RU2815784C1 - Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов - Google Patents
Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815784C1 RU2815784C1 RU2023121878A RU2023121878A RU2815784C1 RU 2815784 C1 RU2815784 C1 RU 2815784C1 RU 2023121878 A RU2023121878 A RU 2023121878A RU 2023121878 A RU2023121878 A RU 2023121878A RU 2815784 C1 RU2815784 C1 RU 2815784C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunosorbent
- chlamydial
- polycaprolactone
- producing
- immunoglobulins
- Prior art date
Links
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 title claims abstract description 16
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 title claims abstract description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 19
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- JCEZOHLWDIONSP-UHFFFAOYSA-N 3-[2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]ethoxy]propan-1-amine Chemical compound NCCCOCCOCCOCCCN JCEZOHLWDIONSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 201000000902 chlamydia Diseases 0.000 description 1
- 208000012538 chlamydia trachomatis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004370 retrospective diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения иммуносорбента. Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов предусматривает получение полимерных микрочастиц из гранул поликапролактона путем их растворения в хлороформе с последующей полимеризацией в спирте, прикрепления к ним линкера с последующим его связыванием с хламидийным антигеном посредством глутарового альдегида. Вышеописанный способ позволяет получить иммуносорбент с высокой активностью. 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарии, биотехнологии и микробиологии, в частности - к способам получения иммуносорбентов, и может найти применение в создании средств диагностики хламидийной инфекции.
Разработка специфичных и недорогих средств диагностики хламидиоза животных является перспективным направлением научных изысканий.
Согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции животных», утвержденным заместителем руководителя Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ от 30 июня 1999 г. диагноз на хламидийные инфекции считают окончательным при применении любого прямого метода диагностики, который выявляет: хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале.
На данный момент имеются разработанные диагностические тест-системы направленные на выявление генетического материала хламидий методом ПНР и выявления антигенов хламидий методом иммунной флюоресценции (Патент RU 2 042 360, МПК A61K 39/118, G01N 33/53, 06.07.1992) в патологических материалах. Однако для постановки этих реакций, лаборатории должны быть оснащены специализированными помещениями, оборудованием и обученными специалистами.
Недорогими по себестоимости и технологичными методами, широко внедренными в ветеринарную практику, позволяющими диагностировать хламидиоз у животных, является выявление антигенов хламидий в патологическом материале методами ИФА и ИХА для постановки которых необходимы очищенные специфические хламидийные иммуноглобулины.
Современные распространенные и коммерциализированные методы выделения высокоочищенных иммуноглобулинов являются дорогостоящими и требуют специализированного современного профессионального лабораторного оборудования в оснащении лабораторий. Однако известны доказанные научные концепции применяющиеся как для очистки сывороток крови от неспецифических компонентов, так и выделения иммуноглобулинов специфичных к различным инфекциям посредством их адсорбции на различных иммуносорбентах, производство и применение которых не требует дорогостоящих оборудования и химических реактивов.
Базовым требованиям к иммуносорбентам относят их стабильность, прочность, инертность к неспецифическим биопрепаратам, сорбционная емкость при иммобилизации лигандов. Наиболее стабильное и прочное присоединение лигандов обеспечивается актривацией поверхности носителя сорбента линкером (Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов. / В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь [и др.] // ЖМЭИ, N 12, 1989, с. 100-104).
Известен способ получения иммуносорбента в качестве носителя которого выступает целлюлоза ковалентно связанная с белковым лигандом. Недостатком данного иммуносорбента является органический носитель, который непрочен и подвержен деструкции при воздействии разных микроорганизмов, что в свою очередь негативно влияет на условия и срок его хранения (Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. / К.Л. Шаханина [и др.] // Ж. Вопросы медицинской химии, N 6, 1976. - С.127-136).
Иммуносорбент, носителем которого является полисахарид целлюлозы с иммобилизированным на его поверхности антигеном, также нестабилен при хранении подвержен воздействию микроорганизмов (Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. / К.Л. Шаханина [и др.] // Ж. Вопросы медицинской химии, N 6, 1976. - С.127-136).
Известен способ получения иммуносорбента сущность которого заключается в активации аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом с последующим ковалентным связыванием антигена (а.с. СССР N 1517545, МПК G01N 33/53, 15.12.93, Бюл. N 45-46).
Недостатком данного способа получения иммуносорбента является то, что носитель сорбента аминопропилсилохром является дефицитным.
Известен способ получения иммуноглобулина для специфической терапии хламидиоза у плотоядных животных (Патент RU 2259849, МПК A61K 39/395, Опубл.: 10.09.2005 Бюл. №25). Сущность данного способа сводится к концентрации общей белковой фракции сывороток крови иммунизированных животных солями аммония. Недостатком данного способа является низкая специфичность полученных иммуноглобулинов.
