RU2812800C1 - Method of predicting relapse of hepatitis d after completion of antiviral therapy - Google Patents
Method of predicting relapse of hepatitis d after completion of antiviral therapy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812800C1 RU2812800C1 RU2023127273A RU2023127273A RU2812800C1 RU 2812800 C1 RU2812800 C1 RU 2812800C1 RU 2023127273 A RU2023127273 A RU 2023127273A RU 2023127273 A RU2023127273 A RU 2023127273A RU 2812800 C1 RU2812800 C1 RU 2812800C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hepatitis
- antiviral therapy
- rna
- pcr
- weeks
- Prior art date
Links
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 claims abstract description 88
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 claims abstract description 86
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 47
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 13
- 229940061603 bulevirtide Drugs 0.000 description 11
- 208000010471 Chronic Hepatitis D Diseases 0.000 description 10
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 10
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 8
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 7
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000002091 elastography Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 5
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 5
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 4
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 4
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 3
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 2
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 2
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 2
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 108010092851 peginterferon alfa-2b Proteins 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 210000000955 splenic vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241001515849 Satellite Viruses Species 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000012788 optical film Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007232 portal hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, инфекционным болезням и онкологии, и предназначено для прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии.The invention relates to medicine, namely to hepatology, infectious diseases and oncology, and is intended to predict relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy.
Вирус гепатита D (HDV) - открытый в 1977 г. дефектный вирус-сателлит вируса гепатита В (HBV), не имеющий собственных ферментных систем и оболочки, использующий полимеразы клетки для репликации и HBsAg для построения оболочки. Распространенность хронической HDV-инфекции составляет в среднем 4,5% от HBsAg-позитивных лиц, или не менее 12 млн инфицированных HDV в мире. Присоединение HDV к текущей инфекции HBV (суперинфекция HDV) с высокой частотой (до 90%) приводит к развитию хронического гепатита D (ХГD) - наиболее тяжелой и быстропрогрессирующей формы хронического вирусного гепатита, характеризующейся ускоренным, в течение 5-10 лет, формированием цирроза печени у 70-80% пациентов, у 15% - в течение 2 лет, и значительно более высоким риском печеночной недостаточности, гепатоцеллюлярного рака и смерти по сравнению с хроническим гепатитом В.Hepatitis D virus (HDV) is a defective satellite virus of the hepatitis B virus (HBV), discovered in 1977, which does not have its own enzyme systems and envelope, uses cell polymerases for replication and HBsAg to build the envelope. The prevalence of chronic HDV infection averages 4.5% of HBsAg-positive individuals, or at least 12 million HDV-infected individuals worldwide. The addition of HDV to a current HBV infection (HDV superinfection) with a high frequency (up to 90%) leads to the development of chronic hepatitis D (CHD) - the most severe and rapidly progressive form of chronic viral hepatitis, characterized by accelerated, over 5-10 years, the formation of liver cirrhosis in 70-80% of patients, 15% within 2 years, and a significantly higher risk of liver failure, hepatocellular cancer and death compared with chronic hepatitis B.
Оценка ответа на противовирусную терапию пациентов с ХГD основана на обнаружении и количественном определении вирусной РНК в сыворотке крови. Однако разработка надежных методов анализа ответа на противовирусную терапию затруднена ввиду отсутствия корреляции авиремии и достижения устойчивого вирусологического ответа, то есть стойкого отсутствия РНК вируса гепатита D в сыворотке крови после завершения лечения. Отсутствие валидной тест-системы для количественной оценки виремии также обусловлено гетерогенностью вируса (по меньшей мере 8 генотипов), быстрой эволюцией возбудителя и особенностями вторичной структуры РНК. Различные методики экстракции HDV РНК, дизайн тестовых праймеров и зондов, общие недостатки стандартизации способствуют существенной вариабельности эксплуатационных характеристик исследовательских и коммерческих тестов. Многими лабораториями для определения предела чувствительности их тестов используется доступный уже более 10 лет стандарт ВОЗ на РНК HDV, который облегчает сравнение уровней РНК в разных исследовательских центрах.Assessing the response to antiviral therapy in patients with chronic hepatitis D is based on the detection and quantification of viral RNA in blood serum. However, the development of reliable methods for analyzing the response to antiviral therapy is difficult due to the lack of correlation between aviremia and the achievement of a sustained virological response, that is, a persistent absence of hepatitis D virus RNA in the blood serum after completion of treatment. The lack of a valid test system for quantitative assessment of viremia is also due to the heterogeneity of the virus (at least 8 genotypes), the rapid evolution of the pathogen and the characteristics of the secondary structure of RNA. Various HDV RNA extraction techniques, test primer and probe designs, and general standardization deficiencies contribute to significant variability in the performance characteristics of research and commercial tests. Many laboratories use the WHO standard for HDV RNA, which has been available for over 10 years, to determine the limit of sensitivity of their tests, which facilitates comparison of RNA levels between different research centers.
Главная задача лечения хронических вирусных гепатитов - стойкое подавление репликации вируса, в идеале - сохраняющееся после завершения противовирусной терапии. При лечении хронического гепатита С это называется достижением устойчивого вирусологического ответа, достижение устойчивого вирусологического ответа при лечении хронического гепатита В крайне маловероятно и требует постоянного продолжения противовирусной терапии. Возможность достижения устойчивого вирусологического ответа при лечении гепатита D возможна, но продолжительность терапии до сих пор не определена. Недостатком существующего способа оценки эффективности противовирусного лечения является отсутствие возможности предикции рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии несмотря негативный результат ПНР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови. Несмотря на длительный, от 36 до 96 недель, негативный результат ПНР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови на фоне противовирусной терапии, у большинства пациентов развивается рецидив гепатита D. Вероятность рецидива гепатита D не коррелирует со скоростью наступления и длительностью сохранения негативного результата ПНР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови на фоне противовирусной терапии.The main goal of treatment of chronic viral hepatitis is persistent suppression of viral replication, ideally persisting after completion of antiviral therapy. In the treatment of chronic hepatitis C, this is called achieving a sustained virological response; achieving a sustained virological response in the treatment of chronic hepatitis B is extremely unlikely and requires constant continuation of antiviral therapy. The possibility of achieving a sustained virological response in the treatment of hepatitis D is possible, but the duration of therapy has not yet been determined. The disadvantage of the existing method for assessing the effectiveness of antiviral treatment is the inability to predict relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy despite a negative PNR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum. Despite a long-term, 36 to 96 weeks, negative PNR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum during antiviral therapy, most patients develop a relapse of hepatitis D. The likelihood of hepatitis D relapse does not correlate with the rate of onset and duration of the negative PNR test result. Hepatitis D virus RNA in blood serum during antiviral therapy.
