RU2814189C1 - Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3 и фармацевтическая композиция на его основе. - Google Patents
Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3 и фармацевтическая композиция на его основе. Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814189C1 RU2814189C1 RU2023115874A RU2023115874A RU2814189C1 RU 2814189 C1 RU2814189 C1 RU 2814189C1 RU 2023115874 A RU2023115874 A RU 2023115874A RU 2023115874 A RU2023115874 A RU 2023115874A RU 2814189 C1 RU2814189 C1 RU 2814189C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- influenza
- subtype
- expression vector
- viruses
- human adenovirus
- Prior art date
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 title claims abstract description 48
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241000702437 Parvovirus H3 Species 0.000 title abstract 5
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 70
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 229940072172 tetracycline antibiotic Drugs 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 abstract description 14
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 75
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 45
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 36
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 27
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 25
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 17
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 15
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 13
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 13
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 13
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 101710082439 Hemagglutinin A Proteins 0.000 description 1
- 241000134304 Influenza A virus H3N2 Species 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940033324 influenza A vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 102200163550 rs63750580 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Описан экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа Н3. Также описана фармацевтическая композиция для защиты от вирусов гриппа А субтипа Н3, содержащая в эффективном количестве указанный экспрессионный вектор. Также описано применение фармацевтической композиции для защиты субъекта от вирусов гриппа А субтипа Н3 и в составе противогриппозной векторной вакцины. Технический результат заключается в получении экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа с делецией Е1 и Е3 областей, несущего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А антигенно далекого субтипа H3, способного обеспечить индукцию кросс-протективного иммунитета против инфекции, вызванной вирусами гриппа А субтипа H3 патогенными для человека, без эффекта антигенного импринтинга при введении субъекту в составе фармацевтической композиции или противогриппозной вакцины. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл,, 7 пр.
Description
Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3, и фармацевтическая композиция на его основе.
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии, медицины. Оно касается экспрессионного вектора на основе аденовируса человека с защитным действием широкого спектра (кросс-протективного) в отношении вирусов гриппа А субтипа H3, а также фармацевтической композиции на его основе. Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства противогриппозных вакцин.
Предшествующий уровень развития
Грипп - высококонтагиозное инфекционное заболевание, широко распространенное по всему миру. В структуре заболеваемости гриппом значительную долю составляют штаммы вируса гриппа А субтипа H3. Важнейшей мерой защиты от гриппозной инфекции и ограничения ее распространения является вакцинопрофилактика с помощью трехвалентных или четырехвалентных вакцин, в состав которых обязательно входит антигенный компонент, полученный из ожидаемого к циркуляции в предстоящем сезоне штамма вируса гриппа А субтипа H3.
Эффективность существующих сезонных вакцин находится в прямой зависимости от степени соответствия антигенной структуры гемагглютининов (HA) вируса гриппа, входящих в состав вакцины, и штаммов гриппа, циркулирующих среди населения в текущий эпидемический сезон. При этом иммунодоминантные эпитопы гемагглютинина вируса гриппа расположены на его глобулярной части и антитела к ним способны нейтрализовать вирус, что является основой защитного иммунного ответа после вакцинации. Высокая антигенная вариабельность (т.н. «антигенный дрейф») иммунодоминантных эпитопов гемагглютинина вызывает необходимость в ежегодном обновлении состава вакцин в отношении штаммов вируса гриппа А. Однако даже обновленные вакцины не всегда оказываются эффективными в очередном эпидемиологическом сезоне по причине несоответствия ожидаемого и пришедшего штамма вируса гриппа. Антигенные эпитопы широкой специфичности, которые вызывают образование перекрестных антител внутри субтипа H3, не являются иммунодоминантными и поэтому при иммунизации нативным гемагглютинином в составе инактивированных вакцин к ним вырабатывается незначительное количество антител, которое не позволяет получить защитный иммунный ответ широкого спектра действия. Проблема широко рассматривается в научной литературе (Lee J., Boutz D.R., et all. Molecular-level analysis of the serum antibody repertoire in young adults before and after seasonal influenza vaccination. // Nat Med. 2016 Dec;22(12):1456-1464; Laursen N.S., Friesen R.H.E., Zhu X., et all. Universal protection against influenza infection by a multidomain antibody to influenza hemagglutinin. Science. 2018 Nov 2;362(6414):598-602).
Кроме вариабельности гемагглютинина вируса гриппа, на защитную эффективность противогриппозных вакцин может оказать феномен «антигенного импринтинга». Предполагают, что основные механизмы этого феномена реализуются за счет ранее выработанных антител в ответ на предыдущие вакцинации или переболевания гриппом (Zarnitsyna V.I., et all. Multi-epitope models explain how pre-existing antibodies affect the generation of broadly protective responses to influenza. PLoS Pathog. 2016 Jun 23;12(6):e1005692). Феномен антигенного импринтинга может снизить эффективность вакцинации и вызвать нежелательные явления, поэтому его потенциальное возникновение следует учитывать на этапе разработки антигенных компонентов. В ряде публикаций отмечено, что феномен не наблюдается при последовательном заражении животных антигеннодалекими штаммами вируса гриппа (Gulati U., Kumari K., Wu W. et al. Amount and avidity of serum antibodies against native glycoproteins and denatured virus after repeated influenza whole-virus vaccination // Vaccine. -005. - Vol. 23. - P. 1414-1425; Kim J.H., Skountzou I., Compans R. et al. // Original antigenic sin responses to influenza viruses // J. Immunol. - 2009. - Vol. 183. - P. 3294-3301).
Следовательно, основной нерешенной научно-технической проблемой при разработке вакцин является получение высокоиммуногенных антигенных компонентов, индуцирующих иммунитет широкого спектра действия против вирусов гриппа А, в частности внутри субтипа H3. Для обеспечения эффективной профилактики сезонного гриппа вакцины должны обеспечивать перекрестную защиту не только от циркулирующих в настоящее время штаммов вируса гриппа А, но и от тех, которые могут возникнуть в будущем в результате мутаций вируса, а также не должны вызывать антигенный импринтинг. Антигенные компоненты с широким спектром действия против вируса гриппа А субтипа H3 не будут требовать ежегодной замены в составе противогриппозных вакцин.
Показано, что некоторые антигены вируса гриппа имеют эпитопы, консервативные для филогенетически далеких штаммов вируса гриппа. Данные антигены и должны служить основой вакцины широкого спектра действия. Известно, что консервативные B-клеточные эпитопы располагаются в основном в стволовом домене гемагглютинина, специфичные антитела к которым были недавно обнаружены. При этом данные антитела реагируют сразу с несколькими подтипами вируса гриппа (гемагглютининами). Антитело CR6261 - с подтипами филогенетической группы 1 (Ekiert D.C. et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope // Science. - 2009. - Vol. 324. - Issue 5924. - P. 246-251), антитело CR8020 - с подтипами филогенетической группы 2 (Ekiert D.C., Wilson I.A. Broadly neutralizing antibodies against influenza virus and prospects for universal therapies // Current Opinion in Virology. - 2012. - Volume 2. - Issue 2. - April 2012. - P. 134-141), антитело FI6 - с подтипами обоих групп (Corti D. et al. A Neutralizing Antibody Selected from Plasma Cells That Binds to Group 1 and Group 2 Influenza A Hemagglutinins // Science. - 2011. - 12 Aug 2011. - Vol. 333. - Issue 6044. - P. 850-856). Показано, что антитела против стволового домена гемагглютинина способны препятствовать конформационным изменениям структуры НА, необходимым для проникновения вируса внутрь клетки.
Следовательно, перспективным является представление HA иммунной системе в таком варианте, в котором иммунодоминантными выступают консервативные сайты стволовой части и максимально снижена иммуногенность иммунодоминантных антигенных сайтов в глобулярной части НА. При иммунизации таким антигеном НА ожидаемо получение кросс-реактивного иммунного ответа за счет индукции антител к стволовой части.
Таким образом, наиболее многообещающими антигенами для создания вакцин широкого спектра действия являются консервативные эпитопы гемагглютинина. В этой связи разрабатываются различные подходы к модификации гемагглютинина для придания ему новых иммуногенных свойств.
Одним из подходов к решению задачи является получение только стволовой части гемагглютинина, так называемые «безголовые» гемагглютинины (Impagliazzo A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.Science // 2015 - Sep 18;349(6254):1301-6.; Yassine H.M., et al. Hemagglutinin-stem nanoparticles generate heterosubtypic influenza protection // Nat Med. 2015 Sep;21(9):1065-70).
Известен патент, в котором применяется данный подход (WO/2019/070955). Раскрыты универсальные вирусы гриппа на основе укороченного белка гемагглютинина (HA) вируса гриппа, не имеющего головного домена (hrHA). Также раскрыта композиция, содержащая наночастицу, покрытую раскрытым полипептидом hrHA. Также раскрыта композиция, содержащая вирусоподобную частицу (VLP), экспрессирующую на своей поверхности раскрытый полипептид hrHA.
Подход по созданию «обезглавленных» гемагглютининов (WO/2019/070955) имеет существенные недостатки, так как на практике чрезвычайно сложно их создать без потери конформационной укладки белка, что вызывает ухудшение иммуногенных свойств подобных антигенов.
Другим подходом является создание химерных гемагглютининов с экзотическими глобулярными частями (Krammer F., Palese P., Steel J.. Advances in universal influenza virus vaccine design and antibody mediated therapies based on conserved regions of the hemagglutinin // Curr Top Microbiol Immunol. 2015;386:301-21.; Hai R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes // J Virol. 2012 May;86(10):5774-81).
Данный подход реализован в технических решениях патентов US11266734B2, US20190106461A1, EP1997831.
Известно, что в патенте US11266734B2 представлены химерные полипептиды гемагглютинина (HA) и их применение для индуцирования иммунного ответа (например, гуморального ответа) против вируса гриппа. Также в настоящем документе предусмотрены способы получения антител к химерным полипептидам HA у субъекта.
В свою очередь, в патенте EP1997831 описаны химерные вакцинные антигены против вируса птичьего гриппа (AI). Такие вакцинные антигены основаны на вирусных субъединицах, связанных с белковыми костимулирующими молекулами, которые усиливают как клеточное, так и гуморальное звено иммунного ответа. Химерные антигены могут быть получены в системах экспрессии, которые гарантируют правильную трехмерную укладку химерных молекул, составляющих основу настоящего изобретения.
Подход по созданию химерных гемагглютининов (US11266734B2, EP1997831) также имеет существенные недостатки, заключающиеся в том, что во-первых, в глобулярной части находятся антигенные сайты С, D и Е, которые являются достаточно консервативными в пределах одного субтипа и, следовательно, при изменении глобулярной части теряется множество эпитопов, антитела к которым являются безусловно протективными, а во вторых, иммунодоминантными по-прежнему остаются антигенные сайты на верхушке HA. В результате, напряженный иммунный ответ широкого спектра действия на такие гемагглютинины сложно получить.
Существует еще один подход по модификации гемагглютинина - гипергликозилирование.
Гликозилирование антигенов - это признанная стратегия уклонения вирусов от иммунного ответа хозяина. Гликозилирование гемагглютинина вируса гриппа происходит в основном в антигенных сайтах, причем сайтов гликозилирования со временем становиться больше (Medina R.A. et al. Glycosylations in the globular head of the hemagglutinin protein modulate the virulence and antigenic properties of the H1N1 influenza viruses. // Sci Transl Med. 2013 May 29;5(187):187ra70).
В ряде публикаций было показано, что гипергликозилирование гемагглютинина в глобулярном домене приводит к значительному увеличению гетеросубтипических антител (Lin S.C., et al. Broader neutralizing antibodies against H5N1 viruses using prime-boost immunization of hyperglycosylated hemagglutinin DNA and virus-like particles // PLoS One -2012-7: e39075.; Lin S.C., et al. Glycan masking of hemagglutinin for adenovirus vector and recombinant protein immunizations elicits broadly neutralizing antibodies against H5N1 avian influenza viruses // PLoS One. 2014 Mar 26;9(3):e92822; Eggink D., Goff P.H., Palese P. Guiding the immune response against influenza virus hemagglutinin toward the conserved stalk domain by hyperglycosylation of the globular head domain // J Virol. 2014 Jan;88(1):699-704; Bajic G., Maron M.J., Adachi Y., et al. Influenza antigen engineering focuses immune responses to a subdominant but broadly protective viral epitope // Cell Host Microbe. 2019 Jun 12;25(6):827-835.e6).
Так, например, Eggink D. с соавт. в 2014 году ввели 7 мутаций в Ca1, Cb, Sa и Sb антигенные сайты HA штамма A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 и, таким образом, гипергликозилировали НА (Eggink D., Goff P.H., Palese P. Guiding the immune response against influenza virus hemagglutinin toward the conserved stalk domain by hyperglycosylation of the globular head domain // J Virol. 2014 Jan;88(1):699-704). В конечном итоге они показали, что в отличие от дикого типа HA увеличивалась, во-первых, выработка антител к стволовой части HA, а во-вторых, такая иммунизация защищала мышей от вируса гриппа подтипа H9.
C другой стороны, имеются сведения о вероятности экранирования иммуногенных эпитопов в стволовой части гемагглютинина сайтами гликозилирования (Andrews S.F., et al. Is it possible to develop a "universal" influenza virus vaccine? Immunogenetic considerations underlying B-cell biology in the development of a pan-subtype influenza a vaccine targeting the hemagglutinin stem // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018 Jul 2;10(7). pii: a029413).
Подход по модификации гемагглютинина вируса гриппа на основе гипергликозилирования, по-видимому, является самым перспективным, поскольку позволяет точно экранировать необходимые антигенные сайты.
В общем понимании, создание антигенов вируса гриппа широкого спектра действия на основе гипергликозилирования заключается в том, чтобы заставить организм индуцировать выработку антител к необходимым эпитопам гемагглютинина вируса гриппа.
В качестве вектора, экспрессирующего созданный модифицированный ген вируса гриппа наиболее перспективным представляется рекомбинантный аденовирус. В настоящее время рекомбинантные аденовирусы, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с другими генетическими векторами, активно применяются в качестве вектора для экспрессии различных целевых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний. Такие векторы безопасны - ДНК рекомбинантных аденовирусов не встраивается в геном клеток-мишеней и введенные аденовирусные частицы выводятся из организма в течение 4- 5 недель. При этом они способны проникать в широкий спектр как делящихся, так и неделящихся клеток, осуществляют высокоэффективную экспрессию генов, индуцируют гуморальный и цитотоксический иммунный ответ на экспрессируемый чужеродный антиген, не требуют адъювантов.
Вирусный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа признан одним из наиболее иммуногенных аденовирусных векторов в отношении трансгена, предполагается, что это происходит из-за более эффективной трансдукции клеток с CAR- рецептором (Abbink P. et.al. Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D. // J.Virol. - 2007.- May;81(9):4654-63). Таким образом, с точки зрения ожидаемой эффективности выбор аденовируса человека 5 серотипа для создания вакцины обоснован. (Coughlan L. Factors which contribute to the immunogenicity of non-replicating adenoviral vectored vaccines // Front. Immunol. -2020.-11:909).
На сегодняшний день в мире активно ведутся разработки противогриппозных вакцин на основе антигенов широкого спектра действия, однако до сих пор зарегистрированные к применению препараты отсутствуют.
Таким образом, для совершенствования эффективности профилактической иммунизации против сезонного гриппа крайне необходимо создание новых антигенов с защитным действием широкого спектра действия (кросс-протективного) в отношении вирусов гриппа А субтипа Н3, которые могут быть использованы в фармацевтической промышленности для производства противогриппозных вакцин.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей изобретения является создание вирусного вектора, экспрессирующего ген целевого антигена, индуцирующего иммунитет к различным штаммам вируса гриппа А человека субтипа H3 без эффекта антигенного импринтинга, который может применяться в качестве фармацевтической композиции для профилактики гриппа А субтипа H3, а также входить в состав противогриппозной вакцины.
Технический результат заключается в получении экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа с делецией Е1 и Е3 областей, несущего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А антигенно далекого субтипа H3, способного обеспечить индукцию кросс-протективного иммунитета против инфекции, вызванной вирусами гриппа А субтипа H3 патогенными для человека, без эффекта антигенного импринтинга при введении субъекту в составе фармацевтической композиции или противогриппозной вакцины.
Указанный технический результат достигается тем, что создан экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3, содержащий:
- геном аденовируса человека 5-го серотипа, за исключением Е1 области, где удалены один или более эндогенных нуклеотидов с потерей её функциональной активности, и E3 области, где удалены один или более эндогенных нуклеотидов с потерей её функциональной активности;
- экспрессионную кассету в месте удаления E1 области генома аденовируса, включающую: промотор, модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1, где ген получен из вируса гриппа штамма A/swine/Indiana/A02214844/2017(H3N2), последовательность сигнала полиаденилирования.
В частном варианте исполнения экспрессионного вектора геном аденовируса человека 5-го серотипа представлен SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в частном варианте исполнения экспрессионного вектора, экспрессионная кассета в месте удаления Е1 области генома аденовируса включает регулируемый промотор, при этом в экспрессионный вектор в месте удаления Е3 области генома аденовируса дополнительно помещается экспрессионная кассета, включающая: конститутивный промотор, ген активатора транскрипции для регулируемого промотора, последовательность сигнала полиаденилирования. При этом, возможен вариант, когда экспрессия модифицированного гена гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3 в эукариотической клетке негативно регулируется в присутствии антибиотика тетрациклинового ряда.
Также создана фармацевтическая композиция для защиты от вирусов гриппа А субтипа H3, содержащая в эффективном количестве разработанный экспрессионный вектор и фармацевтически приемлемый буферный раствор.
Кроме того, разработано применение фармацевтической композиции для защиты субъекта от вирусов гриппа А субтипа H3. В том числе, в составе противогриппозной векторной вакцины.
Описание фигур
На фиг.1 схематически представлено расположение единичных аминокислотных замен () в модифицированном гемагглютинине swH3glyc. На схеме обозначены субъединицы гемагглютинина НА1 и НА2, а также локализация глобулярного и стволового участков молекулы гемагглютинина.
На фиг. 2 представлена схема экспрессионных кассет созданного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc, где
Ад5 - часть генома аденовируса, ψ - сигнал упаковки аденовируса;
промотор Р - регулируемый промотор для гена, кодирующего модифицированный ген гемагглютинина swH3glyc;
целевой ген - модифицированный ген гемагглютинина swH3glyc;
пА - сигнал полиаденилирования;
промотор К - конститутивный промотор для гена, продукт которого активирует транскрипцию регулируемого промотора;
активатор - ген, продукт которого активирует транскрипцию регулируемого промотора;
ИКП - инвертированные концевые повторы аденовируса;
E1 - участок удаления E1 области, куда встроена кассета экспрессирующая целевой ген;
E3 - участок удаления E3 области, куда встроена кассета экспрессирующая ген, продукт которого активирует транскрипцию регулируемого промотора.
На фиг. 3 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc. Полученные в ходе анализа ПЦР - фрагменты (целевые полосы) требуемого размера подтверждают создание экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа по изобретению, так как показывают наличие аденовирусного генома и наличие целевого трансгена.
Обозначения:
М - маркер молекулярного веса Thermo Scientific Gene Ruler 1 kb DNA Ladder;
Треки 1, 2, 3 - результат ПЦР на аденовирусный геном, где:
1 - контроль отрицательный;
2 - контроль положительный (плазмида, несущая гексон аденовируса человека 5 серотипа );
3 - гексон аденовируса человека 5 серотипа (размер фрагмента 578 п.о.)
Треки 4, 5, 6 - результат ПЦР на трансген (модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1), где:
4 - контроль отрицательный;
5 - контроль положительный (плазмида, несущая ген SwH3glyc);
6 - ген SwH3glyc (размер фрагмента 598 п.о.).
Фигура 4
На фиг. 4 представлены результаты оценки иммуногенной активности экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc, проведенной методом ИФА с рекомбинантным гемагглютинином гетерологичного вируса гриппа A/Brisbane/10/2007/H3N2 в сыворотках крови иммунизированных мышей. Ось абсцисс - разведения сывороток крови, ось ординат - оптическая плотность, измеренная с помощью спектрофотометра (при длине волны 450 нм). Кривые титрования обозначают следующие группы животных: ^
| Ad5-swH3glyc, доза 108 БОЕ | |
| Ad5-swH3glyc, доза 107 БОЕ | |
| Ad5-swH3glyc, доза 106 БОЕ | |
| Контроль (буферный раствор) |
На кривых титрования маркеры обозначают средние значения измерений оптической плотности по группам, а линиями с засечками отмечено стандартное отклонение.
Фигура 5
На фигуре 5 представлены результаты изучения кросс - протективного иммунного ответа мышей, иммунизированных экспрессионным вектором Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции при однократном интраназальном способе введения, в дозе 107 БОЕ/животное, с последующим заражением гетерологичным вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).
На графиках кривые выживаемости и изменения массы тела обозначены следующим образом:
- опытная группа мышей, иммунизированных экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции;
- контрольная группа мышей, получившая буферный раствор.
5А. Выживаемость мышей, зараженных 15 LD50 вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).
Ось ординат - % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Маркеры на линиях графика обозначают количество животных в группе.
Различия между выживаемостью в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являются статистически достоверными (p=0,0001).
5Б. Изменение массы тела мышей, зараженных 15 LD50 вируса гриппа штамма A/Aichi/2/68 (H3N2).
Ось ординат - изменения массы тела животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Маркеры на линиях обозначают % изменения средней массы тела животных по группе.
Реализация изобретения
Новизна данного изобретения заключается в том, что для создания противогриппозной вакцины для человека был использован антиген вируса гриппа A/swine/Indiana/A02214844/2017(H3N2), не циркулирующий в популяции человека и антигенно далекий от вирусов гриппа А субтипа H3, патогенных для человека. Таким образом, у человека нет предсуществующих антител к данному антигену, что позволяет избежать эффекта антигенного импринтинга. Авторами была выполнена существенная модификация антигена, которая позволила сфокусировать иммунный ответ на ряд эпитопов стволовой части гемагглютинина. Данные эпитопы являются консервативными и имеют высокую степень гомологии с эпитопами вируса гриппа А субтипа H3, что позволяет обеспечить кросс-протективный эффект.
Специалисту среднего уровня понятно, что иммунный ответ на экспрессионный вектор и фармацевтическую композицию на его основе в первую очередь определяется последовательностью целевого антигена. При этом в состав экспрессионной кассеты может входить любой промотор, обеспечивающий высокую экспрессию гена целевого антигена (например, CMV промотор). Вместе с тем использование регулируемого промотора, которое описано в примерах, дает преимущество при наращивании экспрессионного вектора и позволяет получать его с большим выходом.
В качестве экспрессионного вектора авторы используют вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа. Экспрессионный вектор был получен из последовательности SEQ ID NO:2 путем делеции Е1 и Е3 областей. При этом на место Е1 области помещают экспрессионную кассету с промотором, целевым геном (модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1), последовательностью сигнала полиаденилирования. Возможен вариант изобретения, когда дополнительно вместо Е3 области помещают экспрессионную кассету с конститутивным промотором, геном активатора транскрипции для регулируемого промотора, последовательностью сигнала полиаденилирования. Получение препаративного количества разработанного экспрессионного вектора проводят в суспензионной линии клеток HEK293.
Полученный экспрессионный вектор, а также фармацевтическая композиция на его основе при введении в организм млекопитающих способны индуцировать антиген-специфический иммунный ответ и могут быть использованы как самостоятельное средство для профилактики гриппа А субтипа H3, а также в составе противогриппозных вакцин.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами, которые при этом не ограничивают его объем.
Пример 1
Создание последовательности модифицированного гена гемагглютинина вирусов гриппа А субтипа H3
В примере описана работа по выбору исходного гена гемагглютинина вируса гриппа А для проведения генно-инженерной модификации, которая позволит после введения субъекту модифицированного гена индуцировать кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3 без эффекта антигенного импринтинга.
Для преодоления проблемы «антигенного импринтинга» в качестве основы для создания модифицированных гемагглютининов вирусов гриппа А были выбраны антигенно далекие штаммы вируса гриппа А патогенные для свиней, что по мнению авторов не вызовет бустирование неактуальных в настоящее время предсуществующих антител к иммунодоминантным эпитопам вирусов гриппа А человека. Дополнительно были закрыты иммунодоминантные эпитопы в глобулярной части гемагглютинина и иммунный ответ перенаправлен на консервативные эпитопы стволовой части гемагглютинина.
С целью выбора исходной аминокислотной последовательности гемагглютинина вируса гриппа А патогенного для свиней была получена обобщенная (консенсусная) последовательность изолятов 2017 года. Далее для конструирования за основу взята последовательность гемагглютинина максимально гомологичная консенсусной последовательности.
В результате, в качестве исходного гемагглютинина для создания модифицированных генов был выбран гемагглютинин штамма Influenza A virus A/swine/Indiana/A02214844/2017(H3N2), номер аминокислотной последовательности в общедоступной базе NCBI Protein - ARX97391. Для осуществления модификации была взята соответствующая нуклеотидная последовательность гемагглютинина A/swine/Indiana/A02214844/2017(H3N2), которая находится в общедоступной базе NCBI GenBank под номером MF150342 (ниже по тексту данный ген гемагглютинина обозначен - swH3).
Далее для фокусирования иммунного ответа проводилось экранирование наиболее вариабельных и доступных иммунодоминантных эпитопов на поверхности белка гемагглютинина с помощью введения 2 дополнительных сайтов гликозилирования в глобулярной части гемагглютинина вируса гриппа A/swine/Indiana/A02214844/2017(H3N2) путем замены в последовательности гемагглютинина 2 аминокислот. И, наоборот, часть природных сайтов гликозилирования в стволовой части, маскирующих консервативные эпитопы были убраны путем замены в последовательности гемагглютинина 2 аминокислот для того, чтобы сделать эпитопы более открытыми иммунной системе с целью повышения их иммуногенности.
Таким образом, в результате проведенных работ in silico с исходной нуклеотидной последовательностью swH3, были внесены следующие мутации в гемагглютинине:
1) проведена аминокислотная замена N38H, которая привела к удалению сайта гликозилирования в HA (38-40);
2) проведена аминокислотная замена N285G, которая привела к удалению сайта гликозилирования в HA (285-287);
3) проведена аминокислотная замена в положении V144N, которая привела к добавлению сайта гликозилирования в HA (144-146);
4) проведена аминокислотная замена в положении K160T, которая привела к добавлению сайта гликозилирования в HA (158-160).
В итоге были удалены сайты гликозилирования в стволовой части и добавлены сайты гликозилирования в глобулярной части. Для увеличения экспонирования антигена лидерный пептид гемагглютинина вируса гриппа был заменен на лидерный пептид щелочной фосфатазы - SEAP. Также была проведена оптимизация кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный вариант модифицированного гена гемагглютинина обозначен - swH3glyc.
Целевой ген со всеми модификациями был синтезирован de novo (ЗАО «Евроген», Москва).
Последовательность модифицированного гена гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3 представлена в Перечне последовательностей, как SEQ ID NO: 1 (ген swH3glyc).
Наличие всех модификаций в гене гемагглютинина swH3glyc было подтверждено секвенированием.
Таким образом, был создан модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1, где ген получен из вируса гриппа штамма A/swine/Indiana/A02214844/2017(H3N2).
Пример 2
Получение экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, с удаленными Е1 и Е3 областями, содержащего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3
В данном примере рассмотрен процесс получения экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, содержащего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3 из примера 1, методом гомологичной рекомбинации.
Процесс получения экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, с удаленными Е1 и Е3 областями, содержащего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3 состоял из нескольких основных этапов, суть которых известна специалисту данной области, основывался на общеизвестных методиках (например, Sambrook J. et al., Molecular cloning : a laboratory manual, 3rd ed., Russell, 2001, том 1, 2, 3 - Молекулярное клонирование - лабораторное руководство) и поэтому в данном примере подробно не рассматривается, указывая лишь на самые основные этапы:
1) Переклонирование синтезированного целевого гена swH3glyc с SEQ ID NO: 1 из плазмиды для клонирования продуктов ПЦР в плазмиду pShuttle-TswH3glyc, несущую экспрессионную кассету с регулируемым промотором;
2) Конструирование плазмиды pAdeno-E3/TA на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, представленного SEQ ID NO: 2, с удалением E3 области и вставкой экспрессионной кассеты с геном, продукт которого активирует транскрипцию регулируемого промотора;
3) Гомологичная рекомбинация между плазмидой pShuttle-TswH3glyc и плазмидой pAdeno-E3/TA происходит в клетках линии HEK293 (Human embryonic kidney 293) после трансфекции плазмидными ДНК с получением экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc. В результате рекомбинации в участок удаления E1 области была встроена экспрессионная кассета с регулируемым промотором, целевым геном (модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1), последовательностью сигнала полиаденилирования.
4) Получение препаративного количества экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc проводили в суспензионной линии клеток HEK293.
Схема сконструированного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc представлена на фигуре 2.
Представленные на фигуре 3 результаты проведенного ПЦР анализа подтверждают создание экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1. На электрофореграммах видно, что молекулярные массы фрагментов амплифицированной ДНК в препарате, содержащем экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc, соответствуют молекулярным массам фрагментов амплифицированной ДНК в положительных контролях. При этом наличие целевой полосы с размером фрагмента 578 п.о. в ПЦР с праймерами Gex-for /Gex-rev на ген гексона аденовируса 5 серотипа свидетельствует о наличии ДНК генома аденовируса человека 5 серотипа, а наличие целевой полосы с размером фрагмента 598 п.о. (праймеры swH3-for/swH3-TM-rev) свидетельствует о наличии последовательности гена гемагглютинина swH3glyc.
Корректность указанной конструкции экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа была подтверждена результатами секвенирования генома рекомбинантного аденовируса.
Таким образом, в результате работ был получен экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, с удаленными Е1 и Е3 областями, содержащий в удаленной Е1 области экспрессионную кассету, включающую модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, находящийся под контролем регулируемого промотора, ген активатора которого находится экспрессионной кассете в удаленной Е3 области под контролем конститутивного промотора.
Пример 3
Определение экспрессии модифицированного гена гемагглютинина вируса гриппа A субтипа H3 на культуре клеток
В примере показан эксперимент по изучению экспрессии модифицированного гена гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3 с SEQ ID NO: 1 созданным в примере 2 экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, который проводили на культуре клеток человека A549 и оценивали с помощью метода иммуноблоттинга.
Клеточная линия A549 была трансдуцирована экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа в дозе 5-10 БОЕ на клетку. В качестве отрицательного контроля использовали аденовирус, не несущий экспрессионной кассеты (Ad-null), После 48 часов инкубации собирали клеточный осадок для дальнейшего анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом с использованием мышиных моноклональных антител к гемагглютинину/HA гриппа А H3N2 (Cat: 11056-MM03, Sino Biological Inc.). В качестве вторичных антител использовали антимышиное антитело козы, конъюгированное с пероксидазой хрена (Goat anti-mouse IgG H&L (HRP) (ab205719, Abcam).
Было показано, что созданный по изобретению экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc обеспечивает продукцию в культуре клеток человека модифицированного гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3.
Пример 4
Получение на основе экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа фармацевтической композиции для защиты от вирусов гриппа А субтипа H3
В данном примере показан процесс наращивания сконструированного в примере 2 экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc с целью получения на его основе фармацевтической композиции для защиты субъекта от вирусов гриппа А субтипа H3.
Для наращивания рекомбинантных аденовирусов использовали культуру клеток НЕК 293 (эмбриональной почки человека), адаптированную для роста в суспензии.
Количественное измерение рекомбинантных аденовирусов проводили в единицах активности (БОЕ, бляшкобразующие единицы), измеренных на культуре клеток НЕК 293.
Клеточную суспензию линии НЕК293, инфицировали экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, полученным в примере 2, со множественностью инфекции 10 БОЕ на клетку, и использовали для дальнейшего наращивания большего количества экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа.
С этой целью, в волновой биореактор с 4500,0 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293HEK вносили вируссодержащую жидкость объемом 500,0 мл, содержащую экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа из примера 2. Для наращивания экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc с регулируемым промотором, проводили культивирование в течение 48 часов в присутствие антибиотика тетрациклинового ряда (например, доксициклина) с концентрацией 1-10 мкг на мл среды. Затем экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа очищали из лизата клеток с помощью общеизвестных методов ультрафильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии в несколько этапов.
Для стерилизации полученного препарата использовали фильтр с размером пор 0,22 мкМ и разбавляли стерильным фармацевтически приемлемым буферным раствором, сохраняющим стабильность рекомбинантных аденовирусов, например: трис (гидроксиметил) аминометан - 0,606 мг; натрия хлорид - 2,19 мг; сахароза - 25,0 мг; полисорбат-80 - 0,00025 мл; магния хлорида гексагидрат - 0,1 мг; этанол 95% - 0,0025 мл; ЭДТА динатриевая соль - 0,019 мг; вода для инъекций - остальное, рН 7,0-8.0, с получением на основе экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа фармацевтической композиции, содержащей:
- экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа - 1×1011 -5×1011 частиц/мл с активностью не менее 2×108 БОЕ;
- фармацевтически приемлемый буферный раствор.
Таким образом, в результате проведенных работ была получена фармацевтическая композиция на основе экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа по изобретению, содержащая в эффективном количестве экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и фармацевтически приемлемый буферный раствор.
Пример 5
Иммуногенная активность экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущего модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, при введении лабораторным животным
Иммуногенная активность оценивалась по способности вырабатывать специфические антитела в ответ на интраназальное введение экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc мышам. Оценка проводилась в сыворотке крови мышей методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Мыши линии Balb/c, самки, массой 14-16 грамм, были иммунизированы однократно интраназально фармацевтической композицией из примера 4, с различным содержанием экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа в дозе, что при необходимости достигалось разбавлением исходной концентрации буферным раствором. В качестве контрольной группы были использованы животные, получившие буферный раствор. Количество мышей в опытной и контрольной группах составляло по 6 особей. Таким образом, были сформированы следующие экспериментальные группы:
Группа 1) Ad5-swH3glyc, доза 108 БОЕ;
Группа 2) Ad5-swH3glyc, доза 107 БОЕ;
Группа 3) Ad5-swH3glyc, доза 106 БОЕ;
Группа 4) Буферный раствор (контроль).
Получение сывороток крови мышей. Кровь получали от мышей через 28 дней после иммунизации в пробирки «эппендорф», инкубировали в термостате 40 минут при 37°С для формирования сгустка фибрина. После этого пробирки центрифугировали при 3000 об/мин., 4°С, 20 минут. Сыворотки отбирали в чистые пробирки, прогревали 30 минут при 57°С (для инактивации системы комплемента) и замораживали на -20°С.
Методика проведения ИФА для определения титра антител в сыворотках крови мышей.
Антигеном для реакции служил: рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/10/2007/H3N2 (Sino Biological, 11056-V08).
Для постановки ИФА лунки 96-луночного планшета сенсибилизировали путем внесения антигенов в 10мМ калиево-карбонатном буфере (рН=9.6). Сенсибилизацию проводили 18 часов при 4°С. Затем планшет отмывали 3× кратно дистиллятом и 3× кратно раствором TPBS (фосфатно-солевой буфер с 0,05% Tween 20). Далее проводили инкубацию планшета в буфере забивки (TPBS с 5%ным овоальбумином) при 37°С на шейкере. Затем 3× кратно отмывали TPBS и инкубировали с разведениями сывороток от 1/400 до 1/25600 в буфере забивки 1 час при 37°С на шейкере. Далее снова 3× кратно отмывали TPBS и инкубировали с антивидовым мышиным коньюгатом (поликлональные антитела лошади к IgG мыши, коньюгированные с пероксидазой, (Amersham, Великобритания), в буфере забивки 1 час при 37°С на шейкере (рабочее разведение 1:5000). Затем снова 3× кратно отмывали TPBS. Для проявления реакции использовали TMB-индикаторную смесь. Для остановки реакции использовали 4М H2SO4. Оптическую плотность окрашенного продукта пероксидазной реакции определяли на приборе iEMS Reader MF (Termolabsystems) при длине волны 450 нм. Фоном служили лунки, куда не добавлялись сыворотки, но добавлялись антиген и конъюгат.
На фигуре 4 представлены полученные результаты эксперимента по оценке с помощью ИФА уровня антител, взаимодействующих с рекомбинантным гемагглютинином вируса гриппа A субтипа H3, в сыворотках крови мышей, иммунизированных экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в сравнении с группой контроль, мышам которой вводили буферный раствор.
