RU2818590C1 - Composition and method for inhibiting accumulation, aggregation and formation of tau protein coils - Google Patents
Composition and method for inhibiting accumulation, aggregation and formation of tau protein coils Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818590C1 RU2818590C1 RU2022108499A RU2022108499A RU2818590C1 RU 2818590 C1 RU2818590 C1 RU 2818590C1 RU 2022108499 A RU2022108499 A RU 2022108499A RU 2022108499 A RU2022108499 A RU 2022108499A RU 2818590 C1 RU2818590 C1 RU 2818590C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nurr1
- foxa2
- cells
- present disclosure
- disease
- Prior art date
Links
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 49
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 20
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 title description 20
- 101150026563 NR4A2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 151
- 101150057663 Foxa2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 41
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 46
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 22
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 20
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 31
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 29
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 8
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004289 cerebral ventricle Anatomy 0.000 description 7
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 6
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 6
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 6
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 208000004051 Chronic Traumatic Encephalopathy Diseases 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 4
- 208000017004 dementia pugilistica Diseases 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000011825 3xTg-AD mouse Methods 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- -1 elixir Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000013016 learning Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 101150053137 AIF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 2
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000002339 Frontotemporal Lobar Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108091077621 MAPRE family Proteins 0.000 description 2
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 2
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000005314 Multi-Infarct Dementia Diseases 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 2
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 2
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 1
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 1
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 1
- 201000004066 Ganglioglioma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010027374 Mental impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010027951 Mood swings Diseases 0.000 description 1
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- VTVNNTFKNJLION-UHFFFAOYSA-N O1C(C=CC=C1)O.[Na] Chemical compound O1C(C=CC=C1)O.[Na] VTVNNTFKNJLION-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 208000037048 Prodromal Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011529 cardiovascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 229940013361 cresol Drugs 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 230000003937 effect on alzheimer disease Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000001353 entorhinal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 201000005649 gangliocytoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008361 ganglioneuroma Diseases 0.000 description 1
- 238000010457 gene scissor Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000004694 hippocampus damage Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000008897 memory decline Effects 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- PDTFCHSETJBPTR-UHFFFAOYSA-N phenylmercuric nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 PDTFCHSETJBPTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 101150007867 rbfox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
Настоящее раскрытие относится к композиции для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка и, более конкретно, к методике ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка посредством введения генов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного гена Nurr1 для индукции экспрессии данных генов.The present disclosure relates to a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein and, more particularly, to a technique for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein by introducing the Nurr1 and Foxa2 genes together or the Nurr1 gene alone to induce the expression of these genes.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND ART
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой хроническое нейродегенеративное заболевание, имеющее симптомы, чаще всего включающие потерю памяти, затруднения с языком, нарушение когнитивных функций, резкие перепады настроения и т.д.Alzheimer's disease (AD) is a chronic neurodegenerative disease with symptoms most commonly including memory loss, language difficulties, cognitive impairment, mood swings, etc.
Болезнь Альцгеймера нейропатологически отличается присутствием бляшек в клетках, нервных тканях, сосудах мозга, и нейрофибриллярных клубков (NFT), образующихся в результате накопления тау-белка. Болезнь Альцгеймера также отличается образованием скоплений или бляшек амилоида β и потерей синапсов и т.д. Причина для большинства случаев Альцгеймера все еще остается неизвестной. Кроме того, до сих пор не было лечения против болезни Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера служит причиной самых обычных случаев деменции, действуя в качестве главной причины смерти, наряду с сердечнососудистыми заболеваниями и раком. Прогнозируется, что частота болезни Альцгеймера будет возрастать со средней продолжительностью жизни людей.Alzheimer's disease is neuropathologically characterized by the presence of plaques in cells, nerve tissues, brain vessels, and neurofibrillary tangles (NFTs) resulting from the accumulation of tau protein. Alzheimer's disease is also characterized by the formation of clusters or plaques of amyloid β and loss of synapses, etc. The cause for most cases of Alzheimer's is still unknown. In addition, until now there has been no treatment against Alzheimer's disease. Alzheimer's disease is the most common cause of dementia, acting as a leading cause of death, along with cardiovascular disease and cancer. The incidence of Alzheimer's disease is predicted to increase with the average life expectancy of people.
Кроме того, для принятия комплекса мер и лечения пациентов с болезнью Альцгеймера требуются огромные расходы с пациентами, страдающими от значительного ментального расстройства. Следовательно, существует потребность в эффективном способе предупреждения и лечения пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера.In addition, the intervention and treatment of patients with Alzheimer's disease requires enormous costs with patients suffering from significant mental impairment. Therefore, there is a need for an effective method for preventing and treating patients suffering from Alzheimer's disease.
В том, что касается болезни Альцгеймера, большое количество исследований в недавнее время было сосредоточено на тау-белке. В самом деле, уровень тау в спинномозговой жидкости возрастает на продромальной стадии болезни Альцгеймера, и данный повышенный уровень стабильно поддерживается на протяжении прогрессирования данного заболевания после его начала. NFT, который представляет собой гиперфосфорилированный тау-белок, обнаруживается с ранней стадии болезни Альцгеймера, и его уровень стабильно возрастает с прогрессированием данного заболевания. То есть, опосредованные тау повреждение и дисфункция нейронов являются патологическими находками у большинства пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера. NFT также является биомаркером других таупатий, таких как лобно-височная деменция (FTD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), болезнь Пика, хроническая травматическая энцефалопатия (СТЕ) и т.д., помимо AD. Терапевтические продукты против данных заболеваний до сих пор оставались неразработанными.When it comes to Alzheimer's disease, a lot of research has recently focused on the tau protein. Indeed, tau levels in the cerebrospinal fluid increase during the prodromal stage of Alzheimer's disease, and these elevated levels are consistently maintained throughout the progression of the disease after its onset. NFT, which is hyperphosphorylated tau protein, is detected early in Alzheimer's disease and its levels steadily increase as the disease progresses. That is, tau-mediated neuronal damage and dysfunction are pathological findings in the majority of patients suffering from Alzheimer's disease. NFT is also a biomarker for other tauopathies such as frontotemporal dementia (FTD), progressive supranuclear palsy (PSP), Pick's disease, chronic traumatic encephalopathy (CTE), etc., in addition to AD. Therapeutic products against these diseases have so far remained undeveloped.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION
Техническая проблемаTechnical problem
Приводящее к настоящему раскрытию исследование, проведенное авторами настоящего изобретения, привело к экспериментальным данным о том, что экспрессия транскрипционных факторов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного Nurr1, введенных в мозговые клетки, ингибировала накопление, агрегацию или клубки тау-белков. В частности, при экспрессии Nurr1 в комбинации с соактиватором Foxa2 обнаружили то, что данные два гена имеют мощный синергический эффект ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка. В некоторых воплощениях также обнаружили то, что экспрессия одного Nurr1 имеет существенные эффекты ингибирования тау-белка.Leading up to the present disclosure, research conducted by the present inventors resulted in experimental evidence that expression of the transcription factors Nurr1 and Foxa2 together or Nurr1 alone introduced into brain cells inhibited the accumulation, aggregation or tangles of tau proteins. In particular, when Nurr1 was expressed in combination with the co-activator Foxa2, the two genes were found to have a potent synergistic effect in inhibiting the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein. In some embodiments, it has also been discovered that expression of Nurr1 alone has significant tau inhibitory effects.
Следовательно, одним аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащей вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или один ген Nurr1.Therefore, one aspect of the present disclosure is to provide a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or a single Nurr1 gene.
Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.Another aspect of the present disclosure is to provide a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, the composition comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования фосфорилирования тау-белка, причем данная композиция содержит вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein, the composition comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования фосфорилирования тау-белка, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurrl и Foxa2 или геном Nurr1.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein, the composition comprising neurons or glia introduced into them with the Nurrl and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, причем данная композиция содержит вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, the composition comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, the composition comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения таупатий, причем данная композиция содержит вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for the prevention or treatment of tauopathies, the composition comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения таупатий, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for the prevention or treatment of tauopathies, the composition comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
Решение проблемыSolution
Авторы настоящего изобретения осуществили исследовательские попытки, относящиеся к способам ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, который известен как главная причина таупатий. В результате авторы настоящего изобретения открыли, что введение генов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного гена Nurr1, с последующей экспрессией данных генов оказывало эффекты ингибирования накопления, агрегации или образования нейрофибриллярных клубков (NFL) тау-белка и фосфорилирования тау-белка.The inventors of the present invention have undertaken research efforts related to methods for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, which is known to be a major cause of tauopathies. As a result, the present inventors discovered that introduction of the Nurr1 and Foxa2 genes together or the Nurr1 gene alone, followed by expression of these genes, had the effects of inhibiting the accumulation, aggregation or formation of neurofibrillary tangles (NFL) of tau protein and phosphorylation of tau protein.
Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.According to one aspect of the present disclosure, a composition is provided for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, ия содержащая вектор, несущий ген Nurr1, но не ген Foxa2.According to another aspect of the present disclosure, there is provided a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 gene, but not the Foxa2 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition is provided for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенным в них геном Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition is provided for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein is provided, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein is provided, comprising a vector carrying the Nurr1 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein is provided, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенным в них геном Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein is provided, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition is provided for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition is provided for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition is provided for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенным в них геном Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a composition is provided for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tauopathies is provided, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tauopathies is provided, comprising a vector carrying the Nurr1 gene.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.According to yet another aspect of the present disclosure, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tauopathies is provided comprising neurons or glia introduced therein with the Nurr1 and Foxa2 genes.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.According to yet another aspect of the present disclosure, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tauopathies is provided, comprising a vector carrying the Nurr1 gene.
Согласно одному воплощению настоящего раскрытия таупатия представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из тау-позитивной болезни Альцгеймера, деменции с тельцами Леви, лобно-височной деменции (FTD), мультиинфарктной деменции (MID), лобно-височной лобарной дегенерации (FTLD), прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), болезни Пика, хронической травматической энцефалопатии (СТЕ), кортикобазальной дегенерации (CBD), глобулярной глиальной таупатий, болезни Гентингтона, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, первичной возрастной таупатий (PART), заболевания, характеризующегося появлением аргирофильных зерен, свинцовой энцефалопатии, липофусциноза, болезни Литико-Бодига и менингиоангиоматоза, но не ограничивается ими.According to one embodiment of the present disclosure, tauopathy is a disease selected from the group consisting of tau-positive Alzheimer's disease, dementia with Lewy bodies, frontotemporal dementia (FTD), multi-infarct dementia (MID), frontotemporal lobar degeneration (FTLD), progressive supranuclear palsy (PSP), Pick's disease, chronic traumatic encephalopathy (CTE), corticobasal degeneration (CBD), globular glial tauopathies, Huntington's disease, ganglioglioma, gangliocytoma, primary age-related tauopathies (PART), argyrophilic granule disease, lead encephalopathy , lipofuscinosis, Lytic-Bodig's disease and meningioangiomatosis, but not limited to them.
В настоящем раскрытии ген Foxa2, наряду с геном Nurr1 можно использовать в предупреждении и лечении болезни Альцгеймера, которая представляет собой тип таупатий. Обнаружили то, что экспрессия посредством введения Nurr1 и Foxa2 или введения одного Nurr1 облегчает патологические симптомы болезни Альцгеймера. Данные патологические симптомы могут включать (1) накопление тау-белка, (2) накопление бета-амилоида, 3) старение клеток мозга, 4) потерю синапсов и 5) накопление периферических иммунных клеток. Кроме того, совместная экспрессия Nurr1 и Fox2 или экспрессия одного Nurr1 приводила к нейротрофикации клеток мозга и, таким образом, продемонстрировала эффекты предупреждения и лечения болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий.In the present disclosure, the Foxa2 gene, along with the Nurr1 gene, can be used in the prevention and treatment of Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies. It has been found that expression by administration of Nurr1 and Foxa2 or administration of Nurr1 alone alleviates the pathological symptoms of Alzheimer's disease. These pathological symptoms may include (1) accumulation of tau protein, (2) accumulation of beta-amyloid, 3) aging of brain cells, 4) loss of synapses, and 5) accumulation of peripheral immune cells. In addition, co-expression of Nurr1 and Fox2 or expression of Nurr1 alone resulted in neurotrophication of brain cells and thus demonstrated effects in the prevention and treatment of Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies.
В одном воплощении способа по настоящему раскрытию выражение «введение (трансдуцирование) Nurr1 и Foxa2» относится к введению нуклеиновых кислот, совместно кодирующих два данных гена, в клетки мозга. Два данных гена могут вводиться отдельно или одновременно.In one embodiment of the method of the present disclosure, the expression “transducing Nurr1 and Foxa2” refers to the introduction of nucleic acids co-encoding these two genes into brain cells. These two genes can be introduced separately or simultaneously.
В способе по настоящему раскрытию выражение «введение (трансдуцирование) Nurr1» относится к введению нуклеиновой кислоты, кодирующей ген Nurr1, в клетки мозга.In the method of the present disclosure, the expression “introduction (transduction) of Nurr1” refers to the introduction of a nucleic acid encoding the Nurr1 gene into brain cells.