Так, в уровне техники известен способ прогноза рецидива или стойкой ремиссии хронического гепатита С после интерферонотерапии (патент республики Беларусь BY 11036 С1, опубл. 30.08.2008 г.), заключающийся в том, что до и после интерферонотерапии в биоптате печени определяют гистологический индекс активности, а после интерферонотерапии дополнительно определяют количество агрессивных лимфоцитов из расчета на 100 синусоидов печени и при снижении гистологического индекса активности до 4 и менее и отсутствии или наличии единичных агрессивных лимфоцитов в 100 синусоидах печени прогнозируют стойкую ремиссию, а при снижении гистологического индекса активности до 4 и менее и наличии 30 и более агрессивных лимфоцитов в 100 синусоидах печени прогнозируют рецидив. Недостатками данного способа является, во-первых, то, что способ не предназначен для прогнозирования рецидива гепатита D, а, во-вторых, то, что прогностические маркеры данного способа являются косвенными.Thus, in the state of the art there is a known method for predicting relapse or stable remission of chronic hepatitis C after interferon therapy (patent of the Republic of Belarus BY 11036 C1, published on August 30, 2008), which consists in determining the histological activity index in a liver biopsy before and after interferon therapy , and after interferon therapy, the number of aggressive lymphocytes is additionally determined per 100 liver sinusoids, and when the histological activity index decreases to 4 or less and the absence or presence of single aggressive lymphocytes in 100 liver sinusoids, stable remission is predicted, and when the histological activity index decreases to 4 or less and the presence of 30 or more aggressive lymphocytes in 100 liver sinusoids predict relapse. The disadvantages of this method are, firstly, that the method is not intended to predict relapse of hepatitis D, and, secondly, that the prognostic markers of this method are indirect.
Также в уровне техники известен способ прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии (Галимова С.Ф., Хронический гепатит D, Доказательная гастроэнтерология, 3-4, 2015, с. 32-42), заключающийся в оценке прогностического индекса ожидаемого события для пациентов с хронической HDV-инфекцией (baseline-event-anticipation - ВЕА) и оценке уровня anti-HDV IgM. Факторами, ассоциированными с неблагоприятным отдаленным прогнозом, были возраст (старше 40 лет), мужской пол, тромбоцитопения, высокий уровень билирубина и протромбинового времени, а также происхождение пациентов (жители Средиземноморья). Уровень anti-HDV IgM также может применяться в оценке активности заболевания, прогноза и при решении вопроса о сроках проведения противовирусной терапии. Однако недостатками данного способа являются его сложность, крайне невысокая точность и косвенность прогностических критериев.Also in the state of the art there is a method for predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy (Galimova S.F., Chronic hepatitis D, Evidence-based gastroenterology, 3-4, 2015, pp. 32-42), which consists in assessing the prognostic index of the expected event for patients with chronic HDV infection (baseline-event-anticipation - BEA) and assessing the level of anti-HDV IgM. Factors associated with poor long-term prognosis were age (over 40 years), male sex, thrombocytopenia, high bilirubin and prothrombin time, and the origin of the patients (Mediterranean residents). The anti-HDV IgM level can also be used in assessing disease activity, prognosis, and when deciding on the timing of antiviral therapy. However, the disadvantages of this method are its complexity, extremely low accuracy and indirectness of prognostic criteria.
Также из уровня техники известен способ прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии (Хронический вирусный гепатит D (ХВГD) у взрослых, Клинические рекомендации, 2021 г., с. 14), включающий проведение ПЦР на определение РНК вируса гепатита D в биоматериале (сыворотке крови) пациента, полученном по окончании лечения, выбранный нами за прототип. Качественное определение РНК вируса гепатита D (Hepatitis D virus) в крови методом ПЦР рекомендуется пациентам с ХВГГ), завершившим этиотропное (противовирусное) лечение, через 24 недель после завершения лечения, для прогнозирования рецидива гепатита D. Недостатком способа является его низкая точность и отсутствие корреляции со стойким исчезновением РНК HDV в крови пациента после завершения противовирусной терапии.Also known from the prior art is a method for predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy (Chronic viral hepatitis D (CVD) in adults, Clinical guidelines, 2021, p. 14), including PCR to determine hepatitis D virus RNA in biomaterial (serum blood) of the patient obtained at the end of treatment, chosen by us as a prototype. Qualitative determination of hepatitis D virus RNA in the blood by PCR is recommended for patients with chronic hepatitis D virus who have completed etiotropic (antiviral) treatment, 24 weeks after completion of treatment, to predict relapse of hepatitis D. The disadvantage of this method is its low accuracy and lack of correlation with persistent disappearance of HDV RNA in the patient’s blood after completion of antiviral therapy.
Таким образом, существует потребность в способе прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии, лишенном вышеуказанных недостатков.Thus, there is a need for a method for predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy that does not have the above-mentioned disadvantages.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии за счет раннего выявления РНК вируса гепатита D в гепатобиоптате, подготовленном определенным образом, что, в свою очередь позволит улучшить результаты лечения гепатита D.The technical result of the proposed method is to increase the accuracy of predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy due to the early detection of hepatitis D virus RNA in a hepatobiopsy prepared in a certain way, which, in turn, will improve the results of treatment of hepatitis D.
Для достижения указанного технического результата в способе прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии, включающем проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) на определение РНК вируса гепатита D в сыворотке крови пациента, полученном по окончании лечения, предлагается в качестве биоматериала использовать также гепатобиоптат пациента, полученный в результате пункционной биопсии печени, к которому добавляют 0,5 мл лизирующего раствора и перемешивают пипетированием 3-4 раза, полученный образец помещают в термостат при 65°С на 10 минут, в процессе термостатирования образец перемешивают пипетированием 2 раза, после чего центрифугируют в течение 1 минуты при 13000 об/мин, для проведения ПЦР используют полученную из образца надосадочную жидкость и набор реагентов для качественного определения РНК вируса гепатита D в сыворотке крови; и при получении положительного результата ПЦР на РНК вируса гепатита D в гепатобиоптате, несмотря на отрицательный результат ПЦР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови, прогнозируют наступление рецидива гепатита D в течение 4-24 недель после окончания лечения.To achieve the specified technical result in the method for predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy, including carrying out a polymerase chain reaction (PCR) to determine the RNA of the hepatitis D virus in the patient's blood serum obtained at the end of treatment, it is proposed to also use the patient's hepatobiopsy as a biomaterial, obtained as a result of a puncture biopsy of the liver, to which 0.5 ml of lysis solution is added and mixed by pipetting 3-4 times, the resulting sample is placed in a thermostat at 65°C for 10 minutes, during thermostatting the sample is mixed by pipetting 2 times, then centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm, to carry out PCR, use the supernatant liquid obtained from the sample and a set of reagents for the qualitative determination of hepatitis D virus RNA in blood serum; and upon receiving a positive PCR result for hepatitis D virus RNA in the hepatobiopsy, despite a negative PCR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum, a relapse of hepatitis D is predicted within 4-24 weeks after the end of treatment.
Достоинством предлагаемого способа прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии является применение стандартного ПЦР-теста для выявления РНК вируса гепатита D со специфичностью 100% в ткани печени, что наряду с многократно более высокой концентрацией РНК вируса гепатита D в ткани печени позволяет верифицировать активную репликацию вируса гепатита D даже при неоднократных отрицательных результатах ПЦР в сыворотке крови.The advantage of the proposed method for predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy is the use of a standard PCR test to detect hepatitis D virus RNA with a specificity of 100% in liver tissue, which, along with a many times higher concentration of hepatitis D virus RNA in liver tissue, makes it possible to verify active replication of the virus hepatitis D, even with repeated negative PCR results in the blood serum.
Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.
Пациентам с хроническим гепатитом D назначают противовирусную терапию: ежедневные подкожные инъекции булевиртида в дозе 2 мг/сутки с или без пегилированного интерферона альфа-2b в дозе 1,5 мкг/кг подкожно 1 раз в неделю на срок не менее 48 недель. Лечение продолжается в течение от 36 до 144 недель на фоне достижения и сохранения негативного результата полимеразной цепной реакции (ПЦР) на РНК вируса гепатита D (РНК HDV) в сыворотке крови. ПЦР осуществлялась на наборе РеалБест РНК ВГD (кат. №D-0998) со специфичностью выявления РНК вируса гепатита D - 100% и чувствительностью 100 копий/мл.Patients with chronic hepatitis D are prescribed antiviral therapy: daily subcutaneous injections of bulevirtide at a dose of 2 mg/day with or without pegylated interferon alfa-2b at a dose of 1.5 mcg/kg subcutaneously once a week for at least 48 weeks. Treatment continues for 36 to 144 weeks while achieving and maintaining a negative serum polymerase chain reaction (PCR) for hepatitis D virus RNA (HDV RNA). PCR was carried out using a RealBest HDV RNA kit (cat. No. D-0998) with a specificity for detecting hepatitis D virus RNA of 100% and a sensitivity of 100 copies/ml.
С целью оценки динамики гистологической активности и фиброза печени гепатита D на фоне противовирусной терапии, а также исследования РНК HDV в ткани печени, пациентам выполняют пункционную биопсию печени по Менгини. Полученные биоптаты печеночной ткани разделяют для гистологического и вирусологического исследования. Гепатобиоптат для морфологического исследования фиксируют в 10% нейтральном формалине, забуференном по Лилли. Ткань печени размером 3-5 мм для вирусологического исследования помещают в физиологический раствор и доставляют в ПЦР-лабораторию. Доставка гепатобиоптата при температуре 18-25°С осуществляется в течение 2 часов, при температуре 2-8°С не более суток, при температуре минус 18-60°С до 2 недель.In order to assess the dynamics of histological activity and liver fibrosis of hepatitis D against the background of antiviral therapy, as well as to study HDV RNA in liver tissue, patients undergo a Menghini puncture biopsy of the liver. The obtained liver tissue biopsies are separated for histological and virological examination. Hepatobioptate for morphological examination is fixed in 10% neutral formalin, Lilly buffered. Liver tissue measuring 3-5 mm for virological testing is placed in physiological solution and delivered to the PCR laboratory. Delivery of hepatobiopsy at a temperature of 18-25°C is carried out within 2 hours, at a temperature of 2-8°C no more than a day, at a temperature of minus 18-60°C up to 2 weeks.
Выделение ДНК/РНК из биоптата проводят с помощью набора реагентов для качественного определения РНК вируса гепатита D в сыворотке крови (мы использовали «РеалБест экстракция 100», производства АО Вектор-Бест). Биоматериал помещался в эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора из набора реагентов «РеалБест экстракция 100».Isolation of DNA/RNA from a biopsy is carried out using a set of reagents for the qualitative determination of hepatitis D virus RNA in blood serum (we used RealBest Extraction 100, produced by Vector-Best JSC). The biomaterial was placed in an Eppendorf with 0.5 ml of lysis solution from the RealBest Extraction 100 reagent kit.
Если гепатобиоптат был предварительно заморожен, его размораживают. Аккуратным пипетированием гепатобиоптат перемешивают в лизирующем растворе 3-4 раза. Полученный образец помещают в термостат при 65°С на 10 минут. В процессе термостатирования образец перемешивают пипетированием 2 раза, после чего центрифугируют в течение 1 минуты при 13000 об/мин.If the hepatobiopsy was previously frozen, it is thawed. By careful pipetting, the hepatobioptate is mixed in the lysis solution 3-4 times. The resulting sample is placed in a thermostat at 65°C for 10 minutes. During thermostatting, the sample is mixed by pipetting 2 times, after which it is centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm.
Для проведения ПЦР используют 100 мкл полученной из образца надосадочной жидкости и набор реагентов для качественного определения РНК вируса гепатита D в сыворотке крови. Выделение нуклеиновых кислот осуществляется согласно инструкции к набору реагентов.To carry out PCR, use 100 μl of the supernatant obtained from the sample and a set of reagents for the qualitative determination of hepatitis D virus RNA in blood serum. Isolation of nucleic acids is carried out according to the instructions for the reagent kit.
Амплификацию проводят с помощью набора реагентов для выявления РНК вируса гепатита D методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (мы использовали «РеалБест РНК ВГD)» производства АО «Вектор-Бест»), и набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вируса гепатита методом ПЦР в режиме реального времени (мы использовали «РеалБест ВГВ ПЦР» (вариант 2), производства АО «Вектор-Бест»). В каждую пробирку с лиофилизированной готовой реакционной смесью для ПЦР пипеткой с отдельным наконечником с фильтром вносят 50 мкл соответствующего раствора выделенной РНК (из пробирок, установленных в магнитный штатив). Обращают внимание на недопустимость захвата частиц сорбента. Пробирки закрывают крышками или оптической пленкой и помещают в амплификатор.Amplification is carried out using a set of reagents for the detection of hepatitis D virus RNA by real-time RT-PCR (we used RealBest HDV RNA produced by Vector-Best JSC), and a set of reagents for the detection and quantification of hepatitis D virus DNA by the method Real-time PCR (we used RealBest HBV PCR (option 2), produced by Vector-Best JSC). Using a pipette with a separate tip with a filter, add 50 μl of the corresponding solution of isolated RNA (from tubes installed in a magnetic stand) into each tube with a lyophilized ready-made reaction mixture for PCR. Pay attention to the inadmissibility of capturing sorbent particles. The tubes are covered with caps or optical film and placed in a thermal cycler.
Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) набора «РеалБест РНК BГD» гарантированно (в 100% образцов) составляет 100 копий/мл РНК HDV при выделении РНК из 100 мкл пробы; специфичность определения - 100%. Протокол проведения реакции ОТ-ПЦР: 1 стадия: 45°С - 30 мин; 2 стадия: 94°С - 1 мин; 3 стадия: 50 циклов (94°С - 10 сек, 60°С - 20 сек). Измерение флуоресценции проводится при 60°С. Анализ и учет результатов проводится автоматически с помощью программного обеспечения «РеалБест Диагностика».The analytical sensitivity (detection limit) of the RealBest RNA HDV kit is guaranteed (in 100% of samples) to be 100 copies/ml of HDV RNA when isolating RNA from 100 µl of sample; specificity of determination - 100%. Protocol for the RT-PCR reaction: Stage 1: 45°C - 30 min; Stage 2: 94°C - 1 min; Stage 3: 50 cycles (94°C - 10 sec, 60°C - 20 sec). Fluorescence measurements are carried out at 60°C. Analysis and recording of results is carried out automatically using the RealBest Diagnostics software.
Нами использовался амплификатор «CFX96», производство BIO-RAD, США.We used the CFX96 cycler, manufactured by BIO-RAD, USA.
При получении положительного результата ПЦР на РНК вируса гепатита D в гепатобиоптате, несмотря на наличие отрицательного результата ПЦР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови, прогнозируют наступление рецидива гепатита D в течение 4-24 недель после окончания лечения.If a positive PCR result for hepatitis D virus RNA is obtained in a hepatobiopsy, despite the presence of a negative PCR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum, a relapse of hepatitis D is predicted within 4-24 weeks after the end of treatment.
Новым является то, что ПЦР на РНК вируса гепатита D у пациентов с гепатитом D, получающих противовирусную терапию предложено проводить в оптимально подготовленном образце из гепатобиоптата, а не в сыворотке крови. Учитывая многократно более высокую концентрацию РНК HDV в гепатоцитах, чем в сыворотке крови, позитивный результат ПЦР на РНК вируса гепатита D в гепатобиоптате на фоне противовирусной терапии позволяет достоверно предсказать ранний рецидив HDV-инфекции при негативном результате ПЦР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови. Результат состоит в повышении эффективности противовирусного лечения пациентов с гепатитом D благодаря недопущению необоснованного завершения противовирусной терапии несмотря на отрицательный результат ПЦР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови.What is new is that PCR for hepatitis D virus RNA in patients with hepatitis D receiving antiviral therapy is proposed to be carried out in an optimally prepared sample from hepatobiopsy, and not in blood serum. Taking into account the many times higher concentration of HDV RNA in hepatocytes than in blood serum, a positive PCR result for hepatitis D virus RNA in hepatobiopsy against the background of antiviral therapy can reliably predict an early relapse of HDV infection with a negative PCR result for hepatitis D virus RNA in blood serum. The result is to increase the effectiveness of antiviral treatment for patients with hepatitis D by preventing unnecessary termination of antiviral therapy despite a negative PCR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum.
Высокую точность и ценность предлагаемого способа подтверждают нижеприведенные клинические примеры.The high accuracy and value of the proposed method is confirmed by the clinical examples below.
Пример 1. Пациентка К., жен., 48 лет. Наблюдается у гепатолога с 2015 года по поводу компенсированного цирроза печени в исходе гепатита D (HBV ДНК «-», HDV РНК «+»). В анамнезе 48 недель противовирусной терапии ПЕГ-интерфероном без достижения вирусологического и биохимического ответа.Example 1. Patient K., female, 48 years old. She has been observed by a hepatologist since 2015 for compensated liver cirrhosis as a result of hepatitis D (HBV DNA “-”, HDV RNA “+”). There was a history of 48 weeks of antiviral therapy with PEG-interferon without achieving a virological and biochemical response.
При исходной оценке данных (до противовирусной терапии) выявлены лейкопения легкой степени тяжести - 3,46 тыс., АЧН - 1,69, тромбоцитопения легкой степени тяжести - 129 тыс., умеренное повышение АЛТ - 180 Ед/л при нормальных показателях функции печени: общий билирубин - 19,4 мкмоль/л, альбумин - 39,2 г/л, MHO - 1,22, ПТИ - 73%, протромбиновое время - 15,3 сек., холинэстераза - 9,89 мкмоль/л. По результатам вирусологических тестов HBV ДНК «отр», выявлена HDV РНК, количество - 10*8 коп/мл. При УЗИ органов брюшной полости выявлены признаки незначительных диффузных изменений печени и поджелудочной железы, спленомегалия, воротная и селезеночная вены не расширены. Плотность печени по данным эластографии печени составила 12,3 кПа (F4 по METAVIR).During the initial data assessment (before antiviral therapy), mild leukopenia was detected - 3.46 thousand, ANC - 1.69, mild thrombocytopenia - 129 thousand, a moderate increase in ALT - 180 U/l with normal liver function tests: total bilirubin - 19.4 µmol/l, albumin - 39.2 g/l, MHO - 1.22, PTI - 73%, prothrombin time - 15.3 seconds, cholinesterase - 9.89 µmol/l. According to the results of virological tests of HBV DNA “neg”, HDV RNA was detected, the amount was 10 * 8 copecks/ml. Ultrasound of the abdominal organs revealed signs of minor diffuse changes in the liver and pancreas, splenomegaly, and the portal and splenic veins were not dilated. The liver density according to liver elastography was 12.3 kPa (F4 according to METAVIR).
По результатам обследования был диагностирован цирроз печени в исходе гепатита D без признаков нарушения функции печени (клинико-лабораторная компенсация, отсутствие асцита, признаки портальной гипертензии небольшая спленомегалия по данным УЗИ). Сформулирован диагноз: Цирроз печени в исходе гепатита D (HDV RNA "+", количество 10*8 коп/мл), компенсированный. Child А. Секвестрационная нейтро-, тромбоцитопения легкой степени.Based on the results of the examination, liver cirrhosis was diagnosed as a result of hepatitis D without signs of liver dysfunction (clinical and laboratory compensation, absence of ascites, signs of portal hypertension, slight splenomegaly according to ultrasound). The diagnosis was formulated: Liver cirrhosis as a result of hepatitis D (HDV RNA “+”, amount 10*8 kopecks/ml), compensated. Child A. Mild sequestration neutro-, thrombocytopenia.
