RU2812480C1 - Штамм bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 в качестве полифункционального средства защиты растений и стимулирования их роста - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой щтамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 (ВtН10 109/7), который депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) ФАНО ФГБНУ ВНИИСХМ 14.03.2023г. под регистрационным ВНИИСХМ. под номером RCAM 06262.Новый штамм бактерии Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 полу-чен путем многоступенчатой аналитической селекции из штамма Bacillus thu-ringiensis var. darmstadiensis № 109, выделенного из природного образца. Выявлено и подтверждено опытным путем, что препарат на основе штамма ВtН10109/7 одновременно обладает выраженными энтомоцидными свойствами в отношении широкого круга вредителей-фитофагов (колорадского жука, картофельной коровки, крестоцветных блошек, листоедов, долгоносиков), обитающих на различных сельскохозяйственных культурах (овощные, зерновые и ягодные); он эффективен против фитопатогенов, вызывающих заболевания на ряде культур (серой гнили на землянике, фузариозного увядания томатов и льна, ризоктониоза на картофеле, гельминтоспориозной корневой гнили зерновых культур), а также обладает ростостимулирующими свойствами (например, салата, томата, огурцов, кабачков). То есть штамм ВtН10 109/7 является эффективным полифункциональным средством для использования в растениеводстве сельского хозяйства. 8 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма бактерий p. Bacillus в качестве полифункционального средства, включающего инсектицидную защиту растений от насекомых-вредителей, антифунгальную защиту от грибных болезней, а также стимулирование их роста.

Ежегодные потери урожая сельскохозяйственной продукции от вредителей могут достигать 30% и более (Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф., Микробиологический контроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. Санкт-Петербург, Пушкин, 2009. 245 стр.). В связи с этим защита сельскохозяйственных растений от вредителей и болезней является важной экономической проблемой. Высокие потери урожая из-за вредителей и болезней в сочетании с потребностью в экологически чистой продукции делают использование микробиологических препаратов крайне актуальным.

Наиболее опасными вредителями сельскохозяйственных растений являются жесткокрылые насекомые, в частности колорадский жук, поражающий преимущественно картофель и другие культуры семейства пасленовых (баклажаны, томаты и перец). Заселенность кустов пасленовых культур может достигать 50-70%, а потери урожая - 25-30%. Жуки быстро адаптируются к новым кормам и экологическим условиям. Высокая плотность популяции отмечается в Европейской части ареала. При высокой плодовитости самок (до 500 и более) жук может давать 2 и даже 3 генерации (Бей-Биенко Г.Я., Щеголев В.Н. Сельскохозяйственная энтомология. М., 1955 г. Колорадский жук характеризуется значительным внутривидовым полиморфизмом и экологической пластичностью.

Для борьбы с колорадским жуком используют химические инсектициды: Актелик, Дурсбан, Сайрен, Фастак, Актар, Кофидор, Танрек, Регент, Командор и др. Однако химические препараты загрязняют окружающую среду, накапливаются в почве и небезопасны для человека и теплокровных животных. Они не обладают избирательным действием. Широкое применение химических пестицидов приводит к формированию резистентных расе вредителя, что приводит к снижению их эффективности.

Альтернативой им являются биологические препараты: Боверин, Битокси-бациллин, Лепидоцид, Дендробациллин, Колорадо, Новодор, но и они не обладают широким спектром действия на жесткокрылых насекомых.

Известен патент №2081583 на изобретение «Инсектицидный препарат «Колорадо» против жесткокрылых насекомых и штамм бактерий Bacillus thuringiensis, используемый для получения инсектицидного препарата» по заявке №93018092 с приоритетом от 07.04.1993 г., МПК A01N 63/00, C12N, опубликовано 20.06.1997 г.

В патенте описан штамм Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, синтезирующий кристаллический белковый эндотоксин. Штамм депонирован в ВКПМ под № В-6306, на его основе создан жидкий препарат «Колорадо». Штамм активен против колорадского жука, щавелевого листоеда, пьявицы красногрудой. Препарат содержит в своем составе глицерин, масло тридекан, углерод технический в качестве фотопротектора, Слан 60 и неонол в качестве ПАВ, а также отдушку. Титр штамма ВКПМ №6306 при культивировании на дрожже-полисахаридной среде при 30°С через 48 часов, составляет 3,4 млрд спор/мл, но при этом иногда отмечают спонтанный выход фага. Препарат применяют против личинок 1-2 возраста. Однако недостатком препарата является сравнительно низкая эффективность, что приводит к увеличению норм применения до 4-5 кг/га.

Известен патент №2204598 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis H₈, предназначенный для борьбы с жесткокрылыми насекомыми» по заявке №2001128487 с приоритетом от 23.10.2001., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 20.05.2003 г.

В патенте описан штамм бактерий Bacillus thuringiensis H₈, депонированный в ВКПМ № В-8057, который получен из штамма Bacillus thuringiensis Н₈ № В-6306 путем многоступенчатой селекции по признакам повышенного синтеза токсина против вредных жесткокрылых насекомых, в частности колорадского жука, и пониженного уровня спорообразования для предотвращения загрязнения окружающей среды спорами при применении биопестицида на основе этого штамма. Приведен пример получения культуральной жидкости на основе штамма ВКПМ В-8057.

Известен патент №2559548 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis для борьбы с колорадским жуком» по заявке №2013153071 с приоритетом от 28.11.2013 г., МПК A01N 63/02, C12N 1/20, C12R 1/07, опубликовано 10.06.2015 г.

Штамм Bacillus thuringiensis 16Т100/18 (ВИЗР) может быть использован при производстве препаратов для борьбы с колорадским жуком. Штамм депонирован в Государственной Коллекции Микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей (ГНУ ВНИИ защиты растений) под регистрационным номером Б 94-1 ВИЗР. Изобретение позволяет сократить количество имаго колорадского жука. Культуральная жидкость штамма активна против личинок 1-2 возраста и молодых имаго. Однако эффективность недостаточна высока.

Известен патент №2514211 на изобретение «Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 в качестве средства для получения энтомоцидного биопрепарата» по заявке №2012143320 с приоритетом от 10.10.2012 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 27.04.2014 г.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 (BtH₁ 800/15) выделен из трупов личинок колорадского жука и депонирован в ВКСМ ГНУ ВНИИСХМ под рег. №611. В патенте описан пример получения препарата жидкой формы, созданного на основе штамма BtH₁ 800/15, который обладает энтомоцидной активностью против насекомых фитофагов.

Серьезные экономические проблемы представляют опасные заболевания растений, вызываемые возбудителями болезней грибной и бактериальной этиологии (Наумов Н.А. «Болезни сельскохозяйственных растений» М-Л. Сельхозгиз, 1952, 664 с. По данным ФАО потери урожая от фито-патогенов составляют около 30-50% (ФАО, 2019. Положение дел в области продовольствия и сельского хозяйства. Курс на сокращение потерь и порчи продовольствия. Рим. Для борьбы с ними широко используются химические фунгициды: Топаз, Фундазол, Скор, Строби, Цинеб, Максим, Ревус, Хорус и др. Однако их эффективность не более 50-60%). Кроме того, применение химических фунгицидов способствует формированию резистентности у возбудителей болезней и они способны накапливаться в окружающей среде и вызывать фитотоксическое действие. Эти препараты требуют регламентированного периода ожидания после обработки.

В качестве альтернативных средств используют биологические препараты бактериального происхождения, проявляющие антагонистическую активность по отношению к различным возбудителям заболеваний: Алирин-Б, Гамаир-Б. Триходермин, Альбит, Агат, Фитоспорин, Планриз, Бактофит, Бисолбисан и др. (Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Полифункциональная активность Bacillus thuringiensis Berliner. Сельскохозяйственная биология, 2011, №3, стр. 123-126.

Известно изобретение «Консорциум штаммов-антагонистов для борьбы с бактериальными и грибковыми болезнями растений» по патенту №2149552, заявка 98111359 с приоритетом от 15.06.1998., МПК A01N, C12N 1/20, С12Р 39/00, опубликовано 27.05.2000 г.

Консорциум, состоящий из четырех штаммов почвенных бактерий-антагонистов: Bacillus polymixa, Bacillus thuringiensis, Pantoea agglomerans, Pantoea chlororatis, предназначен для получения препарата против бактериальных и грибных болезней растений. Препарат на основе указанного консорциума штаммов бактерий может быть использован для эффективного подавления развития серой гнили и мучнистой росы у томата и огурца, бактериального рака у клевера, сосудистого бактериоза у капусты, угловатой пятнистости у огурца, фузариозного увядания у томата, гельминтоспориоза у ячменя, корневых гнилей хлопчатника. Пестицидная активность препарата сравнима с активностью химических агентов.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora» по патенту №2347809, заявка 2007132825 с приоритетом от 31.08.2007., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 27.02.2009 г.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis получен путем аналитической селекции из материала, выделенного из природных образцов и депонирован под номером ВКПМ В-9790. Штамм обладает инсектицидной активностью против личинок жесткокрылых насекомых (Coleoptera) - колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), большого мучного хрущака (Tenebrio molitor), щавелевого и калинового листоедов (Gastrophysa viridula, Galerucella viburni), а также подавляет вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora spp. carotovora.

Известен патент №2514023 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensisa №25 в качестве средства комплексного воздействия на вредных жесткокрылых насекомых и фитопатогенные грибы» по заявке 2012156501 с приоритетом от 25.11.2012 г., МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликовано 27.04.2014 г.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis №25 (BtH₁₀ №25), выделенный из трупов колорадского жука, депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под рег. номером RCAM 01490. В патенте приведен пример получения препарата на основе этого штамма, обладающего энтомоцидными свойствами против вредных жесткокрылых насекомых и антифунгальной активностью против фитопатогенных грибов.

Известен патент №2692655 на изобретение «Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiens 56 в качестве полифункционального средства для растениеводства» по заявке 2017143084 с приоритетом от 11.12.2017 г., МПК C12N 1/00, опубликовано 25.06.2019 г.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56, депонированный под № RCAM 04725, является эффективным полифункциональным средством для защиты растений от вредных насекомых и грибных болезней, а также стимулирования их роста.

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis №109 (BtH₁₀ №109) - продуцент бацикола, совмещающий инсектицидные и антифунгальные свойства (Кандыбин Н.В.. Смирнов О.В., Барбашева Н.М. Новый энтомоцидный препарат со специфическим действием на жесткокрылых. // Материалы Всероссийского научно-производственного совещания, Краснодар 21-24 августа 1994 г. 4.2. Пущино, 179-181; Гришечкина С.Д., Смирнов О.В., Кандыбин Н.В. Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuringiensis. Микология и фитопатология, 2002, Т. 36, вып 1. С. 58-62; Гришечкина С.Д., Ермолова В.П. Эффективность бацикола на основе нового штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis №25 против вредителей-фитофагов и фитопатогенов. Сельскохозяйственная биология, 2015. Т. 50, №3. С. 361-368 (8)) - прототип.

Задачей заявляемого изобретения является получение штамма на основе экологически безопасной бактерии из группы Bacillus thuringiensis с полифункциональными свойствами: энтомоцидной и антифунгальной активностью в отношении широкого круга массовых вредителей и фитопатогенных грибов, а также обладающих ростостимулирующим действием на растения.

Задача решается за счет использования нового штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiens №109/7, обладающего энтомоцидной, антифунгальной активностью и ростостимулирующим действием.

Новый штамм бактерии p. Bacillus получен путем многоступенчатой аналитической селекции из штамма Bacillus thuringiensis var. Darmstadiensis №109, выделенного из природного образца.

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) ВНИИСХМ 14.03.2023 г. под номером RCAM 06262, что подтверждается справкой о депонировании от 16.03.2023 (Справка о депонировании прилагается).

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 обладает широким спектром энтомоцидной активности против жесткокрылых, чешуекрылых насекомых-фитофагов, высокой антифунгальной активностью в отношении различных фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, а также ростостимулирующим действием на растения.

Штамм может быть использован в качестве полифункционального средства для защиты растений от вредителей и болезней. Препарат на его основе позволит расширить ассортимент биологических средств.

Культурально-морфологические свойства.

Вегетативные клетки грамположительные, палочковидной формы, размером (1,2-1,5)×(2,5-4,5) мкм, единичные с перитрихиальным типом жгутикования. Образуют наряду со спорой параспоральный кристалл тетрагональной, бипирамидальной или овоидной формы размером (0,2-0,6)×(0,3-0,8) мкм по длине края. Споры овальные, субтерминальные размером (0,6-0,8)×(1,4-1,6) мкм. В клетке образуется одна спора и один кристалл эндотоксина. В рыбном бульоне (РБ) рост хороший, образует пленку.

При выращивании штамма на рыбном агаре (РА) через 48 ч при 28-30°С образует колонии плоские, шероховатые серовато-белого цвета неправильной округлой формы, непрозрачные. Диаметр колоний 8-10 мм. На ломтиках картофеля рост умеренный серовато-зеленого цвета. При культивировании в жидких питательных средах штамм растет при температуре 20-36°С (оптимум 28-32°С) и при показателе кислотности среды рН 6,2-9,0 (оптимум 6,8-7,2) при скорости вращения на качалке 220 об/мин. Образование спор и кристаллов эндотоксина заканчивается через 60-72 часа роста.

Биохимические свойства.

Факультативный анаэроб.

Хорошо развивается на средах, содержащих органический азот: пептон, гидролизат казеина, рыбный бульон, кормовые дрожжи.

Из глюкозы, мальтозы, целлобиозы образует кислоту, но не газ. Не усваивает галактозу, арабинозу, маннозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, маннит, сорбит, дульцит, инозит, инулин.

Гидролизует эскулин и крахмал, салицин не расщепляет, цитрат натрия не использует в качестве единственного источника углерода. Образует амилазу, протеиназу, каталазу и нитратредуктазу. Не образует лецитиназу, уреазу, лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, индол и сероводород.

Пигмента не образует.

Штамм продуцирует водорастворимый термостабильный экзотоксин.

Антигенные свойства.

Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (идентифицирован по этой реакции и по классификации Bacillus thuringiensis (1990) H. de Barjack. По серологическим свойствам относится к 10 серотипу Bacillus thuringiensis. Штамм устойчив к основным производственным фагам: М, К, Э-5, Д2-Д5. По показателям вирулентности, токсичности и токсигенности штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 (BtH₁₀ 109/7) не патогенен для теплокровных животных, относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам. Штамм хранится на агаровых питательных средах: на мясопептонном (МПА), рыбном агаре (РА) в пробирках под вазелиновым маслом, в кристаллах натрия хлорида, методом криоконсервации при температуре минус 80°С.

Выявлено экспериментально, что штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 (BtH₁₀ 109/7) обладает выраженными энтомоцидными свойствами в отношении широкого круга вредителей-фитофагов (колорадского жука, картофельной коровки, крестоцветных блошек, листоедов, долгоносиков), обитающих на различных сельскохозяйственных культурах (овощные, зерновые и ягодные). Он эффективен в различных зонах против фитопатогенов, вызывающих заболевания на ряде культур (серой гнили на землянике, фузариозного увядания томатов и льна, ризоктониоза на картофеле, гельминтоспориозной корневой гнили зерновых культур) при различных технологиях применения. Штамм стимулирует всхожесть семян (например, салата, томата, огурцов, кабачков).

Ниже приведен пример получения биопрепарата с полифункциональными свойствами на основе штамма BtH₁₀ 109/7.

Сначала в колбах (1 л) готовят дрожжевую полисахаридную питательную среду следующего состава, мас. %:

мука соевая - 2,5;

крахмал кукурузный - 2,5;

дрожжи кормовые - 0,5;

K₂HPO₄ - 0,3;

MgSO₄×7H₂O - 0,02;

CaC₁₂×2H₂O - 0,1;

вода - остальное (до 100).

РН среды до стерилизации 7,4-7,8.

Подготовленную среду разливают в колбы Эрленмейера по 40-50 мл и стерилизуют в автоклаве при температуре +(120-125)°С в течение 40 минут.

РН среды после стерилизации 6,8-7,2. Стерильную питательную среду охлаждают до 30-35°С и засевают культурой штамма из пробирки. Для чего в пробирку с культурой на скошенном рыбном агаре вносят 5-8 мл стерильной воды или физиологического раствора. Этой же пипеткой осторожно растирают культуру, взбалтывают до гомогенной суспензии и вносят в колбы по 0,2-0,5 мл. Культуру в колбах выращивают на качалке при скорости вращения 220-250 об/мин и температуре 28-30°С в течение 56-72 часов до полного высыпания спор и образования кристаллов эндотоксинов (проверку осуществляют микроскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма BtH₁₀ 109/7 используют для засева среды в ферментерах.

Для выращивания культуры в ферментере может быть использована любая питательная среда, оптимально - того же состава, который был использован для получения посевной культуральной жидкости в колбах Эрленмейера (состав указан выше). В ферментере любой емкости, заполненном на 25% водой, сначала растворяют соли, затем заваривают расчетное количество кукурузного крахмала при 80-85°С, охлаждают до 40°С, добавляют расчетное количество соевой муки, затем добавляют воду до 50% от объема ферментера и перемешивают с водой в течение 20 минут. Доводят рН среды до 8,0 с помощью 40% едкого натра (каустической соды) и стерилизуют при 1 атм в течение 1 часа, после чего охлаждают до 32-35°С.Перед внесением посевного материала из ферментера берут пробу среды для контроля стерильности. При просмотре под микроскопом в поле зрения не должно быть наличия микроорганизмов. После этого в питательную среду в ферментере вносят 1-2% культуральной жидкости из колб Эрленмейера.

Процесс выращивания культуры в ферментере ведут при температуре 28-30°С, непрерывном перемешивании среды при помощи мешалки, при давлении в ферментере 0,2-0,4 атм и соответствующей аэрации:

до 3 час - только перемешивание;

с 3-12 час - 0,5V воздуха/V среды/мин;

с 12-42 час - 1,0V воздуха/V среды/мин;

с 42 час до окончания ферментации - 0,5V воздуха/V среды/мин.

То есть процесс ферментации проводят в условиях высокой аэрации и заканчивают при достижении соотношения 1:1 количества свободных спор и кристаллов эндотоксина при общем их количестве 70-80% от общего количества включений. Титр спор определяют общепринятым методом серийных разведений. При этом титр спор штамма BtH₁₀ 109/7 в полученном препарате составляет не менее (2,8-4,2)⋅10⁹ спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры и вирулентного фага.

Таким образом, полученный биопрепарат на основе штамма BtH₁₀ 109/7 представляет собой жидкость, легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения серийной опрыскивающей аппаратуры. Технология его производства не требует больших энергозатрат, необходимых для сушки при получении препаратов сухой формы.

Для подтвержения инсектицидной активности штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 (BtH₁₀ 109/7) были проведены лабораторные испытания энтомоцидной эффективности препарата по отношению к массовым насекомомым-фитофагам сельскохозяйственных культур.

Лабораторные испытания проводились на личинках L₂ колорадского жука. Для этих целей корм жука (листья картофеля) обрабатывали водной суспензией штамма BtH₁₀ 109/7 в концентрациях 5; 0; 1,0 и 0,2%). В каждом варианте опыта использовали по 25 личинок колорадского жука (в четырехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях и тех же концентрациях использовали препарат на основе штамма-аналога BtH₁ 800/15 и препарат на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109. В контроле корм обрабатывали водой. Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 7 день.

Содержание экзотоксина в препарате определяли на личинках комнатной мухи по следующей методике.

Препарат на основе штамма BtH₁₀ 109/7 центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Полученный фугат автоклавировали при давлении 0,1 МПа и температуре 105°С в течение 20 мин. Затем готовили разведения препарата: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32, что соответствует концентрациям 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкл/г корма. Каждую концентрацию испытывали в четырех параллельных определениях. Для испытаний в стеклянную 200 мл-банку вносили: 2 мл препарата на основе штамма BtH₁₀ 109/7 соответствующего разведения; 11 мл 2,5% -водной суспензии сухого молока; 7 г стерилизованных пшеничных отрубей. В контрольном опыте в банки вместо разведенного препарата вносили 2 мл стерильной воды. Корм с соответствующими разведениями препарата в каждой банке тщательно перемешивали и помещали туда по 25 личинок комнатной мухи, отверстия банок завязывали бязью и содержали в термостате при температуре (28±1)°С и относительной влажности 70-85%. На 5-е сутки выбирали пупарии и оставляли в тех же условиях до вылета мух.

Для сравнения в опытах при тех же условиях и при тех же концентрациях использовали препарат на основе штамма-аналога BtH₁ 800/15 и препарат на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109.

Активность экзотоксина (по числу погибших на 9 день мух с поправкой на гибель в контроле) определяли по формуле:

Х=(К-В)/К⋅100, где:

К - количество мух, вылетевших в контроле;

В - количество мух, вылетевших в опыте.

По результатам указанных выше лабораторных опытов для каждого случая был определен показатель ЛК₅₀ - доза препарата (в %, в мкл/г корма, в кг, в мл и пр.), вызывающая 50% гибели насекомых.

Значение ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (см., например, Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Полифункциональная активность Bacillus thuringiensis, Berliner. Сельскохозяйственная биология, 2011, №3, стр. 123-126).

Значения ЛК₅₀ для препаратов на основе: штамма-аналога BtH₁ 800/15, штамма-прототипа BtH₁₀ 109, а также нового штамма BtH₁₀ 109/7, характеризующие их энтомоцидную активность, представлены в Таблице 1.

Из представленных в Таблице 1 данных следует, что препарат на основе штамма BtH₁₀ 109/7 по энтомоцидной активности (ЛК₅₀) в отношении личинок колорадского жука оказался в 1,3 раза активнее препарата-прототипа на основе BtH₁₀ 109 и активнее в 1,4 раза препарата-аналога BtH₁ 800/15, а по содержанию экзотоксина в 1,4 раза и 1,6 раза, соответственно.

Были проведены также полевые мелкоделяночные опыты в Тамбовской области на картофеле (сорт Ерема) против колорадского жука. Посадки картофеля, заселенные личинками колорадского жука (L₁ - 54,5%; L₂ - 38,9%; L₃ - 6,6%) обрабатывали жидким препаратом на основе BtH₁₀ 109/7, полученным описанным выше способом. Обработку выполняли ручным опрыскивателем, норма расхода препарата 20 л/га, расход рабочей жидкости - 400 л/га. Для сравнения использовали препараты на основе штамма-аналога BtH₁ 800/15 и штамма-протипа BtH₁₀ 109. Контролем служили необработанные участки.

Учитывая среднее количество личинок колорадского жука на 25 кустах до обработки, а также на 5-й и 10-й дни после обработки, вычисляли % их гибели и рассчитывали энтомоцидную эффективность препаратов по формуле Аббота (Abbott W.S. A method for computing the effectiveness of insecticide. Ecjnom. Entomol. 1925.18).

Результаты опытов приведены в Таблице 2.

Результаты, представленные в Таблице 2, свидетельствуют о высокой эффективности препарата на основе штамма BtH₁₀ 109/7 против колорадского жука в полевых опытах. Его эффективность на 19,5% и 16,1%) выше эффективности препарата на основе штамма-прототипа BtH₁₀109 и препарата на основе штамма-аналога BtH₁₀ 800/15 соответственно.

Энтомоцидная биологическую эффективность препаратов Bt была также проверена в полевых опытах в Приморском крае на гречихе сорта Изумруд против гречишного долгоносика (Rhinoncus sibiricus Fanst).

Посевы гречихи обрабатывали жидким препаратом на основе штамма BtH₁₀ 109/7, полученным описанным выше способом. Обработку проводили в период появления всходов до первого настоящего листа с использованием ручного опрыскивателя. Норма расхода препарата 20 л/га, а рабочей жидкости 300 л/га. Для сравнения использовали препараты на основе штамма-аналога BtH₁ 800/15 и штамма-прототипа BtH₁₀ 109, а в контроле без обработки препаратами. Обследования посевов гречихи на заселенность вредителем проводили путем отбора растений в начале цветения и перед уборкой урожая. На листьях учитывали поврежденность растений жуком. Стебли разрезали вдоль и подсчитывали процент их повреждения личинками жука. Энтомоцидную эффективность препаратов рассчитывали по известной формуле Аббота. Результаты полевых опытов приведены в Таблице 3.

Данные, приведенные в Таблице 3, свидетельствуют о высокой энтомоцидной эффективности препарата на основе штамма BtH₁₀ 109/7 против гречишного долгоносика. При этом, эффективность нового штамма BtH₁₀ 109/7 выше эффективности препаратов на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109 и штамма-аналога BtH₁ 800/15 соответственно: на первых листьях растений гречихи - на 13,3% и 20,3%; на стеблях в период цветения гречихи - на 14,8% и 20,6%; на стеблях перед уборкой урожая - на 14% и 16%; а прибавка урожая увеличилась на 36,3% и на 16,7% по сравнению со штаммом - прототипом BtH₁₀ 109 и штаммом - аналогом BtH₁ 800/15 соответственно.

Эффективность препарата, полученного на основе штамма BtH₁₀ 109/7 указанным выше в примере способом, была проверена в полевых условиях на различных культурах против различных видов насекомых-фитофагов.

Для этого были использованы занятые культурами участки, расположенные в разных регионах страны: в Ленинградской, Воронежской, Тамбовской обл., Ставропольском и Приморском краях. Обработку проводили опрыскиванием, используя ручной опрыскиватель. Доза расхода препарата была в пределах 12-20 л/га. Расход рабочей жидкости составлял 300-400 л/га. В контроле обработку препаратами не проводили. При этом, в зависимости от вида сельскохозяйственной культуры и вида насекомых-фитофагов на ней, расход препарата составил: на капусте против белянок, крестоцветных блошек, на гречихе против гречишного долгоносика, на землянике против землянично-малинного долгоносика, и на картофеле против колорадского жука и картофельной коровки: 12, 15 и 20 л/га соответственно. Заселенность культур вредителями учитывали до обработки и на 10-е сутки после обработки, определяли % их гибели, после чего вычисляли биологическую (энтомоцидную) эффективность препарата на основе штамма BtH₁₀ 109/7 по формуле Аббота. Результаты опытов представлены в Таблице 4.

Данные Таблицы 4 свидетельствуют о высокой энтомоцидной эффективности препарата на основе штамма BtH₁₀ 109/7 против различных видов насекомых-фитофагов на различных сельскохозяйственных культурах.

Для оценки антифунгальных свойств штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 (BtH₁₀ 109/7) были проведены лабораторные испытания препарата, полученного на основе штамма BtH₁₀ 109/7 указанным выше в примере способом.

Оценку антифунгальных свойств препарата на основе штамма бактерий BtH₁₀ 109/7 против различных фитопатогенных грибов, в частности:

Bipolaris sorokiniana (гельмин-тоспориозная корневая гниль, темнобурая пятнистость) - на зерновых (пшенице, ячмене, ржи);

Rhizoctonia solani Kuhn (ризоктониоз) - на картофеле;

Botrytis cinerea Pers (серая гниль) - на ягодниках (землянике, малине, смородине, крыжовнике);

Pythium spp. (питиозная корневая гниль) - на зерновых, горохе, свекле;

Fusarium oxysporum (фузариозное увядание) - на овощных и технических (подсолнечник, рапс, хлопчатник, лен, сахарная свекла) культурах;

Verticillium dahlia Kleb (вертициллезное увядание) - на хлопчатнике, проводили с использованием метода агаровых блоков в чашках Петри (Методы экспериментальной микологии, под ред. Билай В.И., Киев. Изд. «Наукова думка», 1982 г. 552 с). Препарат на основе штамма BtH₁₀ 109/7, полученный указанным выше способом, в 10% концентрации вносили в расплавленную и охлажденную до 40°С среду Чапека и разливали в чашки Петри. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 7- суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Для сравнения в опытах при тех же условиях и концентрациях использовали препараты на основе штаммов аналога BtH₁ 800/15 и прототипа BtH₁₀ 109. Измерения диаметра роста колоний грибов проводили через 5 суток, после чего рассчитывали антифунгальную эффективность препаратов по формуле Аббота. Результаты опытов представлены в Таблице 5.

Из результатов, представленных в Таблице 5 следует, что антифунгальная эффективность препарата на основе штамма BtH₁₀ 109/7 на 13-15% выше, чем препарата на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109, и в несколько раз превосходит эффективность препарата на основе штамма-аналога BtH₁ 800/15 по всем представленным видам фитопатогенов. Наибольший 100% эффект ингибиро-вания роста гриба-патогена возникает при действии препаратов на основе нового штамма BtH₁₀ 109/7 и штамма-прототипа BtH₁₀ 109 на гриб Botrytis cinerea Pers - возбудителя серой гнили на ягодниках.

Антифунгальная эффективность штамма BtH₁₀ 109/7 также была проверена в вегетационных опытах с использованием инфекционных фонов на льне-долгунце (сорт Славный 82) против Fusarium oxysporum и на ячмене (сорт Пиркка) против Bipolaris sorokiniana.

Для этого стерилизованные семена льна-долгунца и ячменя предварительно замачивали в препарате на основе штамма BtH₁₀ 109/7 полученного указанным выше в примере способом в течение 3 часов и высевали в почву, предварительно зараженную фитопатогенными грибами. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препараты на основе штамма-аналога BtH₁ 800/15 и штамма-прототипа BtH₁₀ 109. При этом в контроле семена высевали в зараженную почву без обработки препаратами.

Учет пораженности растений проводили: для льна-долгунца фузариозом через 2 месяца, а для ячменя гельминтоспориозной корневой гнилью - через 1,5 месяца после высева. Для этих целей растения выдергивали из почвы, учитывали степень пораженности их стеблей по баллам (Гришечкина С.Д., Смирнов О.В. Вегетационная и полевая оценка антифунгального эффекта Bacillus thuringiensis. Вестник защиты растений. 2010. №3, с. 44-50.) и рассчитывали по формуле Аббота антифунгальную эффективность препаратов на основе штаммов BtH₁₀ 109/7, аналога BtH₁ 800/15 и прототипа BtH₁₀ 109.

Результаты опытов приведены в Таблице 6.

Результаты опыта, представленные в Таблице 6 показали, что в контроле пораженность растений достигала 100%.