Для введения генов, кодирующих Nurr1 и/или Foxa2, в клетки мозга можно использовать технические способы введения гена в клетки, которые хорошо известны в данной области, например, анализ осаждения ДНК-кальций, способ с использованием липосом, способ с использованием полиаминов, способ электропорации, способ с использованием ретровируса, способ с использованием аденовируса, способ с использованием аденоассоциированного вируса (AAV) и тому подобные.To introduce genes encoding Nurr1 and/or Foxa2 into brain cells, technical methods for introducing the gene into cells that are well known in the art can be used, for example, DNA-calcium precipitation assay, liposome method, polyamine method, electroporation method , a method using a retrovirus, a method using an adenovirus, a method using an adeno-associated virus (AAV) and the like.
Можно использовать вирусные или невирусные векторы, когда они несут Nurr1 и/или Foxa2. Примеры вирусных векторов включают аденоассоциированные вирусы (AAV), аденовирусы, ретровирусы и/или лентивирусы. Примеры невирусных векторов включают молекулы РНК, плазмиды, липосомные комплексы, молекулярные конъюгаты и/или белки генных ножниц (CRISPR, например, Cas9). Следовательно, введение Nurr1 и/или Foxa2 согласно настоящему раскрытию охватывает, в качестве одного воплощения, вставку нуклеиновых кислот, кодирующих Nurr1 и Foxa2, в разные экспрессионные векторы или в один экспрессионный вектор и затем вставку данного(ных) экспрессионного(ных) вектора(ров) в клетки мозга.Viral or non-viral vectors can be used when they carry Nurr1 and/or Foxa2. Examples of viral vectors include adeno-associated viruses (AAV), adenoviruses, retroviruses and/or lentiviruses. Examples of non-viral vectors include RNA molecules, plasmids, liposome complexes, molecular conjugates and/or gene scissor proteins (CRISPR, eg Cas9). Therefore, the introduction of Nurr1 and/or Foxa2 according to the present disclosure includes, as one embodiment, insertion of nucleic acids encoding Nurr1 and Foxa2 into different expression vectors or into a single expression vector and then insertion of the given expression vector(s). ) into brain cells.
В некоторых воплощениях осуществления экспрессии Nurr1 и/или Foxa2 можно использовать методики редактирования генов. Методики редактирования генов используются для демонстрации целевого генетического признака посредством свободного корректирования генетической информации живого организма. Примеры системы, которую можно использовать в методиках генетического редактирования, включают нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN) и короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR)/CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR/Cas 9).In some embodiments, gene editing techniques can be used to express Nurr1 and/or Foxa2. Gene editing techniques are used to demonstrate a target genetic trait by freely adjusting the genetic information of a living organism. Examples of systems that can be used in gene editing techniques include zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas 9).
Термин «направляемая РНК нуклеаза» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеазе, которая может распознавать и расщеплять в конкретном положении в целевом геноме, и, в частности, относится к нуклеазе, имеющей специфичность в отношении мишени посредством РНК-проводника. Данная направляемая РНК нуклеаза может представлять собой, но, в частности, не ограничивается белком Cas, происходящим из микробной иммунной системы CRISPR, и, более конкретно, направляемая РНК нуклеаза может включать нуклеазу на основе ассоциированного с CRISPR белка 9 (Cas9) и ее вариант - Cas9 никазу.The term "RNA-guided nuclease" as used herein refers to a nuclease that can recognize and cleave at a specific position in a target genome, and in particular refers to a nuclease that has target specificity via RNA - conductor. The RNA-guided nuclease may include, but is not particularly limited to, a Cas protein derived from the microbial CRISPR immune system, and more specifically, the RNA-guided nuclease may include a CRISPR-associated protein 9 (Cas9) nuclease and a variant thereof - Cas9, no way.
Термин «белок Cas» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к главному белковому компоненту системы CRISPR/Cas и представляет собой белок, который может действовать в качестве активированной эндонуклеазы. Белок Cas может образовать комплекс совместно с РНК CRISPR (крРНК) и транс-активирующей крРНК (тракрРНК) с демонстрацией его активности.The term “Cas protein” as used herein refers to the major protein component of the CRISPR/Cas system and is a protein that can act as an activated endonuclease. The Cas protein can form a complex together with CRISPR RNA (crRNA) and trans-activating crRNA (tracrRNA), demonstrating its activity.
Нуклеаза Cas9 распознает специфическую нуклеотидную последовательность в геноме животных и растительных клеток, включая человеческие клетки, вызывая, посредством этого двухнитевой разрыв (DSB). Двухнитевой разрыв охватывает расщепление двухцепочечной ДНК с образованием тупого конца или липкого конца. DSB эффективно репарируются в клетках механизмом гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ), и в данной процедуре исследователем может быть введена в целевой сайт желательная мутация. Направляемая РНК нуклеаза может представлять собой искусственную или сконструированную не встречающуюся в природе направляемую РНК нуклеазу.Cas9 nuclease recognizes a specific nucleotide sequence in the genome of animal and plant cells, including human cells, thereby causing a double-strand break (DSB). A double-strand break involves the cleavage of double-stranded DNA to form a blunt end or sticky end. DSBs are efficiently repaired in cells by the mechanism of homologous recombination or non-homologous end joining (NHEJ), and in this procedure the desired mutation can be introduced into the target site by the researcher. The RNA-guided nuclease may be an artificial or engineered non-naturally occurring RNA-guided nuclease.
Cas9 никаза может включать одну или более чем одну мутацию в одном из ее каталитических доменов, где данная одна или более чем одна мутация выбрана из группы, состоящей из D10A, Е762А и D986A в домене RuvC, или одна или более чем одна мутация выбрана из группы, состоящей из Н840А, N854A и N863A в домене HNH. Никаза Cas9, в отличие от нуклеазы Cas9, вызывает однонитевой разрыв. Следовательно, используют две РНК-проводника, которые обеспечивают работу Cas9 никазы и функционируют в виде пары. Данные две РНК-проводника направляют специфичное в отношении последовательности связывание комплекса CRISPR с каждой целевой последовательностью, и направляют расщепление одной нити дуплекса ДНК около каждой целевой последовательности с индукцией двух однонитевых разрывов в разных нитях ДНК.A Cas9 nickase may include one or more mutations in one of its catalytic domains, wherein the one or more mutation is selected from the group consisting of D10A, E762A and D986A in the RuvC domain, or the one or more mutation is selected from the group , consisting of H840A, N854A and N863A in the HNH domain. Cas9 nickase, unlike Cas9 nuclease, causes single-strand breaks. Therefore, two guide RNAs are used, which ensure the operation of Cas9 nickase and function as a pair. These two guide RNAs direct the sequence-specific binding of the CRISPR complex to each target sequence, and direct the cleavage of one strand of the DNA duplex near each target sequence, inducing two single-strand breaks in different DNA strands.
Белок Cas или информация о гене могут быть получены из известной базы данных, такой как GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI). В частности, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Кроме того, белок Cas может представлять собой белок Cas, происходящий из рода Staphylococcus, рода Streptococcus, рода Neisseria, рода Pasteurella, рода Francisella или рода Campylobacter, и, более конкретно, белок Cas9 рода Staphylococcus, но не ограничиваясь ими. Однако настоящее раскрытие не ограничивается вышеописанными примерами. В настоящем раскрытии белок Cas может представлять собой рекомбинантный белок.Cas protein or gene information can be obtained from a known database such as the National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank. In particular, the Cas protein may be a Cas9 protein. In addition, the Cas protein may be a Cas protein derived from, but not limited to, a Cas protein derived from the genus Staphylococcus, the genus Streptococcus, the genus Neisseria, the genus Pasteurella, the genus Francisella, or the genus Campylobacter, and more specifically, the Cas9 protein of the genus Staphylococcus. However, the present disclosure is not limited to the examples described above. In the present disclosure, the Cas protein may be a recombinant protein.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, могут использоваться без ограничения, при условии, что данные нуклеиновые кислоты имеют нуклеотидные последовательности, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, как известно в данной области. Также данные нуклеиновые кислоты могут иметь нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие функциональные эквиваленты Nurr1 и/или Foxa2. Функциональные эквиваленты относятся к полипептиду, имеющему гомологию последовательности (или идентичность) по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% с аминокислотными последовательностями Nurr1 и/или Foxa2. Например, данные функциональные эквиваленты могут включать полипептид, имеющий гомологию последовательности 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Данный функциональный эквивалент может быть получен в результате присоединения, замены или делеции части каждой из аминокислотных последовательностей. Делеция или замена аминокислот предпочтительно находится в области, которая непосредственно не ассоциирована с физиологической активностью полипептида по настоящему раскрытию.Nucleic acids encoding Nurr1 and/or Foxa2 can be used without limitation, provided that the nucleic acids have nucleotide sequences encoding Nurr1 and/or Foxa2, as known in the art. Also, these nucleic acids may have nucleotide sequences encoding the corresponding functional equivalents of Nurr1 and/or Foxa2. Functional equivalents refer to a polypeptide having sequence homology (or identity) of at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80% with the amino acid sequences of Nurr1 and/or Foxa2. For example, these functional equivalents may include a polypeptide having sequence homology of 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% , 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%. This functional equivalent can be obtained by adding, replacing or deleting a portion of each of the amino acid sequences. The deletion or substitution of amino acids is preferably in a region that is not directly associated with the physiological activity of the polypeptide of the present disclosure.
Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белок Nurr1 и/или Foxa2, могут быть получены с использованием способа генной инженерии, известного в данной области. Примеры способов генной инженерии включают ПЦР-амплификацию для осуществления амплификации нуклеиновых кислот из генома, химический синтез или методику получения последовательности кДНК.In addition, nucleic acids encoding Nurr1 and/or Foxa2 protein can be obtained using a genetic engineering method known in the art. Examples of genetic engineering methods include PCR amplification to amplify nucleic acids from the genome, chemical synthesis, or cDNA sequencing techniques.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии и, таким образом, могут быть вставлены в экспрессионный вектор. Термин «связанный функциональным образом» означает то, что один фрагмент нуклеиновой кислоты связывается с другим фрагментом нуклеиновой кислоты таким образом, что функция или экспрессия одного фрагмента нуклеиновой кислоты подвергается влиянию другого фрагмента нуклеиновой кислоты. Кроме того, термин «последовательность контроля экспрессии» означает последовательность ДНК, которая контролирует экспрессию связанной функциональным образом последовательности нуклеиновой кислоты в конкретной клетке-хозяине. Такая последовательность контроля включает промотор для инициации транскрипции, последовательность любого оператора для осуществления контроля транскрипции, последовательность для кодирования подходящего сайта связывания рибосомы с мРНК и последовательность для осуществления контроля терминации транскрипции и трансляции. Все из данных последовательностей, в общем, могут быть выражены как «ДНК-конструкция, включающая нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurrl и/или Foxa2».Nucleic acids encoding Nurr1 and/or Foxa2 are operably linked to an expression control sequence and thus can be inserted into an expression vector. The term “functionally linked” means that one nucleic acid fragment is associated with another nucleic acid fragment in such a way that the function or expression of one nucleic acid fragment is influenced by the other nucleic acid fragment. In addition, the term “expression control sequence” means a DNA sequence that controls the expression of a functionally related nucleic acid sequence in a particular host cell. Such a control sequence includes a promoter for initiating transcription, any operator sequence for controlling transcription, a sequence for encoding a suitable ribosome binding site for the mRNA, and a sequence for controlling termination of transcription and translation. All of these sequences can generally be expressed as a “DNA construct comprising nucleic acids encoding Nurrl and/or Foxa2.”
Термин «экспрессионный вектор» относится к плазмиде, вирусному вектору или другим посредникам, в которые могут быть вставлены нуклеиновые кислоты, кодирующие структурные гены, и в которых данные нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться в клетках-хозяевах, как известно в данной области. В одном воплощении экспрессионный вектор может представлять собой вирусный вектор. Примеры вирусных векторов включают аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), векторы на основе вируса герпеса, векторы на основе вируса оспы птиц, лентивирусные векторы и тому подобные, но не ограничиваются ими. В особенности, предпочтительными являются способы с использованием аденоассоциированного вируса (AAV) или лентивируса.The term “expression vector” refers to a plasmid, viral vector, or other vehicle into which nucleic acids encoding structural genes can be inserted and into which these nucleic acids can be expressed in host cells, as is known in the art. In one embodiment, the expression vector may be a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, herpes virus vectors, fowl pox virus vectors, lentiviral vectors, and the like. Particularly preferred are methods using adeno-associated virus (AAV) or lentivirus.
Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) конструируют введением материалов, способных к образованию вируса, в конкретные клетки, и лентивирусные векторы конструируют посредством нескольких стадий таким образом, что вирусы могут быть получены в конкретной линии клеток. Главными преимуществами векторов на основе аденоассоциированного вируса (AAV) или лентивирусных векторов для генотерапии являются эффективность и стабильность.Adeno-associated virus (AAV) vectors are constructed by introducing materials capable of producing a virus into specific cells, and lentiviral vectors are constructed through several steps so that viruses can be produced in a specific cell line. The main advantages of adeno-associated virus (AAV) or lentiviral vectors for gene therapy are efficiency and stability.
Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновые кислоты по настоящему раскрытию, может быть введен в клетки мозга известным в данной области способом, например, временной трансфекцией, микроинъекцией, трансдукцией, слиянием клеток, осаждением фосфатом кальция, опосредованной липосомами трансфекцией, опосредованной DEAE декстраном трансфекцией, опосредованной полибреном трансфекцией, электропорацией, генной пушкой и другими известными способами, используемыми для введения нуклеиновых кислот в клетки, но не ограничиваясь ими. Например, гены Nurr1 и/или Foxa2 могут быть вставлены в AAV или лентивирусный вектор для конструирования экспрессионного вектора, и данный вектор затем трансдуцируется в упаковывающие клетки. Трансдуцированные упаковывающие клетки инкубируют и затем фильтруют с получением раствора AAV или лентивируса, и данный раствор используют для инфицирования клеток мозга, нейронов и/или клеток-предшественников нейронов, вводя, посредством этого, гены Nurr1 и/или Foxa2 в клетки мозга. Затем, после подтверждения того, что Nurr1 и/или Foxa2 экспрессируются одни или одновременно с использованием селективного маркера, включенного в AAV или лентивирусный вектор, можно получать желательные клетки мозга.An expression vector containing the nucleic acids of the present disclosure can be introduced into brain cells by a method known in the art, for example, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection , electroporation, gene gun and other known methods used to introduce nucleic acids into cells, but not limited to them. For example, the Nurr1 and/or Foxa2 genes can be inserted into an AAV or lentiviral vector to construct an expression vector, and the vector is then transduced into packaging cells. The transduced packaging cells are incubated and then filtered to obtain an AAV or lentivirus solution, and this solution is used to infect brain cells, neurons and/or neuronal progenitor cells, thereby introducing the Nurr1 and/or Foxa2 genes into the brain cells. Then, after confirming that Nurr1 and/or Foxa2 are expressed alone or simultaneously using a selectable marker included in the AAV or lentiviral vector, the desired brain cells can be obtained.
Согласно одному воплощению клетки мозга с введенными и экспрессируемыми в них генами Nurr1 и Foxa2 можно получать способом, включающим следующие стадии:In one embodiment, brain cells with the Nurr1 and Foxa2 genes introduced and expressed therein can be produced by a method comprising the following steps:
(a) конструирование рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК-конструкцию, имеющую нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и Foxa2;(a) constructing a recombinant viral vector containing a DNA construct having nucleic acids encoding Nurr1 and Foxa2;
(b) трансфицирование линии клеток, продуцирующей вирус, рекомбинантным вирусным вектором с получением рекомбинантного вируса, экспрессирующего Nurr1 и Foxa2; и(b) transfecting the virus-producing cell line with the recombinant viral vector to produce a recombinant virus expressing Nurr1 and Foxa2; And
(c) инфицирование клеток мозга рекомбинантным вирусом, экспрессирующим Nurr1 и Foxa2.(c) infection of brain cells with a recombinant virus expressing Nurr1 and Foxa2.
Во-первых, ДНК-конструкцию, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и Foxa2, получают, как описано выше.First, a DNA construct containing nucleic acids encoding Nurr1 and Foxa2 is prepared as described above.
Согласно одному воплощению клетки мозга с введенным и экспрессируемым в них Nurr1 могут быть получены способом, включающим следующие стадии:In one embodiment, brain cells with Nurr1 introduced and expressed therein can be produced by a method comprising the following steps:
(a) конструирование рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК-конструкцию, имеющую нуклеиновую кислоту, кодирующую Nurr1;(a) constructing a recombinant viral vector containing a DNA construct having a nucleic acid encoding Nurr1;
(b) трансфицирование линии клеток, продуцирующей вирус, рекомбинантным вирусным вектором с получением рекомбинантного вируса, экспрессирующего Nurr1; и(b) transfecting the virus-producing cell line with the recombinant viral vector to produce a recombinant virus expressing Nurr1; And
(c) инфицирование клеток мозга рекомбинантным вирусом, экспрессирующим Nurr1.(c) infection of brain cells with a recombinant virus expressing Nurr1.
ДНК-конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую Nurr1 и/или Foxa2, также может быть получена, как описано выше.A DNA construct containing nucleic acid encoding Nurr1 and/or Foxa2 can also be prepared as described above.
Данная ДНК-конструкция может быть связана функциональным образом с последовательностью контроля экспрессии, например, с промотором, и вставлена в вирусный вектор, известный в данной области, конструируя, посредством этого, рекомбинантный вирусный вектор. Затем данный рекомбинантный вирусный вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, вводится в продуцирующую вирус линию клеток, получая, посредством этого, рекомбинантный вирус, экспрессирующий Nurr1 и/или Foxa2. Линию клеток, продуцирующую вирус, соответствующий используемому вирусному вектору, можно использовать в качестве линии клеток, продуцирующей вирус. Затем клетки мозга инфицируются рекомбинантным AAV или лентивирусом, экспресирующим Nurr1 и Foxa2 или Nurr1. Это может проводиться с использованием любых способов, известных в данной области.This DNA construct can be operably linked to an expression control sequence, such as a promoter, and inserted into a viral vector known in the art, thereby constructing a recombinant viral vector. This recombinant viral vector containing nucleic acids encoding Nurr1 and/or Foxa2 is then introduced into a virus-producing cell line, thereby producing a recombinant virus expressing Nurr1 and/or Foxa2. A virus-producing cell line corresponding to the viral vector used can be used as a virus-producing cell line. Brain cells are then infected with recombinant AAV or lentivirus expressing Nurr1 and Foxa2 or Nurr1. This can be carried out using any methods known in the art.
Клетки мозга, экспрессирующие белки Nurr1 и/или Foxa2 согласно настоящему раскрытию, могут пролиферировать и инкубироваться любым способом, известным в данной области.Brain cells expressing the Nurr1 and/or Foxa2 proteins of the present disclosure can be proliferated and incubated by any method known in the art.
Клетки мозга по настоящему раскрытию инкубируются в культуральной среде, которая помогает выживанию или пролиферации желательного типа клеток мозга. Предпочтительно используется культуральная среда, часто пополненная свободными аминокислотами вместо сыворотки. Данную культуральную среду предпочтительно дополняют добавкой, разработанной для непрерывной инкубации клеток мозга. Примеры данной добавки включают среду N2 и добавку В27, которые имеются в продаже у Gibco, бычью сыворотку и тому подобные. Во время инкубации данную среду предпочтительно заменяют свежей средой при соблюдении условий для среды и клеток. В данном случае клетки мозга можно субкультивировать при непрерывной пролиферации клеток мозга до конфлюентности с образованием нейросфер. Субкультивирование может проводиться приблизительно каждые 7-8 суток, в зависимости от конкретного протокола и наблюдаемых характеристик роста данных клеток.The brain cells of the present disclosure are incubated in a culture medium that promotes the survival or proliferation of the desired brain cell type. Preferably, a culture medium is used, often supplemented with free amino acids instead of serum. This culture medium is preferably supplemented with an additive designed for continuous incubation of brain cells. Examples of this supplement include N2 medium and B27 supplement, which are commercially available from Gibco, bovine whey, and the like. During incubation, this medium is preferably replaced with fresh medium, subject to proper conditions for the medium and cells. In this case, brain cells can be subcultured by continuously proliferating brain cells to confluency to form neurospheres. Subculture may be performed approximately every 7-8 days, depending on the specific protocol and the observed growth characteristics of the given cells.
Как описано в данном документе введение и экспрессия Nurr1 и/или Foxa2 в клетках мозга облегчает патологические симптомы болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий, такие как (1) накопление бета-амилоида, (2) накопление тау-белка, (3) старение клеток мозга, (4) потеря синапсов и (5) накопление периферических иммунных клеток, и приводит к нейротрофикации клеток мозга и, таким образом, помогает предупреждать и лечить болезнь Альцгеймера, которая является видом таупатий. Экспрессия Nurr1 и Foxa2 или Nurr1 облегчает патологические симптомы болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий, и демонстрирует эффекты предупреждения и лечения болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий.As described herein, administration and expression of Nurr1 and/or Foxa2 in brain cells alleviates the pathological symptoms of Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies, such as (1) amyloid beta accumulation, (2) tau protein accumulation, (3) cell aging brain, (4) loss of synapses and (5) accumulation of peripheral immune cells, and leads to neurotrophication of brain cells and thus helps prevent and treat Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies. Expression of Nurr1 and Foxa2 or Nurr1 alleviates the pathological symptoms of Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies, and demonstrates the effects of preventing and treating Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies.
В другом аспекте согласно настоящему раскрытию предложено применение клеток мозга с введенными в них Nurr1 и Foxa2 для лечения таупатий.In another aspect, the present disclosure provides the use of Nurr1 and Foxa2 engineered brain cells for the treatment of tauopathies.
Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложено применение клеток мозга с введенным в них Nurr1 для лечения таупатий.In addition, the present disclosure provides the use of Nurr1-introduced brain cells for the treatment of tauopathies.
Например, данные клетки можно терапевтически использовать посредством прямого введения клеток мозга с введенными в них Nurr1 и Foxa2 или Nurr1 в место черного вещества, в зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению. Кроме того, клетки мозга с введенными в них Nurr1 и Foxa2 или Nurrl, можно терапевтически использовать посредством введения или трансплантации в виде композиции, содержащей их терапевтически эффективное количество. Настоящее раскрытие также включает способ лечения таупатий.For example, these cells can be used therapeutically by directly administering Nurr1 and Foxa2 or Nurr1 engineered brain cells to the site of the substantia nigra, depending on the disease or condition being treated. In addition, brain cells introduced with Nurr1 and Foxa2 or Nurrl can be used therapeutically by administration or transplantation in the form of a composition containing a therapeutically effective amount thereof. The present disclosure also includes a method for treating tauopathies.
Один аспект настоящего раскрытия относится к композиции, генотерапевтическому средству или средству клеточной терапии, содержащему клетки мозга с введенными в них Foxa2 и Nurrl или Nurr1 в качестве активного ингредиента, для предупреждения или лечения заболевания (например, болезни Альцгеймера), вызванного накоплением, агрегацией или NFL тау-белка.One aspect of the present disclosure relates to a composition, gene therapy or cell therapy comprising brain cells introduced into them with Foxa2 and Nurrl or Nurr1 as an active ingredient, for the prevention or treatment of a disease (for example, Alzheimer's disease) caused by accumulation, aggregation or NFL Tau protein.
Данное генотерапевтическое средство или средство клеточной терапии по настоящему раскрытию предупреждает накопление тау-белка и/или бета-амилоида и защищает клетки мозга, включая нейроны и глию, от повреждения, посредством этого обеспечивая пополнение (регенерацию) или новое построение (восстановление) нейронов, связанных с памятью.The gene therapy or cell therapy agent of the present disclosure prevents the accumulation of tau protein and/or amyloid beta and protects brain cells, including neurons and glia, from damage, thereby allowing replenishment (regeneration) or new construction (repair) of neurons associated with memory.
Термин «регенерация» относится к пополнению потерянной части образованного органа или индивида, и термин «восстановление», который может именоваться «воссоздание», относится к реконструкции ткани и к реконструкции вновь ткани или органа из клеток или тканей, которые один раз были разъединены.The term "regeneration" refers to the replenishment of the lost portion of a formed organ or individual, and the term "restoration", which may be referred to as "reconstruction", refers to the reconstruction of tissue and the reconstruction again of a tissue or organ from cells or tissues that were once severed.
Композицию или средство клеточной терапии по настоящему раскрытию можно готовить в виде подходящего препарата посредством включения приемлемого носителя, в зависимости от способа введения. Известны подходящие препараты для разных способов введения, и они могут включать препараты, которые типично проходят через мембрану и облегчают миграцию.The cell therapy composition or agent of the present disclosure may be formulated into a suitable formulation by including a suitable carrier, depending on the route of administration. Suitable drugs are known for various routes of administration and may include drugs that typically pass through the membrane and facilitate migration.
Кроме того, композиция по настоящему раскрытию может использоваться в виде обычного медицинского препарата. Парентеральный препарат может быть получен в виде стерильного водного раствора, неводного растворителя, суспендирующего средства, эмульсии или лиофилизирующего средства. Для перорального введения композиция по настоящему раскрытию может быть приготовлена в виде таблетки, пастилки, капсулы, эликсира, суспензии, сиропа или облатки. Для инъекций данная композиция может быть приготовлена в однодозовой ампуле или многодозовом контейнере. Кроме того, композицию для лечения по настоящему раскрытию можно вводить совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Например, для перорального введения можно использовать связующее вещество, смазку, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергирующее средство, стабилизатор, суспендирующее средство, краситель, отдушку или тому подобные. Для инъекций можно использовать буфер, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотоничный агент, стабилизатор или тому подобные. Для местного введения можно использовать субстрат, эксципиент, смазку, консервант или тому подобные.In addition, the composition of the present disclosure can be used in the form of a conventional medical preparation. The parenteral preparation may be prepared as a sterile aqueous solution, a non-aqueous diluent, a suspending agent, an emulsion, or a lyophilizing agent. For oral administration, the composition of the present disclosure may be formulated as a tablet, lozenge, capsule, elixir, suspension, syrup or cachet. For injection, the composition may be prepared in a single-dose ampoule or multi-dose container. In addition, the treatment composition of the present disclosure may be co-administered with a pharmaceutically acceptable carrier. For example, for oral administration, a binder, lubricant, disintegrant, excipient, solubilizer, dispersant, stabilizer, suspending agent, coloring agent, flavoring agent, or the like may be used. For injection, a buffer, preservative, analgesic, solubilizer, isotonic agent, stabilizer or the like may be used. For topical administration, a substrate, excipient, lubricant, preservative or the like may be used.