С 27.05.2020 пациентке назначена комбинированная противовирусная терапия: Пегилированный интерферон альфа-2а (далее Пег-ИФН) 180 мкг в неделю, подкожно + Булевиртид 2 мг в сутки, подкожно на 48 недель, далее монотерапия Булевиртидом 2 мг в сутки подкожно еще на 96 недель.From May 27, 2020, the patient was prescribed combination antiviral therapy: Pegylated interferon alpha-2a (hereinafter referred to as Peg-IFN) 180 mcg per week, subcutaneously + Bulevirtide 2 mg per day, subcutaneously for 48 weeks, then monotherapy with Bulevirtide 2 mg per day subcutaneously for another 96 weeks weeks
Во время противовирусной терапии у пациентки оценивались вирусологический (HDV RNA, HBV DNA), биохимический (анализ крови) и гистологический (в том числе по данным неинвазивной диагностики фиброза печени) ответы, а также безопасность проводимого лечения.During antiviral therapy, the patient's virological (HDV RNA, HBV DNA), biochemical (blood test) and histological (including non-invasive diagnosis of liver fibrosis) responses, as well as the safety of the treatment, were assessed.
Вирусологический ответ:Virological response:
Количество HDV RNA методом ПЦР оценивалось через 12, 24, 48, 72, 96, 144 недели противовирусной терапии. Отмечено достижение авиремии через 12 недель от начала и сохранение негативного результата теста на HDV RNA до завершения терапии. Таким образом, был достигнут полный вирусологический ответ на противовирусную терапию. HBV DNA весь период противовирусной терапии не определялась. Биохимический ответ:The amount of HDV RNA was assessed by PCR after 12, 24, 48, 72, 96, 144 weeks of antiviral therapy. Aviremia was observed to be achieved after 12 weeks from the start and a negative HDV RNA test result remained until completion of therapy. Thus, a complete virological response to antiviral therapy was achieved. HBV DNA was not determined throughout the entire period of antiviral therapy. Biochemical answer:
Начиная с 4-й недели противовирусной терапии отмечено постепенное снижение уровней трансаминаз. Полный биохимический ответ достигнут через 12 недель терапии. В дальнейшем, уровни АЛТ и ACT сохранялись в пределах верхней границы норма (ВГН) в течение всего периода лечения.Starting from the 4th week of antiviral therapy, a gradual decrease in transaminase levels was noted. A complete biochemical response was achieved after 12 weeks of therapy. Subsequently, ALT and AST levels remained within the upper limit of normal (ULN) throughout the entire treatment period.
Во время лечения производился контроль уровня желчных кислот в сыворотке крови, который сохранялся повышенным в течение всей терапии. Максимальное содержание желчных кислот было зарегистрировано после 96 недель лечения и составило 112 мкмоль/л, что может быть, отчасти, показателем эффективности проводимой терапии.During treatment, the level of bile acids in the blood serum was monitored, which remained elevated throughout the entire therapy. The maximum content of bile acids was recorded after 96 weeks of treatment and amounted to 112 µmol/l, which may, in part, be an indicator of the effectiveness of the therapy.
Гистологический ответ:Histological answer:
Выраженность фиброза печени была оценена с помощью неинвазивного метода диагностики - транзиентной эластографии печени на аппарате Фиброскан. Исходно был зарегистрирован уровень фиброза F4 (12,3 кПа) по шкале METAVIR. Через 48 недель терапии повторное исследование показало F3 (10,1 кПа) по шкале METAVIR. Снижение плотности печени по данным транзиентной эластографии продолжалось во время противовирусной терапии и на момент окончания лечения через 144 недели составила 9,2 кПа (METAVIR).The severity of liver fibrosis was assessed using a non-invasive diagnostic method - transient elastography of the liver using the Fibroscan device. At baseline, the level of fibrosis F4 (12.3 kPa) was recorded on the METAVIR scale. After 48 weeks of therapy, a repeat study showed F3 (10.1 kPa) on the METAVIR scale. The decrease in liver density according to transient elastography continued during antiviral therapy and was 9.2 kPa at the end of treatment after 144 weeks (METAVIR).
С целью оценки достижения вирусологического ответа в ткани печени пациентке с длительной авиремией в сыворотке крови по завершении лечения, то есть через 144 недели от начала противовирусной терапии, выполнена биопсия печени с выполнением ПНР на HDV RNA в гепатобиоптате по предлагаемому способу. К гепатобиоптату добавили 0,5 мл лизирующего раствора и перемешали пипетированием 3 раза. Полученный образец поместили в термостат при 65°С на 10 минут, в процессе термостатирования образец перемешивали пипетированием 2 раза. Центрифугировали образец в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Для проведения ПЦР использовали полученную из образца надосадочную жидкость и набор реагентов для качественного определения РНК вируса гепатита D в сыворотке крови. Результат ПЦР в гепатобиоптате - положительный.In order to assess the achievement of a virological response in the liver tissue, a patient with long-term aviremia in the blood serum at the end of treatment, that is, 144 weeks from the start of antiviral therapy, underwent a liver biopsy with PNR for HDV RNA in the hepatobiopsy using the proposed method. 0.5 ml of lysis solution was added to the hepatobiopsy and mixed by pipetting 3 times. The resulting sample was placed in a thermostat at 65°C for 10 minutes; during thermostatting, the sample was mixed by pipetting 2 times. The sample was centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm. To carry out PCR, we used the supernatant liquid obtained from the sample and a set of reagents for the qualitative determination of hepatitis D virus RNA in blood serum. The result of PCR in the hepatobiopsy specimen is positive.
После завершения противовирусной терапии пациентке был рекомендован мониторинг с ежемесячным контролем общего, биохимического и вирусологического анализов крови. Через 2 недели после завершения противовирусной терапии, при негативном результате ПЦР на HDV RNA в сыворотке крови у пациентки зафиксировано повышение АЛТ до 1,4 ВГН. Через 4 недели после завершения противовирусной терапии получен позитивный тест на HDV RNA: верифицирован рецидив гепатитаAfter completion of antiviral therapy, the patient was recommended monitoring with monthly general, biochemical and virological blood tests. 2 weeks after completion of antiviral therapy, with a negative PCR result for HDV RNA in the patient’s blood serum, an increase in ALT to 1.4 ULN was recorded. 4 weeks after completion of antiviral therapy, a positive test for HDV RNA was obtained: relapse of hepatitis was verified
Безопасность проводимой терапии.Safety of the therapy.
