RU2791665C1 - Method for treatment of alzheimer's disease by t-cell inhibition of amino acid uptake - Google Patents
Method for treatment of alzheimer's disease by t-cell inhibition of amino acid uptake Download PDFInfo
- Publication number
- RU2791665C1 RU2791665C1 RU2022105790A RU2022105790A RU2791665C1 RU 2791665 C1 RU2791665 C1 RU 2791665C1 RU 2022105790 A RU2022105790 A RU 2022105790A RU 2022105790 A RU2022105790 A RU 2022105790A RU 2791665 C1 RU2791665 C1 RU 2791665C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- mice
- amino acid
- acid
- phenylalanine
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к лечению болезни Альцгеймера (AD). Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению ассоциации головной мозг-кишечник для ингибирования прогрессирования болезни Альцгеймера.The present invention relates to the treatment of Alzheimer's disease (AD). More specifically, the present invention relates to the use of the brain-gut association to inhibit the progression of Alzheimer's disease.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с постепенным развитием. Клинически она характеризуется общей деменцией, такой как ухудшение памяти, афазия, апраксия, агнозия, нарушение зрительно-пространственных навыков, нарушение способности к целенаправленной деятельности и изменения личности и поведения. Двумя патологическими признаками болезни Альцгеймера являются внеклеточные отложения β-амилоида (старческие бляшки) и внутриклеточные нейрофибриллярные клубки (парный спиральный филамент). Отложения β-амилоида и нейрофибриллярные клубки приводят к утрате синапсов и нейронов, которая приводит к тяжелой атрофии поврежденных областей головного мозга, как правило, начинающейся в височной доле. Механизм этого повреждения, вызываемого пептидами β-амилоида и нейрофибриллярными клубками, не до конца понятен.Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease with gradual development. Clinically, it is characterized by generalized dementia such as memory impairment, aphasia, apraxia, agnosia, impairment of visuospatial skills, impaired ability to purposeful activities, and changes in personality and behavior. Two pathological features of Alzheimer's disease are extracellular deposits of β-amyloid (senile plaques) and intracellular neurofibrillary tangles (paired helical filament). β-amyloid deposits and neurofibrillary tangles lead to loss of synapses and neurons, which leads to severe atrophy of damaged areas of the brain, usually starting in the temporal lobe. The mechanism of this damage caused by β-amyloid peptides and neurofibrillary tangles is not fully understood.
Олигосахариды маннуроновой кислоты, разработанные исследовательской командой под руководством Geng Meiyu, исследователя в Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences/Shanghai Institute of Materia Medica, представляет собой новое пероральное инновационное лекарственное средство против болезни Альцгеймера (AD) с независимыми правами на интеллектуальную собственность. 17 июля 2018 года результаты клинического испытания фазы III с раскрытыми сведениями продемонстрировали, что олигосахариды маннуроновой кислоты достигали ожидаемых результатов с точки зрения основных индикаторов эффективности для улучшения когнитивной функции, что имеет чрезвычайно значимую статистическую и клиническую значимость. Кроме того, встречаемость неблагоприятных явлений является сравнимой с встречаемостью неблагоприятных явлений в группе плацебо, и они имеют хорошую безопасность и пригодны для долговременного применения. Олигосахариды маннуроновой кислоты стали первым лекарственным средством в глобальной области лечения AD, которое оказалось успешным в клиническом испытании фазы III в течение 16 лет.Developed by a research team led by Geng Meiyu, a researcher at the Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences/Shanghai Institute of Materia Medica, mannuronic acid oligosaccharides is a new oral Alzheimer's disease (AD) innovation drug with independent intellectual property rights . On July 17, 2018, the results of the Disclosed Phase III Clinical Trial demonstrated that mannuronic acid oligosaccharides achieved the expected results in terms of key performance indicators for improving cognitive function, which is of extremely significant statistical and clinical significance. In addition, the incidence of adverse events is comparable to the incidence of adverse events in the placebo group, and they have good safety and are suitable for long-term use. Mannuronic acid oligosaccharides became the first drug in the global field of AD treatment to be successful in a phase III clinical trial over a period of 16 years.
Что касается олигосахаридов маннуроновой кислоты, было выдано множество связанных с ними китайских патентов. В CN2017114675966 описана композиция маннуроновой дикислоты. В CN2016100697039 описан способ получения олигоманнуроновой дикислоты. В CN2018107134113 описано применение композиции маннуроновой дикислоты для лечения болезни Паркинсона. В CN2015104243401 описано применение олигосахаридов маннуроновой кислоты с карбоксильной группой в положении 1 от восстанавливающего конца и их производных для лечения болезни Паркинсона. Эти патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.As for mannuronic acid oligosaccharides, many related Chinese patents have been issued. CN2017114675966 describes the composition of mannuronic diacid. CN2016100697039 describes a process for the production of oligomannuronic diacid. CN2018107134113 describes the use of a mannuronic diacid composition for the treatment of Parkinson's disease. CN2015104243401 describes the use of mannuronic acid oligosaccharides with a carboxyl group at
(олигосахариды маннуроновой кислоты)(mannuronic acid oligosaccharides)
В данной области необходимо больше лекарственных средств, которые могут использоваться для лечения болезни Альцгеймера.The field needs more drugs that can be used to treat Alzheimer's disease.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
В настоящем описании авторы изобретения описывают причинно-следственную связь между дисбиозом микробиоты кишечника и нейровоспалением при прогрессировании AD. В частности, изменения состава микробиоты кишечника могут приводить к периферическому накоплению метаболитов флоры, таких как фенилаланин и изолейцин. Они способствуют пролиферации и дифференцировке периферических провоспалительных T-хелперных клеток 1 типа (Th1) при прогрессировании AD. Периферические иммунные клетки инфильтрируют головной мозг и усиливают нейровоспаление. Важно, что повышение уровней метаболитов, таких как фенилаланин и изолейцин, в периферической крови было подтверждено в двух независимых выборках пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI), вызванным AD. Авторы изобретения также продемонстрировали, что олигосахариды маннуроновой кислоты, которые демонстрировали неизменное и стабильное улучшение когнитивной функции в клинических испытаниях фазы III в Китае, изменяют равновесие флоры кишечника, снижают накопление аминокислотных метаболитов флоры в крови и ингибируют нейровоспаление. Главным образом, данные авторов изобретения подчеркивают роль нейровоспаления, вызываемого дисбиозом кишечника, при прогрессировании AD, и предлагают новую стратегию для лечения AD путем вмешательства в ось головной мозг-кишечник.In the present description, the inventors describe a causal relationship between intestinal microbiota dysbiosis and neuroinflammation in the progression of AD. In particular, changes in the composition of the gut microbiota can lead to peripheral accumulation of flora metabolites such as phenylalanine and isoleucine. They promote the proliferation and differentiation of peripheral pro-inflammatory T-helper type 1 (Th1) cells during the progression of AD. Peripheral immune cells infiltrate the brain and increase neuroinflammation. Importantly, increased levels of metabolites such as phenylalanine and isoleucine in peripheral blood have been confirmed in two independent samples of patients with moderate cognitive impairment (MCI) caused by AD. The inventors also demonstrated that mannuronic acid oligosaccharides, which showed a consistent and stable improvement in cognitive function in phase III clinical trials in China, alter the balance of the intestinal flora, reduce the accumulation of amino acid metabolites of the flora in the blood, and inhibit neuroinflammation. Mainly, the inventors' data highlight the role of gut dysbiosis-induced neuroinflammation in the progression of AD and propose a novel strategy for the treatment of AD by intervening in the brain-gut axis.
В одном аспекте настоящее изобретение относится применению средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума.In one aspect, the present invention relates to the use of an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal for the manufacture of a medicament for the treatment of Alzheimer's disease in an individual.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, содержащей эффективное количество средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of Alzheimer's disease in a subject, comprising an effective amount of an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention relates to a method for screening a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease, comprising:
a) введение тестируемого средства моделях in vivo или in vivo с переносчиком SLC7A5, и a) administering the test agent to in vivo or in vivo models with the SLC7A5 transporter, and
b) выбор тестируемого средства, которое ингибирует переносчик SLC7A5, в качестве лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера.b) selecting a test agent that inhibits the SLC7A5 transporter as a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention relates to a method of treating a patient having Alzheimer's disease, comprising:
введение пациенту средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего, так чтобы происходила регуляция доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках у пациента так, чтобы она была близкой к или достигала соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках в соответствующей нормальной выборке.administering to a patient an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal so that the proportion of pro-inflammatory Th1 cells in the patient's CD4+ T cells is regulated to be close to or equal to the corresponding proportion of pro-inflammatory Th1 cells in CD4+ T cells -cells in the corresponding normal sample.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention relates to a method of treating a patient having Alzheimer's disease, comprising:
введение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего пациенту, так чтобы происходила регуляция относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками у пациента так, чтобы он был близким к или достигал соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной выборке.administering an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal to a patient such that the relative level of amino acid uptake by naive T cells in the patient is adjusted to be close to or equal to the corresponding relative level of amino acid uptake by naive T cells in the corresponding normal sample.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Фиг.1. Дисбиоз кишечника и изменения иммунных клеток в ходе прогрессирования заболевания у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD.Fig.1. Gut dysbiosis and immune cell changes during disease progression in 5XFAD transgenic (Tg) mice.
(a) Изменения относительных уровней экспрессии РНК синаптофизина в гиппокампе трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев и у мышей дикого типа (WT) через 2 месяца (n = 5-12). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem) относительно уровня экспрессии актина. *P < 0,05, **P < 0,01 посредством одностороннего ANOVA (F (5, 43) = 2,952).(a) Changes in relative levels of synaptophysin RNA expression in the hippocampus of transgenic (Tg) 5XFAD mice at 2, 3, 5, 7 and 9 months and in wild-type (WT) mice at 2 months (n = 5-12). Data are presented as the mean ± standard error of the mean (mean ± sem) relative to actin expression level. *P < 0.05, **P < 0.01 via one-way ANOVA (F(5, 43) = 2.952).
(b) Изменения во времени относительно из 104 с, затраченных на достижение 80% успеха (см. способы) в тесте для оценки способности к обучению различению у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев и у мышей дикого типа (WT) через 2 месяца (n = 4-8). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05 согласно t-критерию Стьюдента. С, секунды.(b) Changes in time relative to 10 4 s taken to achieve 80% success (see methods) in the discrimination learning test in 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7 and 9 months and in wild-type (WT) mice at 2 months (n=4-8). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). *P < 0.05 by Student's t-test. S, seconds.
(c) Анализ главных компонентов (PCA) для состава микробиома кишечника у мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD на уровне операционной таксономической единицы (OTU) в разные моменты времени (n = 4-10). Формы и цвета точек указывают на образцы от каждой особи и в разные месяцы. Окрашенные овалы указывают на диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой тестируемой группе. M, месяцы.(c) Principal component analysis (PCA) for gut microbiome composition in WT and 5XFAD transgenic (Tg) mice at the operational taxonomic unit (OTU) level at different time points (n = 4-10). The shapes and colors of the dots indicate samples from each individual and in different months. Colored ovals indicate confidence interval (CI) ranges corresponding to 0.95 in each test group. M, months.
(d) Относительные изменения содержания операционных таксономических единиц (OTU) в общей популяции микробиома кишечника трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в разные месяцы, закрашенные на уровне типа на потоковом графике (n = 4-10). Два наиболее распространенных типа, Bacteroidetes и Firmicutes, обозначены на графике. Цветами указаны различные типы микробиоты кишечника.(d) Relative changes in operational taxonomic unit (OTU) content in the total gut microbiome population of 5XFAD transgenic (Tg) mice over different months, shaded at the type level in the flowplot (n = 4-10). The two most common types, Bacteroidetes and Firmicutes , are labeled on the graph. Colors indicate different types of gut microbiota.
(e) Изменения положительной плотности иммунофлуоресцентного окрашивания IBA1, отражающие активацию клеток микроглии в гиппокампе трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев относительно величин у мышей дикого типа (WT) в возрасте 2 месяцев (n = 2-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); линии аппроксимированы посредством кубического сплайна. Величина IBA1 по оси Y представляет собой относительную величину флуоресцентного окрашивания у трансгенного животного в каждый момент времени относительно величины флуоресцентного окрашивания у животного дикого типа в тот же момент времени.(e) Changes in the positive density of IBA1 immunofluorescent staining reflecting the activation of microglial cells in the hippocampus of transgenic (Tg) 5XFAD mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months relative to values in wild-type (WT) mice at 2 months of age (n = 2 -7). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem); the lines are approximated by a cubic spline. The Y-axis IBA1 value is the relative amount of fluorescent staining in a transgenic animal at each time point relative to the amount of fluorescent staining in a wild-type animal at the same time point.
(f) Изменения активированной микроглии типа M1 и M2, выявленное в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев (n = 4-8). Детекцию микроглии типа M1 (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) и микроглии типа M2 (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD206+) проводили посредством проточной цитометрии, и количества этих клеток представлены относительно частоты клеток CD45lowCD11b+. Красные точки и линии: микроглия M1. Зеленые точки и линии: микроглия M2. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (mean ± sem); линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(f) Changes in activated microglial type M1 and M2 detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7 and 9 months (n = 4-8). Type M1 microglia (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD86 + ) and M2 microglia (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD206 + ) were detected by flow cytometry, and the numbers of these cells are presented relative to the frequency of CD45 low CD11b + cells. Red dots and lines: M1 microglia. Green dots and lines: M2 microglia. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem); the lines are approximated using the cubic spline algorithm.
(g) Изменения инфильтрирующих клеток (CD45high), выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (красные точки и линии) и мышей WT (черные точки и линии) в разные моменты времени при определении посредством проточной цитометрии (мыши Tg: 2 месяца, n=5; 3 месяца, n=4; 5 месяцев, n=4; 7 месяцев, n=7; 9 месяцев, n=3. мыши WT: n=6.). Количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45+, и они имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(g) Changes in infiltrating cells (CD45 high ) detected in whole brain homogenates of transgenic (Tg) 5XFAD mice (red dots and lines) and WT mice (black dots and lines) at different time points as determined by flow cytometry (Tg mice: 2 months, n=5; 3 months, n=4; 5 months, n=4; 7 months, n=7; 9 months, n=3. WT mice: n=6.). Cell numbers are presented relative to the frequency of CD45 + cells, and they have the format of the mean ± standard error of the mean (mean ± sem). The lines are approximated using the cubic spline algorithm.
(h) Изменения клеток CD45high у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в разные моменты времени (n = 4-8). На столбиковой диаграмме количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45high. Цветами указаны различные подтипы клеток CD45high: Neu, нейтрофилы; DC, дендритные клетки; NK, натуральные киллеры; Mo/Mϕː моноциты и макрофаги; B, B-клетки; другие, неклассифицированные клетки.(h) Changes in CD45 high cells in 5XFAD transgenic (Tg) mice at different time points (n=4-8). In the bar graph, cell numbers are presented relative to the frequency of CD45 high cells. Colors indicate different subtypes of CD45 high cells: Neu, neutrophils; DC, dendritic cells; NK, natural killers; Mo/Mϕː monocytes and macrophages; B, B cells; other, unclassified cells.
(i) Изменения инфильтрирующих CD4 T-клеток (CD45highCD4+), выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (красные точки и линии) через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев при определении посредством проточной цитометрии (n = 4-8). Количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45high и имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством кубических сплайнов.(i) Changes in infiltrating CD4 T cells (CD45 high CD4 + ) detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice (red dots and lines) at 2, 3, 5, 7, and 9 months as determined by flow cytometry ( n = 4-8). Cell numbers are presented relative to the frequency of CD45 high cells and are formatted as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). The lines are approximated by cubic splines.
(j) Изменения инфильтрирующих периферических клеток Th1 и Th2, выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев (n = 4-8). Детекцию клеток Th1 (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) и клеток Th2 (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-CCR4+) проводили посредством проточной цитометрии, и результаты представлены относительно частоты CD45highCD4+ T-клеток. Красные точки и линии: Th1-клетки. Зеленые точки и линии: Th2-клетки. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством кубических сплайнов.(j) Changes in infiltrating peripheral Th1 and Th2 cells detected in whole brain homogenates of 5XFAD transgenic (Tg) mice at 2, 3, 5, 7, and 9 months ( n = 4-8). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) and Th2 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - CCR4 + ) were detected by flow cytometry and the results are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + T cells. Red dots and lines: Th1 cells. Green dots and lines: Th2 cells. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). The lines are approximated by cubic splines.
(k) Корреляция лимфоцитов головного мозга и микробиоты кишечника, отраженная на уровне рода, в ходе ассоциированной с Th2/M2 стадии и ассоциированной с Th1/M1 стадии на ранней (2-3 месяца) и поздней фазе (7-9 месяцев), соответственно (левые панели, n = 4-8). Все бактерии, которые значимо коррелировали с количествами лимфоцитов в головном мозге мышей 5XFAD, приведены на правой панели. Квадраты красного цвета (положительная корреляция) или синего цвета (отрицательная корреляция) с желтой звездочкой (*) указывают на значимые корреляции со значениями P < 0,05, определенными посредством параметрического теста корреляции Пирсона.(k) Correlation of brain lymphocytes and gut microbiota reflected at the genus level during the Th2/M2-associated stage and the Th1/M1-associated stage at the early (2-3 months) and late phase (7-9 months), respectively. (left panels, n =4-8). All bacteria that significantly correlated with lymphocyte counts in the brain of 5XFAD mice are shown in the right panel. Red (positive correlation) or blue (negative correlation) boxes with a yellow asterisk (*) indicate significant correlations with P values < 0.05 determined by Pearson's parametric correlation test.
Фигура 2. Микробиота кишечника требуется для инфильтрации иммунных клеток и активации микроглии.Figure 2 Gut microbiota is required for immune cell infiltration and microglia activation.
(a) Эффекты введения антибиотиков через желудочной зонд в течение трех месяцев на относительную распространенность микроорганизмов в кишечнике у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 6-7). ABX, коктейль смешанных антибиотиков, состоящий из ампициллина (0,1 мг/мл), стрептомицина (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл). Разные роды микроорганизмов кишечника окрашены по-разному, и их изменения относительного содержания представлены на столбиковой диаграмме.(a) Effects of antibiotic gavage administration for three months on the relative abundance of microorganisms in the gut of 7-month-old 5XFAD transgenic (Tg) mice (n = 6-7). ABX, a mixed antibiotic cocktail consisting of ampicillin (0.1 mg/ml), streptomycin (0.5 mg/ml) and colistin (0.1 mg/ml). Different genera of intestinal micro-organisms are colored differently, and their relative content changes are presented in a bar graph.
(b-c) Эффекты введения антибиотиков через желудочной зонд в течение трех месяцев на частоту Th1-клеток (b) и клеток микроглии M1-типа (c) в гомогенате головного мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев. Количества Th1-клеток (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно частоты CD45highCD4+ клеток (b), в то время как количества клеток микроглии M1-типа (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) представлены относительно частоты CD45lowCD11b+ клеток (c). В обоих случаях детекцию проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem).(bc) Effects of administration of antibiotics by gastric tube for three months on the frequency of Th1 cells (b) and M1-type microglial cells (c) in the brain homogenate of transgenic (Tg) 5XFAD mice at 7 months of age. The numbers of Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + cells ( b ), while the numbers of M1-type microglial cells (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD86 + ) are shown relative to the frequency of CD45 low CD11b + cells ( c ). In both cases, detection was performed by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem).
(d) Относительное содержание микроорганизмов кишечника на уровне рода у мышей WT, совместно содержащихся мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (n = 6-7). Во всех трех группах мышей возраст составлял 7 месяцев. Разные цвета соответствуют разным родам. Совместно содержащиеся WT: мыши WT, которых содержали с мышами Tg.(d) Relative genus-level intestinal abundances in WT mice, co-housed WT mice, and 5XFAD transgenic (Tg) mice ( n = 6-7). All three groups of mice were 7 months old. Different colors correspond to different genders. Co-housed WT: WT mice housed with Tg mice.
(e-f) Изменения частоты Th1-клеток (e) и микроглии типа M1 (f) в гомогенатах головного мозга совместно содержащихся мышей WT, WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 6-7). Th1-клетки (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно частоты CD45highCD4+ клеток (e), в то время как частота клеток микроглии M1-типа (CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+) представлена относительно частоты CD45lowCD11b+ клеток (f). В обоих случаях детекцию проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, **P < 0,01 согласно t-критерию Стьюдента.(ef) Changes in frequency of Th1 cells ( e ) and M1 type microglia ( f ) in brain homogenates of co-housed WT, WT and 5XFAD transgenic (Tg) mice at 7 months of age ( n = 6-7). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + cells ( e ), while the frequency of M1-type microglial cells (CD45 low CD11b + CX3CR1 + Siglec-H + F4/80 + CD86 + ) is shown relative to the frequency of CD45 low CD11b + cells ( f ). In both cases, detection was performed by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). * P < 0.05, ** P < 0.01 according to Student's t-test.
(g) Уровни белков-цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей WT, совместно содержащихся мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев при детекции с использованием чипа с антителами к цитокинам (n = 6-7). Во всех трех группах возраст мышей составлял 7 месяцев. Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.(g) Levels of cytokine proteins in brain homogenates of WT mice, co-housed WT mice and transgenic (Tg) 5XFAD mice at 7 months of age as detected using a cytokine antibody array (n = 6-7). In all three groups, the mice were 7 months old. Colors on the heat map indicate relative levels of cytokines normalized by a rough Z-score; red indicates cytokines that are elevated, and blue indicates cytokines that are declining.
Фигура 3. Эффекты OM1 на изменения поведения в моделях на мышах APP/PS1.Figure 3. Effects of OM1 on behavioral changes in APP/PS1 mouse models.
(a) Структура OM1. OM1 представляет собой смесь кислых линейных олигосахаридов со степенями полимеризации в диапазоне от димеров до декамеров со средней молекулярной массой приблизительно 1 кДа.(a) Structure of OM1. OM1 is a mixture of acidic linear oligosaccharides with degrees of polymerization ranging from dimers to decamers with an average molecular weight of approximately 1 kDa.
(b) Результаты для латентности спасения в тесте с водным лабиринтом Морриса (MWM) в качестве показателя пространственного обучения и памяти у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев до возраста 12 месяцев. Затем проводили тест MWM на способности к пространственному обучению и память в течение 6 дополнительных дней. В ходе теста OM1 вводили постоянно. Латентность начала спасения (секунды) определяли в качестве одного из конечных результатов теста (см. способы). Более высокая латентность показывает, что эти мыши тратят больше времени для достижения цели, что указывает на более тяжело нарушенную способность к пространственному обучению и память (n = 11-14). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Черными звездочками указано сравнение между группами WT и APP/PS1. Синей звездочкой указано сравнение между группой введения OM1 (100 мг/кг) и группой введения APP/PS1. *P < 0,05, ***P < 0,001 согласно двухстороннему ANOVA.(b) Results for Morris Water Maze (MWM) escape latency as an indicator of spatial learning and memory in APP/PS1 mice. Nine month old APP/PS1 mice were treated with 50 mg/kg and 100 mg/kg OM1 for 3 months until 12 months of age. The MWM test was then performed on spatial learning ability and memory for 6 additional days. During the test, OM1 was injected continuously. The latency of the start of rescue (seconds) was determined as one of the final results of the test (see methods). Higher latency indicates that these mice take longer to reach a goal, indicating more severely impaired spatial learning and memory (n = 11-14). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). Black asterisks indicate comparison between WT and APP/PS1 groups. The blue asterisk indicates the comparison between the OM1 (100 mg/kg) administration group and the APP/PS1 administration group. *P < 0.05, ***P < 0.001 according to two-way ANOVA.
(c) Количество пересечений областей платформы в тесте MWM в качестве показателя пространственного обучения и памяти у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев до возраста 12 месяцев. Затем проводили тест MWM на способность к пространственному обучению и память в течение 6 дополнительных дней. В ходе теста постоянно вводили OM1. Количество пересечений областей платформы определяли в качестве другого результата теста (см. способы). Более высокие количества пересечений областей платформы указывают на менее тяжело сниженную способность к пространственному обучению и памяти (n = 11-17). *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (3, 55) = 6,542).(c) The number of intersections of the platform areas in the MWM test as an indicator of spatial learning and memory in APP/PS1 mice. Nine month old APP/PS1 mice were treated with 50 mg/kg and 100 mg/kg OM1 for 3 months until 12 months of age. The MWM test for spatial learning ability and memory was then performed for 6 additional days. During the test, OM1 was constantly injected. The number of intersections of the platform areas was determined as another test result (see methods). Higher platform region crossing counts indicate less severely reduced spatial learning and memory capacity (n = 11-17). *P < 0.05, ***P < 0.001 according to one-way ANOVA (F(3, 55) = 6.542).
(d) Точность пространственной рабочей памяти при тестировании с использованием Y-лабиринта у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев доз возраста 12 месяцев. Затем проводили тест в Y-лабиринте. В ходе теста постоянно вводили OM1. Точность Y-лабиринта представляла собой соотношение между правильным чередованием и общим чередованием (см. "Materials and methods"). Более высокая точность указывает на менее нарушенную способность рабочей памяти (n = 17-20). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). **P < 0,01, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (3, 71) = 12,39).(d) Accuracy of spatial working memory when tested using a Y-maze in APP/PS1 mice. Nine month old APP/PS1 mice were treated with 50 mg/kg and 100 mg/kg OM1 for 3 months at 12 month old doses. Then a test was performed in the Y-maze. During the test, OM1 was constantly administered. The accuracy of the Y-maze was the ratio between the correct alternation and the total alternation (see "Materials and methods"). Higher precision indicates less impaired working memory capacity (n = 17-20). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). **P < 0.01, ***P < 0.001 according to one-way ANOVA (F(3, 71) = 12.39).
Фигура 4. OM1 смягчает нейровоспаление путем реорганизации микробиоты кишечника.Figure 4. OM1 alleviates neuroinflammation by reorganizing the gut microbiota.
(a) Анализ главных координат (PCoA) для состава микробиома кишечника на уровне операционной таксономической единицы (OTU) на основе расстояния Брея-Кертиса для мышей 5XFAD (Tg) и мышей Tg, которым вводили OM1, в возрасте 7 месяцев (n = 7). Формы и цвета точек указывают на образцы от каждой особи. Окрашенными овалами указаны диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой протестированной группе. PC, главный компонент.(a) Principal coordinate analysis (PCoA) for gut microbiome composition at the operational taxonomic unit (OTU) level based on Bray-Curtis distance for 5XFAD (Tg) and OM1-treated Tg mice at 7 months of age (n = 7) . The shapes and colors of the dots indicate patterns from each individual. The colored ovals indicate the confidence interval (CI) ranges corresponding to 0.95 in each group tested. PC, main component.
(b) Тепловая карта значимых изменений микробиоты кишечника, представленных на уровне рода между мышами 5XFAD (Tg) и мышами Tg, которым вводили OM1, в возрасте 7 месяцев (n =17). Цветами на цветовой карте указана относительное содержание микробиоты кишечника; красным цветом указаны бактерии, уровень которых повышается, и синим цветом указаны бактерии, уровень которых снижается.(b) Heatmap of significant gut microbiota changes presented at the genus level between 5XFAD (Tg) mice and OM1-treated Tg mice at 7 months of age ( n =17). The colors on the color map indicate the relative content of the gut microbiota; red indicates bacteria that are rising, and blue indicates bacteria that are declining.
(c) Изменения корреляционных связей между микробиомом кишечника (обозначаемым числами вблизи синих кругов) и лимфоцитами головного мозга (закрашенные круги) до (слева) и после (права) введения через желудочной зонд OM1 мышам 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев. С правой стороны приводится наименование каждого кишечного микробиома.(c) Changes in correlations between gut microbiome (indicated by numbers near blue circles) and brain lymphocytes (solid circles) before (left) and after (right) OM1 gavage in 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age. On the right side is the name of each gut microbiome.
(d) Эффект введения OM1 на частоту Th1-клеток в головном мозге мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев (n = 5-7). Количества Th1-клеток (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно количеств CD45highCD4+ T-клеток при определении посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, ***P < 0,001, в соответствии с t-критерием Стьюдента.(d) Effect of OM1 administration on the frequency of Th1 cells in the brain of 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age ( n = 5-7). Th1 cell counts (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are relative to CD45 high CD4 + T cell counts as determined by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). * P < 0.05, *** P < 0.001, according to Student's t-test.
(e) Эффект введения OM1 на плотность положительного сигнала при иммунофлуоресценом окрашивании IBA1, проведенном для срезов гиппокампа мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев, отражающий активацию клеток микроглии (n = 4-6). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 15) = 21,94).(e) Effect of OM1 injection on positive signal density in IBA1 immunofluorescence staining performed on hippocampal sections of 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age, reflecting microglial cell activation ( n = 4-6). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). * P < 0.05, according to one-way ANOVA (F(2, 15) = 21.94).
(f) Эффект введения OM1 на уровни белков-цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев при детекции посредством чипа с антителами к цитокинам (n = 5-6). Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.(f) Effect of OM1 administration on cytokine protein levels in brain homogenates of 7-month-old 5XFAD (Tg) mice as detected by anti-cytokine antibody array ( n = 5-6). Colors on the heat map indicate relative levels of cytokines normalized by a rough Z-score; red indicates cytokines that are elevated, and blue indicates cytokines that are declining.
(g-h) Эффект OM1 на Aβ-положительную область (g) и тау-положительную область (h) в гиппокампе мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев, оцененный в срезах головного мозга (n = 4-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Для анализа Aβ: *P < 0,05, **P < 0,01 (F (2, 14) = 22,78). Для анализа тау: *P < 0,05, ***P < 0,001 (F (2, 15) = 13,06) в соответствии с односторонним ANOVA.(gh) Effect of OM1 on Aβ-positive region (g) and tau-positive region ( h ) in the hippocampus of 7-month-old 5XFAD (Tg) mice assessed in brain sections ( n = 4-7). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). For Aβ analysis: * P < 0.05, ** P < 0.01 (F(2, 14) = 22.78). For tau analysis: * P < 0.05, *** P < 0.001 (F(2, 15) = 13.06) according to one-way ANOVA.
(i) Эффекты OM1 на время относительно 104 секунд (с), затраченных для достижения 80% успеха (см. способы) в тесте для оценки способности к обучению различению у мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 10-13). Время означает время для достижения уровня эффективности 80% (секунды); чем больше времени требуется, тем тяжелее нарушение (см. способы). *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F(2,31) = 9,751).(i) Effects of OM1 on time relative to 10 4 seconds (s) taken to achieve 80% success (see methods) in the discrimination learning test in 5XFAD mice at 7 months of age (n=10-13). Time means the time to reach the 80% efficiency level (seconds); the more time it takes, the more severe the violation (see methods). * P < 0.05, *** P < 0.001 according to one-way ANOVA (F(2.31) = 9.751).
Фигура 5. OM1 ингибирует нейровоспаление путем взятия под контроль метаболизма аминокислот.Figure 5. OM1 inhibits neuroinflammation by taking control of amino acid metabolism.
(a) Анализ обогащения сигнальных путей для 31 типа фекальных метаболитов мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев с введением OM1 или без него и с использованием MBROLE (n = 6-8). Перечень результатов обогащения приведен с модулями KEGG и взаимодействиями ферментов KEGG, скрининг которых проводили с использованием критерия значения P < 0,05.(a) Signaling pathway enrichment analysis for 31 types of faecal metabolites from 5XFAD (Tg) mice at 7 months of age with or without OM1 administration and using MBROLE ( n = 6-8). Enrichment results are listed with KEGG modules and KEGG enzyme interactions screened using a P value < 0.05 test.
(b) Перечни аминокислот крови между группой WT (n=30) и Tg (n=26), которые можно было различить в период прогрессирования заболевания с использованием модели случайного леса (количество деревьев: 500; количество предсказательных факторов: 7; случайность: включена; см. способ).(b) Blood amino acid lists between WT (n=30) and Tg (n=26) that could be distinguished during disease progression using a random forest model (number of trees: 500; number of predictors: 7; randomness: included ; see method).
(c) Изменения уровней гистидина, фенилаланина и изолейцина в фекалиях мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (n = 6-11). Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.(c) Changes in the levels of histidine, phenylalanine and isoleucine in the faeces of WT mice, Tg mice and Tg mice injected with OM1 (n = 6-11). Red, increased level; blue, reduced level.
(d) Изменения уровней гистидина, фенилаланина и изолейцина в крови мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (n = 6-7). Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.(d) Changes in blood levels of histidine, phenylalanine and isoleucine in WT, Tg mice and OM1 treated Tg mice (n = 6-7). Red, increased level; blue, reduced level.
(e) Эффекты OM1 на дифференцировку наивных CD4+ T-клеток (Th0 клетки) в Th1-клетки, индуцированную фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4+ T-клетки культивировали в течение 3 суток с/без OM1 в присутствии фенилаланина (1 мМ) или изолейцина (1 мМ). Частоту Th1-клеток (CD4+IFN-γ+) тестировали посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); n = 3 повторения на группу. Слева, *P < 0,05, **P < 0,01 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 6) = 15,64). Справа, *P < 0,05, **P < 0,01 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 6) = 10,35).(e) Effects of OM1 on differentiation of naive CD4 + T cells (Th0 cells) into Th1 cells induced by phenylalanine and isoleucine. Naive CD4 + T cells were cultured for 3 days with/without OM1 in the presence of phenylalanine (1 mm) or isoleucine (1 mm). The frequency of Th1 cells (CD4 + IFN-γ + ) was tested by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem); n = 3 reps per group. Left, * P < 0.05, ** P < 0.01 according to one-way ANOVA (F(2, 6) = 15.64). Right, * P < 0.05, ** P < 0.01 according to one-way ANOVA (F(2, 6) = 10.35).