Кроме того, способ лечения таупатий посредством применения композиции для лечения по настоящему раскрытию может включать введение субъекту или пациенту посредством общего пути, в котором вводится заданное вещество подходящим способом. Примеры способа введения включают внутричерепное введение, внутрижелудочковое ведение, введение в позвоночный канал, внутрибрюшинное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, внутрикожное введение, пероральное введение, местное введение, введение в нос, внутрилегочное введение и ректальное введение, но не ограничиваются ими. Однако данная пероральная композиция может расщепляться в клетках при пероральном ведении, и, следовательно, предпочтительным является то, что активное лекарственное средство является покрытым, или пероральную композицию готовят в виде препарата для защиты от деградации в желудке.In addition, a method of treating tauopathies through the use of a treatment composition of the present disclosure may include administration to a subject or patient via a common route in which a given substance is administered in a suitable manner. Examples of the route of administration include, but are not limited to, intracranial administration, intraventricular administration, spinal canal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration. . However, the oral composition may be degraded in cells when administered orally, and therefore, it is preferable that the active drug is coated or the oral composition is formulated to protect against degradation in the stomach.
Данная фармацевтическая композиция также может вводиться любым устройством, которое может доставлять активное вещество в клетку-мишень. Предпочтительные способы введения и препараты включают инъекцию в гиппокамп с использованием стереотактической системы, внутрижелудочковую инъекцию, инъекцию в спинномозговую жидкость, внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию, внутримышечную инъекцию или капельную инъекцию. Данные инъекции можно получать с использованием водного растворителя, такого как физиологический раствор или раствор Рингера, и неводного растворителя, такого как растительное масло, сложный эфир высшей жирной кислоты (например, этилолеат), спирт (например, этанол, бензиловый спирт, пропиленгликоль или глицерин). Данные инъекции могут содержать фармацевтический носитель, такой как стабилизатор для предупрежения порчи (например, аскорбиновая кислота, гидросульфит натрия, пи рол а кто сульфат натрия, ВНА (бутилированный гидроксианизол), токоферол, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и т.д.), эмульгатор, буфер для регулировки рН, консервант для ингибирования микробного роста (например, фенилртутинитрат, тиомерсал, бензалкония хлорид, фенол, крезол, бензиловый спирт и т.д.). Предпочтительно способ лечения таупатий посредством применения композиции для лечения по настоящему раскрытию включает введение композиции для лечения по настоящему раскрытию в фармацевтически эффективном количестве. Данное фармацевтически эффективное количество может быть легко определено специалистом в данной области согласно факторам, хорошо известным в области медицины, включающим тип заболевания, возраст, массу тела, здоровье и пол субъекта (пациента), чувствительность субъекта (пациента) к лекарственному средству, путь введения, способ введения, число введний, период лечения, смешивание, лекарственное(ные) средство(ва), используемое(мые) в комбинации.This pharmaceutical composition can also be administered by any device that can deliver the active substance to the target cell. Preferred administration routes and preparations include hippocampal injection using a stereotactic system, intraventricular injection, cerebrospinal fluid injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, or drip injection. These injections can be prepared using an aqueous solvent, such as saline or Ringer's solution, and a non-aqueous solvent, such as vegetable oil, a higher fatty acid ester (eg, ethyl oleate), alcohol (eg, ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, or glycerol). . These injections may contain a pharmaceutical carrier such as a stabilizer to prevent spoilage (eg, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium pyrol and sodium sulfate, BHA (butylated hydroxyanisole), tocopherol, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), etc.), an emulsifier , buffer for pH adjustment, preservative for inhibiting microbial growth (for example, phenylmercuric nitrate, thiomersal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.). Preferably, a method of treating tauopathies by using a treatment composition of the present disclosure comprises administering a treatment composition of the present disclosure in a pharmaceutically effective amount. A given pharmaceutically effective amount can be readily determined by one skilled in the art according to factors well known in the medical field, including the type of disease, age, body weight, health and sex of the subject (patient), sensitivity of the subject (patient) to the drug, route of administration, route of administration, number of administrations, treatment period, mixing, drug(s) used in combination.
Другой аспект настоящего раскрытия относится к способу лечения заболевания (например, болезни Альцгеймера), вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, включающему прямую трансплантацию в место поражения композиции, содержащей клетки мозга с введенными в них Foxa2 и Nurr1 или Nurr1 в терапевтически эффективном количестве. Трансплантацию и инкубацию клеток можно проводить с использованием известных способов, которые широко известны специалисту в данной области.Another aspect of the present disclosure relates to a method of treating a disease (eg, Alzheimer's disease) caused by the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, comprising direct transplantation into the site of the lesion of a composition containing brain cells introduced into them with Foxa2 and Nurr1 or Nurr1 in a therapeutically effective amount . Transplantation and incubation of cells can be carried out using known methods that are widely known to a person skilled in the art.
Термин «терапевтически эффективное количество» клеток относится к достаточному количеству для прекращения или облегчения физиологического эффекта у субъекта или пациента, вызванного таупатией. Терапевтически эффективное количество использованных клеток может зависеть от нужд субъекта (пациента), возраста, физиологического состояния и здоровья субъекта (пациента), заданного терапевтического эффекта, размера и области ткани, нуждающейся в лечении, тяжести поражения и выбранного пути доставки. Кроме того, низкая клеточная доза клеток может вводиться в один или более чем один сайт в заданной целевой ткани в виде маленьких многочисленных трансплантатов. Клетки по настоящему раскрытию могут быть полностью выделенными перед трансплантацией, например, с образованием суспензии одиночных клеток, или могут быть почти полностью выделенными перед трансплантацией, например, с образованием маленьких агрегатов клеток. Данные клетки могут вводиться посредством пересадки или перемещения такой суспензии или маленьких агрегатов клеток в заданный сайт ткани, реконструируя или регенерируя функционально недостаточную область.The term "therapeutically effective amount" of cells refers to a sufficient amount to terminate or alleviate the physiological effect in a subject or patient caused by tauopathy. The therapeutically effective amount of cells used may depend on the needs of the subject (patient), the age, physiological state and health of the subject (patient), the desired therapeutic effect, the size and area of tissue to be treated, the severity of the lesion, and the route of delivery chosen. In addition, a low cellular dose of cells can be introduced into one or more than one site in a given target tissue in the form of small, multiple grafts. The cells of the present disclosure may be completely isolated before transplantation, for example, to form a suspension of single cells, or may be almost completely isolated before transplantation, for example, to form small aggregates of cells. These cells can be introduced by transplantation or movement of such a suspension or small aggregates of cells into a given tissue site, reconstructing or regenerating a functionally deficient area.
Для субъекта или пациента может правильно использоваться подходящий интервал дозы клеток, подлежащих введению, для достижения терапевтической эффективности в пределах обычной квалификации специалиста в данной области. Например, интервал дозы клеток может находиться в интервале приблизительно от 1000 до 1000000000 или более, но не эффективном для низкой дозы, и может не исключать возможности побочных действий для высокой дозы, и, следовательно, от 100000 до 50000000 может быть предпочтительным.A suitable dosage range of cells to be administered may be appropriately used for a subject or patient to achieve therapeutic efficacy within the normal skill of one skilled in the art. For example, the cell dose range may be in the range of about 1000 to 1000000000 or more, but is not effective for a low dose and may not eliminate the possibility of side effects for a high dose, and therefore 100,000 to 50,000,000 may be preferred.
Однако доза клеток может быть наконец правильно определена решением лечащего врача при рассмотрении типа препарата, способа введения, возраста или массы субъекта (пациента), симптомов пациента и тому подобного, но настоящее раскрытие не ограничивается ими.However, the dose of cells can finally be properly determined by the judgment of the attending physician when considering the type of drug, route of administration, age or weight of the subject (patient), symptoms of the patient and the like, but the present disclosure is not limited thereto.
Подходящая доза композиции по настоящему раскрытию варьирует, в зависимости от таких факторов, как способ получения, способ введения, возраст, масса тела или пол субъекта (пациента), тяжесть заболевания, пища, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа, и врач обычной квалификации может легко принять решение и прописать эффективную дозу для желательного лечения. В общем, фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию содержит от 1×103 до 1×1013 гв (геномы вектора)/мкл вирусного вектора или вирусного гена и может типично инъецироваться в дозе от 1×106 до 3×1015 гв/дозу вирусного вектора или вирусного гена от одного до пяти раз, и для длительных эффектов, инъекцию можно вновь проводить аналогичным способом после нескольких месяцев или нескольких лет.The appropriate dosage of the composition of the present disclosure will vary depending on factors such as the method of preparation, route of administration, age, body weight or sex of the subject (patient), severity of the disease, food, time of administration, route of administration, rate of elimination and sensitivity of response, and a physician of ordinary skill can easily decide and prescribe an effective dose for the desired treatment. In general, the pharmaceutical composition of the present disclosure contains from 1x10 3 to 1x10 13 gv (vector genomes)/μl of viral vector or viral gene and can typically be injected at a dose of 1x10 6 to 3x10 15 gv/dose viral vector or viral gene one to five times, and for long-lasting effects, the injection can be repeated in a similar manner after several months or several years.
В настоящем раскрытии данную композицию можно использовать в виде описанного выше медицинского препарата.In the present disclosure, this composition can be used in the form of a medicinal product described above.
В настоящем раскрытии термин «генотерапевтическое средство» относится к лекарственному средству, где в человеческий организм вводится генетический материал или носитель, несущий генетический материал, с целью лечения заболевания или тому подобного.In the present disclosure, the term “gene therapy” refers to a drug where genetic material or a carrier carrying genetic material is introduced into a human body for the purpose of treating a disease or the like.
Для композиции по настоящему раскрытию, которая применима в качестве генотерапевтического средства, фармацевтически приемлемый носитель является стерильным и биосовместимым. Следовательно, можно использовать одно или более чем одно из физиологического раствора, стерильной воды, раствора Рингера, буферизованного физиологического раствора, инъекционного раствора альбумина, раствора декстрозы, раствора мальтодекстрина, глицерина, этанола и их комбинации, по мере необходимости, могут быть добавлены другие типичные добавки, такие как антиоксидант, буфер и бактериостатический агент. Также в композицию дополнительно добавляют разбавитель, диспергент, поверхностно-активное вещество, связующее вещество и смазку, которая затем может быть приготовлена в инъецируемый препарат, такой как водный раствор, суспензия или эмульсия, пилюля, капсула или таблетка. Кроме того, антитела или другие лиганды, специфичные в отношении органа-мишени, могут связываться с носителем таким образом, что данный носитель может действовать специфично в отношении органа-мишени.For a composition of the present disclosure that is useful as a gene therapy, the pharmaceutically acceptable carrier is sterile and biocompatible. Therefore, one or more of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and combinations thereof may be used, and other typical additives may be added as needed. , such as antioxidant, buffer and bacteriostatic agent. A diluent, dispersant, surfactant, binder and lubricant are also further added to the composition, which can then be formulated into an injectable preparation such as an aqueous solution, suspension or emulsion, pill, capsule or tablet. In addition, antibodies or other ligands that are specific for the target organ can bind to the carrier such that the carrier can act specifically for the target organ.
Вышеописанное содержание может быть применимым или может соответствовать композиции, за исключением того, что прямо используется вектор, экспрессирующий Nurr1 и Foxa2 или Nurr1, вместо клеток мозга, экспрессирующих Nurr1 и Foxa2 или Nurr1.The contents described above may be applicable or may be consistent with the composition, except that a vector expressing Nurr1 and Foxa2 or Nurr1 is directly used instead of brain cells expressing Nurr1 and Foxa2 or Nurr1.
Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложен способ предупреждения или лечения таупатий, включающий введение субъекту композиции, содержащей клетки мозга, трансформированные Nurr1 и Foxa2 или только Nurr1, в терапевтически эффективном количестве.Additionally, the present disclosure provides a method of preventing or treating tauopathies, comprising administering to a subject a composition comprising brain cells transformed with Nurr1 and Foxa2 or Nurr1 alone in a therapeutically effective amount.
Полезные эффекты изобретенияBeneficial effects of the invention
Характеристики и преимущества настоящего раскрытия обобщаются следующим образом.The features and advantages of the present disclosure are summarized as follows.
(a) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1l и Foxa2 или ген Nurr1.(a) The present disclosure provides a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1l and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(b) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.(b) According to the present disclosure, there is provided a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(c) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.(c) According to the present disclosure, there is provided a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(d) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.(d) According to the present disclosure, a composition for inhibiting the phosphorylation of tau protein is provided, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(e) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.(e) According to the present disclosure, there is provided a composition for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(f) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.(f) According to the present disclosure, there is provided a composition for the prevention or treatment of a disease caused by the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(g) Согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.(g) According to the present disclosure, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tauopathies is provided, comprising a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(h) Согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.(h) According to the present disclosure, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tauopathies is provided, comprising neurons or glia introduced into them with the Nurr1 and Foxa2 genes or the Nurr1 gene.
