RU2812356C1 - Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP вируса Марбург в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и рекомбинантный белок GP-MARV, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и используемый для получения иммунобиологических препаратов - Google Patents
Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP вируса Марбург в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и рекомбинантный белок GP-MARV, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и используемый для получения иммунобиологических препаратов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812356C1 RU2812356C1 RU2023127251A RU2023127251A RU2812356C1 RU 2812356 C1 RU2812356 C1 RU 2812356C1 RU 2023127251 A RU2023127251 A RU 2023127251A RU 2023127251 A RU2023127251 A RU 2023127251A RU 2812356 C1 RU2812356 C1 RU 2812356C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- marv
- recombinant
- coordinates
- cho
- cell line
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title abstract description 25
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 title description 47
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 title 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 9
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 claims description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 14
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 208000000932 Marburg Virus Disease Diseases 0.000 description 3
- 201000011013 Marburg hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- ZENKESXKWBIZCV-UHFFFAOYSA-N 2,2,4,4-tetrafluoro-1,3-benzodioxin-6-amine Chemical group O1C(F)(F)OC(F)(F)C2=CC(N)=CC=C21 ZENKESXKWBIZCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 208000007136 Filoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP MARV в клетках млекопитающих. Также описан рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GP-MARV, продуцирующий рекомбинантный поверхностный гликопротеин GP MARV и содержащий интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim. Также описан рекомбинантный белок GP MARV, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии CHO-K1-GP-MARV. Техническим результатом изобретения является создание плазмиды, штамма-продуцента клеток СНО-K1-MARV, продуцирующего поверхностный гликопротеин GP MARV в более корректной форме. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к интегративному плазмидному вектору pVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающему экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP вируса Марбург (MARV) в эукариотической системе клеток млекопитающих, штамму рекомбинантной клеточной линии СНО-K1-GP-MARV и рекомбинантному белку GP-MARV, продуцируемому указанной клеточной линией СНО-GP-MARV и может быть использовано в области генной инженерии и биотехнологии.
Рекомбинантный поверхностный гликопротеин GP-MARV может служить для создания диагностикумов геморрагической лихорадки Марбург, а также для решения лабораторных задач, таких как получение фаговых библиотек.
Интегративный плазмидный вектор PVEAL3- GP-MARV-Trim депонирован в коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Уровень техники
Геморрагическая лихорадка Марбург - острое природно-очаговое заболевание, характеризующееся тяжелым течением, геморрагическим синдромом, высоким уровнем контагиозности и летальности [Siegert R.,Shu H.L., Slenczka W. Peters D, Müller G. On the etiology of an unknown human infection originating from monkeys. DMW. 1967; 92 (51):2341-3].
Периодически возникающие эпидемии в Западной Африке указывают важность разработки вакцин и профилактических препаратов против заболеваний, вызванных филовирусами, для общественного здравоохранения. Вакцина против филовирусных инфекций, прежде всего, нужна исследователям и врачам, непосредственно имеющих контакт с вирусом [Hensley L.E., Jones S.M., Feldmann H., et al. Ebola and Marburg viruses: pathogenesis and development of countermeasures // Curr. Mol. Med. - 2005. - V. 5. - №8. - Р.761-762].
В настоящее время не существует терапевтических препаратов или вакцин, одобренных для лечения или профилактики геморрагической лихорадке, вызванной вирусом Марбург. Поддерживающая терапия остается единственным одобренным медицинским вмешательством для инфицированных лиц. Поэтому существует необходимость иметь безопасную и эффективную вакцину или противовирусные препараты, которые можно было бы использовать для защиты медицинских работников и других лиц из группы риска.