За 144-недельный период наблюдения за пациенткой во время противовирусной терапии у пациентки зарегистрированы прогрессирующая лейкопения и, как следствие, нейтропения, а также тромбоцитопения. Данные изменения были оценены как нежелательные явления интерферонотерапии, но, не потребовавшая модификации дозы Пег-ИФН. Нежелательных явлений, связанных с применением Булевиртида, не зарегистрировано за весь период лечения пациента.During the 144-week observation period of the patient during antiviral therapy, the patient experienced progressive leukopenia and, as a consequence, neutropenia, as well as thrombocytopenia. These changes were assessed as adverse events of interferon therapy, but did not require dose modification of Peg-IFN. There were no adverse events associated with the use of Bulevirtide during the entire period of patient treatment.
Через 2 недели лечения в анализах отмечено снижение уровня лейкоцитов до 2,38×10*9/л, абсолютное число нейтрофилов, при этом, составило 0,95×10*9/л. Зарегистрированы ИФН-индуцированные лейкопения и нейтропения. Уровень тромбоцитов снижался до минимального значения - 94×10*9/л с дальнейшей стабилизацией и в течение всего периода интерферонотерапии. В дальнейшем уровень тромбоцитов не снижался. Наблюдение за пациенткой продолжено без изменения доз получаемых препаратов противовирусного действия.After 2 weeks of treatment, tests showed a decrease in the level of leukocytes to 2.38×10*9/l, the absolute number of neutrophils was 0.95×10*9/l. IFN-induced leukopenia and neutropenia have been recorded. The platelet level decreased to a minimum value of 94×10*9/l with further stabilization throughout the entire period of interferon therapy. Subsequently, the platelet level did not decrease. Monitoring of the patient continued without changing the doses of antiviral drugs received.
Диагноз через 144 недели противовирусной терапии и 12 недель наблюдения после ее завершения:Diagnosis after 144 weeks of antiviral therapy and 12 weeks of observation after its completion:
Основной диагноз: Цирроз печени в исходе гепатита D (HDV RNA "+", количество 10*8 коп/мл; HBV DNA "-"), компенсированный. Child А. ПЕГ-ИФН + Булевиртид (05.2020-04.2021) с достижением вирусологического ответа (08.2020 - отрицательный результат ПЦР), достижением биохимического ответа. ИФН-индуцированная тромбоцитопения легкой ст. Булевиртид 2 мг/сут (04.2021-02.2023). Рецидив (07.2023 - HDV RNA «+»).Main diagnosis: Liver cirrhosis as a result of hepatitis D (HDV RNA “+”, amount 10 * 8 copecks/ml; HBV DNA “-”), compensated. Child A. PEG-IFN + Bulevirtide (05.2020-04.2021) with achievement of a virological response (08.2020 - negative PCR result), achievement of a biochemical response. IFN-induced mild thrombocytopenia. Bulevirtide 2 mg/day (04.2021-02.2023). Relapse (07.2023 - HDV RNA “+”).
Эластография печени (07.2023): 9,2 кПа- F3 (METAVIR); 221 дБ/см - S0.Liver elastography (07.2023): 9.2 kPa-F3 (METAVIR); 221 dB/cm - S0.
Вывод: положительный ПЦР-тест на HDV RNA в ткани печени несмотря на достижение и длительное (до 136 недель) сохранении на фоне противовирусной терапии авиремии (HDV RNA «отр») явился достоверным ранним предиктором рецидива HDV-инфекции после завершения лечения.Conclusion: a positive PCR test for HDV RNA in liver tissue, despite the achievement and long-term (up to 136 weeks) persistence of aviremia during antiviral therapy (HDV RNA “neg”), was a reliable early predictor of relapse of HDV infection after completion of treatment.
Пример 2. Пациент В., муж., 51 год. Наблюдается с 2019 года по поводу хронического гепатита D (HBV ДНК «-», HDV РНК «+»).Example 2. Patient V., male, 51 years old. Observed since 2019 for chronic hepatitis D (HBV DNA “-”, HDV RNA “+”).
При обследовании до противовирусной терапии выявлены умеренное повышение АЛТ - 120 Ед/л при нормальных показателях функции печени: общий билирубин - 17,6 мкмоль/л, альбумин - 40,2 г/л, MHO - 0,9, холинэстераза - 8,9 мкмоль/л. По результатам вирусологических тестов HBV ДНК «отр», выявлена HDV РНК, количество - 10*6 коп/мл. При УЗИ органов брюшной полости выявлены признаки незначительных диффузных изменений печени и поджелудочной железы, воротная и селезеночная вены не расширены. Плотность печени по данным эластографии печени составила 4,3 кПа (F0 по METAVIR).An examination before antiviral therapy revealed a moderate increase in ALT - 120 U/l with normal liver function tests: total bilirubin - 17.6 µmol/l, albumin - 40.2 g/l, MHO - 0.9, cholinesterase - 8.9 µmol/l. According to the results of virological tests of HBV DNA “neg”, HDV RNA was detected, the amount was 10 * 6 copecks/ml. Ultrasound of the abdominal organs revealed signs of minor diffuse changes in the liver and pancreas; the portal and splenic veins were not dilated. The liver density according to liver elastography was 4.3 kPa (F0 according to METAVIR).
По результатам обследования был сформулирован диагноз: хронический гепатит D (HDV RNA "+", количество 10*6 коп/мл).Based on the results of the examination, a diagnosis was formulated: chronic hepatitis D (HDV RNA “+”, amount 10 * 6 kopecks/ml).
С мая 2020 пациенту назначена комбинированная противовирусная терапия: Пегилированный интерферон альфа-2а (далее Пег-ИФН) 180 мкг в неделю, подкожно + Булевиртид 2 мг в сутки, подкожно на 48 недель, далее монотерапия Булевиртидом 2 мг в сутки подкожно еще на 96 недель.Since May 2020, the patient has been prescribed combination antiviral therapy: Pegylated interferon alpha-2a (hereinafter Peg-IFN) 180 mcg per week, subcutaneously + Bulevirtide 2 mg per day, subcutaneously for 48 weeks, then monotherapy with Bulevirtide 2 mg per day subcutaneously for another 96 weeks .