(i) Ингибитор и композиция по настоящему раскрытию при применении могут использоваться в предупреждении или лечении мозгового нервного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка.(i) The inhibitor and composition of the present disclosure, when used, can be used in the prevention or treatment of a brain neurological disease, such as Alzheimer's disease, caused by the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
Приведенные выше и другие аспекты, характеристики и преимущества настоящего раскрытия будут более очевидными из следующего подробного описания, взятого в сочетании с сопровождающими графическими материалами, в которых:The foregoing and other aspects, features and advantages of the present disclosure will be more apparent from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings, in which:
На ФИГ. 1 показана методика анализа системы доставки генов с использованием вируса AAV9;In FIG. 1 shows a method for analyzing a gene delivery system using the AAV9 virus;
На ФИГ. 2 показаны результаты анализа доставки генов (уровни экспрессии GFP (зеленый флуоресцентный белок) в гиппокампе и желудочке головного мозга) с использованием вируса AAV9;In FIG. Figure 2 shows the results of a gene delivery assay (GFP (green fluorescent protein) expression levels in the hippocampus and cerebral ventricle) using the AAV9 virus;
На ФИГ. 3 показаны результаты иммуноокрашивания, которые подтверждают флуоресценцию бета-амилоида и тау-белка в области гиппокампа мышей, у которых гены Nurrl и Foxa2 были введены в клетки мозга;In FIG. Figure 3 shows the results of immunostaining, which confirm the fluorescence of beta-amyloid and tau protein in the hippocampus of mice in which the Nurrl and Foxa2 genes were introduced into the brain cells;
На ФИГ. 4 показаны результаты иммуноокрашивания, которые подтверждают флуоресценцию тау-белка и фосфорилированного тау-белка (фосфор-тау, pTau) в области гиппокампа мышей, у которых гены Nurr1 и Foxa2 были введены в клетки мозга;In FIG. Figure 4 shows the results of immunostaining, which confirm the fluorescence of tau protein and phosphorylated tau protein (phosphor-tau, pTau) in the hippocampal region of mice in which the Nurr1 and Foxa2 genes were introduced into the brain cells;
На ФИГ. 5 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);In FIG. 5 shows the results of a water maze assay comparing the behavioral indicator of mice injected with the Nurr1- and Foxa2-AAV9 virus and the behavioral indicator of mice injected with a control virus (GFP-AAV9);
На ФИГ. 6 показаны результаты анализа Y лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);In FIG. 6 shows the results of a Y maze assay comparing the behavioral indicator of mice injected with the Nurr1- and Foxa2-AAV9 virus and the behavioral indicator of mice injected with a control virus (GFP-AAV9);
На ФИГ. 7 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор (записанная картина движения) мышей, которым был инъецирован Nurrl - и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);In FIG. 7 shows the results of a water maze assay comparing the behavioral indicator (recorded movement pattern) of mice injected with the Nurrl and Foxa2-AAV9 virus and the behavioral indicator of mice injected with a control virus (GFP-AAV9);
На ФИГ. 8 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор (расстояние до цели) мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);In FIG. 8 shows the results of a water maze assay comparing the behavioral indicator (distance to target) of mice injected with the Nurr1- and Foxa2-AAV9 virus and the behavioral indicator of mice injected with a control virus (GFP-AAV9);
На ФИГ. 9 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор (средняя скорость) мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);In FIG. 9 shows the results of a water maze assay comparing the behavioral indicator (average speed) of mice injected with the Nurr1- and Foxa2-AAV9 virus and the behavioral indicator of mice injected with a control virus (GFP-AAV9);
На ФИГ. 10 показаны изображения, показывающие результаты иммуноокрашивания с использованием фосфорилированного тау-белка (p-tau) и Tuj1 в контрольной группе с введением PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), группе с введением одного Nurr1 или группе с совместным введением Nurr1 и Foxa2 у 3xFAD трансгенных (Tg) мышей; иIn FIG. 10 are images showing immunostaining results using phosphorylated tau protein (p-tau) and Tuj1 in PBS control group, Nurr1 alone group, or Nurr1 and Foxa2 co-administration group in 3xFAD transgenics (Tg) mice; And
ФИГ. 11 представляет собой график, иллюстрирующий результаты иммуноокрашивания с использованием фосфорилированного тау-белка (p-tau) и Tuj1 в контрольной группе с введением PBS, группе с введением одного Nurrl или группе с совместным введением Nurr1 и Foxa2 у 3xFAD Tg мышей.FIG. 11 is a graph illustrating immunostaining results using phosphorylated tau protein (p-tau) and Tuj1 in the PBS control group, Nurrl alone group, or Nurr1 and Foxa2 co-administration group in 3xFAD Tg mice.
Наилучший способ осуществления изобретенияBest Mode for Carrying Out the Invention
Композиция для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.A composition for inhibiting the accumulation, aggregation or entanglement of tau protein, containing a vector carrying the Nurr1 and Foxa2 genes.
Способ осуществления изобретенияMethod for carrying out the invention
Далее настоящее раскрытие будет более подробно описано со ссылкой на примеры. Данные примеры служат только для более конкретной иллюстрации настоящего раскрытия, и для специалистов в данной области было бы очевидно, что объем настоящего раскрытия не ограничивается данными примерами согласно сущности настоящего раскрытия.The present disclosure will now be described in more detail with reference to examples. These examples serve only to more specifically illustrate the present disclosure, and it would be apparent to those skilled in the art that the scope of the present disclosure is not limited to these examples in accordance with the spirit of the present disclosure.
Термины, используемые в данном документе, определяются следующим образом.The terms used in this document are defined as follows.
Термин «клетки мозга» относится к клеткам, расположенным в мозгу, и данные клетки мозга состоят из нейронов (клеток-нейронов), глии (глиальных клеток) и тому подобного.The term “brain cells” refers to cells located in the brain, and these brain cells are composed of neurons (neuron cells), glia (glial cells) and the like.
Термин «нейрон» относится к клеткам из центральной системы, и термины «нейрон» и «клетка-нейрон» можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.The term "neuron" refers to cells from the central system, and the terms "neuron" and "cell-neuron" can be used interchangeably herein.
Термин «глиальные клетки» относится к клеткам, которые составляют наибольшую часть клеток, присутствующих в мозгу, и глиальные клетки включают астроциты или микроглиальные клетки.The term "glial cells" refers to the cells that make up the largest proportion of cells present in the brain, and glial cells include astrocytes or microglial cells.
Астроциты участвуют в защите и подаче питания к нейронам и в воспалении, и микроглиальные клетки представляют собой клетки, ответственные за воспаление в мозгу, и известны как группа клеток, которые играют важную роль в мозговых заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера.Astrocytes are involved in protecting and supplying nutrition to neurons and in inflammation, and microglial cells are cells responsible for inflammation in the brain and are known as a group of cells that play an important role in brain diseases such as Alzheimer's disease.
Термин «трансдукция» относится к процессу, в котором генетический признак передается от одной клетки к другой клетке посредством бактериофага. Когда любой тип бактерий инфицируется бактериофагом, фаговая ДНК связывается с ДНК хозяина. При высвобождении фагов посредством лизиса клеток из бактериальных клеток часто высвобождаются бактериофаги, содержащие некоторую ДНК хозяина, а не некоторую из их собственной ДНК. При инфицировании других бактерий такими фагами ген предыдущего хозяина вновь вводится в бактерию таким образом, что данная бактерия может иметь новый признак. Термин «трансдукция» в биологическом исследовании обычно относится к способу, при котором конкретный экзогенный ген вводится и экспрессируется в клетках-мишенях с использованием вирусного вектора.The term "transduction" refers to the process in which a genetic trait is transferred from one cell to another cell through a bacteriophage. When any type of bacteria is infected by a bacteriophage, the phage DNA binds to the host DNA. When phages are released through cell lysis, bacterial cells often release bacteriophages containing some host DNA rather than some of their own DNA. When other bacteria are infected by such phages, the gene from the previous host is reintroduced into the bacterium so that the bacterium can have a new trait. The term "transduction" in biological research usually refers to a method in which a specific exogenous gene is introduced and expressed in target cells using a viral vector.
Термин «ингибирование накопления, агрегации или клубков» включает идеи, охватывающие случаи, где накопление, агрегация или клубки тау-белков и/или амилоида β ингибируются посредством предупреждения их продукции, и случаи, где накопление, агрегация или клубки уже продуцированных тау-белков и/или амилоида β ингибируются посредством деградации.The term "inhibition of accumulation, aggregation or tangles" includes ideas covering cases where the accumulation, aggregation or tangles of tau proteins and/or amyloid β are inhibited by preventing their production, and cases where the accumulation, aggregation or tangles of already produced tau proteins and /or amyloid β is inhibited through degradation.
Термин «субъект» может относиться к позвоночному, подлежащему анализу в отношении лечения, наблюдения или экспериментов, предпочтительно к млекопитающему, например, к корове, свинье, лошади, козе, собаке, кошке, крысе, мыши, кролику, морской свинке, человеку или тому подобным.The term "subject" may refer to a vertebrate to be analyzed for treatment, observation or experimentation, preferably a mammal, such as a cow, pig, horse, goat, dog, cat, rat, mouse, rabbit, guinea pig, human or the like. similar.
Термин «образец ткани или клетки» относится к набору аналогичных клеток, полученных из ткани субъекта или пациента. Источником образца ткани или клеток может быть свежелиофилизированный и/или консервированный образец органа или ткани, или солидная ткань из биопсии или аспирата; кровь или любые компоненты крови; или клетки в оптимальное время беременности или развития мишени. Данный образец ткани может представлять собой первичные или культивируемые клетки, или линию клеток.The term "tissue or cell sample" refers to a collection of similar cells obtained from tissue of a subject or patient. The source of the tissue or cell sample may be a freshly dried and/or preserved organ or tissue sample, or solid tissue from a biopsy or aspirate; blood or any blood components; or cells at the optimal time of pregnancy or target development. The tissue sample may be primary or cultured cells, or a cell line.
Термин «лечение» относится к подходу для получения полезных или предпочтительных клинических результатов. Для цели настоящего раскрытия полезные или предпочтительные клинические результаты охватывают, без ограничения, временное облегчение симптома, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (то есть, отсутствие ухудшения) болезненного состояния, задержку прогрессирования заболевания или уменьшение скорости прогрессирования заболевания, (частичное или общее) улучшение, временное смягчение или облегчение болезненного состояния, возможность быть либо выявляемым, либо невыявляемым и тому подобное. Кроме того, термин «лечение» может относиться к увеличению коэффициента выживаемости по сравнению с ожидаемым коэффициентом выживаемости, когда субъект не получает лечения. Термин «лечение» указывает все типы способов, такие как терапевтическое лечение и профилактические или предупредительные меры. Лечения включают лечения, требующиеся против расстройств, подлежащих предупреждению, или уже развившихся расстройств. Термин «временное облегчение» расстройства относится к уменьшению степени болезненного состояния и/или нежелательного клинического симптома, и/или к откладыванию или удлинению течения прогрессирования заболевания по сравнению с расстройствами, не подвергавшимися лечению.The term "treatment" refers to an approach to obtain beneficial or advantageous clinical results. For the purpose of this disclosure, beneficial or preferred clinical results include, without limitation, temporary relief of a symptom, reduction in the severity of a disease, stabilization (i.e., non-worsening) of a disease state, delay in disease progression or reduction in the rate of disease progression, (partial or overall) improvement, temporary mitigation or alleviation of a painful condition, the ability to be either detectable or undetectable, and the like. In addition, the term "treatment" may refer to an increase in the survival rate compared to the expected survival rate when the subject does not receive treatment. The term "treatment" refers to all types of methods, such as therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures. Treatments include treatments required against preventable disorders or disorders that have already developed. The term "temporary alleviation" of a disorder refers to a reduction in the severity of a disease state and/or an undesirable clinical symptom, and/or a delay or prolongation of disease progression compared to untreated disorders.
Термин «генотерапевтическое средство» относится к лекарственному средству, в котором генетический материал или носитель, несущий генетический материал, вводится в организм человека с целью лечения заболевания или тому подобного.The term "gene therapy" refers to a drug in which genetic material or a carrier carrying genetic material is introduced into the human body for the purpose of treating a disease or the like.
Термин «средство клеточной терапии» относится к лекарственному средству (согласно правилам U.S. FDA (Управление США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств)), используемому с целью лечения, диагностики и профилактики с использованием клеток и тканей, полученных посредством выделения из человека, культивирования и специальной манипуляции, то есть, к лекарственному средству, используемому с целью лечения, диагностики и профилактики посредством серии действий пролиферации и отбора живых аутологических, аллогенных или ксеногенных клеток in vitro для восстановления функций клеток или тканей или изменения биологических характеристик клеток другим способом. Средства клеточной терапии, главным образом, классифицируются на терапевтические средства на основе соматических клеток и терапевтические средства на основе стволовых клеток, в зависимости от уровня дифференциации клеток.The term "cell therapy" refers to a drug (as defined by the U.S. FDA regulations) used for treatment, diagnosis, and prophylaxis using cells and tissues obtained through human isolation, culture and special manipulation, that is, to a medicinal product used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through a series of actions of proliferation and selection of living autologous, allogeneic or xenogeneic cells in vitro to restore the functions of cells or tissues or otherwise change the biological characteristics of cells. Cellular therapies are mainly classified into somatic cell-based therapeutics and stem cell-based therapeutics, depending on the level of cell differentiation.
Термин «млекопитающее», нуждающееся в лечении, относится к любому животному, классифицируемому в качестве млекопитающего, включая человека, домашний скот и сельскохозяйственных животных, животное для зоопарков, спорта или домашних животных, таких как собака, лошадь, кошка, крупный рогатый скот или обезьяна. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.The term "mammal" in need of treatment refers to any animal classified as a mammal, including humans, livestock and farm animals, zoo, sport or pet animals such as a dog, horse, cat, cattle or monkey . Preferably the mammal is a human.
Термин «введение» относится к введению композиции по настоящему раскрытию субъекту или пациенту с применением любого подходящего способа. Композиция по настоящему раскрытию может вводиться посредством разных путей перорального или парентерального введения, при условии, что данная композиция может достигнуть ткани-мишени. Данная композиция может вводиться внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, перорально, местно, в нос, внутрилегочно и ректально, но настоящее раскрытие не ограничивается ими.The term "administration" refers to the administration of the composition of the present disclosure to a subject or patient using any suitable method. The composition of the present disclosure can be administered through various routes of oral or parenteral administration, provided that the composition can reach the target tissue. The composition may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, topically, nasally, intrapulmonarily, and rectally, but the present disclosure is not limited to them.