Основные усилия разработчиков вакцин против болезней, вызванных филовирусами, сосредоточены на использовании в качестве антигена GP, так как он содержит иммуногенные эпитопы [Hevey M., Negley D., VanderZanden L., et al. Marburg virus vaccines: comparing classical and new approaches // Vaccine. - 2001. - V.20. - № 3. - P. 586-593], которые являются мишенью нейтрализующих антител (NAbs) вирус. Наличие гуморального иммунного ответа, направленного на GP, является основным элементом защиты организма [Ascenzi P., Bocedi A., Heptonstall J., et al. Ebolavirus and Marburgvirus: insight the Filoviridae family // Molecular aspects of medicine. - 2008. - V. 29. - №. 3. - P. 151-185]. GP единственный поверхностный белок MARV, тримеры которого образуют шипы на поверхности вириона, которые прикрепляются к клетке, с помощью него РНК MARV проникает в чувствительные клетки. Поэтому основным и важным компонентом любой кандидатной вакцины против MARV, является высокогликозилированный гликопротеиновый комплекс GP, представленный на поверхности вириона [Волкова Н.В., Казачинская Е.И., Щербаков Д.Н. Экспериментальные вакцины для профилактики геморрагической лихорадки Марбург и биомодели для изучения ее патогенеза. Проблемы особо опасных инфекций. 2018;(3):8-15]. Важным фактором для получения GP MARV является выбор системы экспрессии. Наиболее перспективными являются клетки млекопитающих, поскольку позволяют получать целевой белок в наиболее близкой к нативной форме, т.е. прошедший необходимые пострансляционные модификации, что весьма важно для иммуногенности рекомбинантного белка.
Ближайшие аналоги
Предыдущие попытки получить стабильный гликопротеин MARV были раскрыты, например, в международных заявках на патент WO/2017/037196, в которой были описаны определенные стабилизирующие мутации гликопротеина филовируса. Отличием от нашего изобретения является система экспрессии тримера гликопротеина. В данной заявке тримеризованные варианты были получены в клетках млекопитающих Expi293.
Известно изобретение по патенту RU 2752858, МПК С12N 15/74, опубл. 11.08.2021 г. В данном патенте используется наиболее близкий интеграционный вектор pVEAL2 для создания стабильного продуцента вирусного белка RBD SARS-CoV-2 c использованием клеточной линии CHO-K1.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является стабилизированный тример гликопротеина вируса Марбург (патент США №11603390, МПК C07К 14/08, опубл. 14.03.2023 г.). В изобретении предусмотрены филовирусные гликопротеиновые мутации, стабилизирующие тримерную форму гликопротеина. Гликопротеин GP MARV TRIM имеет определенные аминокислотные замены в определенных позициях в последовательности указанного гликопротеина. GP MARV TRIM, описанный в описании изобретения, имеет улучшенный процент образования тримера и/или улучшенный выход тримера по сравнению с гликопротеином, который не имеет одной или нескольких из указанных аминокислотных замен. Также представлены молекулы и векторы нуклеиновых кислот, кодирующие гликопротеин GP MARV TRIM. Плазмидный вектор представляет аденовирусный вектор. Клетка-хозяин содержит молекулу нуклеиновой кислоты или аденовирусный вектор. В качестве клетки-хозяина используют линию клеток человека Expi293.
Однако все еще имеется необходимость в получении тримеров гликопротеина вируса Марбург GP MARV TRIM в более корректной форме для расширения спектра средств профилактики и диагностики указанного вируса.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной конструкции и нового рекомбинантного штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка, продуцирующего поверхностный гликопротеин GP MARV в более корректной форме и способного взаимодействовать с антителами иммунизированного животного.
Технический результат достигается созданием интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающего экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP MARV в клетках млекопитающих, имеющего размер 5919 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 и содержащего в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:
- 5'ITR_SB, имеющий координаты с 88 по 317 п.н.;
- Плечо интеграции 5'IFR, имеющий координаты с 318 по 368 п.н.;
- CMV enhancer, имеющий координаты с 369 по 733 п.н.;
- CmV promoter, имеющий координаты с 734 по 937 п.н.;
- Ген GP-MARV-Trim, имеющий координаты с 1033 по 2442 п.н. и кодирующий поверхностный гликопротеин GP MARV;
- Foldon, имеющий координаты с 2443 по 2523 п.н.;
- Последовательность 10his, имеющий координаты с 2524 по 2553 п.н. и являющийся полигистидиновым тэгом для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии;
- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющий координаты с 2603 по 3177 п.н.;
- BleoR - ген устойчивости к антибиотику блеомицину, имеющий координаты с 3182 по 3189 п.н.;
- PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты с 3190 по 3789 п.н.;
- T3 promoter, имеющий координаты с 3799 по 3806 п.н.;
- SV40 poly(A) signal, имеющий координаты с 3824 по 3945 п.н.;
- Плечо интеграции 3'IFR, имеющий координаты с 3969 по 4016 п.н.;
- 3'ITR_SB, имеющий координаты с 4017 по 4246 п.н.;
- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты с 4433 по 5248 п.н.;
- Участок начала репликации Ori, имеющий координаты с 5311 по 5898 п.н.