(f) Эффекты OM1 на пролиферацию клеток Th1, индуцируемую фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4+ T-клетки окрашивали CellTrace и культивировали в течение 3 суток с/без OM1 в присутствии фенилаланина (1 мМ) и изолейцина (1 мМ). Плотность флуоресценции CellTrace в клетках Th1 (CD4+IFN-γ+) тестировали посредством проточной цитометрии (см. способы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem), n = 3. *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (4, 9) = 28,34).(f) Effects of OM1 on Th1 cell proliferation induced by phenylalanine and isoleucine. Naive CD4 + T cells were stained with CellTrace and cultured for 3 days with/without OM1 in the presence of phenylalanine (1 mm) and isoleucine (1 mm). CellTrace fluorescence density in Th1 (CD4 + IFN-γ + ) cells was tested by flow cytometry (see methods). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem), n = 3. * P < 0.05, *** P < 0.001 according to one-way ANOVA (F(4, 9) = 28, 34).
(g) Изменения Th1-клеток в крови после внутрибрюшинной (в/б) инъекции в течение 4 суток фенилаланина и изолейцина (n = 6). ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 21) = 101,8).(g) Changes in blood Th1 cells after intraperitoneal (ip) injection for 4 days of phenylalanine and isoleucine ( n = 6). *** P < 0.001 according to one-way ANOVA (F(2, 21) = 101.8).
(h) Классификация на основе случайных деревьев изменений аминокислот у здоровых контролей (HC) и у пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (первая группа, n = 9 для MCI вследствие AD, n = 18 для HC).(h) Classification based on random trees of amino acid changes in healthy controls (HC) and in patients with mild cognitive impairment (MCI) due to AD (first group, n =9 for MCI due to AD, n =18 for HC).
(i) Частота Th1-клеток в крови здоровых контролей (HC) и пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (первая группа, n = 8 для MCI вследствие AD, n = 9 для HC). *P < 0,05 согласно t-критерию Стьюдента. По вертикальной оси приведен процент Th1-клеток/CD4+ T-клеток.(i) The frequency of Th1 cells in the blood of healthy controls (HC) and patients with mild cognitive impairment (MCI) due to AD (first group, n = 8 for MCI due to AD, n = 9 for HC). * P < 0.05 by Student's t-test. The vertical axis shows the percentage of Th1 cells/CD4 + T cells.
(j) Уровни фенилаланина и изолейцина в крови здоровых контролей (HC) и пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (вторая группа, n = 22 для обеих групп). *P < 0,05 в соответствии с t-критерием Стьюдента.(j) Blood levels of phenylalanine and isoleucine in healthy controls (HC) and patients with mild cognitive impairment (MCI) due to AD (second group, n = 22 for both groups). * P < 0.05 according to Student's t-test.
Фигура 6. Схематическая диаграмма нейровоспаления при прогрессировании AD и стратегия вмешательстваFigure 6. Schematic diagram of neuroinflammation in AD progression and intervention strategy
Изменение микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD вызывает нарушение метаболизма аминокислот. Оно способствует дифференцировке наивных CD4 T-клеток в Th1-клетки в крови. Между тем, аминокислоты и Th1-клетки могут инфильтрировать головной мозг посредством циркуляции крови. Инфильтрация периферических иммунных клеток и активация микроглии приводят к патологическому нейровоспалению в головном мозге, что приводит к снижению когнитивных способностей. Пероральное введение OM1 может восстанавливать микробиоту кишечника, ингибировать аномальное продуцирование аминокислот и снижать инфильтрацию периферическими иммунными клетками головного мозга, и в конечном итоге устранять нейровоспаление.Changes in the gut microbiota during the progression of AD cause alterations in amino acid metabolism. It promotes the differentiation of naïve CD4 T cells into Th1 cells in the blood. Meanwhile, amino acids and Th1 cells can infiltrate the brain through blood circulation. Infiltration of peripheral immune cells and activation of microglia lead to pathological neuroinflammation in the brain, leading to cognitive decline. Oral administration of OM1 can restore the gut microbiota, inhibit abnormal amino acid production and reduce brain peripheral immune cell infiltration, and ultimately reverse neuroinflammation.
Фигура 7Figure 7
(a-b) Изменения Aβ-положительных областей (a) и положительных по фосфорилированному тау (p-тау) областей (b) в срезах гиппокампа трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) против мышей дикого типа в возрасте 2 месяцев (WT) (n=2-7). Представлены репрезентативные флуоресцентные изображения; масштабная метка соответствует 100 мкм. На линейных графиках обобщенно представлены результаты для всех индивидуальных точек относительно мышей WT, и они представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов. M, месяцы.(a-b) Changes in Aβ-positive regions (a) and phosphorylated tau (p-tau) positive regions (b) in hippocampal sections of 5XFAD transgenic (Tg) mice (aged 2, 3, 5, 7 and 9 months) versus mice wild-type at 2 months of age (WT) (n=2-7). Representative fluorescent images are shown; the scale mark corresponds to 100 µm. The line plots summarize the results for all individual points relative to WT mice and are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). The lines are approximated using the cubic spline algorithm. M, months.
(c) Главный компонент (PC) 1 из анализа главных компонентов (PCA) для состава микробиома кишечника на уровне операционной таксономической единицы (OTU) у мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Красные точки и линии, мыши Tg; синие точки и линии, мыши WT. Естественное соединение в линию без аппроксимации. Использование двухсторонннего критерия суммы рангов Уилкоксона (ранговая сумма); * указывает на значимое отличие по сравнению с возрастом 2 месяца в той же группе. *P<0,05, **P<0,01. # указывает на значимое отличие по сравнению с совпадающими по возрасту мышами WT. #P<0,05; ##P<0,01; ###P<0,001.(c) Principal component (PC) 1 from principal component analysis (PCA) for gut microbiome composition at the operating taxonomic unit (OTU) level in WT mice and 5XFAD transgenic (Tg) mice (aged 2, 3, 5, 7, and 9 months) (n=4-10). Red dots and lines, Tg mice; blue dots and lines, WT mice. Natural line connection without approximation. Using two-tailed Wilcoxon rank sum test (rank sum); * indicates a significant difference from 2 months of age in the same group. *P<0.05, **P<0.01. # indicates a significant difference compared to age-matched WT mice. #P<0.05; ##P<0.01; ###P<0.001.
(d) Изменение относительного содержания микроорганизмов в кишечнике на уровне семейств у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Различные цвета соответствуют различным семействам.(d) Change in the relative abundance of microorganisms in the intestine at the family level in transgenic (Tg) mice 5XFAD (aged 2, 3, 5, 7 and 9 months) (n=4-10). Different colors correspond to different families.
(e) Кладограмма анализа величины эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) для состава кишечного микробиома у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Бактерии с наиболее высокой дискриминационной способностью обозначены на графике для каждого месяца. Цветами указаны таксоны бактерий, которые обогащались каждый месяц. Круги от внутренних к внешним указывают различные таксономические уровни (от внутреннего к внешнему: тип, класс, порядок, семейство и род). M, месяцы. Verrucomicrobia; AlphaProteobacteria; Bacteroidetes; Prevotellaceae; Erysipelotrichia; Firmicutes; Lachnoclostridium.(e) Linear discriminant effect size (LEfSe) analysis cladogram for gut microbiome composition in 5XFAD transgenic (Tg) mice (2, 3, 5, 7, and 9 months of age) (n=4-10). Bacteria with the highest discriminatory ability are indicated on the graph for each month. Colors indicate taxa of bacteria that were enriched every month. Circles from inner to outer indicate different taxonomic levels (from inner to outer: phylum, class, order, family, and genus). M, months. Verrucomicrobia ; AlphaProteobacteria ; Bacteroidetes ; Prevotellaceae ; Erysipelotrichia ; Firmicutes ; Lachnoclostridium .
(f) Анализ PCA для микробиома кишечника на уровне OTU у трансгенных мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 8, 9, 12 и 14 месяцев (n=4-12). Цветами и формами указаны данные в разные месяцы. Окрашенные овалы указывают на диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой тестируемой группе. PC, главный компонент.(f) PCA analysis for gut microbiome at OTU level in APP/PS1 transgenic mice at 3, 6, 8, 9, 12, and 14 months of age (n=4-12). Colors and shapes indicate data for different months. Colored ovals indicate confidence interval (CI) ranges corresponding to 0.95 in each test group. PC, main component.
(g) Изменения относительного содержания микробов кишечника на уровне типа у трансгенных мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 8, 9, 12 и 14 месяцев (n=4-12). Цвета соответствуют различным типам. M, месяцы.(g) Changes in relative gut microbial content at the type level in APP/PS1 transgenic mice at 3, 6, 8, 9, 12 and 14 months of age (n=4-12). Colors correspond to different types. M, months.
(h) Репрезентативные флуоресцентные изображения изменений IBA1-положительных областей в срезах гиппокампа трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) против мышей дикого типа в возрасте 2 месяца (WT) (n=2-7). Масштабная метка соответствует 500 мкм в мелкой рамке (сверху), 250 мкм в крупной рамке (снизу). M, месяцы.(h) Representative fluorescent images of changes in IBA1-positive regions in hippocampal sections of 5XFAD transgenic (Tg) mice (at 2, 3, 5, 7, and 9 months of age) vs. wild-type mice at 2 months of age (WT) (n=2- 7). The scale mark corresponds to 500 µm in a small frame (top), 250 µm in a large frame (bottom). M, months.
(i) Изменения частоты инфильтрирующих клеток (CD45high), обнаруженные в гомогенатах целого мозга мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 9 и 14 месяцев при детекции посредством проточной цитометрии (n=5-8). Количества клеток представлены относительно частоты CD45+ клеток, и они имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(i) Changes in the frequency of infiltrating cells (CD45 high ) found in whole brain homogenates of APP/PS1 mice at 3, 6, 9 and 14 months of age as detected by flow cytometry (n=5-8). Cell numbers are presented relative to the frequency of CD45 + cells, and they have the format of mean ± standard error of the mean (mean ± sem). The lines are approximated using the cubic spline algorithm.
(j) Изменения частоты инфильтрирующих периферических Th1-клеток в гомогенатах целого мозга мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 9 и 14 месяцев при детекции посредством проточной цитометрии (n=3-8). Th1-клетки (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно частоты CD45highCD4+ T-клеток. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.(j) Changes in the frequency of infiltrating peripheral Th1 cells in whole brain homogenates of APP/PS1 mice at 3, 6, 9 and 14 months of age as detected by flow cytometry (n=3-8). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are presented relative to the frequency of CD45 high CD4 + T cells. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). The lines are approximated using the cubic spline algorithm.
Фигура 8. Изменения отличительных признаков AD в пяти моделях на животных и у мышей дикого типа (WT) в возрасте 2, 4, 8 и 18 месяцев из базы данных Mouseac.Figure 8. Changes in the hallmarks of AD in five animal models and wild-type (WT) mice at 2, 4, 8 and 18 months of age from the Mouseac database.
(a) Изменение относительной плотности бляшек Aβ или нейрофибриллярных клубков (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны различные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(a) Change in relative density of Aβ plaques or neurofibrillary tangles (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). Colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
(b) Изменения log2-нормализованных уровней экспрессии синаптофизина (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(b) Changes in log 2 normalized synaptophysin expression levels (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). Colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
(c-d) Изменения log2-нормализованных уровней экспрессии CD86 и ARG1, соответствующие изменениям количеств клеток M1 и M2 (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(cd) Changes in log 2 normalized CD86 and ARG1 expression levels corresponding to changes in M1 and M2 cell numbers (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). Colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
(e-h) Изменения log2-нормализованных уровней экспрессии TIPM, CCL3, GATA-3 и MIF, соответствующие изменениям количеств Th1 и Th2 (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.(eh) Changes in log 2 -normalized expression levels of TIPM, CCL3, GATA-3 and MIF, corresponding to changes in the amounts of Th1 and Th2 (n=4 for each group). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). Colors indicate different models; the lines are approximated using a polynomial algorithm.
Фигура 9Figure 9
(a) Эффекты совместного содержания на время из 104 секунд, затраченных на достижение 80% успеха, в тесте для оценки способности к обучению распознаванию образов у мышей WT, совместно содержащихся WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n=5-8). Затраченное время означает время для достижения уровня эффективности 80% (секунды); чем больше времени требуется, тем тяжелее когнитивное нарушение (см. способы). (a) Effects of co-housing on time out of 10 4 seconds spent to achieve 80% success in a pattern recognition learning ability test in WT mice, co-housing WT and 5XFAD transgenic (Tg) mice at 7 months of age (n= 5-8). The elapsed time means the time to reach the 80% efficiency level (seconds); the longer it takes, the more severe the cognitive impairment (see methods).
(b) Эффекты трансплантации фекальной микробиоты (FMT) на количества иммунных клеток в головном мозге (Th1 и Th2) реципиентных мышей WT, которым инъецировали Aβ (см. способы) с использованием фекалий либо мышей WT, либо трансгенных (Tg) мышей 5XFAD. Клетки Th1 (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) и клетки Th2 (CD45highCD4+CXCR3-CCR6-CCR4+) представлены относительно CD45highCD4+ T-клеток (n=6-8); данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P<0,05, t-критерий Стьюдента.(b) Effects of fecal microbiota transplantation (FMT) on immune cell counts in the brain (Th1 and Th2) of recipient WT mice injected with Aβ (see Methods) using faeces from either WT mice or transgenic (Tg) 5XFAD mice. Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) and Th2 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 - CCR6 - CCR4 + ) are presented relative to CD45 high CD4 + T cells (n=6-8); data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). *P<0.05, Student's t-test.
(c) Эффекты FMT от мышей WT в возрасте 2 месяца на Th1-клетки в головном мозге у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (n=6-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). *P<0,05, t-критерий Стьюдента.(c) Effects of FMT from 2 month old WT mice on Th1 cells in the brain of 5XFAD transgenic (Tg) mice (n=6-7). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). *P<0.05, Student's t-test.
Фигура 10Figure 10
(a) Кладограмма анализа величины эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) для состава микробиома кишечника трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев, которым перорально вводили OM1 (n=5-7). Бактерии с наиболее высокой дискриминационной способностью на уровне типов обозначены на графике. Синий, бактерии с увеличенным содержанием у мышей Tg в возрасте 7 месяцев. Красный, бактерии с увеличенным содержанием у Tg мышей в возрасте 7 месяцев, которым вводили OM1. Круги от внутреннего к внешнему указывают на разные таксономические уровни (от внутреннего к внешнему: тип, класс, порядок, семейство и род). M, месяцы(a) Linear discriminant effect size (LEfSe) analysis cladogram for gut microbiome composition of 7-month-old 5XFAD transgenic (Tg) mice administered orally with OM1 (n=5-7). Bacteria with the highest discriminating ability at the type level are indicated on the graph. Blue, increased bacteria in Tg mice at 7 months of age. Red, upregulated bacteria in 7-month-old Tg mice injected with OM1. Circles from inner to outer indicate different taxonomic levels (from inner to outer: phylum, class, order, family, and genus). M, months
(b-c) Корреляция между микробиотой, имеющей повышенные и сниженные уровни микроорганизмов, вызванные OM1, и частота подтипов иммунных клеток в головном мозге трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев. Квадраты красного цвета (положительная корреляция) или синего цвета (отрицательная корреляция) с желтой звездочкой (*) имеют значение P < 0,05, определенное посредством параметрического теста корреляции Пирсона, чиста в каждом квадрате представляют собой коэффициент корреляции.(b-c) Correlation between microbiota having increased and decreased levels of microorganisms induced by OM1 and frequency of immune cell subtypes in the brains of 7-month-old 5XFAD transgenic (Tg) mice. Red (positive correlation) or blue (negative correlation) squares with a yellow asterisk (*) have a P value < 0.05 determined by Pearson's parametric correlation test, the net in each square represents the correlation coefficient.
(d) Репрезентативные изображения окрашивания IBA1, отложения Aβ и фосфорилирования тау в гиппокампе головного мозга мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1. Масштабная метка соответствует 250 мкм. Положительный сигнал визуализировали с использованием субстрата 3,3’-диаминобензидина (DAB), показанного темно-коричневым цветом.(d) Representative images of IBA1 staining, Aβ deposition and tau phosphorylation in the brain hippocampus of WT mice, Tg mice and Tg mice injected with OM1. The scale mark corresponds to 250 µm. A positive signal was visualized using 3,3'-diaminobenzidine (DAB) substrate, shown in dark brown.
(e) Эффекты FMT из мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1, на Th1-клетки головного мозга у реципиентных мышей C57 с инъекцией Aβ в гиппокамп (n=4-5). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem).(e) Effects of FMT from WT, Tg and OM1 injected Tg mice on Th1 brain cells in C57 recipient mice injected with Aβ into the hippocampus (n=4-5). Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem).
(f) Эффекты введения антибиотика (ампициллин (0,1 мг/мл), стрептомицин (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл) на относительное содержание микробиоты кишечника на уровне рода в модели на трансгенных мышах APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым перорально вводили OM1 (n=6-8). Цветами указаны разные роды.(f) Effects of antibiotic administration (ampicillin (0.1 mg/mL), streptomycin (0.5 mg/mL) and colistin (0.1 mg/mL) on relative abundance of gut microbiota at the genus level in the APP transgenic mouse model /PS1 at 6 months of age treated with OM1 orally (n=6-8) Colors indicate different genera.
(g) Эффекты OM1 на частоту Th1-клеток в головном мозге мышей APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым вводили антибиотики (см. способы). Th1-клетки (CD45highCD4+CXCR3+CCR6-) представлены относительно CD45highCD4+ T-клеток (n=6-8), и данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Слева направо: *P<0,05, t-критерий Стьюдента. NS, нет значимых отличий.(g) Effects of OM1 on Th1 cell frequency in the brains of 6 month old APP/PS1 mice treated with antibiotics (see Methods). Th1 cells (CD45 high CD4 + CXCR3 + CCR6 - ) are plotted against CD45 high CD4 + T cells (n=6-8) and data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). Left to right: *P<0.05, Student's t-test. NS, no significant differences.
(h) Эффекты OM1 на относительную плотность IBA1-положительного иммунофлуоресцентного окрашивания, выявленного в срезах гиппокампа мышей APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым вводили антибиотики (n=4-6, см. способы). IBA1-положительная область отражает активацию клеток микроглии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). ***P < 0,0001 в соответствии с t-критерием Стьюдента. NS, нет значимых отличий.(h) Effects of OM1 on the relative density of IBA1 positive immunofluorescent staining detected in hippocampal sections of 6 month old APP/PS1 mice treated with antibiotics (n=4-6, see methods). The IBA1-positive region reflects the activation of microglial cells. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem). ***P < 0.0001 according to Student's t-test. NS, no significant differences.
(i) Репрезентативное иммунофлуоресцентное окрашивание IBA1 в головном мозге мышей APP/PS1 и мышей APP/PS1, которым вводили OM1, с антибиотиками или без них. IBA1 визуализировали с использованием конъюгированного с FITC вторичного антитела, как показано зеленым цветом. Ядро окрашивали DAPI, как показано синим цветом. Масштабная метка соответствует 250 мкм.(i) Representative immunofluorescent staining of IBA1 in the brains of APP/PS1 mice and APP/PS1 mice treated with OM1 with or without antibiotics. IBA1 was visualized using a FITC-conjugated secondary antibody, as shown in green. The nucleus was stained with DAPI as shown in blue. The scale mark corresponds to 250 µm.
(j) Эффекты OM1 на уровни цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей APP/PS1 в возрасте 7 месяцев при определении посредством чипа с антителами к цитокинам (n=5-6). Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.(j) Effects of OM1 on cytokine levels in brain homogenates of APP/PS1 mice at 7 months of age as determined by anti-cytokine antibody array (n=5-6). Colors on the heat map indicate relative levels of cytokines normalized by a rough Z-score; red indicates cytokines that are elevated, and blue indicates cytokines that are declining.
Фигура 11Figure 11
(a) Эффект OM1 на дифференцировку наивных CD4+ T-клеток, обработанных супернатантом бактерий, в Th1- и Th2-клетки. Наивные CD4 T-клетки культивировали и супернатант из микробиоты мышей 5XFAD добавляли в присутствии/отсутствии OM1 в течение 3 суток. Гейтирование клеток Th1 (CD4+IFN-γ+) и Th2 (CD4+IL-4+) проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); n=3 повторения на группу.(a) Effect of OM1 on the differentiation of naive CD4 + T cells treated with bacterial supernatant into Th1 and Th2 cells. Naive CD4 T cells were cultured and supernatant from 5XFAD mouse microbiota was added in the presence/absence of OM1 for 3 days. Gating of Th1 (CD4 + IFN-γ + ) and Th2 (CD4 + IL-4 + ) cells was performed by flow cytometry. Data are presented as mean ± standard error of the mean (mean ± sem); n=3 repetitions per group.
(b-c) На вулканной диаграмме представлено распределение метаболитов из первичных данных метаболомики фекалий кишечника мышей WT и 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев (n=6-8) (b) и мышей Tg в возрасте 7 месяцев, которым вводили или не вводили OM1 (n=6) (c). Красными точками указаны значимые изменения метаболитов. Значимость определяют как значение P < 0,05 в соответствии с t-критерем Стьюдента и кратность изменений (FC) < 0,83 или > 1,2 между (T) и диким типом (WT). По оси x представлен log2FC, и по оси y представлен -log10 P. (bc) Vulcan plot shows the distribution of metabolites from raw gut fecal metabolomics data from 7-month-old WT and 5XFAD (Tg) mice (n=6-8) (b) and 7-month-old Tg mice treated with or not treated with OM1 (n=6) (c). Red dots indicate significant changes in metabolites. Significance is defined as P value < 0.05 according to Student's t-test and fold change (FC) < 0.83 or > 1.2 between (T) and wild type (WT). The x-axis represents log 2 FC and the y-axis represents -log 10 P.
(d-e) Тепловая карта для семисот восемьдесят шести метаболитов, которые дифференциально регулировались между мышами Tg и WT (d), а также 149 метаболитов между мышами Tg, которому вводили OM1 и не вводили его (e) (n=6-8). Эти метаболиты идентифицированы и аннотированы посредством сопоставления данных молекулярной массы (m/z) значимых пиков с онлайн-базой данных METLIN.(d-e) Heat map for seven hundred and eighty-six metabolites that were differentially regulated between Tg and WT mice (d), as well as 149 metabolites between Tg mice treated with OM1 and not treated with OM1 (e) (n=6-8). These metabolites were identified and annotated by matching the molecular weight (m/z) data of the significant peaks to the METLIN online database.
(f) На диаграмме Венна представлены метаболиты фекалий кишечника, уровни которых часто снижаются при сравнении мышей Tg и WT (T_W) и мышей Tg, которым вводили OM1 или не вводили его (Ttreat_T) (n=6-8). Сто двадцать четыре метаболита имели реверсию паттернов среди двух сравнений, т.е. метаболиты, которые являются либо в обоих случаях высокими для T_W и низкими для Ttreat_T, либо в обоих случаях низкими для T_W и высокими для Ttreat_T.(f) Venn plot shows intestinal faecal metabolites that often decrease in levels when comparing Tg and WT mice (T_W) and Tg mice treated with or without OM1 (Ttreat_T) (n=6-8). One hundred and twenty-four metabolites had pattern reversal among the two comparisons, ie. metabolites that are either both high for T_W and low for Ttreat_T, or both low for T_W and high for Ttreat_T.
(g) На тепловой карте представлен 31 идентифицированный метаболит с дифференциальной регуляцией среди групп WT, Tg и Tg с введением OM1 (n=6-8), которые могут быть сопоставлены со всеми тремя базами данных (Human Metabolites Database (HMDB), METLIN, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)). Красный, повышение уровня; синий, снижение уровня.(g) The heat map shows 31 identified differentially regulated metabolites among the WT, Tg and Tg groups with OM1 administration (n=6-8) that can be compared to all three databases (Human Metabolites Database (HMDB), METLIN, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)). Red, level up; blue, level down.
(h) кривую операционных характеристик приемника (ROC) и величину площади под кривой (AUC) для всех аминокислот в ходе прогрессирования заболевания вычисляют с использованием алгоритма случайного леса.(h) Receiver operating characteristics (ROC) and area under the curve (AUC) for all amino acids during disease progression are calculated using a random forest algorithm.
(i) Эффекты трансплантации фекального микробиома (FMT) на уровни фенилаланина и изолейцина в крови. Фекалии мышей WT в возрасте 2 месяцев трансплантировали мышам Tg в возрасте 7 месяцев (n=6-7). Для фенилаланина ***P < 0,001((F (2, 17)=26,59)). Для изолейцина, **P <0,01 (Tg против WT), **P <0,01 (Tg+FMT против Tg) в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 17)=8,181).(i) Effects of fecal microbiome transplantation (FMT) on blood levels of phenylalanine and isoleucine. Feces from 2 month old WT mice were transplanted into 7 month old Tg mice (n=6-7). For phenylalanine ***P < 0.001((F(2, 17)=26.59)). For isoleucine, **P<0.01 (Tg vs. WT), **P<0.01 (Tg+FMT vs. Tg) according to one-way ANOVA (F(2, 17)=8.181).
(j) Уровни аминокислот в образцах крови мышей WT, совместно содержащихся WT и Tg в разные месяцы (M) возраста. Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.(j) Amino acid levels in blood samples from WT mice co-housed with WT and Tg at different months (M) of age. Red, increased level; blue, reduced level.
(k) Поглощение фенилаланина наивными CD4 T-клетками. Наивные CD4 T-клетки культивировали с/без 13C-меченного фенилаланина в течение 0,5 ч. Проводили масс-спектрометрию родственных фенилаланину соединений. 13C-Фенилаланин вводили в концентрации 5 ммоль/л, и он захватывается переносчиком аминокислот L-типа.(k) Phenylalanine uptake by naive CD4 T cells. Naive CD4 T cells were cultured with/without 13 C-labeled phenylalanine for 0.5 h. Mass spectrometry of phenylalanine-related compounds was performed. 13 C-Phenylalanine was administered at a concentration of 5 mmol/L and is taken up by the L-type amino acid transporter.
Фигура 12. JPH203, 50 мг/кг, эффективно ингибирует часть Th1-клеток в головном мозге.Figure 12. JPH203, 50 mg/kg, effectively inhibits a portion of Th1 cells in the brain.
Фигура 13. Тенденция к изменению уровней OTU в энтеробактериях после введения OM1 по сравнению с контролем - анализ PCoA эффекта деградирующих фенилаланин бактерий на содержание фенилаланина в фекалиях через 1 неделю после трансплантации.Figure 13. Trend in OTU levels in enterobacteria after OM1 administration compared to control - PCoA analysis of the effect of phenylalanine-degrading bacteria on
Фигура 14. Тенденция к изменению относительного содержания энтеробактерий после введения OM1 по сравнению с контролем. Эффект деградирующих фенилаланин бактерий на долю Th1-клеток в крови через одну неделю после трансплантации.Figure 14. Tendency to change the relative content of enterobacteria after the introduction of OM1 compared with the control. Effect of phenylalanine-degrading bacteria on the proportion of Th1 cells in the blood one week after transplantation.
Фигура 15. Изменение тенденции содержания цитокинов в головном мозге по сравнению с контролем после введения OM1.Figure 15. Change in the trend of the content of cytokines in the brain compared with the control after the introduction of OM1.
Фигура 16. Изменение распределения микробов кишечника до и после применения средств, используемых для регуляции относительного содержания микроорганизмов в кишечнике: OM1 или фекальные бактерии (комплекс микроорганизмов кишечника).Figure 16. Change in the distribution of intestinal microbes before and after the use of agents used to regulate the relative content of microorganisms in the intestine: OM1 or fecal bacteria (complex of intestinal microorganisms).
Фигура 17. Различия между уровнем типа и уровнем рода для AD и HC, частично приведенные подробно. AD: пациенты с AD; HC: здоровые контроли.Figure 17. Differences between type level and gender level for AD and HC, partially detailed. AD: patients with AD; HC: healthy controls.
Фигура 18. Часть значимо измененной флоры у AD и HC (на уровне рода и вида). AD: пациенты с AD; HC: здоровые контроли.Figure 18. Part of the significantly altered flora in AD and HC (genus and species level). AD: patients with AD; HC: healthy controls.
Фигура 19. Перечень аминокислот, связанных с AD. Многопараметрический поисковый анализ (Explorer) на основе ROC-кривой использовали для анализа аминокислот в крови мышей дикого типа и мышей 5XFAD в возрасте, соответствующем разному количеству месяцев, и он осуществлял поиск потенциальных комбинаций аминокислот в качестве маркеров для отличения мышей дикого типа от мышей 5XFAD. Ниже приводится перечень первых 15 аминокислот, отсортированных по частоте отбора и всем типам.Figure 19. List of amino acids associated with AD. A multivariate exploratory analysis (Explorer) based on the ROC curve was used to analyze amino acids in the blood of wild-type and 5XFAD mice at different numbers of months of age and searched for potential combinations of amino acids as markers to distinguish wild-type mice from 5XFAD mice. Below is a list of the first 15 amino acids sorted by frequency of selection and all types.
Фигура 20. Мыши 5XFAD в возрасте 6,5 месяцев после введения 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца имеют уровни аминокислот в крови, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней аминокислот у мышей дикого типа.Figure 20. 5XFAD mice at 6.5 months of age following 100 mg/kg OM1 administration for 1 month have blood amino acid levels that tend to recover to amino acid levels in wild-type mice.
Фигура 21. Мыши 5XFAD в возрасте 6,5 месяцев после введения 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца имеют уровни фекальных аминокислот, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней аминокислот у мышей дикого типа.Figure 21. 5XFAD mice at 6.5 months of age after administration of 100 mg/kg OM1 for 1 month have fecal amino acid levels that tend to recover to amino acid levels in wild-type mice.
Фигура 22. Перечень цитокинов, уровни которых восстановились после введения OM1. Мышам 5XFAD в возрасте 6,5 вводили 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца, и они имели цитокины в головном мозге, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней цитокинов у мышей дикого типа.Figure 22. List of cytokines, the levels of which were restored after the introduction of OM1. 5XFAD mice aged 6.5 were injected with 100 mg/kg OM1 for 1 month and had cytokines in the brain that tend to recover to cytokine levels in wild-type mice.
Фигура 23. Тенденция к изменению клеток M1 головного мозга у мышей APP/PS1 в возрасте, соответствующем разному количеству месяцев.Figure 23. Trend in brain M1 cells in APP/PS1 mice at different months of age.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Далее описаны определенные иллюстративные варианты осуществления для обеспечения полного понимания принципов структуры, функции, получения и применения продуктов, способов и применений, описанных в настоящем описании. Один или несколько примеров этих осуществлений проиллюстрированы ниже. Специалистам в данной области будет понятно, что продукты, способы и применения, конкретно описанные в настоящем описании и конкретно проиллюстрированные на прилагаемых чертежах, представляют собой неограничивающие иллюстративные варианты осуществления, и объем настоящего изобретения ограничивается только формулой изобретения. Признаки, проиллюстрированные или описанные вместе в одном иллюстративном варианте осуществления, можно комбинировать с признаками других вариантов осуществления. Подразумевается, что такие модификации и изменения включены в объем настоящего изобретения. Все цитированные публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.Certain illustrative embodiments are described below to provide a thorough understanding of the principles of structure, function, preparation, and use of the products, methods, and uses described herein. One or more examples of these implementations are illustrated below. Those skilled in the art will appreciate that the products, methods, and uses specifically described herein and specifically illustrated in the accompanying drawings are non-limiting illustrative embodiments, and the scope of the present invention is limited only by the claims. Features illustrated or described together in one illustrative embodiment may be combined with features in other embodiments. Such modifications and changes are intended to be included within the scope of the present invention. All cited publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference in their entirety.
В контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте прилагаемой ниже формулы изобретения), если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст явно этому не противоречит, термины в форме единственного числа следует интерпретировать как охватывающие и единственное число, и множественное число. Если нет иных указаний, термины "содержащий", "имеющий", "включающий" и "охватывающий" следует интерпретировать как открытые термины (т.е. "включая, но не ограничиваясь ими"), однако они также включают частично закрытые или закрытые термины "по существу состоящий из" и "состоящий из". Если в настоящем описании нет иных указаний, описание числового диапазона в настоящем описании предназначено для применения только в качестве способа сокращения для независимого указания на каждую индивидуальную величину, входящую в данной диапазон, и каждая индивидуальная величина включена в настоящее описание, как если бы она была независимо приведена в настоящем описании. Если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст этому явно не противоречит, все способы, описанные в настоящем описании, могут быть выполнены в любом подходящем порядке. Если нет иных указаний, применение любых и всех примеров или иллюстративной формулировки (например, "такой как"), приведенных в настоящем описании, предназначено только для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Никакую формулировку в настоящем описании не следует истолковывать как указывающую на то, что какой-либо не заявленный в формуле изобретения элемент является необходимым для применения настоящего изобретения на практике. Все проценты представляют собой проценты по массе, и все проценты по массе основаны на общей массе композиции (с какой-либо необязательной концентрацией и/или разведением). Выражение "один или несколько" включает "два или более" и "три или более" и т.п.In the context of the description of the present invention (especially in the context of the following claims), unless otherwise indicated in the present description, or unless the context clearly contradicts it, terms in the singular form should be interpreted as covering both the singular and the plural. Unless otherwise indicated, the terms "comprising", "having", "including", and "covering" are to be interpreted as open terms (i.e., "including but not limited to"), however, they also include partially closed or closed terms. "essentially consisting of" and "consisting of". Unless otherwise indicated in this specification, the description of a numerical range in this specification is intended to be used only as an abbreviation for independently referring to each individual value within a given range, and each individual value is included in this specification as if it were independently given in the present description. Unless otherwise indicated in the present description, or unless the context clearly contradicts it, all methods described in the present description may be performed in any suitable order. Unless otherwise indicated, the use of any and all examples or illustrative language (eg, "such as") given in the present description is only intended to better illustrate the present invention and does not limit the scope of the present invention. Nothing in the present description should be construed as indicating that any element not claimed in the claims is necessary for the practice of the present invention. All percentages are weight percentages and all weight percentages are based on the total weight of the composition (with any optional concentration and/or dilution). The expression "one or more" includes "two or more" and "three or more", and the like.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем описании. После прочтения вышеуказанного описания изменения предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными специалистам в данной области. Автор изобретения полагает, что специалисты в данной области будут надлежащим образом использовать такие изменения, и автор изобретения предполагает, что настоящее изобретение будет осуществляться способом, отличным от способа, конкретно указанного в настоящем описании. Таким образом, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, описанного в прилагаемой формуле изобретения, допустимые применяемым законом. Более того, если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст этому явно не противоречит, настоящее изобретение охватывает любую комбинацию всех возможных вариантов вышеупомянутых элементов.Preferred embodiments of the present invention are described in the present description. Upon reading the above description, modifications to the preferred embodiments may become apparent to those skilled in the art. The inventor believes that those skilled in the art will make proper use of such changes, and the inventor contemplates that the present invention will be carried out in a manner other than that specifically indicated herein. Thus, the present invention includes all modifications and equivalents of the subject matter described in the appended claims, permitted by applicable law. Moreover, unless otherwise indicated in the present description, or unless the context clearly contradicts it, the present invention covers any combination of all possible variants of the above elements.