Целью изобретения является создание способа получения иммуносорбента, представляющего из себя поликапролактоновые микрочастицы с фиксированным на их поверхности хламидийным антигеном, позволяющие удешевить технологическую цепочку выделения очищенных хламидийных иммуноглобулинов и минимизировать материальные, трудовые и технические затраты на осуществление этого процесса.
Способ осуществляют следующим образом.
Этап 1 - получение микрочастиц поликапролактона.
Для получения 7 см3 твердого осадка полимерных микрочастиц (носитель иммуносорбента) 1 г поликапролактона растворяют в 15 см3 хлороформа.
В получившийся раствор постепенно добавляют 600 см3 технического этилового спирта (ГОСТ 51999-2002), после чего раствор приобретает белый цвет и становится мутным.
Получившийся раствор помещают в холодильную камеру (температура от 4 до 6°С) на 24 часа, по истечению которых на дне флакона выпадает однородный осадок белого цвета (поликапролактоновые микрочастицы). Осадок осаждают центрифугированием при скорости 1500 об/мин в течение 1 мин, супернатант сливают и измеряют объем осадка.
Осажденные микрочастицы ресуспендируют техническим этиловым спиртом (ГОСТ 51999-2002) и хранят в таком виде в стеклянных флаконах при температуре от 4 до 25°С до изготовления иммуносорбента.
Этап 2 - Фиксация хламидийного антигена на поверхности микрочастиц поликапролактона.
Для получения 1 см3 иммуносорбента берут 1 см3 твердого осадка поликапролактонновых микрочастиц полученных на этапе 1, предварительно двукратно отмытых от технического этилового спирта (ГОСТ 51999-2002) дистиллированной водой (ДВ) путем их осаждения на дне пробирки центрифугированием при скорости 1500 об/мин в течение 1 мин и последующим ресуспендированием ДВ.
Далее на поверхность полимерных микрочастиц посредством аминолиза присоединяют линкер. Для этого получившуюся при отмывке дисперсную систему вода/поликапролактон центрифугируют при скорости 1500 об/мин в течение 1 мин, надосадочную жидкость удаляют, а получившийся осадок микрочастиц резуспензируют 10% раствором 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина в смеси изопропиловый спирт/вода в соотношении 1:1. Полученную дисперсную систему выдерживают при температуре плюс 37°С в течение 30 мин. По истечении этого срока проводят отмывку полимерных частиц с иммобилизированными на их поверхности линкерами от не связавшихся молекул диамина по следующей схеме. 1 раз раствором изопропилового спирта в воде в соотношении 1:1 и два раза дистиллированной водой.
Далее полученный осадок модифицированного поликапролактона обрабатывали 2% раствором глутарового альдегида в течение 3 ч при температуре плюс 24°С. После отмывки микрочастиц дистиллированной водой от несвязавшихся молекул глутарового альдегида осадок выдерживают в растворе антигена, полученного по методу, описанному в патенте RU 2485972 (МПК A61K 39/00, Опубл.: 27.06.2013 Бюл. №18) «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных», в разведении 1:5 в 0,6 молярном карбонатно-бикарбонатном буфере со значением рН=9,6 в течение одного часа при температуре плюс 24°С и 12 ч при температуре плюс 4°С. Полученный иммуносорбент три раза отмывают 0,01 молярным фосфатно-буферным раствором (ФБР-Т) от несвязавшегося хламидийного антигена.
Специфическую емкость (активность) полученного иммуносорбента определяют в реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого в две пробирки наливают по 1 см3 гипериммунной положительной сыворотки реагирующих в ИФА в титрах от 1:3200 до 1:6400. В первую пробирку вносят 0,1 см3 твердого осадка иммуносорбента (0,2 см3 дисперсной системы ФБР-Т:иммуносорбент в соотношении 1:1). Во вторую пробирку (контроль) вносят 0,1 см твердого осадка микрочастиц (не связанных с антигеном) полученных на этапе 1 (0,2 см3 дисперсной системы ФБР-Т:поликапролактоновые микрочастицы в соотношении 1:1). После чего две пробирки помещают в термостат (температура плюс 37°С) на 1 ч. Далее иммуносорбент и микрочастицы поликапролактона по отдельности три раза отмывают ФБР-Т от сыворотки. После отмывки иммуносорбент и микрочастицы осаждают на дне пробирки, удаляют ФБР-Т и вносят по 1 см3 рабочего разведения иммунопероксидазного коньюгата для выявления антивидовых иммуноглобулинов. Пробирки помещают в термостат (с температурой плюс 37°С) на 40 мин. После инкубации иммуносорбент и микрочастицы 3 раза отмывают от коньюгата и удаляют буферный раствор. Далее в пробирки вносят субстрат-индикаторный раствор. После окрашивания раствора в желтый цвет реакцию останавливают 10% раствором серной кислоты. После осаждения иммуносорбента и микрочастиц из надосадочной жидкости двух пробирок берут по 0,15 см3 раствора и вносят в лунки полистеролового планшета. Учет результатов проводят на регистрирующем устройстве. Исследуемую пробу (ИП) считают положительной, если частное показателя оптического преломления (ОП) опытного образца (пробирка с иммуносорбентом) по отношению к ОП контроля равна или больше 1,2.