Технический результат был достигнут также созданием штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, полученного путем трансфекции клеток экспрессионным вектором PVEAL3-GP-MARV-Trim по п. 1 и продуцирующего поверхностный гликопротеин GP MARV.
Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный белок GP MARV (поверхностный гликопротеин), продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, молекулярную массу 162 кДа и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.
Для разработки продуцента была выбрана клеточная линия СНО-К1, поскольку экспресcионная система позволяет получать наиболее корректную форму белка, обеспечивая все необходимые процессы посттрансляционной модификации. Для получения эффективной культуры-продуцента в заявленном изобретении проведен отбор наиболее продуктивных клонов. Это дополнительно увеличивает выход целевого продукта, поскольку поликлональная клеточная культура содержит клоны с разной способностью к продукции рекомбинантного белка. Описан способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV продуцента рекомбинантного поверхностного гликопротеина MARV, содержащего генетическую конструкцию (SEQIDNO:1), введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток проводили при помощи антибиотика Puromycin B.
Таким образом, заявляемая группа изобретений обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка GP MARV в иммунологически корректной форме, что является хорошей платформой для создания иммунобиологических препаратов и вакцин. Технические решения соответствуют критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Осуществление изобретения
Описание фигур
Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1 - 6.
На фиг. 1 изображена физическая и генетическая карта универсального интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim.
На фиг.2 представлено электрофоретическое разделение образца культуральной жидкости, содержащей тримеризованный рекомбинантный белок GP-MARV, в 15%-ном ПААГ-SDS.
Примечание:
1 - белковые маркеры молекулярной массы (кДa);
2 - образец культуральной жидкости, содержащей тримеризованный рекомбинантный белок GP-MARV.
На фиг. 3 представлены результаты иммуноферментного анализа взаимодействия отобранных клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с моноклональным антителом MR191 против MARV.
Примечание: MR191 - человеческое моноклональное антитело против MARV, ранее описанное в статье King L.B., Fusco M.L., Flyak A.I. et al. The Marburgvirus-Neutralizing Human Monoclonal Antibody MR191 Targets a Conserved Site to Block Virus Receptor Binding // Cell host & microbe. - 2018. - V. 23. - №. 1. - P. 101-109, полученное в отделе биоинженерии.
В качестве отрицательного контроля использовали тримеризованный вариант RBD поверхностного белка S SARS-CoV-2, полученный в отделе биоинженерии. В качестве положительного контроля использовали вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности поверхностный гликопротеин MARV, полученные в отделе биоинженерии.
На фиг. 4 представлены результаты исследования антигенности тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с помощью дот-блот анализа. В качестве положительного контроля использовали вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности поверхностный гликопротеин MARV, полученные в отделе биоинженерии.
На фиг. 5 приведена нуклеотидная последовательность интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, а на фиг. 6 - аминокислотная последовательность поверхностного гликопротеина GP MARV.
В таблице 1 представлены последовательности синтезированных олигонуклеотидов, использованных для получения плазмиды PVEAL3-GP-MARV-Trim.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K. et al. Science. 1988, 239(4839):487-491; Sanger F. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74:5463-5467].
Пример 1. Конструирование интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающего экспрессию поверхностного гликопротеина GP MARV
Для получения тримеризованного варианта GP MARV взята нуклеотидная последовательность, кодирующая гликопротеин GP MARV, из базы данных GenBank (CAA82539.1). Далее была проведена кодон - оптимизация под клеточную линию яичников китайского хомячка СНО-K1 в онлайн сервисе https://www.thermofisher.com для увеличения выхода целевого белка. Синтез праймеров (табл. 1) и нуклеотидной последовательности, кодирующей тример GP MARV, был осуществлен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).