Когда в настоящей заявке приводится последовательность величин, следует понимать, что любая приведенная величина может представлять собой верхний или нижний предел числового диапазона. Также должно быть понятно, что настоящее изобретение охватывает все такие числовые диапазоны, т.е. диапазон, имеющий комбинацию верхнего предела и нижнего предела, где соответствующие величины верхнего предела и нижнего предела могут представлять собой любые из числовых величин, приведенных настоящем описании. Следует понимать, что диапазон, приведенный в настоящем описании. включает все величины, входящие в диапазон. Например, следует понимать, что 1-10 включает все из величин 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и включает дробные величины в соответствующих случаях. Диапазон, выражаемый посредством "вплоть до" определенной величины (например, вплоть до 5) следует понимать как все величины (включая верхний предел диапазона), такие как 0, 1, 2, 3, 4 и 5, и он включает дробные величины в соответствующих случаях. Следует понимать, что "не более одной недели" или "в пределах недели" включает 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. Аналогично, следует понимать, что диапазон, определяемый посредством "по меньшей мере", включает приведенные более низкие величины и все более высокие величины.When a sequence of values is given in this application, it should be understood that any given value may represent an upper or lower limit of a numerical range. It should also be understood that the present invention covers all such numerical ranges, i. a range having a combination of an upper limit and a lower limit, where the respective values of the upper limit and the lower limit may be any of the numerical values given herein. It should be understood that the range given in the present description. includes all values in the range. For example, 1-10 should be understood to include all of the
Если нет иных указаний, все проценты представляют собой проценты масса/масса.Unless otherwise indicated, all percentages are weight/weight percentages.
Как используют в рамках настоящего изобретения, под "приблизительно/примерно" следует понимать включение в пределы трех стандартных отклонений от средней величины или в стандартный диапазон допустимости в конкретной области. В определенных вариантах осуществления под "приблизительно" следует понимать отклонение не более чем на 0,5. "Приблизительно/примерно" модифицирует все перечисленные величины после них. Например, "приблизительно 1, 2, 3" означает "приблизительно 1", "приблизительно 2", "приблизительно 3".As used in the context of the present invention, by "approximately/approximately" is meant to be within three standard deviations of the mean, or within a standard tolerance range in a particular area. In certain embodiments, "about" should be understood to mean a deviation of no more than 0.5. "Approximately/approximately" modifies all listed values after them. For example, "about 1, 2, 3" means "about 1", "about 2", "about 3".
Если контекст явно не указывает на иное, термин "или" используют в инклюзивном значении в настоящем описании, означающем термин "и/или", и они могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.Unless the context clearly indicates otherwise, the term "or" is used in the inclusive sense in the present description, meaning the term "and/or", and they can be used in the present description interchangeably.
Термин "такой как/например/к примеру" используют в настоящем описании для указания на выражение "такой как/например/к примеру, но не ограничиваясь ими", и они могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.The term "such as/for example/for example" is used herein to refer to the expression "such as/for example/for example, but not limited to", and they can be used interchangeably herein.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что технические признаки, описанные в различных вариантах осуществления выше, могут использоваться отдельно или в комбинации с техническими решениями различных аспектов настоящего изобретения.Those skilled in the art will appreciate that the technical features described in the various embodiments above may be used alone or in combination with the technical solutions of various aspects of the present invention.
Авторы изобретения использовали модель на трансгенных (Tg) мышах 5XFAD, широко используемую в исследовании AD, вследствие ее тяжелого и ускоренного снижения когнитивных способностей. Посредством анализа энтеротипа мышей Tg и мышей WT на различных стадиях прогрессирования AD, было обнаружено, что микробиота кишечника мышей Tg является в высокой степени динамичной (фиг.1d). В возрасте 2-3 месяца Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia являются тремя наиболее распространенными типами бактерий (46,8%, 32,3% и 12,6%, соответственно), в то время как в возрасте 7-9 месяцев преобладающими бактериями становятся Firmicutes, в то время как содержание Bacteroidetes и Verrucomicrobia значительно снижается. Это резко расходится с микробиотой кишечника мышей WT.The inventors used the 5XFAD transgenic (Tg) mouse model widely used in AD research due to its severe and accelerated cognitive decline. By analyzing the enterotype of Tg mice and WT mice at different stages of AD progression, it was found that the gut microbiota of Tg mice is highly dynamic (Fig. 1d). At 2–3 months of age, Bacteroidetes , Firmicutes , and Verrucomicrobia are the three most common bacterial types (46.8%, 32.3%, and 12.6%, respectively), while at 7–9 months of age, Firmicutes become the predominant bacteria. , while the content of Bacteroidetes and Verrucomicrobia is significantly reduced. This is in stark contrast to the gut microbiota of WT mice.
Авторы изобретения также проанализировали периферические иммунные клетки Th1 и Th1 и клетки микроглии M1 и M2 и обнаружили, что два основных подтипа CD4+ клеток (инфильтрирующие Th1- и Th2-клетки) продемонстрировали сходную динамику с двумя основными подтипами клеток микроглии (клетки микроглии M1 и M2) (фиг.1f и фиг.1j). На ранней стадии они в основном представляют собой клетки Th2 и нейропротекторные клетки микроглии M2, и на поздней стадии они в основном представляют собой клетки Th1 и провоспалительные клетки микроглии M1. Авторы изобретения полагают, что по мере изменения паттернов микробиоты кишечника популяция иммунных клеток имеет тенденцию к достижению статуса преобладания Th1 и M1.The inventors also analyzed peripheral immune cells Th1 and Th1 and microglial cells M1 and M2 and found that the two main subtypes of CD4+ cells (infiltrating Th1 and Th2 cells) showed similar dynamics with the two main subtypes of microglial cells (microglial cells M1 and M2) (fig. 1f and fig. 1j). In the early stage they are mainly Th2 cells and neuroprotective M2 microglial cells, and in the late stage they are mainly Th1 cells and pro-inflammatory M1 microglial cells. The inventors believe that as gut microbiota patterns change, the immune cell population tends to achieve Th1 and M1 predominance status.
Авторы изобретения также проанализировали корреляцию между содержанием микробиоты кишечника и клетками головного мозга у мышей Tg, и также отметили, что бактериальный состав на ранней стадии (2-3 месяца) в высокой степени коррелирует с количествами клеток M2 и Th2 в головном мозге (фиг.1k, верх), в то время как на поздней стадии (7-9 месяцев) изменения бактериального паттерна в высокой степени коррелируют с клетками M1 и Th1 (фиг.1k, низ). В целом, эти результаты указывают на то, что в ходе прогрессирования AD кишечные бактерии ассоциированы с инфильтрацией периферических иммунных клеток и нейровоспалением.The inventors also analyzed the correlation between gut microbiota content and brain cells in Tg mice, and also noted that the bacterial composition at an early stage (2-3 months) was highly correlated with the numbers of M2 and Th2 cells in the brain (Fig. 1k , top), while at the late stage (7-9 months), changes in the bacterial pattern are highly correlated with M1 and Th1 cells (Fig. 1k, bottom). Overall, these results indicate that during the progression of AD, gut bacteria are associated with peripheral immune cell infiltration and neuroinflammation.
Более того, авторы изобретения обнаружили, что дисбиоз микробиоты кишечника требуется для инфильтрации различных периферических иммунных клеток (включая CD4+ и CD8+ T-клетки, B-клетки, натуральные киллеры (NK), нейтрофилы, дендритные клетки (DC) и моноциты) в головной мозг. Среди них, особенно примечательными являются клетки Th1, поскольку они тесно связаны с активацией клеток микроглии M1 в ходе прогрессирования AD. Ввиду общепризнанной функциональной взаимосвязи Th1 и клеток микроглии M1 в головном мозге, авторы изобретения предположили, что дисбиоз кишечника способствует инфильтрации Th1-клеток, обеспечивая локальное взаимодействие с микроглией M1, тем самым запуская дифференцировку микроглии в провоспалительное состояние. Посредством серии открытий, полученных в ходе данного исследования, понимание этого механизма возросло. Во-первых, динамические изменения состава микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD на значимом уровне связаны с повышением инфильтрации клеток Th1. Во-вторых, сокращение микробиоты кишечника посредством введения антибиотиков блокировало инфильтрацию Th1-клеток и последующую активацию микроглии M1 у мышей с AD (фиг.2a-c). В третьих, длительное воздействие фекальных бактерий (эксперимент с совместным содержанием) и трансплантация фекальной микробиоты от мышей AD значительно усиливали как инфильтрацию Th1-клеток (фиг.2e), так и активацию микроглии M1, у мышей WT, в то время как трансплантация фекальной микробиоты мышей WT мышам Tg снижала уровни Th1-клеток у реципиентных мышей Tg (фиг.9c). Результаты исследования автора изобретения в целом указывают на то, что микробиота кишечника является пусковым фактором, способствующим нейровоспалению, вызываемому Th1/микроглией M1, при прогрессировании AD.Moreover, the inventors found that gut microbiota dysbiosis is required for the infiltration of various peripheral immune cells (including CD4+ and CD8+ T cells, B cells, natural killer (NK), neutrophils, dendritic cells (DC) and monocytes) into the brain. . Among them, Th1 cells are particularly notable because they are closely associated with the activation of M1 microglial cells during the progression of AD. In view of the generally recognized functional relationship between Th1 and M1 microglial cells in the brain, the inventors hypothesized that gut dysbiosis promotes Th1 cell infiltration by providing local interaction with M1 microglia, thereby triggering microglial differentiation into a pro-inflammatory state. Through a series of discoveries made during this study, understanding of this mechanism has increased. First, dynamic changes in the composition of the gut microbiota during the progression of AD are significantly associated with increased infiltration of Th1 cells. Second, reduction of the gut microbiota by administration of antibiotics blocked Th1 cell infiltration and subsequent activation of M1 microglia in AD mice (FIGS. 2a-c). Third, long-term exposure to fecal bacteria (co-housing experiment) and transplantation of fecal microbiota from AD mice significantly increased both Th1 cell infiltration (Fig. 2e) and M1 microglia activation, in WT mice, while transplantation of fecal microbiota WT mice to Tg mice reduced levels of Th1 cells in recipient Tg mice (Fig. 9c). The results of the inventor's study generally indicate that the gut microbiota is a trigger factor contributing to Th1/M1 microglia-induced neuroinflammation in the progression of AD.
Причинно-следственная взаимосвязь между дисбиозом микробиоты кишечника и нейровоспалением при AD все еще неясна. В этом исследовании авторы изобретения обнаружили, что более 100 метаболитов были на значимом уровне изменены у мышей с AD по сравнению с мышами WT. Среди них, наиболее выраженные изменения происходили среди аминокислот, особенно аминокислот в связанном с фенилаланином каскаде. Авторы изобретения смогли подтвердить, что содержание фенилаланина и изолейцина было повышенным в фекалиях и крови мышей AD относительно мышей WT. Функциональная оценка как in vitro, так и in vivo, продемонстрировала роль фенилаланина и изолейцина в способствовании дифференцировке и пролиферации периферических воспалительных Th1-клеток. Использование антибиотиков для сокращения микробиоты кишечника приводило к одновременному снижению уровней фенилаланина и изолейцина в крови, инфильтрации Th1-клеток и активации клеток M1. Эти данные подчеркивают роль аномального продуцирования фенилаланина и изолейцина в микробиоте кишечника в стимуляции нейровоспаления, определяемого Th1-клетками. В соответствии с этой точкой зрения, авторы изобретения обнаружили, что концентрация фенилаланина/изолейцина и количество Th1-клеток в крови пациентов с MCI, вызванным AD, являются более высокими, чем в группе здоровых контролей.The causal relationship between gut microbiota dysbiosis and neuroinflammation in AD is still unclear. In this study, the inventors found that over 100 metabolites were significantly altered in AD mice compared to WT mice. Among them, the most pronounced changes occurred among the amino acids, especially the amino acids in the phenylalanine-related cascade. The inventors were able to confirm that phenylalanine and isoleucine were elevated in the feces and blood of AD mice relative to WT mice. Functional evaluation, both in vitro and in vivo, demonstrated the role of phenylalanine and isoleucine in promoting the differentiation and proliferation of peripheral inflammatory Th1 cells. The use of antibiotics to reduce the gut microbiota resulted in simultaneous decreases in blood levels of phenylalanine and isoleucine, infiltration of Th1 cells, and activation of M1 cells. These data highlight the role of abnormal phenylalanine and isoleucine production in the gut microbiota in stimulating Th1-mediated neuroinflammation. In accordance with this view, the inventors found that the concentration of phenylalanine/isoleucine and the number of Th1 cells in the blood of patients with MCI caused by AD, are higher than in the group of healthy controls.
Новые появившиеся данные показывают, что полисахариды или олигосахариды имеют преимущество регуляции микробиоты кишечника. Олигосахариды маннуроновой кислоты представляют собой лекарственные средства против AD на углеводной основе. В клиническом испытании фазы III, недавно завершенном в Китае, было показано, что они улучшают когнитивные способности у пациентов с AD от мягкой до умеренной. Олигосахариды маннуроновой кислоты хорошо переносятся и имеют безопасность, сходную с плацебо-контролями. В этом испытании авторы изобретения обнаружили, что OM1 эффективно восстанавливает микробиоту кишечника (фиг.4a-b; фиг.10a), снижает количество фенилаланина и изолейцина в фекалиях и крови (фиг.5c-d), и снижает обусловленное Th1 нейровоспаление (фиг.4g-i). Следует отметить, что фекалии Tg, которым вводили OM1, могут в значительной степени имитировать терапевтический эффект самого лечения OM1, и лечение антибиотиками устраняет их терапевтический эффект. Эти данные обеспечивают важное доказательство того, что терапевтический эффект OM1 в основном опосредуется восстановлением микробиоты кишечника. Таким образом, OM1 может обеспечить привлекательный подход для стратегий лечения AD, сфокусированных на микробиоте, что заслуживает дальнейшего исследования.New emerging data show that polysaccharides or oligosaccharides have the advantage of regulating the gut microbiota. Mannuronic acid oligosaccharides are carbohydrate-based anti-AD drugs. In a phase III clinical trial recently completed in China, they have been shown to improve cognition in patients with mild to moderate AD. mannuronic acid oligosaccharides are well tolerated and have similar safety to placebo controls. In this trial, the inventors found that OM1 was effective in restoring the gut microbiota (FIGS. 4a-b; FIG. 10a), reducing fecal and blood phenylalanine and isoleucine (FIGS. 5c-d), and reducing Th1-mediated neuroinflammation (FIGS. 4g-i). It should be noted that Tg feces injected with OM1 can largely mimic the therapeutic effect of OM1 treatment itself, and antibiotic treatment eliminates their therapeutic effect. These data provide important evidence that the therapeutic effect of OM1 is mainly mediated by restoration of the gut microbiota. Thus, OM1 may provide an attractive approach for microbiota-focused AD treatment strategies that merit further investigation.
Все эти данные позволяют авторам изобретения сделать предположение о концептуальном прорыве в понимании патогенеза AD. AD является не только локальным опосредуемым Aβ заболеванием головного мозга, но ее развитие также требует системных взаимодействий между кишечником, головным мозгом и промежуточными воспалительными факторами (фиг.6). В случае отложения Aβ измененный состав микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD вызывает аномальное повышение уровней аминокислот (особенно фенилаланина и изолейцина). Эти аминокислоты способствуют инфильтрации периферических Th1-клеток в головной мозг через кровоток. Инфильтрирующие периферические Th1-клетки могут локально взаимодействовать с микроглией M1 в головном мозге, что приводит к патологическому нейровоспалению и снижению когнитивной функции. Эти данные о патогенезе AD могут использоваться для восстановления микробиоты кишечника для способствования ответу, направленному против нейровоспаления, и предоставления новых терапевтических решений.All these data allow the inventors to propose a conceptual breakthrough in understanding the pathogenesis of AD. AD is not only a local Aβ-mediated disease of the brain, but its development also requires systemic interactions between the gut, brain, and intermediate inflammatory factors (FIG. 6). In the case of Aβ deposition, the altered composition of the gut microbiota during the progression of AD causes an abnormal increase in amino acid levels (especially phenylalanine and isoleucine). These amino acids promote the infiltration of peripheral Th1 cells into the brain through the bloodstream. Infiltrating peripheral Th1 cells can locally interact with M1 microglia in the brain, leading to pathological neuroinflammation and cognitive decline. These data on the pathogenesis of AD can be used to restore the gut microbiota to promote an anti-inflammatory response and provide new therapeutic solutions.
Результаты исследования автора изобретения могут иметь революционное значение для диагностики и лечения AD. Композиция конкретных бактерий (например, связанные с Th1/M1 бактерии), аминокислот (например, фенилаланин и изолейцин) и инфильтрирующих головной мозг иммунных клеток (например, преобладание Th1-клеток) или комбинация одного или нескольких из них могут использоваться в качестве ранних диагностических биомаркеров для пациентов с MCI, вызванным AD, и это заслуживает дальнейшего подтверждения на большой выборке пациентов с AD.The results of the research of the inventor can be revolutionary for the diagnosis and treatment of AD. A composition of specific bacteria (eg, Th1/M1 associated bacteria), amino acids (eg, phenylalanine and isoleucine), and brain-infiltrating immune cells (eg, Th1 cell predominance), or a combination of one or more of these, can be used as early diagnostic biomarkers for patients with MCI caused by AD, and this deserves further confirmation in a large sample of patients with AD.
Более важно, установленный эффект OM1 против AD, сфокусированный на микробиоте, откроет новые терапевтические подходы для лечения AD путем реорганизации микробиоты кишечника, и определит развитие эффективных способов терапии в будущем путем изучения в высокой степени неисследованной химии сахаров.More importantly, the established microbiota-focused anti-AD effect of OM1 will open up new therapeutic approaches for the treatment of AD by reorganizing the gut microbiota, and will guide the development of effective therapies in the future by exploring the highly unexplored sugar chemistry.
Каждый из идентифицированных авторами изобретения многочисленных характерных микроорганизмов кишечника, аминокислот, иммунных клеток и цитокинов, связанных с осью головной мозг-кишечник составляет микробный профиль кишечника, профиль аминокислот, профиль иммунных клеток и профиль цитокинов. Один или несколько из этих профилей (таких как микробный профиль кишечника) демонстрируют различия между нормальными и заболевшими индивидуумами. Настоящее изобретение нацелено на выявление или регуляцию состояния индивидуума путем выявления или регуляции одного или нескольких из этих профилей (таких как микробный профиль кишечника). В некоторых вариантах осуществления для диагностических целей профиль (например, микробный профиль кишечника) индивидуума может быть определен для сравнения с профилем (например, микробный профиль кишечника) с нормальными характеристиками соответствующего нормального индивидуума и/или профилем (например, микробный профиль кишечника) с характеристиками заболевания соответствующего заболевшего индивидуума, чтобы определить является ли состояние индивидуума нормальным или болезненным, тем самым диагностируя индивидуума. В некоторых вариантах осуществления для терапевтических целей профиль индивидуума с характеристиками заболевания может регулироваться до профиля соответствующего нормального индивидуума, так что болезненное состояние индивидуума может регулироваться до нормального состояния, тем самым осуществляя лечение индивидуума.Each of the numerous characteristic gut microorganisms, amino acids, immune cells, and cytokines associated with the brain-gut axis, identified by the inventors, constitutes a gut microbial profile, an amino acid profile, an immune cell profile, and a cytokine profile. One or more of these profiles (such as the gut microbial profile) show differences between normal and diseased individuals. The present invention aims to detect or regulate the condition of an individual by detecting or regulating one or more of these profiles (such as the gut microbial profile). In some embodiments, for diagnostic purposes, a profile (e.g., gut microbial profile) of an individual may be determined for comparison with a profile (e.g., gut microbial profile) with normal characteristics of a corresponding normal individual and/or a profile (e.g., gut microbial profile) with disease characteristics. of the corresponding diseased individual to determine whether the individual's condition is normal or diseased, thereby diagnosing the individual. In some embodiments, for therapeutic purposes, the profile of an individual with disease characteristics can be adjusted to that of a corresponding normal individual, such that the disease state of the individual can be adjusted to a normal state, thereby treating the individual.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего для производства лекарственного средства для лечения у индивидуума болезни Альцгеймера.Thus, in one aspect, the present invention relates to the use of an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal for the manufacture of a medicament for the treatment of Alzheimer's disease in an individual.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, содержащей эффективное количество средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of Alzheimer's disease in a subject, comprising an effective amount of an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal.
В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой одну или несколько аминокислот, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно фенилаланин и/или изолейцин; наиболее предпочтительно фенилаланин.In some embodiments, the amino acid is one or more amino acids selected from the following: 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-aminoadipic acid, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonine, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine; preferably one or more selected from phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine and acetylornithine; more preferably phenylalanine and/or isoleucine; most preferably phenylalanine.
В некоторых вариантах осуществления средство ингибирует захват аминокислот наивными T-клетками посредством ингибирования транспорта аминокислоты в наивную T-клетку переносчиком.In some embodiments, the agent inhibits amino acid uptake by naive T cells by inhibiting amino acid transport into the naive T cell by a transporter.
В некоторых вариантах осуществления переносчиком является SLC7A5.In some embodiments, the carrier is SLC7A5.
В некоторых вариантах осуществления средство включает одно или несколько, выбранных из JPH 203, BCH и KMH-233.In some embodiments, the agent includes one or more selected from JPH 203, BCH, and KMH-233.
В некоторых вариантах осуществления средство снижает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в образце от индивидуума приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает долю провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках близкой к или достигающей соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the agent reduces the proportion of pro-inflammatory Th1 cells among CD4+ T cells in a sample from an individual by about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; and/or makes the proportion of pro-inflammatory Th1 cells in CD4+ T cells close to or equal to the corresponding proportion of pro-inflammatory Th1 cells in CD4+ T cells of the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления средство снижает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким или достигающим соответствующий относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками соответствующего нормального индивидуума. In some embodiments, the agent reduces the relative uptake of amino acids by naïve T cells by approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 or more; and/or makes the relative level of amino acid uptake by naive T cells close to or equal to the corresponding relative level of amino acid uptake by naive T cells of the corresponding normal individual.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention relates to a method for screening a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease, comprising:
a) введение тестируемого средства в моделях in vivo или in vitro с переносчиком SLC7A5, иa) administering the test agent in in vivo or in vitro models with the SLC7A5 transporter, and
b) выбор тестируемого средства, которое ингибирует переносчик SLC7A5, в качестве лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера.b) selecting a test agent that inhibits the SLC7A5 transporter as a drug candidate that can be used to treat Alzheimer's disease.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение JPH 203 в качестве положительного контроля в модели in vivo или in vitro с переносчиком SLC7A5, предпочтительно выбирая тестируемое средство, которое ингибирует переносчик SLC7A5 по существу сопоставимо с JPH 203.In some embodiments, the method further comprises administering JPH 203 as a positive control in an in vivo or in vitro model with the SLC7A5 transporter, preferably selecting a test agent that inhibits the SLC7A5 transporter substantially comparable to JPH 203.
В некоторых вариантах осуществления модель представляет собой модель in vivo.In some embodiments, the model is an in vivo model.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение выбранного тестируемого средства в модели in vivo с переносчиком SLC7A5 для подтверждения, где выбранное тестируемое вещество снижает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток образца из модели in vivo приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток близкой к или достигающей соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в соответствующей нормальной модели in vivo.In some embodiments, the method further comprises administering the selected test agent to the SLC7A5 transporter in vivo model to confirm where the selected test agent reduces the proportion of pro-inflammatory Th1 cells among CD4+ T cells in the sample from the in vivo model by approximately 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; and/or makes the proportion of pro-inflammatory Th1 cells among CD4+ T cells close to or equal to the corresponding proportion of pro-inflammatory Th1 cells among CD4+ T cells in a corresponding normal in vivo model.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение выбранного тестируемого вещества в модели in vivo или in vitro с переносчиком SLC7A5 для подтверждения, где выбранное тестируемое вещество снижает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким к или достигающим соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной модели in vivo или in vitro.In some embodiments, the method further comprises administering the selected test substance in an in vivo or in vitro model with the SLC7A5 transporter to confirm where the selected test substance reduces the relative level of amino acid uptake by naïve T cells by approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30 , 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155 , 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280 , 285, 290, 295, 300 or more; and/or makes the relative level of amino acid uptake by naive T cells close to or equal to the corresponding relative level of amino acid uptake by naive T cells in a corresponding normal in vivo or in vitro model.
В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно, фенилаланина и/или изолейцина; наиболее предпочтительно, фенилаланина.In some embodiments, the amino acid is one or more selected from the following: 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-aminoadipic acid, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonine, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine ; preferably one or more selected from phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine and acetylornithine; more preferably phenylalanine and/or isoleucine; most preferably, phenylalanine.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:In another aspect, the present invention relates to a method of treating a patient having Alzheimer's disease, comprising:
введение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего пациенту, так чтобы происходила регуляция доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток у пациента так, чтобы она была близкой к или достигала соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в соответствующей нормальной выборке.administering an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal to a patient such that the proportion of pro-inflammatory Th1 cells among the CD4+ T cells in the patient is regulated to be close to or equal to the proportion of pro-inflammatory Th1 cells among the CD4+ T cells -cells in the corresponding normal sample.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:In a further aspect, the present invention relates to a method of treating a patient having Alzheimer's disease, comprising:
введение пациенту средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего, так чтобы происходила регуляция относительного уровня захвата аминокислот наивных T-клеток у пациента так, чтобы он был близким или достигал соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной выборке.administering to a patient an agent for inhibiting amino acid uptake by naive T cells in the peripheral blood of a mammal, so that the relative level of amino acid uptake of naive T cells in the patient is adjusted to be close to or equal to the corresponding relative level of amino acid uptake by naive T cells in the corresponding normal sample.
В некоторых вариантах осуществления углеводное лекарственное средство представляет собой OM1.In some embodiments, the carbohydrate drug is OM1.
В некоторых вариантах осуществления углеводное лекарственное средство не является OM1.In some embodiments, the carbohydrate drug is not OM1.
В некоторых вариантах осуществления олигосахарид маннуроновой кислоты представляет собой OM1.In some embodiments, the mannuronic acid oligosaccharide is OM1.
В некоторых вариантах осуществления олигосахарид маннуроновой кислоты не является OM1.In some embodiments, the mannuronic acid oligosaccharide is not OM1.
Структура и способ получения олигосахаридов маннуроновой кислоты описаны во многих документах уровня техники. В патенте уровня техники CN2016100697039 описан способ получения олигоманнуроновой кислоты, в патенте уровня техники CN2017107964853 описан способ определения средневзвешенной молекулярной массы и количества маннуроновых кислот, в патенте уровня техники CN2017114675966 описана композиция маннуроновой кислоты и ее получение, все из них включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. OM1, используемая в рамках настоящего описания, представляет собой композицию A согласно CN2018107213276 ("олигосахаридная композиция альгиновой кислоты "), который включен в настоящее описание в качестве ссылки.The structure and method of obtaining mannuronic acid oligosaccharides are described in many prior art documents. The prior art patent CN2016100697039 describes a method for producing oligomannuronic acid, the prior art patent CN2017107964853 describes a method for determining the weight average molecular weight and amount of mannuronic acids, the prior art patent CN2017114675966 describes the composition of mannuronic acid and its preparation, all of which are incorporated herein by reference. in full. OM1 as used herein is composition A according to CN2018107213276 ("alginic acid oligosaccharide composition"), which is incorporated herein by reference.
МикробиотаMicrobiota
В настоящем описании описаны способы и композиции, которые включают изменение микробиоты кишечного тракта индивидуума. Термин "микробиота" используют для указания на одно или несколько бактериальных сообществ, которые могут быть найдены или существуют (колонизируют) в кишечном тракте организма. Он может использоваться взаимозаменяемо с "микробами/микроорганизмами" или "кишечными микробами/микроорганизмами" в настоящем описании. При указании на более чем одну микробиоту, микробиоты могут быть одного типа (штамма) или могут представлять собой смесь групп, таких как Bacteroidetes, Proteobacteria и/или Firmicutes, или их подгрупп (класс, порядок, семейство, род, вид). Микробиота может представлять собой смесь микроорганизмов на одном уровне, таких как Bacteroidetes, Proteobacteria и/или Firmicutes; она также может представлять собой смесь различных уровней микроорганизмов, таких как Bacteroidetes и Proteobacteria.The present description describes methods and compositions that include altering the microbiota of the intestinal tract of an individual. The term "microbiota" is used to refer to one or more bacterial communities that can be found or exist (colonize) in the intestinal tract of an organism. It can be used interchangeably with "microbes/microorganisms" or "intestinal microbes/microorganisms" in the present specification. When referring to more than one microbiota, the microbiota may be of the same type (strain) or may be a mixture of groups such as Bacteroidetes, Proteobacteria and/or Firmicutes or subgroups thereof (class, order, family, genus, species). The microbiota may be a mixture of microorganisms at one level, such as Bacteroidetes , Proteobacteria , and/or Firmicutes ; it may also be a mixture of different levels of microorganisms such as Bacteroidetes and Proteobacteria .
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из типа, класса, порядка, семейства рода или вида, приведенных в таблице 1, или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more selected from the phylum, class, order, family of genus or species listed in Table 1, or combinations thereof.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из типа, класса, порядка, семейства, рода или вида, приведенных в таблице 2, или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more selected from the phylum, class, order, family, genus, or species listed in Table 2, or a combination thereof.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации.In some embodiments, the gut microbes are selected from one or more selected from Firmicutes , Bacteroidetes , Proteobacteria , Actinobacteria , Fusobacteria , Cyanobacteria , Verrucomicrobia , or combinations thereof.
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из типа, приведенного в таблице ниже, или их комбинации:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the type shown in the table below, or a combination thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из классов, приведенных в следующей таблице, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the classes shown in the following table, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из порядков, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the orders in the table below, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечный микроорганизм представляет собой один или несколько, выбранных из семейств, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microorganism is one or more selected from the families shown in the table below, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из родов, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the genera listed in the table below, or combinations thereof:
В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из следующих видов или их комбинаций:In some embodiments, the gut microbes are one or more selected from the following, or combinations thereof:
Авторы изобретения обнаружили, что множество кишечных микробов вовлечено в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых кишечных микробов были изменены и после введения, например, OM1, уровни этих кишечных микробов восстанавливались до уровней у мышей WT. Такие кишечные микробы составляют профиль кишечных микробов. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей.The inventors have found that a variety of gut microbes are involved in the brain-gut axis in accordance with the present invention. As shown in the examples, between WT mice and TG mice, the levels of some gut microbes were altered and after administration of, for example, OM1, the levels of these gut microbes were restored to levels in WT mice. Such gut microbes constitute the profile of gut microbes. As mentioned earlier, such a profile can be used for diagnostic and/or therapeutic purposes.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 или 67) кишечных микробов, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% кишечных микробов в профиле кишечных микробов, состоящем из кишечных микробов типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, приведенных в таблице выше, у индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD.In some embodiments, a change (e.g., increase or decrease) in the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 , 66 or 67) of the gut microbes selected from the above table in an individual relative to the level of the corresponding gut microbes in the corresponding normal individual indicates that the individual is at risk of AD or has AD. In one embodiment, a change (e.g., increase or decrease) in level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99, or 100% of gut microbes in a gut microbial profile consisting of gut microbes of the type, class, order, family, genus, and species listed in the table above in an individual relative to the level of the respective gut microbes in the respective normal individual indicates that the individual is at risk for AD or has AD.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 или 67) кишечных микробов, выбранных из типа, класса, порядка, семейства, рода и вида из приведенной выше таблицы у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум получает надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% кишечных микробов в профиле кишечных микробов, состоящем из кишечных микробов типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, приведенных в таблице выше, у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум получает надлежащее лечение.In some embodiments, a change (e.g., increase or decrease) in the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 , 66 or 67) of gut microbes selected from the type, class, order, family, genus and species from the above table in an individual with AD to the level of the corresponding gut microbes in the corresponding normal individual relative to the level of the corresponding intestinal microbes in the corresponding normal individual indicates that that the individual is receiving appropriate treatment. In one embodiment, a change (e.g., increase or decrease) in level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99, or 100% of gut microbes in a gut microbial profile consisting of gut microbes of the type, class, order, family, genus, and species listed in the table above in an individual with AD to the level of the corresponding gut microbes in a corresponding normal individual relative to the level of corresponding intestinal microbes in a corresponding normal individual indicates that the individual is receiving appropriate treatment.