Здесь термин «эффективное количество» относится к желательному количеству, требующемуся для задержки или полного прерывания начала или прогрессирования определенного заболевания, подлежащего лечению. В настоящем раскрытии данная композиция может вводиться в фармацевтически эффективном количестве. Специалисту в данной области было бы очевидно то, что правильное количество используемой ежесуточно композиции определяется медицинским лечением в пределах интервала точного медицинского решения.As used herein, the term "effective amount" refers to the desired amount required to delay or completely interrupt the onset or progression of a particular disease being treated. In the present disclosure, the composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. It would be apparent to one skilled in the art that the correct amount of composition used daily is determined by medical treatment within the range of precise medical judgment.
Для цели настоящего раскрытия конкретное терапевтически эффективное количество для определенного субъекта или пациента предпочтительно применяется по-разному согласно разным факторам, включающим типы и степени реакций, которые следует достигнуть, конкретную композицию, включающую то, используется ли другой препарат согласно обстоятельствам, возрасту, массе, общему физическому состоянию, полу и диете субъекта (пациента), времени и пути введения, скорости секреции композиции, продолжительности лечения и лекарственным средствам, вводимым совместно или используемым в то же самое время наряду с конкретной композицией, и аналогичные факторы, хорошо известные в области медицины.For the purpose of the present disclosure, a particular therapeutically effective amount for a particular subject or patient is preferably administered differently according to various factors including the types and degrees of reactions to be achieved, the particular composition including whether a different drug is used according to the circumstances, age, weight, general the physical condition, sex and diet of the subject (patient), time and route of administration, rate of secretion of the composition, duration of treatment and drugs administered together with or used at the same time along with a particular composition, and similar factors well known in the medical field.
Если не определено иначе, все технические термины, используемые в настоящем раскрытии, имеют такие же значения, которые являются обычно понятными специалисту в области, к которой относится настоящее раскрытие. Кроме того, предпочтительные способы или образцы раскрываются в данном описании изобретения, и аналогичные или эквивалентные способы или образцы также включаются в объем настоящего раскрытия. Содержание всех публикаций, раскрытых в данном документе в качестве ссылок, включается в данный документ.Unless otherwise defined, all technical terms used in this disclosure have the same meanings as commonly understood by one skilled in the art to which this disclosure pertains. In addition, preferred methods or patterns are disclosed herein, and similar or equivalent methods or patterns are also included within the scope of the present disclosure. The contents of all publications disclosed herein by reference are incorporated herein.
Пример 1: исследование эффекта лечения таупатий и облегчения снижения когнитивных функций (способности к обучению и памяти) посредством введения гена Nurr1 и Foxa2Example 1: study of the effect of treating tauopathies and alleviating cognitive decline (learning and memory) through the introduction of the Nurr1 and Foxa2 gene
Материалы и методMaterials and method
(1) Уход за животными и эксперименты(1) Animal care and experiments
Все методики для экспериментов на животной модели 3xFAD были одобрены Институциональным комитетом по уходу и применению животных (IACUC) в Ханьянском колледже медицины (Hanyang College of Medicine) под номером одобрения 2018-0047А. Кроме того, все методики для экспериментов на животной модели 3xFAD проводили согласно руководствам по применению экспериментальных животных в Ханьянском университете (Hanyang University). Животных содержали в помещении с барьерами, свободном от специфических патогенов, с циклом 12-часового света/темноты и поддерживали на стандартном корме (5053 PicoLab®Rodent Diet 20). Размеры животных для настоящих экспериментов определяли посредством анализов in vitro и пилотного анализа настоящих экспериментов без предшествующих статистических расчетов. Данные эксперименты проводили согласно руководству NIH (Национальные институты здравоохранения). Для минимизации отклонения поведенческие анализы, главным образом, анализировали два экспериментатора способом эксперимента вслепую. В экспериментах использовали трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, США) в возрасте 18 и 15 месяцев.All procedures for experiments in the 3xFAD animal model were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Hanyang College of Medicine under approval number 2018-0047A. In addition, all procedures for experiments on the 3xFAD animal model were carried out according to the guidelines for the use of experimental animals at Hanyang University. Animals were housed in a specific pathogen-free barrier facility on a 12-hour light/dark cycle and maintained on standard chow (5053 PicoLab®Rodent Diet 20). Animal sizes for the present experiments were determined by in vitro assays and pilot analyzes of the present experiments without previous statistical calculations. These experiments were performed according to NIH (National Institutes of Health) guidelines. To minimize bias, behavioral assays were primarily analyzed by two experimenters in a blinded fashion. Transgenic mice with Alzheimer's disease (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, USA) at the age of 18 and 15 months were used in the experiments.
(2) Стереотаксическая инъекция AAV в модельную мышь с болезнью Альцгеймера(2) Stereotactic injection of AAV into Alzheimer's disease mouse model
Трансгенным мышам с болезнью Альцгеймера (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, США) в возрасте 18 месяцев (18 мес.) и в возрасте 15 месяцев (15 мес.) инъецировали вирусные векторы, содержащие Nurr1-AAV9 (1 мкл) плюс Foxa2-AAV9 (1 мкл) (всего 2 мкл, 1012 вг/мкл, группа Nurr1+Foxa2), или Nurr1-AAV9 (1 мкл) плюс контрольный AAV9 (1 мкл) (всего 2 мкл, 5×1011 вг/мкл, группа одного Nurr1), или контрольной группе, имеющей один вирус AAV9 (2 мкл, 1012 вг/мкл, только контрольная группа), в гиппокамп (1,5 мм позади брегмы; плюс/минус 1 мм латерально от срединной линии; -2 мм вентрально по отношению к твердой мозговой оболочке) и в мозговой желудочек (0,9 мм позади брегмы; плюс/минус 1,7 мм латерально от срединной линии; -2,2 мм вентрально по отношению к твердой мозговой оболочке) за 10 минут под анестезией, индуцированной золетилом 50 (0,1 мг/кг), смешанным с ромпумом (93,28 мкг/кг). Иглу (26 калибра) оставляли в месте инъекции на 5-10 минут после завершения каждой инъекции и медленно удаляли. При подтверждении неточной инъекции в места гиппокампа и мозгового желудочка (ICV) данных мышей исключали из анализа.Transgenic mice with Alzheimer's disease (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, USA) were injected with viral vectors containing Nurr1-AAV9 (1 μl) plus Foxa2-AAV9 (1 μl) (2 μl total, 10 12 vg/μl, Nurr1+Foxa2 group), or Nurr1-AAV9 (1 μl) plus control AAV9 (1 μl) (2 μl total, 5 × 10 11 vg/ µl, Nurr1 alone group), or AAV9 virus alone control group (2 µl, 10 12 vg/µl, control group only), into the hippocampus (1.5 mm posterior to bregma; plus/minus 1 mm lateral to midline; -2 mm ventral to the dura mater) and into the cerebral ventricle (0.9 mm posterior to bregma; plus/minus 1.7 mm lateral to the midline; -2.2 mm ventral to the dura mater) in 10 minutes under anesthesia induced by zoletil 50 (0.1 mg/kg) mixed with rompum (93.28 mcg/kg). A needle (26 gauge) was left at the injection site for 5-10 minutes after completion of each injection and slowly removed. If inaccurate injection into the hippocampal and cerebral ventricle (ICV) sites was confirmed, these mice were excluded from analysis.
(3) Продукция вируса(3) Virus production
Лентивирусные векторы, экспрессирущие Nurr1 или Foxa2 под контролем промотора CMV (цитомегаловирус), получали посредством вставки соответствующих кДНК в сайт множественного клонирования pCDH (System Biosciences, Mountain View, CA). Лентивирусные векторы pGIPZ-shNurr1 и pGIPZ-shFoxa2 приобретали у Open Biosystems (Rockford, IL). Пустые остовы векторов (pCDH и pGIPZ) использовали в качестве негативных контролей. Данные лентивирусы продуцировали и использовали для трансдукции культур in vitro, как описано выше (Yi SH, Не ХВ, Rhee YH, Park СН, Takizawa Т, Nakashima К, Lee SH (2014) Foxa2 acts as a co-activator potentiating expression of the Nurr1-induced DA phenotype via epigenetic regulation. Development 141: 761-772). Титры лентивирусов определяли с использованием набора для количественного измерения лентивируса ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) QuickTiter™ (Cell Biolabs, San Diego, CA), и для каждой реакции трансдукции использовали 200 мкл/лунку (24-луночный планшет) или 2 мл/6 см чашки 106 трансдуцирующих единиц (TU)/мл (60-70 нг/мл). Для индукции экспрессии in vivo посредством стереотаксической инъекции получали AAV, экспрессирующий Nurr1 или Foxa2 (меченный гемагглютинином (НА)) под контролем промотора CMV, посредством субклонирования соответствующих кДНК в вектор pAAV-MCS (Addgene, Cambridge, MA). Для оценки эффективности экспрессии трансгена также генерировали AAV, экспрессирующие GFP. Упаковка и продукция AAV (серотип 9 или 2) осуществлялись Корейским институтом науки и технологии (Сеул, Корея). Титры AAV определяли с использованием набора для количественного измерения AAV QuickTiter™ (Cell Biolabs). Исследования соэкспрессии проводили посредством инфицирования клеток смесями индивидуальных вирусных препаратов (1:1, об./об.).Lentiviral vectors expressing Nurr1 or Foxa2 under the control of the CMV (cytomegalovirus) promoter were generated by inserting the corresponding cDNAs into the multiple cloning site of pCDH (System Biosciences, Mountain View, CA). Lentiviral vectors pGIPZ-shNurr1 and pGIPZ-shFoxa2 were purchased from Open Biosystems (Rockford, IL). Empty vector backbones (pCDH and pGIPZ) were used as negative controls. These lentiviruses were produced and used for transduction of in vitro cultures as described above (Yi SH, He XB, Rhee YH, Park CH, Takizawa T, Nakashima K, Lee SH (2014) Foxa2 acts as a co-activator potentiating expression of the Nurr1 -induced DA phenotype via epigenetic regulation. Development 141: 761-772). Lentivirus titers were determined using the HIV (human immunodeficiency virus) Lentivirus QuickTiter™ Quantitative Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA), and 200 μl/well (24-well plate) or 2 ml/6 cm was used for each transduction reaction cups 10 6 transducing units (TU)/ml (60-70 ng/ml). To induce expression in vivo, AAV expressing Nurr1 or Foxa2 (hemagglutinin (HA) tagged) under the control of the CMV promoter was prepared by stereotactic injection by subcloning the corresponding cDNAs into the pAAV-MCS vector (Addgene, Cambridge, MA). To evaluate the efficiency of transgene expression, AAVs expressing GFP were also generated. Packaging and production of AAV (serotype 9 or 2) were carried out by the Korea Institute of Science and Technology (Seoul, Korea). AAV titers were determined using the AAV QuickTiter™ Quantification Kit (Cell Biolabs). Coexpression studies were performed by infecting cells with mixtures of individual viral preparations (1:1, v/v).
(4) Иммуноокрашивание(4) Immunostaining
Культивируемые клетки и полученные на криотоме срезы мозга окрашивали следующими первичными антителами: против Nurr1 (1:500, кроличье, 20-е сутки эмбрионального развития, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX и 1:1000, мышиное, R&D Systems); Foxa2 (1:500, козье, Santa Cruz Biotechnology); GFP (1:2000, кроличье, Life Technologies); GFAP (1:200, мышиное, MP Biomedicals, Santa Ana, CA); Iba-1 (1:200, кроличье, Wako), NeuN (1:100, мышиное, EMD Milipore); TAU (1:500, мышиное, Santa Cruz Biotechnology); pTAU (1:500, кроличье, ABcam).Cultivated cells and brain sections obtained on a cryotome were stained with the following primary antibodies: against Nurr1 (1:500, rabbit, embryonic day 20, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX and 1:1000, mouse, R&D Systems); Foxa2 (1:500, goat, Santa Cruz Biotechnology); GFP (1:2000, rabbit, Life Technologies); GFAP (1:200, murine, MP Biomedicals, Santa Ana, CA); Iba-1 (1:200, rabbit, Wako), NeuN (1:100, mouse, EMD Milipore); TAU (1:500, mouse, Santa Cruz Biotechnology); pTAU (1:500, rabbit, ABcam).
Культивируемые клетки фиксировали в 4%-ном парафармальдегиде (PFA) в растворе PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и блокировали 0,3% Triton Х-100 и 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в течение 40 минут. Кроме того, данные клетки культивировали совместно с первичными антителами в течение ночи при 4°С. Вторичные антитела для визуализации были следующими: Су3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories) или Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies). Окрашенные клетки монтировали совместно с заливочным раствором VECTASHIELD и DAPI (Vector Laboratories), и изображения получали посредством эпифлуоресцентного микроскопа (Leica) и конфокального микроскопа (Leica PCS SP5).Cultured cells were fixed in 4% parapharmaldehyde (PFA) in PBS and blocked with 0.3% Triton X-100 and 1% BSA (bovine serum albumin) for 40 minutes. In addition, these cells were co-cultured with primary antibodies overnight at 4°C. Secondary antibodies for imaging were: Cy3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories) or Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies). Stained cells were mounted with VECTASHIELD and DAPI mounting solution (Vector Laboratories), and images were acquired using an epifluorescence microscope (Leica) and a confocal microscope (Leica PCS SP5).