В состав вектора PVEAL3 была клонирована искусственно синтезированная последовательность, кодирующая тримеризованный вариант GP MARV (фиг.1). Последовательности синтезированных праймеров, использованных для сборки интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Последовательности синтезированных олигонуклеотидов, использованных для получения интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim | |
Название | Последовательность |
F-GP | 5’- aaaaaagctagGCTAGCGCCACCATGAAGAC -3’ |
R-GP | 5’-aaaaaaGTCGACTTAATGGTGATGGTGGT -3’ |
С помощью ПЦР была амплифицирована нуклеотидная последовательность GP-MARV-Trim, кодирующая тримеризованный гликопротеин GP MARV. ПЦР проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл, содержащая 2 мкг ДНК (плазмида pGH-GP-MARV-Trim), 10 пкМ каждого праймера (F-GP и R-GP) (таблица 1), 10 мкл 5х Q5 реакционного буфера, 10 мкл 5хQ5 High GC Enhancer, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 0.5 ед. Q5 High-Fidelity ДНК-полимеразы, реакцию осуществляли при следующих параметрах: 10с - 98°С (1 цикл), 10 с - 58°С, 70 с - 72°С (30 циклов). Готовый ПЦР-продукт был выделен и очищен из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Предварительно наработанную и очищенную плазмиду PVEAL3 и ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AsuNHI и SalI. Реакцию гидролиза проводили в условиях, рекомендованных производителем. С целью очистки линеаризованного вектора, плазмидную ДНК наносили на 1%-й агарозный гель и выделяли из геля с использованием набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакция проводилась при +4°С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамм Neb Stable.
Первичную проверку на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл).
Положительные колонии, культивировали в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNAminikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Первичную структуру экспрессионного вектора подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате был получен интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 (фиг. 3) и обеспечивающий экспрессию белка тримеризованного поверхностного гликопротеина GP MARV.
Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемых генов (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена целевая плазмидная ДНК.
Пример 2. Трансфекция клеток CHO-K1 интегративным плазмидным вектором PVEAL3-GP-MARV-Trim, получение штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, продуцирующего тримеризованный поверхностный гликопротеин GP MARV
Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, получен на основе клеточной линии яичников китайского хомячка СНО-K1 с использованием разработанной конструкции PVEAL3-GP-MARV-Trim. Cуспензию клеток CHO-K1, растили в инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности температуре (37±1)°С во влажной атмосфере 5% СО2 и скорости вращения платформы 185 об/мин. При достижении плотности суспензии 5х106 клеток/мл проводили трансфекцию клеток с помощью полиэтиленамина (PEI 25K™) в соответствии с инструкцией производителя. Трансфецировали клетки смесью плазмид PVEAL3-GP-MARV-Trim и pCMV(CAT)T7-SB100, взятых в соотношении 1:10. Через 48 часов после трансфекции добавляли селективный антибиотик пуромицин в концентрации 2 мкг/мл. Cелекцию проводили в течение 12 суток с постепенным увеличением концентрации антибиотика с 2 до 10 мкг/мл. Полученный пул клеток был криоконсервирован, после чего было проведено клонирование с целью отбора индивидуальных клонов с высокой продукцией. Клонирование выполнялось методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах. Через 14 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон, для которых проводили отбор культуральной жидкости с целью оценки продуктивности клонов при помощи ИФА, из которых и получен заявляемый рекомбинантный штамм CHO-K1-GP-MARV.
Характеристика рекомбинантного штамма CHO-K1-GP-MARV.
Морфология: веретеновидные и эпителиоподобные клетки с круглыми ядрами, содержащими от 1 до 2 ядрышек.
Способ культивирования: суспензионный.
Среда для культивирования: 97% питательная среда HyCell CHO, 2% Glutamax, 1% Pluronic-F68.
Температура культивирования: 37°С.
Посевная концентрация: 1x106 клеток в 1 мл.
Частота пассирования: 3-4 суток.
Условия криоконсервации: питательная среда DМЕМ/F-12 (1:1) - 50 %, сыворотка крови плодов коровы - 40 %, ДМСО - 10 %.
