RU2810079C2 - Method of treating alzheimer's disease through regulation of intestinal microorganisms - Google Patents
Method of treating alzheimer's disease through regulation of intestinal microorganisms Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810079C2 RU2810079C2 RU2022105789A RU2022105789A RU2810079C2 RU 2810079 C2 RU2810079 C2 RU 2810079C2 RU 2022105789 A RU2022105789 A RU 2022105789A RU 2022105789 A RU2022105789 A RU 2022105789A RU 2810079 C2 RU2810079 C2 RU 2810079C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mice
- gut
- microbes
- cells
- relative abundance
- Prior art date
Links
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 203
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 title claims abstract description 65
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 48
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 121
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims abstract description 28
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 claims abstract description 26
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 22
- 241001261005 Verrucomicrobia Species 0.000 claims abstract description 20
- 241001453172 Fusobacteria Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 95
- -1 mannuronic acid oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 43
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 35
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 32
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 22
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 12
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 11
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 38
- 230000007149 gut brain axis pathway Effects 0.000 abstract description 12
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 248
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 133
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 129
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 128
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 128
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 127
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 90
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 85
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 85
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 83
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 82
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 75
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 71
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 68
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 67
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 63
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 57
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 57
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 52
- 238000011818 5xFAD mouse Methods 0.000 description 48
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 48
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 48
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 46
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 46
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 46
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 38
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 36
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 31
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 31
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 29
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 27
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 27
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 25
- 230000008859 change Effects 0.000 description 23
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 22
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 21
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 20
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 20
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 20
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 20
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 18
- 102100040121 Allograft inflammatory factor 1 Human genes 0.000 description 17
- 101000890626 Homo sapiens Allograft inflammatory factor 1 Proteins 0.000 description 17
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 17
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 15
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 15
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 15
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102100038204 Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Human genes 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 108091006232 SLC7A5 Proteins 0.000 description 14
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 14
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 13
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 13
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 12
- 230000006724 microglial activation Effects 0.000 description 12
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 12
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 12
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 12
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 11
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 11
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102100025074 C-C chemokine receptor-like 2 Human genes 0.000 description 10
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 10
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 10
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 10
- YGPSJZOEDVAXAB-UHFFFAOYSA-N kynurenine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(=O)C1=CC=CC=C1N YGPSJZOEDVAXAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- XNRZJPQTMQZBCE-SFHVURJKSA-N (2s)-2-amino-3-[4-[(5-amino-2-phenyl-1,3-benzoxazol-7-yl)methoxy]-3,5-dichlorophenyl]propanoic acid Chemical compound ClC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(Cl)=C1OCC1=CC(N)=CC2=C1OC(C=1C=CC=CC=1)=N2 XNRZJPQTMQZBCE-SFHVURJKSA-N 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N N(2)-acetyl-L-ornithine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC[NH3+] JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 8
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N Carnosic acid Natural products CC([C@@H]1CC2)(C)CCC[C@]1(C(O)=O)C1=C2C=C(C(C)C)C(O)=C1O QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N 0.000 description 7
- 108010087806 Carnosine Proteins 0.000 description 7
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YDGMGEXADBMOMJ-LURJTMIESA-N N(g)-dimethylarginine Chemical compound CN(C)C(\N)=N\CCC[C@H](N)C(O)=O YDGMGEXADBMOMJ-LURJTMIESA-N 0.000 description 7
- CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N N-beta-alanyl-L-histidine Natural products NCCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 7
- 229940044199 carnosine Drugs 0.000 description 7
- CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N carnosine Chemical compound [NH3+]CCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC=N1 CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 7
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 7
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 7
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 7
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 7
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 7
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 7
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 7
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 6
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 6
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 6
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 6
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 6
- VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N hypotaurine Chemical compound [NH3+]CCS([O-])=O VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000013016 learning Effects 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 6
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 5
- 108090000835 CX3C Chemokine Receptor 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100039196 CX3C chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 101001034843 Mus musculus Interferon-induced transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 5
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 5
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 5
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 5
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- MPUVBVXDFRDIPT-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-norbornanecarboxylic acid Chemical compound C1CC2C(N)(C(O)=O)CC1C2 MPUVBVXDFRDIPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 4
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 4
- 102100023698 C-C motif chemokine 17 Human genes 0.000 description 4
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 4
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 description 4
- 102000007499 CD27 Ligand Human genes 0.000 description 4
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 4
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010083702 Chemokine CCL21 Proteins 0.000 description 4
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 4
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 4
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 4
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 4
- 101000978362 Homo sapiens C-C motif chemokine 17 Proteins 0.000 description 4
- 101000798130 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Proteins 0.000 description 4
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 4
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 4
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 4
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 4
- 102100037795 Interleukin-6 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 4
- 101710152369 Interleukin-6 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 102100026388 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 4
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710127797 Macrophage colony-stimulating factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000425347 Phyla <beetle> Species 0.000 description 4
- DLRVVLDZNNYCBX-UHFFFAOYSA-N Polydextrose Polymers OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 4
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 4
- 102000007156 Resistin Human genes 0.000 description 4
- 108010047909 Resistin Proteins 0.000 description 4
- 101710170513 Retinoic acid receptor responder protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100033914 Retinoic acid receptor responder protein 2 Human genes 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 4
- 101710108792 Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 4
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 4
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 4
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 4
- 102000009521 Vascular Endothelial Growth Factor B Human genes 0.000 description 4
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 4
- 102000009519 Vascular Endothelial Growth Factor D Human genes 0.000 description 4
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 4
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 4
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 4
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 4
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 4
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 4
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 4
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 3
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 3
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 3
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 3
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 3
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 3
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108091006313 SLC3A2 Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 description 3
- 230000007131 anti Alzheimer effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000007087 memory ability Effects 0.000 description 3
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- MLNOOVGSMCJSCE-DEOSSOPVSA-N (2S)-2-amino-3-[3-[[2,4-dicyano-3-[4-[2-(methylamino)-2-oxoethoxy]phenyl]pyrido[1,2-a]benzimidazol-1-yl]carbamoyl]phenyl]propanoic acid Chemical compound N[C@H](C(=O)O)CC1=CC(=CC=C1)C(NC1=C(C(=C(C=2N1C1=C(N=2)C=CC=C1)C#N)C1=CC=C(C=C1)OCC(=O)NC)C#N)=O MLNOOVGSMCJSCE-DEOSSOPVSA-N 0.000 description 2
- MEYZIGGCNFHINA-UHFFFAOYSA-N (6-aminoquinolin-2-yl) n-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-n-hydroxycarbamate Chemical compound C1=CC2=CC(N)=CC=C2N=C1OC(=O)N(O)N1C(=O)CCC1=O MEYZIGGCNFHINA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[(3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl)oxymethyl]-3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-6-methyloxane-3,5-diol Chemical compound OC1C(OC)C(O)COC1OCC1C(O)C(OC)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(C)C2O)O)O1 SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701474 Alistipes Species 0.000 description 2
- 241001135756 Alphaproteobacteria Species 0.000 description 2
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 2
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 2
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 2
- 102100038238 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Human genes 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 241001135755 Betaproteobacteria Species 0.000 description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241001600148 Burkholderiales Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 241001183186 Fusobacteriaceae Species 0.000 description 2
- UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N Gabapentin Chemical compound OC(=O)CC1(CN)CCCCC1 UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000926 Galactomannan Polymers 0.000 description 2
- 101000800023 Homo sapiens 4F2 cell-surface antigen heavy chain Proteins 0.000 description 2
- 101001121408 Homo sapiens L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 101000605020 Homo sapiens Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008292 L-Amino Acid Oxidase Proteins 0.000 description 2
- YGPSJZOEDVAXAB-QMMMGPOBSA-N L-kynurenine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(=O)C1=CC=CC=C1N YGPSJZOEDVAXAB-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 2
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 2
- 229920001100 Polydextrose Polymers 0.000 description 2
- 241000692844 Prevotellaceae Species 0.000 description 2
- 229920000294 Resistant starch Polymers 0.000 description 2
- 241000692845 Rikenellaceae Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021869 Tyrosine aminotransferase Human genes 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 2
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 2
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 2
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N d-xylitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000011985 exploratory data analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 235000021255 galacto-oligosaccharides Nutrition 0.000 description 2
- 150000003271 galactooligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 2
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000001259 polydextrose Substances 0.000 description 2
- 235000013856 polydextrose Nutrition 0.000 description 2
- 229940035035 polydextrose Drugs 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000021254 resistant starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000003936 working memory Effects 0.000 description 2
- KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- KUNFMZSTKSLIEY-RMTNWKGQSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2r)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KUNFMZSTKSLIEY-RMTNWKGQSA-N 0.000 description 1
- USIQKIIZGMXBHT-IPIKRLCPSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,5-diaminopentanoic acid Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 USIQKIIZGMXBHT-IPIKRLCPSA-N 0.000 description 1
- KJBQDYDTQCIAFO-ZLELNMGESA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O KJBQDYDTQCIAFO-ZLELNMGESA-N 0.000 description 1
- NTTZSGBWJWDEKV-ZBRNBAAYSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTTZSGBWJWDEKV-ZBRNBAAYSA-N 0.000 description 1
- YWOLSBHQLNEVOL-DNVVRKGNSA-N (2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YWOLSBHQLNEVOL-DNVVRKGNSA-N 0.000 description 1
- JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-N (S)-3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CC[C@H](C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEZNOYXGMQIOTB-UHFFFAOYSA-N 2-phenylacetaldehyde Chemical compound O=CCC1=CC=CC=C1.O=CCC1=CC=CC=C1 XEZNOYXGMQIOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006314 APC superfamily Proteins 0.000 description 1
- 102000037095 APC superfamily Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 241000466670 Adlercreutzia Species 0.000 description 1
- 241000606749 Aggregatibacter actinomycetemcomitans Species 0.000 description 1
- 208000006888 Agnosia Diseases 0.000 description 1
- 241001047040 Agnosia Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000448675 Alistipes putredinis DSM 17216 Species 0.000 description 1
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 238000010173 Alzheimer-disease mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940123819 Amino acid transporter inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 229920001685 Amylomaize Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241001013579 Anaerotruncus Species 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003062 Apraxia Diseases 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 101710151768 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108090000121 Aromatic-L-amino-acid decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108030000991 Aromatic-amino-acid transaminases Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000193833 Bacillales Species 0.000 description 1
- 241000606126 Bacteroidaceae Species 0.000 description 1
- 241000692822 Bacteroidales Species 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241001141113 Bacteroidia Species 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 241001430332 Bifidobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001495171 Bilophila Species 0.000 description 1
- 241001202853 Blautia Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000253402 Burkholderiaceae Species 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108030002440 Catalase peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 101001026137 Cavia porcellus Glutathione S-transferase A Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000298828 Cloacibacterium Species 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241001430149 Clostridiaceae Species 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N Cy3-bifunctional dye zwitterion Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N D-mannopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 1
- 241001467894 Desulfovibrionaceae Species 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 241001535083 Dialister Species 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010665 Enzyme Interactions Effects 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000609971 Erysipelotrichaceae Species 0.000 description 1
- 241001081259 Erysipelotrichia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000230562 Flavobacteriia Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241001183197 Fusobacteriales Species 0.000 description 1
- 101001066288 Gallus gallus GATA-binding factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001026109 Gallus gallus Glutathione S-transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000193789 Gemella Species 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 108050003783 Histidinol-phosphate aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000752037 Homo sapiens Arginase-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001078133 Homo sapiens Integrin alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000800287 Homo sapiens Tubulointerstitial nephritis antigen-like Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100025305 Integrin alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 241000558696 Ktedonobacteraceae Species 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 108030005763 L-tryptophan decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 102000014866 L-type amino acid transporters Human genes 0.000 description 1
- 108050005199 L-type amino acid transporters Proteins 0.000 description 1
- 241000125969 Lachnoclostridium Species 0.000 description 1
- 241001112693 Lachnospiraceae Species 0.000 description 1
- 241001147520 Lachnospiraceae bacterium TF01-11 Species 0.000 description 1
- 241001112724 Lactobacillales Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 1
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100509674 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) katG3 gene Proteins 0.000 description 1
- CBQJSKKFNMDLON-JTQLQIEISA-M N-acetyl-L-phenylalaninate Chemical compound CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 CBQJSKKFNMDLON-JTQLQIEISA-M 0.000 description 1
- 102100038333 N-alpha-acetyltransferase 80 Human genes 0.000 description 1
- 241000276945 Nannocystaceae Species 0.000 description 1
- 241000862996 Nannocystis Species 0.000 description 1
- 241000790438 Nannocystis pusilla Species 0.000 description 1
- 241000909283 Negativicutes Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- BTBBXECEJGBITQ-FPAZSGHZSA-N OC(=O)[C@@H]1CCCN1.CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1.CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN BTBBXECEJGBITQ-FPAZSGHZSA-N 0.000 description 1
- YMVALICZSACBRC-BHFSHLQUSA-N OC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 YMVALICZSACBRC-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 1
- 101150096185 PAAS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241001112692 Peptostreptococcaceae Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 1
- 241001464921 Phascolarctobacterium Species 0.000 description 1
- BHHGXPLMPWCGHP-UHFFFAOYSA-N Phenethylamine Chemical compound NCCC1=CC=CC=C1 BHHGXPLMPWCGHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030005765 Phenylacetaldehyde synthases Proteins 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 108030000685 Phenylalanine N-acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108700023158 Phenylalanine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010044588 Phenylalanine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108030003033 Phenylalanine/tyrosine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000605951 Prevotella loescheii Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000095588 Ruminococcaceae Species 0.000 description 1
- 101000808648 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Aromatic amino acid aminotransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000909295 Selenomonadales Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000230565 Sphingobacteriia Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000123710 Sutterella Species 0.000 description 1
- 241001135235 Tannerella forsythia Species 0.000 description 1
- 241000131694 Tenericutes Species 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 102100033469 Tubulointerstitial nephritis antigen-like Human genes 0.000 description 1
- 241001425419 Turicibacter Species 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108010042606 Tyrosine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 241001494424 [Eubacterium] brachy Species 0.000 description 1
- 241001531188 [Eubacterium] rectale Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 1
- 201000007201 aphasia Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007961 artificial flavoring substance Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 241000595832 bacterium 2013Ark19i Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000004203 carnauba wax Substances 0.000 description 1
- 235000013869 carnauba wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007635 classification algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 230000037410 cognitive enhancement Effects 0.000 description 1
- 230000003931 cognitive performance Effects 0.000 description 1
- 230000006998 cognitive state Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009850 completed effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000011827 double-transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- FTSSQIKWUOOEGC-RULYVFMPSA-N fructooligosaccharide Chemical compound OC[C@H]1O[C@@](CO)(OC[C@@]2(OC[C@@]3(OC[C@@]4(OC[C@@]5(OC[C@@]6(OC[C@@]7(OC[C@@]8(OC[C@@]9(OC[C@@]%10(OC[C@@]%11(O[C@H]%12O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]%12O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]%11O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]%10O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]9O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]8O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]7O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]6O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]5O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]4O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]3O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@@H](O)[C@@H]1O FTSSQIKWUOOEGC-RULYVFMPSA-N 0.000 description 1
- 229940107187 fructooligosaccharide Drugs 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229960002870 gabapentin Drugs 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229930182851 human metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 230000008102 immune modulation Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940042040 innovative drug Drugs 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002075 inversion recovery Methods 0.000 description 1
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000011499 joint compound Substances 0.000 description 1
- 101150013110 katG gene Proteins 0.000 description 1
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008449 language Effects 0.000 description 1
- 238000001001 laser micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 230000007334 memory performance Effects 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006762 neuroinflammatory activation Effects 0.000 description 1
- 238000010984 neurological examination Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010855 neuropsychological testing Methods 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- FXLOVSHXALFLKQ-UHFFFAOYSA-N p-tolualdehyde Chemical compound CC1=CC=C(C=O)C=C1 FXLOVSHXALFLKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060006091 phenylalanine 2-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 108010078226 phenylalanine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000554 phenylalanine racemase (ATP-hydrolyzing) Proteins 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000007788 spatial learning performance Effects 0.000 description 1
- 230000007596 spatial working memory Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000007470 synaptic degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000003478 temporal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 1
- 241001646378 uncultured Bacteroidetes bacterium Species 0.000 description 1
- 241000409162 uncultured bacterium adhufec108 Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD
Настоящее изобретение относится к лечению болезни Альцгеймера (AD). Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению ассоциации головной мозг-кишечник для ингибирования прогрессирования болезни Альцгеймера.The present invention relates to the treatment of Alzheimer's disease (AD). More specifically, the present invention relates to the use of the brain-gut association to inhibit the progression of Alzheimer's disease.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с постепенным развитием. Клинически она характеризуется общей деменцией, такой как ухудшение памяти, афазия, апраксия, агнозия, нарушение зрительно-пространственных навыков, нарушение способности к целенаправленной деятельности и изменения личности и поведения. Двумя патологическими признаками болезни Альцгеймера являются внеклеточные отложения β-амилоида (старческие бляшки) и внутриклеточные нейрофибриллярные клубки (парный спиральный филамент). Отложения β-амилоида и нейрофибриллярные клубки приводят к утрате синапсов и нейронов, которая приводит к тяжелой атрофии поврежденных областей головного мозга, как правило, начинающейся в височной доле. Механизм этого повреждения, вызываемого пептидами β-амилоида и нейрофибриллярными клубками, не до конца понятен.Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease with gradual progression. Clinically, it is characterized by general dementia such as memory impairment, aphasia, apraxia, agnosia, impaired visuospatial skills, impaired ability to perform goal-directed activities, and changes in personality and behavior. Two pathological hallmarks of Alzheimer's disease are extracellular deposits of β-amyloid (senile plaques) and intracellular neurofibrillary tangles (paired coiled-coil filament). β-Amyloid deposits and neurofibrillary tangles lead to loss of synapses and neurons, which results in severe atrophy of the affected brain regions, typically beginning in the temporal lobe. The mechanism of this damage, caused by β-amyloid peptides and neurofibrillary tangles, is not fully understood.
Олигосахариды маннуроновой кислоты, разработанные исследовательской командой под руководством Geng Meiyu, исследователя в Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences/Shanghai Institute of Materia Medica, представляет собой новое пероральное инновационное лекарственное средство против болезни Альцгеймера (AD) с независимыми правами на интеллектуальную собственность. 17 июля 2018 года результаты клинического испытания фазы III с раскрытыми сведениями продемонстрировали, что олигосахариды маннуроновой кислоты достигали ожидаемых результатов с точки зрения основных индикаторов эффективности для улучшения когнитивной функции, что имеет чрезвычайно значимую статистическую и клиническую значимость. Кроме того, встречаемость неблагоприятных явлений является сравнимой с встречаемостью неблагоприятных явлений в группе плацебо, и они имеют хорошую безопасность и пригодны для долговременного применения. Олигосахариды маннуроновой кислоты стали первым лекарственным средством в глобальной области лечения AD, которое оказалось успешным в клиническом испытании фазы III в течение 16 лет.Mannuronic acid oligosaccharides, developed by a research team led by Geng Meiyu, a researcher at the Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences/Shanghai Institute of Materia Medica, is a new oral innovative drug against Alzheimer's disease (AD) with independent intellectual property rights . On July 17, 2018, the results of a phase III clinical trial with disclosures demonstrated that mannuronic acid oligosaccharides achieved expected results in terms of key efficacy indicators for improving cognitive function, which is of extremely significant statistical and clinical significance. In addition, the incidence of adverse events is comparable to the incidence of adverse events in the placebo group, and they have good safety and are suitable for long-term use. Mannuronic acid oligosaccharides became the first drug in the global AD treatment field to be successful in a phase III clinical trial over 16 years.
Что касается олигосахаридов маннуроновой кислоты, было выдано множество связанных с ними китайских патентов. В CN2017114675966 описана композиция маннуроновой дикислоты. В CN2016100697039 описан способ получения олигоманнуроновой дикислоты. В CN2018107134113 описано применение композиции маннуроновой дикислоты для лечения болезни Паркинсона. В CN2015104243401 описано применение олигосахаридов маннуроновой кислоты с карбоксильной группой в положении 1 от восстанавливающего конца и их производных для лечения болезни Паркинсона. Эти патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.Regarding mannuronic acid oligosaccharides, many Chinese patents have been issued related to them. CN2017114675966 describes a mannuronic diacid composition. CN2016100697039 describes a method for producing oligomannuronic diacid. CN2018107134113 describes the use of a mannuronic diacid composition for the treatment of Parkinson's disease. CN2015104243401 describes the use of mannuronic acid oligosaccharides with a carboxyl group at
(олигосахариды маннуроновой кислоты)(mannuronic acid oligosaccharides)
В данной области необходимо больше лекарственных средств, которые могут использоваться для лечения болезни Альцгеймера.The field needs more drugs that can be used to treat Alzheimer's disease.
В настоящем описании авторы изобретения описывают причинно-следственную связь между дисбиозом микробиоты кишечника и нейровоспалением при прогрессировании AD. В частности, изменения состава микробиоты кишечника могут приводить к периферическому накоплению метаболитов флоры, таких как фенилаланин и изолейцин. Они способствуют пролиферации и дифференцировке периферических провоспалительных T-хелперных клеток 1 типа (Th1) при прогрессировании AD. Периферические иммунные клетки инфильтрируют головной мозг и усиливают нейровоспаление. Важно, что повышение уровней метаболитов, таких как фенилаланин и изолейцин, в периферической крови было подтверждено в двух независимых выборках пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI), вызванным AD. Авторы изобретения также продемонстрировали, что олигосахариды маннуроновой кислоты, которые демонстрировали неизменное и стабильное улучшение когнитивной функции в клинических испытаниях фазы III в Китае, изменяют равновесие флоры кишечника, снижают накопление аминокислотных метаболитов флоры в крови и ингибируют нейровоспаление. Главным образом, данные авторов изобретения подчеркивают роль нейровоспаления, вызываемого дисбиозом кишечника, при прогрессировании AD, и предлагают новую стратегию для лечения AD путем вмешательства в ось головной мозг-кишечник.Herein, we describe a causal relationship between gut microbiota dysbiosis and neuroinflammation during the progression of AD. In particular, changes in the composition of the gut microbiota may lead to the peripheral accumulation of flora metabolites such as phenylalanine and isoleucine. They promote proliferation and differentiation of peripheral proinflammatory T helper type 1 (Th1) cells during AD progression. Peripheral immune cells infiltrate the brain and increase neuroinflammation. Importantly, increased levels of metabolites such as phenylalanine and isoleucine in peripheral blood were confirmed in two independent samples of patients with mild cognitive impairment (MCI) caused by AD. We also demonstrated that mannuronic acid oligosaccharides, which demonstrated consistent and sustained improvements in cognitive function in a phase III clinical trial in China, alter gut flora balance, reduce the accumulation of flora amino acid metabolites in the blood, and inhibit neuroinflammation. Mainly, our data highlight the role of gut dysbiosis-induced neuroinflammation in AD progression and suggest a new strategy for treating AD by intervening in the brain-gut axis.
В одном аспекте настоящее изобретение относится применению средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума.In one aspect, the present invention relates to the use of an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes for the production of a medicament for the treatment of Alzheimer's disease in an individual.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, содержащей эффективное количество средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease in an individual, comprising an effective amount of an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention relates to a method for screening a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease, comprising:
a) введение тестируемого средства в моделях in vivo или in vitro с кишечными микробами, и a) administration of the test agent in in vivo or in vitro models with gut microbes, and
b) выбор тестируемого вещества, которое регулирует относительное содержание кишечных микробов в качестве лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера.b) selecting a test substance that regulates the relative abundance of intestinal microbes as a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу создания модели на животных для болезни Альцгеймера, включающему введение средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов животному, так чтобы относительное содержание кишечных микробов у животных регулировалось на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; или было близким к или достигало относительного содержания соответствующих кишечных микробов в соответствующей модели на животных, имеющих болезнь Альцгеймера.In another aspect, the present invention relates to a method for creating an animal model for Alzheimer's disease, comprising administering an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes to an animal, such that the relative abundance of intestinal microbes in the animals is adjusted by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; or was close to or equal to the relative abundance of the relevant gut microbes in the relevant animal model of Alzheimer's disease.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention provides a method for treating a patient having Alzheimer's disease, comprising:
(a) детекцию относительного содержания кишечных микробов у пациента и сравнения его с относительным содержанием соответствующих кишечных микробов в соответствующей нормальной выборки для выбора кишечного микроорганизма, относительное содержание которого отличается от уровня соответствующего кишечного микроорганизма в соответствующей нормальной выборке;(a) detecting the relative abundance of gut microbes in the patient and comparing it with the relative abundance of corresponding gut microbes in the corresponding normal sample to select a gut microorganism whose relative abundance differs from the level of the corresponding gut microbe in the corresponding normal sample;
(b) введение средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов млекопитающего пациенту для регуляции относительного содержания выбранного микроорганизма, чтобы он стал близким к или достигал относительного содержания соответствующего кишечного микроорганизма в соответствующей нормальной выборке.(b) administering an agent for regulating the relative abundance of the mammalian gut microbe to the patient to regulate the relative abundance of the selected microorganism so that it becomes close to or reaches the relative abundance of the corresponding gut microbe in the corresponding normal sample.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Фиг. 1. Дисбиоз кишечника и изменения иммунных клеток в ходе прогрессирования заболевания у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD.Fig. 1. Gut dysbiosis and immune cell changes during disease progression in 5XFAD transgenic (Tg) mice.
(a) Изменения относительных уровней экспрессии РНК синаптофизина в гиппокампе трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев и у мышей дикого типа (WT) через 2 месяца (n = 5-12). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem) относительно уровня экспрессии актина. *P < 0,05, **P < 0,01 посредством одностороннего ANOVA (F (5, 43) = 2,952).(a) Changes in relative synaptophysin RNA expression levels in the hippocampus of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months and in wild-type (WT) mice at 2 months (n = 5–12). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.) relative to actin expression level. *P < 0.05, **P < 0.01 by one-way ANOVA (F (5, 43) = 2.952).
(b) Изменения во времени относительно из 104 с, затраченных на достижение 80% успеха (см. способы) в тесте для оценки способности к обучению различению у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев и у мышей дикого типа (WT) через 2 месяца (n = 4-8). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05 согласно t-критерию Стьюдента. С, секунды.(b) Changes over time relative to the 10 4 s taken to achieve 80% success (see Methods) in the Discrimination Learning Test in 5XFAD Transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months and in wild-type (WT) mice after 2 months (n = 4–8). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). *P < 0.05 according to Student's t test. S, seconds.
(c) Анализ главных компонентов (PCA) для состава микробиома кишечника у мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD на уровне операционной таксономической единицы (OTU) в разные моменты времени (n = 4-10). Формы и цвета точек указывают на образцы от каждой особи и в разные месяцы. Окрашенные овалы указывают на диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой тестируемой группе. M, месяцы.(c) Principal component analysis (PCA) for gut microbiome composition in WT and 5XFAD transgenic (Tg) mice at the operational taxonomic unit (OTU) level at different time points (n = 4–10). The shapes and colors of the dots indicate patterns from each individual and in different months. Colored ovals indicate confidence interval (CI) ranges corresponding to 0.95 in each test group. M, months.
(d) Относительные изменения содержания операционных таксономических единиц (OTU) в общей популяции микробиома кишечника трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в разные месяцы, закрашенные на уровне типа на потоковом графике (n = 4-10). Два наиболее распространенных типа, Bacteroidetes и Firmicutes, обозначены на графике. Цветами указаны различные типы микробиоты кишечника.(d) Relative changes in operational taxonomic unit (OTU) abundance in the total gut microbiome population of 5XFAD transgenic (Tg) mice across months, shaded at the phylum level in the flow plot (n = 4–10). The two most common phyla, Bacteroidetes and Firmicutes , are labeled in the graph. The colors indicate different types of gut microbiota.
(e) Изменения положительной плотности иммунофлуоресцентного окрашивания IBA1, отражающие активацию клеток микроглии в гиппокампе трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев относительно величин у мышей дикого типа (WT) в возрасте 2 месяцев (n = 2-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); линии аппроксимированы посредством кубического сплайна. Величина IBA1 по оси Y представляет собой относительную величину флуоресцентного окрашивания у трансгенного животного в каждый момент времени относительно величины флуоресцентного окрашивания у животного дикого типа в тот же момент времени.(e) Changes in IBA1 immunofluorescent staining positive density reflecting microglial cell activation in the hippocampus of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months relative to values in wild-type (WT) mice at 2 months of age (n = 2 -7). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem); the lines are approximated using a cubic spline. The IBA1 value on the Y axis represents the relative amount of fluorescent staining in the transgenic animal at each time point relative to the amount of fluorescent staining in the wild type animal at the same time point.
(f) Изменения активированной микроглии типа M1 и M2, выявленное в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев (n = 4-8). Детекцию микроглии типа M1 (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) и микроглии типа M2 (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD206+) проводили посредством проточной цитометрии, и количества этих клеток представлены относительно частоты клеток CD45lowCD11b+. Красные точки и линии: микроглия M1. Зеленые точки и линии: микроглия M2. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (mean ± sem); линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(f) Changes in activated M1 and M2 microglia detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months (n = 4–8). Microglia type M1 (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD86 + ) and microglia type M2 (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD206 + ) were detected by flow cytometry, and the numbers of these cells are presented relative to the frequency of CD45 low CD11b + cells. Red dots and lines: M1 microglia. Green dots and lines: M2 microglia. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem); the lines are approximated using a cubic spline algorithm.
(g) Изменения инфильтрирующих клеток (CD45high), выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (красные точки и линии) и мышей WT (черные точки и линии) в разные моменты времени при определении посредством проточной цитометрии (мыши Tg: 2 месяца, n=5; 3 месяца, n=4; 5 месяцев, n=4; 7 месяцев, n=7; 9 месяцев, n=3. мыши WT: n=6.). Количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45+, и они имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(g) Changes in infiltrating cells (CD45 high ) detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice (red dots and lines) and WT mice (black dots and lines) at different time points as determined by flow cytometry (Tg mice: 2 months, n=5; 3 months, n=4; 5 months, n=4; 7 months, n=7; 9 months, n=3. WT mice: n=6). Cell numbers are presented relative to the frequency of CD45 + cells, and they are in the format of mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The lines are approximated using a cubic spline algorithm.
(h) Изменения клеток CD45high у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в разные моменты времени (n = 4-8). На столбиковой диаграмме количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45high. Цветами указаны различные подтипы клеток CD45high: Neu, нейтрофилы; DC, дендритные клетки; NK, натуральные киллеры; Mo/Mϕː моноциты и макрофаги; B, B-клетки; другие, неклассифицированные клетки.(h) Changes in CD45 high cells in 5XFAD transgenic (Tg) mice at different time points (n = 4–8). The bar graph plots cell numbers relative to the frequency of CD45 high cells. Colors indicate different CD45 high cell subtypes: Neu, neutrophils; DC, dendritic cells; NK, natural killer cells; Mo/Mϕː monocytes and macrophages; B, B cells; other, unclassified cells.
(i) Изменения инфильтрирующих CD4 T-клеток (CD45highCD4+), выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (красные точки и линии) через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев при определении посредством проточной цитометрии (n = 4-8). Количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45high и имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством кубических сплайнов.(i) Changes in infiltrating CD4 T cells (CD45 high CD4 + ) detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice (red dots and lines) at 2, 3, 5, 7 and 9 months as determined by flow cytometry ( n = 4-8). Cell numbers are presented relative to the frequency of CD45 high cells and are in the format of mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The lines are approximated using cubic splines.
(j) Изменения инфильтрирующих периферических клеток Th1 и Th2, выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев (n = 4-8). Детекцию клеток Th1 (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) и клеток Th2 (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-CCR4+) проводили посредством проточной цитометрии, и результаты представлены относительно частоты CD45highCD4+ T-клеток. Красные точки и линии: Th1-клетки. Зеленые точки и линии: Th2-клетки. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством кубических сплайнов.(j) Changes in infiltrating peripheral Th1 and Th2 cells detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months ( n = 4–8). Detection of Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) and Th2 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - CCR4 + ) was performed by flow cytometry, and the results are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + T cells. Red dots and lines: Th1 cells. Green dots and lines: Th2 cells. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The lines are approximated using cubic splines.
(k) Корреляция лимфоцитов головного мозга и микробиоты кишечника, отраженная на уровне рода, в ходе ассоциированной с Th2/M2 стадии и ассоциированной с Th1/M1 стадии на ранней (2-3 месяца) и поздней фазе (7-9 месяцев), соответственно (левые панели, n = 4-8). Все бактерии, которые значимо коррелировали с количествами лимфоцитов в головном мозге мышей 5XFAD, приведены на правой панели. Квадраты красного цвета (положительная корреляция) или синего цвета (отрицательная корреляция) с желтой звездочкой (*) указывают на значимые корреляции со значениями P < 0,05, определенными посредством параметрического теста корреляции Пирсона.(k) Correlation of brain lymphocytes and gut microbiota reflected at the genus level during the Th2/M2 associated stage and the Th1/M1 associated stage in the early (2-3 months) and late phase (7-9 months), respectively (left panels, n = 4-8). All bacteria that were significantly correlated with lymphocyte counts in the brains of 5XFAD mice are shown in the right panel. Squares in red (positive correlation) or blue (negative correlation) with a yellow asterisk (*) indicate significant correlations with P values < 0.05 determined by parametric Pearson correlation test.
Фигура 2. Микробиота кишечника требуется для инфильтрации иммунных клеток и активации микроглии.Figure 2. Gut microbiota is required for immune cell infiltration and microglial activation.
(a) Эффекты введения антибиотиков через желудочной зонд в течение трех месяцев на относительную распространенность микроорганизмов в кишечнике у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 6-7). ABX, коктейль смешанных антибиотиков, состоящий из ампициллина (0,1 мг/мл), стрептомицина (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл). Разные роды микроорганизмов кишечника окрашены по-разному, и их изменения относительного содержания представлены на столбиковой диаграмме.(a) Effects of three months of antibiotic gavage on the relative abundance of microorganisms in the intestine in 5XFAD transgenic (Tg) mice at 7 months of age (n = 6-7). ABX, a mixed antibiotic cocktail consisting of ampicillin (0.1 mg/mL), streptomycin (0.5 mg/mL), and colistin (0.1 mg/mL). Different genera of intestinal microorganisms are colored differently, and their changes in relative abundance are presented in a bar graph.
(b-c) Эффекты введения антибиотиков через желудочной зонд в течение трех месяцев на частоту Th1-клеток (b) и клеток микроглии M1-типа (c) в гомогенате головного мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев. Количества Th1-клеток (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно частоты CD45highCD4+ клеток (b), в то время как количества клеток микроглии M1-типа (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) представлены относительно частоты CD45lowCD11b+ клеток (c). В обоих случаях детекцию проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem).(bc) Effects of three months of antibiotic gavage on the frequency of Th1 cells (b) and M1-type microglial cells (c) in the brain homogenate of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 7 months of age. The numbers of Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + cells ( b ), while the numbers of M1-type microglial cells (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD86 + ) are presented relative to the frequency of CD45 low CD11b + cells ( c ). In both cases, detection was performed by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.).
(d) Относительное содержание микроорганизмов кишечника на уровне рода у мышей WT, совместно содержащихся мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (n = 6-7). Во всех трех группах мышей возраст составлял 7 месяцев. Разные цвета соответствуют разным родам. Совместно содержащиеся WT: мыши WT, которых содержали с мышами Tg.(d) Relative abundance of gut microorganisms at the genus level in WT mice, cohoused WT mice, and transgenic (Tg) 5XFAD mice ( n = 6–7). All three groups of mice were 7 months old. Different colors correspond to different genera. WT cohoused: WT mice housed with Tg mice.
(e-f) Изменения частоты Th1-клеток (e) и микроглии типа M1 (f) в гомогенатах головного мозга совместно содержащихся мышей WT, WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 6-7). Th1-клетки (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно частоты CD45highCD4+ клеток (e), в то время как частота клеток микроглии M1-типа (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) представлена относительно частоты CD45lowCD11b+ клеток (f). В обоих случаях детекцию проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, **P < 0,01 согласно t-критерию Стьюдента.(ef) Changes in the frequency of Th1 cells ( e ) and M1 type microglia ( f ) in brain homogenates from cohoused WT, WT, and transgenic (Tg) 5XFAD mice at 7 months of age ( n =6-7). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + cells ( e ), while the frequency of M1-type microglial cells (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD86 + ) is presented relative to the frequency of CD45 low CD11b + cells ( f ). In both cases, detection was performed by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). * P < 0.05, ** P < 0.01 according to Student's t test.
(g) Уровни белков-цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей WT, совместно содержащихся мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев при детекции с использованием чипа с антителами к цитокинам (n = 6-7). Во всех трех группах возраст мышей составлял 7 месяцев. Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.(g) Cytokine protein levels in brain homogenates from WT mice, cohoused WT mice, and transgenic (Tg) 5XFAD mice at 7 months of age as detected using a cytokine antibody chip (n = 6-7). In all three groups, the mice were 7 months old. Colors in the heat map indicate relative cytokine levels normalized by crude Z-score; red indicates cytokines whose levels increase, and blue indicates cytokines whose levels decrease.
Фигура 3. Эффекты OM1 на изменения поведения в моделях на мышах APP/PS1.Figure 3. Effects of OM1 on behavioral changes in APP/PS1 mouse models.
(a) Структура OM1. OM1 представляет собой смесь кислых линейных олигосахаридов со степенями полимеризации в диапазоне от димеров до декамеров со средней молекулярной массой приблизительно 1 кДа.(a) Structure of OM1. OM1 is a mixture of acidic linear oligosaccharides with degrees of polymerization ranging from dimers to decamers with an average molecular weight of approximately 1 kDa.