(5) Поведенческие анализы (5)-1. Способ водного лабиринта(5) Behavioral analyzes (5)-1. Water maze method
Способ водного лабиринта, также именуемый водный лабиринт Морриса, широко используется в исследовании пространственной памяти и обучения. Животных помещают в лужи, непрозрачно окрашенные сухим нежирным молоком или нетоксичной краской, где животным нужно плыть до скрытой спасительной платформы. Поскольку животные находятся в непрозрачной воде, данные животные не могут видеть платформу и не могут полагаться на запахи для нахождения путей спасения. Вместо этого, животным нужно полагаться на внешние ориентиры или ориентиры вне лабиринта. По мере того как животные становятся более привыкшими к данной работе, данные животные могут находить платформу быстрее. Эта парадигма, разработанная Ричардом Г. Моррисом в 1984 г., стала одним из «золотых стандартов» в поведенческой нейронауке.The water maze technique, also called the Morris water maze, is widely used in the study of spatial memory and learning. Animals are placed in puddles opaquely colored with non-fat milk powder or non-toxic paint, where the animals must swim to a hidden rescue platform. Because the animals are in opaque water, these animals cannot see the platform and cannot rely on scent to find escape routes. Instead, animals need to rely on external landmarks or landmarks outside the maze. As animals become more accustomed to a given task, these animals can find the platform more quickly. This paradigm, developed by Richard G. Morris in 1984, has become one of the “gold standards” in behavioral neuroscience.
(5)-2. Способ Y-лабиринта(5)-2. Y-maze method
Способ Y-лабиринта широко используется для оценки поведения в доклинических исследованиях для изучения пространственного обучения и памяти. В способе Y-лабиринта животных помещают в конец одной из трех ветвей лабиринта в форме Y, где данные животные решают, двигаться ли налево или направо на перекрестке. Данные анализы можно повторять несколько раз для одного животного. Наблюдатель записывал ряд выборов животных в Y-лабиринте (например, число посещений конкретной ветви, общее число посещений трех ветвей, число раз выбора левой ветви животными, число раз выбора правой ветви животными). Применение анализа Y-лабиринта охватывает анализ спонтанного чередования и анализ конгнитивной памяти. В анализе спонтанного чередования наблюдатель наблюдал и записывал то, имели ли животные тенденцию к посещению ветви, которую недавно не посещали (например, измеренное число спонтанных чередований). Обнаружили, что данные анализы являются чувствительными к повреждению гиппокампа, генетической манипуляции и препаратам, приводящим к потере памяти.The Y-maze technique is widely used for behavioral assessment in preclinical studies to study spatial learning and memory. In the Y-maze method, animals are placed at the end of one of three arms of a Y-shaped maze, where the animals decide whether to go left or right at an intersection. These tests can be repeated several times for one animal. The observer recorded a number of animal choices in the Y-maze (eg, number of visits to a particular branch, total number of visits to three branches, number of times animals chose the left branch, number of times animals chose the right branch). Applications of Y-maze analysis include spontaneous alternation analysis and cognitive memory analysis. In the spontaneous alternation assay, the observer observed and recorded whether animals tended to visit a branch that had not recently been visited (eg, the measured number of spontaneous alternations). These assays were found to be sensitive to hippocampal damage, genetic manipulation, and drugs that cause memory loss.
(6) Подсчет клеток и статистический анализ(6) Cell counting and statistical analysis
Иммуноокрашенные и окрашенные DAPI клетки подсчитывали в случайных областях каждого покровного стекла культуры посредством применения окулярной сетки при увеличении 200× или 400×. Для всех графических материалов данные выражаются как среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего), и статистические критерии обосновываются в установленном порядке. Статистические сравнения делали с использованием t-критерия Стьюдента (напарного) или 2-факторного или однофакторного ANOVA (дисперсионный анализ), с последующим апостериорным анализом Бонферрони с использованием SPSS (Statistics 21; IBM Inc. Bentonville, AR, США), n, значения P и способы статистического анализа указываются в легендах графических материалов. Значение Р меньше, чем 0,05 рассматривалось значимым.Immunostained and DAPI-stained cells were counted in random areas of each culture coverslip using an eyepiece grid at 200× or 400× magnification. For all graphics, data are expressed as mean plus/minus SEM (standard error of the mean) and statistical tests are justified as appropriate. Statistical comparisons were made using Student's t test (paired) or 2-way or one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc analysis using SPSS (Statistics 21; IBM Inc. Bentonville, AR, USA), n, P values and methods of statistical analysis are indicated in the legends of graphic materials. A P value less than 0.05 was considered significant.
Результатыresults
(1) Влияние введения гена Nurr1 и Foxa2 на таупатию(1) Effect of Nurr1 and Foxa2 gene introduction on tauopathy
Поскольку аденоассоциированный вирус (AAV) является очень слабоиммуногенным в человеческом организме, для конструирования системы доставки гена Nurr1 и Foxa2, специфично нацеленной на глию, использовали серотип AAV9, который имеет тенденцию инфицировать, главным образом, нейроны и глию в мозгу. Для осуществления экспрессии генов Nurr1 и Foxa2 использовали промотор CMV или GFAP. Nurr1+Foxa2-AAV9 находился в гиппокампе и мозговом желудочке (ICV), которые являются местами поражения болезни Альцгеймера - вида таупатий.Because adeno-associated virus (AAV) is very weakly immunogenic in the human body, serotype AAV9, which tends to infect mainly neurons and glia in the brain, was used to construct a Nurr1 and Foxa2 gene delivery system specifically targeting glia. The CMV or GFAP promoter was used to express the Nurr1 and Foxa2 genes. Nurr1+Foxa2-AAV9 was located in the hippocampus and cerebral ventricle (ICV), which are sites of lesions in Alzheimer's disease, a type of tauopathy.
Для проведения анализа доставки генов с использованием вируса AAV9 вирус AAV9, который является специфичным в отношении астроцитов и экспрессирует зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора GFAP, инъецировали как в гиппокамп, так и в мозговой желудочек (ICV) мышей. Через три недели после инъекции вируса GFP-AAV9 измеряли экспрессию GFP (ФИГ. 1). В результате инъекцирования GFP-AAV9 в гиппокамп и мозговой желудочек (ICV) GFP экспрессировался по всему гиппокампу и особенно в GFAP+астроцитах (ФИГ. 2). GFAP, NeuN и Iba1 использовали в качестве маркеров для астроцитов, зрелых нейронов и микроглии соответственно. Соэкспрессия GFAP и GFP, отсутствие соэкспрессии GFP и NeuN, и отсутствие соэкспрессии GFP и Iba1 указывали на то, что вирус специфично экспрессировал данные гены в астроцитах.To perform a gene delivery assay using the AAV9 virus, the AAV9 virus, which is specific for astrocytes and expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of the GFAP promoter, was injected into both the hippocampus and the cerebral ventricle (ICV) of mice. Three weeks after injection of the GFP-AAV9 virus, GFP expression was measured (FIG. 1). Following injection of GFP-AAV9 into the hippocampus and cerebral ventricle (ICV), GFP was expressed throughout the hippocampus and particularly in GFAP+ astrocytes (FIG. 2). GFAP, NeuN and Iba1 were used as markers for astrocytes, mature neurons and microglia, respectively. Coexpression of GFAP and GFP, lack of coexpression of GFP and NeuN, and lack of coexpression of GFP and Iba1 indicated that the virus specifically expressed these genes in astrocytes.
Тау-белки представляют собой группу ассоциированных с микротрубочками белков (MAP) в аксонах нормальных нервных клеток. При агрегации тау-белка в мозгу, она влечет за собой тау-опосредованное повреждение и дисфункцию нейронов, которые описываются в качестве типичного этиологического фактора и симптома болезни Альцгеймера.Tau proteins are a group of microtubule-associated proteins (MAPs) in the axons of normal nerve cells. When tau protein aggregates in the brain, it entails tau-mediated neuronal damage and dysfunction, which has been described as a typical etiological factor and symptom of Alzheimer's disease.
Гены Nurr1 и Foxa2 специфично вводили в гиппокамповые глиальные клетки и глиальные клетки мозгового желудочка мышей 3xFAD в возрасте 15 и 18 месяцев, которые являются животными моделями болезни Альцгеймера, имеющими агрегированные в мозгу тау-белки, аналогично человеческим пациентам. Через два месяца после введения данных генов тау-белки количественно анализировали посредством иммуноокрашивания в гиппокамповой области.The Nurr1 and Foxa2 genes were specifically introduced into hippocampal glial cells and cerebral ventricular glial cells of 15- and 18-month-old 3xFAD mice, which are animal models of Alzheimer's disease that have tau proteins aggregated in the brain, similar to human patients. Two months after the introduction of these genes, tau proteins were quantitatively analyzed by immunostaining in the hippocampal region.
На ФИГ. 3А показано значимое снижение тау-специфичных клубков в гиппокамповой области мышей 3xFAD с инъекцией Nurr1+Foxa2-AAV9 по сравнению с тау-специфичными клубками контрольных мышей 3xFAD с инъекцией AAV9. На ФИГ. 3В показаны количественные данные тау+клубков.In FIG. Figure 3A shows a significant reduction in tau-specific tangles in the hippocampal region of 3xFAD mice injected with Nurr1+Foxa2-AAV9 compared to tau-specific tangles in control 3xFAD mice injected with AAV9. In FIG. Figure 3B shows quantitative tau+tangle data.
Тау-белки присутствуют даже в нормальном состоянии, но известно то, что ненормальные тау-белки вызывают нейродегенеративные заболевания, а гиперфосфорилирование тау-белков является характеристикой нормальных тау-белков.Tau proteins are present even in the normal state, but it is known that abnormal tau proteins cause neurodegenerative diseases, and hyperphosphorylation of tau proteins is a characteristic of normal tau proteins.
Гены Nurr1 и Foxa2 специфично вводили в гиппокамповые глиальные клетки и глиальные клетки мозгового желудочка мышей 3xFAD в возрасте 15 и 18 месяцев. Через два месяца после введения данных генов фосфорилированные тау-белки (фосфор-тау, pTau) количественно анализировали посредством иммуноокрашивания в гиппокамповой области.The Nurr1 and Foxa2 genes were specifically introduced into hippocampal glial cells and cerebral ventricular glial cells of 3xFAD mice at 15 and 18 months of age. Two months after the introduction of these genes, phosphorylated tau proteins (phosphor-tau, pTau) were quantitatively analyzed by immunostaining in the hippocampal region.
В результате обнаружили то, что мыши 3xFAD с инъекцией AAV9-pGFAP-Nurr1+Foxa2 имеют пониженные уровни фосфорилированного тау по сравнению с контрольными мышами с инъекцией AAV9 при измерении посредством иммуногистохимии (IHC) (ФИГ. 4).The result was that AAV9-pGFAP-Nurr1+Foxa2-injected 3xFAD mice had reduced levels of phosphorylated tau compared to control AAV9-injected mice when measured by immunohistochemistry (IHC) (FIG. 4).
Данный результат показывает то, что сверхэкспрессия Nurr1 и Foxa2 может уменьшать абсолютное количество образовавшихся тау-клубков или количество фосфорилированного тау-белка, свидетельствуя о терапевтическом влиянии сверхэкспрессии Nurr1 и Foxa2 на тау-патологию.This result indicates that overexpression of Nurr1 and Foxa2 can reduce the absolute number of tau tangles formed or the amount of phosphorylated tau protein, suggesting a therapeutic effect of overexpression of Nurr1 and Foxa2 on tau pathology.
(2) Облегчение снижения когнитивных функций (обучение и память) посредством доставки гена Nurr1 и Foxa2 в мышиную модель болезни Альцгеймера (AD) при анализе посредством поведенческих анализов с использованием водного лабиринта и Y-лабиринта(2) Alleviation of cognitive decline (learning and memory) through Nurr1 and Foxa2 gene delivery in a mouse model of Alzheimer's disease (AD) when analyzed via water maze and Y-maze behavioral assays
Проводили исследование для того, чтобы понять влияние глиальной экспрессии Nurr1 и Foxa2 на лечение болезни Альцгеймера - вида таупатий. В данном отношении Nurr1 и Foxa2 специфично экспрессировались в гиппокамповых глиальных клетках и глиальных клетках мозговых желудочков мышей 3xFAD в возрасте 15-18 месяцев, которые подверглись началу болезни Альцгеймера посредством мутагенеза трех генов: АРР, PS1 и tau. Мыши в возрасте 15-18 месяцев были в значительной степени старыми, принимая во внимание тот факт, что мыши в среднем живут примерно 24 месяца. Через три месяца после доставки генов Nurr1 и Foxa2 модельным мышам с болезнью Альцгеймера данных мышей анализировали на когнитивные способности.A study was conducted to understand the effect of glial expression of Nurr1 and Foxa2 on the treatment of Alzheimer's disease, a type of tauopathy. In this regard, Nurr1 and Foxa2 were specifically expressed in hippocampal glial cells and cerebral ventricular glial cells of 15–18 month old 3xFAD mice that had undergone the onset of Alzheimer's disease through mutagenesis of three genes: APP, PS1, and tau. Mice aged 15-18 months were largely old, considering the fact that mice live on average for about 24 months. Three months after delivery of the Nurr1 and Foxa2 genes to a mouse model of Alzheimer's disease, these mice were analyzed for cognitive abilities.