Антифунгальная эффективность на льне-долгунце у препарата на основе нового штамма BtH₁₀ 109/7 при инфекционном фоне составила 49,9%), что в 1,45 раза выше, чем у препарата на основе штамма - прототипа BtH₁₀ 109 и в 2 раза выше, чем у препарата на основе штамма - аналога BtH₁ 800/15.

На ячмене антифунгальная активность у препарата на основе нового штамма BtH₁₀ 109/7 при инфекционном фоне составила 65,8%, что в 1,4 раза выше, чем у препарата на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109 и в 2,4 раза выше, чем у препарата на основе штамма-аналога BtHi 800/15.

Фиторегуляторная активность (ростостимулирующее действие) штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7 (BtH₁₀ 109/7) была подтверждена лабораторными исследованиями на семенах томата (с. Волгоградский), капусты (с. Подарок), салата (с. Азарт), свеклы (с. Пабло). Для этого семена томата, капусты, салата, свеклы перед посевом замачивали на 3 часа в препарате на основе штамма BtH₁₀ 109/7, полученном описанным выше способом, а для сравнения семена замачивали в препарате на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109, а в контроле - в воде. После замачивания семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги при температуре 26°С и влажности 86%. Через 5 дней учитывали всхожесть семян, а через 3 недели контролировали длину ростков и корней. Результаты опытов представлены в Таблице 7.

Результаты исследований, представленные в таблице 7, показывают, что препарат на основе нового штамма BtH₁₀ 109/7 обладает стимулирующим действием на всхожесть семян, рост проростков и корней растений томата, капусты, салата, свеклы. При этом фиторегуляторная (ростостимулирующая) активность нового штамма BtH₁₀ 109/7 на 6-20% выше, чем у штамма - прототипа BtH₁₀ 109.

Полифункциональная эффективность (энтомоцидное, антифунгальное и ростостимулирующее действие) препаратов на основе штамма BtH₁₀ 109/7 была подтверждена в полевых опытах на посадках земляники (сорт Царскосельская) против землянично-малинного долгоносика и серой гнили.

Посадки земляники опрыскивали в период выдвижения бутонов препаратом основе штамма BtH₁₀ 109/7, полученном описанным выше в примере способом, а для сравнения опрыскивали препаратом на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109. Норма применения препарата - 15 л/га. В контроле обработку препаратами не проводили. Учет пораженности растений землянично-малинным долгоносиком проводили на 10 и 20 сутки, а поражение ягод серой гнилью - на 20 сутки. Учитывали также количество цветоносов. После этого рассчитывали биологическую эффективность в % по отношению к контролю. Результаты опыта приводятся в таблице 8.

Результаты опытов, представленные в таблице 8, подтвердили, что препарат на основе нового штамма BtH₁₀ 109/7 обладает более выраженными полифункциональными свойствами; его активность на 20 сутки была выше против землянично-малинного долгоносика на 13,2%, против серой гнили - на 19,8%, чем у препарата на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109.

Из данных, приведенных в Таблице 8 следует, что обработка посадок земляники препаратами на основе Bt увеличивает количество цветоносов, что подтверждает их фиторегуляторную активность, причем при обработке препаратом на основе нового штамма BtH₁₀ 109/7 она на 8% выше, чем у препарата на основе штамма-прототипа BtH₁₀ 109.

Таким образом, экспериментально доказано, что новый штамм бактерий Bacilllus thuringiensis var. Darmstadiensis 109/7 (BtH₁₀ 109/7) обладает полифункциональными свойствами: инсектицидной активностью в отношении широкой группы массовых вредоносных видов жесткокрылых, чешуекрылых насекомых-фитофагов, высокой антифунгальной активностью в отношении различных фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, а также ростостимулирующим действием (фиторегуляторной активностью) на растения и пригоден для производства высокоэффективных биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от вредных массовых насекомых-фитофагов и грибных фитопатогенов. Новый штамм и биопрепараты, полученные на его основе, позволят расширить класс биологических средств защиты и стимуляции роста растений.

Штамм бактерий BtH₁₀ 109/7 по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсикогенности не патогенен для теплокровных животных и человека и, в соответствии с Методическими указаниями №2620-82 и №4263-87, относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Результаты по безопасности данного препарата согласуются с мировой практикой использования биоинсектицидов на основе штаммов бактерий группы Bacillus thuringiensis.

Claims (1)

1. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 109/7, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 06262 в качестве полифункционального средства для растений, обладающий защитной энтомоцидной и антифунгальной активностью, а также ростостимулирующим действием.