Как видно на фигуре 4, у мышей из опытной группы, иммунизированных экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc, детектируются антитела к гемагглютинину вируса гриппа A субтипа H3. Для группы 1 (доза 108 БОЕ) предельным разведением сыворотки крови, в котором значение оптической плотности при А450 достоверно отличались от контрольной группы было 1:12800 (0,0017), а для группы 2 (доза 107 БОЕ) и группы 3 (доза 106 БОЕ) - 1:6400 (p<0,05). Дозой экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc для применения и использования в дальнейших исследованиях была принята 107 БОЕ на мышь. При этом в контрольной группе антитела определялись на фоновом уровне.
Таким образом, сконструированный экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, содержащий модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, обладает иммуногенной активностью при введении субъекту в составе фармацевтической композиции, то есть способен вызвать образование антител к вирусу гриппа А субтипа H3, что соответствует поставленной цели изобретения.
Пример 6
Применение фармацевтической композиции для профилактики гриппа А субтипа H3 с оценкой кросс-протективных свойств на лабораторных животных
На данном этапе проведены работы по оценке кросс-протективных свойств экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа в составе фармацевтической композиции против различных гетерологичных штаммов вирусов гриппа А субтипа H3. Оценка проводилась по выживаемости и динамике изменения массы тела иммунизированных фармацевтической композицией мышей после их заражения вирусами гриппа.
Исходя из разработанной конструкции экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, иммунизация должна стимулировать выработку антител, в том числе на высококонсервативные участки гемагглютининов вирусов гриппа А субтипа H3, поэтому предполагалось, что экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа в составе фармацевтической композиции будет обладать широким спектром действия (кросс-протективным), то есть способностью защищать от различных штаммов вирусов гриппа А субтипа H3. Для демонстрации кросс-протективного действия иммунизированных мышей заражали гетерологичным штаммом вируса гриппа А/Aichi/2/68(H3N2), адаптированного к мышам.
Для проведения эксперимента использовались мыши линии Balb/c, самки, массой 14-16 грамм. Мыши опытных групп были однократно интраназально иммунизированы экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции в дозе 107 БОЕ. Контрольным мышам вводили буферный раствор. В каждой группе было 10 мышей.
Через 28 дней после иммунизации мышей интраназально под эфирным наркозом заражали вышеуказанными вирусами гриппа в дозе 15 ЛД50 на животное. Для приготовления необходимых разведений вирусов гриппа использовали среду Хенкса с гидролизатом лактальбумина и антибиотиком гентамицином (ПанЭко, Россия).
Таким образом, в эксперименте были сформированы следующие опытные и контрольные группы:
1 группа) Ad5-swH3glyc + заражение А/Aichi/2/68 (H3N2);
2 группа) Буферный раствор+ заражение А/Aichi/2/68 (H3N2).
Наблюдение за мышами проводилось в течение 14 дней после заражения вирусами гриппа, в этот период оценивались выживаемость животных, а также проявление симптомов заболевания (изменение массы тела).
Для статистической обработки результатов эксперимента была использована компьютерная программа. Статистическую обработку выживаемости животных проводили с помощью критерия Гехана-Бреслоу-Вилкоксона, различия между группами считались достоверными при р<0,05.
Результаты эксперимента представлены в таблице 1 и на фигуре 5.
| Таблица 1. Кросс-протективные свойства иммунитета индуцированного экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции к вирусам гриппа А субтипа H3 на мышах, оцененные после заражения гетерологичным штаммом вируса гриппа А субтипа H3 | ||
| Вирус гриппа для заражения | Выживаемость, % | |
| Опыт | Контроль | |
| А/Aichi/2/68 (H3N2) | 100%* | 0% |
| * - достоверное отличие от контроля (p=0,0001) | ||
Из таблицы 1 и фигуры 5 следует, что экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции на 100% защищал мышей от заражения гетерологичным вирусом гриппа А субтипа H3 в опытной группе. При этом выживаемость мышей контрольной группы составила 0%. Разница в выживаемости опытной и контрольной группы является достоверной (p= 0,0001, критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона). У мышей из опытной группы, иммунизированных Ad5-swH3glyc, после незначительного падения массы тела в начале наблюдения, к 14 дню масса тела восстановилась и наблюдался прирост, тогда как в контрольной группе мышей до момента гибели наблюдалось значительное падение массы тела, которое доходило до 35%. При этом у иммунизированных мышей в опытных группах отсутствовали клинические симптомы заболевания, в отличие от контрольных мышей.
Следовательно, в ходе эксперимента было показано защитное действие иммунного ответа, индуцированного у мышей экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции против гетерологичного вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), что подтверждает наличие кросс-протективных свойств в отношении вирусов гриппа А субтипа H3.
Таким образом, экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе фармацевтической композиции индуцирует кросс-протективный иммунитет и может применяться для профилактики гриппа А субтипа H3 у субъекта, что соответствует поставленной цели изобретения.
Пример 7
Применение экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа в составе противогриппозной вакцины с оценкой протективных свойств и безопасности
В примере показана возможность применения экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе противогриппозной векторной вакцины. Оценивали протективные свойства экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе четырехвалентной противогриппозной векторной вакцины и ее безопасность при применении лабораторным животным (мышам).
В состав вакцины входила смесь 4 видов экспрессионных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, различающихся вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа, которые представляли собой: ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H1, ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3 (модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H3, с последовательностью SEQ ID NO: 1- swH3glyc), ген гемагглютинина вируса гриппа В линии Виктория, а также ген гемагглютинина вируса гриппа В линии Ямагата.
Доза экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc в составе противогриппозной векторной вакцины, лекарственная форма которой была представлена объемом 0,5 мл, составляла 1×108 БОЕ.
Для оценки протективных свойств Ad5-swH3glyc и безопасности противогриппозной вакцины, содержащей 4 типа экспрессионных векторов, были использованы мыши линии Balb/c, самки, 14-16 грамм. Животных иммунизировали однократно интраназально вакциной в объеме 50 мкл (содержание экспрессионного вектора Ad5-swH3glyc 107 БОЕ). В качестве контрольной группы были использованы животные, получившие буферный раствор. Количество мышей в опытной и контрольной группе составляло по 10 особей. Через 28 дней после иммунизации мышей интраназально под эфирным наркозом заражали вирусом гриппа A А/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированным для мышей, в дозе 15 ЛД50 на животное. Оценку выживаемости и падения массы тела животных проводили в течение 14 дней после заражения. Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 2.
| Таблица 2. Протективные свойства иммунитета индуцированного экспрессионным вектором на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc, введенного мышам в составе четырехвалентной противогриппозной векторной вакцины | ||
| Группа | Вирус, использованный для заражения мышей | Результат |
| Опыт (Вакцина) | А/Aichi/2/68 (H3N2) | Выживаемость 100%, падение массы тела менее 5% |
| Контроль (буферный раствор) | А/Aichi/2/68 (H3N2) | Выживаемость 0%, падение массы тела 30% |
Из таблицы 2 следует, что выживаемость мышей опытной группы после заражения вируса гриппа А субтипа H3 составила 100%, при этом у мышей контрольной группы составила 0%. Разница между опытной и контрольной группой была достоверной (p= 0,0001, критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона). Падение массы тела мышей в контрольной группе после заражения вирусом гриппа А субтипа H3 достигало 30%, мыши опытной группы теряли массу тела незначительно, с восстановлением прироста к концу периода наблюдения, клинические симптомы заболевания гриппом отсутствовали.
Таким образом, в ответ на введение четырехвалентной противогриппозной векторной вакцины, содержащей экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа Ad5-swH3glyc, у лабораторных мышей вырабатывался защитный иммунный ответ в отношении вируса гриппа А субтипа H3.
Применение вакцины для лабораторных животных было безопасно, токсических эффектов на введенную мышам дозу не наблюдалось.
В результате эксперимента было показано, что экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 5 серотипа по изобретению, введенный в состав противогриппозной векторной вакцины, может применяться для защиты субъекта от заражения вирусами гриппа А субтипа H3.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, создание вирусного вектора несущего антиген, индуцирующего иммунитет к различным штаммам вируса гриппа А человека субтипа H3 без эффекта антигенного импринтинга, который может применятся в качестве фармацевтической композиции для профилактики гриппа А субтипа H3, а также входить в состав противогриппозной вакцины, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают способность разработанного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа индуцировать иммунный ответ против целевого антигена и его промышленную применимость для создания вакцин против гриппа.
--->
<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2023-05-11" softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence" fileName="cross H3.xml" dtdVersion="V1_3">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023-05-04</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-05-04</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>2023-05-04</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3 и фармацевтическая композиция на его основе</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1719</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1719</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgcttggaccctgcatgctgcttctgttgctcctgcttggcttgagacttcagctgtctcttggacagaagctgcccggcagtgacaacagcatggccacactgtgtcttggccaccatgctgttcccaatggcaccttggtgaagaccatcaccgacgatcagatcgaggtgacccacgccaccgagctggtgcagtctagcagtaccagcaggatctgcaactctccccatcagatcctggatggcaagaactgcacactgattgatgccttgcttggcgatccccactgtgacgacttccagaacaagaagtgggacctgttcgtggagaggagcactgcctacagcaactgctatccctactatgttcctgactatgccacactgagaagtctgattgccagcagcggcaacctggagttcacccaggagagcttcaactggacaggagttgcacaggatggctccagctacgcctgcaggagaggcagcaacaacagcttcttcagcagactgaactggttgtacaatctgaactacacctatccagagcagaacgtgaccatgccaaacaacgacaagttcgacaagctctacatctggggcgtgcaccatcctggcaccgacaaggaccagaccaacctgtacgtgcaagcctctggcagagtgatcgtgagcaccaagagaagtcaacagaccgtgatccccaacatcggcagcagaccctgggtgagaggagtgagctccatcatcagcatctactggaccattgtgaaacctggcgacatccttctgatcaacagcacaggcaacctgattgcacccagaggctacttcaagatccagagtggcaagtccagcatcatgagaagtgacgctcacatcgacgagtgcaacagcgagtgcatcactccaggaggcagcattcccaacgacaaacccttccagaatgtgaacaagatcacctatggcgcctgtcccaggtacgtgaaacagaacactctgaaacttgccacaggcatgaggaacgttcctgagaagcagaccagaggcatctttggagccattgcaggcttcatcgagaatggctgggaaggcatggtggatggctggtatggcttcagacatcagaacagcgaaggcactggacaggctgcagacctgaagagcacccaagcagccatcaaccagatcacaggcaagctgaacagagtgatcaagaagaccaacgagaagttccatcagatcgagaaggagttcagtgaggtggaaggcagaatccaggacctggagaagtacgtggaggacaccaagatcgacctgtggagctacaatgccgagctgttggtggccttggagaaccagcacaccatcgacctgaccgactctgagatgagcaagctcttcgagagaaccaggagacagctgagagagaatgccgaggacatgggcaatggctgcttcaagatctaccacaagtgtgacaacgcttgcattggcagcatcaggaatggcacctacgaccacgacatctacaggaacgaagctctgaacaacaggtttcagatcaaaggagtgcagctgaagtccggatacaaggactggattctgtggatcagctttgccatctcctgcttcctgttgtgtgttgtgctgcttggcttcatcatgtgggcttgtcagaagggcaacatcaggtgcaacatctgcatctaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35938</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35938</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human adenovirus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgtgatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttggtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatatttgtctagggccgcggggactttgaccgtttacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgttttccgcgttccgggtcaaagttggcgttttattattatagtcagctgacgtgtagtgtatttatacccggtgagttcctcaagaggccactcttgagtgccagcgagtagagttttctcctccgagccgctccgacaccgggactgaaaatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggaaggtgctgaggtacgatgagacccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgtggcggtaaacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtgaccgaggagctgaggcccgatcacttggtgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatacagattgaggtactgaaatgtgtgggcgtggcttaagggtgggaaagaatatataaggtgggggtcttatgtagttttgtatctgttttgcagcagccgccgccgccatgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggtttaaaacataaataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtctttatttaggggttttgcgcgcgcggtaggcccgggaccagcggtctcggtcgttgagggtcctgtgtattttttccaggacgtggtaaaggtgactctggatgttcagatacatgggcataagcccgtctctggggtggaggtagcaccactgcagagcttcatgctgcggggtggtgttgtagatgatccagtcgtagcaggagcgctgggcgtggtgcctaaaaatgtctttcagtagcaagctgattgccaggggcaggcccttggtgtaagtgtttacaaagcggttaagctgggatgggtgcatacgtggggatatgagatgcatcttggactgtatttttaggttggctatgttcccagccatatccctccggggattcatgttgtgcagaaccaccagcacagtgtatccggtgcacttgggaaatttgtcatgtagcttagaaggaaatgcgtggaagaacttggagacgcccttgtgacctccaagattttccatgcattcgtccataatgatggcaatgggcccacgggcggcggcctgggcgaagatatttctgggatcactaacgtcatagttgtgttccaggatgagatcgtcataggccatttttacaaagcgcgggcggagggtgccagactgcggtataatggttccatccggcccaggggcgtagttaccctcacagatttgcatttcccacgctttgagttcagatggggggatcatgtctacctgcggggcgatgaagaaaacggtttccggggtaggggagatcagctgggaagaaagcaggttcctgagcagctgcgacttaccgcagccggtgggcccgtaaatcacacctattaccgggtgcaactggtagttaagagagctgcagctgccgtcatccctgagcaggggggccacttcgttaagcatgtccctgactcgcatgttttccctgaccaaatccgccagaaggcgctcgccgcccagcgatagcagttcttgcaaggaagcaaagtttttcaacggtttgagaccgtccgccgtaggcatgcttttgagcgtttgaccaagcagttccaggcggtcccacagctcggtcacctgctctacggcatctcgatccagcatatctcctcgtttcgcgggttggggcggctttcgctgtacggcagtagtcggtgctcgtccagacgggccagggtcatgtctttccacgggcgcagggtcctcgtcagcgtagtctgggtcacggtgaaggggtgcgctccgggctgcgcgctggccagggtgcgcttgaggctggtcctgctggtgctgaagcgctgccggtcttcgccctgcgcgtcggccaggtagcatttgaccatggtgtcatagtccagcccctccgcggcgtggcccttggcgcgcagcttgcccttggaggaggcgccgcacgaggggcagtgcagacttttgagggcgtagagcttgggcgcgagaaataccgattccggggagtaggcatccgcgccgcaggccccgcagacggtctcgcattccacgagccaggtgagctctggccgttcggggtcaaaaaccaggtttcccccatgctttttgatgcgtttcttacctctggtttccatgagccggtgtccacgctcggtgacgaaaaggctgtccgtgtccccgtatacagacttgagaggcctgtcctcgagcggtgttccgcggtcctcctcgtatagaaactcggaccactctgagacaaaggctcgcgtccaggccagcacgaaggaggctaagtgggaggggtagcggtcgttgtccactagggggtccactcgctccagggtgtgaagacacatgtcgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctgaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcatccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttggtggcaaacgacccgtagagggcgttggacagcaacttggcgatggagcgcagggtttggtttttgtcgcgatcggcgcgctccttggccgcgatgtttagctgcacgtattcgcgcgcaacgcaccgccattcgggaaagacggtggtgcgctcgtcgggcaccaggtgcacgcgccaaccgcggttgtgcagggtgacaaggtcaacgctggtggctacctctccgcgtaggcgctcgttggtccagcagaggcggccgcccttgcgcgagcagaatggcggtagggggtctagctgcgtctcgtccggggggtctgcgtccacggtaaagaccccgggcagcaggcgcgcgtcgaagtagtctatcttgcatccttgcaagtctagcgcctgctgccatgcgcgggcggcaagcgcgcgctcgtatgggttgagtgggggaccccatggcatggggtgggtgagcgcggaggcgtacatgccgcaaatgtcgtaaacgtagaggggctctctgagtattccaagatatgtagggtagcatcttccaccgcggatgctggcgcgcacgtaatcgtatagttcgtgcgagggagcgaggaggtcgggaccgaggttgctacgggcgggctgctctgctcggaagactatctgcctgaagatggcatgtgagttggatgatatggttggacgctggaagacgttgaagctggcgtctgtgagacctaccgcgtcacgcacgaaggaggcgtaggagtcgcgcagcttgttgaccagctcggcggtgacctgcacgtctagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtaagagcctagcatgtagaactggttgacggcctggtaggcgcagcatcccttttctacgggtagcgcgtatgcctgcgcggccttccggagcgaggtgtgggtgagcgcaaaggtgtccctgaccatgactttgaggtactggtatttgaagtcagtgtcgtcgcatccgccctgctcccagagcaaaaagtccgtgcgctttttggaacgcggatttggcagggcgaaggtgacatcgttgaagagtatctttcccgcgcgaggcataaagttgcgtgtgatgcggaagggtcccggcacctcggaacggttgttaattacctgggcggcgagcacgatctcgtcaaagccgttgatgttgtggcccacaatgtaaagttccaagaagcgcgggatgcccttgatggaaggcaattttttaagttcctcgtaggtgagctcttcaggggagctgagcccgtgctctgaaagggcccagtctgcaagatgagggttggaagcgacgaatgagctccacaggtcacgggccattagcatttgcaggtggtcgcgaaaggtcctaaactggcgacctatggccattttttctggggtgatgcagtagaaggtaagcgggtcttgttcccagcggtcccatccaaggttcgcggctaggtctcgcgcggcagtcactagaggctcatctccgccgaacttcatgaccagcatgaagggcacgagctgcttcccaaaggcccccatccaagtataggtctctacatcgtaggtgacaaagagacgctcggtgcgaggatgcgagccgatcgggaagaactggatctcccgccaccaattggaggagtggctattgatgtggtgaaagtagaagtccctgcgacgggccgaacactcgtgctggcttttgtaaaaacgtgcgcagtactggcagcggtgcacgggctgtacatcctgcacgaggttgacctgacgaccgcgcacaaggaagcagagtgggaatttgagcccctcgcctggcgggtttggctggtggtcttctacttcggctgcttgtccttgaccgtctggctgctcgaggggagttacggtggatcggaccaccacgccgcgcgagcccaaagtccagatgtccgcgcgcggcggtcggagcttgatgacaacatcgcgcagatgggagctgtccatggtctggagctcccgcggcgtcaggtcaggcgggagctcctgcaggtttacctcgcatagacgggtcagggcgcgggctagatccaggtgatacctaatttccaggggctggttggtggcggcgtcgatggcttgcaagaggccgcatccccgcggcgcgactacggtaccgcgcggcgggcggtgggccgcgggggtgtccttggatgatgcatctaaaagcggtgacgcgggcgagcccccggaggtagggggggctccggacccgccgggagagggggcaggggcacgtcggcgccgcgcgcgggcaggagctggtgctgcgcgcgtaggttgctggcgaacgcgacgacgcggcggttgatctcctgaatctggcgcctctgcgtgaagacgacgggcccggtgagcttgagcctgaaagagagttcgacagaatcaatttcggtgtcgttgacggcggcctggcgcaaaatctcctgcacgtctcctgagttgtcttgataggcgatctcggccatgaactgctcgatctcttcctcctggagatctccgcgtccggctcgctccacggtggcggcgaggtcgttggaaatgcgggccatgagctgcgagaaggcgttgaggcctccctcgttccagacgcggctgtagaccacgcccccttcggcatcgcgggcgcgcatgaccacctgcgcgagattgagctccacgtgccgggcgaagacggcgtagtttcgcaggcgctgaaagaggtagttgagggtggtggcggtgtgttctgccacgaagaagtacataacccagcgtcgcaacgtggattcgttgatatcccccaaggcctcaaggcgctccatggcctcgtagaagtccacggcgaagttgaaaaactgggagttgcgcgccgacacggttaactcctcctccagaagacggatgagctcggcgacagtgtcgcgcacctcgcgctcaaaggctacaggggcctcttcttcttcttcaatctcctcttccataagggcctccccttcttcttcttctggcggcggtgggggaggggggacacggcggcgacgacggcgcaccgggaggcggtcgacaaagcgctcgatcatctccccgcggcgacggcgcatggtctcggtgacggcgcggccgttctcgcgggggcgcagttggaagacgccgcccgtcatgtcccggttatgggttggcggggggctgccatgcggcagggatacggcgctaacgatgcatctcaacaattgttgtgtaggtactccgccgccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggcggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgacagaagcaccatgtccttgggtccggcctgctgaatgcgcaggcggtcggccatgccccaggcttcgttttgacatcggcgcaggtctttgtagtagtcttgcatgagcctttctaccggcacttcttcttctccttcctcttgtcctgcatctcttgcatctatcgctgcggcggcggcggagtttggccgtaggtggcgccctcttcctcccatgcgtgtgaccccgaagcccctcatcggctgaagcagggctaggtcggcgacaacgcgctcggctaatatggcctgctgcacctgcgtgagggtagactggaagtcatccatgtccacaaagcggtggtatgcgcccgtgttgatggtgtaagtgcagttggccataacggaccagttaacggtctggtgacccggctgcgagagctcggtgtacctgagacgcgagtaagccctcgagtcaaatacgtagtcgttgcaagtccgcaccaggtactggtatcccaccaaaaagtgcggcggcggctggcggtagaggggccagcgtagggtggccggggctccgggggcgagatcttccaacataaggcgatgatatccgtagatgtacctggacatccaggtgatgccggcggcggtggtggaggcgcgcggaaagtcgcggacgcggttccagatgttgcgcagcggcaaaaagtgctccatggtcgggacgctctggccggtcaggcgcgcgcaatcgttgacgctctagaccgtgcaaaaggagagcctgtaagcgggcactcttccgtggtctggtggataaattcgcaagggtatcatggcggacgaccggggttcgagccccgtatccggccgtccgccgtgatccatgcggttaccgcccgcgtgtcgaacccaggtgtgcgacgtcagacaacgggggagtgctccttttggcttccttccaggcgcggcggctgctgcgctagcttttttggccactggccgcgcgcagcgtaagcggttaggctggaaagcgaaagcattaagtggctcgctccctgtagccggagggttattttccaagggttgagtcgcgggacccccggttcgagtctcggaccggccggactgcggcgaacgggggtttgcctccccgtcatgcaagaccccgcttgcaaattcctccggaaacagggacgagccccttttttgcttttcccagatgcatccggtgctgcggcagatgcgcccccctcctcagcagcggcaagagcaagagcagcggcagacatgcagggcaccctcccctcctcctaccgcgtcaggaggggcgacatccgcggttgacgcggcagcagatggtgattacgaacccccgcggcgccgggcccggcactacctggacttggaggagggcgagggcctggcgcggctaggagcgccctctcctgagcggtacccaagggtgcagctgaagcgtgatacgcgtgaggcgtacgtgccgcggcagaacctgtttcgcgaccgcgagggagaggagcccgaggagatgcgggatcgaaagttccacgcagggcgcgagctgcggcatggcctgaatcgcgagcggttgctgcgcgaggaggactttgagcccgacgcgcgaaccgggattagtcccgcgcgcgcacacgtggcggccgccgacctggtaaccgcatacgagcagacggtgaaccaggagattaactttcaaaaaagctttaacaaccacgtgcgtacgcttgtggcgcgcgaggaggtggctataggactgatgcatctgtgggactttgtaagcgcgctggagcaaaacccaaatagcaagccgctcatggcgcagctgttccttatagtgcagcacagcagggacaacgaggcattcagggatgcgctgctaaacatagtagagcccgagggccgctggctgctcgatttgataaacatcctgcagagcatagtggtgcaggagcgcagcttgagcctggctgacaaggtggccgccatcaactattccatgcttagcctgggcaagttttacgcccgcaagatataccataccccttacgttcccatagacaaggaggtaaagatcgaggggttctacatgcgcatggcgctgaaggtgcttaccttgagcgacgacctgggcgtttatcgcaacgagcgcatccacaaggccgtgagcgtgagccggcggcgcgagctcagcgaccgcgagctgatgcacagcctgcaaagggccctggctggcacgggcagcggcgatagagaggccgagtcctactttgacgcgggcgctgacctgcgctgggccccaagccgacgcgccctggaggcagctggggccggacctgggctggcggtggcacccgcgcgcgctggcaacgtcggcggcgtggaggaatatgacgaggacgatgagtacgagccagaggacggcgagtactaagcggtgatgtttctgatcagatgatgcaagacgcaacggacccggcggtgcgggcggcgctgcagagccagccgtccggccttaactccacggacgactggcgccaggtcatggaccgcatcatgtcgctgactgcgcgcaatcctgacgcgttccggcagcagccgcaggccaaccggctctccgcaattctggaagcggtggtcccggcgcgcgcaaaccccacgcacgagaaggtgctggcgatcgtaaacgcgctggccgaaaacagggccatccggcccgacgaggccggcctggtctacgacgcgctgcttcagcgcgtggctcgttacaacagcggcaacgtgcagaccaacctggaccggctggtgggggatgtgcgcgaggccgtggcgcagcgtgagcgcgcgcagcagcagggcaacctgggctccatggttgcactaaacgccttcctgagtacacagcccgccaacgtgccgcggggacaggaggactacaccaactttgtgagcgcactgcggctaatggtgactgagacaccgcaaagtgaggtgtaccagtctgggccagactattttttccagaccagtagacaaggcctgcagaccgtaaacctgagccaggctttcaaaaacttgcaggggctgtggggggtgcgggctcccacaggcgaccgcgcgaccgtgtctagcttgctgacgcccaactcgcgcctgttgctgctgctaatagcgcccttcacggacagtggcagcgtgtcccgggacacatacctaggtcacttgctgacactgtaccgcgaggccataggtcaggcgcatgtggacgagcatactttccaggagattacaagtgtcagccgcgcgctggggcaggaggacacgggcagcctggaggcaaccctaaactacctgctgaccaaccggcggcagaagatcccctcgttgcacagtttaaacagcgaggaggagcgcattttgcgctacgtgcagcagagcgtgagccttaacctgatgcgcgacggggtaacgcccagcgtggcgctggacatgaccgcgcgcaacatggaaccgggcatgtatgcctcaaaccggccgtttatcaaccgcctaatggactacttgcatcgcgcggccgccgtgaaccccgagtatttcaccaatgccatcttgaacccgcactggctaccgccccctggtttctacaccgggggattcgaggtgcccgagggtaacgatggattcctctgggacgacatagacgacagcgtgttttccccgcaaccgcagaccctgctagagttgcaacagcgcgagcaggcagaggcggcgctgcgaaaggaaagcttccgcaggccaagcagcttgtccgatctaggcgctgcggccccgcggtcagatgctagtagcccatttccaagcttgatagggtctcttaccagcactcgcaccacccgcccgcgcctgctgggcgaggaggagtacctaaacaactcgctgctgcagccgcagcgcgaaaaaaacctgcctccggcatttcccaacaacgggatagagagcctagtggacaagatgagtagatggaagacgtacgcgcaggagcacagggacgtgccaggcccgcgcccgcccacccgtcgtcaaaggcacgaccgtcagcggggtctggtgtgggaggacgatgactcggcagacgacagcagcgtcctggatttgggagggagtggcaacccgtttgcgcaccttcgccccaggctggggagaatgttttaaaaaaaaaaaagcatgatgcaaaataaaaaactcaccaaggccatggcaccgagcgttggttttcttgtattccccttagtatgcggcgcgcggcgatgtatgaggaaggtcctcctccctcctacgagagtgtggtgagcgcggcgccagtggcggcggcgctgggttctcccttcgatgctcccctggacccgccgtttgtgcctccgcggtacctgcggcctaccggggggagaaacagcatccgttactctgagttggcacccctattcgacaccacccgtgtgtacctggtggacaacaagtcaacggatgtggcatccctgaactaccagaacgaccacagcaactttctgaccacggtcattcaaaacaatgactacagcccgggggaggcaagcacacagaccatcaatcttgacgaccggtcgcactggggcggcgacctgaaaaccatcctgcataccaacatgccaaatgtgaacgagttcatgtttaccaataagtttaaggcgcgggtgatggtgtcgcgcttgcctactaaggacaatcaggtggagctgaaatacgagtgggtggagttcacgctgcccgagggcaactactccgagaccatgaccatagaccttatgaacaacgcgatcgtggagcactacttgaaagtgggcagacagaacggggttctggaaagcgacatcggggtaaagtttgacacccgcaacttcagactggggtttgaccccgtcactggtcttgtcatgcctggggtatatacaaacgaagccttccatccagacatcattttgctgccaggatgcggggtggacttcacccacagccgcctgagcaacttgttgggcatccgcaagcggcaacccttccaggagggctttaggatcacctacgatgatctggagggtggtaacattcccgcactgttggatgtggacgcctaccaggcgagcttgaaagatgacaccgaacagggcgggggtggcgcaggcggcagcaacagcagtggcagcggcgcggaagagaactccaacgcggcagccgcggcaatgcagccggtggaggacatgaacgatcatgccattcgcggcgacacctttgccacacgggctgaggagaagcgcgctgaggccgaagcagcggccgaagctgccgcccccgctgcgcaacccgaggtcgagaagcctcagaagaaaccggtgatcaaacccctgacagaggacagcaagaaacgcagttacaacctaataagcaatgacagcaccttcacccagtaccgcagctggtaccttgcatacaactacggcgaccctcagaccggaatccgctcatggaccctgctttgcactcctgacgtaacctgcggctcggagcaggtctactggtcgttgccagacatgatgcaagaccccgtgaccttccgctccacgcgccagatcagcaactttccggtggtgggcgccgagctgttgcccgtgcactccaagagcttctacaacgaccaggccgtctactcccaactcatccgccagtttacctctctgacccacgtgttcaatcgctttcccgagaaccagattttggcgcgcccgccagcccccaccatcaccaccgtcagtgaaaacgttcctgctctcacagatcacgggacgctaccgctgcgcaacagcatcggaggagtccagcgagtgaccattactgacgccagacgccgcacctgcccctacgtttacaaggccctgggcatagtctcgccgcgcgtcctatcgagccgcactttttgagcaagcatgtccatccttatatcgcccagcaataacacaggctggggcctgcgcttcccaagcaagatgtttggcggggccaagaagcgctccgaccaacacccagtgcgcgtgcgcgggcactaccgcgcgccctggggcgcgcacaaacgcggccgcactgggcgcaccaccgtcgatgacgccatcgacgcggtggtggaggaggcgcgcaactacacgcccacgccgccaccagtgtccacagtggacgcggccattcagaccgtggtgcgcggagcccggcgctatgctaaaatgaagagacggcggaggcgcgtagcacgtcgccaccgccgccgacccggcactgccgcccaacgcgcggcggcggccctgcttaaccgcgcacgtcgcaccggccgacgggcggccatgcgggccgctcgaaggctggccgcgggtattgtcactgtgccccccaggtccaggcgacgagcggccgccgcagcagccgcggccattagtgctatgactcagggtcgcaggggcaacgtgtattgggtgcgcgactcggttagcggcctgcgcgtgcccgtgcgcacccgccccccgcgcaactagattgcaagaaaaaactacttagactcgtactgttgtatgtatccagcggcggcggcgcgcaacgaagctatgtccaagcgcaaaatcaaagaagagatgctccaggtcatcgcgccggagatctatggccccccgaagaaggaagagcaggattacaagccccgaaagctaaagcgggtcaaaaagaaaaagaaagatgatgatgatgaacttgacgacgaggtggaactgctgcacgctaccgcgcccaggcgacgggtacagtggaaaggtcgacgcgtaaaacgtgttttgcgacccggcaccaccgtagtctttacgcccggtgagcgctccacccgcacctacaagcgcgtgtatgatgaggtgtacggcgacgaggacctgcttgagcaggccaacgagcgcctcggggagtttgcctacggaaagcggcataaggacatgctggcgttgccgctggacgagggcaacccaacacctagcctaaagcccgtaacactgcagcaggtgctgcccgcgcttgcaccgtccgaagaaaagcgcggcctaaagcgcgagtctggtgacttggcacccaccgtgcagctgatggtacccaagcgccagcgactggaagatgtcttggaaaaaatgaccgtggaacctgggctggagcccgaggtccgcgtgcggccaatcaagcaggtggcgccgggactgggcgtgcagaccgtggacgttcagatacccactaccagtagcaccagtattgccaccgccacagagggcatggagacacaaacgtccccggttgcctcagcggtggcggatgccgcggtgcaggcggtcgctgcggccgcgtccaagacctctacggaggtgcaaacggacccgtggatgtttcgcgtttcagccccccggcgcccgcgcggttcgaggaagtacggcgccgccagcgcgctactgcccgaatatgccctacatccttccattgcgcctacccccggctatcgtggctacacctaccgccccagaagacgagcaactacccgacgccgaaccaccactggaacccgccgccgccgtcgccgtcgccagcccgtgctggccccgatttccgtgcgcagggtggctcgcgaaggaggcaggaccctggtgctgccaacagcgcgctaccaccccagcatcgtttaaaagccggtctttgtggttcttgcagatatggccctcacctgccgcctccgtttcccggtgccgggattccgaggaagaatgcaccgtaggaggggcatggccggccacggcctgacgggcggcatgcgtcgtgcgcaccaccggcggcggcgcgcgtcgcaccgtcgcatgcgcggcggtatcctgcccctccttattccactgatcgccgcggcgattggcgccgtgcccggaattgcatccgtggccttgcaggcgcagagacactgattaaaaacaagttgcatgtggaaaaatcaaaataaaaagtctggactctcacgctcgcttggtcctgtaactattttgtagaatggaagacatcaactttgcgtctctggccccgcgacacggctcgcgcccgttcatgggaaactggcaagatatcggcaccagcaatatgagcggtggcgccttcagctggggctcgctgtggagcggcattaaaaatttcggttccaccgttaagaactatggcagcaaggcctggaacagcagcacaggccagatgctgagggataagttgaaagagcaaaatttccaacaaaaggtggtagatggcctggcctctggcattagcggggtggtggacctggccaaccaggcagtgcaaaataagattaacagtaagcttgatccccgccctcccgtagaggagcctccaccggccgtggagacagtgtctccagaggggcgtggcgaaaagcgtccgcgccccgacagggaagaaactctggtgacgcaaatagacgagcctccctcgtacgaggaggcactaaagcaaggcctgcccaccacccgtcccatcgcgcccatggctaccggagtgctgggccagcacacacccgtaacgctggacctgcctccccccgccgacacccagcagaaacctgtgctgccaggcccgaccgccgttgttgtaacccgtcctagccgcgcgtccctgcgccgcgccgccagcggtccgcgatcgttgcggcccgtagccagtggcaactggcaaagcacactgaacagcatcgtgggtctgggggtgcaatccctgaagcgccgacgatgcttctgaatagctaacgtgtcgtatgtgtgtcatgtatgcgtccatgtcgccgccagaggagctgctgagccgccgcgcgcccgctttccaagatggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataaagaagcaagcaacatcaacaacagctgccgccatgggctccagtgagcaggaactgaaagccattgtcaaagatcttggttgtgggccatattttttgggcacctatgacaagcgctttccaggctttgtttctccacacaagctcgcctgcgccatagtcaatacggccggtcgcgagactgggggcgtacactggatggcctttgcctggaacccgcactcaaaaacatgctacctctttgagccctttggcttttctgaccagcgactcaagcaggtttaccagtttgagtacgagtcactcctgcgccgtagcgccattgcttcttcccccgaccgctgtataacgctggaaaagtccacccaaagcgtacaggggcccaactcggccgcctgtggactattctgctgcatgtttctccacgcctttgccaactggccccaaactcccatggatcacaaccccaccatgaaccttattaccggggtacccaactccatgctcaacagtccccaggtacagcccaccctgcgtcgcaaccaggaacagctctacagcttcctggagcgccactcgccctacttccgcagccacagtgcgcagattaggagcgccacttctttttgtcacttgaaaaacatgtaaaaataatgtactagagacactttcaataaaggcaaatgcttttatttgtacactctcgggtgattatttacccccacccttgccgtctgcgccgtttaaaaatcaaaggggttctgccgcgcatcgctatgcgccactggcagggacacgttgcgatactggtgtttagtgctccacttaaactcaggcacaaccatccgcggcagctcggtgaagttttcactccacaggctgcgcaccatcaccaacgcgtttagcaggtcgggcgccgatatcttgaagtcgcagttggggcctccgccctgcgcgcgcgagttgcgatacacagggttgcagcactggaacactatcagcgccgggtggtgcacgctggccagcacgctcttgtcggagatcagatccgcgtccaggtcctccgcgttgctcagggcgaacggagtcaactttggtagctgccttcccaaaaagggcgcgtgcccaggctttgagttgcactcgcaccgtagtggcatcaaaaggtgaccgtgcccggtctgggcgttaggatacagcgcctgcataaaagccttgatctgcttaaaagccacctgagcctttgcgccttcagagaagaacatgccgcaagacttgccggaaaactgattggccggacaggccgcgtcgtgcacgcagcaccttgcgtcggtgttggagatctgcaccacatttcggccccaccggttcttcacgatcttggccttgctagactgctccttcagcgcgcgctgcccgttttcgctcgtcacatccatttcaatcacgtgctccttatttatcataatgcttccgtgtagacacttaagctcgccttcgatctcagcgcagcggtgcagccacaacgcgcagcccgtgggctcgtgatgcttgtaggtcacctctgcaaacgactgcaggtacgcctgcaggaatcgccccatcatcgtcacaaaggtcttgttgctggtgaaggtcagctgcaacccgcggtgctcctcgttcagccaggtcttgcatacggccgccagagcttccacttggtcaggcagtagtttgaagttcgcctttagatcgttatccacgtggtacttgtccatcagcgcgcgcgcagcctccatgcccttctcccacgcagacacgatcggcacactcagcgggttcatcaccgtaatttcactttccgcttcgctgggctcttcctcttcctcttgcgtccgcataccacgcgccactgggtcgtcttcattcagccgccgcactgtgcgcttacctcctttgccatgcttgattagcaccggtgggttgctgaaacccaccatttgtagcgccacatcttctctttcttcctcgctgtccacgattacctctggtgatggcgggcgctcgggcttgggagaagggcgcttctttttcttcttgggcgcaatggccaaatccgccgccgaggtcgatggccgcgggctgggtgtgcgcggcaccagcgcgtcttgtgatgagtcttcctcgtcctcggactcgatacgccgcctcatccgcttttttgggggcgcccggggaggcggcggcgacggggacggggacgacacgtcctccatggttgggggacgtcgcgccgcaccgcgtccgcgctcgggggtggtttcgcgctgctcctcttcccgactggccatttccttctcctataggcagaaaaagatcatggagtcagtcgagaagaaggacagcctaaccgccccctctgagttcgccaccaccgcctccaccgatgccgccaacgcgcctaccaccttccccgtcgaggcacccccgcttgaggaggaggaagtgattatcgagcaggacccaggttttgtaagcgaagacgacgaggaccgctcagtaccaacagaggataaaaagcaagaccaggacaacgcagaggcaaacgaggaacaagtcgggcggggggacgaaaggcatggcgactacctagatgtgggagacgacgtgctgttgaagcatctgcagcgccagtgcgccattatctgcgacgcgttgcaagagcgcagcgatgtgcccctcgccatagcggatgtcagccttgcctacgaacgccacctattctcaccgcgcgtaccccccaaacgccaagaaaacggcacatgcgagcccaacccgcgcctcaacttctaccccgtatttgccgtgccagaggtgcttgccacctatcacatctttttccaaaactgcaagatacccctatcctgccgtgccaaccgcagccgagcggacaagcagctggccttgcggcagggcgctgtcatacctgatatcgcctcgctcaacgaagtgccaaaaatctttgagggtcttggacgcgacgagaagcgcgcggcaaacgctctgcaacaggaaaacagcgaaaatgaaagtcactctggagtgttggtggaactcgagggtgacaacgcgcgcctagccgtactaaaacgcagcatcgaggtcacccactttgcctacccggcacttaacctaccccccaaggtcatgagcacagtcatgagtgagctgatcgtgcgccgtgcgcagcccctggagagggatgcaaatttgcaagaacaaacagaggagggcctacccgcagttggcgacgagcagctagcgcgctggcttcaaacgcgcgagcctgccgacttggaggagcgacgcaaactaatgatggccgcagtgctcgttaccgtggagcttgagtgcatgcagcggttctttgctgacccggagatgcagcgcaagctagaggaaacattgcactacacctttcgacagggctacgtacgccaggcctgcaagatctccaacgtggagctctgcaacctggtctcctaccttggaattttgcacgaaaaccgccttgggcaaaacgtgcttcattccacgctcaagggcgaggcgcgccgcgactacgtccgcgactgcgtttacttatttctatgctacacctggcagacggccatgggcgtttggcagcagtgcttggaggagtgcaacctcaaggagctgcagaaactgctaaagcaaaacttgaaggacctatggacggccttcaacgagcgctccgtggccgcgcacctggcggacatcattttccccgaacgcctgcttaaaaccctgcaacagggtctgccagacttcaccagtcaaagcatgttgcagaactttaggaactttatcctagagcgctcaggaatcttgcccgccacctgctgtgcacttcctagcgactttgtgcccattaagtaccgcgaatgccctccgccgctttggggccactgctaccttctgcagctagccaactaccttgcctaccactctgacataatggaagacgtgagcggtgacggtctactggagtgtcactgtcgctgcaacctatgcaccccgcaccgctccctggtttgcaattcgcagctgcttaacgaaagtcaaattatcggtacctttgagctgcagggtccctcgcctgacgaaaagtccgcggctccggggttgaaactcactccggggctgtggacgtcggcttaccttcgcaaatttgtacctgaggactaccacgcccacgagattaggttctacgaagaccaatcccgcccgccaaatgcggagcttaccgcctgcgtcattacccagggccacattcttggccaattgcaagccatcaacaaagcccgccaagagtttctgctacgaaagggacggggggtttacttggacccccagtccggcgaggagctcaacccaatccccccgccgccgcagccctatcagcagcagccgcgggcccttgcttcccaggatggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggaggacatgatggaagactgggagagcctagacgaggaagcttccgaggtcgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaatcggcaaccggttccagcatggctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaagcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcatggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcggcagcaacagcagcggccacacagaagcaaaggcgaccggatagcaagactctgacaaagcccaagaaatccacagcggcggcagcagcaggaggaggagcgctgcgtctggcgcccaacgaacccgtatcgacccgcgagcttagaaacaggatttttcccactctgtatgctatatttcaacagagcaggggccaagaacaagagctgaaaataaaaaacaggtctctgcgatccctcacccgcagctgcctgtatcacaaaagcgaagatcagcttcggcgcacgctggaagacgcggaggctctcttcagtaaatactgcgcgctgactcttaaggactagtttcgcgccctttctcaaatttaagcgcgaaaactacgtcatctccagcggccacacccggcgccagcacctgtcgtcagcgccattatgagcaaggaaattcccacgccctacatgtggagttaccagccacaaatgggacttgcggctggagctgcccaagactactcaacccgaataaactacatgagcgcgggaccccacatgatatcccgggtcaacggaatccgcgcccaccgaaaccgaattctcttggaacaggcggctattaccaccacacctcgtaataaccttaatccccgtagttggcccgctgccctggtgtaccaggaaagtcccgctcccaccactgtggtacttcccagagacgcccaggccgaagttcagatgactaactcaggggcgcagcttgcgggcggctttcgtcacagggtgcggtcgcccgggcagggtataactcacctgacaatcagagggcgaggtattcagctcaacgacgagtcggtgagctcctcgcttggtctccgtccggacgggacatttcagatcggcggcgccggccgtccttcattcacgcctcgtcaggcaatcctaactctgcagacctcgtcctctgagccgcgctctggaggcattggaactctgcaatttattgaggagtttgtgccatcggtctactttaaccccttctcgggacctcccggccactatccggatcaatttattcctaactttgacgcggtaaaggactcggcggacggctacgactgaatgttaagtggagaggcagagcaactgcgcctgaaacacctggtccactgtcgccgccacaagtgctttgcccgcgactccggtgagttttgctactttgaattgcccgaggatcatatcgagggcccggcgcacggcgtccggcttaccgcccagggagagcttgcccgtagcctgattcgggagtttacccagcgccccctgctagttgagcgggacaggggaccctgtgttctcactgtgatttgcaactgtcctaaccttggattacatcaagatctttgttgccatctctgtgctgagtataataaatacagaaattaaaatatactggggctcctatcgccatcctgtaaacgccaccgtcttcacccgcccaagcaaaccaaggcgaaccttacctggtacttttaacatctctccctctgtgatttacaacagtttcaacccagacggagtgagtctacgagagaacctctccgagctcagctactccatcagaaaaaacaccaccctccttacctgccgggaacgtacgagtgcgtcaccggccgctgcaccacacctaccgcctgaccgtaaaccagactttttccggacagacctcaataactctgtttaccagaacaggaggtgagcttagaaaacccttagggtattaggccaaaggcgcagctactgtggggtttatgaacaattcaagcaactctacgggctattctaattcaggtttctctagaatcggggttggggttattctctgtcttgtgattctctttattcttatactaacgcttctctgcctaaggctcgccgcctgctgtgtgcacatttgcatttattgtcagctttttaaacgctggggtcgccacccaagatgattaggtacataatcctaggtttactcacccttgcgtcagcccacggtaccacccaaaaggtggattttaaggagccagcctgtaatgttacattcgcagctgaagctaatgagtgcaccactcttataaaatgcaccacagaacatgaaaagctgcttattcgccacaaaaacaaaattggcaagtatgctgtttatgctatttggcagccaggtgacactacagagtataatgttacagttttccagggtaaaagtcataaaacttttatgtatacttttccattttatgaaatgtgcgacattaccatgtacatgagcaaacagtataagttgtggcccccacaaaattgtgtggaaaacactggcactttctgctgcactgctatgctaattacagtgctcgctttggtctgtaccctactctatattaaatacaaaagcagacgcagctttattgaggaaaagaaaatgccttaatttactaagttacaaagctaatgtcaccactaactgctttactcgctgcttgcaaaacaaattcaaaaagttagcattataattagaataggatttaaaccccccggtcatttcctgctcaataccattcccctgaacaattgactctatgtgggatatgctccagcgctacaaccttgaagtcaggcttcctggatgtcagcatctgactttggccagcacctgtcccgcggatttgttccagtccaactacagcgacccaccctaacagagatgaccaacacaaccaacgcggccgccgctaccggacttacatctaccacaaatacaccccaagtttctgcctttgtcaataactgggataacttgggcatgtggtggttctccatagcgcttatgtttgtatgccttattattatgtggctcatctgctgcctaaagcgcaaacgcgcccgaccacccatctatagtcccatcattgtgctacacccaaacaatgatggaatccatagattggacggactgaaacacatgttcttttctcttacagtatgattaaatgagacatgattcctcgagtttttatattactgacccttgttgcgcttttttgtgcgtgctccacattggctgcggtttctcacatcgaagtagactgcattccagccttcacagtctatttgctttacggatttgtcaccctcacgctcatctgcagcctcatcactgtggtcatcgcctttatccagtgcattgactgggtctgtgtgcgctttgcatatctcagacaccatccccagtacagggacaggactatagctgagcttcttagaattctttaattatgaaatttactgtgacttttctgctgattatttgcaccctatctgcgttttgttccccgacctccaagcctcaaagacatatatcatgcagattcactcgtatatggaatattccaagttgctacaatgaaaaaagcgatctttccgaagcctggttatatgcaatcatctctgttatggtgttctgcagtaccatcttagccctagctatatatccctaccttgacattggctggaaacgaatagatgccatgaaccacccaactttccccgcgcccgctatgcttccactgcaacaagttgttgccggcggctttgtcccagccaatcagcctcgccccacttctcccacccccactgaaatcagctactttaatctaacaggaggagatgactgacaccctagatctagaaatggacggaattattacagagcagcgcctgctagaaagacgcagggcagcggccgagcaacagcgcatgaatcaagagctccaagacatggttaacttgcaccagtgcaaaaggggtatcttttgtctggtaaagcaggccaaagtcacctacgacagtaataccaccggacaccgccttagctacaagttgccaaccaagcgtcagaaattggtggtcatggtgggagaaaagcccattaccataactcagcactcggtagaaaccgaaggctgcattcactcaccttgtcaaggacctgaggatctctgcacccttattaagaccctgtgcggtctcaaagatcttattccctttaactaataaaaaaaaataataaagcatcacttacttaaaatcagttagcaaatttctgtccagtttattcagcagcacctccttgccctcctcccagctctggtattgcagcttcctcctggctgcaaactttctccacaatctaaatggaatgtcagtttcctcctgttcctgtccatccgcacccactatcttcatgttgttgcagatgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggggtactctctttgcgcctatccgaacctctagttacctccaatggcatgcttgcgctcaaaatgggcaacggcctctctctggacgaggccggcaaccttacctcccaaaatgtaaccactgtgagcccacctctcaaaaaaaccaagtcaaacataaacctggaaatatctgcacccctcacagttacctcagaagccctaactgtggctgccgccgcacctctaatggtcgcgggcaacacactcaccatgcaatcacaggccccgctaaccgtgcacgactccaaacttagcattgccacccaaggacccctcacagtgtcagaaggaaagctagccctgcaaacatcaggccccctcaccaccaccgatagcagtacccttactatcactgcctcaccccctctaactactgccactggtagcttgggcattgacttgaaagagcccatttatacacaaaatggaaaactaggactaaagtacggggctcctttgcatgtaacagacgacctaaacactttgaccgtagcaactggtccaggtgtgactattaataatacttccttgcaaactaaagttactggagccttgggttttgattcacaaggcaatatgcaacttaatgtagcaggaggactaaggattgattctcaaaacagacgccttatacttgatgttagttatccgtttgatgctcaaaaccaactaaatctaagactaggacagggccctctttttataaactcagcccacaacttggatattaactacaacaaaggcctttacttgtttacagcttcaaacaattccaaaaagcttgaggttaacctaagcactgccaaggggttgatgtttgacgctacagccatagccattaatgcaggagatgggcttgaatttggttcacctaatgcaccaaacacaaatcccctcaaaacaaaaattggccatggcctagaatttgattcaaacaaggctatggttcctaaactaggaactggccttagttttgacagcacaggtgccattacagtaggaaacaaaaataatgataagctaactttgtggaccacaccagctccatctcctaactgtagactaaatgcagagaaagatgctaaactcactttggtcttaacaaaatgtggcagtcaaatacttgctacagtttcagttttggctgttaaaggcagtttggctccaatatctggaacagttcaaagtgctcatcttattataagatttgacgaaaatggagtgctactaaacaattccttcctggacccagaatattggaactttagaaatggagatcttactgaaggcacagcctatacaaacgctgttggatttatgcctaacctatcagcttatccaaaatctcacggtaaaactgccaaaagtaacattgtcagtcaagtttacttaaacggagacaaaactaaacctgtaacactaaccattacactaaacggtacacaggaaacaggagacacaactccaagtgcatactctatgtcattttcatgggactggtctggccacaactacattaatgaaatatttgccacatcctcttacactttttcatacattgcccaagaataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatttttcaattgcagaaaatttcaagtcatttttcattcagtagtatagccccaccaccacatagcttatacagatcaccgtaccttaatcaaactcacagaaccctagtattcaacctgccacctccctcccaacacacagagtacacagtcctttctccccggctggccttaaaaagcatcatatcatgggtaacagacatattcttaggtgttatattccacacggtttcctgtcgagccaaacgctcatcagtgatattaataaactccccgggcagctcacttaagttcatgtcgctgtccagctgctgagccacaggctgctgtccaacttgcggttgcttaacgggcggcgaaggagaagtccacgcctacatgggggtagagtcataatcgtgcatcaggatagggcggtggtgctgcagcagcgcgcgaataaactgctgccgccgccgctccgtcctgcaggaatacaacatggcagtggtctcctcagcgatgattcgcaccgcccgcagcataaggcgccttgtcctccgggcacagcagcgcaccctgatctcacttaaatcagcacagtaactgcagcacagcaccacaatattgttcaaaatcccacagtgcaaggcgctgtatccaaagctcatggcggggaccacagaacccacgtggccatcataccacaagcgcaggtagattaagtggcgacccctcataaacacgctggacataaacattacctcttttggcatgttgtaattcaccacctcccggtaccatataaacctctgattaaacatggcgccatccaccaccatcctaaaccagctggccaaaacctgcccgccggctatacactgcagggaaccgggactggaacaatgacagtggagagcccaggactcgtaaccatggatcatcatgctcgtcatgatatcaatgttggcacaacacaggcacacgtgcatacacttcctcaggattacaagctcctcccgcgttagaaccatatcccagggaacaacccattcctgaatcagcgtaaatcccacactgcagggaagacctcgcacgtaactcacgttgtgcattgtcaaagtgttacattcgggcagcagcggatgatcctccagtatggtagcgcgggtttctgtctcaaaaggaggtagacgatccctactgtacggagtgcgccgagacaaccgagatcgtgttggtcgtagtgtcatgccaaatggaacgccggacgtagtcatatttcctgaagcaaaaccaggtgcgggcgtgacaaacagatctgcgtctccggtctcgccgcttagatcgctctgtgtagtagttgtagtatatccactctctcaaagcatccaggcgccccctggcttcgggttctatgtaaactccttcatgcgccgctgccctgataacatccaccaccgcagaataagccacacccagccaacctacacattcgttctgcgagtcacacacgggaggagcgggaagagctggaagaaccatgtttttttttttattccaaaagattatccaaaacctcaaaatgaagatctattaagtgaacgcgctcccctccggtggcgtggtcaaactctacagccaaagaacagataatggcatttgtaagatgttgcacaatggcttccaaaaggcaaacggccctcacgtccaagtggacgtaaaggctaaacccttcagggtgaatctcctctataaacattccagcaccttcaaccatgcccaaataattctcatctcgccaccttctcaatatatctctaagcaaatcccgaatattaagtccggccattgtaaaaatctgctccagagcgccctccaccttcagcctcaagcagcgaatcatgattgcaaaaattcaggttcctcacagacctgtataagattcaaaagcggaacattaacaaaaataccgcgatcccgtaggtcccttcgcagggccagctgaacataatcgtgcaggtctgcacggaccagcgcggccacttccccgccaggaaccatgacaaaagaacccacactgattatgacacgcatactcggagctatgctaaccagcgtagccccgatgtaagcttgttgcatgggcggcgatataaaatgcaaggtgctgctcaaaaaatcaggcaaagcctcgcgcaaaaaagaaagcacatcgtagtcatgctcatgcagataaaggcaggtaagctccggaaccaccacagaaaaagacaccatttttctctcaaacatgtctgcgggtttctgcataaacacaaaataaaataacaaaaaaacatttaaacattagaagcctgtcttacaacaggaaaaacaacccttataagcataagacggactacggccatgccggcgtgaccgtaaaaaaactggtcaccgtgattaaaaagcaccaccgacagctcctcggtcatgtccggagtcataatgtaagactcggtaaacacatcaggttgattcacatcggtcagtgctaaaaagcgaccgaaatagcccgggggaatacatacccgcaggcgtagagacaacattacagcccccataggaggtataacaaaattaataggagagaaaaacacataaacacctgaaaaaccctcctgcctaggcaaaatagcaccctcccgctccagaacaacatacagcgcttccacagcggcagccataacagtcagccttaccagtaaaaaagaaaacctattaaaaaaacaccactcgacacggcaccagctcaatcagtcacagtgtaaaaaagggccaagtgcagagcgagtatatataggactaaaaaatgacgtaacggttaaagtccacaaaaaacacccagaaaaccgcacgcgaacctacgcccagaaacgaaagccaaaaaacccacaacttcctcaaatcgtcacttccgttttcccacgttacgtaacttcccattttaagaaaactacaattcccaacacatacaagttactccgccctaaaacctacgtcacccgccccgttcccacgccccgcgccacgtcacaaactccaccccctcattatcatattggcttcaatccaaaataaggtatattattgatgatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (9)
1. Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа Н3, содержащий:
- геном аденовируса человека 5-го серотипа, за исключением Е1 области, где удалены один или более эндогенных нуклеотидов с потерей её функциональной активности, и E3 области, где удалены один или более эндогенных нуклеотидов с потерей её функциональной активности;
- экспрессионную кассету в месте удаления E1 области генома аденовируса, включающую: промотор, модифицированный ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа Н3, с последовательностью SEQ ID NO: 1, последовательность сигнала полиаденилирования.
2. Экспрессионный вектор по п.1, отличающийся тем, что геном аденовируса человека 5-го серотипа представлен SEQ ID NO: 2.
3. Экспрессионный вектор по п.1, отличающийся тем, что экспрессионная кассета в месте удаления Е1 области генома аденовируса включает регулируемый промотор, при этом в экспрессионный вектор в месте удаления Е3 области генома аденовируса дополнительно помещается экспрессионная кассета, включающая: конститутивный промотор, ген активатора транскрипции для регулируемого промотора, последовательность сигнала полиаденилирования.
4. Экспрессионный вектор по п.3, отличающийся тем, что экспрессия модифицированного гена гемагглютинина вируса гриппа А субтипа Н3 в эукариотической клетке негативно регулируется в присутствии антибиотика тетрациклинового ряда.
5. Фармацевтическая композиция для защиты от вирусов гриппа А субтипа Н3, содержащая в эффективном количестве экспрессионный вектор по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый буферный раствор.
6. Применение фармацевтической композиции по п.5 для защиты субъекта от вирусов гриппа А субтипа Н3.
7. Применение фармацевтической композиции по п.5 в составе противогриппозной векторной вакцины.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814189C1 true RU2814189C1 (ru) | 2024-02-26 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107427571A (zh) * | 2014-12-31 | 2017-12-01 | 美利坚合众国,由健康及人类服务部部长代表 | 基于纳米颗粒的新型多价疫苗 |
| RU2751485C1 (ru) * | 2021-06-14 | 2021-07-14 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 |
| EP2934581B1 (en) * | 2012-12-18 | 2022-09-14 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2934581B1 (en) * | 2012-12-18 | 2022-09-14 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| CN107427571A (zh) * | 2014-12-31 | 2017-12-01 | 美利坚合众国,由健康及人类服务部部长代表 | 基于纳米颗粒的新型多价疫苗 |
| RU2751485C1 (ru) * | 2021-06-14 | 2021-07-14 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Powell et al. | Pseudotyped influenza A virus as a vaccine for the induction of heterotypic immunity | |
| CA3156350A1 (en) | IMMUNOBIOLOGICAL AGENT FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNITY AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-COV-2) | |
| TWI605124B (zh) | 新穎桿狀病毒載體及使用方法 | |
| Weaver et al. | Protection against divergent influenza H1N1 virus by a centralized influenza hemagglutinin | |
| Vassilieva et al. | Enhanced mucosal immune responses to HIV virus-like particles containing a membrane-anchored adjuvant | |
| Fan et al. | Targeting the HA2 subunit of influenza A virus hemagglutinin via CD40L provides universal protection against diverse subtypes | |
| Guo et al. | Protection against multiple influenza A virus subtypes by intranasal administration of recombinant nucleoprotein | |
| WO2016176624A2 (en) | Porcine pestvirus, vaccines, and assays | |
| US11389523B2 (en) | Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (HA) protein | |
| Kim et al. | A single subcutaneous or intranasal immunization with adenovirus‐based SARS‐CoV‐2 vaccine induces robust humoral and cellular immune responses in mice | |
| Rice et al. | A next generation bivalent human Ad5 COVID-19 vaccine delivering both spike and nucleocapsid antigens elicits Th1 dominant CD4+, CD8+ T-cell and neutralizing antibody responses | |
| Victor et al. | A replication-incompetent PB2-knockout influenza A virus vaccine vector | |
| US20180326040A1 (en) | Influenza virus vaccine and vaccine platform | |
| Kim et al. | Oral immunization with a novel attenuated Salmonella Typhimurium encoding influenza HA, M2e and NA antigens protects chickens against H7N9 infection | |
| Cao et al. | A single vaccine protects against SARS-CoV-2 and influenza virus in mice | |
| Zhou et al. | Sequential immunization with consensus influenza hemagglutinins raises cross-reactive neutralizing antibodies against various heterologous HA strains | |
| Chen et al. | Efficacy of live-attenuated H9N2 influenza vaccine candidates containing NS1 truncations against H9N2 avian influenza viruses | |
| Yin et al. | Protein transduction domain-mediated influenza NP subunit vaccine generates a potent immune response and protection against influenza virus in mice | |
| Srivastava et al. | Induction of potent and durable neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 using a receptor binding domain-based immunogen | |
| JP2023522154A (ja) | インフルエンザワクチン | |
| Zhou et al. | One HA stalk topping multiple heads as a novel influenza vaccine | |
| Özcengiz et al. | Two formulations of coronavirus disease‐19 recombinant subunit vaccine candidate made up of S1 fragment protein P1, S2 fragment protein P2, and nucleocapsid protein elicit strong immunogenicity in mice | |
| RU2751485C1 (ru) | Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 | |
| RU2814189C1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа H3 и фармацевтическая композиция на его основе. | |
| RU2802753C1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, индуцирующий кросс-протективный иммунитет к вирусам гриппа А субтипа Н1, и фармацевтическая композиция на его основе |