Относительное содержание кишечных микробов можно изменять с использованием композиции или способа по настоящему изобретению следующим образом: введение композиции, содержащей соответствующую микробиоту или введение композиции, содержащей одно или несколько соединений, которые значительно повышают и/или снижают относительное содержание соответствующих кишечных микробов.The relative content of gut microbes can be changed using the composition or method of the present invention as follows: administering a composition containing the appropriate microbiota or administering a composition containing one or more compounds that significantly increase and/or reduce the relative content of the relevant intestinal microbes.
Bacteroidetes включают три основных класса бактерий: Bacteroidia, Flavobacteria и Sphingobacteria. Они распространены в окружающей среде, включая почву, ил, морскую воду и кишечник и кожу животных. Bacteroidetes include three major classes of bacteria: Bacteroidia , Flavobacteri a, and Sphingobacteria . They are common in the environment, including soil, silt, sea water, and the intestines and skin of animals.
Proteobacteria являются наиболее крупным типом бактерий. Эти организмы демонстрируют чрезвычайно высокое метаболическое разнообразие и отражают медицинскую, промышленную и сельско-хозяйственную важность большинства известных бактерий. Это является важным с эволюционноной, геологической и экологической точки зрения. Все бактерии Proteobacteria являются грамотрицательными и их внешняя стенка состоит из липополисахарида. Многие из них имеют газовые везикулы, жгутики или могут передвигаться путем скольжения; они могут иметь стебельки, другие отростки или обладают способности формировать многоклеточные плодовые тела. Большинство являются факультативными или облигатно-анаэробными, аутотрофными и гетеротрофными, однако существуют исключения. Некоторые виды способны к фотосинтезу, другие запасают серу внутри или снаружи клетки. Proteobacteria are the largest type of bacteria. These organisms exhibit extremely high metabolic diversity and reflect the medical, industrial and agricultural importance of most of the known bacteria. This is important from an evolutionary, geological and ecological point of view. All Proteobacteria are gram-negative and their outer wall is composed of lipopolysaccharide. Many of them have gas vesicles, flagella, or can move by sliding; they may have stalks, other processes, or have the ability to form multicellular fruiting bodies. Most are facultative or obligate anaerobic, autotrophic and heterotrophic, but there are exceptions. Some species are capable of photosynthesis, while others store sulfur inside or outside the cell.
Firmicutes являются типом в основном грамположительных бактерий. Однако некоторые имеют пористые псевдонаружные мембраны, которые делают их грамотрицательными. Ученые однажды классифицировали Firmicutes как включающих грамположительные бактерии, однако недавно определили их как основную группу с родственной формой, называемой формой с низким-G+C. Они в основном представляют собой округлые клетки, называемые кокками (единичные кокки), или являются палочковидными (бациллы). Многие Firmicutes продуцируют эндоспоры, которые являются устойчивыми к осушению и могут выжить в экстремальных условиях, что позволяет им выжить в различных условиях внешней среды. Firmicutes are a type of mostly Gram-positive bacteria. However, some have porous pseudoouter membranes which make them Gram-negative. Scientists once classified Firmicutes as including Gram-positive bacteria, but have recently identified them as a major group with a related form called the low-G+C form. They are mostly round cells called cocci (single cocci) or are rod-shaped (bacilli). Many Firmicutes produce endospores that are desiccation tolerant and can survive in extreme environments, allowing them to survive in a variety of environmental conditions.
Способ изменения микробиоты также может включать измерение относительного содержания одного или нескольких микроорганизмов кишечника в образце от индивидуума. В ходе секвенирования последнего поколения множество последовательностей определяют для каждого образца. После предварительной обработки используют алгоритмы кластеризации последовательностей для объединения последовательностей со сходством более 97% с получением OTU. Затем может быть получена таблица OTU_table, которая представляет собой матрицу, в которой указано сколько чтений содержит каждая OTU в каждом образце, т.е. каждый образец соответствует числу чтений последовательностей в каждой OTU. Относительное содержание соответствует 100% для каждого образца (каждый ряд), и вычисляют процент числа чтений в каждой OTU относительно числа всех чтений в образце. Таким образом, относительное содержание относится к относительному проценту числа последовательностей каждого микроорганизма в образце. Относительное содержание может быть обнаружено способом, описанным в настоящем описании, или способом, известным в данной области, который может использоваться для его детекции, таким как детекция гена 16S рРНК.The method for modifying the microbiota may also include measuring the relative abundance of one or more gut microorganisms in a sample from an individual. During last generation sequencing, multiple sequences are determined for each sample. After pre-processing, sequence clustering algorithms are used to combine sequences with more than 97% similarity to obtain an OTU. The OTU_table can then be obtained, which is a matrix that indicates how many reads each OTU contains in each sample, i.e. each pattern corresponds to the number of sequence reads in each OTU. The relative content corresponds to 100% for each sample (each row), and calculate the percentage of the number of readings in each OTU relative to the number of all readings in the sample. Thus, relative abundance refers to the relative percentage of the number of sequences of each microorganism in a sample. The relative abundance can be detected by the method described herein, or by a method known in the art that can be used to detect it, such as 16S rRNA gene detection.
Относительное содержание кишечных микробов можно определять путем получения образцов от индивидуума. Образец может представлять собой слюну, фекалии и содержимое желудка, кишечника и/или прямой кишки; образцы тканей пищеварительного тракта (такие как ткань полости рта, пищевода, желудка, тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки и/или прямой кишки); асцитную жидкость в желудочно-кишечных тканях; и любые другие образцы, которые могут использоваться индивидуумами, знакомыми с анализом микробиоты.The relative content of intestinal microbes can be determined by obtaining samples from the individual. The sample may be saliva, feces, and contents of the stomach, intestines, and/or rectum; tissue samples from the digestive tract (such as tissue from the mouth, esophagus, stomach, small intestine, ileum, caecum, colon, and/or rectum); ascitic fluid in the gastrointestinal tissues; and any other samples that may be used by individuals familiar with microbiota analysis.
Относительное содержание одного или нескольких видов кишечных микроорганизмов можно сравнивать с нормальным относительным содержанием соответствующих кишечных микробов. Нормальное относительное содержание может представлять собой содержание у одного или нескольких индивидуумов сходного возраста, пола, расы и т.п. Нормальное относительное содержание может представлять собой содержание у здоровых индивидуумов сходного возраста, пола, расы и т.д., которые отвечали на или продемонстрировали благоприятные результаты лечения или терапевтического вмешательства. В конкретном варианте осуществления нормальное относительное содержание представляет собой относительное содержание кишечных микробов у здоровых индивидуумов.The relative content of one or more types of intestinal microbes can be compared with the normal relative content of the corresponding intestinal microbes. The normal relative content may be that of one or more individuals of similar age, sex, race, and the like. The normal relative content may be the content in healthy individuals of similar age, sex, race, etc., who have responded to or demonstrated favorable results of treatment or therapeutic intervention. In a specific embodiment, the normal relative content is the relative content of intestinal microbes in healthy individuals.
Способы и композиции по изобретению могут вовлекать изменение относительного содержания одного или нескольких кишечных микробов. Иллюстративные варианты осуществления могут вовлекать способы или композиции для изменения относительного содержания кишечных микробов путем введения кишечных микробов индивидууму. В зависимости от желаемого результата (например, снижение уровня метаболитов, снижение лимфоцитарной инфильтрации в головном мозге, снижение активации микроглии, снижение нейровоспаления, улучшение когнитивной функции и облегчение симптомов болезни Альцгеймера) и конкретных индивидуумов, относительное содержание кишечных микробов можно регулировать на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99-100% или более, или на диапазон, состоящий из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, такой как от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или приблизительно на 7%, 14%, 21%, 28% и т.п..; и/или можно обеспечивать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума, близкое или достигающее относительное содержание соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума.The methods and compositions of the invention may involve changing the relative content of one or more intestinal microbes. Exemplary embodiments may involve methods or compositions for changing the relative abundance of gut microbes by administering the gut microbes to an individual. Depending on the desired outcome (e.g., reduced metabolite levels, reduced lymphocytic infiltration in the brain, reduced microglial activation, reduced neuroinflammation, improved cognitive function, and alleviated symptoms of Alzheimer's disease) and specific individuals, the relative content of gut microbes can be adjusted by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99-100% or more, or to a range consisting of the end points of the above values or any values in between, such as from about 7% to about 28%, etc., or by about 7%, 14%, 21%, 28%, etc. .; and/or it is possible to provide the relative content of intestinal microbes in the individual, close to or reaching the relative content of the corresponding intestinal microbes in the corresponding normal individual.
Как описано в настоящем описании, настоящее изобретение направлено на регуляцию показателя, который отличается от соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, в направлении соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, так чтобы показатель после регуляции был близким или достигал соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума. Эта регуляция применима к различным показателям, подлежащим регулированию или регулируемым, как описано в настоящем описании. Очевидно, является идеальным достижение соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, однако также является желательным приближение к соответствующему показателю у соответствующего нормального индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение направлено на получение одного или нескольких показателей у индивидуума, у которого намереваются регулировать один или несколько показателей, чтобы они были близкими или достигли соответствующих показателей у соответствующих нормальных индивидуумов. Как используют в рамках изобретения, термин "близок к или достигает" означает, что различие между показателем до регуляции и соответствующим показателем у соответствующего нормального индивидуума снижается на величину, превышающую или равную приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100%, или на диапазон, состоящий из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, такой как от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п. относительно различия после регуляции. Когда различие между показателем до регуляции и соответствующим показателем у соответствующего нормального индивидуума снижается приблизительно на 100% относительно различия после регуляции, регулируемый показатель достигает соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума. Специалистам в данной области понятно, что конкретная величина различия зависит, например, от объекта регуляции, типа показателя, способа измерения и т.п.As described herein, the present invention is directed to regulating a score that differs from a corresponding score in a corresponding normal individual towards a corresponding score in a corresponding normal individual, so that the score after regulation is close to or reaches the corresponding score in a corresponding normal individual. This regulation is applicable to various indicators to be regulated or regulated, as described in the present description. Obviously, it is ideal to achieve the corresponding indicator in the corresponding normal individual, however, it is also desirable to approximate the corresponding indicator in the corresponding normal individual. Thus, the present invention is directed to obtaining one or more indicators in an individual in which one or more indicators are intended to be adjusted so that they are close to or achieve the corresponding indicators in corresponding normal individuals. As used in the context of the invention, the term "close to or reaches" means that the difference between the score before regulation and the corresponding score in the corresponding normal individual is reduced by an amount greater than or equal to about 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100%, or a range consisting of the end points of the above values or any values in between, such as from about 7% to about 28%, and the like. regarding the difference after regulation. When the difference between the score before regulation and the corresponding score in the corresponding normal individual is reduced by about 100% relative to the difference after regulation, the adjustable score reaches the corresponding score in the corresponding normal individual. Those skilled in the art will appreciate that the exact amount of difference depends on, for example, the object of regulation, the type of indicator, the method of measurement, and the like.
Средство, способное регулировать один или несколько показателей у индивидуума, чтобы они были близкими или достигали соответствующих показателей у соответствующего нормального индивидуума, является терапевтически желательным. Выбор таких средств может быть основан, например, на средствах (таких как OM1), которые служат в качестве положительного контроля. Предпочтительно, выбирают тестируемое вещество, которое регулирует соответствующий показатель по существу сопоставимо со средством, используемым в качестве положительного контроля (например, OM1).An agent capable of regulating one or more parameters in an individual so that they are close to or achieve the corresponding parameters in the corresponding normal individual is therapeutically desirable. The choice of such agents may be based, for example, on agents (such as OM1) that serve as a positive control. Preferably, a test substance is selected that regulates the respective parameter substantially comparable to the agent used as a positive control (eg, OM1).
С другой стороны, один или несколько показателей индивидуума, у которого требуется регуляция одного или нескольких показателей, по существу сопоставимы с эталонным показателем (например, эталонный показатель для диагностики болезни Альцгеймера или идентификации чувствительных к углеводным лекарственным средствам пациентов у пациентов с болезнью Альцгеймера), который может указывать на то, что индивидуум имеет риск болезни Альцгеймера или имеет болезнь Альцгеймера.On the other hand, one or more scores of an individual in whom regulation of one or more scores is required is substantially comparable to a reference score (e.g., benchmark for diagnosing Alzheimer's disease or identifying carbohydrate drug-responsive patients in Alzheimer's disease patients) that may indicate that the individual is at risk for Alzheimer's disease or has Alzheimer's disease.
Как используют в рамках изобретения, термин "по существу такой же" относится к стандартизации тестируемого показателя относительно эталонного показателя (т.е. эталонный показатель принимают за 100%), разность между тестируемым показателем и эталонным показателем является меньшей или равной приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или диапазону, состоящему из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, например, от приблизительно 7% до приблизительно 28%, и т.п., или приблизительно 7%, 14%, 21%, 28% и т.п. Специалистам в данной области понятно, что конкретная величина разности будет зависеть, например, от подлежащего регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.As used herein, the term "substantially the same" refers to the standardization of a test score relative to a reference score (i.e., the benchmark is taken as 100%), the difference between the test score and the reference score is less than or equal to about 0.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% , consisting of the end points of the above values or any values in between, for example, from about 7% to about 28%, etc., or about 7%, 14%, 21%, 28%, etc. Those skilled in the art will appreciate that the exact amount of the difference will depend on, for example, the object to be controlled, the type of indicator, the method of measurement, and the like.
В некоторых вариантах осуществления средство для регуляции относительного содержания кишечных микробов включает комплекс кишечных микробов. В некоторых вариантах осуществления комплекс кишечных микробов включает микроорганизмы, происходящие из фекального материала или бактериальной библиотеки. В некоторых вариантах осуществления фекальный материал происходит из нормального индивидуума или пациента с болезнью Альцгеймера.In some embodiments, the agent for regulating the relative content of intestinal microbes comprises a complex of intestinal microbes. In some embodiments, the gut microbial complex includes microorganisms derived from fecal material or a bacterial library. In some embodiments, the implementation of the fecal material comes from a normal individual or patient with Alzheimer's disease.
Определение бактериальной библиотеки: для получения информации о классификации видов, соответствующей каждой OTU, используют байесовский алгоритм классификации RDP для проведения таксономического анализа на уровне сходства 97% репрезентативных последовательностей OTU и состав сообщества для каждого образца подсчитывают на каждом уровне классификации (домен, царство, тип, класс, порядок, семейство, род, вид). Таксономическая сравнительная база данных видов, используемая для анализа 16S бактериальной флоры, представляет собой silva132/16S:silva132/16S (http://www.arb-silva.de).Bacterial Library Definition: To obtain information on the species classification corresponding to each OTU, the Bayesian RDP classification algorithm is used to perform a taxonomic analysis at the similarity level of 97% representative OTU sequences and the community composition for each sample is calculated at each classification level (domain, kingdom, phylum, class, order, family, genus, species). The taxonomic comparison database of species used for the analysis of 16S bacterial flora is silva132/16S:silva132/16S (http://www.arb-silva.de).
Вовлеченные метаболитыInvolved metabolites
Автор изобретения обнаружил, что некоторые метаболиты кишечных микробов, такие как аминокислоты, вовлечены в ось головной мозг-кишечник при AD, исследованную в рамках настоящего изобретения. Эти аминокислоты могут представлять собой, например, одну или несколько, выбранных из следующей таблицы; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно фенилаланина и/или изолейцина; наиболее предпочтительно фенилаланина.The inventor has found that certain gut microbial metabolites, such as amino acids, are involved in the AD brain-gut axis investigated in the present invention. These amino acids may be, for example, one or more selected from the following table; preferably one or more selected from phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine and acetylornithine; more preferably phenylalanine and/or isoleucine; most preferably phenylalanine.
Авторы изобретения обнаружили, что различные аминокислоты вовлечены в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых аминокислот были изменены и после введения, например, OM1, уровни этих аминокислот восстанавливались в направлении уровней у мышей WT. Такие аминокислоты составляют профиль аминокислот. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей. В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36) аминокислот, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума относительно уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислот в профиле аминокислот, состоящем из аминокислот в приведенной выше таблице, у индивидуума относительно уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск наличия AD или имеет AD.The inventors have found that various amino acids are involved in the brain-gut axis according to the present invention. As shown in the examples, between WT mice and TG mice, the levels of some amino acids were altered and after administration of, for example, OM1, the levels of these amino acids recovered in the direction of the levels in WT mice. Such amino acids constitute the amino acid profile. As mentioned earlier, such a profile can be used for diagnostic and/or therapeutic purposes. In some embodiments, a change (e.g., increase or decrease) in the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 or 36) amino acids selected from the above table , in an individual relative to the level of the corresponding amino acids in a corresponding normal individual indicates that the individual is at risk of AD or has AD. In one embodiment, a change (e.g., increase or decrease) in level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 or 100% amino acids in the amino acid profile of the amino acids in the above table in an individual relative to the level of the corresponding amino acid in the corresponding normal individual indicates that the individual is at risk of having AD or has AD.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36) аминокислот, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума, имеющего AD, относительно уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума в направлении уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислот в профиле аминокислот, состоящем из аминокислот в приведенной выше таблице, у индивидуума, имеющего AD, относительно уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, в направлении уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение.In some embodiments, a change (e.g., increase or decrease) in the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 or 36) amino acids selected from the above table , in an individual having AD, relative to the level of the corresponding amino acid in the corresponding normal individual in the direction of the level of the corresponding amino acid in the corresponding normal individual indicates that the individual is being treated appropriately. In one embodiment, a change (e.g., increase or decrease) in level 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 or 100% amino acids in the amino acid profile consisting of the amino acids in the above table in an individual with AD, relative to the level of the corresponding amino acids in the corresponding normal individual, in the direction of the level of the corresponding amino acids in the corresponding normal individual , indicates that the individual is being treated appropriately.
Авторы изобретения обнаружили, что уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице у индивидуума не соответствует соответствующему уровню аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, что может быть обусловлено болезненным состоянием индивидуума. Когда уровень аминокислоты у индивидуума является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, считают, что произошло повышение регуляции уровня аминокислоты. Когда уровень аминокислоты у индивидуума является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, считают, что произошло снижение регуляции уровня аминокислоты.The inventors have found that the level of one or more amino acids in the above table in an individual does not correspond to the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual, which may be due to the disease state of the individual. When an individual's amino acid level is lower than the corresponding amino acid level of a corresponding normal individual, the amino acid level is considered to be upregulated. When an individual's amino acid level is higher than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual, the amino acid level is considered to be downregulated.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, в то время как уровень другой одной или нескольких аминокислот является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. Повышение регуляции или снижение регуляции может зависеть, например, от подлежащего регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.In some embodiments, the level of one or more amino acids in the table above is lower than the corresponding amino acid level in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of one or more amino acids in the above table is higher than the corresponding amino acid level in the corresponding normal individual. In some embodiments, the level of one or more amino acids in the above table is lower than the corresponding amino acid level in the corresponding normal individual, while the level of another one or more amino acids is higher than the corresponding amino acid level in the corresponding normal individual. Upregulation or downregulation may depend on, for example, the object to be regulated, the type of indicator, the method of measurement, and the like.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина является более низким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина является более низким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более низкими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the implementation of the level of glutamine is lower than the corresponding level of this amino acid in the corresponding normal individual. In some embodiments, the level of methionine is lower than the corresponding level of that amino acid in a corresponding normal individual. In some embodiments, the levels of both glutamine and methionine are lower than the corresponding levels of these amino acids in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более высокими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the implementation of the level of glutamine is higher than the corresponding level of this amino acid in the corresponding normal individual. In some embodiments, the level of methionine is higher than the corresponding level of that amino acid in a corresponding normal individual. In some embodiments, the levels of both glutamine and methionine are higher than the corresponding levels of these amino acids in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной, двух, трех, четырех или пяти из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина и/или изолейцина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the level of one, two, three, four, or five of phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine, and acetylornithine is higher than the corresponding level of these amino acids in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of phenylalanine and/or isoleucine is higher than the corresponding level of these amino acids in a corresponding normal individual. In some embodiments, the level of phenylalanine is higher than the corresponding level of that amino acid in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более низкими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, в то время как уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the levels of both glutamine and methionine are lower than the corresponding levels of these amino acids in a corresponding normal individual, while the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-aminoadipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glycine, histidine, hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid acid, serine, serotonin, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine is higher than the corresponding level of these amino acids in the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, метионина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-aminoadipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine , hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonine, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine is higher than the corresponding level these amino acids in the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы повышается, в то время как уровень другой одной или нескольких аминокислот снижается. В некоторых случаях повышение или снижение уровня может зависеть, например, под подвергаемого регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.In some embodiments, the level of one or more amino acids from the table above is increased. In some embodiments, the level of one or more amino acids from the above table is reduced. In some embodiments, the level of one or more amino acids from the table above is increased while the level of another one or more amino acids is decreased. In some cases, the increase or decrease in the level may depend on, for example, the subject being regulated, the type of indicator, the method of measurement, and the like.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина повышается.In some embodiments, the implementation of the level of glutamine is increased. In some embodiments, the level of methionine is increased. In some embodiments, both glutamine and methionine levels are increased.
В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина, снижается.In some embodiments, the implementation of the level of glutamine is reduced. In some embodiments, the level of methionine is reduced. In some embodiments, both glutamine and methionine levels are reduced.
В некоторых вариантах осуществления уровень одной, двух, трех, четырех или пяти из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина и/или изолейцина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина снижается.In some embodiments, the level of one, two, three, four, or five of phenylalanine, isoleucine, serotonin, histidine, and acetylornithine is reduced. In some embodiments, the level of phenylalanine and/or isoleucine is reduced. In some embodiments, the level of phenylalanine is reduced.
В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина, повышается, в то время как уровень одного или нескольких их 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина снижается.In some embodiments, both glutamine and methionine are elevated while one or more of their 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-aminoadipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glycine, histidine, hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonine, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine is reduced.
В некоторых вариантах осуществления уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, метионина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина снижается. Автор изобретения обнаружил, что иммунные клетки, такие как наивные T-клетки или недифференцированные T-клетки, захватывают аминокислоты (как иллюстрируется фенилаланином и изолейцином) в некоторых случаях, и, например, дифференцируются в определенные типы T-клеток, такие как Th1-клетки, посредством определенных переносчиков, таких как SLC7A5 в качестве примера. Авторы изобретения обнаружил, что предотвращение дифференцировки в Th1-клеки, которое приводит к состоянию доминирования Th1, различными способами может лечить обусловленные доминированием Th1 заболевания. Такие меры включают, но не ограничиваются ими, снижение уровня соответствующих аминокислот, предупреждение захвата иммунными клетками соответствующих аминокислот и т.п.In some embodiments, the level of one or more of 4-OH proline, acetylornithine, alanine, alpha-aminoadipate, asparagine, aspartic acid, asymmetric dimethylarginine, beta-alanine, carnosine, citrulline, creatinine, GABA, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine , hypotaurine, isoleucine, kynurenine, leucine, lysine, methionine, methionine sulfoxide, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, proline, putrescine, pyroglutamic acid, serine, serotonine, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine is reduced. The inventor has found that immune cells, such as naïve T cells or undifferentiated T cells, take up amino acids (as exemplified by phenylalanine and isoleucine) in some cases, and, for example, differentiate into certain types of T cells, such as Th1 cells , via certain transporters such as SLC7A5 as an example. The inventors have found that preventing differentiation into Th1 cells, which results in a Th1-dominant state, can treat Th1-dominated diseases in various ways. Such measures include, but are not limited to, reducing the level of the respective amino acids, preventing immune cells from taking up the respective amino acids, and the like.
SLC7A5 называют переносчиком 1 аминокислот L-типа (LAT1), и он принадлежит суперсемейству APC. Он образует гетеродимерный переносчик аминокислот, который взаимодействует с гликопротеином CD98 (SLC3A2), через консервативные дисульфидные связи. CD98 (4F2hc, SLC3A2) является гликопротеином типа II, который выступает в качестве белка-шаперона для LAT1, стабилизирующего и способствующего его перемещению на плазматическую мембрану. Этот комплекс отвечает за захват незаменимых аминокислот в ключевых областях организма, таких как плацента и гематоэнцефалический барьер. Субстрат включает серию крупных нейтральных аминокислот, таких как тирозин, лейцин, изолейцин, валин и фенилаланин, а также лекарственных средств, включающих L-DOPA и габапентин.SLC7A5 is referred to as L-type amino acid transporter 1 (LAT1) and belongs to the APC superfamily. It forms a heterodimeric amino acid transporter that interacts with the CD98 (SLC3A2) glycoprotein via conserved disulfide bonds. CD98 (4F2hc, SLC3A2) is a type II glycoprotein that acts as a chaperone protein for LAT1, stabilizing and promoting its translocation to the plasma membrane. This complex is responsible for the uptake of essential amino acids in key areas of the body such as the placenta and the blood-brain barrier. The substrate includes a series of large neutral amino acids such as tyrosine, leucine, isoleucine, valine and phenylalanine, as well as drugs including L-DOPA and gabapentin.
Различные агенты (такие как ферменты) можно использовать для деградации аминокислот для снижения уровня соответствующих аминокислот, тем самым уменьшая дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки. Ферменты, представленные в таблице ниже, можно использовать для деградации соответствующих аминокислот, таких как фенилаланин и изолейцин. Представленные ферменты можно доставлять в соответствующие области у индивидуума различными способами, например, в кишечник или периферический кровоток (такой как периферическая кровь), для деградации аминокислот. Например, фермент можно доставлять в соответствующую область путем доставки микроорганизма (например, Escherichia coli), экспрессирующего фермент, в соответствующую область для экспрессии фермента в соответствующей области. Микроорганизм может экспрессировать один или несколько из указанных ферментов. Специалистам в данной понятно, что для доставки фермента может использоваться любой микроорганизм, который может быть доставлен в соответствующую область различными путями (например, пероральный) без утраты способности экспрессировать фермент в соответствующей области. Например, Escherichia coli, модифицированные способами инженерии для экспрессии фермента для деградации фенилаланина, использовали в качестве деградирующей фенилаланин бактерии, которую перорально вводили мышам для снижения содержания фенилаланина у мышей (как показано путем определения содержания фенилаланина в фекалиях) и снижения доли Th1-клеток (как показано путем детекции доли Th1-клеток в периферической крови).Various agents (such as enzymes) can be used to degrade amino acids to reduce the levels of the corresponding amino acids, thereby reducing the differentiation of naïve T cells into Th1 cells. The enzymes shown in the table below can be used to degrade the corresponding amino acids such as phenylalanine and isoleucine. Present enzymes can be delivered to the appropriate areas in the individual in various ways, for example, in the intestine or peripheral circulation (such as peripheral blood), for the degradation of amino acids. For example, the enzyme can be delivered to an appropriate area by delivering an enzyme-expressing microorganism (eg, Escherichia coli ) to an appropriate area to express the enzyme in the corresponding area. The microorganism may express one or more of these enzymes. Those of skill in the art will appreciate that any microorganism that can be delivered to the area of interest by a variety of routes (eg, orally) can be used to deliver the enzyme without losing the ability to express the enzyme in the area. For example, Escherichia coli engineered to express an enzyme to degrade phenylalanine was used as a phenylalanine-degrading bacterium that was orally administered to mice to reduce phenylalanine in mice (as shown by fecal phenylalanine) and reduce the proportion of Th1 cells (as shown by detecting the proportion of Th1 cells in peripheral blood).
Ферменты, которые могут быть использованы для деградации фенилаланинаEnzymes that can be used to degrade phenylalanine
Ферменты, которые можно использовать для деградации изолейцинаEnzymes that can be used to degrade isoleucine
Ингибиторы переносчиков можно использовать для предотвращения захвата иммунными клетками соответствующих аминокислот посредством ингибирования захвата наивными T-клетками соответствующей аминокислоты путем ингибирования переносчика (например, общий переносчик SLC7A5 для фенилаланина и изолейцина), тем самым снижая дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки. Ингибиторы, которые могут использоваться для ингибирования переносчика SLC7A5, включают, но не ограничиваются ими, JPH 203, BCH и KMH-233, известные в данной области. Например, как показано в примере 4, введение ингибитора SLC7A5 JPH 203 мышам значительно снижает долю Th1-клеток в головном мозге мыши.Transporter inhibitors can be used to prevent immune cells from taking up appropriate amino acids by inhibiting naive T cell uptake of the corresponding amino acid by inhibiting the transporter (e.g., the common transporter SLC7A5 for phenylalanine and isoleucine), thereby reducing the differentiation of naive T cells into Th1 cells. Inhibitors that can be used to inhibit the SLC7A5 transporter include, but are not limited to, JPH 203, BCH, and KMH-233 known in the art. For example, as shown in Example 4, administration of the SLC7A5 inhibitor JPH 203 to mice significantly reduces the proportion of Th1 cells in the mouse brain.
JPH203 представляет собой химически синтезированное низкомолекулярное соединение, доступное от J-Pharma of Japan (http://www.j-pharma.com/b3_e.html), которое селективно ингибирует LAT1, с номером CAS 1037592-40-7 (https: //www.medkoo.com/products/9544).JPH203 is a chemically synthesized small molecule compound available from J-Pharma of Japan (http://www.j-pharma.com/b3_e.html) that selectively inhibits LAT1, with CAS number 1037592-40-7 (https:/ /www.medkoo.com/products/9544).
BCH представляет собой известный ингибитор LAT1 с номером CAS 20448-79-7 (https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027).BCH is a known LAT1 inhibitor with CAS number 20448-79-7 (https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027).
KMH-233 представляет собой известный ингибитор LAT1 с номером CAS 1941174-13-5 (https://www.medkoo.com/products/9545).KMH-233 is a known LAT1 inhibitor with CAS number 1941174-13-5 (https://www.medkoo.com/products/9545).
Специалистам в данной области понятно, что способы, которые можно использовать для предотвращения дифференцировки наивных T-клеток в Th1-клетки, не ограничиваются этим. Любые способы, которые могут использоваться для предотвращения влияния кишечных микробов и/или их метаболитов на дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки, можно использовать для снижения доли Th1, и облегчения или обращения вспять Th1-доминантного состояния, как описано в настоящем описании.Those skilled in the art will recognize that methods that can be used to prevent naïve T cells from differentiating into Th1 cells are not limited to this. Any methods that can be used to prevent the influence of gut microbes and/or their metabolites on the differentiation of naive T cells into Th1 cells can be used to reduce the proportion of Th1, and alleviate or reverse the Th1-dominant state, as described in the present description.
Авторы изобретения обнаружили, что различные цитокины вовлечены в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых цитокинов изменялись и после введения, например, OM1, уровни этих цитокинов восстанавливались до уровней у мышей WT. Такие цитокины составляют профиль цитокинов. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей.The inventors have found that various cytokines are involved in the brain-gut axis in accordance with the present invention. As shown in the examples, between WT mice and TG mice, the levels of some cytokines changed and after administration of, for example, OM1, the levels of these cytokines were restored to levels in WT mice. Such cytokines constitute a cytokine profile. As mentioned earlier, such a profile can be used for diagnostic and/or therapeutic purposes.
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31) цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума относительно уровня соответствующего цитокина у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% цитокинов в профиле цитокинов, состоящем из цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума относительно уровня соответствующего цитокина у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD.In some embodiments, a change (e.g., increase or decrease) in the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 or 31) cytokines selected from the following: OPG, resistin, TARC, VEGF, chemerin, IL -9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, granzyme B, LIX, CT-1, CD27L, endoglin , TRANCE, MCSF, 4-1BB, leptin R, CD36,
В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31) цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума с AD до уровня соответствующих цитокинов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих цитокинов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% цитокинов в профиле кишечных микробов, состоящем из цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение.In some embodiments, a change (e.g., increase or decrease) in the level of one or more (i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 or 31) cytokines selected from the following: OPG, resistin, TARC, VEGF, chemerin, IL -9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, granzyme B, LIX, CT-1, CD27L, endoglin , TRANCE, MCSF, 4-1BB, leptin R, CD36,
Настоящее изобретение относится к композиции, которая может прямо или непрямо изменять относительное содержание кишечных микробов до заданного уровня (такого как терапевтический уровень) в течение заданного периода времени (например, до применения следующей дозы). Заданный уровень может быть получен путем измерения относительного содержания микробиоты, которое привело к терапевтическому ответу (например, снижение уровней метаболитов, снижение инфильтрации лимфоцитов в головной мозг, снижение активации микроглии, снижение нейровоспаления, улучшение познавательных способностей, облегчение симптомов болезни Альцгеймера).The present invention relates to a composition that can directly or indirectly change the relative content of intestinal microbes to a given level (such as a therapeutic level) for a given period of time (for example, until the application of the next dose). Target levels can be obtained by measuring the relative microbiota content that resulted in a therapeutic response (e.g., reduced metabolite levels, decreased lymphocyte infiltration into the brain, decreased microglial activation, decreased neuroinflammation, improved cognition, improved symptoms of Alzheimer's disease).
В некоторых вариантах осуществления способа, средство или композиция по настоящему изобретению могут содержать достаточно очищенные или обогащенные кишечные микробы, так что средство или композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 5 масс.%, 10 масс.%, 20 масс.%, 30 масс.%, 40 масс.%, 50 масс.%, 60 масс.%, 70 масс.%, 80 масс.%, 85 масс.%, 90 масс.%, 95 масс.%, 99 масс.% или более желаемых кишечных микробов в расчете на массу средства или композиции, и/или менее чем приблизительно 40 масс.%, 30 масс.%, 20 масс.%, 15 масс.%, 14 масс.%, 13 масс.%, 12 масс.%, 11 масс.%, 10 масс.%, 9 масс.%, 8 масс.%, 7 масс.%, 6 масс.%, 5 масс.%, 4 масс.%, 3 масс.%, 2 масс.%, 1 масс.% или менее нежелательных кишечных микробов в расчете на массу средства или композиции.In some embodiments of the method, the agent or composition of the present invention may contain sufficiently purified or enriched intestinal microbes such that the agent or composition may contain at least about 5 wt.%, 10 wt.%, 20 wt.%, 30 wt. %, 40 wt.%, 50 wt.%, 60 wt.%, 70 wt.%, 80 wt.%, 85 wt.%, 90 wt.%, 95 wt.%, 99 wt.% or more desired intestinal microbes based on the weight of the agent or composition, and/or less than about 40 wt.%, 30 wt.%, 20 wt.%, 15 wt.%, 14 wt.%, 13 wt.%, 12 wt.%, 11 wt.%, 10 wt.%, 9 wt.%, 8 wt.%, 7 wt.%, 6 wt.%, 5 wt.%, 4 wt.%, 3 wt.%, 2 wt.%, 1 wt.% or less unwanted intestinal microbes, based on the weight of the tool or composition.
Средства и композиции, которые регулируют относительное содержание кишечных микробов в соответствии с настоящим изобретением, могут приводить к изменению метаболических функций. Например, измененная метаболическая функция может включать регуляцию уровня аминокислот среди микробных метаболитов.Agents and compositions that regulate the relative content of intestinal microbes in accordance with the present invention can lead to changes in metabolic functions. For example, altered metabolic function may include regulation of amino acid levels among microbial metabolites.
В некоторых вариантах осуществления при проведении детекции в образце периферической крови индивидуума, способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут регулировать уровень аминокислот приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 мкМ или более, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними; и/или делать уровень аминокислот близким к или достигать соответствующего уровня аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, when performing detection in a sample of the peripheral blood of an individual, the methods, tools and compositions of the present invention can adjust the level of amino acids by approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 , 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185 , 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 μM or more, or by the range defined by the endpoints of the aforementioned values, or by any value in between; and/or make the amino acid level close to or achieve an appropriate amino acid level in an appropriate normal individual.
В некоторых вариантах осуществления при проведении детекции в образце фекалий индивидуума, способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут регулировать уровень аминокислот приблизительно на 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 мкмоль/г мкМ или более, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними; и/или делать уровень аминокислот близким к или достигать соответствующего уровня аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, when performing detection in a faecal sample of an individual, the methods, agents and compositions of the present invention can adjust the level of amino acids by approximately 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 µmol/g µM or more, or over the range determined by the endpoints the aforementioned values, or any value in between; and/or make the amino acid level close to or achieve an appropriate amino acid level in an appropriate normal individual.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут вызывать измененную инфильтрацию иммунными клетками головного мозга. Например, доля провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток снижается. В некоторых вариантах осуществления средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать долю провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток в образце индивидуума приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делать долю провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток близкой или достигающей доли соответствующих провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the present invention may cause altered infiltration by immune cells in the brain. For example, the proportion of pro-inflammatory Th1 cells among CD4+ T cells is reduced. In some embodiments, the agents and compositions of the present invention may reduce the proportion of pro-inflammatory Th1 cells relative to CD4+ T cells in an individual's sample by about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% or more; and/or make the proportion of pro-inflammatory Th1 cells relative to CD4+ T cells close to or equal to the proportion of corresponding pro-inflammatory Th1 cells relative to CD4+ T cells in a corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать относительный захват аминокислот наивными T-клетками. В некоторых вариантах осуществления средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать относительный захват аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делать относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким или достигающим относительный уровень захвата аминокислот соответствующими наивными T-клетками у соответствующего нормального индивидуума.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the present invention may decrease the relative uptake of amino acids by naive T cells. In some embodiments, the agents and compositions of the present invention may reduce the relative uptake of amino acids by naïve T cells by approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 , 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 or more; and/or make the relative level of amino acid uptake by the naive T cells close to or equal to the relative level of amino acid uptake by the corresponding naive T cells in the corresponding normal individual.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут приводить к измененной активации микроглии в головном мозге. Например, измененная активация микроглии в головном мозге может включать повышение или снижение активации микроглии в головном мозге. Активация микроглии в головном мозге может повышаться или снижаться приблизительно на 1-100%, например, приблизительно на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% или 100%, или на любой диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними например, на от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или приблизительно на 7%, 14%, 21%, 28% и т.п.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the present invention may result in altered activation of microglia in the brain. For example, altered activation of microglia in the brain may include an increase or decrease in the activation of microglia in the brain. Microglia activation in the brain can increase or decrease by about 1-100%, for example, by about 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% or 100%, or any range, defined by the end points of the above values, or any value in between, for example, by about 7% to about 28%, etc., or by about 7%, 14%, 21%, 28%, etc.
В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по изобретению могут приводить к измененным уровням IBA1. Например, изменение уровня IBA1 может включать повышение или снижение уровня IBA1. Уровень IBA1 может быть повышен или снижен на от приблизительно 0 до приблизительно 3000 относительных уровней, например, на относительный уровень, составляющий приблизительно 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000 относительных уровней, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними, например, на от приблизительно 500 до приблизительно 3000, или приблизительно на 500, 1000, 1500 и т.п.In some embodiments, the methods, agents, and compositions of the invention may result in altered levels of IBA1. For example, changing the level of IBA1 may include increasing or decreasing the level of IBA1. The level of IBA1 can be increased or decreased by from about 0 to about 3000 relative levels, for example, by a relative level of about 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 , 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 170.00 relative levels by the range defined by the endpoints of the above values, or by any value in between, such as from about 500 to about 3000, or about 500, 1000, 1500, and the like.
СоставыLineups
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать кишечные микробы, которые могут регулировать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума. Кишечные микробы могут быть жизнеспособными (живыми), покоящимися, неактивными или погибшими бактериями. Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать соединение или средство, которые могут регулировать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума. Для изменения микробиоты у индивидуума можно использовать одно или несколько соединений. Такие соединения или средства могут включать, но не ограничиваться ими, антибиотики и/или антибактериальные средства, пребиотики, такие как компоненты клеточной стенки бактерий, бактериальные нуклеиновые кислоты (такие как ДНК и РНК), компоненты бактериальных мембран и структурные компоненты бактерий (такие как белки, углеводы, липиды и их комбинации, такие как липопротеины, сложные эфиры сахаров и гликопротеины), органические кислоты, неорганические кислоты, щелочи, белки и пептиды, ферменты и коферменты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, сахара, липиды, гликопротеины, липопротеины, сложные эфиры сахаров, витамины, биологически активные соединения, метаболиты, содержащие неорганические компоненты, низкомолекулярные соединения, такие как азотсодержащие молекулы или содержащие сернистую кислоту молекулы, стойкий крахмал, картофельный крахмал или крахмал с высоким содержанием амилозы, модифицированный крахмал (в том числе карбоксилированный крахмал, ацетилированный крахмал, пропионированный крахмал и бутилированный крахмал), не усваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахарид, олигодекстроза, ксилоолигосахарид, галактоолигосахарид, арабиноксилан, арабиногалактан, полисахариды галактоманнана, полидекстроза, олигофруктоза, инулин и их производные, однако другие олигосахариды, другие растворимые волокна и их комбинация, которые могут играть пребиотическую роль, не исключены. Сахар может быть выбран из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов или их производных, их комбинации и/или их производных; предпочтительно олигосахаридов и полисахаридов; более предпочтительно олигосахариды маннуроновой кислоты.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may contain intestinal microbes, which can regulate the relative content of intestinal microbes in an individual. Gut microbes can be viable (live), dormant, dormant, or dead bacteria. The agent or pharmaceutical composition of the present invention may contain a compound or agent that can regulate the relative content of intestinal microbes in an individual. One or more compounds can be used to alter the microbiota in an individual. Such compounds or agents may include, but are not limited to, antibiotics and/or antibacterial agents, prebiotics such as bacterial cell wall components, bacterial nucleic acids (such as DNA and RNA), bacterial membrane components, and bacterial structural components (such as proteins). , carbohydrates, lipids and combinations thereof such as lipoproteins, sugar esters and glycoproteins), organic acids, inorganic acids, alkalis, proteins and peptides, enzymes and coenzymes, amino acids and nucleic acids, sugars, lipids, glycoproteins, lipoproteins, esters sugars, vitamins, biologically active compounds, metabolites containing inorganic components, small molecular weight compounds such as nitrogen-containing molecules or molecules containing sulfurous acid, resistant starch, potato starch or starch with a high amylose content, modified starch (including carboxylated starch, acetylated starch , propionirov this starch and butylated starch), non-digestible oligosaccharides such as fructooligosaccharide, oligodextrose, xylooligosaccharide, galactooligosaccharide, arabinoxylan, arabinogalactan, galactomannan polysaccharides, polydextrose, oligofructose, inulin and their derivatives, but other oligosaccharides, other soluble fibers, and a combination thereof that may play a prebiotic role are not excluded. The sugar may be selected from monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides or derivatives thereof, combinations thereof and/or derivatives thereof; preferably oligosaccharides and polysaccharides; more preferably mannuronic acid oligosaccharides.
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также могут включать, например, аминокислоты, аминосахара, спирты сахаров, белки, углеводы, моносахариды, дисахариды, олигосахариды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, буферы, поверхностно-активные вещества, липиды, липосомы, другие эксципиенты и их смеси. Другие пригодные ингредиенты могут включать стероиды, противовоспалительные средства, нестероидные противовоспалительные средства, болеутоляющие средства, клетки, противовоспалительные средства, факторы роста, фрагменты факторов роста, низкомолекулярные стимуляторы заживления ран, гормоны, цитокины, пептиды, антитела, ферменты, выделенные клетки, тромбоциты, иммунодепрессанты, нуклеиновые кислоты, типы клеток, вирусы, вирусные частицы, незаменимые питательные вещества, минералы, металлы или витамины, и их комбинацию. Кроме того, средства и композиции по настоящему изобретению могут включать разбавители, такие как вода, солевой раствор или буфер.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may also include, for example, amino acids, amino sugars, sugar alcohols, proteins, carbohydrates, monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, nucleic acids, buffers, surfactants, lipids, liposomes, other excipients and their mixtures. Other useful ingredients may include steroids, anti-inflammatory drugs, non-steroidal anti-inflammatory drugs, painkillers, cells, anti-inflammatory drugs, growth factors, growth factor fragments, small molecule wound healing promoters, hormones, cytokines, peptides, antibodies, enzymes, isolated cells, platelets, immunosuppressants , nucleic acids, cell types, viruses, viral particles, essential nutrients, minerals, metals or vitamins, and combinations thereof. In addition, the agents and compositions of the present invention may include diluents such as water, saline or buffer.
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены в качестве фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все физиологически совместимые растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для доставки индивидууму. Фармацевтическая композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из следующих: вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, глюкоза, глицерин, этанол и т.д., и их комбинацию. Во многих случаях предпочтительно включать в композиции обеспечивающие изотоничность средства, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, a "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all physiologically compatible diluents, dispersants, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, absorption delay agents, and the like. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for delivery to an individual. The pharmaceutical composition may also include a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, a "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all physiologically compatible solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, absorption delay agents, and the like. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include one or more of the following: water, saline, phosphate buffered saline, glucose, glycerol, ethanol, etc., and combinations thereof. In many cases it is preferable to include isotonicity agents such as sugars, polyhydric alcohols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride in the compositions.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые формы препарата, такие как жидкие растворы (такие как инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы, суппозитории и другие составы. Фармацевтическая композиция может быть составлена для высокой концентрации лекарственного средства. Фармацевтическая композиция, кроме того, может быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения. Стерильные инъекционные растворы можно получать путем включения в них одного из ингредиентов, перечисленных выше, или их комбинации (при необходимости) в подходящем растворителе в требуемом количестве с последующей фильтрацией и стерилизацией.The pharmaceutical composition may be formulated in various forms. They include, for example, liquid, semi-solid and solid form preparations such as liquid solutions (such as injectable and infusion solutions), dispersions or suspensions, tablets, pills, powders, liposomes, suppositories and other formulations. The pharmaceutical composition may be formulated for a high drug concentration. The pharmaceutical composition may also be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. Sterile injectable solutions can be obtained by including one of the ingredients listed above, or a combination of them (if necessary) in a suitable solvent in the required amount, followed by filtration and sterilization.
Иллюстративная форма фармацевтической композиции может зависеть от предполагаемого способа доставки и терапевтического применения. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию составляют для пероральной доставки. Некоторые композиции могут быть в форме доставки на основе пилюль (как описано в патентной заявке США № 12/976648 под названием "pill catchers", поданной 22 октября 2010 года) и иметь пролонгированное высвобождение. В одном варианте осуществления доставка на основе пилюль может быть частью системы, которая позволяет доставку в конкретное положение в кишечном тракте. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена в качестве состава с замедленным высвобождением. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть заключена в покрытие, которое не начинает деградировать до тех пор, пока не покинет желудок. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть получена с носителем, который защищает композицию от быстрого высвобождения, например, в случае состава с замедленным или контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Для многих способов получения таких составов были выданы права на патент, или они хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. "Замедленное высвобождение" относится к высвобождению композиции или ее активного соединения на протяжении пролонгированного периода времени относительно высвобождения, достигаемого посредством доставки общепринятого состава композиции.The exemplary form of the pharmaceutical composition may depend on the intended mode of delivery and therapeutic application. In one embodiment, the pharmaceutical composition is formulated for oral delivery. Some compositions may be in a pill-based delivery form (as described in US Patent Application No. 12/976,648 titled "pill catchers" filed Oct. 22, 2010) and have extended release. In one embodiment, pill-based delivery may be part of a system that allows delivery to a specific location in the intestinal tract. In another embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated as a sustained release formulation. In another embodiment, the pharmaceutical composition may be enclosed in a coating that does not begin to degrade until it leaves the stomach. In another embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated with a carrier that protects the composition from rapid release, such as in the case of a sustained or controlled release formulation, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid can be used. Many methods for preparing such formulations have been granted patent rights or are well known to those skilled in the art. See, for example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. "Sustained release" refers to the release of a composition or active compound thereof over an extended period of time relative to the release achieved by delivery of a conventional composition formulation.
Другой тип фармацевтической композиции включает активируемую форму, как например, составление композиции с микробиотой в покоящемся или неактивном состоянии (например, в лиофилизированном состоянии). В комбинированной композиции микробиота может присутствовать в покоящемся или неактивном состоянии, или соединение или агент, в котором культивируется микробиота, может быть неактивным. В одном иллюстративном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена так, чтобы включать по меньшей мере один тип покоящейся или неактивной микробиоты и неактивное соединение или вещество, которое культивирует микробиоту.Another type of pharmaceutical composition includes an activated form, such as formulation with the microbiota in a dormant or inactive state (eg, in a lyophilized state). In the combined composition, the microbiota may be present in a dormant or inactive state, or the compound or agent in which the microbiota is cultured may be inactive. In one exemplary embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated to include at least one type of resting or inactive microbiota and an inactive compound or substance that cultivates the microbiota.
Описанные фармацевтические композиции и комбинированные фармацевтические композиции также могут быть составлены в форме продуктов питания, напитков, пищевых добавок и/или дополнительных веществ. Такие композиции представляют собой композиции, пригодные для употребления человеком и/или животным. Специалистам в данной области могут быть хорошо известны конкретные составы микробиоты, которые могут использоваться в пероральных или принимаемых внутрь составах, и они считаются пригодными для введения человеку и/или животному. Множество композиций используется для производства пищи или пищевых добавок/дополнительных веществ; таким образом, другим важным аспектом является предоставление человеку или животному продуктов питания или пищевых добавок/дополнительных веществ, включающих микробиоту, для регуляции кишечных микробов у индивидуума.The described pharmaceutical compositions and combination pharmaceutical compositions can also be formulated as foodstuffs, beverages, nutritional supplements and/or additional substances. Such compositions are compositions suitable for human and/or animal consumption. Those skilled in the art may be well aware of specific microbiota formulations that can be used in oral or ingestible formulations and are considered suitable for human and/or animal administration. Many compositions are used for the production of food or nutritional supplements/additional substances; thus, another important aspect is to provide a human or animal with food or nutritional supplements/supplements that include microbiota for the regulation of gut microbes in an individual.
Пригодная для употребления композиция может быть составлена так, чтобы она включала подсластители, стабилизаторы или связующие вещества, увлажнители и/или натуральные и/или искусственные вкусовые добавки. Композиция также может включать натуральные и/или искусственные красители и консерванты. В одном варианте осуществления композиция может включать моносахариды, дисахариды и полисахариды, такие как, но не ограничиваясь ими, сахароза (сахар), декстроза, мальтоза, декстрин, ксилоза, рибоза, глюкоза, манноза, галактоза, сукромальт, фруктоза (левоза), инвертированный сахар, кукурузный сироп, мальтодекстрин, олигофруктозный сироп, частично гидролизованный крахмал, сухая кукурузная патока, полидекстроза, растворимое волокно, нерастворимое волокно, натуральный сок сахарного тростника, желатин, лимонная кислота, молочная кислота, натуральные красители, натуральные вкусовые добавки, фракционированное кокосовое масло, карнаубский воск или их комбинация.A consumable composition may be formulated to include sweeteners, stabilizers or binders, humectants, and/or natural and/or artificial flavors. The composition may also include natural and/or artificial colors and preservatives. In one embodiment, the composition may include monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides such as, but not limited to, sucrose (sugar), dextrose, maltose, dextrin, xylose, ribose, glucose, mannose, galactose, sucromalt, fructose (levose), inverted Sugar, Corn Syrup, Maltodextrin, Oligofructose Syrup, Partially Hydrolysed Starch, Dry Corn Syrup, Polydextrose, Soluble Fiber, Insoluble Fiber, Natural Cane Juice, Gelatin, Citric Acid, Lactic Acid, Natural Colors, Natural Flavors, Fractionated Coconut Oil, carnauba wax or a combination.
ДозировкаDosage
Средство или композиция по настоящему изобретению может содержать "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" ингредиентов. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического результата в требуемой дозе и в течение некоторого периода времени. Терапевтически эффективное количество средства или фармацевтической композиции может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как болезненное состояние индивидуума, возраст, пол и состояние головного мозга, и способность композиции вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, в котором терапевтически благоприятные эффекты средства или фармацевтической композиции превышают токсические или вредоносные эффекты средства или фармацевтической композиции. В иллюстративном варианте осуществления терапевтически эффективное количество средства или фармацевтической композиции представляет собой количество, в котором относительное содержание одного или нескольких кишечных микробов возрастает. Например, терапевтически эффективное количество средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов повышает относительное содержание одного или нескольких кишечных микробов у индивидуума.The agent or composition of the present invention may contain a "therapeutically effective amount" or "effective amount" of the ingredients. "Therapeutically effective amount" refers to an amount that is effective to achieve the desired therapeutic result at the required dose and for a certain period of time. The therapeutically effective amount of the agent or pharmaceutical composition may vary depending on various factors such as the disease state of the individual, age, sex and brain state, and the ability of the composition to elicit the desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also the amount in which the therapeutically beneficial effects of the agent or pharmaceutical composition outweigh the toxic or deleterious effects of the agent or pharmaceutical composition. In an exemplary embodiment, a therapeutically effective amount of an agent or pharmaceutical composition is an amount in which the relative content of one or more intestinal microbes is increased. For example, a therapeutically effective amount of an agent for regulating the relative abundance of intestinal microbes increases the relative abundance of one or more intestinal microbes in an individual.
Как используют в рамках изобретения, термин "лечение", главным образом, относится к достижению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения заболевания или его симптомов; и/или он может быть терапевтическим с точки зрения частичной или полной стабилизации или лечения заболевания и/или побочных эффектов заболевания. "Лечение", как используют в рамках изобретения, охватывает любое лечение заболевания пациента, включая: (a) предупреждение заболеваний или симптомов, которые возникают у пациентов, которые являются предрасположенными к заболеваниям или симптомам, но у которых еще не диагностировано заболевание; (b) ингибирование симптомов заболевания, например, ингибирование прогрессирования заболевания и предупреждение развития заболевания; или (c) облегчение симптомов заболевания, т.е. обеспечение угасания заболевания или симптомов.As used within the scope of the invention, the term "treatment" mainly refers to the achievement of the desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of total or partial prevention of the disease or its symptoms; and/or it may be therapeutic in terms of partial or complete stabilization or treatment of the disease and/or side effects of the disease. "Treatment", as used herein, encompasses any treatment of a disease in a patient, including: (a) prevention of diseases or symptoms that occur in patients who are predisposed to diseases or symptoms but who have not yet been diagnosed with a disease; (b) inhibiting the symptoms of the disease, for example, inhibiting the progression of the disease and preventing the development of the disease; or (c) alleviating the symptoms of the disease, i. e. ensuring the extinction of the disease or symptoms.
ПоказанияIndications
Путем исследования в рамках настоящего изобретения авторы изобретения обнаружили, что аномальный кишечный микробный паттерн вызывал сверхдифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки, и уровень Th1-клеток в периферической крови возрастал аномальным образом. Повышенные уровни периферических Th1-клеток вызывают инфильтрацию большего количества Th1-клеток в головной мозг, вызывая заболевания, такие как болезнь Альцгеймера. Путем восстановления кишечной микробиоты, дифференцировка наивных T-клеток в Th1-клетки может быть снижена, и аномально повышенный уровень Th1-клеток в периферической крови может быть снижен, тем самым осуществляя лечение заболевания. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с высокими уровнями Th1-клеток в периферической крови у индивидуума, причем способ включает регуляцию относительного содержания кишечных микробов у индивидуума, как описано в настоящем описании, снижение уровня аминокислот в периферической крови, как описано в настоящем описании, или ингибирование захвата наивными T-клетками аминокислоты в периферической крови, как описано в настоящем описании.Through research within the scope of the present invention, the inventors found that an abnormal intestinal microbial pattern caused naive T cells to overdifferentiate into Th1 cells, and the level of Th1 cells in the peripheral blood increased in an abnormal manner. Elevated levels of peripheral Th1 cells cause more Th1 cells to infiltrate into the brain, causing diseases such as Alzheimer's disease. By restoring the gut microbiota, differentiation of naïve T cells into Th1 cells can be reduced, and abnormally elevated levels of Th1 cells in peripheral blood can be reduced, thereby curing the disease. Thus, the present invention relates to a method of treating diseases associated with high levels of Th1 cells in the peripheral blood of an individual, and the method includes regulating the relative content of intestinal microbes in the individual, as described in the present description, reducing the level of amino acids in the peripheral blood, as described in the present description, or inhibition of uptake by naive T cells of an amino acid in peripheral blood, as described in the present description.
Термины "доминантность Th1" и "доминантность клеток Th1" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. В некоторых случаях, доминантность Th1 может быть представлена высокими уровнями Th1-клеток в периферической крови. Высокий уровень Th1-клеток в периферической крови может относиться к уровню Th1-клеток в периферической крови индивидуума, на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% или превышающему уровень у подходящего контроля (например, нормальный контроль, такой как выборка здоровых людей), или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними, например, на от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или на приблизительно 7%, 14%, 21%, 28% и т.п. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, рассеянный склероз, болезнь Крона, диабет 1 типа, ревматоидный артрит, тиреоидит Хашимото, витилиго, синдром Шегрена, поликистоз яичника (PCOS), целиакию и болезнь Грэйвса.The terms "Th1 dominance" and "Th1 cell dominance" are used interchangeably herein. In some cases, Th1 dominance may be represented by high levels of Th1 cells in the peripheral blood. A high level of Th1 cells in the peripheral blood can refer to the level of Th1 cells in the peripheral blood of an individual, at 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% , 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250 %, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% or above a suitable control (for example, a normal control, such as a sample of healthy people), or a range defined by the end points of the above values, or any value in between, for example, from about 7% to about 28%, etc., or by about 7%, 14%, 21%, 28%, etc. Such diseases include, but are not limited to, multiple sclerosis, Crohn's disease,
Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к любому живому организму, включая, но не ограничиваясь ими, людей, не являющихся человеком приматов, таких как шимпанзе и другие человекообразные обезьяны и мартышки, сельскохозяйственных животных, таких как коровы, овцы, свиньи, козы и лошади, домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки, лабораторные животные, включая грызунов, таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.п. Термин не указывает на конкретный возраст и пол. В одном варианте осуществления индивидуумом является человек. В контексте настоящего изобретения термины "субъект", "индивидуум" и "пациент" используются взаимозаменяемо.As used herein, the term "individual" refers to any living organism, including, but not limited to, humans, non-human primates such as chimpanzees and other great apes and marmosets, farm animals such as cows, sheep, pigs. , goats and horses, domestic mammals such as dogs and cats, laboratory animals including rodents such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, and the like. The term does not indicate a specific age or gender. In one embodiment, the individual is a human. In the context of the present invention, the terms "subject", "individual" and "patient" are used interchangeably.
В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума превышает их относительное содержание у здорового индивидуума. В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума является более низким, чем у здорового индивидуума. В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума превышает их относительно содержание у здорового индивидуума, и относительное содержание другого одного или нескольких микроорганизмов является более низким, чем у здорового индивидуума.In one embodiment, the relative content of one or more intestinal microorganisms in an individual exceeds their relative content in a healthy individual. In one embodiment, the relative content of one or more intestinal microorganisms in an individual is lower than in a healthy individual. In one embodiment, the relative content of one or more intestinal microorganisms in an individual exceeds their content in a healthy individual, and the relative content of the other one or more microorganisms is lower than that of a healthy individual.
Дозировка может зависеть от типа микробиоты, присутствующей в средстве или фармацевтической композиции по изобретению. Дозировка также может быть определена на основе относительного содержания одного или нескольких типов микробиоты, присутствующих у индивидуума.The dosage may depend on the type of microbiota present in the agent or pharmaceutical composition of the invention. The dosage may also be determined based on the relative content of one or more types of microbiota present in the individual.
В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может эффективно изменять относительное содержание одного или нескольких типов микробиоты. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция может эффективно повышать или снижать относительное содержание микробиоты у индивидуума. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция может повышать или снижать относительное содержание конкретных микроорганизмов микробиоты у индивидуума и снижать относительное содержание других конкретных микроорганизмов микробиоты у индивидуума.In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention can effectively change the relative content of one or more types of microbiota. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition can effectively increase or decrease the relative microbiota content of an individual. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition can increase or decrease the relative abundance of specific microbiota microorganisms in an individual and decrease the relative abundance of other specific microbiota microorganisms in an individual.
В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может эффективно изменять микробиоту у индивидуума, так что после введения средства или фармацевтической композиции микробиота у индивидуума имитирует микробиоту, присутствующую у индивидуума, отвечающего на процесс лечения болезни Альцгеймера. Средство или фармацевтическая композиция может эффективно изменять микробиоту для имитации микробиоты у нормальных и здоровых индивидуумов со сходным состоянием головного мозга, возрастом, полом, расой и т.п.In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention can also effectively alter the microbiota in an individual such that, upon administration of the agent or pharmaceutical composition, the individual's microbiota mimics the microbiota present in an individual responding to an Alzheimer's disease treatment process. The agent or pharmaceutical composition can effectively alter the microbiota to mimic the microbiota of normal and healthy individuals with similar brain conditions, age, sex, race, and the like.
Режим дозирования можно корректировать для обеспечения наиболее подходящего желаемого ответа (такого как терапевтический ответ или профилактический ответ). Например, можно доставлять однократный болюс, можно доставлять множество разделенных доз с течением времени или дозу можно снижать или повышать пропорционально необходимости ситуации лечения. Особенно преимущественным является составление парентеральных композиций в виде единичной дозированной формы для облегчения доставки и единообразия дозировок. Единичная дозированная форма, как используют в рамках изобретения, относится к физически дискретной единице, пригодной в качестве однократной дозы для млекопитающего, подвергаемого лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное для достижения желаемого терапевтического эффекта, в комбинации с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики единичной дозированной формы, используемой в рамках настоящего изобретения, определяются или прямо зависят от следующих: (a) уникальные свойства активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, подлежащего достижению; и (b) ограничения, присущие области комбинирования этого активного соединения для индивидуальной терапии.The dosage regimen can be adjusted to provide the most appropriate desired response (such as a therapeutic response or a prophylactic response). For example, a single bolus may be delivered, multiple divided doses may be delivered over time, or the dose may be reduced or increased in proportion to the need of the treatment situation. It is particularly advantageous to formulate parenteral compositions in unit dosage form for ease of delivery and dosage uniformity. A unit dosage form, as used herein, refers to a physically discrete unit suitable as a single dose for a mammal to be treated; each unit contains a predetermined amount of the active compound, calculated to achieve the desired therapeutic effect, in combination with the required pharmaceutical carrier. The characteristics of the unit dosage form used in the present invention are determined by or directly dependent on the following: (a) the unique properties of the active compound and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved; and (b) the limitations inherent in the field of combination of this active compound for individual therapy.
При применении для способов, предусматриваемых в рамках настоящего изобретения, иллюстративный диапазон дозировок для средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может составлять от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг/кг массы тела в сутки, как например, от приблизительно 0,05 до приблизительно 10 мг/кг массы тела в сутки, доставляемые за одну или несколько доз, например, 1-3 дозы. Точная дозировка зависит от частоты и способа доставки, пола, возраста, массы тела и общего состояния индивидуума, подвергаемого лечения, природы и тяжести состояния, подвергаемого лечению, любых сопутствующих заболеваний, которые будут подвергаться лечению, и других факторов, известных специалистам в данной области.When used for the methods contemplated by the present invention, an exemplary dosage range for the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be from about 0.001 to about 100 mg/kg of body weight per day, from about 0.01 to about 50 mg/kg of body weight body per day, such as from about 0.05 to about 10 mg/kg of body weight per day, delivered in one or more doses, for example, 1-3 doses. The exact dosage depends on the frequency and method of delivery, sex, age, body weight and general condition of the individual being treated, the nature and severity of the condition being treated, any comorbidities to be treated, and other factors known to those skilled in the art.
В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг. В следующем варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг.In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention contains a microbiota, such as Verrucomicrobia , having a total concentration ranging from about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition contains a microbiota, such as Verrucomicrobia , having a total concentration in the range of about 0.1 mg/kg to about 50 mg/kg. In a further embodiment, the agent or pharmaceutical composition comprises a microbiota, such as Verrucomicrobia , having a total concentration in the range of about 1 mg/kg to about 10 mg/kg.
В некоторых аспектах средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, вводят в дозах в расчете на массу тела индивидуума. В некоторых вариантах осуществления средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, содержат одно или несколько средств, упоминаемых в настоящем описании, в количестве в расчете на массу тела индивидуума.In some aspects, the agents, compositions, or kits described herein are administered in doses based on the individual's body weight. In some embodiments, the agents, compositions or kits described herein contain one or more of the agents mentioned herein in an amount based on the body weight of the individual.
В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании, находится в диапазоне от приблизительно 1,0 до приблизительно 50,0 мг/кг или более, предпочтительно приблизительно от 5,0 до 40,0 мг/кг, более предпочтительно приблизительно от 10,0 до 30,0 мг/кг, в расчете на массу тела индивидуума. В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании, составляет приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 23,5, 24,0, 24,5, 25,0, 25,5, 26,0, 26,5, 27,0, 27,5, 28,0, 28,5, 29,0, 29,5, 30,0, 30,5, 31,0, 31,5, 32,0, 32,5, 33,0, 33,5, 34,0, 34,5, 35,0, 35,5, 36,0, 36,5, 37,0, 37,5, 38,0, 38,5, 39,0, 39,5, 40,0, 40,5, 41,0, 41,5, 42,0, 42,5, 43,0, 43,5, 44,0, 44,5, 45,0, 45,5, 46,0, 46,5, 47,0, 47,5, 48,0, 48,5, 49,0, 49,5, 50,0 мг/кг или более, или любой диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или любую величину между ними, как например, приблизительно от 1,1 до 1,4 мг/кг и т.п., или приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 мг/кг и т.п. в расчете на массу тела индивидуума.In some embodiments, the amount of one or more of the agents mentioned herein in the agents, compositions, or kits described herein ranges from about 1.0 to about 50.0 mg/kg or more, preferably from about 5 0 to 40.0 mg/kg, more preferably from about 10.0 to 30.0 mg/kg, based on the body weight of the individual. In some embodiments, the amount of one or more agents mentioned herein in the agents, compositions, or kits described herein is approximately 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3 .5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 , 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16 .0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 20.5, 21.0, 21.5, 22.0 , 22.5, 23.0, 23.5, 24.0, 24.5, 25.0, 25.5, 26.0, 26.5, 27.0, 27.5, 28.0, 28 .5, 29.0, 29.5, 30.0, 30.5, 31.0, 31.5, 32.0, 32.5, 33.0, 33.5, 34.0, 34.5 , 35.0, 35.5, 36.0, 36.5, 37.0, 37.5, 38.0, 38.5, 39.0, 39.5, 40.0, 40.5, 41 .0, 41.5, 42.0, 42.5, 43.0, 43.5, 44.0, 44.5, 45.0, 45.5, 46.0, 46.5, 47.0 , 47.5, 48.0, 48.5, 49.0, 49.5, 50.0 mg/kg or more, or any range defined by the endpoints of the above values, or any value in between, such as, about 1.1 to 1.4 mg/kg, etc., or about 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 mg/kg etc. based on the body weight of the individual.
В других аспектах средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, вводят в фиксированных дозах. В некоторых вариантах осуществления средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, содержат фиксированное количество одного или нескольких средств, упомянутых в настоящем описании.In other aspects, the agents, compositions or kits described herein are administered in fixed doses. In some embodiments, the agents, compositions, or kits described herein contain a fixed amount of one or more of the agents mentioned herein.
В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании в каждом случае независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 мг или более, или диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или любую величину между ними, например, приблизительно от 1,1 до 1,4 мг и т.п. или приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 и т.п.In some embodiments, the amount of one or more of the agents mentioned herein in the agents, compositions, or kits described herein is independently 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 at each occurrence. , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 , 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 mg or more, or endpoint range of the above values, or any value in between, for example, from about 1.1 to 1.4 mg, and the like. or about 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, or the like.
В других аспектах некоторые из компонентов средств, композиций или наборов, описанных в настоящем описании, вводят в дозах по массе индивидуума, как описано выше, в то время как другие компоненты вводят в фиксированных дозах, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления количества некоторых из компонентов в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании. представляют собой количества на основе массы индивидуума, как описано выше, а другие компоненты представляют собой фиксированные количества, как описано выше.In other aspects, some of the components of the agents, compositions or kits described herein are administered at individual weight doses as described above, while other components are administered at fixed doses as described above. In some embodiments, the amounts of some of the components in the agents, compositions, or kits described herein. are amounts based on the weight of the individual, as described above, and the other components are fixed amounts, as described above.
ДоставкаDelivery
Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению можно доставлять или вводить различными способами, известными в данной области. Термины "доставка", "доставлять", "вводить" и "применять" используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Как будет понятно специалистам в данной области, путь и/или способ доставки варьируется в зависимости от желаемого результата. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическую композицию по изобретению доставляют перорально. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическую композицию по изобретению доставляют перорально. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по изобретению доставляют назальным путем. Другой способ доставки может включать способы и комбинации для доставки в кишечник.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can be delivered or administered by various methods known in the art. The terms "delivery", "deliver", "administer", and "apply" are used interchangeably herein. As will be understood by those skilled in the art, the route and/or method of delivery varies depending on the desired result. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention is delivered orally. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention is delivered orally. In another embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the invention is delivered by the nasal route. Another delivery method may include methods and combinations for delivery to the intestine.
Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять в заданную область и/или структуру у индивидуума. Область, на которую может быть осуществлено нацеливание в кишечнике, может включать, но не ограничивается ими, желудок, билиарно-панкреатическую ветвь (сегмент), ветвь Ру, общую ветвь, подвздошную кишку, слепую кишку или ободочную кишку. Они могут быть нацелены на структуру, которая составляет область с индивидуализированной средой с конкретным диапазоном pH, температурой, влажности и содержанием метаболитов. Заболевания или состояния, ассоциированные с измененной генеалогией микробиоты, могут демонстрировать присутствие новых микроорганизмов, отсутствие нормальных микроорганизмов или изменение соотношения микроорганизмов.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can be delivered to a given area and/or structure in an individual. The region that can be targeted in the intestine may include, but is not limited to, the stomach, the biliary-pancreatic branch (segment), the Roux branch, the common branch, the ileum, the caecum, or the colon. They can be targeted to a structure that constitutes an individualized environment with a specific pH range, temperature, humidity, and metabolite content. Diseases or conditions associated with altered microbiota genealogy may show the presence of new microorganisms, the absence of normal microorganisms, or a change in the ratio of microorganisms.
Доставка средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть нацелена на одну или несколько областей у индивидуума. Область может включать, но не ограничивается ими, область в кишечнике. В иллюстративном варианте осуществления доставка нацелена на полость рта, желудок, билиарно-панкреатическую ветвь, ветвь Ру, общую ветвь, тонкую кишку, подвздошную кишку, слепую кишку, толстую кишку или ободочную кишку в кишечнике. Доставка также может быть нацелена на одну или несколько тканей индивидуума. Ткань может включать любую ткань в кишечнике, такую как ткань желудка, билиарно-панкриатической ветви, ветви Ру, общей ветви, тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки или ободочной кишки.Delivery of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be targeted to one or more areas in an individual. The area may include, but is not limited to, the area in the intestine. In an exemplary embodiment, delivery is targeted to the oral cavity, stomach, biliary-pancreatic branch, Roux branch, common branch, small intestine, ileum, cecum, colon, or colon in the intestine. Delivery can also be targeted to one or more tissues of an individual. The tissue may include any tissue in the intestine, such as that of the stomach, biliary-pancreatic ramus, roux, common ramus, small intestine, ileum, caecum, colon, or colon.
Компоненты средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть составлены по отдельности, или часть из них может быть составлена вместе. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены в виде средства или фармацевтической композиции, пригодных для однократного или многократного введения.The components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be formulated separately, or some of them may be formulated together. In one embodiment, the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as an agent or pharmaceutical composition suitable for single or multiple administration.
Компоненты средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть введены по отдельности, или часть или все из них могут быть введены вместе. Средства или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть введены по существу в разные моменты времени, или некоторые или все из них могут быть введены по существу одновременно.The components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be administered separately, or some or all of them may be administered together. The agents or components of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at substantially different times, or some or all of them may be administered at substantially the same time.
Каждое из средств или компонентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть независимо введено различными подходящими путями, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный или парентеральный (внутривенный, внутримышечный, местный или подкожный пути). В некоторых вариантах осуществления каждый из компонентов средств или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть независимо введен пероральным путем или посредством инъекции, например, посредством внутривенной инъекции или внутрибрюшинной инъекции.Each of the agents or components of the pharmaceutical composition of the present invention may be independently administered by a variety of suitable routes, including, but not limited to, oral or parenteral (intravenous, intramuscular, topical, or subcutaneous routes). In some embodiments, each of the components of the agents or pharmaceutical composition of the present invention may be independently administered orally or by injection, for example, by intravenous injection or intraperitoneal injection.
Каждый из компонентов средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может независимо представлять собой подходящую дозированную форму, включая, но не ограничиваясь ими, дозированные формы таблеток, лепешек, пилюль, капсул (например, твердые капсулы, мягкие капсулы, покрытые кишечно-растворимой оболочкой капсулы, микрокапсулы), эликсиров, гранул, сиропов, инъекционных форм (внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные), гранул, эмульсий, суспензий, растворов, дисперсий и препаратов замедленного высвобождения для перорального или парентерального введения.Each of the components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may independently be a suitable dosage form, including, but not limited to, dosage forms of tablets, lozenges, pills, capsules (e.g., hard capsules, soft capsules, enteric-coated capsules, microcapsules), elixirs, granules, syrups, injectables (intramuscular, intravenous, intraperitoneal), granules, emulsions, suspensions, solutions, dispersions and sustained release preparations for oral or parenteral administration.
Каждое из средств или компонентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению может независимо содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.Each of the agents or components of the pharmaceutical composition of the present invention may independently contain a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient.
Средства по настоящему изобретению или компоненты фармацевтической композиции можно вводить независимо каждые 1 сутки, каждые 2 суток, каждые 3 суток, каждые 4 суток, каждые 5 суток, каждые 6 суток, каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели или каждый месяц или с меньшей частотой.The agents of the present invention or components of the pharmaceutical composition can be administered independently every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, every 5 days, every 6 days, every week, every 2 weeks, every 3 weeks, or every month or from lower frequency.
Средства по настоящему изобретению или компоненты в фармацевтической композиции могут быть введены независимо 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз или более в сутки.The agents of the present invention or components in the pharmaceutical composition can be administered independently 1 time, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times or 10 times or more per day.
Средства по настоящему изобретению или компоненты фармацевтической композиции можно вводить независимо в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 последовательных суток или более.The agents of the present invention or components of the pharmaceutical composition can be administered independently within 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 consecutive days or more.
Один из компонентов средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть введен за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более суток до или после введения другого компонента. Например, в одном варианте осуществления средство или компонент 1 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят на 1 сутки, и средство или компонент 2 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят через 2 суток (т.е. на 3 сутки), и средство или компонент 1 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят через другие трое суток (т.е. на 6 сутки).One of the components of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be administered 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 or more days before or after the administration of the other component. For example, in one embodiment, the agent or
Доставку средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению также можно повторять один или несколько раз. Повторная доставка средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть осуществлена один или несколько раз до и/или после лечения заболевания. Повторная доставка может быть осуществлена аналогичным образом с первоначальной доставкой.The delivery of the agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be repeated one or more times. Re-delivery of the agent or pharmaceutical composition of the present invention may be carried out one or more times before and/or after the treatment of the disease. Re-delivery can be made in the same way as the original delivery.
Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить вместе со средством, которое может включать терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство. Терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство выбрано из низкомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот, белков, таких как полипептидные пребиотики, включая бактериальные компоненты (такие как компоненты клеточной стенки бактерий (такие как пептидогликан), бактериальная нуклеиновая кислота (такая как ДНК и РНК), компоненты бактериальной мембраны и структурные компоненты бактерий (такие как белки, углеводы, липиды и их комбинации, такие как липопротеины, сложные эфиры сахаров и гликопротеин)), бактериальные метаболиты, органические кислоты, неорганические кислоты, основания, белки и пептиды, ферменты и коферменты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, гликопротеины, липопротеины, сложные эфиры сахаров, витамины, биологически активные соединения, метаболиты, содержащие неорганические компоненты, низкомолекулярные соединения (например, азотсодержащие молекулы или содержащие сернистую кислоту молекулы), стойкий крахмал, картофельный крахмал или крахмал с высоким содержанием амилозы, модифицированный крахмал (включая карбоксилированный крахмал, ацетилированный крахмал, пропионированный крахмал и бутилированный крахмал), усваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды, декстроза, ксилоолигосахарид, галактоолигосахарид, арабиноксилан, арабиногалактан, полисахариды галактоманнан, полидекстран, олигофруктоза, инулин и их производные (однако другие олигосахариды, которые могут играть роль пребиотиков, не исключены), другие растворимые волокна и их комбинация. В одном варианте осуществления доставляемое средство представляет собой доставляемое низкомолекулярное соединение, которое имеет низкую пероральную биодоступность и действует на область микроорганизмов в кишечнике хозяина. Низкая биодоступность обычно является нежелательной в медицине, поскольку кишечное всасывание является целью большинства пероральных способов лечения.The agent or pharmaceutical composition of the present invention may also be administered with an agent, which may include a therapeutic, prophylactic, or diagnostic agent. The therapeutic, prophylactic or diagnostic agent is selected from small molecule compounds, nucleic acids, proteins such as polypeptide prebiotics, including bacterial components (such as bacterial cell wall components (such as peptidoglycan), bacterial nucleic acid (such as DNA and RNA), bacterial components membranes and structural components of bacteria (such as proteins, carbohydrates, lipids and combinations thereof such as lipoproteins, sugar esters and glycoprotein)), bacterial metabolites, organic acids, inorganic acids, bases, proteins and peptides, enzymes and coenzymes, amino acids and nucleic acids, carbohydrates, lipids, glycoproteins, lipoproteins, sugar esters, vitamins, biologically active compounds, metabolites containing inorganic components, small molecular weight compounds (for example, nitrogen-containing molecules or molecules containing sulfurous acid), resistant starch, potato starch or starch with high amylose, modified starch (including carboxylated starch, acetylated starch, propionated starch and butylated starch), digestible oligosaccharides such as fructooligosaccharides, dextrose, xylooligosaccharide, galactooligosaccharide, arabinoxylan, arabinogalactan, galactomannan polysaccharides, polydextran, oligofructose, inulin and their derivatives ( however, other oligosaccharides that may act as prebiotics are not excluded), other soluble fibers, and a combination thereof. In one embodiment, the delivered agent is a delivered small molecule compound that has low oral bioavailability and acts on a microbial site in the host's gut. Low bioavailability is generally undesirable in medicine since intestinal absorption is the target of most oral treatments.
Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить в той же композиции, что и вышеупомянутое средство, или их можно вводить отдельно от средства, вводимого до, одновременно и/или после средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить по меньшей мере приблизительно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или более суток до введения средства. Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить по меньшей мере приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или более суток после введения средства.The agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the same composition as the aforementioned agent, or they can be administered separately from the agent administered before, simultaneously and/or after the agent or pharmaceutical composition of the present invention. The agent or pharmaceutical composition of the present invention may be administered at least about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or more days prior to drug administration. The agent or pharmaceutical composition of the present invention can also be administered at least about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or more days after administration of the agent.
Средство или фармацевтическую композицию по изобретению также можно доставлять посредством по меньшей мере частично имплантируемой системы. Имплантируемая система может представлять собой любую систему, известную и используемую в данной области. Система может включать программируемые насосы (такие как насосы, часто используемые для доставки инсулина пациентам с диабетом). Один или несколько этих компонентов могут быть модульными или соединены с трансдермальной системой доставки, которая может включать отверстия, иглы, пластыри и т.п. В иллюстративном варианте осуществления имплантируемая система включает резервуар и отверстие. Резервуар может включать заправляемый или перезагружаемый контейнер для вмещения композиции. В другом варианте осуществления система может включать катетер. В другом варианте осуществления имплантируемая система представляет собой транслюминальный катетер. Система также может быть организована для доставки композиции в назначаемой дозе и/или с назначаемым интервалом. Назначаемая доза и/или назначаемый интервал могут быть определены специалистами в данной области.The agent or pharmaceutical composition of the invention can also be delivered via an at least partially implantable system. The implantable system may be any system known and used in the art. The system may include programmable pumps (such as pumps often used to deliver insulin to diabetic patients). One or more of these components may be modular or connected to a transdermal delivery system, which may include holes, needles, patches, and the like. In an exemplary embodiment, the implantable system includes a reservoir and an orifice. The reservoir may include a refillable or refillable container to contain the composition. In another embodiment, the system may include a catheter. In another embodiment, the implantable system is a transluminal catheter. The system may also be arranged to deliver the composition at a prescribed dose and/or at a prescribed interval. The dose to be administered and/or the interval to be administered can be determined by those skilled in the art.
Некоторые варианты осуществления изобретения проиллюстрированы в следующих неограничивающих примерах.Some embodiments of the invention are illustrated in the following non-limiting examples.
ПРИМЕРEXAMPLE
Материалы и способыMaterials and methods
Животные. Мышей Tg и совместно содержащихся мышей WT (соответствующих мышам WT, полученных путем скрещивания мышей Tg и мышей C57) содержали в одной клетке после рождения. Мышей WT (C57) содержали в отдельных клетках во избежание перекрестного переноса микробиоты. Всех мышей держали в помещении при 23°C с 12-часовым (ч) циклом на свету/в темноте. Мышей случайным образом распределяли в различные группы перед лечением. На протяжении анализа мышей Tg, самцов и самок мышей Tg умерщвляли в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев. Головной мозг извлекали и окрашивали для анализа иммунных клеток и анализа цитокинов. Перед умерщвлением мышей фекалии собирали для анализа микробиоты. Для введения OM1 в возрасте 6,5 месяцев на основе 450 мг b.i.d. (два раза в сутки) в испытании фазы III, мышам Tg вводили 100 мг/кг OM1 посредством перорального введения один раз в сутки в течение одного месяца. Для мониторинга когнитивной активности после последнего введения проводили поведенческие тесты. Затем головной мозг и фекалии мышей использовали для различных анализов. Для поведенческого тестирования мышей Tg и мышей WT в разные месяцы и подвергаемых лечению мышей тестировали посредством обучения различению, как описано ранее. Все движения мышей, которые происходили в Phenotyper (HomeCage) регистрировали посредством компьютеризованной системы отслеживания, которая вычисляет время и количество вхождений, требуемых для достижения 80% стандарта эффективности (Noldus, Ethovision). Для внутрибрюшинной инъекции фенилаланина и изолейцина мышам C57 в возрасте 4 месяцев вводили 50 мг/кг фенилаланина или изолейцина в течение 4 суток. Для инъекции в гиппокамп фенилаланина и изолейцина мышам C57 в возрасте 4 месяцев инъецировали 3 мкл фенилаланина или изолейцина в дозе 120 мл/л. Через 10 суток у этих мышей проводили анализ образца крови и поведенческое тестирование с использованием FACS. Animals. Tg mice and co-housed WT mice (corresponding to WT mice obtained by crossing Tg mice and C57 mice) were kept in the same cage after birth. WT mice (C57) were housed in separate cages to avoid cross-transfer of microbiota. All mice were kept indoors at 23° C. with a 12 hour (h) light/dark cycle. Mice were randomly assigned to different groups before treatment. Throughout the assay, Tg mice, male and female Tg mice were sacrificed at 2, 3, 5, 7 and 9 months of age. The brain was removed and stained for immune cell analysis and cytokine analysis. Before sacrificing mice, faeces were collected for microbiota analysis. For OM1 administration at 6.5 months of age on a 450 mg bid (twice daily) basis in the phase III trial, Tg mice were administered 100 mg/kg OM1 via oral administration once daily for one month. Behavioral tests were performed to monitor cognitive activity after the last administration. The brains and faeces of the mice were then used for various analyses. For behavioral testing, Tg mice and WT mice at different months and treated mice were tested by discrimination training as described previously. All mouse movements that occurred in the Phenotyper (HomeCage) were recorded by a computerized tracking system that calculates the time and number of entries required to reach the 80% efficiency standard (Noldus, Ethovision). For intraperitoneal injection of phenylalanine and isoleucine, 4-month-old C57 mice were injected with 50 mg/kg of phenylalanine or isoleucine for 4 days. For hippocampal injection of phenylalanine and isoleucine, 4-month-old C57 mice were injected with 3 μl of phenylalanine or isoleucine at a dose of 120 ml/l. After 10 days, these mice were subjected to blood sample analysis and behavioral testing using FACS.
Для анализа мышей APP/PS1 в разные моменты времени, мышей и совпадающих по возрасту мышей дикого типа умерщвляли в возрасте 3, 9 и 14 месяцев. Головной мозг и кровь мышей собирали для различных анализов. Перед умерщвлением фекалии мышей собирали для анализа микробиоты. Для введения мышам APP/PS1 мышам в возрасте 6 месяцев проводили введение с антибиотиками или без них в течение 3 месяцев 50 мг/кг OM1 через желудочный зонд один раз в сутки. Поведенческие тесты проводили для мониторинга когнитивной активности после последнего введения. Эксперимент на животных был одобрен этическим комитетом Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd (No.: 2016002).For analysis of APP/PS1 mice at different time points, mice and age-matched wild-type mice were sacrificed at 3, 9 and 14 months of age. The brain and blood of mice were collected for various analyses. Before sacrifice, mice faeces were collected for microbiota analysis. To administer APP/PS1 mice, 6-month-old mice were administered with or without antibiotics for 3 months at 50 mg/kg OM1 by gavage once daily. Behavioral tests were performed to monitor cognitive activity after the last administration. The animal experiment has been approved by the ethical committee of Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd (No.: 2016002).
Экстракция ДНК из образца фекалий и амплификация способом ПЦР. Все образцы фекалий замораживали при -80°C перед экстракцией ДНК и анализом. Микробную ДНК экстрагировали из фекальных образцов с использованием E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, U.S.) в соответствии с протоколами изготовителя. Конечную концентрацию и чистоту ДНК определяли с использованием спектрофотометра УФ и видимой области спектра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, США), и качество ДНК проверяли посредством 1% агарозного гель-электрофореза. Гипервариабельные области V3-V4 гена бактериальной 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров 338 F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) и 806 R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) посредством системы термоциклера ПЦР (GeneAmp 9700, ABI, США). Реакции ПЦР проводили с использованием следующей программы: 3 минуты (мин) денатурации при 95°C, 27 циклов из 30 секунд (с) при 95°C, отжиг в течение 30 с при 55°C, и элонгация в течение 45 с при 72°C, и конечное удлинение при 72°C в течение 10 мин. Реакции ПЦР проводили в трех экземплярах в 20 мкл смеси, содержавшей 4 мкл 5 × буфера FastPfu, 2 мкл 2,5 ммоль/л dNTP, 0,8 мкл каждого праймера (5 мкмоль/л), 0,4 мкл полимеразы FastPfu и 10 нг ДНК-матрицы. Полученные продукты ПЦР экстрагировали из 2% агарозного геля и далее очищали с использованием набора AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, США) и количественно определяли с использованием QuantiFluor™-ST (Promega, США) в соответствии с протоколом изготовителя. Вырожденный праймер относится к смеси различных последовательностей, которые отражают все различные возможности оснований для кодирования одной аминокислоты. Для повышения специфичности можно обратиться к таблице использования кодонов для уменьшения вырожденности в соответствии с предпочтениями использования оснований у различных организмов. В дополнение к нормальным обозначениям четырех оснований A, T, G и C, другие буквы, такие как R, Y, M, K и т.п., присутствуют в нуклеотидной цепи, где R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A/T, H= A/C/T, B= C/G /T, V=A/C/G, D=A/G /T, N=A/C/G/T. Extraction of DNA from a faecal sample and amplification by PCR . All faecal samples were frozen at -80°C prior to DNA extraction and analysis. Microbial DNA was extracted from fecal samples using the EZNA® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, US) according to the manufacturer's protocols. The final concentration and purity of the DNA was determined using a NanoDrop 2000 UV-Visible spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA) and DNA quality was checked by 1% agarose gel electrophoresis. Hypervariable regions V3-V4 of the bacterial 16S rRNA gene were amplified using primers 338 F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') and 806 R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') using a PCR thermal cycler system (GeneAmp 9700, ABI, USA). PCR reactions were performed using the following program: 3 minutes (min) denaturation at 95°C, 27 cycles of 30 seconds (s) at 95°C, anneal for 30 s at 55°C, and elongation for 45 s at 72 °C, and final elongation at 72°C for 10 min. PCR reactions were run in triplicate in a 20 µl mixture containing 4
Секвенирование с использованием Illumina MiSeq. В соответствии со стандартным протоколом Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, Китай), очищенные ампликоны объединяли в эквимолярных количествах и подвергали секвенированию спаренных концов (2×300) на платформе Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, США). Sequencing using Illumina MiSeq . According to the standard protocol of Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, China), purified amplicons were pooled in equimolar amounts and subjected to sequencing of paired ends (2×300) on the Illumina MiSeq platform (Illumina, San Diego, USA).
Обработка данных секвенирования. Исходные файлы fastq подвергали демультиплексинованию, фильтрации качества посредством Trimmomatic и объединению посредством FLASH на основе следующих критериев: (i) Чтения укорачивали в любом участке, который получал средний показатель качества < 20 на протяжении окна скольжения 50 п.н. (ii) Проводили точный подбор праймеров, допуская несоответствие 2 нуклеотидов, и чтения, содержавшие неоднозначные основания, удаляли. (iii) Последовательности с перекрыванием более 10 п.н. объединяли в соответствии с их последовательностью перекрывания. Операционные таксономические единицы (OTU) подвергали кластеризации с порогом сходства 97% с использованием UPARSE (версия 7.1 http://drive5.com/uparse/), и химерные последовательности идентифицировали и удаляли с использованием UCHIME. Таксономию каждой последовательности гена 16S рРНК анализировали посредством алгоритма RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) против базы данных 16S рРНК Silva (SSU123) с использованием порогового значения достоверности 70%. Processing of sequencing data. Fastq source files were demultiplexed, quality filtered by Trimmomatic, and merged by FLASH based on the following criteria: (i) Reads were truncated in any region that received an average quality score of < 20 over a 50 bp glide window. (ii) Primers were fine-tuned, allowing for a 2 nucleotide mismatch, and reads containing ambiguous bases were deleted. (iii) Sequences with more than 10 bp overlap. were combined according to their overlap sequence. Operational Taxonomic Units (OTUs) were clustered with a 97% similarity threshold using UPARSE (version 7.1 http://drive5.com/uparse/) and chimeric sequences were identified and deleted using UCHIME. The taxonomy of each 16S rRNA gene sequence was analyzed by the RDP Classifier algorithm (http://rdp.cme.msu.edu/) against the Silva 16S rRNA database (SSU123) using a confidence threshold of 70%.
Получение образцов метаболитов. Образцы, хранившиеся при -80°C, отбирали и размораживали при комнатной температуре. В эксперименте использовали образцы массой 50 мг и также добавляли 400 мкл смеси метанол-вода (4:1, об./об.) для гомогенизации образца с использованием гомогенизатора в течение 10 секунд. Раствор подвергали ультразвуковой экстракции на льду в течение 10 мин и хранили при -20°C в течение 30 мин, затем центрифугировали в течение 15 мин при 13000 об/мин при 4°C. Для анализа LC-MS использовали 200 мкл супернатанта. Obtaining metabolite samples. Samples stored at -80°C were taken and thawed at room temperature. The experiment used samples weighing 50 mg and also added 400 μl of a mixture of methanol-water (4:1, v/v) to homogenize the sample using a homogenizer for 10 seconds. The solution was subjected to ultrasonic extraction on ice for 10 min and stored at -20°C for 30 min, then centrifuged for 15 min at 13,000 rpm at 4°C. For LC-MS analysis, 200 μl of the supernatant was used.
Параметры анализа LC/MS. LC-MS проводили на масс-спектрометрической системе AB Sciex TripleTOF 5600TM (AB SCIEX, USA). Условия LC: колонка: Acquity BEH C18 (100 мм × 2,1 мм i.d., 1,7 мкм; Waters, Milford, США). Растворитель: колонку поддерживали при 40°C и разделения достигали с использованием следующего градиента: 5% B-30% B на протяжении 0-3 мин, 30% B-95% B на протяжении 3-9 мин, 95% B-95% B на протяжении 9-13,0 мин; 95% B-5% B на протяжении 13,0-13,1 мин, и удержание в течение 13,1-16 мин при 5% B; скорость потока составляет 0,40 мл/мин, где B представляет собой ацетонитрил:изопропанол 1:1 (0,1% (об./об.) муравьиная кислота) и A представляет собой водный раствор муравьиной кислоты (0,1% (об./об.) муравьиная кислота). Объем инжектирования составил 20 мкл. Данные масс-спектрометрии получали с использованием масс-спектрометрической системы AB Sciex TripleTOF 5600TM, оборудованной источником электрораспылительной ионизации (ESI), действующем либо режиме положительных ионов, либо в режиме отрицательных ионов, с капиллярным напряжением 1,0 кВ, пробоотборным конусом, 40 В, энергией столкновений 6 эВ. Температура источника была установлена на 120°C, с потоком газа десольватации 45 л/ч. Центроидные данные получали при от 50 до 1000 m/z с разрешением 30000. LC/MS Analysis Parameters . LC-MS was performed on an AB Sciex TripleTOF 5600TM mass spectrometric system (AB SCIEX, USA). LC Conditions: Column: Acquity BEH C18 (100 mm x 2.1 mm id, 1.7 µm; Waters, Milford, USA). Solvent: column was maintained at 40°C and separation was achieved using the following gradient: 5% B-30% B over 0-3 min, 30% B-95% B over 3-9 min, 95% B-95% B for 9-13.0 min; 95% B-5% B over 13.0-13.1 min, and hold for 13.1-16 min at 5% B; the flow rate is 0.40 ml/min, where B is acetonitrile:isopropanol 1:1 (0.1% (v/v) formic acid) and A is an aqueous solution of formic acid (0.1% (v/v) ./vol.) formic acid). The injection volume was 20 µl. Mass spectrometry data were obtained using an AB Sciex TripleTOF 5600TM mass spectrometry system equipped with an electrospray ionization (ESI) source operating in either positive ion or negative ion mode, capillary voltage 1.0 kV, sampling cone, 40 V,
Получение образца метаболитов QC. Образец QC получали путем смешения аликвот всех образцов с получением объединенного образца, а затем анализировали с использованием одного и того же способа с аналитическими образцами. QC инжектировали с регулярными интервалами (каждые 10 образцов) на протяжении аналитической серии с получением набора данных, из которых может быть оценена повторяемость. Obtaining a sample of QC metabolites . A QC sample was prepared by mixing aliquots of all samples to form a pooled sample and then analyzed using the same method with the analytical samples. QC was injected at regular intervals (every 10 samples) throughout the analytical series to obtain a set of data from which repeatability can be estimated.
Дифференцировка in vitro наивных CD4 в Th1 и Th2, индуцируемая супернатантом фекалий мышей. Наивные CD4+ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4+ T-клеток (Stem Cell, #19765). Как описано выше, получали супернатант фекалий мышей в возрасте 7 месяцев. Всего 0,5×106 клеток/лунка в 0,5 мл среды RPMI-1640 высевали в 48-луночные планшеты, покрытые антителом против CD3 и антителом против CD28, и культуральную среду дополняли цитокинами и блокирующими антителами. Th0: 20 нг/мл mIL-2; Th1: 20 нг/мл mIL-2, 10 мкл супернатанта, 5000 нг/мл 11B11; Th2: 20 нг/мл mIL-2, 10 мкл супернатанта, 5000 нг/мл XMG1.2. OM1 добавляли в обозначенные лунки до конечной концентрации 100 мкг/мл. После инкубации при 37°C в 5% CO2 в течение 5 суток клетки получали на цитометре BD Aria III, и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. In vitro differentiation of naïve CD4 into Th1 and Th2 induced by mouse faecal supernatant. Naïve CD4 + T cells were separated from splenocytes from female C57BL/6 mice at 8 months of age using a naïve CD4 + T cell isolation kit (Stem Cell, #19765). As described above, the supernatant of faeces from mice at the age of 7 months was obtained. A total of 0.5×10 6 cells/well in 0.5 ml of RPMI-1640 medium were plated in 48-well plates coated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, and the culture medium was supplemented with cytokines and blocking antibodies. Th0: 20 ng/ml mIL-2; Th1: 20 ng/ml mIL-2, 10 µl supernatant, 5000 ng/ml 11B11; Th2: 20 ng/ml mIL-2, 10 µl supernatant, 5000 ng/ml XMG1.2. OM1 was added to the designated wells to a final concentration of 100 μg/ml. After incubation at 37° C. in 5% CO 2 for 5 days, cells were obtained on a BD Aria III cytometer and data was analyzed using FlowJo software.
Иммуногистохимия. Для окрашивания с проявкой 3,30-диаминобензидином (DAB срезы подвергали иммунному окрашиванию с использованием Leica BOND-RX Autostainer (Leica Microsystems) и Coverslipper CV5030 (Leica Microsystems) в соответствии с протоколом IHC изготовителя. В кратком изложении срезы подвергали индуцированной нагреванием демаскировке эпитопов с использованием раствора Epitope Retrieval solution 2 (ER2, AR9640, Leica Biosystems) в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3%-4% (об./об.) пероксидом водорода (часть DS9800, Leica Biosystems) в течение 10 мин. Затем срезы инкубировали с блокирующим буфером (10% NGS в PBS с 0,3% Triton x-100) в течение 60 мин. Наконец, проводили окрашивание с использованием системы Bond Polymer Refine Detection System (DS9800, Leica Biosystems) в соответствии с протоколом изготовителя. Время инкубации с первичным антителом составляло 30 мин. Срезы окрашивали в отношении активированной микроглии с использованием антитела кролика против IBA1 (1:1000, каталожный номер № 019-19741, Wako), отложений амилоида с использованием антитела мыши против Aβ42 (1:1000; каталожный номер № 803003, Biolegend) и фосфорилирования тау с использованием антитела мыши anti-PHF-Tau & tangles-Thr231 antibody (1:300, каталожный номер № MN1040, Thermo Fisher). Окрашенные срезы автоматически сканировались посредством высокопроизводительного светлопольного сканера (NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu), и изображения получали с использованием программного обеспечения NDP.scan 3.2 (Hamamatsu). Для флуоресцентного окрашивания предметные стекла блокировали блокирующим буфером (10% NGS в PBS с 0,3% Triton x-100) при к.т. в течение 1 ч, а затем инкубировали в растворе первичного антитела (Iba-1 1:1000, Aβ42 1:1000, тау 1:300) в течение ночи при 4°C. После промывания предметные стекла инкубировали с флуоресцентным вторичным антителом против антител кролика или против антител мыши (1:1000, Invitrogen) в течение 60 мин при к.т. и далее промывали 3 раза в PBS. Наконец, предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию с DAPI (1:10000 в PBS, Sigma) в течение 5 мин при к.т., промывали, запечатывали и хранили при 4°C для получения изображений. Репрезентативные флуоресцентные изображения получали посредством прямого флуоресцентного микроскопа Zmager-m2 (Zeiss, Germany) под 10× объективом с использованием программного обеспечения Zen (Zeiss). Immunohistochemistry . For 3,30-diaminobenzidine (DAB) development staining, sections were immunostained using a Leica BOND-RX Autostainer (Leica Microsystems) and Coverslipper CV5030 (Leica Microsystems) according to the manufacturer's IHC protocol. Briefly, sections were subjected to heat-induced epitope unmasking with using Epitope Retrieval solution 2 (ER2, AR9640, Leica Biosystems) for 20 minutes Endogenous peroxidase activity was blocked with 3%-4% (v/v) hydrogen peroxide (part of DS9800, Leica Biosystems) for 10 minutes Then sections were incubated with blocking buffer (10% NGS in PBS with 0.3% Triton x-100) for 60 minutes Finally, staining was performed using the Bond Polymer Refine Detection System (DS9800, Leica Biosystems) according to the manufacturer's protocol. The incubation time with the primary antibody was 30 minutes Sections were stained for activated microglia using rabbit antibodies against IBA1 (1:1000, cat. no. 019-19741, Wako), amyloid deposits using mouse anti-Aβ42 antibody (1:1000; 803003, Biolegend) and phosphorylation of tau using the mouse anti-PHF-Tau & tangles-Thr231 antibody (1:300, catalog no. MN1040, Thermo Fisher). Stained sections were automatically scanned with a high performance brightfield scanner (NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu) and images were acquired using NDP.scan 3.2 software (Hamamatsu). For fluorescent staining, slides were blocked with blocking buffer (10% NGS in PBS with 0.3% Triton x-100) at rt. for 1 h, and then incubated in a solution of the primary antibody (Iba-1 1:1000, Aβ42 1:1000, tau 1:300) overnight at 4°C. After washing, the slides were incubated with a fluorescent anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody (1:1000, Invitrogen) for 60 min at RT. and then washed 3 times in PBS. Finally, slides were counterstained with DAPI (1:10,000 in PBS, Sigma) for 5 min at RT, washed, sealed and stored at 4°C for imaging. Representative fluorescence images were obtained with a Zmager-m2 (Zeiss, Germany) upright fluorescence microscope under a 10x objective using Zen software (Zeiss).
