B1 (ko) * | 2001-12-21 | 2004-05-14 | 대한민국 | 대장균 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 |
| RU2791614C1 (ru) * | 2022-07-12 | 2023-03-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О N2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных |
| RU2804634C1 (ru) * | 2023-04-19 | 2023-10-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Штамм "SAT-1/Кения/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/NWZ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takano et al. | Antibody-dependent enhancement occurs upon re-infection with the identical serotype virus in feline infectious peritonitis virus infection | |
| Russell et al. | Malignant catarrhal fever: a review | |
| Zhao et al. | A comprehensive study of neutralizing antigenic sites on the hepatitis E virus (HEV) capsid by constructing, clustering, and characterizing a tool box | |
| CN110964102A (zh) | 能同时与犬、猫、水貂细小病毒结合的单克隆抗体、其可变区序列、杂交瘤细胞株及应用 | |
| JPS63264532A (ja) | インフルエンザワクチン | |
| Nollens et al. | New recognition of Enterovirus infections in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) | |
| Smith | Serologic tests for detection of antibody to rodent viruses | |
| RU2821044C1 (ru) | Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма "SAT-1/Кения/2017" с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА | |
| Srivastava et al. | Antigenicity of Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein V 3 (E) and its cyanogen bromide cleaved fragments examined by monoclonal antibodies and Western blotting | |
| RU2815531C1 (ru) | Тест-система для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА | |
| RU2811996C1 (ru) | Тест-система для определения титра антител против 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-2/IV с помощью жидкофазного ИФА | |
| RU2804845C1 (ru) | Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА | |
| RU2825453C1 (ru) | Тест-система для детекции антител к структурным белкам штамма "SAT-2/Eritrea/1998" вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа | |
| RU2818811C1 (ru) | Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма "А/Танзания/2013" с помощью жидкофазного иммуноферментного анализа | |
| RU2834234C1 (ru) | Тест-система для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа A/ASIA/Iran-05SIS-13 с помощью жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа | |
| RU2798510C1 (ru) | Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура A N 2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА | |
| RU2812211C1 (ru) | Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма "Азия-1 N 2356/14/2018" с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА | |
| AU649473B2 (en) | Enterovirus peptides | |
| RU2815540C1 (ru) | Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма "О N2212/Приморский/2014" генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА | |
| RU2817382C1 (ru) | Тест-система для количественной детекции антител против 146S компонента вируса ящура генотипа O/EA-3 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного иммуноферментного анализа | |
| RU2812210C1 (ru) | Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма "О-N2356/Пакистан/2018" генотипа O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 в сыворотках крови животных | |
| RU2831181C1 (ru) | Штамм "А/Египет/Africa G-IV/2022" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа А/AFRICA/G-IV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
| RU2821894C1 (ru) | Тест-система для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма "О/Кения/2017" вируса ящура с применением жидкофазного "сэндвич"-варианта ИФА | |
| RU2816943C1 (ru) | Штамм "Азия-1/G-V/2006" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
| RU2831185C1 (ru) | Штамм "А/Кирухара/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура |