RU2817377C1 - Method for detecting gbssi gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences - Google Patents
Method for detecting gbssi gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817377C1 RU2817377C1 RU2023131563A RU2023131563A RU2817377C1 RU 2817377 C1 RU2817377 C1 RU 2817377C1 RU 2023131563 A RU2023131563 A RU 2023131563A RU 2023131563 A RU2023131563 A RU 2023131563A RU 2817377 C1 RU2817377 C1 RU 2817377C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- editing
- insdfeature
- seq
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims abstract description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 17
- 108010004047 granule-bound starch synthase I Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 claims abstract description 11
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 12
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 abstract description 11
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 abstract description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 9
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 8
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 8
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 6
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical class [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим редактирование гена GBSSI в геноме твердой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale).The invention relates to the field of biotechnology and plant genetic engineering, namely to genetic markers that detect editing of the GBSSI gene in the genome of durum wheat (Triticum durum) and winter and spring triticale (×Triticosecale).
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Крахмал, содержащийся в эндосперме зерна, играет ключевую роль в определении качества зерна, включая его вкусовые характеристики и пищевую ценность. Мутация генов пути биосинтеза крахмала оказывает сильное влияние на качество и количество крахмала и является важной целью для селекции растений. Ген GBSS один из значимых генов пути биосинтеза крахмала, кодирующий гранулосвязанную синтазу крахмала (GBSS) в эндосперме (Chen J. et al., 2021). Ген GBSS состоит из двух изоформ: GBSSI, который функционирует в основном в запасаемых тканях (таких как эндосперм семян), и GBSSII, который играет роль в тканях растений, не хранящих запасы (например, в листьях), для временного накопления крахмала (P.L. Vrinten and Т. Nakamura, 2000). Введение мутаций, затрагивающих данный ген приводит к улучшению качества крахмала и, как следствие, качества зерна (Perez L. at al., 2019). Так как естественное появление мутаций способных нокаутировать работу гена в природе достаточно редко, для ускорения селекционного процесса необходимо направленное изменение гена GBSSI с помощью систем редактирования генома. Введение мутаций осуществляется с помощью геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas9.Starch, contained in the endosperm of the grain, plays a key role in determining the quality of the grain, including its taste characteristics and nutritional value. Mutation of starch biosynthetic pathway genes has a strong effect on starch quality and quantity and is an important target for plant breeding. The GBSS gene is one of the significant genes in the starch biosynthesis pathway, encoding granule-bound starch synthase (GBSS) in the endosperm (Chen J. et al., 2021). The GBSS gene consists of two isoforms: GBSSI, which functions primarily in storage tissues (such as the endosperm of seeds), and GBSSII, which plays a role in non-storing plant tissues (such as leaves) to temporarily accumulate starch (P.L. Vrinten and T. Nakamura, 2000). The introduction of mutations affecting this gene leads to an improvement in starch quality and, as a consequence, grain quality (Perez L. at al., 2019). Since the natural occurrence of mutations capable of knocking out a gene in nature is quite rare, to speed up the selection process, a targeted change in the GBSSI gene is necessary using genome editing systems. The introduction of mutations is carried out using genomic editing using the CRISPR/Cas9 system.
Редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9 - высокоточный молекулярный метод, способный внести точечный разрыв в необходимое место генома, меченное с помощью специально подобранной гидовой РНК, комплементарной затравки - мишени для Cas9. Впервые система редактирования с помощью CRISPR/Cas9 была использована для редактирования генома растений еще в 2013 году (Wenzhi J. at al., 2013). В ходе развития технологии редактирование гена GBSSI проводилось на таких культурах, как рис (Pérez L. at al., 2019), мягкая пшеница (Zhang S. at al., 2018), маниок (Carmo C.D., 2020), и т.д.Editing using the CRISPR/Cas9 system is a high-precision molecular method that can introduce a point break at the desired location in the genome, labeled with a specially selected guide RNA, a complementary primer - the target for Cas9. The CRISPR/Cas9 editing system was first used to edit plant genomes back in 2013 (Wenzhi J. at al., 2013). During the development of technology, GBSSI gene editing was carried out on crops such as rice (Pérez L. at al., 2019), bread wheat (Zhang S. at al., 2018), cassava (Carmo C.D., 2020), etc. .
После проведения редактирования необходимо подтвердить наличие мутаций в каждом из сайтов редактирования для дальнейшей дифференциации растений на редактированные и нередактированные, во всех вышеперечисленных работах редактирование выявляли с помощью секвенирования следующего поколения (NGS).After editing, it is necessary to confirm the presence of mutations in each of the editing sites to further differentiate plants into edited and unedited; in all of the above works, editing was detected using next generation sequencing (NGS).
Секвенирование следующего поколения (NGS) представляет собой передовую биологическую технологию, используемую для определения последовательности нуклеотидов в геноме с высокой точностью и эффективностью. Подготовительным этапом для проведения секвенирования является подготовка генетического материала, включающая фрагментацию и прикрепление адаптеров, амплификацию образцов и создание кластеров на поверхности чипа или потока. Далее следует этап секвенирования, в процессе которого получают короткие последовательности, называемые "рилами". Риды обрабатываются и выравниваются на референсный геном или собираются в контиги с использованием биоинформатических инструментов.Next generation sequencing (NGS) is an advanced biological technology used to determine the nucleotide sequence of the genome with high accuracy and efficiency. The preparatory step for sequencing is the preparation of genetic material, including fragmentation and attachment of adapters, amplification of samples and creation of clusters on the surface of a chip or stream. Next comes the sequencing step, which produces short sequences called “reels.” Reads are processed and aligned to a reference genome or assembled into contigs using bioinformatics tools.
Секвенирование нового поколения (NGS) представляет собой мощный инструмент для исследования генетической информации, но оно также является трудоемким и дорогостоящим процессом по нескольким факторам. Во-первых, NGS генерирует огромные объемы данных, особенно при анализе целых геномов или больших наборов образцов, что требует значительных вычислительных ресурсов и времени для их обработки и анализа. Во-вторых, секвенирование требует использования дорогостоящего оборудования и химических реагентов, что увеличивает финансовые затраты на проведение исследований. В-третьих, эффективное использование NGS требует высокой квалификации и опыта в обработке данных и биоинформатике, что делает этот процесс трудоемким и зависящим от наличия опытного исполнителя. Наконец, анализ и интерпретация данных, полученных с помощью NGS, также являются сложными и времязатратными процессами.Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for studying genetic information, but it is also labor-intensive and expensive due to several factors. First, NGS generates enormous amounts of data, especially when analyzing entire genomes or large sets of samples, which requires significant computational resources and time to process and analyze. Secondly, sequencing requires the use of expensive equipment and chemical reagents, which increases the financial costs of research. Third, the effective use of NGS requires high skill and experience in data processing and bioinformatics, which makes the process labor intensive and dependent on the availability of an experienced performer. Finally, analysis and interpretation of data obtained using NGS are also complex and time-consuming processes.
Проведение каждой новой модификации представляет собой индивидуальный процесс, который обусловлен необходимостью подбора новых сайтов и гидовых последовательностей для проведения редактирования. В связи с этим каждое новое редактирование требует создания уникальных олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область редактирования и специфичны для данного эксперимента. Олигонуклеотиды, использованные ранее в аналогичных экспериментах, не подходят для выявления проведенного нами редактирования, так как в нашем случае использовались новые сайты редактирования, и их количество также отличалось от предыдущих работ.Carrying out each new modification is an individual process, which is determined by the need to select new sites and guide sequences for editing. In this regard, each new editing requires the creation of unique oligonucleotide primers that flank the editing region and are specific to a given experiment. Oligonucleotides previously used in similar experiments are not suitable for detecting the editing we carried out, since in our case new editing sites were used, and their number also differed from previous works.
Таким образом, существует потребность более простом, способе обнаружения изменений нуклеотидных последовательностей целевых генов, в частности гена GBSSI, возникающих в геноме в результате редактирования с помощью системы CRJSPR/Cas9. Настоящее изобретение предлагает такой способ.Thus, there is a need for a simpler method for detecting changes in the nucleotide sequences of target genes, in particular the GBSSI gene, that occur in the genome as a result of editing using the CRJSPR/Cas9 system. The present invention provides such a method.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Задачей изобретения является разработка способа выявления событий редактирования гена GBSSI у зерновых культур, который был бы более простым в осуществлении и менее трудоемким и финансово затратным.The objective of the invention is to develop a method for detecting GBSSI gene editing events in cereal crops, which would be simpler to implement and less labor-intensive and financially expensive.
Для решения этой задачи авторы предлагают использовать способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза.To solve this problem, the authors propose to use a method based on polymerase chain reaction (PCR) with oligonucleotide primers flanking the site of the intended editing, followed by detection of PCR results using capillary electrophoresis.
Заявленный способ предусматривает использование набора олигонуклеотидных праймеров (олигонуклеотидов), которые фланкируют трии сайта редактирования гена GBSSI (Фигура 1). Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже в Таблице 1 и в Перечне последовательностей.The claimed method involves the use of a set of oligonucleotide primers (oligonucleotides) that flank the three editing sites of the GBSSI gene (Figure 1). The nucleotide sequences of these primers are given below in Table 1 and in the Sequence Listing.
Способ осуществляется путем проведения полимеразной цепной реакции с представленными в Таблице 1 олигонуклеотидами, визуализацией продукта с помощью капиллярного электрофореза и дальнейшем сравнении размера фрагментов контрольного образца (растение, которое не подвергалось редактированию) и редактированных растений. Благодаря точному определению длины амплифицированных фрагментов на капиллярном электрофорезе, сдвиг - разница в размере контрольного и исследуемых образцов показывает наличие редактирования у исследуемых растений и размер инсерций и делеций.The method is carried out by performing a polymerase chain reaction with the oligonucleotides presented in Table 1, visualizing the product using capillary electrophoresis and further comparing the size of the fragments of the control sample (a plant that was not edited) and edited plants. Thanks to the precise determination of the length of amplified fragments on capillary electrophoresis, the shift - the difference in the size of the control and test samples indicates the presence of editing in the plants under study and the size of insertions and deletions.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фигура 1. Расположение сайтов редактирования и олигонуклеотидов, используемых для выявления редактирования в этих сайтах на гене GBSSIaFigure 1. Location of editing sites and oligonucleotides used to detect editing at these sites on the GBSSIa gene
Фигура 2. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×1 гена GBSSIaFigure 2. Phorograms of triticale samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 to identify genetic modifications in the W×1 editing site of the GBSSIa gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) pherogram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping the reads of the sample under study to the reference unmodified sequence - no editing detected
Фигура 3. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×2 гена GBSSIaFigure 3. Phoregrams of triticale samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 to identify genetic modifications in the W×2 editing site of the GBSSIa gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) pherogram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping the reads of the sample under study to the reference unmodified sequence - no editing detected
Фигура 4. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×3 гена GBSSIaFigure 4. Phorograms of triticale samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6 to identify genetic modifications in the W×3 editing site of the GBSSIa gene
а) форезграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) phoresgram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) pherogram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping the reads of the sample under study to the reference unmodified sequence - no editing detected
Фигура 5. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×1 гена GBSSIaFigure 5. Phorograms of durum wheat samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 to identify genetic modifications in the W×1 editing site of the GBSSIa gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) pherogram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping the reads of the sample under study to the reference unmodified sequence - no editing detected
Фигура 6. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×2 гена GBSSIaFigure 6. Phorograms of durum wheat samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 to identify genetic modifications in the W×2 editing site of the GBSSIa gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) pherogram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping the reads of the sample under study to the reference unmodified sequence - no editing detected
Фигура 7. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×3 гена GBSSIaFigure 7. Phorograms of durum wheat samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6 to identify genetic modifications in the W×3 editing site of the GBSSIa gene
а) форезграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) phoresgram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) pherogram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping the reads of the sample under study to the reference unmodified sequence - no editing detected
Осуществление изобретения (Примеры)Carrying out the invention (Examples)
Настоящее изобретение было валидировано на растениях являющихся аллополиплоидами, а именно яровой и озимой тритикале и твердой пшеницы, имеющих генотип с различающимися субгеномами (ABR в случае тритикале и АВ в случае твердой пшеницы).The present invention was validated on plants that are allopolyploids, namely spring and winter triticale and durum wheat, having a genotype with different subgenomes (ABR in the case of triticale and AB in the case of durum wheat).
Пример 1Example 1
На первом этапе проводилось выделение ДНК из 78 растений-регенерантов озимой и яровой тритикале прошедших редактирование гена GBSSIa. Выделение проводили из сухих листьев модифицированным СТАВ-методом (Springer et al., 2010) модифицированным для зерновых культур. Для дальнейшей постановки ПЦР олигонуклеотиды использовались в следующих комбинациях: SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6.At the first stage, DNA was isolated from 78 regenerated winter and spring triticale plants that had undergone editing of the GBSSIa gene. Isolation was carried out from dry leaves using a modified CTAB method (Springer et al., 2010) modified for cereal crops. For further PCR, oligonucleotides were used in the following combinations: SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6.