Тест нейротоксичности. Клетки SH-SY5Y (ATCC, США) высевали на белый полистироловый 96-луночный планшет (Corning Inc., США) с плотностью 5000 клеток/лунка и культивировали в инкубаторе с увлажнением при 37℃ и 5% CO2 в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (DMEM) (Corning Inc., США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Через 24 часа клетки обрабатывали L-фенилаланином или L-изолейцином (Sigma) в конечных концентрациях 10 мМ, 1 мМ и 0,1 мМ, соответственно. Для детекции жизнеспособности клеток через 24 часа использовали CellTiter-Glo (Promega Inc., США). Для регистрации люминесцентного сигнала использовали устройство Cytation5 (BioTek). Neurotoxicity test . SH-SY5Y cells (ATCC, USA) were seeded in a white polystyrene 96-well plate (Corning Inc., USA) at a density of 5000 cells/well and cultured in a humidified incubator at 37℃ and 5% CO 2 in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Corning Inc., USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. After 24 hours, cells were treated with L-phenylalanine or L-isoleucine (Sigma) at final concentrations of 10 mM, 1 mM and 0.1 mM, respectively. Cell viability was detected after 24 hours using CellTiter-Glo (Promega Inc., USA). The luminescent signal was recorded using a Cytation5 device (BioTek).
Детекция аминокислот. Набор растворов стандартных смесей аминокислот получали в диапазоне концентраций 100-2000 мкмоль/л. Часть объемом 10 мкл каждого раствора стандартной смеси или образца плазмы вносили пипеткой в нижнюю часть пробирки, а затем добавляли 70 мкл буфера на основе бората натрия (200 ммоль/л при pH 8,8). Добавляли 20 мкл 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC) (4 мг/мл в ацетонитриле), пробирку закрывали и нагревали в течение 10 мин при 55 °C с получением AQC-аминокислоты. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры и часть каждого раствора объемом 2 мкл инжектировали в систему UPLC-ESI-MS для анализа аминокислот без дальнейшей очистки. Amino acid detection . A set of solutions of standard mixtures of amino acids was obtained in the concentration range of 100-2000 µmol/l. A 10 μl portion of each standard mix solution or plasma sample was pipetted into the bottom of the tube, and then 70 μl of sodium borate buffer (200 mmol/l at pH 8.8) was added. 20 µl of 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate (AQC) (4 mg/ml in acetonitrile) was added, the tube was capped and heated for 10 min at 55°C to obtain the AQC-amino acid. The solution was then cooled to room temperature and a 2 μl portion of each solution was injected into the UPLC-ESI-MS system for amino acid analysis without further purification.
ЛюдиPeople
Проводили сбор крови пациентов с MCI вследствие AD и здоровых контролей в пилотном испытании. MCI вследствие AD определяли в соответствии с клиническими и научными диагностическими критериями NIA-AA 2011 для MCI вследствие AD. Пациенты с MCI вследствие AD в этом испытании должны удовлетворять следующим критериям. Первым фактором является изменение когнитивной функции. Вторым является нарушение одного или нескольких когнитивных доменов. Третьим является сохранение независимости функциональных способностей. Четвертым является отсутствие деменции (клинические критерии NIA-AA 2011 диагноза MCI вследствие AD). Всех участников подвергали процессу скрининга, который включал изучение их медицинского анамнеза, физикальное и неврологическое обследование, лабораторные тесты и изображения МРТ. Клиническая оценка умеренного когнитивного расстройства или деменции включала нейропсихологические тесты, а также поведенческие и психиатрические опросы, проводимые лечащими врачами. Для пациентов с AD регистрировали показатели < 4 по шкале ишемии Хачинского, и у них отсутствовали в анамнезе значительные системные или психиатрические состояния или травматические повреждения головного мозга, которые могли нарушить функцию головного мозга. Для всех участников проводили клиническую оценку деменции (CDR) и Монреальскую оценку когнитивных функций (MoCA). На основе данной оценки авторы изобретения оставляли индивидуумов с MCI вследствие AD, а других исключали, таких как индивидуумы, которые имели нарушение единичного домена, не относящегося к памяти (подтип MCI с единичным доменом, не относящимся к памяти), и индивидуумы, которые имели нарушение двух или более доменов (множество доменов, подтип MCI со слабым нарушением). Нормальные контрольные индивидуумы не имели снижения когнитивных способностей в анамнезе, неврологических нарушений или неконтролируемых системных медицинских нарушений. Все индивидуумы, включенные в это испытание, имели ишемию не более двух лакун (диаметром < 1 см) при определении посредством последовательности МРТ в режиме инверсионного восстановления с подавлением сигнала от жидкости (FLAIR).Blood was collected from patients with MCI due to AD and healthy controls in a pilot trial. MCI due to AD was determined according to the NIA-AA 2011 clinical and scientific diagnostic criteria for MCI due to AD. Patients with MCI due to AD in this trial must meet the following criteria. The first factor is the change in cognitive function. The second is the disruption of one or more cognitive domains. The third is to preserve the independence of functional abilities. The fourth is the absence of dementia (NIA-AA 2011 clinical criteria for the diagnosis of MCI due to AD). All participants underwent a screening process that included their medical history, physical and neurological examination, laboratory tests, and MRI images. Clinical assessment of mild cognitive impairment or dementia included neuropsychological tests, as well as behavioral and psychiatric interviews conducted by attending physicians. Patients with AD scored < 4 on the Khachinsky Ischemia Scale and had no history of significant systemic or psychiatric conditions or traumatic brain injury that could impair brain function. All participants underwent a clinical assessment of dementia (CDR) and a Montreal Cognitive Assessment (MoCA). Based on this assessment, the inventors retained individuals with MCI due to AD and excluded others, such as individuals who had a non-memory single domain disorder (non-memory single domain MCI subtype) and individuals who had a non-memory single domain disorder. two or more domains (multiple domains, MCI subtype with mild impairment). Normal control individuals had no history of cognitive decline, neurological impairment, or uncontrolled systemic medical disorders. All individuals included in this trial had ischemia of no more than two lacunae (< 1 cm in diameter) as determined by fluid suppression inversion recovery (FLAIR) MRI sequence.
Размер выборки для первой группы (фиг.5h, i) составляет 9 пациентов с MCI вследствие AD и 18 здоровых индивидуумов. Размер выборки для второй группы (фиг.5j) составляет 22 пациента с MCI вследствие AD и 22 здоровых индивидуумов. Диагноз MCI был основан на следующих критериях, которые были адаптированы из диагностических критериев Петерсена для MCI: (1) жалобы на память, предпочтительно подтвержденные супругом или родственником; (2) объективное нарушение памяти; (3) нормальная общая когнитивная функция; (4) интактная повседневная активность и (5) отсутствие деменции. Этический комитет Shanghai Mental Health Centre Institutional Review Board одобрил испытание (номер: 2016-22R1). От всех индивидуумов и опекунов индивидуумов было получено информированное согласие. Информация о возрасте и поле и т.д. приведена ниже.The sample size for the first group (Fig. 5h, i) is 9 patients with MCI due to AD and 18 healthy individuals. The sample size for the second group (FIG. 5j) is 22 patients with MCI due to AD and 22 healthy individuals. The diagnosis of MCI was based on the following criteria, which were adapted from the Petersen diagnostic criteria for MCI: (1) memory complaints, preferably confirmed by a spouse or relative; (2) objective memory impairment; (3) normal general cognitive function; (4) intact daily activities; and (5) no dementia. The Ethics Committee of the Shanghai Mental Health Center Institutional Review Board approved the trial (number: 2016-22R1). Informed consent was obtained from all individuals and guardians of individuals. Information about age and gender, etc. below.
Первая группа:First group:
Вторая группа:Second group:
Дифференцировка и пролиферация in vitro, индуцированная фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4+ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4+ T-клеток (Stem Cell, #19765), и клетки окрашивали посредством CellTrace (Thermo Fisher, #C34557). Всего 1×105 клеток/лунка в 0,2 мл среды RPMI-1640 высевали в 96-луночные планшеты и культуральную среду дополняли цитокинами или блокирующими антителами. Th0: 10 нг/мл mIL-2; Th1:10 нг/мл mIL-2, 5000 нг/мл 11B11. В указанные лунки добавляли фенилаланин (конечная концентрация, 2 ммоль/л), изолейцин (конечная концентрация, 2 ммоль/л) и OM1 (конечная концентрация, 100 мкг/мл), соответственно. После инкубации при 37°C в 5% CO2 в течение 5 суток клетки получали на цитометре BD Fortessa и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Differentiation and proliferation in vitro, induced by phenylalanine and isoleucine. Naive CD4+ T cells were separated from splenocytes from female C57BL/6 mice at 8 months of age using a naïve CD4 isolation kit.+ T cells (Stem Cell, #19765) and cells were stained with CellTrace (Thermo Fisher, #C34557). Total 1×105 cells/well in 0.2 ml of RPMI-1640 medium were seeded into 96-well plates and the culture medium was supplemented with cytokines or blocking antibodies. Th0: 10 ng/ml mIL-2; Th1: 10 ng/ml mIL-2, 5000 ng/ml 11B11. To these wells were added phenylalanine (final concentration, 2 mmol/l), isoleucine (final concentration, 2 mmol/l) and OM1 (final concentration, 100 μg/ml), respectively. After incubation at 37°C in 5% CO2 within 5 days, cells were obtained on a BD Fortessa cytometer and data was analyzed using FlowJo software.
Захват фенилаланина. Наивные CD4+ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4+ T-клеток (Stem Cell, каталожный номер 19765) и индуцировали к дифференцировке в Th1 посредством 20 нг/мл IL-12. Через 3 суток всего 5×105 Th1-клеток и Th0-клеток/лунка в 0,5 мл среды RPMI-1640 высевали в 48-луночные планшеты. В указанные лунки добавляли 13C-меченный фенилаланин и 5 мМ ингибитор переносчика аминокислот BCH. Через 0,5 ч клетки собирали и промывали два раза ледяным D-PBS. Добавляли 50 мкл деионизированной воды и клетки лизировали посредством замораживания и размораживания два раза при -80°C. Клеточный лизат центрифугировали при 12000×g в течение 10 мин и 13C-меченный фенилаланин в супернатанте анализировали посредством масс-спектрометрии. Phenylalanine uptake . Naïve CD4 + T cells were separated from splenocytes from 8-month-old female C57BL/6 mice using a naïve CD4 + T cell isolation kit (Stem Cell, cat. no. 19765) and induced to differentiate into Th1 with 20 ng/mL IL- 12. After 3 days, a total of 5×10 5 Th1 cells and Th0 cells/well in 0.5 ml of RPMI-1640 medium were seeded into 48-well plates. 13 C-labeled phenylalanine and 5 mM amino acid transport inhibitor BCH were added to these wells. After 0.5 h, the cells were harvested and washed twice with ice-cold D-PBS. Added 50 μl of deionized water and cells were lysed by freezing and thawing twice at -80°C. The cell lysate was centrifuged at 12,000×g for 10 min and the 13 C-labeled phenylalanine in the supernatant was analyzed by mass spectrometry.
Обработка антибиотиком. Мышам проводили введение путем добавления в стерильную питьевую воду раствора антибиотика (ATB), содержавшего ампициллин (0,1 мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде), стрептомицин (0,5 мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде) и колистин (0,1 мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде) (Sigma-Aldrich). Растворы и бутылки заменяли 3 раза и один раз в неделю, соответственно. Активность антибиотика подтверждали посредством секвенирования гена 16S рРНК. Типы бактерий с относительным содержанием менее 0,01 удаляли для группы Tg. Длительность введения ABX несколько различалась, исходя из условий эксперимента. В контексте экспериментов с трансплантацией фекальной микробиоты, мышам проводили введение ATB в течение 3 суток перед проведением трансплантации фекальной микробиоты на следующий день через желудочный зонд с использованием игл для кормления животных. Antibiotic treatment . Mice were administered by adding to sterile drinking water an antibiotic solution (ATB) containing ampicillin (0.1 mg/ml, final concentration in drinking water), streptomycin (0.5 mg/ml, final concentration in drinking water) and colistin ( 0.1 mg/ml, final concentration in drinking water) (Sigma-Aldrich). Solutions and bottles were replaced 3 times and once a week, respectively. Antibiotic activity was confirmed by sequencing the 16S rRNA gene. Bacterial types with a relative content of less than 0.01 were removed for the Tg group. The duration of administration of ABX varied somewhat, based on the conditions of the experiment. In the context of the fecal microbiota transplantation experiments, mice were treated with ATB for 3 days before undergoing fecal microbiota transplantation the next day via gavage using animal feeding needles.
Эксперименты по трансплантации фекальной микробиоты (FMT). FMT проводили путем размораживания фекального материала. Затем 200 мкл суспензии переносили посредством желудочного зонда каждому из реципиентов, которым вводили ATB. FMT проводили 3 раза за 5 суток. Мышам C57 в возрасте двенадцати месяцев сначала вводили коктейль антибиотиков в питьевой воде в течение 3 суток, а затем 40 мг смешанного стула, суспендированного в PBS, вводили через желудочный зонд каждой мыши 3 раза с интервалом 2 суток между введениями. Через 3 суток проводили инъекцию 4,2 мкг олигомера Aβ 1-40 в обе стороны гиппокампа. Через 3 суток мышей умерщвляли и использовали для разных анализов. Fecal Microbiota Transplant (FMT) Experiments . FMT was performed by thawing fecal material. Then 200 μl of the suspension was transferred by means of a gastric tube to each of the recipients who were administered ATB. FMT was performed 3 times in 5 days. Twelve month old C57 mice were first treated with an antibiotic cocktail in drinking water for 3 days, and then 40 mg of mixed stool suspended in PBS was administered by gavage to each
Биоинформатический анализ. Анализ сигнальных путей и анализ обогащения биологических функций проводили с использованием Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype (KEGG). Обогащение данных проводили с использованием R-пакета "DOSE", "GO.db", "GSEABase" и "ClusterProfiler". Отображались только каскады со значением p с поправкой на частоту ложноположительных результатов (FDR) < 0,05. Для анализа корреляций использовали R-пакет "ggcorrplot". R-пакет "igraph" использовали для построения круговых диаграмм корреляций. R-пакеты "ggalluvial" и "networkD3" использовали для получения блок-схем для бактерий и диаграмм Сэнки. R-пакет "Mfuzz" использовали для кластерного анализа тенденций. Другие способы биоинформатического анализа проводили с использованием онлайн-платформы Majorbio I-Sanger Cloud (www.i-sanger.com). Анализ биомаркеров ROC и классификацию на основе случайного леса проводили с использованием MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/). Bioinformatic Analysis . Signaling pathway analysis and biological function enrichment analysis were performed using the Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype (KEGG). Data enrichment was performed using the R package "DOSE", "GO.db", "GSEABase" and "ClusterProfiler". Only cascades with a p-value adjusted for false positive rate (FDR) < 0.05 were displayed. The R-package "ggcorrplot" was used to analyze correlations. The R package "igraph" was used to construct pie charts of correlations. The R packages "ggalluvial" and "networkD3" were used to generate block diagrams for bacteria and Sankey diagrams. R-package "Mfuzz" was used for cluster trend analysis. Other bioinformatics analysis methods were performed using the Majorbio I-Sanger Cloud online platform (www.i-sanger.com). ROC biomarker analysis and random forest classification were performed using MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
Получение образцов для проточной цитометрии и анализ. Мышей подвергали анестезии, проводили взятие образцов крови в содержавшие EDTA пробирки и эритроциты удаляли с использованием 1× буфера для лизиса эритроцитов. Перед сбором тканей головной мозг подвергали перфузии ледяным PBS, чтобы избежать попадания циркулирующих иммунных клеток крови, и головной мозг извлекали, нарезали на фрагменты и проводили диссекцию в соответствии с инструкцией к набору Adult Brain Dissociation Kit (Miltenyi, каталожный номер № 130-107-677) с использованием диссоциатора gentleMACS (Miltenyi Biotec). Гомогенат головного мозга фильтровали через 70-мкм клеточное сито и центрифугировали при 300×g в течение 5 мин при 4°C. Клеточный осадок ресуспендировали в холодном буфере PBS и вновь центрифугировали при 300×g в течение 5 мин при 4°C. Все образцы подсчитывали и доводили до плотности 2-3×106/100 мкл, метили с использованием набора Live/Dead Kit в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 500×g в течение 3 мин при 4°C. Клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера PBS, блокировали антителом против CD16/32 (Biolegend, каталожный номер № 101320) в течение 10 мин, и инкубировали с антителом в соответствии с протоколами изготовителей при 4°C в течение 30 мин. Следующие антитела использовали для FACS-анализа: CD45(30-F11)-APC-Cy7(103116,Biolegend),CD11b(M1/70)-FITC(101205,Biolegend),CX3CR1(SA011F11)-PE-Dazzle 594(149014,Biolegend),F4/80(BM8)-BV421(123132,Biolegend),CD86(IT2,2)-PE(305438,Biolegend),CD206(15-2)-APC(321110,Biolegend),CD206(15-2)-BV785(321142,Biolegend),CD11c(N418)-PE-Cy7(117318,Biolegend),CD8(53-6,7)-Percp-Cy5.5(100734,Biolegend),Ly-6C(HK1.4)-PE-Dazzle 594(128044,Biolegend),Gr-1(RB6-8C5)-Percp-Cy5,5(108428,Biolegend),B220(RA3-6B2)-BV421(103240,Biolegend),CD19(6D5)-PE(115508,Biolegend),CD49b(DX5)-PE-Cy7(108922,Biolegend),CD4(GK1,5)-PE-Cy7(100422,Biolegend),CD4(GK1,5)-FITC(100406,Biolegend),CXCR3(CXCR3-173)-BV421(126522,Biolegend),CCR4(L291H4)-PE-Cy7(359410,Biolegend),CCR6(29-2L17)-APC(129814,Biolegend),CD127(A019D5)-PE(351304,Biolegend),CD25(3C7)-Percp-Cy5,5(101912,Biolegend),Live/Dead(423104,Biolegend). Клетки добавляли к 500 мкл буфера PBS, центрифугировали при 500×g в течение 3 мин при 4°C и ресуспендировали в 200 мкл подвижного буфера. Соответствующий отрицательный контроль, контроль Fluorescence Minus One (FMO) и каждый образец для компенсации флуоресценции использовали для внесения поправки на компенсацию флуоресценции и идентификации представляющих интерес популяций. Клетки обрабатывали на цитометре BD Aria III и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Sample acquisition for flow cytometry and analysis . Mice were anesthetized, blood samples were taken into tubes containing EDTA, and erythrocytes were removed using 1x erythrocyte lysis buffer. Before tissue harvesting, the brain was perfused with ice-cold PBS to avoid circulating immune blood cells, and the brain was removed, cut into fragments, and dissected according to the instructions for the Adult Brain Dissociation Kit (Miltenyi, cat. no. 130-107-677 ) using gentleMACS dissociator (Miltenyi Biotec). The brain homogenate was filtered through a 70 μm cell sieve and centrifuged at 300×g for 5 min at 4°C. The cell pellet was resuspended in cold PBS buffer and centrifuged again at 300×g for 5 min at 4°C. All samples were counted and adjusted to a density of 2-3×10 6 /100 μl, labeled using the Live/Dead Kit for 30 min, and then centrifuged at 500×g for 3 min at 4°C. Cells were resuspended in 100 µl of PBS buffer, blocked with anti-CD16/32 antibody (Biolegend, cat. no. 101320) for 10 min, and incubated with antibody according to manufacturer's protocols at 4°C for 30 min. The following antibodies were used for FACS analysis: CD45(30-F11)-APC-Cy7(103116,Biolegend),CD11b(M1/70)-FITC(101205,Biolegend),CX3CR1(SA011F11)-PE-Dazzle 5901(4 Biolegend),F4/80(BM8)-BV421(123132,Biolegend),CD86(IT2.2)-PE(305438,Biolegend),CD206(15-2)-APC(321110,Biolegend(206) )-BV785(321142,Biolegend),CD11c(N418)-PE-Cy7(117318,Biolegend),CD8(53-6.7)-Percp-Cy5.5(100734,Biolegend(H1.4,Ly-6C )-PE-Dazzle 594(128044,Biolegend),Gr-1(RB6-8C5)-Percp-Cy5.5(108428,Biolegend),B220(RA3-6B2)-BV421(103240,9,Biolegend) -PE(115508,Biolegend),CD49b(DX5)-PE-Cy7(108922,Biolegend),CD4(GK1.5)-PE-Cy7(100422,Biolegend),CD4(GK1.5)-FITC,100Bioend6 ) , Cxcr3 (cxcr3-173) -bv421 (126522 , biolegend) ccr4 (l291h4 )pe-q7 (359410 , biolegend) , ccr6 (-sapp) 129814 , biolegend) biolegend) biolegend) biolegend) biolegend) biolegend) biolegend) biolegend (351304,Biolegend),CD25(3C7)-Percp-Cy5.5(101912,Biolegend),Live/Dead(423104,Biolegend). Cells were added to 500 μl of PBS buffer, centrifuged at 500×g for 3 min at 4°C and resuspended in 200 μl of running buffer. The respective negative control, Fluorescence Minus One (FMO) control, and each fluorescence compensation sample were used to correct for fluorescence compensation and identify populations of interest. Cells were processed on a BD Aria III cytometer and data analyzed using FlowJo software.
Чип с антителами. Гомогенаты головного мозга (из 20 мг ткани) анализировали с использованием чипа для цитокинов с антителами на основе предметного стекла, включавшего 200 белков (RayBiotech, GSM-CAA-4000-1). В каждую лунку добавляли 100 мкл разбавителя для образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем буфер заменяли другими 100 мкл образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Образцы удаляли и промывали 5 раз (по 5 мин каждый раз) с использованием 150 мкл 1×промывочного буфера I и 2 раза (по 5 мин каждый раз) с использованием 150 мкл 1× промывочного буфера II при комнатной температуре при осторожном качании. В каждую лунку добавляли 80 мкл коктейля антител для детекции и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Предметное стекло промывали 5 раз (по 5 мин каждый раз) посредством 150 мкл 1× буфера для промывания I, а затем 2 раза (по 5 мин каждый раз) посредством 150 мкл 1× буфера для промывания II при комнатной температуре при осторожном качании. В каждую лунку добавляли восемьдесят микролитров стрептавидина, конъюгированного с эквивалентным Cy3 красителем, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После 5 промываний (по 5 мин каждый раз), сигнал визуализировали посредством лазерного сканера. Затем данные визуализировали посредством диаграммы тепловой карты (www.metaboanalyst.ca). Chip with antibodies . Brain homogenates (from 20 mg of tissue) were analyzed using a cytokine antibody microslide chip containing 200 proteins (RayBiotech, GSM-CAA-4000-1). 100 µl sample diluent was added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes. The buffer was then replaced with another 100 µl of sample and incubated at room temperature for 2 h. Samples were removed and washed 5 times (5 min each time) using 150 µl of 1×wash buffer I and 2 times (5 min each time) with using 150 µl of 1x wash buffer II at room temperature with gentle rocking. 80 µl detection antibody cocktail was added to each well and incubated at room temperature for 2 h. each time) with 150 µl of 1x wash buffer II at room temperature with gentle rocking. Eighty microliters of streptavidin conjugated with an equivalent Cy3 dye was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. After 5 washes (5 minutes each time), the signal was visualized with a laser scanner. The data was then visualized with a heat map chart (www.metaboanalyst.ca).
Получение срезов головного мозга. Мышам проводили транскардиальную перфузию 0,9% NaCl после глубокой анестезии пентобарбиталом (100 мг/кг, в/б). Ткани головного мозга быстро извлекали, замораживали и хранили при -70 °C. Получали серийные фронтальные срезы головного мозга (толщиной 12 мкм) с использованием нарезающего на срезы замораживающего микротома (Leica Microsystems), помещали на предметные стекла и сушили в течение ночи на воздухе при комнатной температуре. Срезы тканей хранили при -70°C использовали сразу. Getting slices of the brain . Mice were transcardially perfused with 0.9% NaCl after deep anesthesia with pentobarbital (100 mg/kg, ip). Brain tissues were quickly removed, frozen and stored at -70°C. Serial frontal brain sections (12 μm thick) were obtained using a slicing freezing microtome (Leica Microsystems), placed on glass slides, and dried overnight in air at room temperature. Tissue sections were stored at -70°C used immediately.
Лазерная микродиссекция и анализ с использованием к-ПЦР. Замороженные образцы головного мозга мыши нарезали на срезы и собирали на предметных стеклах с мембраной из PEN (Leica, 11600288). Гиппокамп извлекали посредством микроскопии с лазерной диссекцией (Leica Microsystems, LMD6). РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004) и подвергали обратной транскрипции в кДНК (Takara, PrimeScript RT Master Mix, RR036A). К-ПЦР проводили с использованием системы ABI 7500 способом SYBR (Takara, SYBR Premix Ex Taq II). Использовали следующие праймеры: синаптофизин-прямой: CAGTTCCGGGTGGTCAAGG; синаптофизин-обратный: ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC; актин-прямой: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT; актин-обратный: AGGTCTTTACGGAT GTCAACG. Laser microdissection and analysis using q-PCR . Frozen mouse brain samples were cut into sections and collected on slides with a PEN membrane (Leica, 11600288). The hippocampus was removed by laser dissection microscopy (Leica Microsystems, LMD6). RNA was extracted using the RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004) and reverse transcribed into cDNA (Takara, PrimeScript RT Master Mix, RR036A). Q-PCR was performed using the ABI 7500 system by the SYBR method (Takara, SYBR Premix Ex Taq II). The following primers were used: synaptophysin-direct: CAGTTCCGGGTGGTCAAGG; synaptophysin-reverse: ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC; actin direct: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT; actin-reverse: AGGTCTTTACGGAT GTCAACG.
Статистический анализ. В поведенческом тесте животных случайным образом распределяли на различные группы. Для сравнений двух групп использовали непарный двухсторонний t-критерий Стьюдента. Для сравнения более чем двух групп выполняли односторонний ANOVA или двухсторонний ANOVA с последующим тестом Даннета. Все данные с планками погрешностей представлены в качестве среднего значения ± sem. Статистически значимым считали P < 0,05. Большинство данных анализировали в GraphPad Prism. Для количественного определения изображений Iba-1-положительные, Aβ42-положительные и положительные по фосфорилированному тау клетки анализировали посредством ImageJ v1.8.0 с регистрацией "площади". Statistical Analysis . In the behavioral test, the animals were randomly assigned to different groups. An unpaired two-tailed Student's t-test was used to compare the two groups. To compare more than two groups, one-way ANOVA or two-way ANOVA followed by Dunnett's test was performed. All data with error bars are presented as mean ± sem. P < 0.05 was considered statistically significant. Most of the data was analyzed in GraphPad Prism. For imaging quantification, Iba-1 positive, Aβ42 positive, and phosphorylated tau positive cells were analyzed by ImageJ v1.8.0 with "area" recording.
Поведенческие тесты. Проводили следующие поведенческие тесты: водный лабиринт Морриса (водный лабиринт Морриса, MWM), Y-лабиринт и приподнятый крестообразный лабиринт (EPM). Все перемещения регистрировали с использованием камеры и программное обеспечение (Jiliang) использовали для вычисления соответствующих параметров. Behavioral tests . Conducted the following behavioral tests: Morris water maze (Morris water maze, MWM), Y-maze and elevated plus maze (EPM). All movements were recorded using a camera and software (Jiliang) was used to calculate the corresponding parameters.
Тест MWM используют для определения пространственного обучения и памяти в соответствии с протоколом, опубликованным ранее. В кратком изложении, мышей подвергали экспериментам для получения данных в течение 6 суток, и для каждой мыши проводили 3 испытания каждый день. Животных выпускали в воду в желаемом стартовом положении и определяли латентность поиска платформы. На 7-е сутки платформу удаляли и мышам позволяли плавать в течение 60 секунд. Траекторию и количество пересечений областей платформ регистрировали с использованием видеокамеры.The MWM test is used to determine spatial learning and memory according to a previously published protocol. Briefly, mice were subjected to data acquisition experiments for 6 days, and 3 trials were performed for each mouse each day. Animals were released into the water in the desired starting position and the platform search latency was determined. On
Рабочую память оценивали посредством Y-лабиринта в соответствии с литературой с некоторыми модификациями. Y-состоял из трех идентичных звеньев (A, B, C) с разными ключами. Мышей помещали в стартовое звено (A) и регистрировали последовательность исследованных звеньев (такую как ABCBA). Общее количество вхождений в звенья и изменения поведения регистрировали с использованием видеокамеры. Точность в Y-лабиринте представляла собой соотношение между правильным чередованием и общим чередованием.Working memory was assessed using a Y-maze according to the literature with some modifications. Y-consisted of three identical links (A, B, C) with different keys. Mice were placed in the starting link (A) and recorded the sequence of the investigated links (such as ABCBA). The total number of link entries and behavioral changes were recorded using a video camera. The accuracy in the Y-maze was the ratio between correct alternation and total alternation.
Тест EPM широко используется для оценки тревожности у животных и состоит из двух открытых звеньев (30 см × 6 см), двух закрытых звеньев (30 см × 6 см × 22 см) и центральной области (6 см × 6 см). Каждую мышь помещали в центр лабиринтом в сторону закрытого звена, и позволяли исследовать лабиринт в течение 5 минут. Траекторию регистрировали и вычисляли частоту посещений открытого звена, которая негативно коррелировала с тревожностью мышей.The EPM test is widely used to assess anxiety in animals and consists of two open links (30 cm x 6 cm), two closed links (30 cm x 6 cm x 22 cm), and a central region (6 cm x 6 cm). Each mouse was placed in the center of the maze towards the closed link and allowed to explore the maze for 5 minutes. The trajectory was recorded and the frequency of visits to the open link was calculated, which was negatively correlated with anxiety in mice.
ПримерыExamples
Пример 1: Прогрессирование AD ассоциировано с изменением кишечной микробиоты и инфильтрацией иммунных клетокExample 1 AD Progression Associated with Gut Microbiota Change and Immune Cell Infiltration
Для оценки роли изменения кишечной микробиоты в патогенезе AD авторы изобретения использовали модель с трансгенными мышами (Tg) 5XFAD, которая широко используется в исследованиях AD вследствие ее быстрого начала и правдоподобного воспроизведения множества ассоциированных с AD патологических признаков и клинических фенотипов. Она демонстрирует нарушение памяти на 4-м месяце после рождения, поведенческие изменения на 7-м месяце и утрату нейронов на 9-м месяце. В качестве контролей использовали совпадающих по возрасту мышей дикого типа (WT) из той же линии, выращенных в тех же условиях. В соответствии с предшествующими сообщениями, авторы изобретения выявили изменения отложения бляшек Aβ, фосфорилирования тау, экспрессии синаптофизина, поведения и т.п. В частности, отложение бляшек Aβ в коре и гиппокампе быстро накапливается, начиная с 3-го месяца после рождения (фиг.7a). Фосфорилирование тау в головном мозге мышей Tg сначала было обнаружено на 5-месяце, и оно постепенно возрастало с увеличением возраста (фиг.7b); уровень экспрессии синаптофизина в гиппокампе значительно снижался с 7-го по 9-й месяцы, что указывает на синаптическую дегенерацию (фиг.1a). Поведенческий тест у мышей Tg продемонстрировало значительное ухудшение обучения различению в возрасте 9 месяцев (фиг.1b). Следует отметить, что ранние (2-3 месяца) и поздние (7-9 месяцев) стадии у мышей Tg в рамках настоящего изобретения имеют не тот же принцип, что и поздние стадии клинической AD у человека. Поздняя стадия у мышей Tg является симптоматически сравнимой с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD у человека. Таким образом, в рамках настоящего изобретения пациентов с MCI вследствие AD используют в качестве индивидуумов для проведения исследований у человека.To assess the role of gut microbiota alteration in the pathogenesis of AD, the inventors used the 5XFAD transgenic (Tg) mouse model, which is widely used in AD research due to its rapid onset and plausible reproduction of many AD-associated pathological features and clinical phenotypes. She shows memory impairment at 4 months after birth, behavioral changes at 7 months, and neuronal loss at 9 months. Age-matched wild-type (WT) mice from the same strain grown under the same conditions were used as controls. In accordance with prior reports, the inventors have identified changes in Aβ plaque deposition, tau phosphorylation, synaptophysin expression, behavior, and the like. In particular, the deposition of Aβ plaques in the cortex and hippocampus rapidly accumulates starting from the 3rd month after birth (Fig. 7a). Tau phosphorylation in the brain of Tg mice was first detected at 5 months and gradually increased with age (Fig. 7b); the expression level of synaptophysin in the hippocampus decreased significantly from the 7th to the 9th month, indicating synaptic degeneration (Fig. 1a). A behavioral test in Tg mice demonstrated a significant impairment in discrimination learning at 9 months of age (FIG. 1b). It should be noted that early (2-3 months) and late (7-9 months) stages in Tg mice in the context of the present invention do not follow the same principle as late stages of human clinical AD. Late stage in Tg mice is symptomatically comparable to mild cognitive impairment (MCI) due to human AD. Thus, within the scope of the present invention, patients with MCI due to AD are used as subjects for human studies.