Во время противовирусной терапии у пациента оценивались вирусологический (HDV RNA, HBV DNA), биохимический (анализ крови) и гистологический (в том числе по данным неинвазивной диагностики фиброза печени) ответы, а также безопасность проводимого лечения.During antiviral therapy, the patient's virological (HDV RNA, HBV DNA), biochemical (blood test) and histological (including non-invasive diagnosis of liver fibrosis) responses, as well as the safety of the treatment, were assessed.
Вирусологический ответ:Virological response:
Наличие в сыворотке крови HDV RNA методом ПЦР оценивалось через 12, 24, 48, 72, 96, 144 недели противовирусной терапии. Отмечено достижение авиремии через 12 недель от начала и сохранение негативного результата теста на HDV RNA до завершения терапии. Таким образом, был достигнут полный вирусологический ответ на противовирусную терапию. HBV DNA весь период противовирусной терапии не определялась.The presence of HDV RNA in the blood serum using PCR was assessed after 12, 24, 48, 72, 96, 144 weeks of antiviral therapy. Aviremia was observed to be achieved after 12 weeks from the start and a negative HDV RNA test result remained until completion of therapy. Thus, a complete virological response to antiviral therapy was achieved. HBV DNA was not determined throughout the entire period of antiviral therapy.
Биохимический ответBiochemical response
Начиная с 4-й недели противовирусной терапии отмечено постепенное снижение уровней трансаминаз. Полный биохимический ответ (нормализация АЛТ) достигнут через 8 недель терапии. В дальнейшем, уровни АЛТ и ACT сохранялись в пределах верхней границы норма (ВГН) в течение всего периода лечения.Starting from the 4th week of antiviral therapy, a gradual decrease in transaminase levels was noted. A complete biochemical response (normalization of ALT) was achieved after 8 weeks of therapy. Subsequently, ALT and AST levels remained within the upper limit of normal (ULN) throughout the entire treatment period.
Во время лечения производился контроль уровня желчных кислот в сыворотке крови, который сохранялся повышенным в течение всей терапии. Максимальное содержание желчных кислот было зарегистрировано после 48 недель лечения и составило 96 мкмоль/л, что может быть показателем эффективности проводимой терапии.During treatment, the level of bile acids in the blood serum was monitored, which remained elevated throughout the entire therapy. The maximum content of bile acids was recorded after 48 weeks of treatment and amounted to 96 µmol/l, which may be an indicator of the effectiveness of the therapy.
Гистологический ответHistological response
Выраженность фиброза печени была оценена с помощью неинвазивного метода диагностики - транзиентной эластографии печени на аппарате Фиброскан. Исходно был зарегистрирован уровень фиброза F0 (4,3 кПа) по шкале METAVIR, сохранявшийся весь период противовирусной терапии.The severity of liver fibrosis was assessed using a non-invasive diagnostic method - transient elastography of the liver using the Fibroscan device. Initially, the level of fibrosis F0 (4.3 kPa) according to the METAVIR scale was recorded, which persisted throughout the entire period of antiviral therapy.
С целью оценки достижения вирусологического ответа в ткани печени пациенту с длительной авиремией в сыворотке крови по завершении лечения, то есть через 144 недели от начала противовирусной терапии, выполнена биопсия печени с выполнением ПЦР на HDV RNA в гепатобиоптате. К гепатобиоптату добавили 0,5 мл лизирующего раствора и перемешали пипетированием 4 раза. Полученный образец поместили в термостат при 65°С на 10 минут, в процессе термостатирования образец перемешивали пипетированием 2 раза. Центрифугировали образец в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Для проведения ПЦР использовали полученную из образца надосадочную жидкость и набор реагентов для качественного определения РНК вируса гепатита D в сыворотке крови. Результат ПЦР в гепатобиоптате - положительный.In order to assess the achievement of a virological response in the liver tissue, a patient with long-term aviremia in the blood serum at the end of treatment, that is, 144 weeks from the start of antiviral therapy, underwent a liver biopsy with PCR for HDV RNA in the hepatobiopsy. 0.5 ml of lysis solution was added to the hepatobiopsy and mixed by pipetting 4 times. The resulting sample was placed in a thermostat at 65°C for 10 minutes; during thermostatting, the sample was mixed by pipetting 2 times. The sample was centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm. To carry out PCR, we used the supernatant liquid obtained from the sample and a set of reagents for the qualitative determination of hepatitis D virus RNA in blood serum. The result of PCR in the hepatobiopsy specimen is positive.
После завершения противовирусной терапии пациенту был рекомендован мониторинг с ежемесячным контролем общего, биохимического и вирусологического анализов крови. Через 16 недель после завершения противовирусной терапии, при негативном результате ПЦР на HDV RNA в крови у пациента зафиксировано повышение АЛТ до 1,1 ВГН. Через 24 недель после завершения противовирусной терапии получен позитивный тест на HDV RNA: верифицирован рецидив гепатита D.After completion of antiviral therapy, the patient was recommended monitoring with monthly general, biochemical and virological blood tests. 16 weeks after completion of antiviral therapy, with a negative PCR result for HDV RNA in the patient’s blood, an increase in ALT was recorded to 1.1 ULN. 24 weeks after completion of antiviral therapy, a positive test for HDV RNA was obtained: a relapse of hepatitis D was verified.
Безопасность проводимой терапии.Safety of the therapy.
За 144-недельный период наблюдения за пациентом во время противовирусной терапии значимые нежелательные явления не зарегистрированы.During the 144-week observation period of the patient during antiviral therapy, no significant adverse events were recorded.
Диагноз через 144 недели противовирусной терапии и 24 недели наблюдения:Diagnosis after 144 weeks of antiviral therapy and 24 weeks of observation:
Основной диагноз: Хронический гепатит D (HDV RNA "+", количество 10*6 коп/мл; HBV DNA "-"). ПЕГ-ИФН + Булевиртид (05.2020-04.2021) с достижением вирусологического ответа (08.2020 - отрицательный результат ПЦР), достижением биохиимического ответа. Булевиртид 2 мг/сут (04.2021-02.2023). Рецидив (08.2023 - HDV RNA «+»).Main diagnosis: Chronic hepatitis D (HDV RNA “+”, amount 10*6 kopecks/ml; HBV DNA “-”). PEG-IFN + Bulevirtide (05.2020-04.2021) with achievement of a virological response (08.2020 - negative PCR result), achievement of a biochemical response. Bulevirtide 2 mg/day (04.2021-02.2023). Relapse (08.2023 - HDV RNA “+”).
Эластография печени (08.2023): 4,2 кПа- F0 (METAVIR); 221 дБ/см - S0.Liver elastography (08.2023): 4.2 kPa-F0 (METAVIR); 221 dB/cm - S0.