ПЦР-амплификацию проводили по единому режиму для всех пар олигонуклеотидов (95°С - 3 мин; 95°С - 20 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 20 сек -35 циклов; 72°С - 10 мин), в стандартной ПЦР-смеси (Mg2+ 2.5 мМ, dNTP 0.25 мМ) с добавлением 1 мкл ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. При постановке реакций в реакционную смесь так же добавляли 0.5 мкл ДМСО 100% для лучшей амплификации GC-богатых регионов. Продукты амплификации с ДМСО перед капиллярным форезом разводили дистиллированной водой в 20 раз с целью снижения концентрации солей для лучшего прохождения электрофореза.PCR amplification was carried out according to the same regime for all pairs of oligonucleotides (95°C - 3 min; 95°C - 20 sec, 60°C - 30 sec, 72°C - 20 sec - 35 cycles; 72°C - 10 min) , in a standard PCR mixture (Mg2+ 2.5 mM, dNTP 0.25 mM) with the addition of 1 μl of DNA with a concentration of 5-10 ng/μl. When setting up reactions, 0.5 μl of DMSO 100% was also added to the reaction mixture for better amplification of GC-rich regions. Before capillary phoresis, amplification products with DMSO were diluted with distilled water 20 times in order to reduce the salt concentration for better electrophoresis.
Продукты амплификации визуализировали методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора Нанофор 05 в присутствии маркера молекулярного веса. Капиллярный электрофорез на генетическом анализаторе проводится в соответствии с руководством пользователя, предоставляемым его производителем (Синтол, Россия). Параметры электрофореза зависели от длины капилляров и типа полимера, рекомендуемые параметры инжекции 1800 В, 5 секунд. Продукты амлификации, полученные в постановке ПЦР с олигонуклеотидами 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4; 3) SEQ ID NO: 5-6 визуализировали на фрагментном анализе одновременно.Amplification products were visualized by capillary electrophoresis using a Nanofor 05 genetic analyzer in the presence of a molecular weight marker. Capillary electrophoresis on a genetic analyzer is carried out in accordance with the user manual provided by its manufacturer (Syntol, Russia). Electrophoresis parameters depended on the length of the capillaries and the type of polymer; the recommended injection parameters were 1800 V, 5 seconds. Amplification products obtained by PCR with oligonucleotides 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4; 3) SEQ ID NO: 5-6 were visualized on fragment analysis simultaneously.
Результаты постановок - получившиеся профили образцов, проходившие редактирование сравнивали с профилем контрольного образца, не проходившего редактирование и за счет изменения размера фрагментов выявляли редактирование и его тип.The results of the productions - the resulting profiles of samples that underwent editing were compared with the profile of a control sample that did not undergo editing, and by changing the size of the fragments, editing and its type were revealed.
Далее все образцы были отправлены на NGS. Библиотеки для NGS были подготовлены по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq.Next, all samples were sent for NGS. Libraries for NGS were prepared using the 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation protocol (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Sequencing was performed on an Illumina MiSeq instrument.
Для каждого секвенируемого образца длина прочтения, качество и количество ридов в полученных fastq-файлах оценивались с помощью программы FastQC 0.11.9. Первичная обработка ридов осуществлялась с помощью программы Trimmomatic-0.39. После тримминга fastq файлы конвертировались в fasta файлы, которые анализировались в программе Unipro UGENE 33.0.For each sequenced sample, the read length, quality and number of reads in the resulting fastq files were assessed using the FastQC 0.11.9 program. Primary processing of reads was carried out using the Trimmomatic-0.39 program. After trimming, the fastq files were converted into fasta files, which were analyzed in the Unipro UGENE 33.0 program.
Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев (Фигура 2-4), что демонстрирует высокую эффективность и надежность метода в выявлении генетических изменений, данные результаты также подчеркивают перспективность и потенциал данного метода и его дальнейшего использования.The results of fragment analysis coincided with the results of NGS in 100% of cases (Figure 2-4), which demonstrates the high efficiency and reliability of the method in identifying genetic changes; these results also highlight the promise and potential of this method and its further use.