Режим замораживания: при температуре 4°С - 1 ч, минус 80°С - 12 ч, минус 196°С.
Условия хранения: в криопробирках в количестве 5 шт. хранится в жидком азоте при температуре минус 196°С.
Номер пассажа в жидком азоте: 3.
Жизнеспособность после криоконсервации: 85-90 %.
Пример 3. Очистка тримеризованного варианта поверхностного гликопротеина GP MARV
Тримеризованный рекомбинантный белок GP MARV выделяли из культуральной среды с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии с использованием сорбента Ni-IMAC сефарозы (GE Helthcare, США). Связывание белка с колонкой происходило при скорости 1,5 мл/мин. Промывку колонки от не связавшихся белков проводили пятикратным объемом промывочного буфера (40 мМ имидазола, 30 мМ NaH2PO4 , 500 мМ NaCl, pH 7,4) при скорости потока 2 мл/мин. Тримеризованный поверхностный гликопротеин GP MARV элюировали в трехкратном объеме элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 30 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, pH 7,4) при скорости потока 1 мл/мин. Фракции анализировали при помощи SDS-PAAG электрофореза.
Пример 4. Детекция тримеризованного варианта поверхностного гликопротеина GP MARV с помощью SDS-PAAG электрофореза
Электрофоретическое разделение белков проводили в SDS-ПААГ по Лэммли в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Образцы белков для электрофореза в нередуцирующих условиях смешивали с равным объемом буфера для нанесения и прогревали смесь 15 мин при 95°С. Разделение белков в SDS-ПААГ проводили в камере Mini-PROTEAN (BioRad, США) при постоянном напряжении 150V. Визуализацию белков проводили при окрашивании геля Кумасси Brilliant Blue R-250. На фиг.2 представлено электрофоретическое разделение образца культуральной жидкости, содержащей тримеризованный рекомбинантный белок GP-MARV, в 15%-ном ПААГ-SDS.
Пример 5. Иммуноферментный анализ взаимодействия отобранных клонов тримеризованного GP MARV с моноклональным антителом MR191 против MARV
Для идентификации тримеризованного белка поверхностного гликопротеина GP MARV, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, приведенную на фиг. 6, использовали иммуноферментный анализ. В качестве антитела было использовано нейтрализующее моноклональное антитело MR191 против MARV. В качестве отрицательного контроля был использован тримеризованный вариант RBD поверхностного белка S SARS-CoV-2. Сорбировали антитело MR191 в концентрации 200 нг/лунка в течение 16 часов при 4°С, а затем удалили из лунок путем встряхивания. Блокировка проходила при добавлении в лунки к сорбированным антигенам по 200 мкл блокирующего буфера (фосфатно-солевой буфер (ФСБ) + 1% BSA) и инкубации при 37°С в течении 2 часов. После удаления растворов четырехкратно промыли лунки промывочным буфером ФСБ-0,5% Tween20 (ФСБ-Т). Затем вносили 100 мкл образцов культуральной жидкости индивидуальных клонов в двух повторах и инкубировали 1 ч при 37°С. Затем отмывали лунки четырехкратно промывочным буфером и в лунки вносили по добавляли Goat anti mouse igG (ООО «Bio-rad», США) в разведении 1/1000. Инкубировали 2 часа при 37°С и промыли лунки четырехкратно с ФСБ-Т. Для визуализации результатов в лунки вносили по 100 мкл 0,02% раствора хромогена ТМБ в цитрат-фотфатном буфере с перекисью водорода (БРС). После 15 мин инкубации при 37°С в лунки нанесли по 50 мкл 0,9М раствора серной кислоты в качестве стоп-реагента. Результаты регистрировали в планшетном ридере при длине волны 450 нм. Данные оптической плотности и анализ приведены на фиг. 3. Результаты иммуноферментного анализа подтверждают взаимодействия отобранных клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с моноклональным антителом MR191 против MARV.