Вывод: положительный ПЦР-тест на HDV RNA в ткани печени несмотря на достижение и длительное сохранение на фоне противовирусной терапии авиремии (HDV RNA «отр») явился предиктором позднего (через 24 недели) рецидива HDV-инфекции после завершения лечения.Conclusion: a positive PCR test for HDV RNA in liver tissue, despite the achievement and long-term persistence of aviremia during antiviral therapy (HDV RNA “neg”), was a predictor of late (24 weeks) relapse of HDV infection after completion of treatment.
Всего нами было исследовано 24 пациента с хроническим гепатитом D, которые получали противовирусную терапию Пегилированным интерфероном альфа-2b в дозе 1,5 мкг/кг подкожно 1 раз в неделю в течение 48 недель и ежедневные подкожные инъекции булевиртидом в дозе 2 мг/сут в течение 96 - 144 недель. У всех пациентов через 12-24 недели от начала противовирусной терапии был зафиксирован негативный результат ПЦР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови, то есть достигнут полный вирусологический ответ (негативный результат ПЦР на РНК вируса гепатита D в сыворотке крови), который сохранялся до конца противовирусного лечения (от 84 до 132 недель). Всем пациентам в конце противовирусной терапии произведена биопсия печени с гистологическим и вирусологическим исследованием ткани печени. У 16 пациентов при проведении ПЦР в биоптате печени выявлена РНК вируса гепатита D. В течение 4-24 недель после завершения противовирусной терапии у всех из них зафиксирован рецидив гепатита D: появление РНК вируса гепатита D в сыворотке крови.In total, we studied 24 patients with chronic hepatitis D who received antiviral therapy with pegylated interferon alfa-2b at a dose of 1.5 mcg/kg subcutaneously once a week for 48 weeks and daily subcutaneous injections with bulevirtide at a dose of 2 mg/day for 96 - 144 weeks. In all patients, 12-24 weeks after the start of antiviral therapy, a negative PCR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum was recorded, that is, a complete virological response was achieved (negative PCR result for hepatitis D virus RNA in the blood serum), which was maintained until the end antiviral treatment (from 84 to 132 weeks). At the end of antiviral therapy, all patients underwent a liver biopsy with histological and virological examination of liver tissue. In 16 patients, PCR revealed hepatitis D virus RNA in a liver biopsy. Within 4-24 weeks after completion of antiviral therapy, all of them had a relapse of hepatitis D: the appearance of hepatitis D virus RNA in the blood serum.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность прогнозирования рецидива гепатита D после завершения противовирусной терапии за счет раннего выявления РНК вируса гепатита D в гепатобиоптате, подготовленном определенным образом, что, в свою очередь позволит улучшить результаты лечения гепатита D.Thus, the proposed method makes it possible to increase the accuracy of predicting relapse of hepatitis D after completion of antiviral therapy due to the early detection of hepatitis D virus RNA in a hepatobiopsy prepared in a certain way, which, in turn, will improve the results of treatment of hepatitis D.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812800C1 true RU2812800C1 (en) | 2024-02-02 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021076714A1 (en) * | 2019-10-16 | 2021-04-22 | Eiger Biopharmaceuticals, Inc. | Methods to treat hepatitis delta viral infections |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021076714A1 (en) * | 2019-10-16 | 2021-04-22 | Eiger Biopharmaceuticals, Inc. | Methods to treat hepatitis delta viral infections |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Клинические рекомендации "Хронический вирусный гепатит D (ХВГD) у взрослых". Разраб.: Национальное научное общество инфекционистов" (ННОИ). - 2021. CASTELNAU C. et al. Efficacy of peginterferon alpha-2b in chronic hepatitis delta: relevance of quantitative RT-PCR for follow-up. Hepatology. 2006 Sep; 44(3): 728-35. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Papatheodoridis et al. | Course of virologic breakthroughs under long-term lamivudine in HBeAg-negative precore mutant HBV liver disease | |
| Bonacini et al. | Patients co‐infected with human immunodeficiency virus and hepatitis C virus demonstrate higher levels of hepatic HCV RNA | |
| Falize et al. | Reversibility of hepatic fibrosis in treated genetic hemochromatosis: a study of 36 cases | |
| Chazouilleres et al. | Quantitation of hepatitis C virus RNA in liver transplant recipients | |
| Davis et al. | Quantitative detection of hepatitis C virus RNA with a solid‐phase signal amplification method: definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferon‐treated patients | |
| Cacciola et al. | Quantification of intrahepatic hepatitis B virus (HBV) DNA in patients with chronic HBV infection | |
| Yuki et al. | Long‐term histologic and virologic outcomes of acute self‐limited hepatitis B | |
| Frank et al. | Amylase normal, lipase elevated: is it pancreatitis?: a case series and review of the literature | |
| Lau et al. | Significance of serum hepatitis C virus RNA levels in chronic hepatitis C | |
| Enomoto et al. | Usefulness of transient elastography for assessment of liver fibrosis in chronic hepatitis B: Regression of liver stiffness during entecavir therapy | |
| WO2022095731A1 (en) | Kit and method for detecting sars-cov-2 | |
| Cabrera et al. | Using an immune functional assay to differentiate acute cellular rejection from recurrent hepatitis C in liver transplant patients | |
| JP2010520744A (en) | Method and kit for examining drug sensitivity of patients infected with HCV | |
| Persico et al. | Diagnosis of chronic liver disease: reproducibility and validation of liver biopsy | |
| Terrault et al. | Hepatitis C virus: quantitation and distribution in liver | |
| de Souza Pires-Neto et al. | Hepatic TLR4, MBL and CRP gene expression levels are associated with chronic hepatitis C | |
| JP4915794B2 (en) | Genetic markers and their use | |
| RU2812800C1 (en) | Method of predicting relapse of hepatitis d after completion of antiviral therapy | |
| Schmidt et al. | Effect of interferon therapy on hepatitis C virus RNA in whole blood, plasma, and peripheral blood mononuclear cells | |
| RU2256182C2 (en) | Method for predicting infantine chronic glomerulonephritis treatment effectiveness | |
| SÖKMEN | Serum complement C4 in chronic hepatitis C: correlation with histopathologic findings and disease activity | |
| US20030013118A1 (en) | Methods of determining resistance to treatment for hepatitis c virus | |
| CN109593887B (en) | Kit for quantitative detection of hepatitis C virus nucleic acid | |
| RU2709507C1 (en) | Method for diagnosing hepatic fibrosis in patients with chronic viral hepatitis c | |
| RU2563812C2 (en) | Method of predicting fast virological response in patients with chronic hepatitis c |