Болезнь Альцгеймера, которая представляет собой вид таупатий, является нейродегенеративным заболеванием, отличающимся медленным прогрессированием ухудшения памяти и когнитивных способностей. Анализы водного лабиринта и Y-лабиринта поводили в качестве животных анализов болезни Альцгеймера. И анализ водного лабиринта, и анализ Y-лабиринта представляют собой разрешенные к использованию репрезентативные экспериментальные способы экспериментов по эффективности в отношении памяти и когнитивных способностей, и они используются в качестве индикаторов поведенческих анализов для определения прогрессирования болезни Альцгеймера и терапевтических эффектов на болезнь Альцгеймера.Alzheimer's disease, which is a type of tauopathies, is a neurodegenerative disease characterized by slow progression of memory and cognitive decline. The water maze and Y-maze assays were used as animal assays for Alzheimer's disease. Both the water maze assay and the Y-maze assay are validated representative experimental methods for performance experiments on memory and cognition, and they are used as indicator behavioral assays to determine the progression of Alzheimer's disease and therapeutic effects on Alzheimer's disease.
Примерно через две недели после инъекции вируса Nurr1+Foxa2-AAV9 мышам в возрасте 15-18 месяцев поведенческие анализы водного лабиринта и Y-лабиринта поводили один раз в две недели в течение двух месяцев. Поведенческие индексы сравнивали между мышами с инъекцией вируса Nurr1+Foxa2-AAV9 и контрольного вируса (GFP-AAV9). В результате поведенческого анализа у животных моделей мыши с экспрессией Nurr1+Foxa2 демонстрировали лучшие поведенческие индексы и большие скорости ответа по сравнению с контрольными мышами, указывая на то, что глиальная экспрессия Nurr1 и Foxa2 осуществляла значимое улучшение когнитивной активности, ответственной за обучение и память, и, таким образом, терапевтический эффект на болезнь Альцгеймера - вид таупатий. То есть, идентифицировали то, что экспрессия Nurr1 и Foxa2 в мозговых клетках имеет клинический генотерапевтический эффект на болезнь Альцгеймера (ФИГ. 5, 6, 7, 8 и 9).Approximately two weeks after injection of the Nurr1+Foxa2-AAV9 virus, 15- to 18-month-old mice were subjected to water maze and Y-maze behavioral assays once every two weeks for two months. Behavioral indices were compared between mice injected with the Nurr1+Foxa2-AAV9 virus and a control virus (GFP-AAV9). As a result of behavioral analysis in animal models, mice expressing Nurr1+Foxa2 showed better behavioral indices and faster response rates compared with control mice, indicating that glial expression of Nurr1 and Foxa2 significantly improved cognitive activity responsible for learning and memory, and , thus, the therapeutic effect on Alzheimer's disease is a type of tauopathies. That is, the expression of Nurr1 and Foxa2 in brain cells has been identified to have a clinical gene therapy effect on Alzheimer's disease (FIGS. 5, 6, 7, 8 and 9).
Пример 2: исследование ингибирования образования p-tau белка (фосфорилированного тау-белка) посредством введения гена Nurr1 и Foxa2Example 2: study of inhibition of p-tau protein (phosphorylated tau protein) formation by introducing Nurr1 and Foxa2 gene
Далее исследовали, может ли образование фосфорилированного тау-белка ингибироваться посредством введения гена Nurr1 и Foxa2.We next examined whether the formation of phosphorylated tau protein could be inhibited by introducing the Nurr1 and Foxa2 genes.
Трансгенным по болезни Альцгеймера мышам (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, США) в возрасте 18 и 15 месяцев с индукциями мутаций АРР, PS1 и tau вводили Nurr1-AAV9 (1 мкл) плюс Foxa2-AAV9 (1 мкл) (всего 2 мкл, 1012 вг/мкл, группа Nurr1+Foxa2), один Nurr1-AAV9 (1 мкл) или физиологический раствор (PBS) в гиппокамп и мозговой желудочек анестезированных мышей посредством стереотаксической микроинъекции. Через два месяца после введения трансгенных по болезни Альцгеймера мышей умерщвляли, фиксировали в параформальдегиде (PFA) и затем блокировали в течение 1 часа посредством добавления 0,6% Triton Х-100 в 1% растворе BSA (бычий сывороточный альбумин)/PBS. Затем первичные антитела (p-tau, Tuj1) связывались с тем же самым раствором, и осуществлялось окрашивание ткани в течение ночи при 4°С. Вторичное окрашивание проводили посредством Су3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories), Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies) в качестве вторичных антител для визуализации. Окрашенные клетки монтировали совместно с заливочным раствором VECTASHIELD, DAPI (Vector Laboratories), и область энторинальной коры визуализировали посредством конфокального микроскопа (Leica PCS SP5). Полученные изображения показаны на ФИГ. 10, и их количественно измеренные результаты показаны на ФИГ. 11 и в Таблице 1.Alzheimer's disease transgenic mice (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, USA) aged 18 and 15 months with induction of APP, PS1 and tau mutations were injected with Nurr1-AAV9 (1 μl) plus Foxa2-AAV9 (1 μl) (total 2 µl, 10 12 vg/µl, Nurr1+Foxa2 group), Nurr1-AAV9 alone (1 µl) or saline (PBS) into the hippocampus and cerebral ventricle of anesthetized mice via stereotactic microinjection. Two months after administration, Alzheimer's disease transgenic mice were sacrificed, fixed in paraformaldehyde (PFA) and then blocked for 1 hour with 0.6% Triton X-100 in 1% BSA/PBS. Primary antibodies (p-tau, Tuj1) were then bound to the same solution and the tissue was stained overnight at 4°C. Secondary staining was performed with Cy3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories), Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies) as secondary antibodies for imaging. Stained cells were mounted with VECTASHIELD, DAPI mounting solution (Vector Laboratories), and the entorhinal cortex region was imaged using a confocal microscope (Leica PCS SP5). The resulting images are shown in FIG. 10, and their quantitatively measured results are shown in FIG. 11 and Table 1.
Как подтверждается на ФИГ. 10 и 11, результаты анализа подтвердили то, что уровень фосфорилированного тау-белка, экспрессируемого в нейронах мозга Tg мышей 3xFAD, был значительно сниженным при введении и экспрессии Nurr1 и Foxa2, и был значительно сниженным при введении и экспрессии одного Nurr1.As confirmed in FIG. 10 and 11, the results of the analysis confirmed that the level of phosphorylated tau protein expressed in brain neurons of Tg 3xFAD mice was significantly reduced when Nurr1 and Foxa2 were administered and expressed, and was significantly reduced when Nurr1 alone was administered and expressed.
Результаты анализа показали то, что при совместной экспрессии транскрипционных факторов Nurr1 и Foxa2 или экспрессии одного Nurr1 у Tg мышей 3xFAD в качестве модельных мышей с болезнью Альцгеймера уровень фосфорилированного тау-белка в нейронах снижался по сравнению с контрольной группой. Рассматривая то, что фосфорилированный тау-белок представляет собой вещество, составляющее нейрофибриллярные клубки - главную характеристику болезни Альцгеймера, и они накапливаются в нейронах с вызовом клеточной гибели нейронов, в конечном счете приводя к расстройству памяти, ожидается, что введение Nurr1 и Foxa2 совместно или одного Nurrl согласно настоящему раскрытию подлежит применению в лечении таупатий и болезни Альцгеймера.The results of the analysis showed that when the transcription factors Nurr1 and Foxa2 were coexpressed or Nurr1 alone was expressed in Tg 3xFAD mice as a model mouse for Alzheimer's disease, the level of phosphorylated tau protein in neurons was reduced compared to the control group. Considering that phosphorylated tau protein is a substance constituting neurofibrillary tangles, a major characteristic of Alzheimer's disease, and they accumulate in neurons causing cell death of neurons, ultimately leading to memory impairment, it is expected that administration of Nurr1 and Foxa2 together or alone Nurrl according to the present disclosure is to be used in the treatment of tauopathies and Alzheimer's disease.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Настоящее раскрытие относится к композиции для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка и, более конкретно, к методике ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка посредством введения генов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного гена Nurr1 для индукции экспрессии данных генов.The present disclosure relates to a composition for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein and, more particularly, to a technique for inhibiting the accumulation, aggregation or tangle formation of tau protein by introducing the Nurr1 and Foxa2 genes together or the Nurr1 gene alone to induce the expression of these genes.
Claims (3)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2019-0115466 | 2019-09-19 | ||
| KR10-2020-0106368 | 2020-08-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818590C1 true RU2818590C1 (en) | 2024-05-03 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008135762A (en) * | 2006-02-16 | 2010-03-27 | Де МакЛин Хоспитал Корпорейшн (US) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE |
| RU2016101106A (en) * | 2013-07-17 | 2017-08-22 | Юниверсити Оф Питтсбург-Оф Дзе Коммонвелт Систем Оф Хайер Эдьюкейшн | NON-TOXIC VECTORS ON THE BASIS OF HSV FOR APPLICATIONS IN EFFECTIVE DELIVERY OF GENES AND COMPLETE CELLS FOR THEIR PRODUCTION |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008135762A (en) * | 2006-02-16 | 2010-03-27 | Де МакЛин Хоспитал Корпорейшн (US) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE |
| RU2016101106A (en) * | 2013-07-17 | 2017-08-22 | Юниверсити Оф Питтсбург-Оф Дзе Коммонвелт Систем Оф Хайер Эдьюкейшн | NON-TOXIC VECTORS ON THE BASIS OF HSV FOR APPLICATIONS IN EFFECTIVE DELIVERY OF GENES AND COMPLETE CELLS FOR THEIR PRODUCTION |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MOON MINHO et al., Nurrl(NR4A2) regulates alzheimer's disease-related pathogenesis and cognitive function in the 5XFAD mouse model, Aging Cell, 2019, v. 18, n. 1, art. el2866, p.1-11. * |
| SONG JAE-JIN ET AL., Cografting astrocytes improves cell therapeutic outcomes in a Parkinson's disease model, The Journal of Clinical Investigation, 2018, v. 128, n. 1, p. 463-482. OH SANG MIN et al., Combined Nurrl and Foxa2 roles in the therapy of parkinson's disease, EMBO Molecular Medicine, 2015, v.7, n.5, p.510-523. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alizadeh et al. | Neuregulin‐1 positively modulates glial response and improves neurological recovery following traumatic spinal cord injury | |
| Tweedie et al. | Tumor necrosis factor-α synthesis inhibitor 3, 6′-dithiothalidomide attenuates markers of inflammation, Alzheimer pathology and behavioral deficits in animal models of neuroinflammation and Alzheimer’s disease | |
| Lee et al. | Regulator of G-protein signaling-10 negatively regulates NF-κB in microglia and neuroprotects dopaminergic neurons in hemiparkinsonian rats | |
| JP2019520788A (en) | Anti-Ryk antibodies and methods of use thereof | |
| KR102526556B1 (en) | COMPOSITION AND METHOD OF INHIBITING AMYLOID BETA ACCUMULATION and/or AGGREGATION | |
| JP2016538276A (en) | Compositions and methods for inhibiting NF-κB and SOD-1 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis | |
| KR20190062363A (en) | Therapeutic effects of Nurr1 and Foxa2 in inflammatory neurologic disorders by M1-to-M2 polarization of glial cells | |
| JP2024069332A (en) | Composition for preventing or treating neurodegenerative brain diseases comprising TMEM176B or a modulator of its expression or activity as an active ingredient | |
| Li et al. | Secreted phosphoprotein 1 slows neurodegeneration and rescues visual function in mouse models of aging and glaucoma | |
| Wu et al. | Lin28B regulates the fate of grafted mesenchymal stem cells and enhances their protective effects against Alzheimer's disease by upregulating IGF‐2 | |
| RU2818590C1 (en) | Composition and method for inhibiting accumulation, aggregation and formation of tau protein coils | |
| Winkler et al. | Continuous exposure to glial cell line-derived neurotrophic factor to mature dopaminergic transplants impairs the graft’s ability to improve spontaneous motor behavior in parkinsonian rats | |
| CA3144874C (en) | Composition and method for inhibiting tau protein accumulation, aggregation, and tangle formation | |
| JP6912072B2 (en) | Pharmaceuticals for the prevention or treatment of frontotemporal dementia | |
| WO2020141648A1 (en) | Novel glia-like cells differentiated from somatic cells, preparation method therefor, cocktail composition for preparing same, cell therapeutic agent for preventing or treating neurological disorders, comprising same, and method for preventing and treating neurological disorders by administering same | |
| Parmasad et al. | Genetic and pharmacological reduction of CDK14 mitigates synucleinopathy | |
| Khan | Therapeutic Effects of Transgenic Canine Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells in Canine Spinal Cord Injury | |
| JP6998057B2 (en) | Nerve injury treatment transplant material containing dental pulp cells | |
| CN110755426B (en) | Application of rapamycin and structural analogs thereof in preparing medicines for treating diseases caused by ectopic overexpression of Msi1 gene | |
| CN117500530A (en) | Composition for inhibiting alpha-synuclein and aggregation inhibition method | |
| US10246712B2 (en) | Genetic or pharmacological reduction of PERK enhances cortical- and hippocampus-dependent cognitive function | |
| US20110262387A1 (en) | Methods and materials for reducing or suppressing amyloid deposition | |
| Rousseaux et al. | Genetic and pharmacological reduction of CDK14 mitigates synucleinopathy | |
| KR20230011839A (en) | Composition for inhibiting α-synuclein aggregation and method for inhibiting aggregation | |
| Shoda et al. | Inhibition of hypoxia-inducible factors suppresses subretinal fibrosis |