Хранят иммуносорбент в 0,01 молярном фосфатно-буферном растворе при температуре плюс 4°С или в глицерине, в соотношении глицерин: иммуносорбент - 1:1, при температуре минус 20°С.
Активность иммуносорбента, изученная в ИФА иллюстрируется следующим примером.
В таблице 1 представлены результаты оценки активности полученного иммуносорбента (3 серии опытов).
Реакцию иммуноферментного анализа ставили по вышеописанной методике определения специфической емкости (активности) полученного иммуносорбента. Регистрацию результатов ИФА проводили с помощью микропланшетного фотометра Bio-Rad 680, при длине волны 490 нм. Результат считали положительным если коэффициент специфичности был равен или выше 1,2.
Как видно из таблицы 1, коэффициент специфичности (К. сп.) в трех сериях опытов был выше 1,2 и варьировался в пределах от 6,3 до 7,1. Среднее значение К. сп. составило 6,8. Полученные данные свидетельствуют о высокой активности полученных иммуносорбентов.
Таким образом, разработанный способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона обеспечивает получаемому иммуносорбенту способность фиксировать на своей поверхности специфические хламидийные иммуноглобулины из иммунных сывороток крови животных. Способ отличается простотой и воспроизводимостью.
Claims (1)
- Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов, предусматривающий получение полимерных микрочастиц из гранул поликапролактона путем их растворения в хлороформе с последующей полимеризацией в спирте, прикрепления к ним линкера с последующим его связыванием с хламидийным антигеном посредством глутарового альдегида.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815784C1 true RU2815784C1 (ru) | 2024-03-21 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2156620C2 (ru) * | 1998-06-02 | 2000-09-27 | Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности | Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных |
| RU2488117C2 (ru) * | 2011-10-04 | 2013-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета |
| CN106404754A (zh) * | 2016-06-30 | 2017-02-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 一种肺炎衣原体IgM化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2156620C2 (ru) * | 1998-06-02 | 2000-09-27 | Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности | Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных |
| RU2488117C2 (ru) * | 2011-10-04 | 2013-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета |
| CN106404754A (zh) * | 2016-06-30 | 2017-02-15 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 一种肺炎衣原体IgM化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6742978B2 (ja) | ラテラルフローおよび関連する免疫アッセイにおけるシグナル増幅 | |
| US4332783A (en) | Process for immunologic determination tests | |
| US20100209946A1 (en) | Uses of water-dispersible silica nanoparticles for attaching biomolecules | |
| JP6348151B2 (ja) | 抗ａ抗体または抗ｂ抗体に結合するクロマトグラフィー媒体の品質を評価する方法 | |
| AU2017321642B2 (en) | Antibody measurement method using antigen-carrying insoluble carrier particles on which antigen is immobilized by different methods, and reagent for antibody measurement | |
| RU2815784C1 (ru) | Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов | |
| CN101680894B (zh) | 检测待测物的试剂及其方法 | |
| CN109001453B (zh) | 一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒 | |
| EP1700128B1 (fr) | Methode de diagnostic serologique et determination de statut vaccinal comprenant differents controles | |
| CN1318152A (zh) | 沙门氏菌抗原制剂和测定沙门氏菌抗体的试剂盒 | |
| RU2380708C1 (ru) | Способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации | |
| EP0134868A1 (en) | Unicellular organisms activated by glutaraldehyde as solid carriers for sensitizing agents and uses of sensitized unicellular organisms | |
| RU2625031C1 (ru) | Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии животных и контроля напряженности поствакцинального иммунитета | |
| RU2138813C1 (ru) | Способ получения иммуносорбента (варианты) | |
| RU2798124C9 (ru) | Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума | |
| KR101311736B1 (ko) | 샌드위치 면역분석 바이오칩 및 이를 사용한 면역분석법 | |
| RU2798124C1 (ru) | Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума | |
| RU2754465C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при клостридиозах животных | |
| JP3681873B2 (ja) | 物質の測定方法 | |
| US20080032315A1 (en) | Method and Kit for Determining the Immunisation Status of a Person | |
| RU2737776C1 (ru) | Тест-комплект для выявления холерного токсина в среде культивирования | |
| RU2614960C1 (ru) | Способ получения бифункционального аффинного сорбента для хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих | |
| Spiridonov et al. | Results of studies on the development of an immuno-enzymed test system for diagnosing infectious enterotoxemia in animals | |
| JP2001264333A (ja) | インフルエンザウイルスの型の同定・識別方法 | |
| Simalai | EVALUATION OF IMMOBILIZATION PROTOCOLS OF A FLUORESCENCE-BASED IMMUNOSENSOR USED TO DETECT INFECTIOUS DISEASES |