(b) Результаты для латентности спасения в тесте с водным лабиринтом Морриса (MWM) в качестве показателя пространственного обучения и памяти у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев до возраста 12 месяцев. Затем проводили тест MWM на способности к пространственному обучению и память в течение 6 дополнительных дней. В ходе теста OM1 вводили постоянно. Латентность начала спасения (секунды) определяли в качестве одного из конечных результатов теста (см. способы). Более высокая латентность показывает, что эти мыши тратят больше времени для достижения цели, что указывает на более тяжело нарушенную способность к пространственному обучению и память (n = 11-14). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Черными звездочками указано сравнение между группами WT и APP/PS1. Синей звездочкой указано сравнение между группой введения OM1 (100 мг/кг) и группой введения APP/PS1. *P < 0,05, ***P < 0,001 согласно двухстороннему ANOVA.(b) Results for escape latency in the Morris water maze (MWM) test as an indicator of spatial learning and memory in APP/PS1 mice. Nine-month-old APP/PS1 mice were treated with 50 mg/kg and 100 mg/kg OM1 for 3 months until 12 months of age. The MWM test of spatial learning and memory abilities was then administered for 6 additional days. During the test, OM1 was administered continuously. Rescue onset latency (seconds) was determined as one of the test endpoints (see Methods). Higher latencies indicate that these mice take longer to reach the goal, indicating more severely impaired spatial learning and memory abilities (n = 11–14). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). Black asterisks indicate comparisons between the WT and APP/PS1 groups. The blue asterisk indicates the comparison between the OM1 (100 mg/kg) administration group and the APP/PS1 administration group. *P < 0.05, ***P < 0.001 by two-way ANOVA.
(c) Количество пересечений областей платформы в тесте MWM в качестве показателя пространственного обучения и памяти у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев до возраста 12 месяцев. Затем проводили тест MWM на способность к пространственному обучению и память в течение 6 дополнительных дней. В ходе теста постоянно вводили OM1. Количество пересечений областей платформы определяли в качестве другого результата теста (см. способы). Более высокие количества пересечений областей платформы указывают на менее тяжело сниженную способность к пространственному обучению и памяти (n = 11-17). *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (3, 55) = 6,542).(c) Number of crossings of platform areas in the MWM test as an indicator of spatial learning and memory in APP/PS1 mice. Nine-month-old APP/PS1 mice were treated with 50 mg/kg and 100 mg/kg OM1 for 3 months until 12 months of age. The MWM test of spatial learning and memory was then administered for 6 additional days. OM1 was continuously administered throughout the test. The number of intersections of platform areas was determined as another test result (see Methods). Higher numbers of platform area intersections indicate less severely impaired spatial learning and memory abilities (n = 11–17). *P < 0.05, ***P < 0.001 according to one-way ANOVA (F (3, 55) = 6.542).
(d) Точность пространственной рабочей памяти при тестировании с использованием Y-лабиринта у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев доз возраста 12 месяцев. Затем проводили тест в Y-лабиринте. В ходе теста постоянно вводили OM1. Точность Y-лабиринта представляла собой соотношение между правильным чередованием и общим чередованием (см. "Materials and methods"). Более высокая точность указывает на менее нарушенную способность рабочей памяти (n = 17-20). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). **P < 0,01, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (3, 71) = 12,39).(d) Spatial working memory accuracy when tested using the Y-maze in APP/PS1 mice. Nine month old APP/PS1 mice were treated with 50 mg/kg and 100 mg/kg OM1 for 3 months at 12 month old doses. Then the test was carried out in the Y-maze. OM1 was continuously administered throughout the test. Y-maze accuracy was the ratio between correct alternation and overall alternation (see “Materials and methods”). Higher accuracy indicates less impaired working memory ability (n = 17–20). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). **P < 0.01, ***P < 0.001 according to one-way ANOVA (F (3, 71) = 12.39).
Фигура 4. OM1 смягчает нейровоспаление путем реорганизации микробиоты кишечника.Figure 4. OM1 mitigates neuroinflammation by reorganizing the gut microbiota.
(a) Анализ главных координат (PCoA) для состава микробиома кишечника на уровне операционной таксономической единицы (OTU) на основе расстояния Брея-Кертиса для мышей 5XFAD (Tg) и мышей Tg, которым вводили OM1, в возрасте 7 месяцев (n = 7). Формы и цвета точек указывают на образцы от каждой особи. Окрашенными овалами указаны диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой протестированной группе. PC, главный компонент.(a) Principal coordinate analysis (PCoA) for gut microbiome composition at the operational taxonomic unit (OTU) level based on Bray-Curtis distance for 5XFAD (Tg) mice and OM1-injected Tg mice at 7 months of age (n = 7) . The shapes and colors of the dots indicate samples from each individual. The colored ovals indicate the confidence interval (CI) ranges corresponding to 0.95 in each group tested. PC, main component.
(b) Тепловая карта значимых изменений микробиоты кишечника, представленных на уровне рода между мышами 5XFAD (Tg) и мышами Tg, которым вводили OM1, в возрасте 7 месяцев (n =17). Цветами на цветовой карте указана относительное содержание микробиоты кишечника; красным цветом указаны бактерии, уровень которых повышается, и синим цветом указаны бактерии, уровень которых снижается.(b) Heat map of significant gut microbiota changes represented at the genus level between 5XFAD (Tg) mice and OM1-injected Tg mice at 7 months of age ( n =17). The colors on the color map indicate the relative abundance of the gut microbiota; red indicates bacteria whose levels are increasing, and blue indicates bacteria whose levels are decreasing.
(c) Изменения корреляционных связей между микробиомом кишечника (обозначаемым числами вблизи синих кругов) и лимфоцитами головного мозга (закрашенные круги) до (слева) и после (права) введения через желудочной зонд OM1 мышам 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев. С правой стороны приводится наименование каждого кишечного микробиома.(c) Changes in correlations between the gut microbiome (indicated by numbers near blue circles) and brain lymphocytes (filled circles) before (left) and after (right) gavage of OM1 in 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age. On the right side is the name of each gut microbiome.
(d) Эффект введения OM1 на частоту Th1-клеток в головном мозге мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев (n = 5-7). Количества Th1-клеток (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно количеств CD45highCD4+ T-клеток при определении посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, ***P < 0,001, в соответствии с t-критерием Стьюдента.(d) Effect of OM1 administration on the frequency of Th1 cells in the brain of 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age ( n = 5–7). The numbers of Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the numbers of CD45 high CD4 + T cells as determined by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). * P < 0.05, *** P < 0.001, according to Student's t test.
(e) Эффект введения OM1 на плотность положительного сигнала при иммунофлуоресценом окрашивании IBA1, проведенном для срезов гиппокампа мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев, отражающий активацию клеток микроглии (n = 4-6). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 15) = 21,94).(e) Effect of OM1 administration on positive signal density in IBA1 immunofluorescence staining performed on hippocampal sections from 7-month-old 5XFAD (Tg) mice, reflecting microglial cell activation ( n = 4–6). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). * P < 0.05, according to one-way ANOVA (F (2, 15) = 21.94).
(f) Эффект введения OM1 на уровни белков-цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев при детекции посредством чипа с антителами к цитокинам (n = 5-6). Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.(f) Effect of OM1 administration on cytokine protein levels in brain homogenates from 7-month-old 5XFAD (Tg) mice as detected by the cytokine antibody chip ( n = 5–6). Colors in the heat map indicate relative cytokine levels normalized by crude Z-score; red indicates cytokines whose levels increase, and blue indicates cytokines whose levels decrease.
(g-h) Эффект OM1 на Aβ-положительную область (g) и тау-положительную область (h) в гиппокампе мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев, оцененный в срезах головного мозга (n = 4-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Для анализа Aβ: *P < 0,05, **P < 0,01 (F (2, 14) = 22,78). Для анализа тау: *P < 0,05, ***P < 0,001 (F (2, 15) = 13,06) в соответствии с односторонним ANOVA.(gh) Effect of OM1 on the Aβ-positive region (g) and tau-positive region ( h ) in the hippocampus of 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age, assessed in brain slices ( n =4-7). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). For Aβ analysis: * P < 0.05, ** P < 0.01 (F (2, 14) = 22.78). For tau analysis: * P < 0.05, *** P < 0.001 (F (2, 15) = 13.06) by one-way ANOVA.
(i) Эффекты OM1 на время относительно 104 секунд (с), затраченных для достижения 80% успеха (см. способы) в тесте для оценки способности к обучению различению у мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 10-13). Время означает время для достижения уровня эффективности 80% (секунды); чем больше времени требуется, тем тяжелее нарушение (см. способы). *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F(2,31) = 9,751).(i) Effects of OM1 on time relative to the 10 4 seconds (s) taken to achieve 80% success (see Methods) in the discrimination learning test in 5XFAD mice at 7 months of age (n = 10-13). Time means the time to reach the 80% efficiency level (seconds); the longer it takes, the more severe the violation (see methods). * P < 0.05, *** P < 0.001 according to one-way ANOVA (F(2,31) = 9.751).
Фигура 5. OM1 ингибирует нейровоспаление путем взятия под контроль метаболизма аминокислот.Figure 5. OM1 inhibits neuroinflammation by taking control of amino acid metabolism.
(a) Анализ обогащения сигнальных путей для 31 типа фекальных метаболитов мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев с введением OM1 или без него и с использованием MBROLE (n = 6-8). Перечень результатов обогащения приведен с модулями KEGG и взаимодействиями ферментов KEGG, скрининг которых проводили с использованием критерия значения P < 0,05.(a) Signaling pathway enrichment analysis for 31 types of fecal metabolites from 7-month-old 5XFAD (Tg) mice with or without OM1 administration and using MBROLE ( n = 6–8). Enrichment results are listed with KEGG modules and KEGG enzyme interactions screened using the P < 0.05 value criterion.
(b) Перечни аминокислот крови между группой WT (n=30) и Tg (n=26), которые можно было различить в период прогрессирования заболевания с использованием модели случайного леса (количество деревьев: 500; количество предсказательных факторов: 7; случайность: включена; см. способ).(b) Lists of blood amino acids between WT (n=30) and Tg (n=26) that could be distinguished during disease progression using a random forest model (number of trees: 500; number of predictors: 7; randomness: included ; see method).
(c) Изменения уровней гистидина, фенилаланина и изолейцина в фекалиях мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (n = 6-11). Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.(c) Changes in histidine, phenylalanine, and isoleucine levels in feces of WT, Tg, and OM1-treated Tg mice (n = 6–11). Red, increased level; blue, reduced level.
(d) Изменения уровней гистидина, фенилаланина и изолейцина в крови мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (n = 6-7). Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.(d) Changes in blood levels of histidine, phenylalanine, and isoleucine in WT, Tg, and OM1-treated Tg mice (n = 6–7). Red, increased level; blue, reduced level.
(e) Эффекты OM1 на дифференцировку наивных CD4+ T-клеток (Th0 клетки) в Th1-клетки, индуцированную фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4+ T-клетки культивировали в течение 3 суток с/без OM1 в присутствии фенилаланина (1 мМ) или изолейцина (1 мМ). Частоту Th1-клеток (CD4+IFN-γ+) тестировали посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); n = 3 повторения на группу. Слева, *P < 0,05, **P < 0,01 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 6) = 15,64). Справа, *P < 0,05, **P < 0,01 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 6) = 10,35).(e) Effects of OM1 on the differentiation of naive CD4 + T cells (Th0 cells) into Th1 cells induced by phenylalanine and isoleucine. Naive CD4 + T cells were cultured for 3 days with/without OM1 in the presence of phenylalanine (1 mM) or isoleucine (1 mM). The frequency of Th1 cells (CD4 + IFN-γ + ) was tested by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.); n = 3 repetitions per group. Left, * P < 0.05, ** P < 0.01 by one-way ANOVA (F(2, 6) = 15.64). Right, * P < 0.05, ** P < 0.01 by one-way ANOVA (F(2, 6) = 10.35).
(f) Эффекты OM1 на пролиферацию клеток Th1, индуцируемую фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4+ T-клетки окрашивали CellTrace и культивировали в течение 3 суток с/без OM1 в присутствии фенилаланина (1 мМ) и изолейцина (1 мМ). Плотность флуоресценции CellTrace в клетках Th1 (CD4+IFN-γ+) тестировали посредством проточной цитометрии (см. способы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem), n = 3. *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (4, 9) = 28,34).(f) Effects of OM1 on Th1 cell proliferation induced by phenylalanine and isoleucine. Naïve CD4 + T cells were stained with CellTrace and cultured for 3 days with/without OM1 in the presence of phenylalanine (1 mM) and isoleucine (1 mM). CellTrace fluorescence density in Th1 (CD4 + IFN-γ + ) cells was tested by flow cytometry (see methods). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.), n = 3. * P < 0.05, *** P < 0.001 by one-way ANOVA (F(4, 9) = 28, 34).
(g) Изменения Th1-клеток в крови после внутрибрюшинной (в/б) инъекции в течение 4 суток фенилаланина и изолейцина (n = 6). ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 21) = 101,8).(g) Changes in Th1 cells in the blood after intraperitoneal (IP) injection of phenylalanine and isoleucine for 4 days ( n = 6). *** P < 0.001 according to one-way ANOVA (F (2, 21) = 101.8).
(h) Классификация на основе случайных деревьев изменений аминокислот у здоровых контролей (HC) и у пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (первая группа, n = 9 для MCI вследствие AD, n = 18 для HC).(h) Classification based on random trees of amino acid changes in healthy controls (HC) and patients with mild cognitive impairment (MCI) due to AD (first group, n = 9 for MCI due to AD, n = 18 for HC).
(i) Частота Th1-клеток в крови здоровых контролей (HC) и пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (первая группа, n = 8 для MCI вследствие AD, n = 9 для HC). *P < 0,05 согласно t-критерию Стьюдента. По вертикальной оси приведен процент Th1-клеток/CD4+ T-клеток.(i) Frequency of Th1 cells in the blood of healthy controls (HC) and patients with mild cognitive impairment (MCI) due to AD (first group, n = 8 for MCI due to AD, n = 9 for HC). * P < 0.05 according to Student's t test. The vertical axis shows the percentage of Th1 cells/CD4 + T cells.
(j) Уровни фенилаланина и изолейцина в крови здоровых контролей (HC) и пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (вторая группа, n = 22 для обеих групп). *P < 0,05 в соответствии с t-критерием Стьюдента.(j) Phenylalanine and isoleucine levels in the blood of healthy controls (HC) and patients with mild cognitive impairment (MCI) due to AD (second group, n = 22 for both groups). * P < 0.05 according to Student's t test.
Фигура 6. Схематическая диаграмма нейровоспаления при прогрессировании AD и стратегия вмешательстваFigure 6. Schematic diagram of neuroinflammation during AD progression and intervention strategy
Изменение микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD вызывает нарушение метаболизма аминокислот. Оно способствует дифференцировке наивных CD4 T-клеток в Th1-клетки в крови. Между тем, аминокислоты и Th1-клетки могут инфильтрировать головной мозг посредством циркуляции крови. Инфильтрация периферических иммунных клеток и активация микроглии приводят к патологическому нейровоспалению в головном мозге, что приводит к снижению когнитивных способностей. Пероральное введение OM1 может восстанавливать микробиоту кишечника, ингибировать аномальное продуцирование аминокислот и снижать инфильтрацию периферическими иммунными клетками головного мозга, и в конечном итоге устранять нейровоспаление.Changes in the intestinal microbiota during the progression of AD cause disruption of amino acid metabolism. It promotes the differentiation of naïve CD4 T cells into Th1 cells in the blood. Meanwhile, amino acids and Th1 cells can infiltrate the brain through the blood circulation. Infiltration of peripheral immune cells and activation of microglia lead to pathological neuroinflammation in the brain, leading to cognitive decline. Oral administration of OM1 can restore the intestinal microbiota, inhibit abnormal amino acid production and reduce the infiltration of peripheral immune cells in the brain, and ultimately eliminate neuroinflammation.
Фигура 7Figure 7
(a-b) Изменения Aβ-положительных областей (a) и положительных по фосфорилированному тау (p-тау) областей (b) в срезах гиппокампа трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) против мышей дикого типа в возрасте 2 месяцев (WT) (n=2-7). Представлены репрезентативные флуоресцентные изображения; масштабная метка соответствует 100 мкм. На линейных графиках обобщенно представлены результаты для всех индивидуальных точек относительно мышей WT, и они представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов. M, месяцы.(a-b) Changes in Aβ-positive regions (a) and phosphorylated tau positive (p-tau) regions (b) in hippocampal slices from 5XFAD transgenic (Tg) mice (2, 3, 5, 7, and 9 months of age) vs. mice wild type at 2 months of age (WT) (n=2-7). Representative fluorescence images are shown; the scale mark corresponds to 100 µm. Line graphs summarize the results for all individual points relative to WT mice and are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The lines are approximated using a cubic spline algorithm. M, months.
(c) Главный компонент (PC) 1 из анализа главных компонентов (PCA) для состава микробиома кишечника на уровне операционной таксономической единицы (OTU) у мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Красные точки и линии, мыши Tg; синие точки и линии, мыши WT. Естественное соединение в линию без аппроксимации. Использование двухсторонннего критерия суммы рангов Уилкоксона (ранговая сумма); * указывает на значимое отличие по сравнению с возрастом 2 месяца в той же группе. *P<0,05, **P<0,01. # указывает на значимое отличие по сравнению с совпадающими по возрасту мышами WT. #P<0,05; ##P<0,01; ###P<0,001.(c) Principal component (PC) 1 from principal component analysis (PCA) for gut microbiome composition at the operational taxonomic unit (OTU) level in WT and 5XFAD transgenic (Tg) mice (aged 2, 3, 5, 7, and 9 months) (n=4-10). Red dots and lines, Tg mice; blue dots and lines, WT mice. Natural connection into a line without approximation. Using a two-tailed Wilcoxon rank sum test (rank sum); * indicates a significant difference compared to 2 months of age in the same group. *P<0.05, **P<0.01. # indicates a significant difference compared to age-matched WT mice. #P<0.05; ##P<0.01; ###P<0.001.
(d) Изменение относительного содержания микроорганизмов в кишечнике на уровне семейств у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Различные цвета соответствуют различным семействам.(d) Changes in the relative abundance of intestinal microorganisms at the family level in 5XFAD transgenic (Tg) mice (2, 3, 5, 7 and 9 months of age) (n=4-10). Different colors correspond to different families.
(e) Кладограмма анализа величины эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) для состава кишечного микробиома у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Бактерии с наиболее высокой дискриминационной способностью обозначены на графике для каждого месяца. Цветами указаны таксоны бактерий, которые обогащались каждый месяц. Круги от внутренних к внешним указывают различные таксономические уровни (от внутреннего к внешнему: тип, класс, порядок, семейство и род). M, месяцы. Verrucomicrobia; AlphaProteobacteria; Bacteroidetes; Prevotellaceae; Erysipelotrichia; Firmicutes; Lachnoclostridium.(e) Cladogram of linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of gut microbiome composition in 5XFAD transgenic (Tg) mice (2, 3, 5, 7, and 9 months of age) (n=4-10). Bacteria with the highest discriminatory power are indicated on the graph for each month. The colors indicate bacterial taxa that were enriched each month. Circles from inner to outer indicate different taxonomic levels (inner to outer: phylum, class, order, family and genus). M, months. Verrucomicrobia ; AlphaProteobacteria ; Bacteroidetes ; Prevotellaceae ; Erysipelotrichia ; Firmicutes ; Lachnoclostridium .
(f) Анализ PCA для микробиома кишечника на уровне OTU у трансгенных мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 8, 9, 12 и 14 месяцев (n=4-12). Цветами и формами указаны данные в разные месяцы. Окрашенные овалы указывают на диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой тестируемой группе. PC, главный компонент.(f) PCA analysis of the gut microbiome at the OTU level in APP/PS1 transgenic mice at 3, 6, 8, 9, 12 and 14 months of age (n=4-12). Colors and shapes indicate data for different months. Colored ovals indicate confidence interval (CI) ranges corresponding to 0.95 in each test group. PC, main component.
(g) Изменения относительного содержания микробов кишечника на уровне типа у трансгенных мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 8, 9, 12 и 14 месяцев (n=4-12). Цвета соответствуют различным типам. M, месяцы.(g) Changes in the relative abundance of gut microbes at the phylum level in APP/PS1 transgenic mice at 3, 6, 8, 9, 12, and 14 months of age (n=4-12). The colors correspond to the different types. M, months.
(h) Репрезентативные флуоресцентные изображения изменений IBA1-положительных областей в срезах гиппокампа трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) против мышей дикого типа в возрасте 2 месяца (WT) (n=2-7). Масштабная метка соответствует 500 мкм в мелкой рамке (сверху), 250 мкм в крупной рамке (снизу). M, месяцы.(h) Representative fluorescence images of changes in IBA1-positive regions in hippocampal slices from 5XFAD transgenic (Tg) mice (2, 3, 5, 7, and 9 months of age) versus 2-month-old wild-type (WT) mice (n=2- 7). The scale mark corresponds to 500 µm in the small frame (top), 250 µm in the large frame (bottom). M, months.
(i) Изменения частоты инфильтрирующих клеток (CD45high), обнаруженные в гомогенатах целого мозга мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 9 и 14 месяцев при детекции посредством проточной цитометрии (n=5-8). Количества клеток представлены относительно частоты CD45+ клеток, и они имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(i) Changes in infiltrating cell frequency (CD45 high ) detected in whole brain homogenates of APP/PS1 mice at 3, 6, 9 and 14 months of age as detected by flow cytometry (n=5-8). Cell counts are presented relative to the frequency of CD45 + cells and are in the format of mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The lines are approximated using a cubic spline algorithm.
(j) Изменения частоты инфильтрирующих периферических Th1-клеток в гомогенатах целого мозга мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 9 и 14 месяцев при детекции посредством проточной цитометрии (n=3-8). Th1-клетки (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно частоты CD45highCD4+ T-клеток. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(j) Changes in the frequency of infiltrating peripheral Th1 cells in whole brain homogenates of APP/PS1 mice at 3, 6, 9, and 14 months of age as detected by flow cytometry (n=3-8). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + T cells. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The lines are approximated using a cubic spline algorithm.
Фигура 8. Изменения отличительных признаков AD в пяти моделях на животных и у мышей дикого типа (WT) в возрасте 2, 4, 8 и 18 месяцев из базы данных Mouseac.Figure 8. Changes in AD hallmarks in five animal models and wild-type (WT) mice at 2, 4, 8, and 18 months of age from the Mouseac database.
(a) Изменение относительной плотности бляшек Aβ или нейрофибриллярных клубков (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны различные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(a) Change in relative density of Aβ plaques or neurofibrillary tangles (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The colors indicate the different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
(b) Изменения log2-нормализованных уровней экспрессии синаптофизина (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(b) Changes in log 2 -normalized synaptophysin expression levels (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
(c-d) Изменения log2-нормализованных уровней экспрессии CD86 и ARG1, соответствующие изменениям количеств клеток M1 и M2 (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(cd) Changes in log2 normalized expression levels of CD86 and ARG1 corresponding to changes in M1 and M2 cell numbers (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
(e-h) Изменения log2-нормализованных уровней экспрессии TIPM, CCL3, GATA-3 и MIF, соответствующие изменениям количеств Th1 и Th2 (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(eh) Changes in log 2 -normalized expression levels of TIPM, CCL3, GATA-3 and MIF corresponding to changes in Th1 and Th2 amounts (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). The colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
Фигура 9Figure 9
(a) Эффекты совместного содержания на время из 104 секунд, затраченных на достижение 80% успеха, в тесте для оценки способности к обучению распознаванию образов у мышей WT, совместно содержащихся WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n=5-8). Затраченное время означает время для достижения уровня эффективности 80% (секунды); чем больше времени требуется, тем тяжелее когнитивное нарушение (см. способы). (a) Effects of co-housing on the time of 10 4 seconds taken to achieve 80% success in a test to assess pattern recognition learning ability in WT mice, co-housed WT and transgenic (Tg) 5XFAD mice at 7 months of age (n= 5-8). Time taken means the time to reach the 80% efficiency level (seconds); the longer it takes, the more severe the cognitive impairment (see methods).
(b) Эффекты трансплантации фекальной микробиоты (FMT) на количества иммунных клеток в головном мозге (Th1 и Th2) реципиентных мышей WT, которым инъецировали Aβ (см. способы) с использованием фекалий либо мышей WT, либо трансгенных (Tg) мышей 5XFAD. Клетки Th1 (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) и клетки Th2 (CD45highCD4+CXCR3-CCR6-CCR4+) представлены относительно CD45highCD4+ T-клеток (n=6-8); данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P<0,05, t-критерий Стьюдента.(b) Effects of fecal microbiota transplantation (FMT) on immune cell numbers in the brains (Th1 and Th2) of recipient WT mice injected with Aβ (see Methods) using feces from either WT mice or transgenic (Tg) 5XFAD mice. Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) and Th2 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 - CCR6 - CCR4 + ) are represented relative to CD45 high CD4 + T cells (n=6-8); data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). *P<0.05, Student's t test.
(c) Эффекты FMT от мышей WT в возрасте 2 месяца на Th1-клетки в головном мозге у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (n=6-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). *P<0,05, t-критерий Стьюдента.(c) Effects of FMT from WT mice at 2 months of age on Th1 cells in the brain of 5XFAD transgenic (Tg) mice (n=6-7). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). *P<0.05, Student's t test.
Фигура 10Figure 10
(a) Кладограмма анализа величины эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) для состава микробиома кишечника трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев, которым перорально вводили OM1 (n=5-7). Бактерии с наиболее высокой дискриминационной способностью на уровне типов обозначены на графике. Синий, бактерии с увеличенным содержанием у мышей Tg в возрасте 7 месяцев. Красный, бактерии с увеличенным содержанием у Tg мышей в возрасте 7 месяцев, которым вводили OM1. Круги от внутреннего к внешнему указывают на разные таксономические уровни (от внутреннего к внешнему: тип, класс, порядок, семейство и род). M, месяцы(a) Cladogram of linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of the gut microbiome composition of 7-month-old 5XFAD transgenic (Tg) mice orally administered OM1 (n=5-7). Bacteria with the highest discriminatory power at the phylum level are indicated in the graph. Blue, Bacteria are enriched in Tg mice at 7 months of age. Red, Bacteria are enriched in OM1-treated 7-month-old Tg mice. Circles from inner to outer indicate different taxonomic levels (inner to outer: phylum, class, order, family and genus). M, months
(b-c) Корреляция между микробиотой, имеющей повышенные и сниженные уровни микроорганизмов, вызванные OM1, и частота подтипов иммунных клеток в головном мозге трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев. Квадраты красного цвета (положительная корреляция) или синего цвета (отрицательная корреляция) с желтой звездочкой (*) имеют значение P < 0,05, определенное посредством параметрического теста корреляции Пирсона, чиста в каждом квадрате представляют собой коэффициент корреляции.(b-c) Correlation between OM1-induced increased and decreased microbiota levels and the frequency of immune cell subtypes in the brains of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 7 months of age. Squares in red (positive correlation) or blue (negative correlation) with a yellow asterisk (*) have a P value < 0.05 determined by the parametric Pearson correlation test, the net in each square represents the correlation coefficient.
(d) Репрезентативные изображения окрашивания IBA1, отложения Aβ и фосфорилирования тау в гиппокампе головного мозга мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1. Масштабная метка соответствует 250 мкм. Положительный сигнал визуализировали с использованием субстрата 3,3’-диаминобензидина (DAB), показанного темно-коричневым цветом.(d) Representative images of IBA1 staining, Aβ deposition, and tau phosphorylation in the hippocampal brains of WT, Tg, and OM1-injected Tg mice. The scale mark corresponds to 250 µm. A positive signal was visualized using the
(e) Эффекты FMT из мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1, на Th1-клетки головного мозга у реципиентных мышей C57 с инъекцией Aβ в гиппокамп (n=4-5). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem).(e) Effects of FMT from WT, Tg, and OM1-injected Tg mice on brain Th1 cells in hippocampal Aβ-injected C57 recipient mice (n=4-5). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem).
(f) Эффекты введения антибиотика (ампициллин (0,1 мг/мл), стрептомицин (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл) на относительное содержание микробиоты кишечника на уровне рода в модели на трансгенных мышах APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым перорально вводили OM1 (n=6-8). Цветами указаны разные роды.(f) Effects of antibiotic administration (ampicillin (0.1 mg/ml), streptomycin (0.5 mg/ml) and colistin (0.1 mg/ml) on the relative abundance of the gut microbiota at the genus level in the APP transgenic mouse model /PS1 at 6 months of age treated orally with OM1 (n=6-8) Colors indicate different genera.
(g) Эффекты OM1 на частоту Th1-клеток в головном мозге мышей APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым вводили антибиотики (см. способы). Th1-клетки (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно CD45highCD4+ T-клеток (n=6-8), и данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Слева направо: *P<0,05, t-критерий Стьюдента. NS, нет значимых отличий.(g) Effects of OM1 on Th1 cell frequency in the brains of 6-month-old APP/PS1 mice treated with antibiotics (see Methods). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to CD45 high CD4 + T cells (n=6-8), and data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.). From left to right: *P<0.05, Student's t test. NS, no significant differences.
(h) Эффекты OM1 на относительную плотность IBA1-положительного иммунофлуоресцентного окрашивания, выявленного в срезах гиппокампа мышей APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым вводили антибиотики (n=4-6, см. способы). IBA1-положительная область отражает активацию клеток микроглии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). ***P < 0,0001 в соответствии с t-критерием Стьюдента. NS, нет значимых отличий.(h) Effects of OM1 on the relative density of IBA1-positive immunofluorescence staining detected in hippocampal sections from 6-month-old APP/PS1 mice treated with antibiotics (n=4-6, see methods). The IBA1-positive region reflects the activation of microglial cells. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). ***P < 0.0001 according to Student's t test. NS, no significant differences.
(i) Репрезентативное иммунофлуоресцентное окрашивание IBA1 в головном мозге мышей APP/PS1 и мышей APP/PS1, которым вводили OM1, с антибиотиками или без них. IBA1 визуализировали с использованием конъюгированного с FITC вторичного антитела, как показано зеленым цветом. Ядро окрашивали DAPI, как показано синим цветом. Масштабная метка соответствует 250 мкм.(i) Representative immunofluorescence staining of IBA1 in the brains of APP/PS1 mice and OM1-treated APP/PS1 mice with or without antibiotics. IBA1 was visualized using a FITC-conjugated secondary antibody as shown in green. The nucleus was stained with DAPI as shown in blue. The scale mark corresponds to 250 µm.
(j) Эффекты OM1 на уровни цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей APP/PS1 в возрасте 7 месяцев при определении посредством чипа с антителами к цитокинам (n=5-6). Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.(j) Effects of OM1 on cytokine levels in brain homogenates from 7-month-old APP/PS1 mice as determined by anti-cytokine chip (n=5-6). Colors in the heat map indicate relative cytokine levels normalized by crude Z-score; red indicates cytokines whose levels increase, and blue indicates cytokines whose levels decrease.
Фигура 11Figure 11
(a) Эффект OM1 на дифференцировку наивных CD4+ T-клеток, обработанных супернатантом бактерий, в Th1- и Th2-клетки. Наивные CD4 T-клетки культивировали и супернатант из микробиоты мышей 5XFAD добавляли в присутствии/отсутствии OM1 в течение 3 суток. Гейтирование клеток Th1 (CD4+IFN-γ+) и Th2 (CD4+IL-4+) проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); n=3 повторения на группу.(a) Effect of OM1 on the differentiation of naïve CD4 + T cells treated with bacterial supernatant into Th1 and Th2 cells. Naive CD4 T cells were cultured and supernatant from the microbiota of 5XFAD mice was added in the presence/absence of OM1 for 3 days. Gating of Th1 (CD4 + IFN-γ + ) and Th2 (CD4 + IL-4 + ) cells was performed by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± s.e.m.); n=3 repetitions per group.
(b-c) На вулканной диаграмме представлено распределение метаболитов из первичных данных метаболомики фекалий кишечника мышей WT и 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев (n=6-8) (b) и мышей Tg в возрасте 7 месяцев, которым вводили или не вводили OM1 (n=6) (c). Красными точками указаны значимые изменения метаболитов. Значимость определяют как значение P < 0,05 в соответствии с t-критерем Стьюдента и кратность изменений (FC) < 0,83 или > 1,2 между (T) и диким типом (WT). По оси x представлен log2FC, и по оси y представлен -log10 P. (bc) Volcano plot represents the distribution of metabolites from raw fecal metabolomics data from WT and 5XFAD (Tg) mice aged 7 months (n=6-8) (b) and Tg mice aged 7 months treated or not treated with OM1 (n=6) (c). Red dots indicate significant changes in metabolites. Significance was defined as P value < 0.05 according to Student's t test and fold change (FC) < 0.83 or > 1.2 between (T) and wild type (WT). The x-axis represents log 2 FC, and the y-axis represents -log 10 P.
(d-e) Тепловая карта для семисот восемьдесят шести метаболитов, которые дифференциально регулировались между мышами Tg и WT (d), а также 149 метаболитов между мышами Tg, которому вводили OM1 и не вводили его (e) (n=6-8). Эти метаболиты идентифицированы и аннотированы посредством сопоставления данных молекулярной массы (m/z) значимых пиков с онлайн-базой данных METLIN.(d-e) Heat map for seven hundred and eighty-six metabolites that were differentially regulated between Tg and WT mice (d), as well as 149 metabolites between OM1-treated and non-OM1-treated Tg mice (e) (n=6-8). These metabolites were identified and annotated by matching molecular weight (m/z) data of significant peaks with the online METLIN database.
(f) На диаграмме Венна представлены метаболиты фекалий кишечника, уровни которых часто снижаются при сравнении мышей Tg и WT (T_W) и мышей Tg, которым вводили OM1 или не вводили его (Ttreat_T) (n=6-8). Сто двадцать четыре метаболита имели реверсию паттернов среди двух сравнений, т.е. метаболиты, которые являются либо в обоих случаях высокими для T_W и низкими для Ttreat_T, либо в обоих случаях низкими для T_W и высокими для Ttreat_T.(f) Venn diagram shows intestinal fecal metabolites whose levels are often reduced when comparing Tg and WT mice (T_W) and Tg mice treated with or without OM1 (Ttreat_T) (n=6-8). One hundred and twenty-four metabolites had reversal patterns among the two comparisons, i.e. metabolites that are either both high for T_W and low for Ttreat_T, or both low for T_W and high for Ttreat_T.
(g) На тепловой карте представлен 31 идентифицированный метаболит с дифференциальной регуляцией среди групп WT, Tg и Tg с введением OM1 (n=6-8), которые могут быть сопоставлены со всеми тремя базами данных (Human Metabolites Database (HMDB), METLIN, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)). Красный, повышение уровня; синий, снижение уровня.(g) Heat map shows 31 identified differentially regulated metabolites among WT, Tg and Tg with OM1 injection groups (n=6-8), which can be compared with all three databases (Human Metabolites Database (HMDB), METLIN, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)). Red, level up; blue, level decrease.
(h) кривую операционных характеристик приемника (ROC) и величину площади под кривой (AUC) для всех аминокислот в ходе прогрессирования заболевания вычисляют с использованием алгоритма случайного леса.(h) Receiver operating characteristic (ROC) curve and area under the curve (AUC) value for all amino acids during disease progression are calculated using a random forest algorithm.
(i) Эффекты трансплантации фекального микробиома (FMT) на уровни фенилаланина и изолейцина в крови. Фекалии мышей WT в возрасте 2 месяцев трансплантировали мышам Tg в возрасте 7 месяцев (n=6-7). Для фенилаланина ***P < 0,001((F (2, 17)=26,59)). Для изолейцина, **P <0,01 (Tg против WT), **P <0,01 (Tg+FMT против Tg) в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 17)=8,181).(i) Effects of fecal microbiome transplantation (FMT) on blood phenylalanine and isoleucine levels. Feces from 2-month-old WT mice were transplanted into 7-month-old Tg mice (n=6-7). For phenylalanine ***P < 0.001((F (2, 17)=26.59)). For isoleucine, **P < 0.01 (Tg vs. WT), **P < 0.01 (Tg+FMT vs. Tg) by one-way ANOVA (F(2, 17)=8.181).
(j) Уровни аминокислот в образцах крови мышей WT, совместно содержащихся WT и Tg в разные месяцы (M) возраста. Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.(j) Amino acid levels in blood samples of WT and Tg mice cohoused at different months (M) of age. Red, increased level; blue, reduced level.
(k) Поглощение фенилаланина наивными CD4 T-клетками. Наивные CD4 T-клетки культивировали с/без 13C-меченного фенилаланина в течение 0,5 ч. Проводили масс-спектрометрию родственных фенилаланину соединений. 13C-Фенилаланин вводили в концентрации 5 ммоль/л, и он захватывается переносчиком аминокислот L-типа.(k) Phenylalanine uptake by naive CD4 T cells. Naïve CD4 T cells were cultured with/without 13 C-labeled phenylalanine for 0.5 h. Mass spectrometry of phenylalanine-related compounds was performed. 13 C-Phenylalanine was administered at a concentration of 5 mmol/L and is taken up by the L-type amino acid transporter.
Фигура 12. JPH203, 50 мг/кг, эффективно ингибирует часть Th1-клеток в головном мозге.Figure 12. JPH203, 50 mg/kg, effectively inhibits a subset of Th1 cells in the brain.
Фигура 13. Тенденция к изменению уровней OTU в энтеробактериях после введения OM1 по сравнению с контролем - анализ PCoA эффекта деградирующих фенилаланин бактерий на содержание фенилаланина в фекалиях через 1 неделю после трансплантации.Figure 13. Trend in OTU levels in Enterobacteriaceae after OM1 administration compared to control - PCoA analysis of the effect of phenylalanine-degrading bacteria on
Фигура 14. Тенденция к изменению относительного содержания энтеробактерий после введения OM1 по сравнению с контролем. Эффект деградирующих фенилаланин бактерий на долю Th1-клеток в крови через одну неделю после трансплантации.Figure 14. Trend in changes in the relative abundance of Enterobacteriaceae after administration of OM1 compared to control. Effect of phenylalanine-degrading bacteria on the proportion of Th1 cells in the blood one week after transplantation.
Фигура 15. Изменение тенденции содержания цитокинов в головном мозге по сравнению с контролем после введения OM1.Figure 15. Change in the trend of cytokine content in the brain compared to control after administration of OM1.
Фигура 16. Изменение распределения микробов кишечника до и после применения средств, используемых для регуляции относительного содержания микроорганизмов в кишечнике: OM1 или фекальные бактерии (комплекс микроорганизмов кишечника).Figure 16. Change in the distribution of intestinal microbes before and after the use of agents used to regulate the relative abundance of microorganisms in the intestine: OM1 or fecal bacteria (intestinal microbial complex).
Фигура 17. Различия между уровнем типа и уровнем рода для AD и HC, частично приведенные подробно. AD: пациенты с AD; HC: здоровые контроли.Figure 17. Differences between phylum level and genus level for AD and HC, partially detailed. AD: patients with AD; HC: healthy controls.
Фигура 18. Часть значимо измененной флоры у AD и HC (на уровне рода и вида). AD: пациенты с AD; HC: здоровые контроли.Figure 18. Part of the significantly changed flora in AD and HC (at the genus and species level). AD: patients with AD; HC: healthy controls.
Фигура 19. Перечень аминокислот, связанных с AD. Многопараметрический поисковый анализ (Explorer) на основе ROC-кривой использовали для анализа аминокислот в крови мышей дикого типа и мышей 5XFAD в возрасте, соответствующем разному количеству месяцев, и он осуществлял поиск потенциальных комбинаций аминокислот в качестве маркеров для отличения мышей дикого типа от мышей 5XFAD. Ниже приводится перечень первых 15 аминокислот, отсортированных по частоте отбора и всем типам.Figure 19. List of amino acids associated with AD. ROC curve-based multivariate exploratory analysis (Explorer) was used to analyze amino acids in the blood of wild-type mice and 5XFAD mice at different months of age, and it searched for potential amino acid combinations as markers to distinguish wild-type mice from 5XFAD mice. Below is a list of the top 15 amino acids, sorted by selection frequency and all types.
Фигура 20. Мыши 5XFAD в возрасте 6,5 месяцев после введения 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца имеют уровни аминокислот в крови, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней аминокислот у мышей дикого типа.Figure 20. 5XFAD mice at 6.5 months of age following administration of 100 mg/kg OM1 for 1 month have blood amino acid levels that tend to recover to amino acid levels in wild-type mice.
Фигура 21. Мыши 5XFAD в возрасте 6,5 месяцев после введения 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца имеют уровни фекальных аминокислот, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней аминокислот у мышей дикого типа.Figure 21. 5XFAD mice at 6.5 months of age following administration of 100 mg/kg OM1 for 1 month have fecal amino acid levels that tend to recover to amino acid levels in wild-type mice.
Фигура 22. Перечень цитокинов, уровни которых восстановились после введения OM1. Мышам 5XFAD в возрасте 6,5 вводили 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца, и они имели цитокины в головном мозге, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней цитокинов у мышей дикого типа.Figure 22. List of cytokines whose levels were restored after administration of OM1. 5XFAD mice aged 6.5 were treated with 100 mg/kg OM1 for 1 month and had cytokines in the brain that tended to recover to cytokine levels in wild-type mice.
Фигура 23. Тенденция к изменению клеток M1 головного мозга у мышей APP/PS1 в возрасте, соответствующем разному количеству месяцев.Figure 23. Trend of brain M1 cells in APP/PS1 mice at different ages corresponding to different numbers of months.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Далее описаны определенные иллюстративные варианты осуществления для обеспечения полного понимания принципов структуры, функции, получения и применения продуктов, способов и применений, описанных в настоящем описании. Один или несколько примеров этих осуществлений проиллюстрированы ниже. Специалистам в данной области будет понятно, что продукты, способы и применения, конкретно описанные в настоящем описании и конкретно проиллюстрированные на прилагаемых чертежах, представляют собой неограничивающие иллюстративные варианты осуществления, и объем настоящего изобретения ограничивается только формулой изобретения. Признаки, проиллюстрированные или описанные вместе в одном иллюстративном варианте осуществления, можно комбинировать с признаками других вариантов осуществления. Подразумевается, что такие модификации и изменения включены в объем настоящего изобретения. Все цитированные публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.Certain illustrative embodiments are described below to provide a thorough understanding of the structure, function, preparation and use of the products, methods and uses described herein. One or more examples of these implementations are illustrated below. Those skilled in the art will appreciate that the products, methods and applications specifically described herein and specifically illustrated in the accompanying drawings are non-limiting exemplary embodiments and the scope of the present invention is limited only by the claims. Features illustrated or described together in one exemplary embodiment may be combined with features of other embodiments. Such modifications and changes are intended to be included within the scope of the present invention. All cited publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference in their entirety.
В контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте прилагаемой ниже формулы изобретения), если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст явно этому не противоречит, термины в форме единственного числа следует интерпретировать как охватывающие и единственное число, и множественное число. Если нет иных указаний, термины "содержащий", "имеющий", "включающий" и "охватывающий" следует интерпретировать как открытые термины (т.е. "включая, но не ограничиваясь ими"), однако они также включают частично закрытые или закрытые термины "по существу состоящий из" и "состоящий из". Если в настоящем описании нет иных указаний, описание числового диапазона в настоящем описании предназначено для применения только в качестве способа сокращения для независимого указания на каждую индивидуальную величину, входящую в данной диапазон, и каждая индивидуальная величина включена в настоящее описание, как если бы она была независимо приведена в настоящем описании. Если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст этому явно не противоречит, все способы, описанные в настоящем описании, могут быть выполнены в любом подходящем порядке. Если нет иных указаний, применение любых и всех примеров или иллюстративной формулировки (например, "такой как"), приведенных в настоящем описании, предназначено только для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Никакую формулировку в настоящем описании не следует истолковывать как указывающую на то, что какой-либо не заявленный в формуле изобретения элемент является необходимым для применения настоящего изобретения на практике. Все проценты представляют собой проценты по массе, и все проценты по массе основаны на общей массе композиции (с какой-либо необязательной концентрацией и/или разведением). Выражение "один или несколько" включает "два или более" и "три или более" и т.п.As used herein (especially in the context of the claims appended below), unless otherwise indicated in the present description or unless the context clearly contradicts it, terms in the singular form should be interpreted to include both the singular and the plural. Unless otherwise indicated, the terms “comprising,” “having,” “including,” and “encompassing” are to be interpreted as open terms (i.e., “including, but not limited to”), but they also include partially closed or closed terms "essentially consisting of" and "consisting of". Unless otherwise indicated herein, the description of a numerical range herein is intended to be used only as a shorthand for independently referring to each individual value included within the range, and each individual value is included herein as if it were independently given in the present description. Unless otherwise indicated herein or unless the context clearly contradicts it, all methods described herein may be performed in any suitable order. Unless otherwise indicated, the use of any and all examples or illustrative language (eg, "such as") provided herein is intended to better illustrate the present invention only and does not limit the scope of the present invention. Nothing in this specification should be construed as indicating that any element not claimed is necessary for the practice of the present invention. All percentages are percentages by weight, and all percentages by weight are based on the total weight of the composition (with any optional concentration and/or dilution). The expression "one or more" includes "two or more" and "three or more" and the like.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем описании. После прочтения вышеуказанного описания изменения предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными специалистам в данной области. Автор изобретения полагает, что специалисты в данной области будут надлежащим образом использовать такие изменения, и автор изобретения предполагает, что настоящее изобретение будет осуществляться способом, отличным от способа, конкретно указанного в настоящем описании. Таким образом, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, описанного в прилагаемой формуле изобретения, допустимые применяемым законом. Более того, если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст этому явно не противоречит, настоящее изобретение охватывает любую комбинацию всех возможных вариантов вышеупомянутых элементов.Preferred embodiments of the present invention are described in the present specification. Upon reading the foregoing description, variations in the preferred embodiments may become apparent to those skilled in the art. The inventor believes that those skilled in the art will make appropriate use of such modifications, and the inventor anticipates that the present invention will be practiced in a manner other than that specifically set forth herein. Thus, the present invention includes all modifications and equivalents to the subject matter described in the appended claims as permitted by applicable law. Moreover, unless otherwise indicated in the present description or unless the context clearly contradicts it, the present invention covers any combination of all possible variations of the above elements.
Когда в настоящей заявке приводится последовательность величин, следует понимать, что любая приведенная величина может представлять собой верхний или нижний предел числового диапазона. Также должно быть понятно, что настоящее изобретение охватывает все такие числовые диапазоны, т.е. диапазон, имеющий комбинацию верхнего предела и нижнего предела, где соответствующие величины верхнего предела и нижнего предела могут представлять собой любые из числовых величин, приведенных настоящем описании. Следует понимать, что диапазон, приведенный в настоящем описании. включает все величины, входящие в диапазон. Например, следует понимать, что 1-10 включает все из величин 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и включает дробные величины в соответствующих случаях. Диапазон, выражаемый посредством "вплоть до" определенной величины (например, вплоть до 5) следует понимать как все величины (включая верхний предел диапазона), такие как 0, 1, 2, 3, 4 и 5, и он включает дробные величины в соответствующих случаях. Следует понимать, что "не более одной недели" или "в пределах недели" включает 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. Аналогично, следует понимать, что диапазон, определяемый посредством "по меньшей мере", включает приведенные более низкие величины и все более высокие величины.Whenever a sequence of values is given in this application, it should be understood that any given value may represent the upper or lower limit of the numerical range. It should also be understood that the present invention covers all such numerical ranges, i.e. a range having a combination of an upper limit and a lower limit, where the corresponding values of the upper limit and lower limit may be any of the numerical values given herein. It should be understood that the range given herein. includes all values within the range. For example, it will be understood that 1-10 includes all of the
Если нет иных указаний, все проценты представляют собой проценты масса/масса.Unless otherwise noted, all percentages are weight/weight percentages.
Как используют в рамках настоящего изобретения, под "приблизительно/примерно" следует понимать включение в пределы трех стандартных отклонений от средней величины или в стандартный диапазон допустимости в конкретной области. В определенных вариантах осуществления под "приблизительно" следует понимать отклонение не более чем на 0,5. "Приблизительно/примерно" модифицирует все перечисленные величины после них. Например, "приблизительно 1, 2, 3" означает "приблизительно 1", "приблизительно 2", "приблизительно 3".As used herein, "about" is meant to be within three standard deviations of the mean or within the standard range of tolerance in a particular field. In certain embodiments, by “about” is meant a deviation of no more than 0.5. "About/Approximately" modifies all listed quantities after them. For example, "about 1, 2, 3" means "about 1", "about 2", "about 3".
Если контекст явно не указывает на иное, термин "или" используют в инклюзивном значении в настоящем описании, означающем термин "и/или", и они могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.Unless the context clearly indicates otherwise, the term “or” is used in the present specification in an inclusive sense to mean the term “and/or,” and they may be used interchangeably herein.
Термин "такой как/например/к примеру" используют в настоящем описании для указания на выражение "такой как/например/к примеру, но не ограничиваясь ими", и они могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.The term "such as/for example/for example" is used herein to refer to the expression "such as/for example/for example, but not limited to", and they may be used interchangeably herein.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что технические признаки, описанные в различных вариантах осуществления выше, могут использоваться отдельно или в комбинации с техническими решениями различных аспектов настоящего изобретения.Those skilled in the art will appreciate that the technical features described in the various embodiments above can be used alone or in combination with technical solutions of various aspects of the present invention.
Авторы изобретения использовали модель на трансгенных (Tg) мышах 5XFAD, широко используемую в исследовании AD, вследствие ее тяжелого и ускоренного снижения когнитивных способностей. Посредством анализа энтеротипа мышей Tg и мышей WT на различных стадиях прогрессирования AD, было обнаружено, что микробиота кишечника мышей Tg является в высокой степени динамичной (фиг.1d). В возрасте 2-3 месяца Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia являются тремя наиболее распространенными типами бактерий (46,8%, 32,3% и 12,6%, соответственно), в то время как в возрасте 7-9 месяцев преобладающими бактериями становятся Firmicutes, в то время как содержание Bacteroidetes и Verrucomicrobia значительно снижается. Это резко расходится с микробиотой кишечника мышей WT.We used the 5XFAD transgenic (Tg) mouse model, widely used in AD research due to its severe and accelerated cognitive decline. Through enterotype analysis of Tg mice and WT mice at different stages of AD progression, the gut microbiota of Tg mice was found to be highly dynamic (Figure 1d). At 2–3 months of age, Bacteroidetes , Firmicutes , and Verrucomicrobia are the three most common bacterial phyla (46.8%, 32.3%, and 12.6%, respectively), while at 7–9 months of age, Firmicutes become the predominant bacteria , while the content of Bacteroidetes and Verrucomicrobia is significantly reduced. This is in stark contrast to the gut microbiota of WT mice.
Авторы изобретения также проанализировали периферические иммунные клетки Th1 и Th1 и клетки микроглии M1 и M2 и обнаружили, что два основных подтипа CD4+ клеток (инфильтрирующие Th1- и Th2-клетки) продемонстрировали сходную динамику с двумя основными подтипами клеток микроглии (клетки микроглии M1 и M2) (фиг. 1f и фиг. 1j). На ранней стадии они в основном представляют собой клетки Th2 и нейропротекторные клетки микроглии M2, и на поздней стадии они в основном представляют собой клетки Th1 и провоспалительные клетки микроглии M1. Авторы изобретения полагают, что по мере изменения паттернов микробиоты кишечника популяция иммунных клеток имеет тенденцию к достижению статуса преобладания Th1 и M1.We also analyzed peripheral Th1 and Th1 immune cells and M1 and M2 microglial cells and found that the two major CD4+ cell subtypes (infiltrating Th1 and Th2 cells) showed similar dynamics to the two major microglial cell subtypes (M1 and M2 microglial cells) (Fig. 1f and Fig. 1j). In the early stage, they are mainly Th2 cells and neuroprotective M2 microglia cells, and in the late stage, they are mainly Th1 cells and pro-inflammatory M1 microglia cells. We believe that as gut microbiota patterns change, the immune cell population tends to achieve a Th1 and M1 predominant status.
Авторы изобретения также проанализировали корреляцию между содержанием микробиоты кишечника и клетками головного мозга у мышей Tg, и также отметили, что бактериальный состав на ранней стадии (2-3 месяца) в высокой степени коррелирует с количествами клеток M2 и Th2 в головном мозге (фиг. 1k, верх), в то время как на поздней стадии (7-9 месяцев) изменения бактериального паттерна в высокой степени коррелируют с клетками M1 и Th1 (фиг. 1k, низ). В целом, эти результаты указывают на то, что в ходе прогрессирования AD кишечные бактерии ассоциированы с инфильтрацией периферических иммунных клеток и нейровоспалением.We also analyzed the correlation between gut microbiota content and brain cells in Tg mice, and also noted that bacterial composition at an early stage (2-3 months) was highly correlated with the numbers of M2 and Th2 cells in the brain (Figure 1k , top), while at the late stage (7-9 months), changes in bacterial pattern are highly correlated with M1 and Th1 cells (Fig. 1k, bottom). Overall, these results indicate that during AD progression, gut bacteria are associated with peripheral immune cell infiltration and neuroinflammation.
Более того, авторы изобретения обнаружили, что дисбиоз микробиоты кишечника требуется для инфильтрации различных периферических иммунных клеток (включая CD4+ и CD8+ T-клетки, B-клетки, натуральные киллеры (NK), нейтрофилы, дендритные клетки (DC) и моноциты) в головной мозг. Среди них, особенно примечательными являются клетки Th1, поскольку они тесно связаны с активацией клеток микроглии M1 в ходе прогрессирования AD. Ввиду общепризнанной функциональной взаимосвязи Th1 и клеток микроглии M1 в головном мозге, авторы изобретения предположили, что дисбиоз кишечника способствует инфильтрации Th1-клеток, обеспечивая локальное взаимодействие с микроглией M1, тем самым запуская дифференцировку микроглии в провоспалительное состояние. Посредством серии открытий, полученных в ходе данного исследования, понимание этого механизма возросло. Во-первых, динамические изменения состава микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD на значимом уровне связаны с повышением инфильтрации клеток Th1. Во-вторых, сокращение микробиоты кишечника посредством введения антибиотиков блокировало инфильтрацию Th1-клеток и последующую активацию микроглии M1 у мышей с AD (фиг. 2a-c). В третьих, длительное воздействие фекальных бактерий (эксперимент с совместным содержанием) и трансплантация фекальной микробиоты от мышей AD значительно усиливали как инфильтрацию Th1-клеток (фиг. 2e), так и активацию микроглии M1, у мышей WT, в то время как трансплантация фекальной микробиоты мышей WT мышам Tg снижала уровни Th1-клеток у реципиентных мышей Tg (фиг. 9c). Результаты исследования автора изобретения в целом указывают на то, что микробиота кишечника является пусковым фактором, способствующим нейровоспалению, вызываемому Th1/микроглией M1, при прогрессировании AD.Moreover, we discovered that dysbiosis of the gut microbiota is required for the infiltration of various peripheral immune cells (including CD4+ and CD8+ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, neutrophils, dendritic cells (DC), and monocytes) into the brain . Among them, Th1 cells are particularly noteworthy as they are closely associated with the activation of M1 microglial cells during AD progression. In view of the well-established functional relationship between Th1 and M1 microglia cells in the brain, we hypothesized that gut dysbiosis promotes Th1 cell infiltration by mediating local interaction with M1 microglia, thereby triggering microglial differentiation into a pro-inflammatory state. Through a series of discoveries from this study, understanding of this mechanism has increased. First, dynamic changes in the composition of the intestinal microbiota during the progression of AD are significantly associated with increased infiltration of Th1 cells. Second, reduction of gut microbiota through antibiotic administration blocked Th1 cell infiltration and subsequent activation of M1 microglia in AD mice (Fig. 2a–c). Third, long-term exposure to fecal bacteria (co-housing experiment) and fecal microbiota transplantation from AD mice significantly enhanced both Th1 cell infiltration (Fig. 2e) and M1 microglial activation in WT mice, whereas fecal microbiota transplantation WT mice to Tg mice decreased Th1 cell levels in recipient Tg mice (Fig. 9c). The results of the inventor's study overall indicate that the gut microbiota is a triggering factor contributing to Th1/M1 microglia-driven neuroinflammation in the progression of AD.
Причинно-следственная взаимосвязь между дисбиозом микробиоты кишечника и нейровоспалением при AD все еще неясна. В этом исследовании авторы изобретения обнаружили, что более 100 метаболитов были на значимом уровне изменены у мышей с AD по сравнению с мышами WT. Среди них, наиболее выраженные изменения происходили среди аминокислот, особенно аминокислот в связанном с фенилаланином каскаде. Авторы изобретения смогли подтвердить, что содержание фенилаланина и изолейцина было повышенным в фекалиях и крови мышей AD относительно мышей WT. Функциональная оценка как in vitro, так и in vivo, продемонстрировала роль фенилаланина и изолейцина в способствовании дифференцировке и пролиферации периферических воспалительных Th1-клеток. Использование антибиотиков для сокращения микробиоты кишечника приводило к одновременному снижению уровней фенилаланина и изолейцина в крови, инфильтрации Th1-клеток и активации клеток M1. Эти данные подчеркивают роль аномального продуцирования фенилаланина и изолейцина в микробиоте кишечника в стимуляции нейровоспаления, определяемого Th1-клетками. В соответствии с этой точкой зрения, авторы изобретения обнаружили, что концентрация фенилаланина/изолейцина и количество Th1-клеток в крови пациентов с MCI, вызванным AD, являются более высокими, чем в группе здоровых контролей.The cause-and-effect relationship between gut microbiota dysbiosis and neuroinflammation in AD is still unclear. In this study, the inventors found that more than 100 metabolites were altered at significant levels in AD mice compared to WT mice. Among them, the most pronounced changes occurred among amino acids, especially amino acids in the phenylalanine-related cascade. We were able to confirm that phenylalanine and isoleucine were elevated in the feces and blood of AD mice relative to WT mice. Functional evaluation , both in vitro and in vivo, demonstrated the role of phenylalanine and isoleucine in promoting the differentiation and proliferation of peripheral inflammatory Th1 cells. The use of antibiotics to reduce the gut microbiota resulted in a concomitant decrease in blood phenylalanine and isoleucine levels, Th1 cell infiltration, and M1 cell activation. These data highlight the role of abnormal phenylalanine and isoleucine production in the gut microbiota in promoting Th1 cell-driven neuroinflammation. Consistent with this view, the inventors found that the concentration of phenylalanine/isoleucine and the number of Th1 cells in the blood of patients with MCI caused by AD are higher than in a group of healthy controls.
Новые появившиеся данные показывают, что полисахариды или олигосахариды имеют преимущество регуляции микробиоты кишечника. Олигосахариды маннуроновой кислоты представляют собой лекарственные средства против AD на углеводной основе. В клиническом испытании фазы III, недавно завершенном в Китае, было показано, что они улучшают когнитивные способности у пациентов с AD от мягкой до умеренной. Олигосахариды маннуроновой кислоты хорошо переносятся и имеют безопасность, сходную с плацебо-контролями. В этом испытании авторы изобретения обнаружили, что OM1 эффективно восстанавливает микробиоту кишечника (фиг. 4a-b; фиг. 10a), снижает количество фенилаланина и изолейцина в фекалиях и крови (фиг. 5c-d), и снижает обусловленное Th1 нейровоспаление (фиг. 4g-i). Следует отметить, что фекалии Tg, которым вводили OM1, могут в значительной степени имитировать терапевтический эффект самого лечения OM1, и лечение антибиотиками устраняет их терапевтический эффект. Эти данные обеспечивают важное доказательство того, что терапевтический эффект OM1 в основном опосредуется восстановлением микробиоты кишечника. Таким образом, OM1 может обеспечить привлекательный подход для стратегий лечения AD, сфокусированных на микробиоте, что заслуживает дальнейшего исследования.Newly emerging evidence suggests that polysaccharides or oligosaccharides have benefits in regulating the gut microbiota. Mannuronic acid oligosaccharides are carbohydrate-based anti-AD drugs. In a phase III clinical trial recently completed in China, they were shown to improve cognitive performance in patients with mild to moderate AD. Mannuronic acid oligosaccharides are well tolerated and have safety similar to placebo controls. In this trial, we found that OM1 effectively restores the gut microbiota (Fig. 4a-b; Fig. 10a), reduces phenylalanine and isoleucine in feces and blood (Fig. 5c-d), and reduces Th1-mediated neuroinflammation (Fig. 4g-i). It should be noted that OM1-treated Tg feces can largely mimic the therapeutic effect of OM1 treatment itself, and antibiotic treatment eliminates its therapeutic effect. These data provide important evidence that the therapeutic effect of OM1 is primarily mediated by restoration of the gut microbiota. Thus, OM1 may provide an attractive approach for microbiota-focused treatment strategies for AD that merits further investigation.
Все эти данные позволяют авторам изобретения сделать предположение о концептуальном прорыве в понимании патогенеза AD. AD является не только локальным опосредуемым Aβ заболеванием головного мозга, но ее развитие также требует системных взаимодействий между кишечником, головным мозгом и промежуточными воспалительными факторами (фиг. 6). В случае отложения Aβ измененный состав микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD вызывает аномальное повышение уровней аминокислот (особенно фенилаланина и изолейцина). Эти аминокислоты способствуют инфильтрации периферических Th1-клеток в головной мозг через кровоток. Инфильтрирующие периферические Th1-клетки могут локально взаимодействовать с микроглией M1 в головном мозге, что приводит к патологическому нейровоспалению и снижению когнитивной функции. Эти данные о патогенезе AD могут использоваться для восстановления микробиоты кишечника для способствования ответу, направленному против нейровоспаления, и предоставления новых терапевтических решений.All these data allow the inventors to suggest a conceptual breakthrough in understanding the pathogenesis of AD. AD is not only a localized Aβ-mediated disease of the brain, but its development also requires systemic interactions between the gut, brain, and inflammatory intermediates (Figure 6). In the case of Aβ deposition, the altered composition of the gut microbiota during AD progression causes abnormal increases in amino acid levels (especially phenylalanine and isoleucine). These amino acids promote the infiltration of peripheral Th1 cells into the brain through the bloodstream. Infiltrating peripheral Th1 cells may locally interact with M1 microglia in the brain, leading to pathological neuroinflammation and cognitive decline. These insights into AD pathogenesis can be used to restore the gut microbiota to promote anti-neuroinflammation responses and provide novel therapeutic solutions.
Результаты исследования автора изобретения могут иметь революционное значение для диагностики и лечения AD. Композиция конкретных бактерий (например, связанные с Th1/M1 бактерии), аминокислот (например, фенилаланин и изолейцин) и инфильтрирующих головной мозг иммунных клеток (например, преобладание Th1-клеток) или комбинация одного или нескольких из них могут использоваться в качестве ранних диагностических биомаркеров для пациентов с MCI, вызванным AD, и это заслуживает дальнейшего подтверждения на большой выборке пациентов с AD.The results of the inventor's research may have revolutionary implications for the diagnosis and treatment of AD. A composition of specific bacteria (eg, Th1/M1-associated bacteria), amino acids (eg, phenylalanine and isoleucine), and brain-infiltrating immune cells (eg, Th1 cell predominance), or a combination of one or more of these, can be used as early diagnostic biomarkers for patients with MCI caused by AD, and this deserves further confirmation in a larger sample of AD patients.
Более важно, установленный эффект OM1 против AD, сфокусированный на микробиоте, откроет новые терапевтические подходы для лечения AD путем реорганизации микробиоты кишечника, и определит развитие эффективных способов терапии в будущем путем изучения в высокой степени неисследованной химии сахаров.More importantly, the established microbiota-focused anti-AD effect of OM1 will open up new therapeutic approaches to treat AD by reorganizing the gut microbiota, and will guide the development of effective therapies in the future by exploring highly unexplored sugar chemistry.
Каждый из идентифицированных авторами изобретения многочисленных характерных микроорганизмов кишечника, аминокислот, иммунных клеток и цитокинов, связанных с осью головной мозг-кишечник составляет микробный профиль кишечника, профиль аминокислот, профиль иммунных клеток и профиль цитокинов. Один или несколько из этих профилей (таких как микробный профиль кишечника) демонстрируют различия между нормальными и заболевшими индивидуумами. Настоящее изобретение нацелено на выявление или регуляцию состояния индивидуума путем выявления или регуляции одного или нескольких из этих профилей (таких как микробный профиль кишечника). В некоторых вариантах осуществления для диагностических целей профиль (например, микробный профиль кишечника) индивидуума может быть определен для сравнения с профилем (например, микробный профиль кишечника) с нормальными характеристиками соответствующего нормального индивидуума и/или профилем (например, микробный профиль кишечника) с характеристиками заболевания соответствующего заболевшего индивидуума, чтобы определить является ли состояние индивидуума нормальным или болезненным, тем самым диагностируя индивидуума. В некоторых вариантах осуществления для терапевтических целей профиль индивидуума с характеристиками заболевания может регулироваться до профиля соответствующего нормального индивидуума, так что болезненное состояние индивидуума может регулироваться до нормального состояния, тем самым осуществляя лечение индивидуума.Each of the inventors' identification of numerous representative gut microorganisms, amino acids, immune cells, and cytokines associated with the brain-gut axis constitutes a gut microbial profile, amino acid profile, immune cell profile, and cytokine profile. One or more of these profiles (such as the gut microbial profile) demonstrate differences between normal and diseased individuals. The present invention aims to detect or regulate the condition of an individual by detecting or regulating one or more of these profiles (such as the gut microbial profile). In some embodiments, for diagnostic purposes, a profile (eg, gut microbial profile) of an individual may be determined for comparison with a profile (eg, gut microbial profile) with normal characteristics of the corresponding normal individual and/or a profile (eg, gut microbial profile) with disease characteristics the corresponding diseased individual to determine whether the individual's condition is normal or diseased, thereby diagnosing the individual. In some embodiments, for therapeutic purposes, the profile of an individual with disease characteristics may be adjusted to that of a corresponding normal individual, such that the disease state of the individual may be adjusted to the normal state, thereby treating the individual.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов для производства лекарственного средства для лечения у индивидуума болезни Альцгеймера.Thus, in one aspect, the present invention relates to the use of an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes for the production of a medicament for treating an individual with Alzheimer's disease.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, причем фармацевтическая композиция содержит эффективное количество средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease in an individual, wherein the pharmaceutical composition contains an effective amount of an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации. In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more of Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, or combinations thereof .
В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из углеводных лекарственных средств, микробных комплексов в кишечнике или их комбинаций; где углеводное лекарственное средство выбрано из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов или их производных, или их комбинаций и/или их производных; предпочтительно олигосахаридов и полисахаридов; более предпочтительно олигосахаридов маннуроновой кислоты или композиции, содержащей олигосахариды маннуроновой кислоты; где микробный комплекс кишечника включает одно или несколько из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации.In some embodiments, the agent is selected from carbohydrate drugs, gut microbial complexes, or combinations thereof; wherein the carbohydrate drug is selected from monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides or derivatives thereof, or combinations thereof and/or derivatives thereof; preferably oligosaccharides and polysaccharides; more preferably mannuronic acid oligosaccharides or a composition containing mannuronic acid oligosaccharides; wherein the gut microbial complex includes one or more of Firmicutes , Bacteroidetes , Proteobacteria , Actinomycetes , Fusobacteria , Cyanobacteria , Verrucomicrobia , or combinations thereof.
В некоторых вариантах осуществления средство регулирует относительное содержание микробов у индивидуума на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает относительное содержание кишечных микробов у индивидуума близким к или достигающим относительного содержания кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the agent adjusts the relative microbial abundance of an individual by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; and/or makes the relative abundance of intestinal microbes in the individual close to or equal to the relative abundance of intestinal microbes in the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления регуляция относительного содержания кишечных микробов осуществляется для повышения относительного одного или нескольких кишечных микроорганизмов и/или снижения содержания одного или нескольких кишечных микроорганизмов.In some embodiments, the relative abundance of gut microbes is adjusted to increase the relative abundance of one or more gut microbes and/or decrease the relative abundance of one or more gut microbes.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственных средств-кандидатов, которые могут использоваться для лечения болезни Альцгеймера, причем способ включает:In another aspect, the present invention relates to a method for screening drug candidates that may be used to treat Alzheimer's disease, the method comprising:
a) введение тестируемого средства в моделях in vivo или in vitro models с кишечными микробами, иa) administration of the test agent in in vivo or in vitro models with gut microbes, and
b) выбор тестируемого средства, которое регулирует относительное содержание кишечных микробов, в качестве лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера.b) selecting a test agent that regulates the relative abundance of intestinal microbes as a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease.
В некоторых вариантах осуществления способ также включает введение OM1 в качестве положительного контроля в модели in vivo или in vitro с кишечными микробами, предпочтительно выбирая тестируемое средство, которое регулирует относительное содержание кишечных микробов по существу сопоставимо с OM1. In some embodiments, the method also includes administering OM1 as a positive control in an in vivo or in vitro model of gut microbes, preferably selecting a test agent that regulates the relative abundance of gut microbes substantially comparable to OM1.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение выбранного тестируемого средства в модели in vivo или in vitro с кишечными микробами для подтверждения, где выбранное тестируемое средство регулирует относительное содержание кишечных микробов на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает относительное содержание кишечных микробов близким к или достигающим относительного содержания соответствующих кишечных микробов в соответствующей нормальной модели in vivo или in vitro.In some embodiments, the method further includes administering the selected test agent to an in vivo or in vitro model of gut microbes for confirmation, wherein the selected test agent adjusts the relative abundance of gut microbes by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; and/or makes the relative abundance of gut microbes similar to or equal to the relative abundance of the corresponding gut microbes in the corresponding normal in vivo or in vitro model.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more of Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, or combinations thereof.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу создания модели болезни Альцгеймера на животных, причем способ включает введение средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов животному, так чтобы относительное содержание кишечных микробов у животного регулировалось на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; или было близким к или достигало относительного содержания соответствующих кишечных микробов в соответствующей модели на животных, имеющих болезнь Альцгеймера.In another aspect, the present invention relates to a method for creating an animal model of Alzheimer's disease, the method comprising administering an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes to an animal, such that the relative abundance of intestinal microbes in the animal is adjusted by 1, 2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; or was close to or equal to the relative abundance of the relevant gut microbes in the relevant animal model of Alzheimer's disease.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more of Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinomycetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, or combinations thereof.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение агрегированного белка Aβ животному посредством инъекции в гиппокамп.In some embodiments, the method further comprises administering the aggregated Aβ protein to an animal via injection into the hippocampus.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациентов с болезнью Альцгеймера, причем способ включает:In another aspect, the present invention relates to a method of treating patients with Alzheimer's disease, the method comprising:
(a) детекцию относительного содержания кишечных микробов у пациента и сравнение его с относительным содержанием соответствующих кишечных микробов в соответствующей нормальной выборке для выбора кишечного микроорганизма, относительное содержание которого отличается от относительного содержания соответствующего кишечного микроорганизма в соответствующей нормальной выборке.(a) detecting the relative abundance of gut microbes in the patient and comparing it with the relative abundance of the corresponding gut microbes in the corresponding normal sample to select a gut microorganism whose relative abundance differs from the relative abundance of the corresponding gut microbe in the corresponding normal sample.
(b) введение средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов пациенту для регуляции относительного содержания выбранного кишечного микроорганизма, чтобы он был близким или достигал относительного содержания соответствующего кишечного микроорганизма в соответствующей нормальной выборке.(b) administering an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes to the patient to regulate the relative abundance of the selected intestinal microorganism so that it is similar to or reaches the relative abundance of the corresponding intestinal microorganism in the corresponding normal sample.
В некоторых вариантах осуществления углеводное лекарственное средство представляет собой OM1.In some embodiments, the carbohydrate drug is OM1.
В некоторых вариантах осуществления углеводное лекарственное средство не является OM1.In some embodiments, the carbohydrate drug is not OM1.
В некоторых вариантах осуществления олигосахарид маннуроновой кислоты представляет собой OM1.In some embodiments, the mannuronic acid oligosaccharide is OM1.
В некоторых вариантах осуществления олигосахарид маннуроновой кислоты не является OM1.In some embodiments, the mannuronic acid oligosaccharide is not OM1.
Структура и способ получения олигосахаридов маннуроновой кислоты описаны во многих документах уровня техники. В патенте уровня техники CN2016100697039 описан способ получения олигоманнуроновой кислоты, в патенте уровня техники CN2017107964853 описан способ определения средневзвешенной молекулярной массы и количества маннуроновых кислот, в патенте уровня техники CN2017114675966 описана композиция маннуроновой кислоты и ее получение, все из них включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. OM1, используемая в рамках настоящего описания, представляет собой композицию A согласно CN2018107213276 ("олигосахаридная композиция альгиновой кислоты "), который включен в настоящее описание в качестве ссылки.The structure and method of preparation of mannuronic acid oligosaccharides are described in many prior art documents. The prior art patent CN2016100697039 describes a method for the preparation of oligomannuronic acid, the prior art patent CN2017107964853 describes a method for determining the weight average molecular weight and amount of mannuronic acids, the prior art patent CN2017114675966 describes the composition of mannuronic acid and its preparation, all of which are incorporated herein by reference in full. OM1 used herein is composition A according to CN2018107213276 (“alginic acid oligosaccharide composition”), which is incorporated herein by reference.
МикробиотаMicrobiota
В настоящем описании описаны способы и композиции, которые включают изменение микробиоты кишечного тракта индивидуума. Термин "микробиота" используют для указания на одно или несколько бактериальных сообществ, которые могут быть найдены или существуют (колонизируют) в кишечном тракте организма. Он может использоваться взаимозаменяемо с "микробами/микроорганизмами" или "кишечными микробами/микроорганизмами" в настоящем описании. При указании на более чем одну микробиоту, микробиоты могут быть одного типа (штамма) или могут представлять собой смесь групп, таких как Bacteroidetes, Proteobacteria и/или Firmicutes, или их подгрупп (класс, порядок, семейство, род, вид). Микробиота может представлять собой смесь микроорганизмов на одном уровне, таких как Bacteroidetes, Proteobacteria и/или Firmicutes; она также может представлять собой смесь различных уровней микроорганизмов, таких как Bacteroidetes и Proteobacteria.Described herein are methods and compositions that involve altering the microbiota of an individual's intestinal tract. The term "microbiota" is used to refer to one or more bacterial communities that can be found or exist (colonize) in the intestinal tract of an organism. It may be used interchangeably with "microbes/microorganisms" or "gut microbes/microorganisms" herein. When referring to more than one microbiota, microbiotas may be of a single type (strain) or may be a mixture of groups such as Bacteroidetes, Proteobacteria and/or Firmicutes , or subgroups thereof (class, order, family, genus, species). The microbiota may be a mixture of microorganisms at one level, such as Bacteroidetes , Proteobacteria and/or Firmicutes ; it may also be a mixture of different levels of microorganisms such as Bacteroidetes and Proteobacteria .
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из типа, класса, порядка, семейства рода или вида, приведенных в таблице 1, или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more selected from the type, class, order, family, genus or species shown in Table 1, or a combination thereof.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из типа, класса, порядка, семейства, рода или вида, приведенных в таблице 2, или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more selected from the type, class, order, family, genus or species shown in Table 2, or a combination thereof.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more selected from Firmicutes , Bacteroidetes , Proteobacteria , Actinobacteria , Fusobacteria , Cyanobacteria , Verrucomicrobia , or a combination thereof.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из типа, приведенного в таблице ниже, или их комбинации:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the type shown in the table below, or a combination thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из классов, приведенных в следующей таблице, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the classes shown in the following table, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из порядков, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the orders shown in the table below, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечный микроорганизм представляет собой один или несколько, выбранных из семейств, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:In some embodiments, the enteric microorganism is one or more selected from the families listed in the table below, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из родов, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the genera listed in the table below, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из следующих видов или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the following types or combinations thereof:
Авторы изобретения обнаружили, что множество кишечных микробов вовлечено в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых кишечных микробов были изменены и после введения, например, OM1, уровни этих кишечных микробов восстанавливались до уровней у мышей WT. Такие кишечные микробы составляют профиль кишечных микробов. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей.The inventors have discovered that a variety of gut microbes are involved in the brain-gut axis in accordance with the present invention. As shown in the examples, between WT mice and TG mice the levels of certain gut microbes were altered and after administration of, for example, OM1, the levels of these gut microbes were restored to the levels in WT mice. Such gut microbes make up the gut microbial profile. As mentioned earlier, such a profile can be used for diagnostic and/or therapeutic purposes.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 или 67) кишечных микробов, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% кишечных микробов в профиле кишечных микробов, состоящем из кишечных микробов типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, приведенных в таблице выше, у индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD.In some embodiments, changing (e.g., increasing or decreasing) the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 , 66 or 67) of gut microbes selected from the table above in an individual relative to the level of corresponding gut microbes in a corresponding normal individual indicates that the individual is at risk for AD or has AD. In one embodiment, changing (e.g., increasing or decreasing) level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 or 100% of gut microbes in a gut microbial profile consisting of gut microbes of the type, class, order, family, genus and species shown in the table above in an individual relative to the level of corresponding gut microbes in the corresponding normal individual indicates that the individual is at risk for AD or has AD.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 или 67) кишечных микробов, выбранных из типа, класса, порядка, семейства, рода и вида из приведенной выше таблицы у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум получает надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% кишечных микробов в профиле кишечных микробов, состоящем из кишечных микробов типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, приведенных в таблице выше, у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум получает надлежащее лечение.In some embodiments, changing (e.g., increasing or decreasing) the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 , 66 or 67) gut microbes selected from the type, class, order, family, genus and species from the table above in an individual with AD to the level of corresponding gut microbes in a corresponding normal individual relative to the level of corresponding gut microbes in a corresponding normal individual indicates that that the individual is receiving appropriate treatment. In one embodiment, changing (e.g., increasing or decreasing) level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99, or 100% of gut microbes in a gut microbe profile consisting of gut microbes of the type, class, order, family, genus, and species listed in the table above, in an individual with AD to the level of the corresponding gut microbes in a corresponding normal individual relative to the level of corresponding intestinal microbes in a corresponding normal individual indicates that the individual is receiving appropriate treatment.
Относительное содержание кишечных микробов можно изменять с использованием композиции или способа по настоящему изобретению следующим образом: введение композиции, содержащей соответствующую микробиоту или введение композиции, содержащей одно или несколько соединений, которые значительно повышают и/или снижают относительное содержание соответствующих кишечных микробов.The relative abundance of intestinal microbes can be altered using the composition or method of the present invention as follows: administration of a composition containing the appropriate microbiota or administration of a composition containing one or more compounds that significantly increase and/or decrease the relative abundance of the appropriate intestinal microbes.
Bacteroidetes включают три основных класса бактерий: Bacteroidia, Flavobacteria и Sphingobacteria. Они распространены в окружающей среде, включая почву, ил, морскую воду и кишечник и кожу животных. Bacteroidetes include three main classes of bacteria: Bacteroidia , Flavobacteria , and Sphingobacteria . They are common in the environment, including soil, mud, seawater and animal intestines and skin.
Proteobacteria являются наиболее крупным типом бактерий. Эти организмы демонстрируют чрезвычайно высокое метаболическое разнообразие и отражают медицинскую, промышленную и сельско-хозяйственную важность большинства известных бактерий. Это является важным с эволюционноной, геологической и экологической точки зрения. Все бактерии Proteobacteria являются грамотрицательными и их внешняя стенка состоит из липополисахарида. Многие из них имеют газовые везикулы, жгутики или могут передвигаться путем скольжения; они могут иметь стебельки, другие отростки или обладают способности формировать многоклеточные плодовые тела. Большинство являются факультативными или облигатно-анаэробными, аутотрофными и гетеротрофными, однако существуют исключения. Некоторые виды способны к фотосинтезу, другие запасают серу внутри или снаружи клетки. Proteobacteria are the largest phylum of bacteria. These organisms exhibit extremely high metabolic diversity and reflect the medical, industrial and agricultural importance of most known bacteria. This is important from an evolutionary, geological and ecological point of view. All Proteobacteria bacteria are gram-negative and their outer wall is composed of lipopolysaccharide. Many of them have gas vesicles, flagella, or can move by sliding; they may have stalks, other processes, or have the ability to form multicellular fruiting bodies. Most are facultative or obligate anaerobic, autotrophic and heterotrophic, but there are exceptions. Some species are capable of photosynthesis, others store sulfur inside or outside the cell.
Firmicutes являются типом в основном грамположительных бактерий. Однако некоторые имеют пористые псевдонаружные мембраны, которые делают их грамотрицательными. Ученые однажды классифицировали Firmicutes как включающих грамположительные бактерии, однако недавно определили их как основную группу с родственной формой, называемой формой с низким-G+C. Они в основном представляют собой округлые клетки, называемые кокками (единичные кокки), или являются палочковидными (бациллы). Многие Firmicutes продуцируют эндоспоры, которые являются устойчивыми к осушению и могут выжить в экстремальных условиях, что позволяет им выжить в различных условиях внешней среды. Firmicutes are a type of primarily gram-positive bacteria. However, some have porous pseudoouter membranes that make them Gram-negative. Scientists once classified the Firmicutes as including gram-positive bacteria, but have recently identified them as a major group with a related form called the low-G+C form. They are mostly round cells called cocci (single cocci) or are rod-shaped (bacilli). Many Firmicutes produce endospores that are resistant to desiccation and can survive in extreme conditions, allowing them to survive in a variety of environmental conditions.
Способ изменения микробиоты также может включать измерение относительного содержания одного или нескольких микроорганизмов кишечника в образце от индивидуума. В ходе секвенирования последнего поколения множество последовательностей определяют для каждого образца. После предварительной обработки используют алгоритмы кластеризации последовательностей для объединения последовательностей со сходством более 97% с получением OTU. Затем может быть получена таблица OTU_table, которая представляет собой матрицу, в которой указано сколько чтений содержит каждая OTU в каждом образце, т.е. каждый образец соответствует числу чтений последовательностей в каждой OTU. Относительное содержание соответствует 100% для каждого образца (каждый ряд), и вычисляют процент числа чтений в каждой OTU относительно числа всех чтений в образце. Таким образом, относительное содержание относится к относительному проценту числа последовательностей каждого микроорганизма в образце. Относительное содержание может быть обнаружено способом, описанным в настоящем описании, или способом, известным в данной области, который может использоваться для его детекции, таким как детекция гена 16S рРНК.The method of modifying the microbiota may also include measuring the relative abundance of one or more gut microorganisms in a sample from an individual. In last-generation sequencing, multiple sequences are determined for each sample. After preprocessing, sequence clustering algorithms are used to combine sequences with greater than 97% similarity to obtain OTUs. The OTU_table can then be obtained, which is a matrix indicating how many reads each OTU contains in each sample, i.e. each sample corresponds to the number of sequence reads in each OTU. Relative abundance is set to 100% for each sample (each row), and the percentage of the number of reads in each OTU relative to the number of all reads in the sample is calculated. Thus, relative abundance refers to the relative percentage of the number of sequences of each microorganism in a sample. The relative abundance can be detected by the method described herein or by a method known in the art that can be used to detect it, such as 16S rRNA gene detection.
Относительное содержание кишечных микробов можно определять путем получения образцов от индивидуума. Образец может представлять собой слюну, фекалии и содержимое желудка, кишечника и/или прямой кишки; образцы тканей пищеварительного тракта (такие как ткань полости рта, пищевода, желудка, тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки и/или прямой кишки); асцитную жидкость в желудочно-кишечных тканях; и любые другие образцы, которые могут использоваться индивидуумами, знакомыми с анализом микробиоты.The relative abundance of gut microbes can be determined by obtaining samples from an individual. The sample may be saliva, feces, and stomach, intestinal, and/or rectal contents; digestive tract tissue samples (such as tissue from the oral cavity, esophagus, stomach, small intestine, ileum, cecum, colon, and/or rectum); ascites fluid in gastrointestinal tissues; and any other samples that may be used by individuals familiar with microbiota analysis.
Относительное содержание одного или нескольких видов кишечных микроорганизмов можно сравнивать с нормальным относительным содержанием соответствующих кишечных микробов. Нормальное относительное содержание может представлять собой содержание у одного или нескольких индивидуумов сходного возраста, пола, расы и т.п. Нормальное относительное содержание может представлять собой содержание у здоровых индивидуумов сходного возраста, пола, расы и т.д., которые отвечали на или продемонстрировали благоприятные результаты лечения или терапевтического вмешательства. В конкретном варианте осуществления нормальное относительное содержание представляет собой относительное содержание кишечных микробов у здоровых индивидуумов.The relative abundance of one or more species of intestinal microorganisms can be compared with the normal relative abundance of the corresponding intestinal microbes. Normal relative abundance may be that of one or more individuals of similar age, gender, race, or the like. Normal relative content may be that of healthy individuals of similar age, sex, race, etc., who have responded to or demonstrated favorable results from a treatment or therapeutic intervention. In a specific embodiment, the normal relative abundance is the relative abundance of intestinal microbes in healthy individuals.
Способы и композиции по изобретению могут вовлекать изменение относительного содержания одного или нескольких кишечных микробов. Иллюстративные варианты осуществления могут вовлекать способы или композиции для изменения относительного содержания кишечных микробов путем введения кишечных микробов индивидууму. В зависимости от желаемого результата (например, снижение уровня метаболитов, снижение лимфоцитарной инфильтрации в головном мозге, снижение активации микроглии, снижение нейровоспаления, улучшение когнитивной функции и облегчение симптомов болезни Альцгеймера) и конкретных индивидуумов, относительное содержание кишечных микробов можно регулировать на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99-100% или более, или на диапазон, состоящий из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, такой как от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или приблизительно на 7%, 14%, 21%, 28% и т.п..; и/или можно обеспечивать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума, близкое или достигающее относительное содержание соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума.The methods and compositions of the invention may involve changing the relative abundance of one or more gut microbes. Exemplary embodiments may involve methods or compositions for changing the relative abundance of gut microbes by administering gut microbes to an individual. Depending on the desired outcome (eg, reduced metabolite levels, reduced lymphocytic infiltration in the brain, reduced microglial activation, reduced neuroinflammation, improved cognitive function, and alleviation of Alzheimer's disease symptoms) and the specific individual, the relative abundance of gut microbes can be adjusted by 1, 2. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99-100% or more, or to a range consisting of the end points of the above values or any values in between, such as from about 7% to about 28%, etc., or by about 7%, 14%, 21%, 28%, and the like. .; and/or the relative abundance of gut microbes in an individual can be provided to be similar to or equal to the relative abundance of the corresponding gut microbes in a corresponding normal individual.
Как описано в настоящем описании, настоящее изобретение направлено на регуляцию показателя, который отличается от соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, в направлении соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, так чтобы показатель после регуляции был близким или достигал соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума. Эта регуляция применима к различным показателям, подлежащим регулированию или регулируемым, как описано в настоящем описании. Очевидно, является идеальным достижение соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, однако также является желательным приближение к соответствующему показателю у соответствующего нормального индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение направлено на получение одного или нескольких показателей у индивидуума, у которого намереваются регулировать один или несколько показателей, чтобы они были близкими или достигли соответствующих показателей у соответствующих нормальных индивидуумов. Как используют в рамках изобретения, термин "близок к или достигает" означает, что различие между показателем до регуляции и соответствующим показателем у соответствующего нормального индивидуума снижается на величину, превышающую или равную приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100%, или на диапазон, состоящий из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, такой как от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п. относительно различия после регуляции. Когда различие между показателем до регуляции и соответствующим показателем у соответствующего нормального индивидуума снижается приблизительно на 100% относительно различия после регуляции, регулируемый показатель достигает соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума. Специалистам в данной области понятно, что конкретная величина различия зависит, например, от объекта регуляции, типа показателя, способа измерения и т.п.As described herein, the present invention is directed to regulating a score that differs from a corresponding score in a corresponding normal individual toward a corresponding score in a corresponding normal individual such that the score after regulation is similar to or reaches the corresponding score in a corresponding normal individual. This regulation is applicable to various indicators subject to regulation or controllability, as described herein. Obviously, achieving the corresponding score in a suitable normal individual is ideal, but approximating the corresponding score in a corresponding normal individual is also desirable. Thus, the present invention is directed to obtaining one or more indicators from an individual in whom one or more indicators are intended to be adjusted to approximate or achieve the corresponding indicators in corresponding normal individuals. As used herein, the term "close to or reaches" means that the difference between the pre-adjustment score and the corresponding score in a corresponding normal individual is reduced by an amount greater than or equal to approximately 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100%, or the range consisting of the endpoints of the above values or any values in between, such as from about 7% to about 28% and the like. regarding differences after regulation. When the difference between the pre-regulation score and the corresponding score in the corresponding normal individual is reduced by approximately 100% relative to the difference after regulation, the regulated score reaches the corresponding score in the corresponding normal individual. Those skilled in the art understand that the specific magnitude of the difference depends, for example, on the object of regulation, the type of indicator, the method of measurement, etc.
Средство, способное регулировать один или несколько показателей у индивидуума, чтобы они были близкими или достигали соответствующих показателей у соответствующего нормального индивидуума, является терапевтически желательным. Выбор таких средств может быть основан, например, на средствах (таких как OM1), которые служат в качестве положительного контроля. Предпочтительно, выбирают тестируемое вещество, которое регулирует соответствующий показатель по существу сопоставимо со средством, используемым в качестве положительного контроля (например, OM1).An agent capable of adjusting one or more parameters in an individual to match or achieve those of a corresponding normal individual is therapeutically desirable. The selection of such agents may be based, for example, on agents (such as OM1) that serve as positive controls. Preferably, a test substance is selected that controls the relevant parameter substantially comparable to the agent used as a positive control (eg, OM1).
С другой стороны, один или несколько показателей индивидуума, у которого требуется регуляция одного или нескольких показателей, по существу сопоставимы с эталонным показателем (например, эталонный показатель для диагностики болезни Альцгеймера или идентификации чувствительных к углеводным лекарственным средствам пациентов у пациентов с болезнью Альцгеймера), который может указывать на то, что индивидуум имеет риск болезни Альцгеймера или имеет болезнь Альцгеймера.On the other hand, one or more indicators of an individual in whom regulation of one or more indicators is required is substantially comparable to a reference indicator (for example, a reference indicator for diagnosing Alzheimer's disease or identifying carbohydrate-drug-sensitive patients in patients with Alzheimer's disease) that may indicate that an individual is at risk for Alzheimer's disease or has Alzheimer's disease.
Как используют в рамках изобретения, термин "по существу такой же" относится к стандартизации тестируемого показателя относительно эталонного показателя (т.е. эталонный показатель принимают за 100%), разность между тестируемым показателем и эталонным показателем является меньшей или равной приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или диапазону, состоящему из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, например, от приблизительно 7% до приблизительно 28%, и т.п., или приблизительно 7%, 14%, 21%, 28% и т.п. Специалистам в данной области понятно, что конкретная величина разности будет зависеть, например, от подлежащего регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.As used herein, the term "substantially the same" refers to the standardization of the test score relative to the reference score (i.e., the reference score is taken as 100%), the difference between the test score and the reference score is less than or equal to approximately 0.1. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or range , consisting of the end points of the above values or any values in between, for example, from about 7% to about 28%, etc., or about 7%, 14%, 21%, 28%, and the like. Those skilled in the art will understand that the specific magnitude of the difference will depend, for example, on the object being regulated, the type of indicator, the method of measurement, and the like.
В некоторых вариантах осуществления средство для регуляции относительного содержания кишечных микробов включает комплекс кишечных микробов. В некоторых вариантах осуществления комплекс кишечных микробов включает микроорганизмы, происходящие из фекального материала или бактериальной библиотеки. В некоторых вариантах осуществления фекальный материал происходит из нормального индивидуума или пациента с болезнью Альцгеймера.In some embodiments, the agent for regulating the relative abundance of gut microbes comprises a complex of gut microbes. In some embodiments, the gut microbial complex includes microorganisms derived from fecal material or a bacterial library. In some embodiments, the fecal material comes from a normal individual or a patient with Alzheimer's disease.
Определение бактериальной библиотеки: для получения информации о классификации видов, соответствующей каждой OTU, используют байесовский алгоритм классификации RDP для проведения таксономического анализа на уровне сходства 97% репрезентативных последовательностей OTU и состав сообщества для каждого образца подсчитывают на каждом уровне классификации (домен, царство, тип, класс, порядок, семейство, род, вид). Таксономическая сравнительная база данных видов, используемая для анализа 16S бактериальной флоры, представляет собой silva132/16S:silva132/16S (http://www.arb-silva.de).Bacterial library identification: To obtain species classification information corresponding to each OTU, the Bayesian RDP classification algorithm is used to perform taxonomic analysis at the 97% similarity level of representative OTU sequences and the community composition for each sample is calculated at each classification level (domain, kingdom, phylum, class, order, family, genus, species). The taxonomic comparative species database used for the analysis of 16S bacterial flora is silva132/16S:silva132/16S (http://www.arb-silva.de).
Вовлеченные метаболитыMetabolites involved
Автор изобретения обнаружил, что некоторые метаболиты кишечных микробов, такие как аминокислоты, вовлечены в ось головной мозг-кишечник при AD, исследованную в рамках настоящего изобретения. Эти аминокислоты могут представлять собой, например, одну или несколько, выбранных из следующей таблицы; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно фенилаланина и/или изолейцина; наиболее предпочтительно фенилаланина.The inventor has discovered that certain gut microbial metabolites, such as amino acids, are involved in the brain-gut axis in AD investigated by the present invention. These amino acids may be, for example, one or more selected from the following table; preferably one or more selected from phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine and acetylornithine; more preferably phenylalanine and/or isoleucine; most preferably phenylalanine.
Авторы изобретения обнаружили, что различные аминокислоты вовлечены в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых аминокислот были изменены и после введения, например, OM1, уровни этих аминокислот восстанавливались в направлении уровней у мышей WT. Такие аминокислоты составляют профиль аминокислот. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей. В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36) аминокислот, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума относительно уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислот в профиле аминокислот, состоящем из аминокислот в приведенной выше таблице, у индивидуума относительно уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск наличия AD или имеет AD.The inventors have discovered that various amino acids are involved in the brain-gut axis in accordance with the present invention. As shown in the examples, between WT mice and TG mice the levels of certain amino acids were altered and after administration of, for example, OM1, the levels of these amino acids were restored towards the levels in WT mice. Such amino acids make up the amino acid profile. As mentioned earlier, such a profile can be used for diagnostic and/or therapeutic purposes. In some embodiments, changing (e.g., increasing or decreasing) the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 or 36) amino acids selected from the table above , in an individual relative to the level of corresponding amino acids in a corresponding normal individual, indicates that the individual is at risk for AD or has AD. In one embodiment, changing (e.g., increasing or decreasing) level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99, or 100% of the amino acids in the amino acid profile of the amino acids in the table above in an individual relative to the level of the corresponding amino acid in a corresponding normal individual indicates that the individual is at risk of having AD or has AD.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36) аминокислот, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума, имеющего AD, относительно уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума в направлении уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислот в профиле аминокислот, состоящем из аминокислот в приведенной выше таблице, у индивидуума, имеющего AD, относительно уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, в направлении уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение.In some embodiments, changing (e.g., increasing or decreasing) the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 or 36) amino acids selected from the table above , in an individual having AD, relative to the level of the corresponding amino acid in the corresponding normal individual in the direction of the level of the corresponding amino acid in the corresponding normal individual, indicates that the individual is receiving appropriate treatment. In one embodiment, changing (e.g., increasing or decreasing) level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 or 100% of the amino acids in the amino acid profile consisting of the amino acids in the table above in an individual having AD, relative to the level of the corresponding amino acids in the corresponding normal individual, in the direction of the level of the corresponding amino acids in the corresponding normal individual , indicates that the individual is receiving appropriate treatment.
Авторы изобретения обнаружили, что уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице у индивидуума не соответствует соответствующему уровню аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, что может быть обусловлено болезненным состоянием индивидуума. Когда уровень аминокислоты у индивидуума является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, считают, что произошло повышение регуляции уровня аминокислоты. Когда уровень аминокислоты у индивидуума является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, считают, что произошло снижение регуляции уровня аминокислоты.The inventors have discovered that the level of one or more amino acids in the above table in an individual does not correspond to the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual, which may be due to the disease state of the individual. When the amino acid level in an individual is lower than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual, upregulation of the amino acid level is considered to have occurred. When an individual's amino acid level is higher than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual, downregulation of the amino acid level is considered to have occurred.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, в то время как уровень другой одной или нескольких аминокислот является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. Повышение регуляции или снижение регуляции может зависеть, например, от подлежащего регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.In some embodiments, the level of one or more amino acids in the table above is lower than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of one or more amino acids in the table above is higher than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of one or more amino acids in the table above is lower than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual, while the level of another one or more amino acids is higher than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual. Increased regulation or decreased regulation may depend, for example, on the object being regulated, the type of indicator, the method of measurement, etc.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина является более низким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина является более низким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более низкими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the level of glutamine is lower than the corresponding level of this amino acid in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of methionine is lower than the corresponding level of this amino acid in a corresponding normal individual. In some embodiments, the levels of both glutamine and methionine are lower than the corresponding levels of these amino acids in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более высокими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the level of glutamine is higher than the corresponding level of this amino acid in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of methionine is higher than the corresponding level of this amino acid in a corresponding normal individual. In some embodiments, the levels of both glutamine and methionine are higher than the corresponding levels of these amino acids in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной, двух, трех, четырех или пяти из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина и/или изолейцина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the level of one, two, three, four, or five of phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine, and acetylornithine is higher than the corresponding level of these amino acids in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of phenylalanine and/or isoleucine is higher than the corresponding level of these amino acids in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of phenylalanine is higher than the corresponding level of this amino acid in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более низкими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, в то время как уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the levels of both glutamine and methionine are lower than the corresponding levels of these amino acids in a corresponding normal individual, while the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-amino adipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glycine, histidine, hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonin, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine is higher than the corresponding level of these amino acids in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, метионина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-amino adipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine , hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonin, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine is higher than the corresponding level of these amino acids in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы повышается, в то время как уровень другой одной или нескольких аминокислот снижается. В некоторых случаях повышение или снижение уровня может зависеть, например, под подвергаемого регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.In some embodiments, the level of one or more amino acids from the table above is increased. In some embodiments, the level of one or more amino acids from the table above is reduced. In some embodiments, the level of one or more amino acids from the table above is increased while the level of another one or more amino acids is decreased. In some cases, an increase or decrease in the level may depend, for example, on the object being regulated, the type of indicator, the method of measurement, etc.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина повышается.In some embodiments, glutamine levels are increased. In some embodiments, the methionine level is increased. In some embodiments, both glutamine and methionine levels are increased.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина, снижается.In some embodiments, glutamine levels are reduced. In some embodiments, the methionine level is reduced. In some embodiments, both glutamine and methionine levels are reduced.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной, двух, трех, четырех или пяти из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина и/или изолейцина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина снижается.In some embodiments, the level of one, two, three, four, or five of phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine, and acetylornithine is reduced. In some embodiments, the level of phenylalanine and/or isoleucine is reduced. In some embodiments, the level of phenylalanine is reduced.
В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина, повышается, в то время как уровень одного или нескольких их 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина снижается.In some embodiments, the level of both glutamine and methionine is increased, while the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-amino adipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glycine, histidine, hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonin, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine decreases.
В некоторых вариантах осуществления уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, метионина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина снижается. Автор изобретения обнаружил, что иммунные клетки, такие как наивные T-клетки или недифференцированные T-клетки, захватывают аминокислоты (как иллюстрируется фенилаланином и изолейцином) в некоторых случаях, и, например, дифференцируются в определенные типы T-клеток, такие как Th1-клетки, посредством определенных переносчиков, таких как SLC7A5 в качестве примера. Авторы изобретения обнаружил, что предотвращение дифференцировки в Th1-клеки, которое приводит к состоянию доминирования Th1, различными способами может лечить обусловленные доминированием Th1 заболевания. Такие меры включают, но не ограничиваются ими, снижение уровня соответствующих аминокислот, предупреждение захвата иммунными клетками соответствующих аминокислот и т.п.In some embodiments, the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-amino adipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine , hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonin, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine are reduced. The inventor has discovered that immune cells, such as naïve T cells or undifferentiated T cells, take up amino acids (as exemplified by phenylalanine and isoleucine) in some cases, and, for example, differentiate into certain types of T cells, such as Th1 cells , through certain transporters such as SLC7A5 as an example. The inventors have discovered that preventing differentiation into Th1 cells, which leads to a state of Th1 dominance, can treat Th1 dominance diseases in various ways. Such measures include, but are not limited to, reducing the level of the corresponding amino acids, preventing the uptake of the corresponding amino acids by immune cells, and the like.
SLC7A5 называют переносчиком 1 аминокислот L-типа (LAT1), и он принадлежит суперсемейству APC. Он образует гетеродимерный переносчик аминокислот, который взаимодействует с гликопротеином CD98 (SLC3A2), через консервативные дисульфидные связи. CD98 (4F2hc, SLC3A2) является гликопротеином типа II, который выступает в качестве белка-шаперона для LAT1, стабилизирующего и способствующего его перемещению на плазматическую мембрану. Этот комплекс отвечает за захват незаменимых аминокислот в ключевых областях организма, таких как плацента и гематоэнцефалический барьер. Субстрат включает серию крупных нейтральных аминокислот, таких как тирозин, лейцин, изолейцин, валин и фенилаланин, а также лекарственных средств, включающих L-DOPA и габапентин.SLC7A5 is called L-type amino acid transporter 1 (LAT1) and belongs to the APC superfamily. It forms a heterodimeric amino acid transporter that interacts with the CD98 glycoprotein (SLC3A2) through conserved disulfide bonds. CD98 (4F2hc, SLC3A2) is a type II glycoprotein that acts as a chaperone protein for LAT1, stabilizing and promoting its translocation to the plasma membrane. This complex is responsible for capturing essential amino acids in key areas of the body such as the placenta and blood-brain barrier. The substrate includes a series of large neutral amino acids such as tyrosine, leucine, isoleucine, valine and phenylalanine, as well as drugs including L-DOPA and gabapentin.
Различные агенты (такие как ферменты) можно использовать для деградации аминокислот для снижения уровня соответствующих аминокислот, тем самым уменьшая дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки. Ферменты, представленные в таблице ниже, можно использовать для деградации соответствующих аминокислот, таких как фенилаланин и изолейцин. Представленные ферменты можно доставлять в соответствующие области у индивидуума различными способами, например, в кишечник или периферический кровоток (такой как периферическая кровь), для деградации аминокислот. Например, фермент можно доставлять в соответствующую область путем доставки микроорганизма (например, Escherichia coli), экспрессирующего фермент, в соответствующую область для экспрессии фермента в соответствующей области. Микроорганизм может экспрессировать один или несколько из указанных ферментов. Специалистам в данной понятно, что для доставки фермента может использоваться любой микроорганизм, который может быть доставлен в соответствующую область различными путями (например, пероральный) без утраты способности экспрессировать фермент в соответствующей области. Например, Escherichia coli, модифицированные способами инженерии для экспрессии фермента для деградации фенилаланина, использовали в качестве деградирующей фенилаланин бактерии, которую перорально вводили мышам для снижения содержания фенилаланина у мышей (как показано путем определения содержания фенилаланина в фекалиях) и снижения доли Th1-клеток (как показано путем детекции доли Th1-клеток в периферической крови).Various agents (such as enzymes) can be used to degrade amino acids to reduce the levels of the corresponding amino acids, thereby reducing the differentiation of naïve T cells into Th1 cells. The enzymes presented in the table below can be used to degrade corresponding amino acids such as phenylalanine and isoleucine. The present enzymes can be delivered to appropriate areas in an individual by various means, such as the intestine or the peripheral circulation (such as peripheral blood), to degrade amino acids. For example, the enzyme can be delivered to the appropriate area by delivering a microorganism (eg, Escherichia coli ) expressing the enzyme to the appropriate area to express the enzyme in the appropriate area. The microorganism may express one or more of these enzymes. Those skilled in the art will understand that any microorganism can be used to deliver the enzyme and can be delivered to the appropriate area by various routes (eg, oral) without losing the ability to express the enzyme in the appropriate area. For example, Escherichia coli engineered to express an enzyme to degrade phenylalanine was used as a phenylalanine-degrading bacterium that was orally administered to mice to reduce phenylalanine levels in mice (as demonstrated by fecal phenylalanine testing) and reduce the proportion of Th1 cells (as indicated by detecting the proportion of Th1 cells in peripheral blood).
Ферменты, которые могут быть использованы для деградации фенилаланинаEnzymes that can be used to degrade phenylalanine
Ферменты, которые можно использовать для деградации изолейцинаEnzymes that can be used to degrade isoleucine
Ингибиторы переносчиков можно использовать для предотвращения захвата иммунными клетками соответствующих аминокислот посредством ингибирования захвата наивными T-клетками соответствующей аминокислоты путем ингибирования переносчика (например, общий переносчик SLC7A5 для фенилаланина и изолейцина), тем самым снижая дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки. Ингибиторы, которые могут использоваться для ингибирования переносчика SLC7A5, включают, но не ограничиваются ими, JPH 203, BCH и KMH-233, известные в данной области. Например, как показано в примере 4, введение ингибитора SLC7A5 JPH 203 мышам значительно снижает долю Th1-клеток в головном мозге мыши.Transporter inhibitors can be used to prevent immune cell uptake of the corresponding amino acids by inhibiting the uptake of naïve T cells by inhibiting the transporter (eg, the common transporter SLC7A5 for phenylalanine and isoleucine), thereby reducing the differentiation of naïve T cells into Th1 cells. Inhibitors that can be used to inhibit the SLC7A5 transporter include, but are not limited to, JPH 203, BCH and KMH-233, known in the art. For example, as shown in Example 4, administration of the SLC7A5 inhibitor JPH 203 to mice significantly reduced the proportion of Th1 cells in the mouse brain.
JPH203 представляет собой химически синтезированное низкомолекулярное соединение, доступное от J-Pharma of Japan (http://www.j-pharma.com/b3_e.html), которое селективно ингибирует LAT1, с номером CAS 1037592-40-7 (https: //www.medkoo.com/products/9544).JPH203 is a chemically synthesized small molecule compound available from J-Pharma of Japan (http://www.j-pharma.com/b3_e.html) that selectively inhibits LAT1, with CAS number 1037592-40-7 (https:/ /www.medkoo.com/products/9544).
BCH представляет собой известный ингибитор LAT1 с номером CAS 20448-79-7 (https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027).BCH is a known LAT1 inhibitor with CAS number 20448-79-7 (https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027).
KMH-233 представляет собой известный ингибитор LAT1 с номером CAS 1941174-13-5 (https://www.medkoo.com/products/9545).KMH-233 is a known LAT1 inhibitor with CAS number 1941174-13-5 (https://www.medkoo.com/products/9545).
Специалистам в данной области понятно, что способы, которые можно использовать для предотвращения дифференцировки наивных T-клеток в Th1-клетки, не ограничиваются этим. Любые способы, которые могут использоваться для предотвращения влияния кишечных микробов и/или их метаболитов на дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки, можно использовать для снижения доли Th1, и облегчения или обращения вспять Th1-доминантного состояния, как описано в настоящем описании.Those skilled in the art will appreciate that the methods that can be used to prevent naïve T cells from differentiating into Th1 cells are not limited to this. Any methods that can be used to prevent the influence of gut microbes and/or their metabolites on the differentiation of naive T cells into Th1 cells can be used to reduce the proportion of Th1, and alleviate or reverse the Th1 dominant state, as described herein.
Авторы изобретения обнаружили, что различные цитокины вовлечены в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых цитокинов изменялись и после введения, например, OM1, уровни этих цитокинов восстанавливались до уровней у мышей WT. Такие цитокины составляют профиль цитокинов. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей.The inventors have discovered that various cytokines are involved in the brain-gut axis in accordance with the present invention. As shown in the examples, between WT mice and TG mice the levels of some cytokines changed and after administration, for example, OM1, the levels of these cytokines were restored to the levels in WT mice. Such cytokines constitute the cytokine profile. As mentioned earlier, such a profile can be used for diagnostic and/or therapeutic purposes.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31) цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума относительно уровня соответствующего цитокина у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% цитокинов в профиле цитокинов, состоящем из цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума относительно уровня соответствующего цитокина у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD.In some embodiments, changing (e.g., increasing or decreasing) the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 or 31) cytokines selected from the following: OPG, resistin, TARC, VEGF, chemerin, IL -9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, granzyme B, LIX, CT-1, CD27L, endoglin , TRANCE, MCSF, 4-1BB, leptin R, CD36,
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31) цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума с AD до уровня соответствующих цитокинов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих цитокинов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% цитокинов в профиле кишечных микробов, состоящем из цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение.In some embodiments, changing (e.g., increasing or decreasing) the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 or 31) cytokines selected from the following: OPG, resistin, TARC, VEGF, chemerin, IL -9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, granzyme B, LIX, CT-1, CD27L, endoglin , TRANCE, MCSF, 4-1BB, leptin R, CD36,
Настоящее изобретение относится к композиции, которая может прямо или непрямо изменять относительное содержание кишечных микробов до заданного уровня (такого как терапевтический уровень) в течение заданного периода времени (например, до применения следующей дозы). Заданный уровень может быть получен путем измерения относительного содержания микробиоты, которое привело к терапевтическому ответу (например, снижение уровней метаболитов, снижение инфильтрации лимфоцитов в головной мозг, снижение активации микроглии, снижение нейровоспаления, улучшение познавательных способностей, облегчение симптомов болезни Альцгеймера).The present invention provides a composition that can directly or indirectly change the relative abundance of intestinal microbes to a predetermined level (such as a therapeutic level) for a predetermined period of time (eg, until the next dose). The target level can be obtained by measuring the relative abundance of the microbiota that resulted in a therapeutic response (eg, reduction in metabolite levels, reduction in lymphocyte infiltration into the brain, reduction in microglial activation, reduction in neuroinflammation, improvement in cognition, improvement in Alzheimer's disease symptoms).
В некоторых вариантах осуществления способа, средство или композиция по настоящему изобретению могут содержать достаточно очищенные или обогащенные кишечные микробы, так что средство или композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 5 масс.%, 10 масс.%, 20 масс.%, 30 масс.%, 40 масс.%, 50 масс.%, 60 масс.%, 70 масс.%, 80 масс.%, 85 масс.%, 90 масс.%, 95 масс.%, 99 масс.% или более желаемых кишечных микробов в расчете на массу средства или композиции, и/или менее чем приблизительно 40 масс.%, 30 масс.%, 20 масс.%, 15 масс.%, 14 масс.%, 13 масс.%, 12 масс.%, 11 масс.%, 10 масс.%, 9 масс.%, 8 масс.%, 7 масс.%, 6 масс.%, 5 масс.%, 4 масс.%, 3 масс.%, 2 масс.%, 1 масс.% или менее нежелательных кишечных микробов в расчете на массу средства или композиции.In some embodiments of the method, the agent or composition of the present invention may contain sufficiently purified or enriched intestinal microbes such that the agent or composition may contain at least about 5 wt.%, 10 wt.%, 20 wt.%, 30 wt. %, 40 wt%, 50 wt%, 60 wt%, 70 wt%, 80 wt%, 85 wt%, 90 wt%, 95 wt%, 99 wt% or more of desired intestinal microbes based on the weight of the product or composition, and/or less than about 40 wt.%, 30 wt.%, 20 wt.%, 15 wt.%, 14 wt.%, 13 wt.%, 12 wt.%, 11 wt.%, 10 wt.%, 9 wt.%, 8 wt.%, 7 wt.%, 6 wt.%, 5 wt.%, 4 wt.%, 3 wt.%, 2 wt.%, 1 wt.% or less of unwanted intestinal microbes based on the weight of the product or composition.
Средства и композиции, которые регулируют относительное содержание кишечных микробов в соответствии с настоящим изобретением, могут приводить к изменению метаболических функций. Например, измененная метаболическая функция может включать регуляцию уровня аминокислот среди микробных метаболитов.Agents and compositions that regulate the relative content of intestinal microbes in accordance with the present invention may lead to changes in metabolic functions. For example, altered metabolic function may involve regulation of amino acid levels among microbial metabolites.
В некоторых вариантах осуществления при проведении детекции в образце периферической крови индивидуума, способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут регулировать уровень аминокислот приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 мкМ или более, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними; и/или делать уровень аминокислот близким к или достигать соответствующего уровня аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, when performing detection in a peripheral blood sample of an individual, the methods, tools and compositions of the present invention can adjust the amino acid level by approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 , 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185 . or by the range defined by the end points of the above values, or by any value in between; and/or make the amino acid level close to or achieve the corresponding amino acid level in a suitable normal individual.
В некоторых вариантах осуществления при проведении детекции в образце фекалий индивидуума, способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут регулировать уровень аминокислот приблизительно на 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 мкмоль/г мкМ или более, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними; и/или делать уровень аминокислот близким к или достигать соответствующего уровня аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, when performing detection in a fecal sample of an individual, the methods, tools and compositions of the present invention can adjust the amino acid level by approximately 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 µmol/g µM or more, or a range determined end points from the above values, or any amount in between; and/or make the amino acid level close to or achieve the corresponding amino acid level in a suitable normal individual.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут вызывать измененную инфильтрацию иммунными клетками головного мозга. Например, доля провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток снижается. В некоторых вариантах осуществления средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать долю провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток в образце индивидуума приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делать долю провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток близкой или достигающей доли соответствующих провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the present invention can cause altered immune cell infiltration in the brain. For example, the proportion of proinflammatory Th1 cells among CD4+ T cells decreases. In some embodiments, the agents and compositions of the present invention can reduce the proportion of pro-inflammatory Th1 cells relative to CD4+ T cells in an individual's sample by approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; and/or make the proportion of proinflammatory Th1 cells relative to CD4+ T cells similar to or equal to the proportion of the corresponding proinflammatory Th1 cells relative to CD4+ T cells in the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать относительный захват аминокислот наивными T-клетками. В некоторых вариантах осуществления средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать относительный захват аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делать относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким или достигающим относительный уровень захвата аминокислот соответствующими наивными T-клетками у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the present invention can reduce the relative uptake of amino acids by naïve T cells. In some embodiments, the agents and compositions of the present invention can reduce the relative amino acid uptake of naïve T cells by approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 , 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 or more; and/or making the relative amino acid uptake level of naïve T cells similar to or equal to the relative amino acid uptake level of the corresponding naïve T cells in the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут приводить к измененной активации микроглии в головном мозге. Например, измененная активация микроглии в головном мозге может включать повышение или снижение активации микроглии в головном мозге. Активация микроглии в головном мозге может повышаться или снижаться приблизительно на 1-100%, например, приблизительно на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% или 100%, или на любой диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними например, на от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или приблизительно на 7%, 14%, 21%, 28% и т.п.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the present invention may result in altered activation of microglia in the brain. For example, altered microglial activation in the brain may involve increased or decreased microglial activation in the brain. Microglial activation in the brain may be increased or decreased by approximately 1-100%, e.g., approximately 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% or 100%, or any range, defined by endpoints of the above values, or any amount in between, for example, by about 7% to about 28%, etc., or by about 7%, 14%, 21%, 28%, and the like.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по изобретению могут приводить к измененным уровням IBA1. Например, изменение уровня IBA1 может включать повышение или снижение уровня IBA1. Уровень IBA1 может быть повышен или снижен на от приблизительно 0 до приблизительно 3000 относительных уровней, например, на относительный уровень, составляющий приблизительно 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000 относительных уровней, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними, например, на от приблизительно 500 до приблизительно 3000, или приблизительно на 500, 1000, 1500 и т.п.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the invention may result in altered levels of IBA1. For example, a change in the level of IBA1 may involve increasing or decreasing the level of IBA1. The level of IBA1 may be increased or decreased by about 0 to about 3000 relative levels, for example, by a relative level of about 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 , 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 17 00, 1750, 1800, 1850 , 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2 900, 2950, 3000 relative levels, or by the range defined by the endpoints of the above values, or by any amount between them, for example, by about 500 to about 3000, or by about 500, 1000, 1500, and the like.
СоставыCompositions
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать кишечные микробы, которые могут регулировать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума. Кишечные микробы могут быть жизнеспособными (живыми), покоящимися, неактивными или погибшими бактериями. Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать соединение или средство, которые могут регулировать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума. Для изменения микробиоты у индивидуума можно использовать одно или несколько соединений. Такие соединения или средства могут включать, но не ограничиваться ими, антибиотики и/или антибактериальные средства, пребиотики, такие как компоненты клеточной стенки бактерий, бактериальные нуклеиновые кислоты (такие как ДНК и РНК), компоненты бактериальных мембран и структурные компоненты бактерий (такие как белки, углеводы, липиды и их комбинации, такие как липопротеины, сложные эфиры сахаров и гликопротеины), органические кислоты, неорганические кислоты, щелочи, белки и пептиды, ферменты и коферменты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, сахара, липиды, гликопротеины, липопротеины, сложные эфиры сахаров, витамины, биологически активные соединения, метаболиты, содержащие неорганические компоненты, низкомолекулярные соединения, такие как азотсодержащие молекулы или содержащие сернистую кислоту молекулы, стойкий крахмал, картофельный крахмал или крахмал с высоким содержанием амилозы, модифицированный крахмал (в том числе карбоксилированный крахмал, ацетилированный крахмал, пропионированный крахмал и бутилированный крахмал), не усваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахарид, олигодекстроза, ксилоолигосахарид, галактоолигосахарид, арабиноксилан, арабиногалактан, полисахариды галактоманнана, полидекстроза, олигофруктоза, инулин и их производные, однако другие олигосахариды, другие растворимые волокна и их комбинация, которые могут играть пребиотическую роль, не исключены. Сахар может быть выбран из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов или их производных, их комбинации и/или их производных; предпочтительно олигосахаридов и полисахаридов; более предпочтительно олигосахариды маннуроновой кислоты.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may contain intestinal microbes, which can regulate the relative abundance of intestinal microbes in an individual. Gut microbes can be viable (living), dormant, inactive, or dead bacteria. The agent or pharmaceutical composition of the present invention may contain a compound or agent that can regulate the relative abundance of intestinal microbes in an individual. One or more compounds may be used to alter the microbiota of an individual. Such compounds or agents may include, but are not limited to, antibiotics and/or antibacterial agents, prebiotics such as bacterial cell wall components, bacterial nucleic acids (such as DNA and RNA), bacterial membrane components, and bacterial structural components (such as proteins , carbohydrates, lipids and their combinations, such as lipoproteins, sugar esters and glycoproteins), organic acids, inorganic acids, alkalis, proteins and peptides, enzymes and coenzymes, amino acids and nucleic acids, sugars, lipids, glycoproteins, lipoproteins, esters sugars, vitamins, biologically active compounds, metabolites containing inorganic components, low molecular weight compounds such as nitrogen-containing molecules or sulfurous acid-containing molecules, resistant starch, potato starch or high-amylose starch, modified starch (including carboxylated starch, acetylated starch , propionated starch and butylated starch), non-digestible oligosaccharides such as fructooligosaccharide, oligodextrose, xylooligosaccharide, galactooligosaccharide, arabinoxylan, arabinogalactan, galactomannan polysaccharides, polydextrose, oligofructose, inulin and their derivatives, but other oligosaccharides, other soluble fibers and a combination thereof , which may play a prebiotic role, cannot be excluded. The sugar may be selected from monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides or derivatives thereof, combinations thereof and/or derivatives thereof; preferably oligosaccharides and polysaccharides; more preferably mannuronic acid oligosaccharides.
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также могут включать, например, аминокислоты, аминосахара, спирты сахаров, белки, углеводы, моносахариды, дисахариды, олигосахариды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, буферы, поверхностно-активные вещества, липиды, липосомы, другие эксципиенты и их смеси. Другие пригодные ингредиенты могут включать стероиды, противовоспалительные средства, нестероидные противовоспалительные средства, болеутоляющие средства, клетки, противовоспалительные средства, факторы роста, фрагменты факторов роста, низкомолекулярные стимуляторы заживления ран, гормоны, цитокины, пептиды, антитела, ферменты, выделенные клетки, тромбоциты, иммунодепрессанты, нуклеиновые кислоты, типы клеток, вирусы, вирусные частицы, незаменимые питательные вещества, минералы, металлы или витамины, и их комбинацию. Кроме того, средства и композиции по настоящему изобретению могут включать разбавители, такие как вода, солевой раствор или буфер.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may also include, for example, amino acids, amino sugars, sugar alcohols, proteins, carbohydrates, monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, nucleic acids, buffers, surfactants, lipids, liposomes, other excipients and their mixtures. Other suitable ingredients may include steroids, anti-inflammatory agents, non-steroidal anti-inflammatory drugs, analgesics, cells, anti-inflammatory agents, growth factors, growth factor fragments, small molecule wound healing promoters, hormones, cytokines, peptides, antibodies, enzymes, isolated cells, platelets, immunosuppressants , nucleic acids, cell types, viruses, viral particles, essential nutrients, minerals, metals or vitamins, and a combination thereof. In addition, the agents and compositions of the present invention may include diluents such as water, saline or buffer.
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены в качестве фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все физиологически совместимые растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для доставки индивидууму. Фармацевтическая композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из следующих: вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, глюкоза, глицерин, этанол и т.д., и их комбинацию. Во многих случаях предпочтительно включать в композиции обеспечивающие изотоничность средства, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, a "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all physiologically compatible solvents, dispersants, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonicity and absorption retardants, and the like. In one embodiment, an agent or pharmaceutical composition of the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for delivery to an individual. The pharmaceutical composition may also include a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, a "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all physiologically compatible solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonicity and absorption retardants, and the like. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include one or more of the following: water, saline, phosphate-buffered saline, glucose, glycerol, ethanol, etc., and combinations thereof. In many cases, it is preferable to include isotonic agents such as sugars, polyhydric alcohols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride in the compositions.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые формы препарата, такие как жидкие растворы (такие как инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы, суппозитории и другие составы. Фармацевтическая композиция может быть составлена для высокой концентрации лекарственного средства. Фармацевтическая композиция, кроме того, может быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения. Стерильные инъекционные растворы можно получать путем включения в них одного из ингредиентов, перечисленных выше, или их комбинации (при необходимости) в подходящем растворителе в требуемом количестве с последующей фильтрацией и стерилизацией.The pharmaceutical composition can be formulated in various forms. These include, for example, liquid, semi-solid and solid forms of the drug, such as liquid solutions (such as injections and infusions), dispersions or suspensions, tablets, pills, powders, liposomes, suppositories and other formulations. The pharmaceutical composition can be formulated to provide a high concentration of drug. The pharmaceutical composition may further be sterile and stable under conditions of manufacture and storage. Sterile injection solutions can be prepared by incorporating one of the ingredients listed above, or a combination thereof (if necessary), in a suitable solvent in the required quantity, followed by filtration and sterilization.
Иллюстративная форма фармацевтической композиции может зависеть от предполагаемого способа доставки и терапевтического применения. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию составляют для пероральной доставки. Некоторые композиции могут быть в форме доставки на основе пилюль (как описано в патентной заявке США № 12/976648 под названием "pill catchers", поданной 22 октября 2010 года) и иметь пролонгированное высвобождение. В одном варианте осуществления доставка на основе пилюль может быть частью системы, которая позволяет доставку в конкретное положение в кишечном тракте. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена в качестве состава с замедленным высвобождением. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть заключена в покрытие, которое не начинает деградировать до тех пор, пока не покинет желудок. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть получена с носителем, который защищает композицию от быстрого высвобождения, например, в случае состава с замедленным или контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Для многих способов получения таких составов были выданы права на патент, или они хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. "Замедленное высвобождение" относится к высвобождению композиции или ее активного соединения на протяжении пролонгированного периода времени относительно высвобождения, достигаемого посредством доставки общепринятого состава композиции.The exemplary form of the pharmaceutical composition may depend on the intended mode of delivery and therapeutic use. In one embodiment, the pharmaceutical composition is formulated for oral delivery. Some compositions may be in the form of pill-based delivery (as described in US patent application No. 12/976648 entitled "pill catchers", filed October 22, 2010) and have a sustained release. In one embodiment, pill-based delivery may be part of a system that allows delivery to a specific location in the intestinal tract. In another embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated as a sustained release formulation. In another embodiment, the pharmaceutical composition may be enclosed in a coating that does not begin to degrade until it leaves the stomach. In another embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated with a carrier that protects the composition from immediate release, such as in the case of sustained or controlled release formulations, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid can be used. Many methods for preparing such compositions have been patented or are well known to those skilled in the art. See, for example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. "Sustained release" refers to the release of a composition or active compound thereof over a prolonged period of time relative to the release achieved by delivery of a conventional composition formulation.
Другой тип фармацевтической композиции включает активируемую форму, как например, составление композиции с микробиотой в покоящемся или неактивном состоянии (например, в лиофилизированном состоянии). В комбинированной композиции микробиота может присутствовать в покоящемся или неактивном состоянии, или соединение или агент, в котором культивируется микробиота, может быть неактивным. В одном иллюстративном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена так, чтобы включать по меньшей мере один тип покоящейся или неактивной микробиоты и неактивное соединение или вещество, которое культивирует микробиоту.Another type of pharmaceutical composition includes an activated form, such as formulation with microbiota in a dormant or inactive state (eg, in a lyophilized state). In the combination composition, the microbiota may be present in a dormant or inactive state, or the compound or agent in which the microbiota is cultured may be inactive. In one illustrative embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated to include at least one type of dormant or inactive microbiota and an inactive compound or substance that cultivates the microbiota.
Описанные фармацевтические композиции и комбинированные фармацевтические композиции также могут быть составлены в форме продуктов питания, напитков, пищевых добавок и/или дополнительных веществ. Такие композиции представляют собой композиции, пригодные для употребления человеком и/или животным. Специалистам в данной области могут быть хорошо известны конкретные составы микробиоты, которые могут использоваться в пероральных или принимаемых внутрь составах, и они считаются пригодными для введения человеку и/или животному. Множество композиций используется для производства пищи или пищевых добавок/дополнительных веществ; таким образом, другим важным аспектом является предоставление человеку или животному продуктов питания или пищевых добавок/дополнительных веществ, включающих микробиоту, для регуляции кишечных микробов у индивидуума.The described pharmaceutical compositions and combination pharmaceutical compositions may also be formulated in the form of foods, beverages, dietary supplements and/or additional substances. Such compositions are compositions suitable for human and/or animal consumption. Those skilled in the art may be well aware of specific microbiota compositions that can be used in oral or ingestible formulations and are considered suitable for administration to humans and/or animals. Many compositions are used for the production of food or food additives/additional substances; Thus, another important aspect is to provide food or nutritional supplements/supplements including microbiota to a person or animal to regulate the gut microbes of the individual.
Пригодная для употребления композиция может быть составлена так, чтобы она включала подсластители, стабилизаторы или связующие вещества, увлажнители и/или натуральные и/или искусственные вкусовые добавки. Композиция также может включать натуральные и/или искусственные красители и консерванты. В одном варианте осуществления композиция может включать моносахариды, дисахариды и полисахариды, такие как, но не ограничиваясь ими, сахароза (сахар), декстроза, мальтоза, декстрин, ксилоза, рибоза, глюкоза, манноза, галактоза, сукромальт, фруктоза (левоза), инвертированный сахар, кукурузный сироп, мальтодекстрин, олигофруктозный сироп, частично гидролизованный крахмал, сухая кукурузная патока, полидекстроза, растворимое волокно, нерастворимое волокно, натуральный сок сахарного тростника, желатин, лимонная кислота, молочная кислота, натуральные красители, натуральные вкусовые добавки, фракционированное кокосовое масло, карнаубский воск или их комбинация.The usable composition may be formulated to include sweeteners, stabilizers or binders, humectants, and/or natural and/or artificial flavors. The composition may also include natural and/or artificial colors and preservatives. In one embodiment, the composition may include monosaccharides, disaccharides and polysaccharides such as, but not limited to, sucrose (sugar), dextrose, maltose, dextrin, xylose, ribose, glucose, mannose, galactose, sucromalt, fructose (levose), invert sugar, corn syrup, maltodextrin, oligofructose syrup, partially hydrolyzed starch, corn syrup powder, polydextrose, soluble fiber, insoluble fiber, natural sugar cane juice, gelatin, citric acid, lactic acid, natural colors, natural flavors, fractionated coconut oil, carnauba wax or a combination of both.
ДозировкаDosage
Средство или композиция по настоящему изобретению может содержать "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" ингредиентов. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического результата в требуемой дозе и в течение некоторого периода времени. Терапевтически эффективное количество средства или фармацевтической композиции может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как болезненное состояние индивидуума, возраст, пол и состояние головного мозга, и способность композиции вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, в котором терапевтически благоприятные эффекты средства или фармацевтической композиции превышают токсические или вредоносные эффекты средства или фармацевтической композиции. В иллюстративном варианте осуществления терапевтически эффективное количество средства или фармацевтической композиции представляет собой количество, в котором относительное содержание одного или нескольких кишечных микробов возрастает. Например, терапевтически эффективное количество средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов повышает относительное содержание одного или нескольких кишечных микробов у индивидуума.The agent or composition of the present invention may contain a "therapeutically effective amount" or "effective amount" of ingredients. "Therapeutically effective amount" refers to an amount that is effective to achieve the desired therapeutic result at the required dose and over a period of time. The therapeutically effective amount of the agent or pharmaceutical composition may vary depending on various factors, such as the disease state of the individual, age, sex and brain condition, and the ability of the composition to produce the desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also an amount in which the therapeutically beneficial effects of the agent or pharmaceutical composition exceed the toxic or harmful effects of the agent or pharmaceutical composition. In an illustrative embodiment, a therapeutically effective amount of an agent or pharmaceutical composition is an amount in which the relative abundance of one or more gut microbes increases. For example, a therapeutically effective amount of an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes increases the relative abundance of one or more intestinal microbes in an individual.
Как используют в рамках изобретения, термин "лечение", главным образом, относится к достижению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения заболевания или его симптомов; и/или он может быть терапевтическим с точки зрения частичной или полной стабилизации или лечения заболевания и/или побочных эффектов заболевания. "Лечение", как используют в рамках изобретения, охватывает любое лечение заболевания пациента, включая: (a) предупреждение заболеваний или симптомов, которые возникают у пациентов, которые являются предрасположенными к заболеваниям или симптомам, но у которых еще не диагностировано заболевание; (b) ингибирование симптомов заболевания, например, ингибирование прогрессирования заболевания и предупреждение развития заболевания; или (c) облегчение симптомов заболевания, т.е. обеспечение угасания заболевания или симптомов.As used herein, the term "treatment" generally refers to achieving the desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of complete or partial prevention of the disease or its symptoms; and/or it may be therapeutic in terms of partial or complete stabilization or treatment of the disease and/or side effects of the disease. "Treatment" as used herein includes any treatment of a patient's disease, including: (a) prevention of diseases or symptoms that occur in patients who are predisposed to the diseases or symptoms but who have not yet been diagnosed with the disease; (b) inhibiting symptoms of a disease, eg, inhibiting the progression of a disease and preventing the development of a disease; or (c) relief of symptoms of the disease, i.e. ensuring the extinction of the disease or symptoms.
ПоказанияIndications
Путем исследования в рамках настоящего изобретения авторы изобретения обнаружили, что аномальный кишечный микробный паттерн вызывал сверхдифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки, и уровень Th1-клеток в периферической крови возрастал аномальным образом. Повышенные уровни периферических Th1-клеток вызывают инфильтрацию большего количества Th1-клеток в головной мозг, вызывая заболевания, такие как болезнь Альцгеймера. Путем восстановления кишечной микробиоты, дифференцировка наивных T-клеток в Th1-клетки может быть снижена, и аномально повышенный уровень Th1-клеток в периферической крови может быть снижен, тем самым осуществляя лечение заболевания. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с высокими уровнями Th1-клеток в периферической крови у индивидуума, причем способ включает регуляцию относительного содержания кишечных микробов у индивидуума, как описано в настоящем описании, снижение уровня аминокислот в периферической крови, как описано в настоящем описании, или ингибирование захвата наивными T-клетками аминокислоты в периферической крови, как описано в настоящем описании.Through research within the scope of the present invention, the inventors discovered that the abnormal intestinal microbial pattern caused naïve T cells to overdifferentiate into Th1 cells, and the level of Th1 cells in the peripheral blood increased in an abnormal manner. Increased levels of peripheral Th1 cells cause more Th1 cells to infiltrate into the brain, causing diseases such as Alzheimer's disease. By restoring the intestinal microbiota, the differentiation of naive T cells into Th1 cells can be reduced, and the abnormally elevated level of Th1 cells in the peripheral blood can be reduced, thereby treating the disease. Thus, the present invention provides a method for treating diseases associated with high levels of Th1 cells in the peripheral blood of an individual, the method comprising regulating the relative abundance of gut microbes in the individual, as described herein, reducing the level of amino acids in the peripheral blood, as described herein, or inhibiting the uptake of naïve T cells of an amino acid in peripheral blood, as described herein.
Термины "доминантность Th1" и "доминантность клеток Th1" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. В некоторых случаях, доминантность Th1 может быть представлена высокими уровнями Th1-клеток в периферической крови. Высокий уровень Th1-клеток в периферической крови может относиться к уровню Th1-клеток в периферической крови индивидуума, на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% или превышающему уровень у подходящего контроля (например, нормальный контроль, такой как выборка здоровых людей), или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними, например, на от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или на приблизительно 7%, 14%, 21%, 28% и т.п. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, рассеянный склероз, болезнь Крона, диабет 1 типа, ревматоидный артрит, тиреоидит Хашимото, витилиго, синдром Шегрена, поликистоз яичника (PCOS), целиакию и болезнь Грэйвса.The terms “Th1 dominance” and “Th1 cell dominance” are used interchangeably herein. In some cases, Th1 dominance may be represented by high levels of Th1 cells in the peripheral blood. High level of Th1 cells in peripheral blood may refer to the level of Th1 cells in an individual's peripheral blood, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% , 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250 %, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% or higher a suitable control (for example, a normal control, such as a sample of healthy people), or by a range defined by the end points of the above values, or by any value in between, for example, from about 7% to about 28%, etc. or by approximately 7%, 14%, 21%, 28%, etc. Such diseases include, but are not limited to, multiple sclerosis, Crohn's disease,
Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к любому живому организму, включая, но не ограничиваясь ими, людей, не являющихся человеком приматов, таких как шимпанзе и другие человекообразные обезьяны и мартышки, сельскохозяйственных животных, таких как коровы, овцы, свиньи, козы и лошади, домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки, лабораторные животные, включая грызунов, таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.п. Термин не указывает на конкретный возраст и пол. В одном варианте осуществления индивидуумом является человек. В контексте настоящего изобретения термины "субъект", "индивидуум" и "пациент" используются взаимозаменяемо.As used herein, the term "individual" refers to any living organism, including, but not limited to, humans, non-human primates such as chimpanzees and other apes and monkeys, farm animals such as cows, sheep, pigs , goats and horses, domestic mammals such as dogs and cats, laboratory animals including rodents such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, etc. The term does not indicate a specific age or gender. In one embodiment, the individual is a human. In the context of the present invention, the terms "subject", "individual" and "patient" are used interchangeably.
В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума превышает их относительное содержание у здорового индивидуума. В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума является более низким, чем у здорового индивидуума. В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума превышает их относительно содержание у здорового индивидуума, и относительное содержание другого одного или нескольких микроорганизмов является более низким, чем у здорового индивидуума.In one embodiment, the relative abundance of one or more intestinal microorganisms in an individual exceeds their relative abundance in a healthy individual. In one embodiment, the relative abundance of one or more intestinal microorganisms in an individual is lower than that of a healthy individual. In one embodiment, the relative abundance of one or more intestinal microorganisms in an individual is greater than that of a healthy individual, and the relative abundance of the other one or more microorganisms is lower than that of a healthy individual.
Дозировка может зависеть от типа микробиоты, присутствующей в средстве или фармацевтической композиции по изобретению. Дозировка также может быть определена на основе относительного содержания одного или нескольких типов микробиоты, присутствующих у индивидуума.The dosage may depend on the type of microbiota present in the agent or pharmaceutical composition of the invention. Dosage may also be determined based on the relative abundance of one or more types of microbiota present in an individual.
В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может эффективно изменять относительное содержание одного или нескольких типов микробиоты. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция может эффективно повышать или снижать относительное содержание микробиоты у индивидуума. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция может повышать или снижать относительное содержание конкретных микроорганизмов микробиоты у индивидуума и снижать относительное содержание других конкретных микроорганизмов микробиоты у индивидуума.In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention can effectively change the relative abundance of one or more types of microbiota. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition can effectively increase or decrease the relative abundance of the microbiota in an individual. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition may increase or decrease the relative abundance of specific microbiota microorganisms in an individual and decrease the relative abundance of other specific microbiota microorganisms in an individual.
В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может эффективно изменять микробиоту у индивидуума, так что после введения средства или фармацевтической композиции микробиота у индивидуума имитирует микробиоту, присутствующую у индивидуума, отвечающего на процесс лечения болезни Альцгеймера. Средство или фармацевтическая композиция может эффективно изменять микробиоту для имитации микробиоты у нормальных и здоровых индивидуумов со сходным состоянием головного мозга, возрастом, полом, расой и т.п.In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention can also effectively alter the microbiota in an individual such that, upon administration of the agent or pharmaceutical composition, the microbiota in the individual mimics the microbiota present in the individual responding to treatment for Alzheimer's disease. The agent or pharmaceutical composition can effectively modify the microbiota to mimic the microbiota of normal and healthy individuals with similar brain conditions, age, gender, race, and the like.
Режим дозирования можно корректировать для обеспечения наиболее подходящего желаемого ответа (такого как терапевтический ответ или профилактический ответ). Например, можно доставлять однократный болюс, можно доставлять множество разделенных доз с течением времени или дозу можно снижать или повышать пропорционально необходимости ситуации лечения. Особенно преимущественным является составление парентеральных композиций в виде единичной дозированной формы для облегчения доставки и единообразия дозировок. Единичная дозированная форма, как используют в рамках изобретения, относится к физически дискретной единице, пригодной в качестве однократной дозы для млекопитающего, подвергаемого лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное для достижения желаемого терапевтического эффекта, в комбинации с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики единичной дозированной формы, используемой в рамках настоящего изобретения, определяются или прямо зависят от следующих: (a) уникальные свойства активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, подлежащего достижению; и (b) ограничения, присущие области комбинирования этого активного соединения для индивидуальной терапии.The dosage regimen may be adjusted to provide the most appropriate desired response (such as a therapeutic response or a prophylactic response). For example, a single bolus may be delivered, multiple divided doses may be delivered over time, or the dose may be decreased or increased in proportion to the need of the treatment situation. It is particularly advantageous to formulate parenteral compositions in unit dosage form for ease of delivery and uniformity of dosage. Unit dosage form, as used herein, refers to a physically discrete unit suitable as a single dose for a mammal being treated; each unit contains a predetermined amount of active compound, calculated to achieve the desired therapeutic effect, in combination with the desired pharmaceutical carrier. The characteristics of the unit dosage form used in the present invention are determined by or directly dependent on the following: (a) the unique properties of the active compound and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved; and (b) the limitations inherent in the field of combining this active compound for individual therapy.
При применении для способов, предусматриваемых в рамках настоящего изобретения, иллюстративный диапазон дозировок для средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может составлять от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг/кг массы тела в сутки, как например, от приблизительно 0,05 до приблизительно 10 мг/кг массы тела в сутки, доставляемые за одну или несколько доз, например, 1-3 дозы. Точная дозировка зависит от частоты и способа доставки, пола, возраста, массы тела и общего состояния индивидуума, подвергаемого лечения, природы и тяжести состояния, подвергаемого лечению, любых сопутствующих заболеваний, которые будут подвергаться лечению, и других факторов, известных специалистам в данной области.When used for the methods provided by the present invention, an exemplary dosage range for the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be from about 0.001 to about 100 mg/kg body weight per day, from about 0.01 to about 50 mg/kg body weight body weight per day, such as about 0.05 to about 10 mg/kg body weight per day, delivered in one or more doses, such as 1-3 doses. The exact dosage will depend on the frequency and route of delivery, sex, age, body weight and general condition of the individual being treated, the nature and severity of the condition being treated, any concomitant diseases to be treated, and other factors known to those skilled in the art.
В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг. В следующем варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг.In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention contains microbiota, such as Verrucomicrobia , having a total concentration ranging from about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition contains microbiota, such as Verrucomicrobia , having a total concentration ranging from about 0.1 mg/kg to about 50 mg/kg. In a further embodiment, the agent or pharmaceutical composition contains a microbiota, such as Verrucomicrobia , having a total concentration ranging from about 1 mg/kg to about 10 mg/kg.
В некоторых аспектах средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, вводят в дозах в расчете на массу тела индивидуума. В некоторых вариантах осуществления средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, содержат одно или несколько средств, упоминаемых в настоящем описании, в количестве в расчете на массу тела индивидуума.In some aspects, the agents, compositions, or kits described herein are administered in dosages based on the body weight of the individual. In some embodiments, the agents, compositions, or kits described herein contain one or more of the agents mentioned herein in an amount based on the body weight of the individual.
В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании, находится в диапазоне от приблизительно 1,0 до приблизительно 50,0 мг/кг или более, предпочтительно приблизительно от 5,0 до 40,0 мг/кг, более предпочтительно приблизительно от 10,0 до 30,0 мг/кг, в расчете на массу тела индивидуума. В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании, составляет приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 23,5, 24,0, 24,5, 25,0, 25,5, 26,0, 26,5, 27,0, 27,5, 28,0, 28,5, 29,0, 29,5, 30,0, 30,5, 31,0, 31,5, 32,0, 32,5, 33,0, 33,5, 34,0, 34,5, 35,0, 35,5, 36,0, 36,5, 37,0, 37,5, 38,0, 38,5, 39,0, 39,5, 40,0, 40,5, 41,0, 41,5, 42,0, 42,5, 43,0, 43,5, 44,0, 44,5, 45,0, 45,5, 46,0, 46,5, 47,0, 47,5, 48,0, 48,5, 49,0, 49,5, 50,0 мг/кг или более, или любой диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или любую величину между ними, как например, приблизительно от 1,1 до 1,4 мг/кг и т.п., или приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 мг/кг и т.п. в расчете на массу тела индивидуума.In some embodiments, the amount of one or more agents mentioned herein in the agents, compositions or kits described herein ranges from about 1.0 to about 50.0 mg/kg or more, preferably from about 5 .0 to 40.0 mg/kg, more preferably from about 10.0 to 30.0 mg/kg, based on the body weight of the individual. In some embodiments, the amount of one or more agents mentioned herein in the agents, compositions, or kits described herein is about 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3 ,5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 , 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16 ,0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 20.5, 21.0, 21.5, 22.0 , 22.5, 23.0, 23.5, 24.0, 24.5, 25.0, 25.5, 26.0, 26.5, 27.0, 27.5, 28.0, 28 .5, 29.0, 29.5, 30.0, 30.5, 31.0, 31.5, 32.0, 32.5, 33.0, 33.5, 34.0, 34.5 , 35.0, 35.5, 36.0, 36.5, 37.0, 37.5, 38.0, 38.5, 39.0, 39.5, 40.0, 40.5, 41 ,0, 41.5, 42.0, 42.5, 43.0, 43.5, 44.0, 44.5, 45.0, 45.5, 46.0, 46.5, 47.0 , 47.5, 48.0, 48.5, 49.0, 49.5, 50.0 mg/kg or more, or any range defined by the endpoints of the above values, or any value in between, such as, about 1.1 to 1.4 mg/kg and the like, or about 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 mg/kg and the like. based on the body weight of the individual.
В других аспектах средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, вводят в фиксированных дозах. В некоторых вариантах осуществления средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, содержат фиксированное количество одного или нескольких средств, упомянутых в настоящем описании.In other aspects, the agents, compositions or kits described herein are administered in fixed doses. In some embodiments, the agents, compositions, or kits described herein contain a fixed amount of one or more of the agents mentioned herein.
В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании в каждом случае независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 мг или более, или диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или любую величину между ними, например, приблизительно от 1,1 до 1,4 мг и т.п. или приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 и т.п.In some embodiments, the amount of one or more agents referred to herein in the agents, compositions, or kits described herein is in each instance independently 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 , 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 mg or more, or range as determined by endpoints of the above values, or any value between them, for example, from about 1.1 to 1.4 mg, and the like. or approximately 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, etc.
В других аспектах некоторые из компонентов средств, композиций или наборов, описанных в настоящем описании, вводят в дозах по массе индивидуума, как описано выше, в то время как другие компоненты вводят в фиксированных дозах, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления количества некоторых из компонентов в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании. представляют собой количества на основе массы индивидуума, как описано выше, а другие компоненты представляют собой фиксированные количества, как описано выше.In other aspects, some of the components of the agents, compositions or kits described herein are administered in doses based on the individual's weight, as described above, while other components are administered in fixed doses, as described above. In some embodiments, the amounts of some of the components in the agents, compositions, or kits described herein. are amounts based on the weight of the individual, as described above, and the other components are fixed amounts, as described above.
ДоставкаDelivery
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению можно доставлять или вводить различными способами, известными в данной области. Термины "доставка", "доставлять", "вводить" и "применять" используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Как будет понятно специалистам в данной области, путь и/или способ доставки варьируется в зависимости от желаемого результата. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическую композицию по изобретению доставляют перорально. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическую композицию по изобретению доставляют перорально. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по изобретению доставляют назальным путем. Другой способ доставки может включать способы и комбинации для доставки в кишечник.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can be delivered or administered by various methods known in the art. The terms "delivery", "deliver", "administer" and "apply" are used interchangeably herein. As will be appreciated by those skilled in the art, the route and/or method of delivery varies depending on the desired result. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention is delivered orally. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention is delivered orally. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention is delivered by the nasal route. Another delivery method may include methods and combinations for delivery to the intestine.
Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять в заданную область и/или структуру у индивидуума. Область, на которую может быть осуществлено нацеливание в кишечнике, может включать, но не ограничивается ими, желудок, билиарно-панкреатическую ветвь (сегмент), ветвь Ру, общую ветвь, подвздошную кишку, слепую кишку или ободочную кишку. Они могут быть нацелены на структуру, которая составляет область с индивидуализированной средой с конкретным диапазоном pH, температурой, влажности и содержанием метаболитов. Заболевания или состояния, ассоциированные с измененной генеалогией микробиоты, могут демонстрировать присутствие новых микроорганизмов, отсутствие нормальных микроорганизмов или изменение соотношения микроорганизмов.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can be delivered to a predetermined area and/or structure in an individual. The area that can be targeted in the intestine may include, but is not limited to, the stomach, biliary-pancreatic branch (segment), Roux branch, common branch, ileum, cecum or colon. They can target a structure that constitutes an area with a customized environment with a specific pH range, temperature, humidity, and metabolite content. Diseases or conditions associated with altered microbiota lineages may demonstrate the presence of new microorganisms, the absence of normal microorganisms, or a change in the ratio of microorganisms.
Доставка средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть нацелена на одну или несколько областей у индивидуума. Область может включать, но не ограничивается ими, область в кишечнике. В иллюстративном варианте осуществления доставка нацелена на полость рта, желудок, билиарно-панкреатическую ветвь, ветвь Ру, общую ветвь, тонкую кишку, подвздошную кишку, слепую кишку, толстую кишку или ободочную кишку в кишечнике. Доставка также может быть нацелена на одну или несколько тканей индивидуума. Ткань может включать любую ткань в кишечнике, такую как ткань желудка, билиарно-панкриатической ветви, ветви Ру, общей ветви, тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки или ободочной кишки.Delivery of an agent or pharmaceutical composition of the present invention may be targeted to one or more areas in an individual. The area may include, but is not limited to, the area in the intestines. In an illustrative embodiment, delivery is targeted to the oral cavity, stomach, biliary-pancreatic branch, Roux branch, common branch, small intestine, ileum, cecum, colon, or colon in the intestine. Delivery may also be targeted to one or more tissues of an individual. The tissue may include any tissue in the intestine, such as stomach, biliary-pancreatic branch, Roux branch, common branch, small intestine, ileum, cecum, colon or colon.
Компоненты средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть составлены по отдельности, или часть из них может быть составлена вместе. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены в виде средства или фармацевтической композиции, пригодных для однократного или многократного введения.The components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be formulated separately, or a portion of them may be formulated together. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as an agent or pharmaceutical composition suitable for single or multiple administrations.
Компоненты средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть введены по отдельности, или часть или все из них могут быть введены вместе. Средства или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть введены по существу в разные моменты времени, или некоторые или все из них могут быть введены по существу одновременно.The components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be administered separately, or some or all of them may be administered together. The agents or components of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at substantially different times, or some or all of them may be administered substantially simultaneously.
Каждое из средств или компонентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть независимо введено различными подходящими путями, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный или парентеральный (внутривенный, внутримышечный, местный или подкожный пути). В некоторых вариантах осуществления каждый из компонентов средств или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть независимо введен пероральным путем или посредством инъекции, например, посредством внутривенной инъекции или внутрибрюшинной инъекции.Each of the agents or components of the pharmaceutical composition of the present invention can be independently administered by various suitable routes, including, but not limited to, oral or parenteral (intravenous, intramuscular, topical or subcutaneous routes). In some embodiments, each of the components of the agents or pharmaceutical composition of the present invention may be independently administered orally or by injection, for example, by intravenous injection or intraperitoneal injection.
Каждый из компонентов средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может независимо представлять собой подходящую дозированную форму, включая, но не ограничиваясь ими, дозированные формы таблеток, лепешек, пилюль, капсул (например, твердые капсулы, мягкие капсулы, покрытые кишечно-растворимой оболочкой капсулы, микрокапсулы), эликсиров, гранул, сиропов, инъекционных форм (внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные), гранул, эмульсий, суспензий, растворов, дисперсий и препаратов замедленного высвобождения для перорального или парентерального введения.Each of the components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may independently be in a suitable dosage form, including, but not limited to, dosage forms of tablets, lozenges, pills, capsules (e.g., hard capsules, soft capsules, enteric-coated capsules, microcapsules), elixirs, granules, syrups, injection forms (intramuscular, intravenous, intraperitoneal), granules, emulsions, suspensions, solutions, dispersions and slow-release preparations for oral or parenteral administration.
Каждое из средств или компонентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению может независимо содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.Each of the agents or components of the pharmaceutical composition of the present invention may independently contain a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient.
Средства по настоящему изобретению или компоненты фармацевтической композиции можно вводить независимо каждые 1 сутки, каждые 2 суток, каждые 3 суток, каждые 4 суток, каждые 5 суток, каждые 6 суток, каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели или каждый месяц или с меньшей частотой.The agents of the present invention or the components of the pharmaceutical composition can be administered independently every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, every 5 days, every 6 days, every week, every 2 weeks, every 3 weeks or every month or from lower frequency.
Средства по настоящему изобретению или компоненты в фармацевтической композиции могут быть введены независимо 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз или более в сутки.The agents of the present invention or components in the pharmaceutical composition can be administered independently 1 time, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times or 10 times or more per day.
Средства по настоящему изобретению или компоненты фармацевтической композиции можно вводить независимо в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 последовательных суток или более.The agents of the present invention or the components of the pharmaceutical composition can be administered independently within 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 consecutive days or more.
Один из компонентов средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть введен за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более суток до или после введения другого компонента. Например, в одном варианте осуществления средство или компонент 1 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят на 1 сутки, и средство или компонент 2 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят через 2 суток (т.е. на 3 сутки), и средство или компонент 1 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят через другие трое суток (т.е. на 6 сутки).One of the components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be administered 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 days or more before or after the administration of the other component. For example, in one embodiment, agent or
Доставку средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению также можно повторять один или несколько раз. Повторная доставка средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть осуществлена один или несколько раз до и/или после лечения заболевания. Повторная доставка может быть осуществлена аналогичным образом с первоначальной доставкой.Delivery of the agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be repeated one or more times. Repeated delivery of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be performed one or more times before and/or after treatment of the disease. Re-delivery may be made in the same manner as the original delivery.
Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить вместе со средством, которое может включать терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство. Терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство выбрано из низкомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот, белков, таких как полипептидные пребиотики, включая бактериальные компоненты (такие как компоненты клеточной стенки бактерий (такие как пептидогликан), бактериальная нуклеиновая кислота (такая как ДНК и РНК), компоненты бактериальной мембраны и структурные компоненты бактерий (такие как белки, углеводы, липиды и их комбинации, такие как липопротеины, сложные эфиры сахаров и гликопротеин)), бактериальные метаболиты, органические кислоты, неорганические кислоты, основания, белки и пептиды, ферменты и коферменты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, гликопротеины, липопротеины, сложные эфиры сахаров, витамины, биологически активные соединения, метаболиты, содержащие неорганические компоненты, низкомолекулярные соединения (например, азотсодержащие молекулы или содержащие сернистую кислоту молекулы), стойкий крахмал, картофельный крахмал или крахмал с высоким содержанием амилозы, модифицированный крахмал (включая карбоксилированный крахмал, ацетилированный крахмал, пропионированный крахмал и бутилированный крахмал), усваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды, декстроза, ксилоолигосахарид, галактоолигосахарид, арабиноксилан, арабиногалактан, полисахариды галактоманнан, полидекстран, олигофруктоза, инулин и их производные (однако другие олигосахариды, которые могут играть роль пребиотиков, не исключены), другие растворимые волокна и их комбинация. В одном варианте осуществления доставляемое средство представляет собой доставляемое низкомолекулярное соединение, которое имеет низкую пероральную биодоступность и действует на область микроорганизмов в кишечнике хозяина. Низкая биодоступность обычно является нежелательной в медицине, поскольку кишечное всасывание является целью большинства пероральных способов лечения.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be administered together with an agent, which may include a therapeutic, prophylactic or diagnostic agent. The therapeutic, prophylactic or diagnostic agent is selected from small molecule compounds, nucleic acids, proteins such as polypeptide prebiotics, including bacterial components (such as bacterial cell wall components (such as peptidoglycan), bacterial nucleic acid (such as DNA and RNA), bacterial components membranes and structural components of bacteria (such as proteins, carbohydrates, lipids and their combinations such as lipoproteins, sugar esters and glycoprotein)), bacterial metabolites, organic acids, inorganic acids, bases, proteins and peptides, enzymes and coenzymes, amino acids and nucleic acids, carbohydrates, lipids, glycoproteins, lipoproteins, sugar esters, vitamins, biologically active compounds, metabolites containing inorganic components, low molecular weight compounds (for example, nitrogen-containing molecules or sulfurous acid-containing molecules), resistant starch, potato starch or high amylose content, modified starch (including carboxylated starch, acetylated starch, propionated starch and butylated starch), digestible oligosaccharides such as fructooligosaccharides, dextrose, xylooligosaccharide, galactooligosaccharide, arabinoxylan, arabinogalactan, galactomannan polysaccharides, polydextran, oligofructose, inulin and their derivatives (however other oligosaccharides that may play a role as prebiotics cannot be excluded), other soluble fibers and combinations thereof. In one embodiment, the delivered agent is a delivered small molecule compound that has low oral bioavailability and acts on the microbial region of the host intestine. Low bioavailability is generally undesirable in medicine, since intestinal absorption is the goal of most oral treatments.
Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить в той же композиции, что и вышеупомянутое средство, или их можно вводить отдельно от средства, вводимого до, одновременно и/или после средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить по меньшей мере приблизительно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или более суток до введения средства. Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить по меньшей мере приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или более суток после введения средства.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the same composition as the above-mentioned agent, or it can be administered separately from the agent administered before, simultaneously and/or after the agent or pharmaceutical composition of the present invention. The agent or pharmaceutical composition of the present invention can be administered in at least about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or more days before administration of the drug. The agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be administered at least about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or more days after administration of the drug.
Средство или фармацевтическую композицию по изобретению также можно доставлять посредством по меньшей мере частично имплантируемой системы. Имплантируемая система может представлять собой любую систему, известную и используемую в данной области. Система может включать программируемые насосы (такие как насосы, часто используемые для доставки инсулина пациентам с диабетом). Один или несколько этих компонентов могут быть модульными или соединены с трансдермальной системой доставки, которая может включать отверстия, иглы, пластыри и т.п. В иллюстративном варианте осуществления имплантируемая система включает резервуар и отверстие. Резервуар может включать заправляемый или перезагружаемый контейнер для вмещения композиции. В другом варианте осуществления система может включать катетер. В другом варианте осуществления имплантируемая система представляет собой транслюминальный катетер. Система также может быть организована для доставки композиции в назначаемой дозе и/или с назначаемым интервалом. Назначаемая доза и/или назначаемый интервал могут быть определены специалистами в данной области.The agent or pharmaceutical composition of the invention can also be delivered via an at least partially implantable system. The implantable system may be any system known and used in the art. The system may include programmable pumps (such as the pumps often used to deliver insulin to diabetic patients). One or more of these components may be modular or coupled to a transdermal delivery system, which may include orifices, needles, patches, or the like. In an illustrative embodiment, the implantable system includes a reservoir and an orifice. The reservoir may include a refillable or refillable container for housing the composition. In another embodiment, the system may include a catheter. In another embodiment, the implantable system is a transluminal catheter. The system may also be arranged to deliver the composition at a prescribed dose and/or at a prescribed interval. The prescribed dose and/or the prescribed interval can be determined by those skilled in the art.
Некоторые варианты осуществления изобретения проиллюстрированы в следующих неограничивающих примерах.Some embodiments of the invention are illustrated in the following non-limiting examples.
ПРИМЕРEXAMPLE
Материалы и способыMaterials and methods
Животные. Мышей Tg и совместно содержащихся мышей WT (соответствующих мышам WT, полученных путем скрещивания мышей Tg и мышей C57) содержали в одной клетке после рождения. Мышей WT (C57) содержали в отдельных клетках во избежание перекрестного переноса микробиоты. Всех мышей держали в помещении при 23°C с 12-часовым (ч) циклом на свету/в темноте. Мышей случайным образом распределяли в различные группы перед лечением. На протяжении анализа мышей Tg, самцов и самок мышей Tg умерщвляли в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев. Головной мозг извлекали и окрашивали для анализа иммунных клеток и анализа цитокинов. Перед умерщвлением мышей фекалии собирали для анализа микробиоты. Для введения OM1 в возрасте 6,5 месяцев на основе 450 мг b.i.d. (два раза в сутки) в испытании фазы III, мышам Tg вводили 100 мг/кг OM1 посредством перорального введения один раз в сутки в течение одного месяца. Для мониторинга когнитивной активности после последнего введения проводили поведенческие тесты. Затем головной мозг и фекалии мышей использовали для различных анализов. Для поведенческого тестирования мышей Tg и мышей WT в разные месяцы и подвергаемых лечению мышей тестировали посредством обучения различению, как описано ранее. Все движения мышей, которые происходили в Phenotyper (HomeCage) регистрировали посредством компьютеризованной системы отслеживания, которая вычисляет время и количество вхождений, требуемых для достижения 80% стандарта эффективности (Noldus, Ethovision). Для внутрибрюшинной инъекции фенилаланина и изолейцина мышам C57 в возрасте 4 месяцев вводили 50 мг/кг фенилаланина или изолейцина в течение 4 суток. Для инъекции в гиппокамп фенилаланина и изолейцина мышам C57 в возрасте 4 месяцев инъецировали 3 мкл фенилаланина или изолейцина в дозе 120 мл/л. Через 10 суток у этих мышей проводили анализ образца крови и поведенческое тестирование с использованием FACS. Animals. Tg mice and cohoused WT mice (corresponding to WT mice obtained by crossing Tg mice and C57 mice) were housed in the same cage after birth. WT (C57) mice were housed in separate cages to avoid cross-transfer of microbiota. All mice were housed at 23°C on a 12-hour (h) light/dark cycle. Mice were randomly assigned to different groups before treatment. Throughout the analysis, Tg mice, male and female Tg mice were sacrificed at 2, 3, 5, 7, and 9 months of age. Brains were removed and stained for immune cell analysis and cytokine analysis. Before killing the mice, feces were collected for microbiota analysis. To administer OM1 at 6.5 months of age on a 450 mg bid (bid) basis in a phase III trial, Tg mice were administered 100 mg/kg OM1 via oral administration once daily for one month. To monitor cognitive activity, behavioral tests were performed after the last administration. The brains and feces of the mice were then used for various analyses. For behavioral testing, Tg mice and WT mice at different months and treated mice were tested through discrimination training as previously described. All mouse movements that occurred in the Phenotyper (HomeCage) were recorded through a computerized tracking system that calculates the time and number of entries required to achieve an 80% efficiency standard (Noldus, Ethovision). For intraperitoneal injection of phenylalanine and isoleucine, 4-month-old C57 mice were given 50 mg/kg phenylalanine or isoleucine for 4 days. For hippocampal injection of phenylalanine and isoleucine, 4-month-old C57 mice were injected with 3 μl of phenylalanine or isoleucine at a dose of 120 ml/l. After 10 days, these mice underwent blood sample analysis and behavioral testing using FACS.
Для анализа мышей APP/PS1 в разные моменты времени, мышей и совпадающих по возрасту мышей дикого типа умерщвляли в возрасте 3, 9 и 14 месяцев. Головной мозг и кровь мышей собирали для различных анализов. Перед умерщвлением фекалии мышей собирали для анализа микробиоты. Для введения мышам APP/PS1 мышам в возрасте 6 месяцев проводили введение с антибиотиками или без них в течение 3 месяцев 50 мг/кг OM1 через желудочный зонд один раз в сутки. Поведенческие тесты проводили для мониторинга когнитивной активности после последнего введения. Эксперимент на животных был одобрен этическим комитетом Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd (No.: 2016002).For analysis of APP/PS1 mice at different time points, mice and age-matched wild-type mice were sacrificed at 3, 9, and 14 months of age. The brains and blood of the mice were collected for various analyses. Before sacrifice, mouse feces were collected for microbiota analysis. To administer APP/PS1 to mice, 6-month-old mice were administered with or without antibiotics for 3 months with 50 mg/kg OM1 by gavage once daily. Behavioral tests were performed to monitor cognitive activity after the last administration. The animal experiment was approved by the ethical committee of Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd (No.: 2016002).
Экстракция ДНК из образца фекалий и амплификация способом ПЦР. Все образцы фекалий замораживали при -80°C перед экстракцией ДНК и анализом. Микробную ДНК экстрагировали из фекальных образцов с использованием E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, U.S.) в соответствии с протоколами изготовителя. Конечную концентрацию и чистоту ДНК определяли с использованием спектрофотометра УФ и видимой области спектра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, США), и качество ДНК проверяли посредством 1% агарозного гель-электрофореза. Гипервариабельные области V3-V4 гена бактериальной 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров 338 F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) и 806 R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) посредством системы термоциклера ПЦР (GeneAmp 9700, ABI, США). Реакции ПЦР проводили с использованием следующей программы: 3 минуты (мин) денатурации при 95°C, 27 циклов из 30 секунд (с) при 95°C, отжиг в течение 30 с при 55°C, и элонгация в течение 45 с при 72°C, и конечное удлинение при 72°C в течение 10 мин. Реакции ПЦР проводили в трех экземплярах в 20 мкл смеси, содержавшей 4 мкл 5 × буфера FastPfu, 2 мкл 2,5 ммоль/л dNTP, 0,8 мкл каждого праймера (5 мкмоль/л), 0,4 мкл полимеразы FastPfu и 10 нг ДНК-матрицы. Полученные продукты ПЦР экстрагировали из 2% агарозного геля и далее очищали с использованием набора AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, США) и количественно определяли с использованием QuantiFluor™-ST (Promega, США) в соответствии с протоколом изготовителя. Вырожденный праймер относится к смеси различных последовательностей, которые отражают все различные возможности оснований для кодирования одной аминокислоты. Для повышения специфичности можно обратиться к таблице использования кодонов для уменьшения вырожденности в соответствии с предпочтениями использования оснований у различных организмов. В дополнение к нормальным обозначениям четырех оснований A, T, G и C, другие буквы, такие как R, Y, M, K и т.п., присутствуют в нуклеотидной цепи, где R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A/T, H= A/C/T, B= C/G /T, V=A/C/G, D=A/G /T, N=A/C/G/T. DNA extraction from a fecal sample and amplification by PCR . All fecal samples were frozen at −80°C prior to DNA extraction and analysis. Microbial DNA was extracted from fecal samples using the EZNA® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, US) according to the manufacturer's protocols. The final DNA concentration and purity were determined using a NanoDrop 2000 UV–Vis spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA), and DNA quality was checked by 1% agarose gel electrophoresis. Hypervariable regions V3-V4 of the bacterial 16S rRNA gene were amplified using primers 338 F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) and 806 R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) via a PCR thermal cycler system (GeneAmp 9700, ABI, USA). PCR reactions were performed using the following program: 3 minutes (min) of denaturation at 95°C, 27 cycles of 30 seconds (s) at 95°C, annealing for 30 s at 55°C, and elongation for 45 s at 72 °C, and final extension at 72°C for 10 min. PCR reactions were performed in triplicate in 20 μl of a mixture containing 4 μl of 5× FastPfu buffer, 2 μl of 2.5 mmol/l dNTPs, 0.8 μl of each primer (5 μmol/l), 0.4 μl of FastPfu polymerase and 10 ng DNA template. The resulting PCR products were extracted from a 2% agarose gel and further purified using the AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) and quantified using QuantiFluor™-ST (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol . A degenerate primer refers to a mixture of different sequences that reflect all the different base possibilities for coding a single amino acid. To increase specificity, a table of codon usage can be consulted to reduce degeneracy according to the base usage preferences of different organisms. In addition to the normal four base symbols A, T, G and C, other letters such as R, Y, M, K, etc. are present in the nucleotide chain, where R=A/G, Y=C/T , M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A/T, H= A/C/T, B= C/G /T, V=A/C/G, D =A/G/T, N=A/C/G/T.
Секвенирование с использованием Illumina MiSeq. В соответствии со стандартным протоколом Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, Китай), очищенные ампликоны объединяли в эквимолярных количествах и подвергали секвенированию спаренных концов (2×300) на платформе Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, США). Sequencing using Illumina MiSeq . In accordance with the standard protocol of Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, China), purified amplicons were pooled in equimolar quantities and subjected to paired-end sequencing (2×300) on the Illumina MiSeq platform (Illumina, San Diego, USA).
Обработка данных секвенирования. Исходные файлы fastq подвергали демультиплексинованию, фильтрации качества посредством Trimmomatic и объединению посредством FLASH на основе следующих критериев: (i) Чтения укорачивали в любом участке, который получал средний показатель качества < 20 на протяжении окна скольжения 50 п.н. (ii) Проводили точный подбор праймеров, допуская несоответствие 2 нуклеотидов, и чтения, содержавшие неоднозначные основания, удаляли. (iii) Последовательности с перекрыванием более 10 п.н. объединяли в соответствии с их последовательностью перекрывания. Операционные таксономические единицы (OTU) подвергали кластеризации с порогом сходства 97% с использованием UPARSE (версия 7.1 http://drive5.com/uparse/), и химерные последовательности идентифицировали и удаляли с использованием UCHIME. Таксономию каждой последовательности гена 16S рРНК анализировали посредством алгоритма RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) против базы данных 16S рРНК Silva (SSU123) с использованием порогового значения достоверности 70%. Processing of sequencing data. Raw fastq files were demultiplexed, quality filtered by Trimmomatic, and merged by FLASH based on the following criteria: (i) Reads were trimmed at any region that received an average quality score < 20 over a 50-bp sliding window. (ii) Precision primer selection was performed, allowing for 2 nucleotide mismatches, and reads containing ambiguous bases were removed. (iii) Sequences with overlap greater than 10 bp. were combined according to their overlap sequence. Operational taxonomic units (OTUs) were clustered at a 97% similarity threshold using UPARSE (version 7.1 http://drive5.com/uparse/ ), and chimeric sequences were identified and removed using UCHIME. The taxonomy of each 16S rRNA gene sequence was analyzed by the RDP Classifier algorithm ( http://rdp.cme.msu.edu/ ) against the Silva 16S rRNA database (SSU123) using a confidence threshold of 70%.
Получение образцов метаболитов. Образцы, хранившиеся при -80°C, отбирали и размораживали при комнатной температуре. В эксперименте использовали образцы массой 50 мг и также добавляли 400 мкл смеси метанол-вода (4:1, об./об.) для гомогенизации образца с использованием гомогенизатора в течение 10 секунд. Раствор подвергали ультразвуковой экстракции на льду в течение 10 мин и хранили при -20°C в течение 30 мин, затем центрифугировали в течение 15 мин при 13000 об/мин при 4°C. Для анализа LC-MS использовали 200 мкл супернатанта. Obtaining metabolite samples. Samples stored at -80°C were collected and thawed at room temperature. The experiment used 50 mg samples and also added 400 μL of methanol-water (4:1, v/v) to homogenize the sample using a homogenizer for 10 seconds. The solution was subjected to ultrasonic extraction on ice for 10 min and stored at -20°C for 30 min, then centrifuged for 15 min at 13,000 rpm at 4°C. 200 μL of supernatant was used for LC-MS analysis.
Параметры анализа LC/MS. LC-MS проводили на масс-спектрометрической системе AB Sciex TripleTOF 5600TM (AB SCIEX, USA). Условия LC: колонка: Acquity BEH C18 (100 мм × 2,1 мм i.d., 1,7 мкм; Waters, Milford, США). Растворитель: колонку поддерживали при 40°C и разделения достигали с использованием следующего градиента: 5% B-30% B на протяжении 0-3 мин, 30% B-95% B на протяжении 3-9 мин, 95% B-95% B на протяжении 9-13,0 мин; 95% B-5% B на протяжении 13,0-13,1 мин, и удержание в течение 13,1-16 мин при 5% B; скорость потока составляет 0,40 мл/мин, где B представляет собой ацетонитрил:изопропанол 1:1 (0,1% (об./об.) муравьиная кислота) и A представляет собой водный раствор муравьиной кислоты (0,1% (об./об.) муравьиная кислота). Объем инжектирования составил 20 мкл. Данные масс-спектрометрии получали с использованием масс-спектрометрической системы AB Sciex TripleTOF 5600TM, оборудованной источником электрораспылительной ионизации (ESI), действующем либо режиме положительных ионов, либо в режиме отрицательных ионов, с капиллярным напряжением 1,0 кВ, пробоотборным конусом, 40 В, энергией столкновений 6 эВ. Температура источника была установлена на 120°C, с потоком газа десольватации 45 л/ч. Центроидные данные получали при от 50 до 1000 m/z с разрешением 30000. LC/MS Analysis Parameters . LC-MS was carried out on an AB Sciex TripleTOF 5600TM mass spectrometric system (AB SCIEX, USA). LC conditions: Column: Acquity BEH C18 (100 mm × 2.1 mm id, 1.7 µm; Waters, Milford, USA). Solvent: The column was maintained at 40°C and separations were achieved using the following gradient: 5% B-30% B over 0-3 min, 30% B-95% B over 3-9 min, 95% B-95% B for 9-13.0 minutes; 95% B-5% B for 13.0-13.1 min, and hold for 13.1-16 min at 5% B; the flow rate is 0.40 ml/min, where B is acetonitrile:isopropanol 1:1 (0.1% (v/v) formic acid) and A is an aqueous solution of formic acid (0.1% (v/v) ./vol.) formic acid). The injection volume was 20 μl. Mass spectrometry data were acquired using an AB Sciex TripleTOF 5600TM mass spectrometry system equipped with an electrospray ionization (ESI) source operating in either positive ion mode or negative ion mode, 1.0 kV capillary voltage, 40 V sampling cone,
Получение образца метаболитов QC. Образец QC получали путем смешения аликвот всех образцов с получением объединенного образца, а затем анализировали с использованием одного и того же способа с аналитическими образцами. QC инжектировали с регулярными интервалами (каждые 10 образцов) на протяжении аналитической серии с получением набора данных, из которых может быть оценена повторяемость. Obtaining a sample of QC metabolites . The QC sample was prepared by mixing aliquots of all samples to create a pooled sample and then analyzed using the same method with the analytical samples. QC was injected at regular intervals (every 10 samples) throughout the analytical run to obtain a data set from which repeatability could be assessed.
Дифференцировка in vitro наивных CD4 в Th1 и Th2, индуцируемая супернатантом фекалий мышей. Наивные CD4+ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4+ T-клеток (Stem Cell, #19765). Как описано выше, получали супернатант фекалий мышей в возрасте 7 месяцев. Всего 0,5×106 клеток/лунка в 0,5 мл среды RPMI-1640 высевали в 48-луночные планшеты, покрытые антителом против CD3 и антителом против CD28, и культуральную среду дополняли цитокинами и блокирующими антителами. Th0: 20 нг/мл mIL-2; Th1: 20 нг/мл mIL-2, 10 мкл супернатанта, 5000 нг/мл 11B11; Th2: 20 нг/мл mIL-2, 10 мкл супернатанта, 5000 нг/мл XMG1.2. OM1 добавляли в обозначенные лунки до конечной концентрации 100 мкг/мл. После инкубации при 37°C в 5% CO2 в течение 5 суток клетки получали на цитометре BD Aria III, и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. In vitro differentiation of naive CD4 into Th1 and Th2 induced by mouse fecal supernatant. Naive CD4 + T cells were separated from splenocytes of female C57BL/6 mice at 8 months of age using a naïve CD4 + T cell isolation kit (Stem Cell, #19765). The fecal supernatant of 7-month-old mice was obtained as described above. A total of 0.5 x 10 6 cells/well in 0.5 ml RPMI-1640 medium was seeded in 48-well plates coated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, and the culture medium was supplemented with cytokines and blocking antibodies. Th0: 20 ng/ml mIL-2; Th1: 20 ng/ml mIL-2, 10 µl supernatant, 5000 ng/ml 11B11; Th2: 20 ng/ml mIL-2, 10 µl supernatant, 5000 ng/ml XMG1.2. OM1 was added to the indicated wells to a final concentration of 100 μg/ml. After incubation at 37°C in 5% CO 2 for 5 days, cells were acquired on a BD Aria III cytometer and data were analyzed using FlowJo software.
Иммуногистохимия. Для окрашивания с проявкой 3,30-диаминобензидином (DAB срезы подвергали иммунному окрашиванию с использованием Leica BOND-RX Autostainer (Leica Microsystems) и Coverslipper CV5030 (Leica Microsystems) в соответствии с протоколом IHC изготовителя. В кратком изложении срезы подвергали индуцированной нагреванием демаскировке эпитопов с использованием раствора Epitope Retrieval solution 2 (ER2, AR9640, Leica Biosystems) в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3%-4% (об./об.) пероксидом водорода (часть DS9800, Leica Biosystems) в течение 10 мин. Затем срезы инкубировали с блокирующим буфером (10% NGS в PBS с 0,3% Triton x-100) в течение 60 мин. Наконец, проводили окрашивание с использованием системы Bond Polymer Refine Detection System (DS9800, Leica Biosystems) в соответствии с протоколом изготовителя. Время инкубации с первичным антителом составляло 30 мин. Срезы окрашивали в отношении активированной микроглии с использованием антитела кролика против IBA1 (1:1000, каталожный номер № 019-19741, Wako), отложений амилоида с использованием антитела мыши против Aβ42 (1:1000; каталожный номер № 803003, Biolegend) и фосфорилирования тау с использованием антитела мыши anti-PHF-Tau & tangles-Thr231 antibody (1:300, каталожный номер № MN1040, Thermo Fisher). Окрашенные срезы автоматически сканировались посредством высокопроизводительного светлопольного сканера (NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu), и изображения получали с использованием программного обеспечения NDP.scan 3.2 (Hamamatsu). Для флуоресцентного окрашивания предметные стекла блокировали блокирующим буфером (10% NGS в PBS с 0,3% Triton x-100) при к.т. в течение 1 ч, а затем инкубировали в растворе первичного антитела (Iba-1 1:1000, Aβ42 1:1000, тау 1:300) в течение ночи при 4°C. После промывания предметные стекла инкубировали с флуоресцентным вторичным антителом против антител кролика или против антител мыши (1:1000, Invitrogen) в течение 60 мин при к.т. и далее промывали 3 раза в PBS. Наконец, предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию с DAPI (1:10000 в PBS, Sigma) в течение 5 мин при к.т., промывали, запечатывали и хранили при 4°C для получения изображений. Репрезентативные флуоресцентные изображения получали посредством прямого флуоресцентного микроскопа Zmager-m2 (Zeiss, Germany) под 10× объективом с использованием программного обеспечения Zen (Zeiss). Immunohistochemistry . For 3,30-diaminobenzidine (DAB) development staining, sections were immunostained using a Leica BOND-RX Autostainer (Leica Microsystems) and Coverslipper CV5030 (Leica Microsystems) according to the manufacturer's IHC protocol. Briefly, sections were subjected to heat-induced epitope unmasking with using Epitope Retrieval solution 2 (ER2, AR9640, Leica Biosystems) for 20 min. Endogenous peroxidase activity was blocked with 3%-4% (v/v) hydrogen peroxide (part of DS9800, Leica Biosystems) for 10 min. Then Sections were incubated with blocking buffer (10% NGS in PBS with 0.3% Triton x-100) for 60 min. Finally, staining was performed using the Bond Polymer Refine Detection System (DS9800, Leica Biosystems) according to the manufacturer's protocol. Incubation time with primary antibody was 30 min. Sections were stained for activated microglia using rabbit anti-IBA1 antibody (1:1000, catalog no. 019-19741, Wako), amyloid deposits using mouse anti-Aβ42 antibody (1:1000; cat. no. 803003, Biolegend) and tau phosphorylation using mouse anti-PHF-Tau & tangles-Thr231 antibody (1:300, cat. no. MN1040, Thermo Fisher). Stained sections were automatically scanned using a high-performance bright-field scanner (NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu), and images were acquired using NDP.scan 3.2 software (Hamamatsu). For fluorescent staining, slides were blocked with blocking buffer (10% NGS in PBS with 0.3% Triton x-100) at RT. for 1 h and then incubated in a primary antibody solution (Iba-1 1:1000, Aβ42 1:1000, Tau 1:300) overnight at 4°C. After washing, the slides were incubated with fluorescent anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody (1:1000, Invitrogen) for 60 min at RT. and then washed 3 times in PBS. Finally, slides were counterstained with DAPI (1:10,000 in PBS, Sigma) for 5 min at RT, washed, sealed, and stored at 4°C for imaging. Representative fluorescence images were obtained using a Zmager-m2 upright fluorescence microscope (Zeiss, Germany) under a 10× objective using Zen software (Zeiss).
Тест нейротоксичности. Клетки SH-SY5Y (ATCC, США) высевали на белый полистироловый 96-луночный планшет (Corning Inc., США) с плотностью 5000 клеток/лунка и культивировали в инкубаторе с увлажнением при 37℃ и 5% CO2 в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (DMEM) (Corning Inc., США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Через 24 часа клетки обрабатывали L-фенилаланином или L-изолейцином (Sigma) в конечных концентрациях 10 мМ, 1 мМ и 0,1 мМ, соответственно. Для детекции жизнеспособности клеток через 24 часа использовали CellTiter-Glo (Promega Inc., США). Для регистрации люминесцентного сигнала использовали устройство Cytation5 (BioTek). Neurotoxicity test . SH-SY5Y cells (ATCC, USA) were seeded on a white polystyrene 96-well plate (Corning Inc., USA) at a density of 5000 cells/well and cultured in a humidified incubator at 37℃ and 5% CO 2 in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Corning Inc., USA), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin. After 24 h, cells were treated with L-phenylalanine or L-isoleucine (Sigma) at final concentrations of 10 mM, 1 mM, and 0.1 mM, respectively. CellTiter-Glo (Promega Inc., USA) was used to detect cell viability after 24 hours. A Cytation5 device (BioTek) was used to record the luminescent signal.
Детекция аминокислот. Набор растворов стандартных смесей аминокислот получали в диапазоне концентраций 100-2000 мкмоль/л. Часть объемом 10 мкл каждого раствора стандартной смеси или образца плазмы вносили пипеткой в нижнюю часть пробирки, а затем добавляли 70 мкл буфера на основе бората натрия (200 ммоль/л при pH 8,8). Добавляли 20 мкл 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC) (4 мг/мл в ацетонитриле), пробирку закрывали и нагревали в течение 10 мин при 55 °C с получением AQC-аминокислоты. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры и часть каждого раствора объемом 2 мкл инжектировали в систему UPLC-ESI-MS для анализа аминокислот без дальнейшей очистки. Detection of amino acids . A set of solutions of standard mixtures of amino acids was prepared in the concentration range of 100-2000 µmol/
ЛюдиPeople
Проводили сбор крови пациентов с MCI вследствие AD и здоровых контролей в пилотном испытании. MCI вследствие AD определяли в соответствии с клиническими и научными диагностическими критериями NIA-AA 2011 для MCI вследствие AD. Пациенты с MCI вследствие AD в этом испытании должны удовлетворять следующим критериям. Первым фактором является изменение когнитивной функции. Вторым является нарушение одного или нескольких когнитивных доменов. Третьим является сохранение независимости функциональных способностей. Четвертым является отсутствие деменции (клинические критерии NIA-AA 2011 диагноза MCI вследствие AD). Всех участников подвергали процессу скрининга, который включал изучение их медицинского анамнеза, физикальное и неврологическое обследование, лабораторные тесты и изображения МРТ. Клиническая оценка умеренного когнитивного расстройства или деменции включала нейропсихологические тесты, а также поведенческие и психиатрические опросы, проводимые лечащими врачами. Для пациентов с AD регистрировали показатели < 4 по шкале ишемии Хачинского, и у них отсутствовали в анамнезе значительные системные или психиатрические состояния или травматические повреждения головного мозга, которые могли нарушить функцию головного мозга. Для всех участников проводили клиническую оценку деменции (CDR) и Монреальскую оценку когнитивных функций (MoCA). На основе данной оценки авторы изобретения оставляли индивидуумов с MCI вследствие AD, а других исключали, таких как индивидуумы, которые имели нарушение единичного домена, не относящегося к памяти (подтип MCI с единичным доменом, не относящимся к памяти), и индивидуумы, которые имели нарушение двух или более доменов (множество доменов, подтип MCI со слабым нарушением). Нормальные контрольные индивидуумы не имели снижения когнитивных способностей в анамнезе, неврологических нарушений или неконтролируемых системных медицинских нарушений. Все индивидуумы, включенные в это испытание, имели ишемию не более двух лакун (диаметром < 1 см) при определении посредством последовательности МРТ в режиме инверсионного восстановления с подавлением сигнала от жидкости (FLAIR).Blood was collected from patients with MCI due to AD and healthy controls in a pilot trial. MCI due to AD was defined according to the 2011 NIA-AA clinical and scientific diagnostic criteria for MCI due to AD. Patients with MCI due to AD in this trial must meet the following criteria. The first factor is changes in cognitive function. The second is impairment in one or more cognitive domains. The third is maintaining independence of functional abilities. The fourth is the absence of dementia (NIA-AA 2011 clinical criteria for the diagnosis of MCI due to AD). All participants were subjected to a screening process that included a review of their medical history, physical and neurological examination, laboratory tests, and MRI images. Clinical assessment of mild cognitive impairment or dementia included neuropsychological tests and behavioral and psychiatric interviews administered by treating physicians. For patients with AD, scores < 4 on the Hachinsky Ischemia Scale were recorded and they had no history of significant systemic or psychiatric conditions or traumatic brain injury that could impair brain function. The Clinical Dementia Rating (CDR) and the Montreal Cognitive Assessment (MoCA) were administered to all participants. Based on this assessment, the inventors retained individuals with MCI due to AD and excluded others, such as individuals who had single nonmemory domain impairment (single nonmemory domain MCI subtype) and individuals who had impairment two or more domains (multiple domains, mildly impaired MCI subtype). Normal control individuals had no history of cognitive decline, neurological impairment, or uncontrolled systemic medical conditions. All individuals included in this trial had ischemia of no more than two lacunae (diameter < 1 cm) as determined by a fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR) MRI sequence.
Размер выборки для первой группы (фиг. 5h, i) составляет 9 пациентов с MCI вследствие AD и 18 здоровых индивидуумов. Размер выборки для второй группы (фиг. 5j) составляет 22 пациента с MCI вследствие AD и 22 здоровых индивидуумов. Диагноз MCI был основан на следующих критериях, которые были адаптированы из диагностических критериев Петерсена для MCI: (1) жалобы на память, предпочтительно подтвержденные супругом или родственником; (2) объективное нарушение памяти; (3) нормальная общая когнитивная функция; (4) интактная повседневная активность и (5) отсутствие деменции. Этический комитет Shanghai Mental Health Centre Institutional Review Board одобрил испытание (номер: 2016-22R1). От всех индивидуумов и опекунов индивидуумов было получено информированное согласие. Информация о возрасте и поле и т.д. приведена ниже.The sample size for the first group (Fig. 5h, i) is 9 patients with MCI due to AD and 18 healthy individuals. The sample size for the second group (Fig. 5j) is 22 patients with MCI due to AD and 22 healthy individuals. The diagnosis of MCI was based on the following criteria, which were adapted from Petersen's diagnostic criteria for MCI: (1) memory complaints, preferably confirmed by a spouse or relative; (2) objective memory impairment; (3) normal general cognitive function; (4) intact activities of daily living and (5) absence of dementia. The ethics committee of the Shanghai Mental Health Center Institutional Review Board approved the trial (number: 2016-22R1). Informed consent was obtained from all individuals and individuals' guardians. Information about age and gender, etc. is given below.
Первая группа:First group:
Вторая группа:Second group:
Дифференцировка и пролиферация in vitro, индуцированная фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4+ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4+ T-клеток (Stem Cell, #19765), и клетки окрашивали посредством CellTrace (Thermo Fisher, #C34557). Всего 1×105 клеток/лунка в 0,2 мл среды RPMI-1640 высевали в 96-луночные планшеты и культуральную среду дополняли цитокинами или блокирующими антителами. Th0: 10 нг/мл mIL-2; Th1:10 нг/мл mIL-2, 5000 нг/мл 11B11. В указанные лунки добавляли фенилаланин (конечная концентрация, 2 ммоль/л), изолейцин (конечная концентрация, 2 ммоль/л) и OM1 (конечная концентрация, 100 мкг/мл), соответственно. После инкубации при 37°C в 5% CO2 в течение 5 суток клетки получали на цитометре BD Fortessa и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Differentiation and proliferation in vitro, induced by phenylalanine and isoleucine. Naive CD4+ T cells were separated from splenocytes of female C57BL/6 mice at 8 months of age using a naïve CD4 isolation kit+ T cells (Stem Cell, #19765), and cells were stained with CellTrace (Thermo Fisher, #C34557). Total 1x105 cells/well in 0.2 ml RPMI-1640 medium were seeded in 96-well plates, and the culture medium was supplemented with cytokines or blocking antibodies. Th0: 10 ng/ml mIL-2; Th1: 10 ng/ml mIL-2, 5000 ng/ml 11B11. Phenylalanine (final concentration, 2 mmol/L), isoleucine (final concentration, 2 mmol/L), and OM1 (final concentration, 100 μg/ml) were added to the indicated wells, respectively. After incubation at 37°C in 5% CO2 within 5 days, cells were obtained on a BD Fortessa cytometer and data were analyzed using FlowJo software.
Захват фенилаланина. Наивные CD4+ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4+ T-клеток (Stem Cell, каталожный номер 19765) и индуцировали к дифференцировке в Th1 посредством 20 нг/мл IL-12. Через 3 суток всего 5×105 Th1-клеток и Th0-клеток/лунка в 0,5 мл среды RPMI-1640 высевали в 48-луночные планшеты. В указанные лунки добавляли 13C-меченный фенилаланин и 5 мМ ингибитор переносчика аминокислот BCH. Через 0,5 ч клетки собирали и промывали два раза ледяным D-PBS. Добавляли 50 мкл деионизированной воды и клетки лизировали посредством замораживания и размораживания два раза при -80°C. Клеточный лизат центрифугировали при 12000×g в течение 10 мин и 13C-меченный фенилаланин в супернатанте анализировали посредством масс-спектрометрии. Phenylalanine uptake . Naive CD4 + T cells were separated from splenocytes of female C57BL/6 mice at 8 months of age using a naïve CD4 + T cell isolation kit (Stem Cell, catalog no. 19765) and induced to differentiate into Th1 by 20 ng/ml IL- 12. After 3 days, a total of 5×10 5 Th1 cells and Th0 cells/well in 0.5 ml of RPMI-1640 medium were seeded into 48-well plates. 13 C-labeled phenylalanine and 5 mM amino acid transporter inhibitor BCH were added to the indicated wells. After 0.5 h, cells were harvested and washed twice with ice-cold D-PBS. 50 μl of deionized water was added and cells were lysed by freezing and thawing twice at -80°C. The cell lysate was centrifuged at 12,000×g for 10 min and 13 C-labeled phenylalanine in the supernatant was analyzed by mass spectrometry.
Обработка антибиотиком. Мышам проводили введение путем добавления в стерильную питьевую воду раствора антибиотика (ATB), содержавшего ампициллин (0,1 мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде), стрептомицин (0,5 мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде) и колистин (0,1 мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде) (Sigma-Aldrich). Растворы и бутылки заменяли 3 раза и один раз в неделю, соответственно. Активность антибиотика подтверждали посредством секвенирования гена 16S рРНК. Типы бактерий с относительным содержанием менее 0,01 удаляли для группы Tg. Длительность введения ABX несколько различалась, исходя из условий эксперимента. В контексте экспериментов с трансплантацией фекальной микробиоты, мышам проводили введение ATB в течение 3 суток перед проведением трансплантации фекальной микробиоты на следующий день через желудочный зонд с использованием игл для кормления животных. Antibiotic treatment . Mice were administered by adding to sterile drinking water an antibiotic solution (ATB) containing ampicillin (0.1 mg/ml, final concentration in drinking water), streptomycin (0.5 mg/ml, final concentration in drinking water) and colistin ( 0.1 mg/ml final concentration in drinking water) (Sigma-Aldrich). Solutions and bottles were replaced 3 times and once a week, respectively. The activity of the antibiotic was confirmed by sequencing of the 16S rRNA gene. Bacterial types with relative abundances less than 0.01 were removed for the Tg group. The duration of ABX administration varied slightly based on experimental conditions. In the context of fecal microbiota transplantation experiments, mice were administered ATB for 3 days before undergoing fecal microbiota transplantation the following day via gavage using animal feeding needles.
Эксперименты по трансплантации фекальной микробиоты (FMT). FMT проводили путем размораживания фекального материала. Затем 200 мкл суспензии переносили посредством желудочного зонда каждому из реципиентов, которым вводили ATB. FMT проводили 3 раза за 5 суток. Мышам C57 в возрасте двенадцати месяцев сначала вводили коктейль антибиотиков в питьевой воде в течение 3 суток, а затем 40 мг смешанного стула, суспендированного в PBS, вводили через желудочный зонд каждой мыши 3 раза с интервалом 2 суток между введениями. Через 3 суток проводили инъекцию 4,2 мкг олигомера Aβ 1-40 в обе стороны гиппокампа. Через 3 суток мышей умерщвляли и использовали для разных анализов. Fecal microbiota transplantation (FMT) experiments . FMT was performed by thawing fecal material. 200 μl of the suspension was then transferred by gavage to each of the ATB recipients. FMT was performed 3 times over 5 days. Twelve-month-old C57 mice were first administered a cocktail of antibiotics in drinking water for 3 days, and then 40 mg of mixed stool suspended in PBS was gavaged into each
Биоинформатический анализ. Анализ сигнальных путей и анализ обогащения биологических функций проводили с использованием Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype (KEGG). Обогащение данных проводили с использованием R-пакета "DOSE", "GO.db", "GSEABase" и "ClusterProfiler". Отображались только каскады со значением p с поправкой на частоту ложноположительных результатов (FDR) < 0,05. Для анализа корреляций использовали R-пакет "ggcorrplot". R-пакет "igraph" использовали для построения круговых диаграмм корреляций. R-пакеты "ggalluvial" и "networkD3" использовали для получения блок-схем для бактерий и диаграмм Сэнки. R-пакет "Mfuzz" использовали для кластерного анализа тенденций. Другие способы биоинформатического анализа проводили с использованием онлайн-платформы Majorbio I-Sanger Cloud (www.i-sanger.com). Анализ биомаркеров ROC и классификацию на основе случайного леса проводили с использованием MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/). Bioinformatics analysis . Signaling pathway analysis and biological function enrichment analysis were performed using Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype (KEGG). Data enrichment was performed using the R package “DOSE”, “GO.db”, “GSEABase” and “ClusterProfiler”. Only cascades with a false-positive rate (FDR)-corrected p value of <0.05 were displayed. The R package “ggcorrplot” was used to analyze correlations. The R package “igraph” was used to generate pie charts of correlations. The R packages “ggalluvial” and “networkD3” were used to produce flowcharts for bacteria and Sankey diagrams. The R package “Mfuzz” was used for cluster trend analysis. Other bioinformatics analysis methods were performed using the Majorbio I-Sanger Cloud online platform (www.i-sanger.com). ROC biomarker analysis and random forest classification were performed using MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
Получение образцов для проточной цитометрии и анализ. Мышей подвергали анестезии, проводили взятие образцов крови в содержавшие EDTA пробирки и эритроциты удаляли с использованием 1× буфера для лизиса эритроцитов. Перед сбором тканей головной мозг подвергали перфузии ледяным PBS, чтобы избежать попадания циркулирующих иммунных клеток крови, и головной мозг извлекали, нарезали на фрагменты и проводили диссекцию в соответствии с инструкцией к набору Adult Brain Dissociation Kit (Miltenyi, каталожный номер № 130-107-677) с использованием диссоциатора gentleMACS (Miltenyi Biotec). Гомогенат головного мозга фильтровали через 70-мкм клеточное сито и центрифугировали при 300×g в течение 5 мин при 4°C. Клеточный осадок ресуспендировали в холодном буфере PBS и вновь центрифугировали при 300×g в течение 5 мин при 4°C. Все образцы подсчитывали и доводили до плотности 2-3×106/100 мкл, метили с использованием набора Live/Dead Kit в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 500×g в течение 3 мин при 4°C. Клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера PBS, блокировали антителом против CD16/32 (Biolegend, каталожный номер № 101320) в течение 10 мин, и инкубировали с антителом в соответствии с протоколами изготовителей при 4°C в течение 30 мин. Следующие антитела использовали для FACS-анализа: CD45(30-F11)-APC-Cy7(103116,Biolegend),CD11b(M1/70)-FITC(101205,Biolegend),CX3CR1(SA011F11)-PE-Dazzle 594(149014,Biolegend),F4/80(BM8)-BV421(123132,Biolegend),CD86(IT2,2)-PE(305438,Biolegend),CD206(15-2)-APC(321110,Biolegend),CD206(15-2)-BV785(321142,Biolegend),CD11c(N418)-PE-Cy7(117318,Biolegend),CD8(53-6,7)-Percp-Cy5.5(100734,Biolegend),Ly-6C(HK1.4)-PE-Dazzle 594(128044,Biolegend),Gr-1(RB6-8C5)-Percp-Cy5,5(108428,Biolegend),B220(RA3-6B2)-BV421(103240,Biolegend),CD19(6D5)-PE(115508,Biolegend),CD49b(DX5)-PE-Cy7(108922,Biolegend),CD4(GK1,5)-PE-Cy7(100422,Biolegend),CD4(GK1,5)-FITC(100406,Biolegend),CXCR3(CXCR3-173)-BV421(126522,Biolegend),CCR4(L291H4)-PE-Cy7(359410,Biolegend),CCR6(29-2L17)-APC(129814,Biolegend),CD127(A019D5)-PE(351304,Biolegend),CD25(3C7)-Percp-Cy5,5(101912,Biolegend),Live/Dead(423104,Biolegend). Клетки добавляли к 500 мкл буфера PBS, центрифугировали при 500×g в течение 3 мин при 4°C и ресуспендировали в 200 мкл подвижного буфера. Соответствующий отрицательный контроль, контроль Fluorescence Minus One (FMO) и каждый образец для компенсации флуоресценции использовали для внесения поправки на компенсацию флуоресценции и идентификации представляющих интерес популяций. Клетки обрабатывали на цитометре BD Aria III и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Sample acquisition and analysis for flow cytometry . Mice were anesthetized, blood samples were collected in EDTA tubes, and red blood cells were removed using 1× red cell lysis buffer. Before tissue collection, the brain was perfused with ice-cold PBS to avoid ingress of circulating immune cells from the blood, and the brain was removed, sliced, and dissected according to the instructions for the Adult Brain Dissociation Kit (Miltenyi, catalog no. 130-107-677 ) using gentleMACS dissociator (Miltenyi Biotec). The brain homogenate was filtered through a 70-μm cell sieve and centrifuged at 300 × g for 5 min at 4°C. The cell pellet was resuspended in cold PBS buffer and centrifuged again at 300 × g for 5 min at 4°C. All samples were counted and adjusted to a density of 2-3
Чип с антителами. Гомогенаты головного мозга (из 20 мг ткани) анализировали с использованием чипа для цитокинов с антителами на основе предметного стекла, включавшего 200 белков (RayBiotech, GSM-CAA-4000-1). В каждую лунку добавляли 100 мкл разбавителя для образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем буфер заменяли другими 100 мкл образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Образцы удаляли и промывали 5 раз (по 5 мин каждый раз) с использованием 150 мкл 1×промывочного буфера I и 2 раза (по 5 мин каждый раз) с использованием 150 мкл 1× промывочного буфера II при комнатной температуре при осторожном качании. В каждую лунку добавляли 80 мкл коктейля антител для детекции и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Предметное стекло промывали 5 раз (по 5 мин каждый раз) посредством 150 мкл 1× буфера для промывания I, а затем 2 раза (по 5 мин каждый раз) посредством 150 мкл 1× буфера для промывания II при комнатной температуре при осторожном качании. В каждую лунку добавляли восемьдесят микролитров стрептавидина, конъюгированного с эквивалентным Cy3 красителем, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После 5 промываний (по 5 мин каждый раз), сигнал визуализировали посредством лазерного сканера. Затем данные визуализировали посредством диаграммы тепловой карты (www.metaboanalyst.ca). Antibody chip . Brain homogenates (from 20 mg tissue) were analyzed using a 200-protein glass slide-based antibody cytokine chip (RayBiotech, GSM-CAA-4000-1). 100 μL of sample diluent was added to each well and incubated at room temperature for 30 min. The buffer was then replaced with another 100 μl of sample and incubated at room temperature for 2 hours. Samples were removed and washed 5 times (5 min each time) with 150 μl of 1× wash buffer I and 2 times (5 min each time) with using 150 µl of 1× wash buffer II at room temperature with gentle shaking. 80 μl of detection antibody cocktail was added to each well and incubated at room temperature for 2 hours. The slide was washed 5 times (5 min each time) with 150 μl of 1× wash buffer I, and then 2 times (5 min each). each time) with 150 μl of 1× wash buffer II at room temperature with gentle shaking. Eighty microliters of streptavidin conjugated to an equivalent Cy3 dye was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. After 5 washes (5 minutes each time), the signal was visualized using a laser scanner. The data was then visualized using a heat map diagram (www.metaboanalyst.ca).
Получение срезов головного мозга. Мышам проводили транскардиальную перфузию 0,9% NaCl после глубокой анестезии пентобарбиталом (100 мг/кг, в/б). Ткани головного мозга быстро извлекали, замораживали и хранили при -70 °C. Получали серийные фронтальные срезы головного мозга (толщиной 12 мкм) с использованием нарезающего на срезы замораживающего микротома (Leica Microsystems), помещали на предметные стекла и сушили в течение ночи на воздухе при комнатной температуре. Срезы тканей хранили при -70°C использовали сразу. Obtaining brain slices . Mice were transcardially perfused with 0.9% NaCl after deep anesthesia with pentobarbital (100 mg/kg, i.p.). Brain tissues were quickly removed, frozen and stored at -70°C. Serial coronal brain sections (12 μm thick) were prepared using a freezing microtome slicer (Leica Microsystems), mounted on glass slides, and air-dried overnight at room temperature. Tissue sections were stored at -70°C and used immediately.
Лазерная микродиссекция и анализ с использованием к-ПЦР. Замороженные образцы головного мозга мыши нарезали на срезы и собирали на предметных стеклах с мембраной из PEN (Leica, 11600288). Гиппокамп извлекали посредством микроскопии с лазерной диссекцией (Leica Microsystems, LMD6). РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004) и подвергали обратной транскрипции в кДНК (Takara, PrimeScript RT Master Mix, RR036A). К-ПЦР проводили с использованием системы ABI 7500 способом SYBR (Takara, SYBR Premix Ex Taq II). Использовали следующие праймеры: синаптофизин-прямой: CAGTTCCGGGTGGTCAAGG; синаптофизин-обратный: ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC; актин-прямой: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT; актин-обратный: AGGTCTTTACGGAT GTCAACG. Laser microdissection and q-PCR analysis . Frozen mouse brain samples were sectioned and collected on PEN membrane slides (Leica, 11600288). The hippocampus was removed by laser dissection microscopy (Leica Microsystems, LMD6). RNA was extracted using the RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004) and reverse transcribed into cDNA (Takara, PrimeScript RT Master Mix, RR036A). Q-PCR was performed using the ABI 7500 system using the SYBR method (Takara, SYBR Premix Ex Taq II). The following primers were used: synaptophysin-forward: CAGTTCCGGGTGGTCAAGG; synaptophysin-reverse: ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC; actin-direct: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT; actin-reverse: AGGTCTTTACGGAT GTCAACG.
Статистический анализ. В поведенческом тесте животных случайным образом распределяли на различные группы. Для сравнений двух групп использовали непарный двухсторонний t-критерий Стьюдента. Для сравнения более чем двух групп выполняли односторонний ANOVA или двухсторонний ANOVA с последующим тестом Даннета. Все данные с планками погрешностей представлены в качестве среднего значения ± sem. Статистически значимым считали P < 0,05. Большинство данных анализировали в GraphPad Prism. Для количественного определения изображений Iba-1-положительные, Aβ42-положительные и положительные по фосфорилированному тау клетки анализировали посредством ImageJ v1.8.0 с регистрацией "площади". Statistical analysis . In the behavioral test, animals were randomly assigned to different groups. An unpaired two-tailed Student's t test was used for comparisons between two groups. To compare more than two groups, one-way ANOVA or two-way ANOVA followed by Dunnett's test was performed. All data with error bars are presented as mean ± s.e.m. P < 0.05 was considered statistically significant. Most data were analyzed in GraphPad Prism. For image quantification, Iba-1-positive, Aβ42-positive, and phosphorylated tau-positive cells were analyzed using ImageJ v1.8.0 with “area” recording.
Поведенческие тесты. Проводили следующие поведенческие тесты: водный лабиринт Морриса (водный лабиринт Морриса, MWM), Y-лабиринт и приподнятый крестообразный лабиринт (EPM). Все перемещения регистрировали с использованием камеры и программное обеспечение (Jiliang) использовали для вычисления соответствующих параметров. Behavioral tests . The following behavioral tests were administered: Morris water maze (Morris water maze, MWM), Y-maze, and elevated plus maze (EPM). All movements were recorded using a camera, and software (Jiliang) was used to calculate the corresponding parameters.
Тест MWM используют для определения пространственного обучения и памяти в соответствии с протоколом, опубликованным ранее. В кратком изложении, мышей подвергали экспериментам для получения данных в течение 6 суток, и для каждой мыши проводили 3 испытания каждый день. Животных выпускали в воду в желаемом стартовом положении и определяли латентность поиска платформы. На 7-е сутки платформу удаляли и мышам позволяли плавать в течение 60 секунд. Траекторию и количество пересечений областей платформ регистрировали с использованием видеокамеры.The MWM test is used to measure spatial learning and memory according to a previously published protocol. Briefly, mice were subjected to data acquisition experiments for 6 days, and 3 trials were performed each day for each mouse. Animals were released into the water at the desired starting position and the latency to find the platform was determined. On
Рабочую память оценивали посредством Y-лабиринта в соответствии с литературой с некоторыми модификациями. Y-состоял из трех идентичных звеньев (A, B, C) с разными ключами. Мышей помещали в стартовое звено (A) и регистрировали последовательность исследованных звеньев (такую как ABCBA). Общее количество вхождений в звенья и изменения поведения регистрировали с использованием видеокамеры. Точность в Y-лабиринте представляла собой соотношение между правильным чередованием и общим чередованием.Working memory was assessed using the Y-maze according to the literature with some modifications. Y-consisted of three identical links (A, B, C) with different keys. Mice were placed in the starting link (A) and the sequence of the tested links (such as ABCBA) was recorded. The total number of unit entries and behavioral changes were recorded using a video camera. Accuracy in the Y-maze was the ratio between correct alternation and overall alternation.
Тест EPM широко используется для оценки тревожности у животных и состоит из двух открытых звеньев (30 см × 6 см), двух закрытых звеньев (30 см × 6 см × 22 см) и центральной области (6 см × 6 см). Каждую мышь помещали в центр лабиринтом в сторону закрытого звена, и позволяли исследовать лабиринт в течение 5 минут. Траекторию регистрировали и вычисляли частоту посещений открытого звена, которая негативно коррелировала с тревожностью мышей.The EPM test is widely used to assess anxiety in animals and consists of two open sections (30 cm × 6 cm), two closed sections (30 cm × 6 cm × 22 cm) and a central region (6 cm × 6 cm). Each mouse was placed in the center of the maze, facing the closed arm, and allowed to explore the maze for 5 min. The trajectory was recorded and the frequency of visits to the open link was calculated, which negatively correlated with anxiety in mice.
ПримерыExamples
Пример 1: Прогрессирование AD ассоциировано с изменением кишечной микробиоты и инфильтрацией иммунных клетокExample 1: Progression of AD is associated with changes in gut microbiota and infiltration of immune cells
Для оценки роли изменения кишечной микробиоты в патогенезе AD авторы изобретения использовали модель с трансгенными мышами (Tg) 5XFAD, которая широко используется в исследованиях AD вследствие ее быстрого начала и правдоподобного воспроизведения множества ассоциированных с AD патологических признаков и клинических фенотипов. Она демонстрирует нарушение памяти на 4-м месяце после рождения, поведенческие изменения на 7-м месяце и утрату нейронов на 9-м месяце. В качестве контролей использовали совпадающих по возрасту мышей дикого типа (WT) из той же линии, выращенных в тех же условиях. В соответствии с предшествующими сообщениями, авторы изобретения выявили изменения отложения бляшек Aβ, фосфорилирования тау, экспрессии синаптофизина, поведения и т.п. В частности, отложение бляшек Aβ в коре и гиппокампе быстро накапливается, начиная с 3-го месяца после рождения (фиг. 7a). Фосфорилирование тау в головном мозге мышей Tg сначала было обнаружено на 5-месяце, и оно постепенно возрастало с увеличением возраста (фиг. 7b); уровень экспрессии синаптофизина в гиппокампе значительно снижался с 7-го по 9-й месяцы, что указывает на синаптическую дегенерацию (фиг. 1a). Поведенческий тест у мышей Tg продемонстрировало значительное ухудшение обучения различению в возрасте 9 месяцев (фиг. 1b). Следует отметить, что ранние (2-3 месяца) и поздние (7-9 месяцев) стадии у мышей Tg в рамках настоящего изобретения имеют не тот же принцип, что и поздние стадии клинической AD у человека. Поздняя стадия у мышей Tg является симптоматически сравнимой с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD у человека. Таким образом, в рамках настоящего изобретения пациентов с MCI вследствие AD используют в качестве индивидуумов для проведения исследований у человека.To evaluate the role of altered gut microbiota in the pathogenesis of AD, we used the 5XFAD transgenic (Tg) mouse model, which is widely used in AD research due to its rapid onset and plausible replication of multiple AD-associated pathological features and clinical phenotypes. She demonstrates memory impairment at 4 months postnatal, behavioral changes at 7 months, and neuronal loss at 9 months. Age-matched wild-type (WT) mice from the same strain raised under the same conditions were used as controls. Consistent with previous reports, we identified changes in Aβ plaque deposition, tau phosphorylation, synaptophysin expression, behavior, and the like. In particular, Aβ plaque deposition in the cortex and hippocampus accumulates rapidly starting at 3 months postnatally (Fig. 7a). Tau phosphorylation in the brain of Tg mice was first detected at 5 months and gradually increased with increasing age (Fig. 7b); the expression level of synaptophysin in the hippocampus decreased significantly from
Заметный сдвиг композиции микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD у мышей Tg был выявлен при дальнейшем анализе главных компонентов (PCA) для серии моментов времени, в то время как практически никаких изменений не наблюдали у мышей WT с течением времени (фиг. 1c; фиг. 7c).A marked shift in gut microbiota composition during AD progression in Tg mice was revealed by further principal component analysis (PCA) across a series of time points, while virtually no change was observed in WT mice over time (Figure 1c; Figure 7c ).
С использованием OTU для отслеживания динамики содержания различных бактериальных типов у мышей Tg авторы изобретения обнаружили два характерных изменения профилей кишечной микробиоты у мышей Tg в ходе прогрессирования заболевания. В возрасте 2-3 месяцев Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia были тремя из наиболее распространенных типов бактерий (46,8%, 32,3% и 12,6%, соответственно). В возрасте 7-9 месяцев Firmicutes стали преобладающими бактериями, в то время как содержание Bacteroidetes и Verrucomicrobia значительно снижалось, что указывает на изменение типов бактерий (фиг.1d). Авторы изобретения далее исследовали репрезентативные бактерии из мышей Tg в каждый момент времени (фиг. 7d, фиг. 7e). Эти результаты показали, что кишечная микробиота мышей Tg была в высокой степени динамичной, что в значительной степени отличается от мышей WT. Сходные результаты также были получены в модели на дважды трансгенных мышах APP/PS1, другой широко используемой модели для исследования AD (фиг. 7f, фиг. 7g).Using OTUs to track the dynamics of different bacterial phyla in Tg mice, we discovered two characteristic changes in gut microbiota profiles in Tg mice during disease progression. At 2–3 months of age, Bacteroidetes, Firmicutes , and Verrucomicrobia were three of the most common bacterial phyla (46.8%, 32.3%, and 12.6%, respectively). At 7–9 months of age, Firmicutes became the predominant bacteria, while Bacteroidetes and Verrucomicrobia decreased significantly, indicating a change in bacterial types (Fig. 1d). We further examined representative bacteria from Tg mice at each time point (Fig. 7d, Fig. 7e). These results indicated that the gut microbiota of Tg mice was highly dynamic, which is largely different from WT mice. Similar results were also obtained in the APP/PS1 double transgenic mouse model, another widely used model for AD research (Fig. 7f, Fig. 7g).
Авторы изобретения предположили, что наблюдаемое изменение кишечной микробиоты в ходе прогрессирования AD может быть ассоциировано с нейровоспалением. Для тестирования этой гипотезы авторы изобретения оценили воспалительный статус у мышей Tg. Иммунное окрашивание на IBA1, являющегося характерным признаком активации микроглии, в срезах головного мозга мышей с AD продемонстрировало две очевидных стадии активации микроглии, на 3-м месяце и 7-9-м месяцах, соответственно (фиг.1e). Учитывая, что активация микроглии может быть отнесена к двум противоположным типам, провоспалительный подтип M1 и нейропротективный подтип M2, авторы изобретения также тщательно охарактеризовали фенотипы M1 и M2. На ранней стадии в возрасте 2-3 месяцев происходило повышение уровня как клеток M1, так и клеток M2 микроглии. В следующие месяцы уровень клеток подтипа M1 продолжал возрастать и достигал пика через 7-9 месяцев, в то время как уровень клеток микроглии типа M2 снижалось с 3 по 5 месяцы и оставалось на низком уровне после этого (фиг. 1f). Можно видеть, что, по мере прогрессирования AD мышей Tg с течением времени провоспалительный подтип микроглии M1 в головном мозге изменялся от сравнимого с нейропротективным подтипом микроглии M2 (фиг.1f, 2-3 месяца) до преобладающего в микроглии (фиг. 1f, 5-9 месяцев) и происходило повышение общей активации микроглии (фиг. 1e, 5-9 месяцев).We hypothesized that the observed change in gut microbiota during AD progression may be associated with neuroinflammation. To test this hypothesis, we assessed the inflammatory status in Tg mice. Immunostaining for IBA1, a hallmark of microglial activation, in brain sections from AD mice demonstrated two apparent stages of microglial activation, at 3 months and 7–9 months, respectively (Figure 1e). Given that microglial activation can be classified into two opposing types, the pro-inflammatory M1 subtype and the neuroprotective M2 subtype, we also carefully characterized the M1 and M2 phenotypes. At an early stage at 2–3 months of age, there was an increase in both M1 and M2 microglial cells. In the following months, the level of M1 subtype cells continued to increase and peaked at 7–9 months, while the level of M2 microglial cells decreased from
В дополнение к активации микроглии, известно, что AD-ассоциированное нейровоспаление вовлекает инфильтрацию периферических иммунных клеток. Таким образом, авторы изобретения также проанализировали инфильтрацию периферических иммунных клеток в головной мозг в ходе прогрессирования AD. Было обнаружено, что уровень CD45high клеток в головном мозге был значимо более высоким у мышей Tg, чем у мышей WT, аналогично результату окрашивания IBA1 (фиг. 1g). Подтипы клеток CD45high в ходе серии моментов времени далее анализировали в ходе прогрессирования AD, что продемонстрировало изменение CD4+ T-клеток, поскольку основная часть CD45high клеток имеет сходную тенденцию к изменению с IBA1 (фиг. 1h-i). На протяжении периода времени, исследованного авторами изобретения, инфильтрирующие Th1- и Th2-клетки, два основных подтипа CD4+ клеток, демонстрировали сходную динамику с клетками микроглии M1 и M2 (фиг. 1j). Можно видеть, что при прогрессировании AD у мышей Tg с течением времени Th1 изменялись от сравнимых с Th2 (фиг. 1j, 2-3 месяца) до преобладающих в CD4+ T-клетках (фиг. 1j, 5-9 месяцев) и происходило общее повышение уровня CD4+ T-клеток (фиг.1i, 5-9 месяцев).In addition to microglial activation, AD-associated neuroinflammation is known to involve the infiltration of peripheral immune cells. Thus, we also analyzed the infiltration of peripheral immune cells into the brain during AD progression. It was found that the level of CD45 high cells in the brain was significantly higher in Tg mice than in WT mice, similar to the result of IBA1 staining (Fig. 1g). CD45 high cell subtypes over a series of time points were further analyzed during AD progression, demonstrating CD4 + T cell changes as the bulk of CD45 high cells showed a similar pattern of change to IBA1 (Figure 1h-i). Over the time period studied by us, infiltrating Th1 and Th2 cells, the two major subtypes of CD4 + cells, showed similar dynamics to M1 and M2 microglial cells (Figure 1j). It can be seen that as AD progressed in Tg mice over time, Th1 changed from comparable to Th2 (Fig. 1j, 2-3 months) to predominant in CD4 + T cells (Fig. 1j, 5-9 months) and there was a general increased levels of CD4 + T cells (Fig. 1i, 5-9 months).
Таким образом, авторы изобретения поняли, что, поскольку паттерн кишечной микробы изменялся, популяция иммунных клеток имела тенденцию к изменению на Th1- и M1-преобладающее состояние, особенно поразительным является значение этих изменений с течением времени (фиг.1d-j). Сходные результаты также были обнаружены в модели на мышах APP/PS1 (фиг.8, фиг.7i, фиг.7j, фиг.23). Следует отметить, что модель на мышах APP/PS1 и модель на трансгенных мышах (Tg) 5XFAD отличаются в отношении прогрессирования AD с течением времени. Мыши Tg имеют очевидное отложение Aβ в возрасте 5 месяцев (фиг.7a), в то время как мыши APP/PS1 не имеют очевидных отложений Aβ в возрасте 5 месяцев (фиг.8a). Изменения кишечных микробов в этих двух моделях с течением времени (фиг.1d, фиг.7g) не являются полностью устойчивыми, что отражает внутривидовое и межиндивидуальное прогрессирование AD и отличия кишечных микробов, однако все они демонстрируют корреляцию между изменениями паттернов кишечных микробов и изменениями иммунных клеток с течением времени.Thus, we realized that as the gut microbial pattern changed, the immune cell population tended to change to a Th1- and M1-dominant state, particularly striking is the significance of these changes over time (Figure 1d-j). Similar results were also found in the APP/PS1 mouse model (Fig. 8, Fig. 7i, Fig. 7j, Fig. 23). It should be noted that the APP/PS1 mouse model and the 5XFAD transgenic (Tg) mouse model differ with respect to AD progression over time. Tg mice have obvious Aβ deposits at 5 months of age (Figure 7a), while APP/PS1 mice have no obvious Aβ deposits at 5 months of age (Figure 8a). Changes in gut microbes in these two models over time (Figure 1d, Figure 7g) are not entirely consistent, reflecting intra- and inter-individual progression of AD and differences in gut microbes, but they all show a correlation between changes in gut microbe patterns and changes in immune cells over time.
Авторы изобретения также проанализировали корреляцию между содержанием кишечной микробиоты и частотой иммунных клеток в головном мозге, и отметили, что ранняя (2-3 месяца) бактериальная композиция в высокой степени коррелирует с количествами клеток M2 и Th2 в головном мозге (фиг. 1k, верх), однако изменения бактериального паттерна в высокой степени коррелировали с клетками M1 и Th1 (фиг. 1k, низ). Бактерии, которые были в значительной степени взаимосвязаны с иммунными клетками, приведены на правой панели фиг. 1k, вновь подтверждая корреляцию между паттерном кишечной микробиоты и иммунными клетками, особенно Th1 и M1.We also analyzed the correlation between gut microbiota content and the frequency of immune cells in the brain, and noted that early (2-3 months) bacterial composition was highly correlated with the numbers of M2 and Th2 cells in the brain (Figure 1k, top). , however, bacterial pattern changes were highly correlated with M1 and Th1 cells (Fig. 1k, bottom). Bacteria that were significantly associated with immune cells are shown in the right panel of Fig. 1k, again confirming the correlation between gut microbiota pattern and immune cells, especially Th1 and M1.
В целом, эти результаты показали, что кишечные бактерии ассоциированы с инфильтрацией периферических иммунных клеток и возникновением нейровоспаления в ходе прогрессирования AD, исследование которых описано далее.Overall, these results indicated that gut bacteria are associated with peripheral immune cell infiltration and neuroinflammation during the progression of AD, studies of which are described below.
Пример 2: Изменения кишечной микробиоты приводят к чрезмерной инфильтрации Th1-клеток и чрезмерной активации клеток микроглии M1 в головном мозгеExample 2: Changes in Gut Microbiota Lead to Excessive Th1 Cell Infiltration and Excessive M1 Microglial Cell Activation in the Brain
Для определения того, требуется ли изменение кишечной микробиоты для запуска инфильтрации периферических иммунных клеток и в свою очередь нейровоспаления при прогрессировании AD, авторы изобретения использовали коктейль антибиотиков, содержавший ампициллин (0,1 мг/мл), стрептомицин (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл) у мышей Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев) для сокращения кишечной микробиоты. Введение антибиотика у мышей Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев) приводило к выраженному сокращению как микробного разнообразия, так и содержания в кишечнике (фиг. 2a).To determine whether changes in the gut microbiota are required to trigger peripheral immune cell infiltration and in turn neuroinflammation during AD progression, we used an antibiotic cocktail containing ampicillin (0.1 mg/ml), streptomycin (0.5 mg/ml) and colistin (0.1 mg/ml) in late-stage Tg mice (7 months of age) to reduce gut microbiota. Administration of the antibiotic to Tg mice at a late stage (at 7 months of age) resulted in a marked reduction in both microbial diversity and abundance in the gut (Fig. 2a).
Вместе с этим изменением авторы изобретения выявили снижение уровня как инфильтрирующих провоспалительных Th1-клеток (фиг. 2b), так и клеток M1 (фиг. 2c) в головном мозге. Это предварительно показывает, что, посредством препятствования распределению кишечных микробов у мышей AD может быть изменено преобладающее состояние Th1 и M1 у мышей с AD поздней стадии, что указывает на причинно-следственную взаимосвязь между изменениями кишечных микробов и изменениями иммунных клеток.Concomitant with this change, we detected a decrease in the levels of both infiltrating pro-inflammatory Th1 cells (Figure 2b) and M1 cells (Figure 2c) in the brain. This tentatively shows that by interfering with the distribution of gut microbes in AD mice, the predominant Th1 and M1 state in late-stage AD mice can be reversed, indicating a causal relationship between changes in gut microbes and changes in immune cells.
Кроме того, эти данные были подтверждены посредством эксперимента с совместным содержанием. Мышей WT совместно содержали с мышами Tg того же возраста в течение 7 месяцев с рождения. Совместно содержащиеся мыши WT демонстрировали снижение обучения различению, сравнимое с мышами Tg (фиг. 9a). Для установления причин этого, анализ изменения кишечной микробиоты у этих мышей в возрасте 7 месяцев показал, что композиция кишечной микробиоты была довольно сходной между совместно содержащимися мышами WT и мышами Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев), но значительно отличалась от мышей WT того же возраста, содержащихся отдельно (фиг. 2d), что указывает на то, что длительное воздействие на мышей WT бактерий Tg (т.е. модель кишечных микробов при AD у мышей Tg) вызывало сдвиг композиции кишечной микробиоты у мышей WT в направлении мышей Tg, и в то же время вызывало снижение когнитивных функций. Это позволяет предложить стратегию для создания модели AD, которая отличается от общепринятой схемы, т.е. посредством регуляции паттерна кишечной микробиоты модели WT для изменения на микробиоту модели AD.Additionally, these findings were confirmed through a co-content experiment. WT mice were cohoused with age-matched Tg mice for 7 months from birth. Cohoused WT mice showed a reduction in discrimination learning comparable to Tg mice (Fig. 9a). To determine the reasons for this, analysis of changes in the gut microbiota in these mice at 7 months of age showed that the composition of the gut microbiota was quite similar between housed WT mice and late stage Tg mice (at 7 months of age), but was significantly different from that of WT mice. same age housed alone (Figure 2d), indicating that long-term exposure of WT mice to Tg bacteria (i.e., a Tg mouse model of AD gut microbes) caused a shift in gut microbiota composition in WT mice towards Tg mice , and at the same time caused a decrease in cognitive functions. This allows us to propose a strategy for creating an AD model that differs from the conventional one, i.e. by regulating the gut microbiota pattern of the WT model to change to that of the AD model.
Более того, уровни инфильтрирующих Th1-клеток между совместно содержащимися мышами WT и Tg также были сравнимыми, что в обоих случаях значительно превышало уровни у отдельно содержащихся мышей WT (фиг. 2e). Между тем, уровни клеток M1 возрастали у совместно содержащихся мышей WT (фиг. 2f). Одновременно с изменением иммунных клеток экспрессия цитокинов в головном мозге продемонстрировала выраженное сходство между совместно содержащимися мышами WT и Tg, но отличалась от их экспрессии у мышей WT (фиг. 2g).Moreover, the levels of infiltrating Th1 cells between cohoused WT and Tg mice were also comparable, in both cases significantly exceeding the levels in single housed WT mice (Fig. 2e). Meanwhile, M1 cell levels increased in cohoused WT mice (Fig. 2f). Concomitant with the change in immune cells, cytokine expression in the brain showed marked similarity between cohoused WT and Tg mice, but was different from their expression in WT mice (Fig. 2g).
Таким образом, приведенное выше описание подтвердило, что путем изменения кишечной микробиоты мышей WT на кишечную микробиоту мышей Tg, клетки Th1 и M1 мышей WT преобразовывались в состояние, сходное с состоянием у мышей Tg, что приводило к сходному снижению когнитивных способностей, и также подтверждению причинно-следственной взаимосвязи между изменениями кишечной микробиоты и изменением иммунных клеток, а также когнитивной функции.Thus, the above description confirmed that by changing the gut microbiota of WT mice to the gut microbiota of Tg mice, the Th1 and M1 cells of WT mice were transformed into a state similar to that of Tg mice, resulting in a similar decline in cognitive abilities, and also confirming the cause -consecutive relationship between changes in intestinal microbiota and changes in immune cells, as well as cognitive function.
Более того, авторы изобретения использовали мышей C57BL/6WT для создания модели для демонстрации терапевтической ценности описанного выше способа. Авторы изобретения провели эксперименты по трансплантации фекальной микробиоты (FMT) с использованием мышей C57BL/6 WT, и результаты представлены в столбцах 6-10 фиг. 16.Moreover, the inventors used C57BL/6WT mice to create a model to demonstrate the therapeutic value of the method described above. We performed fecal microbiota transplantation (FMT) experiments using C57BL/6 WT mice and the results are presented in columns 6-10 of FIG. 16.