Пример 6. Исследование антигенности отобранный клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV
На нитроцеллюлозную мембрану однократно наносили по 1 мкл культуральной среды отобранных клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV под номерами 1, 2, 4, 9, 11 и высушивали на воздухе. В качестве отрицательного контроля на нитроцеллюлозную мембрану наносили 1 мкл бычьего сывороточного альбумина. В качестве положительного контроля на нитроцеллюлозную мембрану наносили 1 мкл ВПЧ MARV. Целлюлозу инкубировали с блокирующим буферным раствором, содержащего 1% казеина + ФСБ-Т. После трехкратной промывки ФСБ-Т наносили антитело MR191 (2 мкг/мл) разбавленном в блокирующем растворе и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После трехкратной промывки добавляли раствора антитела IgG против Fc-участка IgG человека, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Invitrogen, США), в рабочем разведении 1:1000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После трехкратной промывки наносили добавляли BCIP/NBT (Invitrogen, США), инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в темноте. После трехкратной промывки водой нитроцеллюлозную мембрану высушивали на воздухе.
На фиг. 4 представлены результаты исследования, подтверждающие антигенность тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с помощью дот-блот анализа. В качестве отрицательного контроля использовали бычий сывороточный альбумин.
Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, содержащий в своем составе ген, кодирующий тримеризованный поверхностный гликопротеин GP MARV. Транфецированная рекомбинантной плазмидой культура клеток CHO-K1 осуществляет синтез и секрецию тримеризованного поверхностного гликопротеина GP MARV.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Интегративный
плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-09-05">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>RU-PVEAL3-GP-MARV-Trim</ApplicationNumberText
>
<FilingDate>2023-09-05</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>RU-PVEAL3-GP-MARV-Trim</ApplicantFileReferenc
e>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>RU-PVEAL3-GP-MARV-Trim</ApplicationNumberText
>
<FilingDate>2023-09-05</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>State Research Center of Virology and
Biotechnology VECTOR</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle
languageCode="ru">PVEAL3-GP-MARV-Trim</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>5919</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..5919</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgaagaaaggcccacccgtgaaggtgagccagtgagttgattgcagtcc
agttacgctggagtctgaggctcgtcctgaatggatccctatacagttgaagtcggaagtttacatacac
ttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttg
gcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagat
tatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttcgactcc
tctgcagaatgcggcgatgtttcggtaaggggtccgctactagttattaatagtaatcaattacggggtc
attagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg
cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcc
attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc
aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctta
tgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggc
agtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaa
tgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg
caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaaccca
ctgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccgctagcgcc
accatgaagaccacctgtctgttcatctccctgatcctgatccagggcatcaagaccctgcctatcctgg
aaatcgcctccaacaaccagcctcagaacgtggactctgtgtgcagcggcaccctgcagaaaaccgagga
tgtgcacctgatgggcttcaccctgagcggccagaaagtggccgattctccactggaagcctccaagaga
tgggccttcagaacaggcgtgccacctaagaacgtcgagtacaccgagggcgaagaggccaagacctgct
acaacatctccgtgaccgatccttccggcaagtccctgctgctggatcctcctaccaacatccgggacta
ccccaagtgcaagaccatccaccacatccagggccagaatcctcacgctcagggaatcgctctgcatctg
tggggcgcctttttcctgtacgaccggatcgccagcaccaccatgtacagaggcagagtgtttaccgagg
gcaatatcgccgccatgatcgtgaacaagaccgtgcacaagatgatcttcagccggcaaggccagggcta
cagacacatgaacctgacctccaccaacaagtactggaccagcaacaacggcacccagaccaacgacacc
ggctgttttggtgccctgcaagagtacaactccaccaagaaccagacctgcgctcccagcaagatcccct
ctcctttgcctactgctcggcccgagatcaagcctacctctacacctaccgacgccaccacactgaacac
ccagcacctggtgtacttccggaaaaagcggtccatcctttggcgcgagggcgatatgttccctttcctg
gacggcctgatcaacgcccctatcgacttcgaccctgtgcctaacaccaagacaatcttcgacgagtcct
cctcctctggcgcctctgctgaagaggatcagcacgcctctccaaacatctctctgaccctgagctactt
ccccaacatcaacgagaacaccgcctactccggcgagaacgagaacgactgtgatgccgagctgcggatt
tggagcgtgcaagaggatgatctggctgccggcctgagctggatccctttctttggacctggcatcgagg
gcctgtataccgccggactgatcaagaatcagaacaacctcgtgtgccggctgcgcagactggctaatca
gaccgccaagagcctggaactgctgctgagagtgaccaccgaggaacggaccttctctctgatcaaccgg
cacgccatcgactttctgctgaccagatggggcggcacatgcaaagtgctgggccctgactgttgcatcg
gaatcgaggacctgagccggaacatcagcgagcagatcgaccagatcaagaaggacgagcagaaagaagg
caccggcgcctccggctacatccctgaggcccctagagatggccaggcctatgtgagaaaggatggcgag
tgggtgctgctgtctacctttctgcatcaccaccatcatcaccatcaccaccactaagcttaagtttaaa
ccgctgatcagcctcgtcgaccgagcggttcccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccg
aagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggc
aatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgcca
aaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaac
gtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagcca
cgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaa
gagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtat
gggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggcc
ccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatgaccgagt
acaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgtt
cgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaa
gaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtgg
cggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccga
gttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggag
cccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcg
tgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaa
cctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacc
tggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgattcgcatatgggttaatgcttcgagcagacatgataagat
acattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtga
tgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagtttaccgtcgacctctagctagagct
actcgggaccccttaccgaaacatcgccgcattctgcagaggagtcgagtgtatgtaaacttctgaccca
ctgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctctctactattattctgatatttcaca
ttcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaa
ttgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtataggga
tccgctcaatactgaccatttaaatcatacctgacctccatagcagaaagtcaaaagcctccgaccggag
gcttttgacttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgt
attttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgagccatattcaacgggaaacgtct
tgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatg
tcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaaca
tggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaggctaaactggctgacggaatttatg
cctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatcccag
ggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagt
gttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacggcgatcgcgtatttcgtctg
gctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttggtgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggct
ggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactca
tggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacga
gtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcat
tacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcacttgat
gctcgatgagtttttctaatgagggcccaaatgtaatcacctggctcaccttcgggtgggcctttctgcg
ttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgatgctcaagtcagaggt
ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgt
tccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagc
tcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccg
ttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatc
gccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttg
aagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtta
cctcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtt
tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgattttctac</INSDSeq_
sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>470</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..470</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MKTTCLFISLILIQGIKTLPILEIASNNQPQNVDSVCSGTLQKTEDVHL
MGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPTNIRDYPKC
KTIHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRIASTTMYRGRVFTEGNIAAMIVNKTVHKMIFSRQGQGYRHM
NLTSTNKYWTSNNGTQTNDTGCFGALQEYNSTKNQTCAPSKIPSPLPTARPEIKPTSTPTDATTLNTQHL
VYFRKKRSILWREGDMFPFLDGLINAPIDFDPVPNTKTIFDESSSSGASAEEDQHASPNISLTLSYFPNI
NENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAK
SLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSRNISEQIDQIKKDEQKEGTGA
S</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (19)
1. Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP MARV в клетках млекопитающих, имеющий размер 5919 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и содержащий в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:
- 5'ITR_SB, имеющий координаты с 88 по 317 п.н.;
- Плечо интеграции 5'IFR, имеющий координаты с 318 по 368 п.н.;
- CMV enhancer, имеющий координаты с 369 по 733 п.н.;
- CmV promoter, имеющий координаты с 734 по 937 п.н.;
- Ген GP-MARV-Trim, имеющий координаты с 1033 по 2442 п.н. и кодирующий поверхностный гликопротеин GP MARV;
- Foldon, имеющий координаты с 2443 по 2523 п.н.;
- Последовательность 10his, имеющий координаты с 2524 по 2553 п.н. и являющийся полигистидиновым тэгом для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии;
- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющий координаты с 2603 по 3177 п.н.;
- BleoR - ген устойчивости к антибиотику блеомицину, имеющий координаты с 3182 по 3189 п.н.;
- PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты с 3190 по 3789 п.н.;
- T3 promoter, имеющий координаты с 3799 по 3806 п.н.;
- SV40 poly(A) signal, имеющий координаты с 3824 по 3945 п.н.;
- Плечо интеграции 3'IFR, имеющий координаты с 3969 по 4016 п.н.;
- 3'ITR_SB, имеющий координаты с 4017 по 4246 п.н.;
- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты с 4433 по 5248 п.н.;
- Участок начала репликации Ori, имеющий координаты с 5311 по 5898 п.н.
2. Рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, продуцирующий рекомбинантный поверхностный гликопротеин GP MARV и содержащий интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim по п. 1.
3. Рекомбинантный белок GP MARV, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, молекулярную массу 162 кДа и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2812356C1 true RU2812356C1 (ru) | 2024-01-30 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011130627A3 (en) * | 2010-04-16 | 2011-12-08 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Chimpanzee adenoviral vector-based filovirus vaccines |
JP2021001191A (ja) * | 2012-04-12 | 2021-01-07 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | フィロウイルスコンセンサス抗原、核酸構築物、およびそれから作製されるワクチン、ならびにその使用方法 |
RU2760439C1 (ru) * | 2021-04-30 | 2021-11-25 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011130627A3 (en) * | 2010-04-16 | 2011-12-08 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Chimpanzee adenoviral vector-based filovirus vaccines |
JP2021001191A (ja) * | 2012-04-12 | 2021-01-07 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | フィロウイルスコンセンサス抗原、核酸構築物、およびそれから作製されるワクチン、ならびにその使用方法 |
RU2760439C1 (ru) * | 2021-04-30 | 2021-11-25 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Волкова Н.В., Казачинская Е.И., Щербаков Д.Н. Экспериментальные вакцины для профилактики геморрагической лихорадки Марбург и биомодели для изучения ее патогенеза // Проблемы особо опасных инфекций. 2018. N3. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2022046460A (ja) | 祖先ウイルス配列を予測する方法およびその使用 | |
TWI297040B (en) | Recombinant baculovirus and virus-like particle | |
Brugge et al. | Peptide analysis of the transformation-specific antigen from avian sarcoma virus-transformed cells | |
RU2733831C1 (ru) | Искусственный ген, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связующего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 | |
CN113845576B (zh) | 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用 | |
JPH06502069A (ja) | ワクシニアベクター,ワクシニア遺伝子及びその発現生成物 | |
CN114437185A (zh) | 冠状病毒三聚体亚单位疫苗及其应用 | |
US6514728B1 (en) | Process for preparation of cytokines using Sendai virus expression system | |
CN108823245A (zh) | 一种病毒样颗粒的纯化方法 | |
JP2009502117A (ja) | 赤血球新生刺激タンパク質生成のための組み換え法 | |
RU2812356C1 (ru) | Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP вируса Марбург в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и рекомбинантный белок GP-MARV, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и используемый для получения иммунобиологических препаратов | |
US20140308706A1 (en) | Recombinant fusion interferon for animals | |
CN108250293B (zh) | 抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体g7a6及其应用 | |
JP3847257B2 (ja) | Hbvの検出又は測定方法 | |
TWI245048B (en) | Methods and constructs for protein expression | |
CN116444661A (zh) | 一种广谱中和SARS-CoV-2的中和抗体P186-1H2及其应用 | |
Garanina et al. | Construction of recombinant adenovirus containing picorna-viral 2A-peptide sequence for the co-expression of neuro-protective growth factors in human umbilical cord blood cells | |
CN110204613B (zh) | 一种针对胡宁病毒的中和抗体、其制备方法及其应用 | |
Sorokin et al. | Human recombinant laminin-binding protein: isolation, purification, and crystallization | |
RU2801532C1 (ru) | Плазмидная генетическая конструкция pVEAL2-9E2ch-scFv, штамм рекомбинантной клеточной линии CHO-K1-9E2ch и химерное одноцепочечное антитело 9E2ch против вируса Западного Нила, продуцируемое указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-9E2ch, обладающее высоким сродством к неонатальному рецептору FcRn | |
JPH02142737A (ja) | 擬似狂犬病ウイルスワクチン | |
CN111286512A (zh) | 靶向人源化酪氨酸激酶孤儿受体1的嵌合抗原受体及其用途 | |
CN111518823B (zh) | 一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用 | |
CN111533791B (zh) | 一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的制备方法和应用 | |
RU2789735C1 (ru) | Штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка NS1 |