Пример 2Example 2
Данный набор олигонуклеотидов также был апробирован на 68 растениях твердой пшеницы, где продемонстрировал высокую эффективность и точность при выявлении редактирования. Выделение ДНК, ПЦР-амплификацию, постановку фрагментного анализа и NGS проводили аналогично Примеру 1. Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев, чем подтверждают возможность его использования для быстрого обнаружения генетических модификаций в твердой пшенице и, вероятно, в других ценных сельскохозяйственных культурах (Фигура 5-7).This set of oligonucleotides was also tested on 68 durum wheat plants, where it demonstrated high efficiency and accuracy in detecting editing. DNA isolation, PCR amplification, fragment analysis and NGS were carried out similarly to Example 1. The obtained fragment analysis results coincided with the NGS results in 100% of cases, which confirms the possibility of its use for the rapid detection of genetic modifications in durum wheat and, probably, in other valuable crops (Figure 5-7).
Финансирование работ по созданию настоящего изобретения проводилось из средств Соглашения №075-15-2019-1667 от «31» октября 2019 г. о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня «Курчатовский геномный центр» в рамках реализации федерального проекта «Развитие научной и научно-производственной кооперации» национального проекта «Наука».Funding for the creation of the present invention was carried out from the funds of Agreement No. 075-15-2019-1667 dated October 31, 2019 on the provision of grants from the federal budget in the form of subsidies in accordance with paragraph 4 of Article 78.1 of the Budget Code of the Russian Federation for the provision of state support creation and development of a world-class genomic research center “Kurchatov Genome Center” as part of the implementation of the federal project “Development of scientific and scientific-industrial cooperation” of the national project “Science”.
Список литературыBibliography
Carmo C.D. (15 April 2020 г.). Identification and validation of mutation points associated with waxy phenotype in cassava. BMC Plant Biology, p. 164.Carmo C.D. (April 15, 2020). Identification and validation of mutation points associated with waxy phenotype in cassava. BMC Plant Biology, p. 164.
Chen J. et al. (April 2021 г.). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.Chen J. et al. (April 2021). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.
P.L. Vrinten and T. Nakamura. (January 2000 г.). Wheat Granule-Bound Starch Synthase I and II Are Encoded by Separate Genes That Are Expressed in Different Tissues. Plant Physiology, p. 255-264.P.L. Vrinten and T. Nakamura. (January 2000). Wheat Granule-Bound Starch Synthase I and II Are Encoded by Separate Genes That Are Expressed in Different Tissues. Plant Physiology, p. 255-264.
Pérez L. at al. (4 February 2019 г. ). CRISPR/Cas9 mutations in the rice Waxy/GBSSI gene induce allele-specific and zygosity-dependent feedback effects on endosperm starch biosynthesis. Plant Cell Reports, p. 417-433.Perez L. at al. (4 February 2019). CRISPR/Cas9 mutations in the rice Waxy/GBSSI gene induce allele-specific and zygosity-dependent feedback effects on endosperm starch biosynthesis. Plant Cell Reports, p. 417-433.
Springer et al. (November 2010 г.). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and СТАВ. Cold Spring Harbor Protocols.Springer et al. (November 2010). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and STAB. Cold Spring Harbor Protocols.
Wenzhi J. at al. (1 November 2013 г.). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, p. 188.Wenzhi J. at al. (November 1, 2013). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, p. 188.