Мышам C57BL/6WT вводили антибиотики для обеспечения первоначальной среды для последующей трансплантации фекальной микробиоты. Агрегированный Aβ инъецировали в их гиппокамп, а затем перорально вводили фекальные бактерии от мышей Tg в возрасте от 7 до 9 месяцев ("Receptor_C57_ Receiving TG Fecal Bacteria") или фекальные бактерии от мышей WT мышей ("Receptor_C57_Receive WT Fecal Bacteria") в качестве контроля. Это приводило к значительному повышению уровня Th1-клеток и значительному снижению уровня Th2 в головном мозге по сравнению с контролем (фиг.9b), что согласовывалось с изменениями у мышей Tg, описанными выше. Это доказало, что трансплантация фекалий Tg может приводить к изменению паттерна кишечных микроорганизмов у мышей WT, что также приводит к изменению паттерна иммунных клеток.C57BL/6WT mice were treated with antibiotics to provide an initial environment for subsequent fecal microbiota transplantation. Aggregated Aβ was injected into their hippocampus, followed by oral administration of fecal bacteria from 7 to 9 month old Tg mice (“Receptor_C57_ Receiving TG Fecal Bacteria”) or fecal bacteria from WT mice (“Receptor_C57_Receive WT Fecal Bacteria”) as a control . This resulted in a significant increase in Th1 cell levels and a significant decrease in Th2 levels in the brain compared to controls (Figure 9b), which was consistent with the changes in Tg mice described above. This proved that Tg fecal transplantation could lead to a change in the pattern of intestinal microorganisms in WT mice, which also leads to a change in the pattern of immune cells.
С другой стороны, напротив, трансплантация фекалий от мышей WT с нормальным паттерном распределения кишечных микроорганизмов снижала уровень Th1-клеток в головном мозге реципиентных мышей Tg (фиг.9c). Это показало, что паттерн кишечных микробов мышей Tg изменяется относительно паттерна кишечных микробов у мышей WT, и также изменяется паттерн иммунных клеток.On the other hand, in contrast, fecal transplantation from WT mice with a normal gut microbial distribution pattern reduced the level of Th1 cells in the brains of recipient Tg mice (Figure 9c). This showed that the gut microbe pattern of Tg mice changes relative to the gut microbe pattern of WT mice, and the pattern of immune cells also changes.
Эти результаты вновь подтвердили причинно-следственную взаимосвязь между изменениями кишечной микробиоты и изменениями иммунных клеток головного мозга (особенно Th1/M1) и когнитивной функции при прогрессировании AD. Для лечения AD была предложена и подтверждена стратегия использования оси головной мозг-кишечник.These results reaffirmed the causal relationship between changes in gut microbiota and changes in brain immune cells (especially Th1/M1) and cognitive function during AD progression. The strategy of using the brain-gut axis has been proposed and validated for the treatment of AD.
Взятые вместе, эти данные указывают на то, что изменение кишечной микробиоты запускает инфильтрацию периферических иммунных клеток и нейровоспалительную активацию при прогрессировании AD. Путем введения средств (например, фекалий WT с нормальными паттернами распределения кишечных микроорганизмов или OM1, проиллюстрированного ниже), регулирующих относительное содержание кишечных микробов, мышам Tg, распределение кишечных микробов которых демонстрирует связанный с заболеванием паттерн, происходила реорганизация распределения кишечных микроорганизмов у мышей Tg в направлении раннего и нормального распределения кишечных микроорганизмов. Это эффективно обращало вспять паттерн иммунных клеток с преобладанием Th1/M1 у мышей Tg, тем самым улучшая когнитивную функцию и осуществляя лечение AD. Это обеспечивает надежное основание и убедительные доказательства для дальнейшего улучшения когнитивной функции и лечения AD путем реорганизации распределения кишечных микроорганизмов у людей-пациентов с AD (например, стратегия использования средств для регуляции относительного содержания кишечных микроорганизмов) для обращения вспять паттерна иммунных клеток; а также для применения распределения кишечных микроорганизмов и/или статуса иммунных клеток (например, статуса Th1 (например, доля в популяции), статуса M1 (например, доля в популяции)) в качестве маркеров прогрессирования AD.Taken together, these data indicate that changes in the gut microbiota trigger peripheral immune cell infiltration and neuroinflammatory activation during AD progression. By administering agents (eg, WT feces with normal gut microbial distribution patterns, or OM1, illustrated below) that regulate the relative abundance of gut microbes to Tg mice whose gut microbial distribution exhibits a disease-related pattern, the gut microbial distribution of Tg mice was reorganized toward early and normal distribution of intestinal microorganisms. This effectively reversed the Th1/M1 dominant immune cell pattern in Tg mice, thereby improving cognitive function and treating AD. This provides a strong basis and compelling evidence to further improve cognitive function and treat AD by reorganizing the distribution of intestinal microorganisms in human patients with AD (eg, the strategy of using agents to regulate the relative abundance of intestinal microorganisms) to reverse the pattern of immune cells; and to use gut microbial distribution and/or immune cell status (eg, Th1 status (eg, population proportion), M1 status (eg, population proportion)) as markers of AD progression.
Пример 3: OM1 облегчает нейровоспаление посредством регуляции кишечной микробиотыCase Study 3: OM1 Ameliorates Neuroinflammation by Regulating Gut Microbiota
Незаменимая роль кишечной микробиоты при прогрессировании AD, показанная в настоящем описании, может указывать на терапевтические последствия вмешательства в микробиоту кишечника. Чтобы вновь это подтвердить, авторы изобретения использовали OM1, который является клинически одобренным лекарственным средством против AD, экстрагированным из коричневых водорослей. OM1 представляет собой смесь кислых линейных олигосахаридов со степенью полимеризации в диапазоне от димера до декамера со средней молекулярной массой приблизительно 1 кДа (фиг.3a).The essential role of the gut microbiota in AD progression demonstrated herein may indicate the therapeutic implications of interfering with the gut microbiota. To reaffirm this, we used OM1, which is a clinically approved anti-AD drug extracted from brown algae. OM1 is a mixture of acidic linear oligosaccharides with degrees of polymerization ranging from dimer to decamer with an average molecular weight of approximately 1 kDa (Fig. 3a).
У модельных мышей с APP/PS1 поздней стадии AD в возрасте от 9 месяцев до 12 месяцев, которым вводили OM1 в течение 3 месяцев, OM1 демонстрировал выраженный эффект смягчения когнитивного расстройства, как показано посредством усиленного пространственного обучения, и характеристик памяти у мышей APP/PS1 как в обучающем испытании (фиг.3b), так и в пробном испытании (фиг. 3c) в задании с водным лабиринтом Морриса (MWM). OM1 также значительно улучшал результаты мышей в Y-лабиринте (фиг.3d). Недавно OM1 показал терапевтический эффект в отношении обращения вспять нарушения состояния у пациентов с AD в 36-недельном мультицентровом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом клиническом испытании фазы 3 (код клинического испытания: CTR20140274) в Китае. Авторы изобретения интересовались пониманием того, демонстрирует ли OM1 эффект улучшения когнитивной функции путем влияния на микробиоту пациентов с AD.In APP/PS1 late-stage AD mouse model aged 9 months to 12 months that were treated with OM1 for 3 months, OM1 exhibited a significant effect of alleviating cognitive impairment, as demonstrated by enhanced spatial learning, and memory performance in APP/PS1 mice. in both the training trial (Fig. 3b) and the test trial (Fig. 3c) in the Morris water maze (MWM) task. OM1 also significantly improved mice's performance in the Y-maze (Figure 3d). Recently, OM1 showed a therapeutic effect in reversing impairment in AD patients in a 36-week, multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled,
Интересно, что пероральное введение OM1 в течение одного месяца мышам Tg на поздней стадии, начиная в возрасте 7 месяцев изменяло состав кишечной микробиоты (фиг. 4a-b; фиг.10a), восстанавливая его в направлении паттерна WT (фиг.13-14; фиг.16).Interestingly, oral administration of OM1 for one month to late-stage Tg mice starting at 7 months of age altered the composition of the gut microbiota (Fig. 4a-b; Fig. 10a), restoring it towards the WT pattern (Fig. 13-14; Fig.16).
Наряду с изменением кишечной микробиоты, введение OM1 мышам Tg нарушало корреляцию между количествами лимфоцитов в головном мозге и изменением кишечных бактерий (фиг.4c; фиг.10b и c), снижало уровни Th1-клеток в головном мозге (фиг.4d), значительно снижало активацию микроглии до уровней, сходных с мышами WT (фиг.4e) и снижало уровни цитокинов в головном мозге (фиг.4f), восстанавливая их в направлении паттерна WT (фиг.15). Параллельно, введение OM1 значимо снижало отложение бляшек Aβ, фосфорилирование тау и снижение обучения различению, наблюдаемое у мышей Tg (фиг.4g-i). Это вновь подтвердило стратегию восстановления распределения кишечных микробов, например, с использованием средств для регуляции относительного содержания кишечных микробов, для обращения вспять паттерна иммунных клеток, тем самым улучшая состояния и осуществляя лечение AD.Along with changes in gut microbiota, administration of OM1 to Tg mice disrupted the correlation between brain lymphocyte counts and changes in gut bacteria (Figure 4c; Figures 10b and c), reduced Th1 cell levels in the brain (Figure 4d), and significantly reduced activated microglia to levels similar to WT mice (Figure 4e) and reduced cytokine levels in the brain (Figure 4f), restoring them towards the WT pattern (Figure 15). In parallel, OM1 administration significantly reduced Aβ plaque deposition, tau phosphorylation, and reduced discrimination learning observed in Tg mice (Fig. 4g-i). This again supported the strategy of restoring the distribution of gut microbes, for example, using agents to regulate the relative abundance of gut microbes to reverse the pattern of immune cells, thereby improving conditions and treating AD.
Далее авторы изобретения провели трансплантацию фекальной микрофлоры (FMT), трансплантируя фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, реципиентным мышам C57BL/6 WT, которым проводили внутрижелудочковую инъекцию агрегированного Aβ. Фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, приводили к снижению уровня Th1-клеток головного мозга реципиентных мышей по сравнению с мышами Tg без введения OM1 (фиг.10e). Можно видеть, что фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, и фекалии мышей WT, проверенные в примере 2, имеют сходный эффект на восстановления распределения кишечных микробов и снижение Th1, что подтверждает эффект восстановления OM1 на кишечные микробы мышей Tg. В соответствии с этим, введение антибиотиков снижало эффект OM1 на клетки Th1, уровни IBA1 и экспрессию цитокинов в модели на мышах APP/PS1 (фиг.10f-j). Все эти данные показали, что OM1 может облегчать нейровоспаление и снижение когнитивной функции посредством модулирования дисбиоза кишечника.We next performed fecal microbiome transplantation (FMT) by transplanting feces from OM1-treated Tg mice into recipient C57BL/6 WT mice that received an intraventricular injection of aggregated Aβ. Feces from Tg mice administered OM1 resulted in decreased levels of brain Th1 cells in recipient mice compared to Tg mice without OM1 administration (Figure 10e). It can be seen that the feces of Tg mice administered OM1 and the feces of WT mice tested in Example 2 have a similar effect on restoring gut microbe distribution and reducing Th1, which confirms the effect of restoring OM1 on the gut microbes of Tg mice. Consistent with this, antibiotic administration reduced the effect of OM1 on Th1 cells, IBA1 levels and cytokine expression in the APP/PS1 mouse model (Fig. 10f-j). All these data suggested that OM1 may alleviate neuroinflammation and cognitive decline through modulating gut dysbiosis.
Как правило, приведенные выше эксперименты на мышах in vivo полностью подтвердили изменения кишечных микробов и их тенденцию к регуляции преобладания иммунных клеток Th1/M1 и его обращения вспять при когнитивных нарушениях, таких как AD, и их улучшениях, для каскадов регуляции оси головной мозг-кишечник при AD и способов лечения с вмешательством в них. Кроме того, такие регуляторные каскады и вмешательства стабильно демонстрируются в различных моделях на мышах (модель на трансгенных (Tg) 5XFAD, модель на мышах APP/PS1, модель на мышах C57BL/6), хотя существуют определенные внутривидовые и межиндивидуальные различия в первоначальном состоянии и переходе процесса для кишечных микробов среди этих мышей. Таким образом, общность таких регуляторных каскадов и вмешательств у различных индивидуумов полностью подтверждается. Таким образом, предлагается стратегия улучшения когнитивной функции и лечения AD посредством регуляции кишечных микробов для восстановления кишечных микробов к нормальному и здоровому состоянию с целью обращения вспять состояния опосредуемого иммунными клетками заболевания.Generally, the above in vivo mouse experiments have fully confirmed the changes in gut microbes and their tendency to regulate Th1/M1 immune cell predominance and its reversal in cognitive impairments such as AD and their ameliorations for brain-gut axis regulatory cascades for AD and treatment methods with intervention in them. In addition, such regulatory cascades and interventions are consistently demonstrated in various mouse models (transgenic (Tg) 5XFAD mouse model, APP/PS1 mouse model, C57BL/6 mouse model), although there are some intraspecific and interindividual differences in the initial state and transition process for gut microbes among these mice. Thus, the commonality of such regulatory cascades and interventions across different individuals is fully confirmed. Thus, a strategy is proposed to improve cognitive function and treat AD by regulating gut microbes to restore gut microbes to a normal and healthy state to reverse the immune cell-mediated disease state.
Авторы изобретения использовали данные для пациентов с AD и здоровых контролей для сравнения и анализа связанных с осью головной мозг-кишечник при AD микроорганизмов, которые различаются между этими двумя моделями, как приведено в таблицах 1-2 и как проиллюстрировано на фиг.17-18, в качестве мишени для регуляции. При применении вышеупомянутой стратегии лечения, направленной на ось головной мозг-кишечник при AD для людей, в дополнение к межвидовым различиям кишечных микробов между протестированными мышами в качестве грызунов и людьми в качестве приматов, протестированных в рамках настоящего изобретения, внутривидовые и межиндивидуальные различия кишечных микроорганизмов между пациентами AD также должны полностью учитываться. Таким образом, типы кишечных микроорганизмов мышей, конкретно показанные в приведенных выше экспериментах, являются только инструктирующими, и не должны жестко и механически применяться для пациентов-людей с AD.We used data from AD patients and healthy controls to compare and analyze AD brain-gut axis-associated microorganisms that differ between the two models, as listed in Tables 1-2 and as illustrated in FIGS. 17-18. as a target for regulation. When applying the above-mentioned treatment strategy targeting the brain-gut axis in AD to humans, in addition to the interspecies differences in gut microbes between mice as rodents tested and humans as primates tested in the present invention, intraspecific and interindividual differences in gut microbes between AD patients must also be fully taken into account. Thus, the types of mouse intestinal microorganisms specifically shown in the above experiments are for guidance only, and should not be rigidly and mechanically applied to human AD patients.
Пример 4: OM1 ингибирует нейровоспаление посредством регуляции метаболизма аминокислотExample 4: OM1 Inhibits Neuroinflammation by Regulating Amino Acid Metabolism
В рамках настоящего изобретения также исследована промежуточная связь между изменением кишечной микробиоты и изменением иммунных клеток или вмешательством в него.The present invention also explores the intermediary relationship between alteration of the intestinal microbiota and alteration or intervention of immune cells.
Причинно-следственная связь между метаболитами кишечных микробов и дифференцировкой наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в нихCausality between gut microbial metabolites and naïve T cell differentiation into Th1/Th2 and interference with them
Для тестирования возможного вовлечения метаболитов в иммунное модулирование супернатант культивируемых фекалий in vitro от мышей Tg в возрасте 7 месяцев добавляли к культуре наивных CD4+ T-клеток, что стимулировало дифференцировку наивных CD4+ T-клеток в Th1- и Th2-клетки. Напротив, фекальный супернатант мышей Tg, которым вводили OM1, способствовал дифференцировке в Th2 и ингибировал дифференцировку в Th1 (фиг.11a), что указывает на то, что метаболиты микробов кишечника влияют на дифференцировку наивных T-клеток в Th1- и Th2-клетки.To test the possible involvement of metabolites in immune modulation, the supernatant of in vitro cultured feces from Tg mice at 7 months of age was added to a culture of naive CD4 + T cells, which stimulated the differentiation of naive CD4 + T cells into Th1 and Th2 cells. In contrast, fecal supernatant from OM1-treated Tg mice promoted Th2 differentiation and inhibited Th1 differentiation (Fig. 11a), indicating that gut microbial metabolites influence the differentiation of naïve T cells into Th1 and Th2 cells.
Причинно-следственная связь между аминокислотами в метаболитах кишечных микробов и дифференцировкой наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в нихCausal relationship between amino acids in gut microbial metabolites and naïve T cell Th1/Th2 differentiation and intervention
Авторы изобретения далее использовали способ нецелевой метаболомики для охарактеризации фекального метаболома. Всего 11289 метаболитов было идентифицировано в фекальных образцах от мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (фиг.11b-c). Среди этих метаболитов содержание 124 метаболитов, аннотированных в базе данных METLIN, значительно изменялось, снижалось или повышалось у мышей Tg относительно мышей WT, что указывает на то, что они связаны с AD. Поразительно, все эти изменения метаболитов могут быть в значительной степени обращены вспять посредством обработки OM1 (фиг.11d-f), что указывает на то, что лечение AD восстанавливало аномальное состояние этих связанных с AD метаболитов. Эти измененные метаболиты далее аннотировали с использованием базы данных Human Metabolome Database (HMDB) и Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) с получением всего 31 метаболита, которые дифференциально регулировались у мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1, которые могли быть сопоставлены со всеми тремя базами данных (HMDB, METLIN, KEGG). Анализ обогащения каскадов для этих метаболитов с использованием MBROLE или MetaboAnalyst далее продемонстрировал значимые изменения связанных с аминокислотами метаболических каскадов и ферментов, особенно связанных с фенилаланином каскадов (фиг. 5a).We further used an untargeted metabolomics approach to characterize the fecal metabolome. A total of 11,289 metabolites were identified in fecal samples from WT, Tg and OM1-treated Tg mice (Fig. 11b-c). Among these metabolites, 124 metabolites annotated in the METLIN database were significantly altered, decreased, or increased in Tg mice relative to WT mice, indicating that they are associated with AD. Strikingly, all these metabolite changes could be largely reversed by OM1 treatment (Figure 11d-f), indicating that AD treatment restored the abnormal state of these AD-related metabolites. These altered metabolites were further annotated using the Human Metabolome Database (HMDB) and the Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG), yielding a total of 31 metabolites that were differentially regulated in WT, Tg mice, and OM1-treated Tg mice that could be compared with all three databases (HMDB, METLIN, KEGG). Cascade enrichment analysis for these metabolites using MBROLE or MetaboAnalyst further demonstrated significant changes in amino acid-related metabolic cascades and enzymes, especially phenylalanine-related cascades (Figure 5a).
Таким образом, авторы изобретения решили сфокусироваться на аминокислотах для дальнейшего испытания. Проводили скрининг концентраций в плазме всего 36 аминокислот (таблица 3) как у мышей WT, так и у мышей Tg. Для классификации этих аминокислот использовали алгоритм случайного леса, и некоторые из них были отсортированы, как показано на фиг.19 и представлено в таблице 4. Фенилаланин был оценен в качестве наивысшего результата, за которым следовали изолейцин, серотонин, гистидин и ацетилорнитин. Многопараметрический поисковый анализ этих пяти аминокислот выявил значимые различия между мышами WT и Tg в соответствии с кривой операционных характеристик приемника (ROC) (фиг.5b; фиг.11h), что указывает на то, что они являются тесно связанными с прогрессированием заболевания. Затем авторы изобретения исследовали концентрацию выбранных аминокислот в образцах фекалий и крови в мышей Tg, которым вводили OM1 или не проводили введение, и сравнили ее с мышами WT. Ссылаясь на фиг.20 и фиг.21, авторы изобретения обнаружили, что OM1 влиял на различные аминокислоты, и они восстанавливались от паттерна Tg к паттерну дикого типа. В частности, концентрации фенилаланина и изолейцина были значимо более высокими в фекалиях мышей Tg, чем в фекалиях мышей WT, и введение OM1 значимо снижало их концентрации до уровня, сравнимого с уровнем у мышей WT (фиг.5c). Сходные изменения содержания фенилаланина и изолейцина были обнаружены в крови (фиг.5d). Следует отметить, что фенилаланин и изолейцин являются типичными представителями метаболитов кишечных микробов, которые изменяются при прогрессировании заболевания и обращаются вспять посредством OM1. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что после введения OM1 цитокины мышей имеют тенденцию к восстановлению до паттерна дикого типа (фиг.22). Это соответствует статусу цитокинов у мышей WT, имеющему тенденцию к изменению до паттерна у мышей Tg, как показано на фиг.2g, при совместном содержании с мышами Tg.Thus, the inventors decided to focus on amino acids for further testing. Plasma concentrations of a total of 36 amino acids were screened (Table 3) in both WT and Tg mice. A random forest algorithm was used to classify these amino acids and some of them were sorted as shown in Fig. 19 and presented in Table 4. Phenylalanine was ranked as the highest result, followed by isoleucine, serotonin, histidine and acetylornithine. Multivariate exploratory analysis of these five amino acids revealed significant differences between WT and Tg mice according to the receiver operating characteristic (ROC) curve (Figure 5b; Figure 11h), indicating that they are closely associated with disease progression. We then examined the concentrations of selected amino acids in fecal and blood samples in OM1-treated or untreated Tg mice and compared them to WT mice. Referring to FIG. 20 and FIG. 21, the inventors found that OM1 affected various amino acids and they were restored from the Tg pattern to the wild type pattern. Specifically, phenylalanine and isoleucine concentrations were significantly higher in the feces of Tg mice than in the feces of WT mice, and administration of OM1 significantly reduced their concentrations to levels comparable to those of WT mice (Fig. 5c). Similar changes in phenylalanine and isoleucine levels were found in the blood (Figure 5d). It should be noted that phenylalanine and isoleucine are typical representatives of gut microbial metabolites that change during disease progression and are reversed by OM1. In addition, the inventors also found that after administration of OM1, mouse cytokines tended to recover to the wild-type pattern (Fig. 22). This is consistent with the cytokine status in WT mice tending to change to the pattern in Tg mice, as shown in Figure 2g, when cohoused with Tg mice.
Для тестирования того, было ли повышение уровня этих аминокислот результатом изменения кишечной микробиоты, тем самым обеспечивающего вмешательство в аминокислоты путем препятствования кишечной микробиоте, авторы изобретения исследовали концентрацию аминокислот в исследовании FMT. Фекалии мышей WT в возрасте 2 месяцев могли значительно снижать уровень фенилаланина и изолейцина у мышей Tg (фиг.11i). Аналогично, у совместно содержащихся мышей WT, описанных на фиг. 2, концентрации фенилаланина и изолейцина в крови также повышались, что было сравнимым с мышами Tg (фиг.11j). Таким образом, можно было определить, что, когда мышей WT совместно содержали с мышами Tg для преобразования их собственного паттерна кишечных микробов WT в паттерн Tg, происходило аномальное продуцирование фенилаланина и изолейцина и уровень фенилаланина и изолейцина возрастал. Напротив, трансплантация фекалий мышей WT, содержавших нормальную кишечную микробиоту WT, мышам Tg вызывала сдвиг кишечной микробиоты мышей Tg в сторону паттерна WT, что приводило к восстановлению аномального продуцирования фенилаланина и изолейцина, и уровень фенилаланина и изолейцина снижался. Это подтверждало, что уровни метаболитов кишечных микробов фенилаланина и изолейцина могут быть восстановлены путем восстановления кишечной микробиоты мышей Tg.To test whether the increase in the levels of these amino acids was the result of changes in the gut microbiota, thereby interfering with amino acids by interfering with the gut microbiota, we examined amino acid concentrations in the FMT study. Feces of WT mice at 2 months of age could significantly reduce the levels of phenylalanine and isoleucine in Tg mice (Fig. 11i). Similarly, in the cohoused WT mice described in FIG. 2, blood phenylalanine and isoleucine concentrations were also increased, which was comparable to Tg mice (Figure 11j). Thus, it could be determined that when WT mice were cohoused with Tg mice to convert their own WT gut microbial pattern into the Tg pattern, abnormal production of phenylalanine and isoleucine occurred and the levels of phenylalanine and isoleucine increased. In contrast, transplantation of feces from WT mice containing normal WT gut microbiota into Tg mice caused a shift in the gut microbiota of Tg mice toward the WT pattern, resulting in the restoration of abnormal phenylalanine and isoleucine production, and the levels of phenylalanine and isoleucine were reduced. This confirmed that levels of the gut microbial metabolites phenylalanine and isoleucine could be restored by restoring the gut microbiota of Tg mice.
Подтверждение того, что фенилаланин и изолейцин влияют на дифференцировку наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в нихConfirmation that phenylalanine and isoleucine influence and interfere with naïve T cell differentiation into Th1/Th2
Для оценки эффектов фенилаланина и изолейцина на клетки, эти два соединения добавляли непосредственно в культуру наивных CD4+ T-клеток. Происходило повышение как дифференцировки Th0-клеток в Th1-клетки (фиг.5e), так и пролиферации Th1-клеток (фиг.5f). Напротив, введение OM1 может ингибировать дифференцировку Th1, индуцированную фенилаланином и изолейцином и стимуляцию пролиферации Th1-клеток, что указывает на то, что OM1 не только влияет на кишечные микробы, но также прямо влияет на саму их аминокислоту-метаболит. Кроме того, авторы изобретения проводили мышам WT внутрибрюшинную инъекцию фенилаланина и изолейцина и обнаружили, что количество Th1-клеток в крови значительно возрастало (фиг. 5g), подтверждая, что аминокислоты способствуют дифференцировке Th0 в Th1 in vivo. Эти результаты указывают на то, что накопление фенилаланина и изолейцина может повышать количество Th1-клеток в крови.To evaluate the effects of phenylalanine and isoleucine on cells, these two compounds were added directly to a culture of naïve CD4 + T cells. There was an increase in both the differentiation of Th0 cells into Th1 cells (Fig. 5e) and the proliferation of Th1 cells (Fig. 5f). In contrast, administration of OM1 can inhibit Th1 differentiation induced by phenylalanine and isoleucine and stimulation of Th1 cell proliferation, indicating that OM1 not only affects gut microbes but also directly affects their amino acid metabolite itself. In addition, we gave WT mice an intraperitoneal injection of phenylalanine and isoleucine and found that the number of Th1 cells in the blood increased significantly (Figure 5g), confirming that amino acids promote Th0 to Th1 differentiation in vivo . These results indicate that the accumulation of phenylalanine and isoleucine may increase the number of Th1 cells in the blood.
Вмешательство в дифференцировку наивных T-клеток путем препятствования захвату аминокислот наивными T-клеткамиInterfering with naive T cell differentiation by interfering with amino acid uptake by naive T cells
Аминокислоты могут захватываться иммунными клетками через специализированные переносчики. Авторы изобретения далее исследовали уровни экспрессии SLC7A5, переносчика фенилаланина и изолейцина, в наивных CD4+ T-клетках и обнаружили, что SLC7A5 экспрессировался в CD4+ T-клетках. Инкубация CD4+ T-клеток с 13C-меченным фенилаланином продемонстрировала захват фенилаланина CD4+ T-клетками, который мог блокироваться фармакологическим ингибитором SLC7A5, JPH 203 (фиг.11k), указывая на то, что он способен ингибировать захват аминокислот иммунными клетками посредством ингибирования переносчиков аминокислот. Авторы изобретения далее протестировали полученное изменение соотношения Th1-клеток. Мышам 5XFAD в возрасте 6 месяцев вводили 50 мг/кг JPH 203 или контроль в виде носителя посредством внутрибрюшинной инъекции каждые сутки. Через один месяц после введения мышей умерщвляли и долю провоспалительных Th1-клеток в головном мозге мышей в контрольной группе и группе введения JPH 203 анализировали посредством проточной цитометрии. Это было репрезентативным, отражая нейровоспаление в головном мозге. Результаты представлены на фиг.13. По сравнению с группой контроля в виде носителя, введение JPH203 в течение одного месяца значительно снижало долю провоспалительных Th1-клеток в головном мозге мыши, демонстрируя, что посредством ингибирования переносчика аминокислот поглощение аминокислот иммунными клетками ингибируется, тем самым предотвращая способствование аминокислотами дифференцировке иммунных клеток и снижая нейровоспаление в головном мозге.Amino acids can be taken up by immune cells through specialized transporters. We further examined the expression levels of SLC7A5, a phenylalanine and isoleucine transporter, in naive CD4 + T cells and found that SLC7A5 was expressed in CD4 + T cells. Incubation of CD4 + T cells with 13C -labeled phenylalanine demonstrated phenylalanine uptake by CD4 + T cells, which could be blocked by the pharmacological SLC7A5 inhibitor, JPH 203 (Fig. 11k), indicating that it is capable of inhibiting amino acid uptake by immune cells through inhibition amino acid transporters. The inventors further tested the resulting change in Th1 cell ratio. 5XFAD mice at 6 months of age were treated with 50 mg/kg JPH 203 or vehicle control via intraperitoneal injection every 24 hours. One month after administration, mice were sacrificed, and the proportion of pro-inflammatory Th1 cells in the brain of mice in the control and JPH 203 administration groups was analyzed by flow cytometry. This was representative, reflecting neuroinflammation in the brain. The results are presented in Fig. 13. Compared with the vehicle control group, JPH203 administration for one month significantly reduced the proportion of pro-inflammatory Th1 cells in the mouse brain, demonstrating that by inhibiting the amino acid transporter, the uptake of amino acids by immune cells is inhibited, thereby preventing amino acids from promoting immune cell differentiation and reducing neuroinflammation in the brain.
Подтверждение аномальных уровней фенилаланина и изолейцина у людей с ADConfirmation of abnormal phenylalanine and isoleucine levels in people with AD
Наконец, автор изобретения подтверждает это у человека, исследуя, могут ли указанные выше данные быть воспроизведены у пациентов с MCI вследствие AD (см. способ, использованный в этом исследовании для определения MCI, использованного в этом исследовании). Действительно, концентрации фенилаланина и изолейцина, а также количества Th1-клеток в крови индивидуумов с MCI вследствие AD (n=9) были значимо более высокими, чем у совпадающих по возрасту здоровых индивидуумов (n=18) (фиг.5h, i). Повышенные уровни как фенилаланина, так и изолейцина в крови также были подтверждены в другой небольшой группе с MCI вследствие AD (фиг.5j), таким образом обеспечивая планирование стратегий диагностики и лечения у человека на основе этого.Finally, the inventor confirms this in humans by examining whether the above findings can be replicated in patients with MCI due to AD (see the method used in this study to determine MCI used in this study). Indeed, the concentrations of phenylalanine and isoleucine, as well as the number of Th1 cells in the blood of individuals with MCI due to AD (n=9) were significantly higher than those of age-matched healthy individuals (n=18) (Fig. 5h, i). Elevated levels of both phenylalanine and isoleucine in the blood were also confirmed in another small group with MCI due to AD (Fig. 5j), thus allowing diagnostic and treatment strategies to be planned in humans based on this.
В общем, авторы изобретения обнаружили, что несколько метаболитов кишечных микробов вовлечено в последующий переход иммунных клеток в состояние преобладания Th1. Авторы изобретения, в частности, исследовали аминокислоты в метаболитах, особенно фенилаланин и изолейцин, и подтвердили причинно-следственную взаимосвязь между изменениями состава кишечной микробиоты, аномальным продуцированием фенилаланина и изолейцина, и чрезмерной дифференцировкой в Th1 наивных T-клеток. Посредством введения фекальных бактерий WT и OM1, для которых выше подтверждено, что они восстанавливают аномальную микробиоту мышей Tg в сторону нормальной кишечной микробиоты WT, аномально высокие уровни фенилаланина и изолейцина снижались и восстанавливались до нормального уровня. Более того, дифференцировка Th0 клеток в Th1-клетки ингибировалась, обращая вспять болезненное состояние с преобладанием Th1, подтверждая, что метаболиты кишечных микробов являются мостиком между аномальным составом микробиоты кишечника и аномальным состоянием иммунных клеток, и они являются частью взаимосвязей в оси головной мозг-кишечник при AD. Авторы изобретения также протестировали другие способы препятствования метаболитам, такие как снижение уровня метаболитов или препятствование поглощению метаболитов иммунными клетками, для вмешательства в последующее аномальное состояние иммунных клеток посредством метаболитов кишечных микробов, и, таким образом, в когнитивное состояние.In summary, we found that several gut microbial metabolites are involved in the subsequent transition of immune cells to a Th1 predominant state. We specifically examined amino acid metabolites, particularly phenylalanine and isoleucine, and confirmed a causal relationship between changes in gut microbiota composition, abnormal production of phenylalanine and isoleucine, and overdifferentiation into Th1 naïve T cells. By administering fecal bacteria WT and OM1, which were confirmed above to restore the abnormal microbiota of Tg mice towards the normal intestinal microbiota of WT, the abnormally high levels of phenylalanine and isoleucine were reduced and restored to normal levels. Moreover, the differentiation of Th0 cells into Th1 cells was inhibited, reversing the Th1-dominant disease state, suggesting that gut microbial metabolites bridge the gap between abnormal gut microbiota composition and abnormal immune cell health, and they are part of the crosstalk in the brain-gut axis with AD. The inventors have also tested other methods of interfering with metabolites, such as reducing the level of metabolites or interfering with the uptake of metabolites by immune cells, to interfere with the subsequent abnormal state of immune cells through metabolites of gut microbes, and thus the cognitive state.
Хотя принцип настоящего изобретения описан выше применительно к предпочтительным вариантам осуществления, должно быть хорошо понятно, что описание приводится только в качестве примера, и не для ограничения объема настоящего изобретения.Although the principle of the present invention has been described above in relation to preferred embodiments, it should be clearly understood that the description is given by way of example only, and not to limit the scope of the present invention.
Таблица 1. Перечень измененной флоры у пациентов с AD или мышейTable 1. List of altered flora in AD patients or mice
Таблица 2. Перечень флоры со значительными отличиями относительного содержания кишечных бактерий между пациентами с AD и здоровыми контролями (HC)Table 2. List of flora with significant differences in the relative abundance of intestinal bacteria between patients with AD and healthy controls (HC)
Таблица 3. В приведенном ниже перечне приводится наименование аминокислот, выявленных в крови мышей WT (2-9 месяцев) и Tg (2-9 месяцев). Связана с фиг. 5b.Table 3. The list below provides the names of amino acids identified in the blood of WT (2-9 months) and Tg (2-9 months) mice. Related to Fig. 5b.
Таблица 4. ROC-анализ всех аминокислотных маркеров в крови мышей WT и мышей Tg по порядку частоты выбораTable 4. ROC analysis of all amino acid markers in the blood of WT mice and Tg mice in order of frequency of selection
Claims (21)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910720486.9 | 2019-08-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2022105789A RU2022105789A (en) | 2023-09-11 |
RU2810079C2 true RU2810079C2 (en) | 2023-12-21 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005089776A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Ocean University Of China | Algin oligosaccharides and the derivatives thereof as well as the manufacture and the use of the same |
WO2019013838A1 (en) * | 2017-07-08 | 2019-01-17 | The General Hospital Corporation | Screening platform to identify therapeutic drugs or agents for treatment of alzheimer's disease |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005089776A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Ocean University Of China | Algin oligosaccharides and the derivatives thereof as well as the manufacture and the use of the same |
WO2019013838A1 (en) * | 2017-07-08 | 2019-01-17 | The General Hospital Corporation | Screening platform to identify therapeutic drugs or agents for treatment of alzheimer's disease |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
E.AKBARI et al. Effect of Probiotic Supplementation on Cognitive Function and Metabolic Status in Alzheimer's Disease: A Randomized, Double-Blind and Controlled Trial. Frontiers in Aging Neuroscience. 2016 Nov 10; 8:256. doi: 10.3389/fnagi.2016.00256. F.ANGELUCCI et al. Antibiotics, gut microbiota, and Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 2019 May 22; 16(1):108. doi: 10.1186/s12974-019-1494-4. Y.KOBAYASHI et al. Therapeutic potential of Bifidobacterium breve strain A1 for preventing cognitive impairment in Alzheimer’s disease. Scientific Reports. 2017 Oct 18; 7(1):13510. doi: 10.1038/s41598-017-13368-2. D.CHEN et al. Prebiotic Effect of Fructooligosaccharides from Morinda officinalis on Alzheimer’s Disease in Rodent Models by Targeting the Microbiota-Gut-Brain Axis. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017; 9: 403, Published online 2017 Dec 8. doi: 10.3389/fnagi.2017.00403. Y.XIN et al. Effects of Oligosaccharides From Morinda officinalis on Gut Microbiota and Metabolome of * |
F.FRANCESCHI ET AL. Microbes and Alzheimer' disease: lessons from H. pylori and GUT microbiota. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2019 Jan; 23(1):426-430. doi: 10.26355/eurrev_201901_16791. * |
N.M.VOGT et al. Gut microbiome alterations in Alzheimer’s disease. Scien Rep. 2017 Oct 19;7(1):13537. doi: 10.1038/s41598-017-13601-y. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220280578A1 (en) | Method for treating alzheimer's disease by regulating intestinal microorganisms | |
US20180271919A1 (en) | Probiotic composition at least comprising bifidobacterium bifidum w23 and capable of controlling intestinal barrier function | |
JP2021501797A (en) | Treatment of subtypes of ASD | |
US20220280541A1 (en) | Method for identifying carbohydrate drug-sensitive patient in patients having alzheimer's disease | |
US20220273598A1 (en) | Method for treating alzheimer's disease by inhibiting uptake of amino acids by t cells | |
US20220280589A1 (en) | Method for treating alzheimer's disease by regulating amino acid level | |
RU2810079C2 (en) | Method of treating alzheimer's disease through regulation of intestinal microorganisms | |
RU2806017C2 (en) | Method of identifying patient sensitive to medicinal product based on mannuronic acid oligosaccharides among patients with alzheimer's disease | |
RU2801150C1 (en) | Method of treatment of alzheimer's disease through regulation of amino acid level | |
RU2791665C1 (en) | Method for treatment of alzheimer's disease by t-cell inhibition of amino acid uptake | |
Bianchimano et al. | Human gut derived Anaerotruncus colihominis ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis | |
Abdel-Haq | Gut Microbiome Modulates Microglia Physiology in Homeostatic and Disease States | |
Perini | Investigation on the role of nutrition and bacteria in human health using Next Generation Sequencing (NGS): from gut microbiota in immune-related disorders to genomic epidemiology | |
CA3103161A1 (en) | Compositions comprising bacterial strains |