Zhang S. at al. (26 November 2018 г.). Targeted mutagenesis using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas9 system in common wheat. BMC Plant Biology, p. 302.Zhang S. at al. (November 26, 2018). Targeted mutagenesis using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas9 system in common wheat. BMC Plant Biology, p. 302.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="List
последовательностей GBSSIa-1.xml" softwareName="WIPO Sequence" sequences GBSSIa-1.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>GBSSIa-1</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>GBSSIa-1</ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate> <FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>GBSSIa-1</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>GBSSIa-1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБНУ ВНИИСБ</ApplicantName> <ApplicantName languageCode="ru">FGBNU VNIISS</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural <ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural
Biotechnology</ApplicantNameLatin>Biotechnology</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ <InventionTitle languageCode="en">METHOD OF EVENT DETECTION
РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА GBSSI У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА EDITING THE GBSSI GENE IN CEREAL CROPS USING A KIT
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ</InventionTitle>OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1"> <INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggcggctctggtcacg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>atggcggctctggtcacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcttgctccagggcgc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gtcttgctccagggcgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3"> <INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaaggcgctgaacaaggagg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gaaggcgctgaacaaggagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aacttcttcttcccggtgcc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>aacttcttcttcccggtgcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5"> <INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctggcctgctacctcaagag</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ctggcctgctacctcaagag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagttgatcttgcgcccctc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cagttgatcttgcgcccctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817377C1 true RU2817377C1 (en) | 2024-04-15 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2528748C1 (en) * | 2013-01-29 | 2014-09-20 | Рамиль Ришадович Вафин | METHOD OF CARRYING OUT PCR AND PCR-RFLP FOR IDENTIFICATION OF ALLELIC VERSIONS OF Waxy-GENES OF WHEAT |
| WO2017192095A1 (en) * | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Lyckeby Starch Ab | Amylopectin potato starch with improved stability against retrogradation and improved freeze and thaw stability |
| RU2668819C2 (en) * | 2013-09-04 | 2018-10-02 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2528748C1 (en) * | 2013-01-29 | 2014-09-20 | Рамиль Ришадович Вафин | METHOD OF CARRYING OUT PCR AND PCR-RFLP FOR IDENTIFICATION OF ALLELIC VERSIONS OF Waxy-GENES OF WHEAT |
| RU2668819C2 (en) * | 2013-09-04 | 2018-10-02 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion |
| WO2017192095A1 (en) * | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Lyckeby Starch Ab | Amylopectin potato starch with improved stability against retrogradation and improved freeze and thaw stability |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Самарина М. А. Метод подтверждения редактирования растений картофеля с использованием капиллярного электрофореза / М. А. Самарина, А. В. Архипов М. Г. Дивашук // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии: Сборник тезисов докладов XXII Всероссийской международной конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева, Москва, 07-09 декабря 2022 года. - Москва: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии", 2022, стр. 70-71. ALI N. et al., GENETIC VARIATION AT LOCI CONTROLLING QUALITY TRAITS IN SPRING WHEAT, Pak. J. Agri. Sci., 2013, Vol. 50 (4), pp. 637-647. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumar et al. | SNP discovery through next-generation sequencing and its applications | |
| Morgil et al. | Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in plant genetics and breeding | |
| Bentolila et al. | Comprehensive high-resolution analysis of the role of an Arabidopsis gene family in RNA editing | |
| Yang et al. | Target SSR-Seq: a novel SSR genotyping technology associate with perfect SSRs in genetic analysis of cucumber varieties | |
| CN106048009B (en) | Label joint for ultralow frequency gene mutation detection and application thereof | |
| Xue et al. | Exploiting genome variation to improve next-generation sequencing data analysis and genome editing efficiency in Populus tremula× alba 717-1B4 | |
| EP1546345B1 (en) | Genome partitioning | |
| CN110628880B (en) | Method for detecting gene variation by synchronously using messenger RNA and genome DNA template | |
| CN110628890B (en) | Sequencing quality control standard product and application and product thereof | |
| CN113564266B (en) | SNP typing genetic marker combination, detection kit and application | |
| Pereira et al. | Patterns of DNA methylation changes in elite Eucalyptus clones across contrasting environments | |
| RU2817377C1 (en) | Method for detecting gbssi gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences | |
| Palan et al. | TILLING in the era of precise genome editing | |
| CN105695581B (en) | Medium-flux gene expression analysis method based on second-generation test platform | |
| CN108642209B (en) | Wheat plant thousand grain weight judgment marker and application thereof | |
| Li et al. | Development of a target capture sequencing SNP genotyping platform for genetic analysis and genomic breeding in rapeseed | |
| Miyamoto et al. | Nanopore sequencing reveals a structural alteration of mirror‐image duplicated genes in a genome‐editing mouse line | |
| Llaca | Sequencing technologies and their use in plant biotechnology and breeding | |
| CN114790484A (en) | MNP (MNP protein) marker site of xanthomonas oryzae, primer composition, kit and application of MNP marker site | |
| Dida | Molecular Markers in Breeding of Crops: Recent Progress and Advancements | |
| CN108642199B (en) | SNP (Single nucleotide polymorphism) marker related to growth of millet flag leaves as well as detection primer and application thereof | |
| CN108707684B (en) | SNP (Single nucleotide polymorphism) marker related to millet flag leaf length and detection primer and application thereof | |
| Liang et al. | Review on the evolution in DNA-based techniques for molecular characterization and authentication of GMOs | |
| Dalla Costa et al. | Integrated approach for the molecular characterization of edited plants obtained via Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer | |
| Stirzaker et al. | Evaluation and measurement of epigenetic modifications in population-based studies |