Заметный сдвиг композиции микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD у мышей Tg был выявлен при дальнейшем анализе главных компонентов (PCA) для серии моментов времени, в то время как практически никаких изменений не наблюдали у мышей WT с течением времени (фиг.1c; фиг.7c).A marked shift in gut microbiota composition during the progression of AD in Tg mice was identified by further principal component analysis (PCA) for a series of time points, while virtually no change was observed in WT mice over time (Fig. 1c; Fig. 7c ).
С использованием OTU для отслеживания динамики содержания различных бактериальных типов у мышей Tg авторы изобретения обнаружили два характерных изменения профилей кишечной микробиоты у мышей Tg в ходе прогрессирования заболевания. В возрасте 2-3 месяцев Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia были тремя из наиболее распространенных типов бактерий (46,8%, 32,3% и 12,6%, соответственно). В возрасте 7-9 месяцев Firmicutes стали преобладающими бактериями, в то время как содержание Bacteroidetes и Verrucomicrobia значительно снижалось, что указывает на изменение типов бактерий (фиг.1d). Авторы изобретения далее исследовали репрезентативные бактерии из мышей Tg в каждый момент времени (фиг.7d, фиг.7e). Эти результаты показали, что кишечная микробиота мышей Tg была в высокой степени динамичной, что в значительной степени отличается от мышей WT. Сходные результаты также были получены в модели на дважды трансгенных мышах APP/PS1, другой широко используемой модели для исследования AD (фиг.7f, фиг.7g).Using OTU to track the dynamics of different bacterial types in Tg mice, the inventors found two characteristic changes in gut microbiota profiles in Tg mice during disease progression. At 2-3 months of age, Bacteroidetes, Firmicutes , and Verrucomicrobia were three of the most common bacterial types (46.8%, 32.3%, and 12.6%, respectively). At the age of 7-9 months, Firmicutes became the predominant bacteria, while the content of Bacteroidetes and Verrucomicrobia decreased significantly, indicating a change in bacterial types (Fig. 1d). The inventors further examined representative bacteria from Tg mice at each time point (Fig. 7d, Fig. 7e). These results indicated that the gut microbiota of Tg mice was highly dynamic, which is quite different from WT mice. Similar results were also obtained in the APP/PS1 doubly transgenic mouse model, another widely used model for the study of AD (Fig. 7f, Fig. 7g).
Авторы изобретения предположили, что наблюдаемое изменение кишечной микробиоты в ходе прогрессирования AD может быть ассоциировано с нейровоспалением. Для тестирования этой гипотезы авторы изобретения оценили воспалительный статус у мышей Tg. Иммунное окрашивание на IBA1, являющегося характерным признаком активации микроглии, в срезах головного мозга мышей с AD продемонстрировало две очевидных стадии активации микроглии, на 3-м месяце и 7-9-м месяцах, соответственно (фиг.1e). Учитывая, что активация микроглии может быть отнесена к двум противоположным типам, провоспалительный подтип M1 и нейропротективный подтип M2, авторы изобретения также тщательно охарактеризовали фенотипы M1 и M2. На ранней стадии в возрасте 2-3 месяцев происходило повышение уровня как клеток M1, так и клеток M2 микроглии. В следующие месяцы уровень клеток подтипа M1 продолжал возрастать и достигал пика через 7-9 месяцев, в то время как уровень клеток микроглии типа M2 снижалось с 3 по 5 месяцы и оставалось на низком уровне после этого (фиг.1f). Можно видеть, что, по мере прогрессирования AD мышей Tg с течением времени провоспалительный подтип микроглии M1 в головном мозге изменялся от сравнимого с нейропротективным подтипом микроглии M2 (фиг.1f, 2-3 месяца) до преобладающего в микроглии (фиг.1f, 5-9 месяцев) и происходило повышение общей активации микроглии (фиг.1e, 5-9 месяцев).The inventors suggested that the observed change in the intestinal microbiota during the progression of AD may be associated with neuroinflammation. To test this hypothesis, the inventors assessed the inflammatory status in Tg mice. Immunostaining for IBA1, a hallmark of microglial activation, in brain sections of AD mice showed two distinct stages of microglial activation, at 3 months and 7-9 months, respectively (FIG. 1e). Given that microglial activation can be classified into two opposite types, the pro-inflammatory M1 subtype and the neuroprotective M2 subtype, the inventors also carefully characterized the M1 and M2 phenotypes. At an early stage at the age of 2-3 months, there was an increase in the level of both M1 cells and M2 microglial cells. In the following months, the level of M1 subtype cells continued to increase and peaked at 7-9 months, while the level of M2 microglial cells decreased from 3 to 5 months and remained at a low level thereafter (Fig. 1f). It can be seen that, as AD of Tg mice progressed over time, the pro-inflammatory M1 microglia subtype in the brain changed from comparable to the neuroprotective M2 microglia subtype (Fig. 1f, 2-3 months) to predominant in microglia (Fig. 1f, 5- 9 months) and there was an increase in overall microglial activation (Fig. 1e, 5-9 months).
В дополнение к активации микроглии, известно, что AD-ассоциированное нейровоспаление вовлекает инфильтрацию периферических иммунных клеток. Таким образом, авторы изобретения также проанализировали инфильтрацию периферических иммунных клеток в головной мозг в ходе прогрессирования AD. Было обнаружено, что уровень CD45high клеток в головном мозге был значимо более высоким у мышей Tg, чем у мышей WT, аналогично результату окрашивания IBA1 (фиг.1g). Подтипы клеток CD45high в ходе серии моментов времени далее анализировали в ходе прогрессирования AD, что продемонстрировало изменение CD4+ T-клеток, поскольку основная часть CD45high клеток имеет сходную тенденцию к изменению с IBA1 (фиг.1h-i). На протяжении периода времени, исследованного авторами изобретения, инфильтрирующие Th1- и Th2-клетки, два основных подтипа CD4+ клеток, демонстрировали сходную динамику с клетками микроглии M1 и M2 (фиг.1j). Можно видеть, что при прогрессировании AD у мышей Tg с течением времени Th1 изменялись от сравнимых с Th2 (фиг.1j, 2-3 месяца) до преобладающих в CD4+ T-клетках (фиг.1j, 5-9 месяцев) и происходило общее повышение уровня CD4+ T-клеток (фиг.1i, 5-9 месяцев).In addition to microglia activation, AD-associated neuroinflammation is known to involve infiltration of peripheral immune cells. Thus, the inventors also analyzed the infiltration of peripheral immune cells into the brain during the progression of AD. It was found that the level of CD45 high cells in the brain was significantly higher in Tg mice than in WT mice, similar to the result of IBA1 staining (Fig. 1g). The subtypes of CD45 high cells over a series of time points were further analyzed during the progression of AD, which demonstrated the change in CD4 + T cells, since the main part of CD45 high cells has a similar trend to change with IBA1 (Fig.1h-i). Over the time period studied by the inventors, infiltrating Th1 and Th2 cells, the two major subtypes of CD4 + cells, showed similar dynamics to M1 and M2 microglial cells (FIG. 1j). It can be seen that as AD progressed in mice, Tg changed over time from being comparable to Th2 (Fig. 1j, 2-3 months) to predominant in CD4 + T cells (Fig. 1j, 5-9 months) and there was a general increased levels of CD4 + T cells (fig.1i, 5-9 months).
Таким образом, авторы изобретения поняли, что, поскольку паттерн кишечной микробы изменялся, популяция иммунных клеток имела тенденцию к изменению на Th1- и M1-преобладающее состояние, особенно поразительным является значение этих изменений с течением времени (фиг.1d-j). Сходные результаты также были обнаружены в модели на мышах APP/PS1 (фиг.8, фиг.7i, фиг.7j, фиг.23). Следует отметить, что модель на мышах APP/PS1 и модель на трансгенных мышах (Tg) 5XFAD отличаются в отношении прогрессирования AD с течением времени. Мыши Tg имеют очевидное отложение Aβ в возрасте 5 месяцев (фиг.7a), в то время как мыши APP/PS1 не имеют очевидных отложений Aβ в возрасте 5 месяцев (фиг.8a). Изменения кишечных микробов в этих двух моделях с течением времени (фиг.1d, фиг.7g) не являются полностью устойчивыми, что отражает внутривидовое и межиндивидуальное прогрессирование AD и отличия кишечных микробов, однако все они демонстрируют корреляцию между изменениями паттернов кишечных микробов и изменениями иммунных клеток с течением времени.Thus, the inventors realized that as the gut microbial pattern changed, the immune cell population tended to change to a Th1- and M1-predominant state, the significance of these changes over time being particularly striking (FIGS. 1d-j). Similar results were also found in the APP/PS1 mouse model (Fig. 8, Fig. 7i, Fig. 7j, Fig. 23). It should be noted that the APP/PS1 mouse model and the 5XFAD transgenic (Tg) mouse model differ with respect to the progression of AD over time. Tg mice have obvious Aβ deposits at 5 months of age (FIG. 7a), while APP/PS1 mice have no obvious Aβ deposits at 5 months of age (FIG. 8a). Changes in gut microbes in these two models over time (fig. 1d, fig. 7g) are not completely robust, reflecting the intraspecies and inter-individual progression of AD and differences in gut microbes, however, they all show a correlation between changes in gut microbial patterns and changes in immune cells. over time.
Авторы изобретения также проанализировали корреляцию между содержанием кишечной микробиоты и частотой иммунных клеток в головном мозге, и отметили, что ранняя (2-3 месяца) бактериальная композиция в высокой степени коррелирует с количествами клеток M2 и Th2 в головном мозге (фиг.1k, верх), однако изменения бактериального паттерна в высокой степени коррелировали с клетками M1 и Th1 (фиг.1k, низ). Бактерии, которые были в значительной степени взаимосвязаны с иммунными клетками, приведены на правой панели фиг.1k, вновь подтверждая корреляцию между паттерном кишечной микробиоты и иммунными клетками, особенно Th1 и M1.The inventors also analyzed the correlation between gut microbiota content and the frequency of immune cells in the brain, and noted that early (2-3 months) bacterial composition is highly correlated with the numbers of M2 and Th2 cells in the brain (Fig. 1k, top) , however, changes in bacterial pattern were highly correlated with M1 and Th1 cells (Fig. 1k, bottom). Bacteria that were highly correlated with immune cells are shown in the right panel of Figure 1k, reaffirming the correlation between gut microbiota pattern and immune cells, especially Th1 and M1.
В целом, эти результаты показали, что кишечные бактерии ассоциированы с инфильтрацией периферических иммунных клеток и возникновением нейровоспаления в ходе прогрессирования AD, исследование которых описано далее.Overall, these results indicate that gut bacteria are associated with peripheral immune cell infiltration and neuroinflammation during the progression of AD, a study of which is described below.
Пример 2: Изменения кишечной микробиоты приводят к чрезмерной инфильтрации Th1-клеток и чрезмерной активации клеток микроглии M1 в головном мозгеExample 2: Changes in the Gut Microbiota Lead to Excessive Th1 Cell Infiltration and Excessive Activation of M1 Microglial Cells in the Brain
Для определения того, требуется ли изменение кишечной микробиоты для запуска инфильтрации периферических иммунных клеток и в свою очередь нейровоспаления при прогрессировании AD, авторы изобретения использовали коктейль антибиотиков, содержавший ампициллин (0,1 мг/мл), стрептомицин (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл) у мышей Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев) для сокращения кишечной микробиоты. Введение антибиотика у мышей Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев) приводило к выраженному сокращению как микробного разнообразия, так и содержания в кишечнике (фиг.2a).To determine whether a change in the gut microbiota is required to trigger peripheral immune cell infiltration and in turn neuroinflammation in the progression of AD, the inventors used an antibiotic cocktail containing ampicillin (0.1 mg/mL), streptomycin (0.5 mg/mL) and colistin (0.1 mg/mL) in late stage Tg mice (at 7 months of age) to reduce gut microbiota. Administration of the antibiotic to Tg mice at a late stage (at 7 months of age) resulted in a marked reduction in both microbial diversity and intestinal abundance (FIG. 2a).
Вместе с этим изменением авторы изобретения выявили снижение уровня как инфильтрирующих провоспалительных Th1-клеток (фиг.2b), так и клеток M1 (фиг.2c) в головном мозге. Это предварительно показывает, что, посредством препятствования распределению кишечных микробов у мышей AD может быть изменено преобладающее состояние Th1 и M1 у мышей с AD поздней стадии, что указывает на причинно-следственную взаимосвязь между изменениями кишечных микробов и изменениями иммунных клеток.Together with this change, the inventors found a decrease in the level of both infiltrating pro-inflammatory Th1 cells (Fig. 2b) and M1 cells (Fig. 2c) in the brain. This preliminary shows that by inhibiting the distribution of gut microbes in AD mice, the predominant state of Th1 and M1 in mice with advanced AD can be altered, indicating a causal relationship between changes in gut microbes and changes in immune cells.
Кроме того, эти данные были подтверждены посредством эксперимента с совместным содержанием. Мышей WT совместно содержали с мышами Tg того же возраста в течение 7 месяцев с рождения. Совместно содержащиеся мыши WT демонстрировали снижение обучения различению, сравнимое с мышами Tg (фиг.9a). Для установления причин этого, анализ изменения кишечной микробиоты у этих мышей в возрасте 7 месяцев показал, что композиция кишечной микробиоты была довольно сходной между совместно содержащимися мышами WT и мышами Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев), но значительно отличалась от мышей WT того же возраста, содержащихся отдельно (фиг.2d), что указывает на то, что длительное воздействие на мышей WT бактерий Tg (т.е. модель кишечных микробов при AD у мышей Tg) вызывало сдвиг композиции кишечной микробиоты у мышей WT в направлении мышей Tg, и в то же время вызывало снижение когнитивных функций. Это позволяет предложить стратегию для создания модели AD, которая отличается от общепринятой схемы, т.е. посредством регуляции паттерна кишечной микробиоты модели WT для изменения на микробиоту модели AD.In addition, these data were confirmed through a joint content experiment. WT mice were co-housed with Tg mice of the same age for 7 months from birth. Co-housed WT mice showed a reduction in discrimination learning comparable to Tg mice (FIG. 9a). To establish the reasons for this, analysis of the change in gut microbiota in these mice at 7 months of age showed that the composition of the gut microbiota was fairly similar between co-housed WT mice and Tg mice at the late stage (at 7 months of age), but significantly different from WT mice at that time. of the same age, kept separately (Fig. 2d), indicating that long-term exposure of WT mice to Tg bacteria (i.e., a gut microbial model in AD in Tg mice) caused a shift in the composition of the gut microbiota in WT mice towards Tg mice. , and at the same time caused a decrease in cognitive functions. This allows us to propose a strategy for creating an AD model that differs from the generally accepted scheme, i.e. by regulating the pattern of the WT model gut microbiota to change to the AD model microbiota.
Более того, уровни инфильтрирующих Th1-клеток между совместно содержащимися мышами WT и Tg также были сравнимыми, что в обоих случаях значительно превышало уровни у отдельно содержащихся мышей WT (фиг.2e). Между тем, уровни клеток M1 возрастали у совместно содержащихся мышей WT (фиг.2f). Одновременно с изменением иммунных клеток экспрессия цитокинов в головном мозге продемонстрировала выраженное сходство между совместно содержащимися мышами WT и Tg, но отличалась от их экспрессии у мышей WT (фиг.2g).Moreover, the levels of infiltrating Th1 cells between co-housed WT and Tg mice were also comparable, in both cases significantly higher than the levels in solitary WT mice (FIG. 2e). Meanwhile, M1 cell levels increased in co-housed WT mice (FIG. 2f). Simultaneously with the change in immune cells, the expression of cytokines in the brain showed a marked similarity between co-housed WT and Tg mice, but differed from their expression in WT mice (Fig. 2g).
Таким образом, приведенное выше описание подтвердило, что путем изменения кишечной микробиоты мышей WT на кишечную микробиоту мышей Tg, клетки Th1 и M1 мышей WT преобразовывались в состояние, сходное с состоянием у мышей Tg, что приводило к сходному снижению когнитивных способностей, и также подтверждению причинно-следственной взаимосвязи между изменениями кишечной микробиоты и изменением иммунных клеток, а также когнитивной функции.Thus, the above description confirmed that by changing the gut microbiota of WT mice to the gut microbiota of Tg mice, Th1 and M1 cells of WT mice were transformed into a state similar to that of Tg mice, resulting in similar cognitive decline, and also confirming causation. -investigative relationship between changes in the intestinal microbiota and changes in immune cells, as well as cognitive function.
Более того, авторы изобретения использовали мышей C57BL/6WT для создания модели для демонстрации терапевтической ценности описанного выше способа. Авторы изобретения провели эксперименты по трансплантации фекальной микробиоты (FMT) с использованием мышей C57BL/6 WT, и результаты представлены в столбцах 6-10 фиг.16.Moreover, the inventors used C57BL/6WT mice to create a model to demonstrate the therapeutic value of the method described above. The inventors conducted fecal microbiota transplantation (FMT) experiments using C57BL/6 WT mice and the results are shown in columns 6-10 of FIG.
Мышам C57BL/6WT вводили антибиотики для обеспечения первоначальной среды для последующей трансплантации фекальной микробиоты. Агрегированный Aβ инъецировали в их гиппокамп, а затем перорально вводили фекальные бактерии от мышей Tg в возрасте от 7 до 9 месяцев ("Receptor_C57_ Receiving TG Fecal Bacteria") или фекальные бактерии от мышей WT мышей ("Receptor_C57_Receive WT Fecal Bacteria") в качестве контроля. Это приводило к значительному повышению уровня Th1-клеток и значительному снижению уровня Th2 в головном мозге по сравнению с контролем (фиг.9b), что согласовывалось с изменениями у мышей Tg, описанными выше. Это доказало, что трансплантация фекалий Tg может приводить к изменению паттерна кишечных микроорганизмов у мышей WT, что также приводит к изменению паттерна иммунных клеток.C57BL/6WT mice were treated with antibiotics to provide an initial environment for subsequent fecal microbiota transplantation. Aggregated Aβ was injected into their hippocampus and then fecal bacteria from 7 to 9 month old Tg mice ("Receptor_C57_Receiving TG Fecal Bacteria") or fecal bacteria from WT mice ("Receptor_C57_Receive WT Fecal Bacteria") were orally administered as controls . This resulted in a significant increase in the level of Th1 cells and a significant decrease in the level of Th2 in the brain compared to the control (Fig.9b), which was consistent with the changes in Tg mice described above. This proved that Tg faecal transplantation can lead to a change in the pattern of intestinal microorganisms in WT mice, which also leads to a change in the pattern of immune cells.
С другой стороны, напротив, трансплантация фекалий от мышей WT с нормальным паттерном распределения кишечных микроорганизмов снижала уровень Th1-клеток в головном мозге реципиентных мышей Tg (фиг.9c). Это показало, что паттерн кишечных микробов мышей Tg изменяется относительно паттерна кишечных микробов у мышей WT, и также изменяется паттерн иммунных клеток.Conversely, faecal transplantation from WT mice with a normal intestinal microorganism distribution pattern reduced the level of Th1 cells in the brains of recipient Tg mice (Fig. 9c). This showed that the gut microbial pattern of Tg mice changes relative to the gut microbial pattern of WT mice, and the immune cell pattern also changes.
Эти результаты вновь подтвердили причинно-следственную взаимосвязь между изменениями кишечной микробиоты и изменениями иммунных клеток головного мозга (особенно Th1/M1) и когнитивной функции при прогрессировании AD. Для лечения AD была предложена и подтверждена стратегия использования оси головной мозг-кишечник.These results re-confirm a causal relationship between changes in the gut microbiota and changes in brain immune cells (especially Th1/M1) and cognitive function in the progression of AD. For the treatment of AD, a strategy using the brain-gut axis has been proposed and validated.
Взятые вместе, эти данные указывают на то, что изменение кишечной микробиоты запускает инфильтрацию периферических иммунных клеток и нейровоспалительную активацию при прогрессировании AD. Путем введения средств (например, фекалий WT с нормальными паттернами распределения кишечных микроорганизмов или OM1, проиллюстрированного ниже), регулирующих относительное содержание кишечных микробов, мышам Tg, распределение кишечных микробов которых демонстрирует связанный с заболеванием паттерн, происходила реорганизация распределения кишечных микроорганизмов у мышей Tg в направлении раннего и нормального распределения кишечных микроорганизмов. Это эффективно обращало вспять паттерн иммунных клеток с преобладанием Th1/M1 у мышей Tg, тем самым улучшая когнитивную функцию и осуществляя лечение AD. Это обеспечивает надежное основание и убедительные доказательства для дальнейшего улучшения когнитивной функции и лечения AD путем реорганизации распределения кишечных микроорганизмов у людей-пациентов с AD (например, стратегия использования средств для регуляции относительного содержания кишечных микроорганизмов) для обращения вспять паттерна иммунных клеток; а также для применения распределения кишечных микроорганизмов и/или статуса иммунных клеток (например, статуса Th1 (например, доля в популяции), статуса M1 (например, доля в популяции)) в качестве маркеров прогрессирования AD.Taken together, these data indicate that changes in the gut microbiota trigger peripheral immune cell infiltration and neuroinflammatory activation during AD progression. By administering agents (e.g., WT faeces with normal gut microbial distribution patterns or OM1, illustrated below) that regulate the relative abundance of gut microbes to Tg mice whose gut microbial distribution exhibits a disease-associated pattern, the gut microbial distribution of Tg mice was reorganized in the direction early and normal distribution of intestinal microorganisms. This effectively reversed the Th1/M1-dominated immune cell pattern in Tg mice, thereby improving cognitive function and treating AD. This provides a sound basis and strong evidence for further improving cognition and treating AD by reorganizing the distribution of gut micro-organisms in human AD patients (eg, the strategy of using agents to regulate the relative content of gut micro-organisms) to reverse the immune cell pattern; as well as to use the distribution of intestinal microorganisms and/or immune cell status (eg, Th1 status (eg, proportion in the population), M1 status (eg, proportion in the population)) as markers of AD progression.
Пример 3 OM1 облегчает нейровоспаление посредством регуляции кишечной микробиотыExample 3 OM1 Facilitates Neuroinflammation Through Gut Microbiota Regulation
Незаменимая роль кишечной микробиоты при прогрессировании AD, показанная в настоящем описании, может указывать на терапевтические последствия вмешательства в микробиоту кишечника. Чтобы вновь это подтвердить, авторы изобретения использовали OM1, который является клинически одобренным лекарственным средством против AD, экстрагированным из коричневых водорослей. OM1 представляет собой смесь кислых линейных олигосахаридов со степенью полимеризации в диапазоне от димера до декамера со средней молекулярной массой приблизительно 1 кДа (фиг.3a).The indispensable role of the gut microbiota in the progression of AD, shown in the present description, may point to therapeutic implications of interfering with the gut microbiota. To confirm this again, the inventors used OM1, which is a clinically approved anti-AD drug extracted from brown algae. OM1 is a mixture of acidic linear oligosaccharides with a degree of polymerization ranging from dimer to decamer with an average molecular weight of approximately 1 kDa (FIG. 3a).
У модельных мышей с APP/PS1 поздней стадии AD в возрасте от 9 месяцев до 12 месяцев, которым вводили OM1 в течение 3 месяцев, OM1 демонстрировал выраженный эффект смягчения когнитивного расстройства, как показано посредством усиленного пространственного обучения, и характеристик памяти у мышей APP/PS1 как в обучающем испытании (фиг.3b), так и в пробном испытании (фиг.3c) в задании с водным лабиринтом Морриса (MWM). OM1 также значительно улучшал результаты мышей в Y-лабиринте (фиг.3d). Недавно OM1 показал терапевтический эффект в отношении обращения вспять нарушения состояния у пациентов с AD в 36-недельном мультицентровом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом клиническом испытании фазы 3 (код клинического испытания: CTR20140274) в Китае. Авторы изобретения интересовались пониманием того, демонстрирует ли OM1 эффект улучшения когнитивной функции путем влияния на микробиоту пациентов с AD.In late stage AD APP/PS1 model mice aged 9 months to 12 months, administered with OM1 for 3 months, OM1 showed a pronounced effect of attenuating cognitive decline as shown by enhanced spatial learning and memory performance in APP/PS1 mice in both the training trial (FIG. 3b) and the trial trial (FIG. 3c) in the Morris Water Maze (MWM) task. OM1 also significantly improved the performance of mice in the Y-maze (Fig. 3d). Recently, OM1 showed a therapeutic effect on reversal of impairment in AD patients in a 36-week, multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled
Интересно, что пероральное введение OM1 в течение одного месяца мышам Tg на поздней стадии, начиная в возрасте 7 месяцев изменяло состав кишечной микробиоты (фиг.4a-b; фиг.10a), восстанавливая его в направлении паттерна WT (фиг.13-14; фиг.16).Interestingly, oral administration of OM1 for one month to late stage Tg mice, starting at 7 months of age, altered the gut microbiota composition (FIGS. 4a-b; FIG. 10a), restoring it in the direction of the WT pattern (FIGS. 13-14; Fig.16).
Наряду с изменением кишечной микробиоты, введение OM1 мышам Tg нарушало корреляцию между количествами лимфоцитов в головном мозге и изменением кишечных бактерий (фиг.4c; фиг.10b и c), снижало уровни Th1-клеток в головном мозге (фиг.4d), значительно снижало активацию микроглии до уровней, сходных с мышами WT (фиг.4e) и снижало уровни цитокинов в головном мозге (фиг.4f), восстанавливая их в направлении паттерна WT (фиг.15). Параллельно, введение OM1 значимо снижало отложение бляшек Aβ, фосфорилирование тау и снижение обучения различению, наблюдаемое у мышей Tg (фиг.4g-i). Это вновь подтвердило стратегию восстановления распределения кишечных микробов, например, с использованием средств для регуляции относительного содержания кишечных микробов, для обращения вспять паттерна иммунных клеток, тем самым улучшая состояния и осуществляя лечение AD.Along with altering the gut microbiota, administration of OM1 to Tg mice disrupted the correlation between brain lymphocyte counts and gut bacteria alteration (Fig. 4c; Fig. 10b and c), decreased levels of Th1 cells in the brain (Fig. 4d), significantly reduced activation of microglia to levels similar to WT mice (Fig. 4e) and reduced cytokine levels in the brain (Fig. 4f), restoring them in the direction of the WT pattern (Fig. 15). In parallel, OM1 administration significantly reduced Aβ plaque deposition, tau phosphorylation, and reduced discrimination learning observed in Tg mice (Fig. 4g-i). This again validated a strategy to restore the distribution of gut microbes, for example, using agents to regulate the relative abundance of gut microbes, to reverse the pattern of immune cells, thereby improving conditions and treating AD.
Далее авторы изобретения провели трансплантацию фекальной микрофлоры (FMT), трансплантируя фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, реципиентным мышам C57BL/6 WT, которым проводили внутрижелудочковую инъекцию агрегированного Aβ. Фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, приводили к снижению уровня Th1-клеток головного мозга реципиентных мышей по сравнению с мышами Tg без введения OM1 (фиг.10e). Можно видеть, что фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, и фекалии мышей WT, проверенные в примере 2, имеют сходный эффект на восстановления распределения кишечных микробов и снижение Th1, что подтверждает эффект восстановления OM1 на кишечные микробы мышей Tg. В соответствии с этим, введение антибиотиков снижало эффект OM1 на клетки Th1, уровни IBA1 и экспрессию цитокинов в модели на мышах APP/PS1 (фиг.10f-j). Все эти данные показали, что OM1 может облегчать нейровоспаление и снижение когнитивной функции посредством модулирования дисбиоза кишечника.Further, the inventors performed fecal microflora transplantation (FMT) by transplanting the faeces of Tg mice injected with OM1 into recipient C57BL/6 WT mice that had received intraventricular injection of aggregated Aβ. The faeces of Tg mice injected with OM1 resulted in a decrease in the level of Th1 brain cells of the recipient mice compared to Tg mice without OM1 administration (FIG. 10e). It can be seen that the faeces of Tg mice injected with OM1 and the faeces of WT mice tested in Example 2 have a similar effect on restoring the distribution of gut microbes and reducing Th1, confirming the effect of restoring OM1 on the gut microbes of Tg mice. Consistently, administration of antibiotics reduced the effect of OM1 on Th1 cells, IBA1 levels, and cytokine expression in the APP/PS1 mouse model (FIGS. 10f-j). All of these data indicate that OM1 can alleviate neuroinflammation and cognitive decline through modulation of gut dysbiosis.
Как правило, приведенные выше эксперименты на мышах in vivo полностью подтвердили изменения кишечных микробов и их тенденцию к регуляции преобладания иммунных клеток Th1/M1 и его обращения вспять при когнитивных нарушениях, таких как AD, и их улучшениях, для каскадов регуляции оси головной мозг-кишечник при AD и способов лечения с вмешательством в них. Кроме того, такие регуляторные каскады и вмешательства стабильно демонстрируются в различных моделях на мышах (модель на трансгенных (Tg) 5XFAD, модель на мышах APP/PS1, модель на мышах C57BL/6), хотя существуют определенные внутривидовые и межиндивидуальные различия в первоначальном состоянии и переходе процесса для кишечных микробов среди этих мышей. Таким образом, общность таких регуляторных каскадов и вмешательств у различных индивидуумов полностью подтверждается. Таким образом, предлагается стратегия улучшения когнитивной функции и лечения AD посредством регуляции кишечных микробов для восстановления кишечных микробов к нормальному и здоровому состоянию с целью обращения вспять состояния опосредуемого иммунными клетками заболевания.In general, the above in vivo mouse experiments have fully confirmed gut microbial changes and their tendency to regulate and reverse Th1/M1 immune cell predominance and reversal in cognitive impairments such as AD and their amelioration for brain-gut axis regulation cascades. in AD and interventional therapies. In addition, such regulatory cascades and interventions are consistently demonstrated in various mouse models (transgenic (Tg) 5XFAD model, APP/PS1 mouse model, C57BL/6 mouse model), although there are certain intraspecies and interindividual differences in initial state and transition process for gut microbes among these mice. Thus, the commonality of such regulatory cascades and interventions in different individuals is fully confirmed. Thus, a strategy is proposed to improve cognitive function and treat AD through the regulation of gut microbes to restore gut microbes to a normal and healthy state in order to reverse the state of immune cell-mediated disease.
Авторы изобретения использовали данные для пациентов с AD и здоровых контролей для сравнения и анализа связанных с осью головной мозг-кишечник при AD микроорганизмов, которые различаются между этими двумя моделями, как приведено в таблицах 1-2 и как проиллюстрировано на фиг.17-18, в качестве мишени для регуляции. При применении вышеупомянутой стратегии лечения, направленной на ось головной мозг-кишечник при AD для людей, в дополнение к межвидовым различиям кишечных микробов между протестированными мышами в качестве грызунов и людьми в качестве приматов, протестированных в рамках настоящего изобретения, внутривидовые и межиндивидуальные различия кишечных микроорганизмов между пациентами AD также должны полностью учитываться. Таким образом, типы кишечных микроорганизмов мышей, конкретно показанные в приведенных выше экспериментах, являются только инструктирующими, и не должны жестко и механически применяться для пациентов-людей с AD.The inventors used data from AD patients and healthy controls to compare and analyze AD brain-gut axis-associated microorganisms that differ between the two models, as summarized in Tables 1-2 and as illustrated in Figures 17-18. as a target for regulation. When applying the aforementioned treatment strategy aimed at the brain-gut axis in AD for humans, in addition to the interspecies differences in gut microbes between mice tested as rodents and humans as primates tested in the framework of the present invention, intraspecies and inter-individual differences in gut microorganisms between AD patients should also be fully considered. Thus, the mouse gut microbial types specifically shown in the above experiments are instructive only, and should not be rigidly and mechanically applied to human AD patients.
Пример 4: OM1 ингибирует нейровоспаление посредством регуляции метаболизма аминокислотExample 4 OM1 Inhibits Neuroinflammation Through Regulation of Amino Acid Metabolism
В рамках настоящего изобретения также исследована промежуточная связь между изменением кишечной микробиоты и изменением иммунных клеток или вмешательством в него.Within the framework of the present invention, an intermediate relationship between alteration of the intestinal microbiota and alteration of immune cells or interference with it has also been investigated.
Причинно-следственная связь между метаболитами кишечных микробов и дифференцировкой наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в нихCausal relationship between gut microbial metabolites and Th1/Th2 naïve T-cell differentiation and intervention
Для тестирования возможного вовлечения метаболитов в иммунное модулирование супернатант культивируемых фекалий in vitro от мышей Tg в возрасте 7 месяцев добавляли к культуре наивных CD4+ T-клеток, что стимулировало дифференцировку наивных CD4+ T-клеток в Th1- и Th2-клетки. Напротив, фекальный супернатант мышей Tg, которым вводили OM1, способствовал дифференцировке в Th2 и ингибировал дифференцировку в Th1 (фиг.11a), что указывает на то, что метаболиты микробов кишечника влияют на дифференцировку наивных T-клеток в Th1- и Th2-клетки.To test for possible involvement of metabolites in immune modulation, in vitro cultured faecal supernatant from 7-month-old Tg mice was added to a culture of naive CD4 + T cells, which stimulated the differentiation of naive CD4 + T cells into Th1 and Th2 cells. In contrast, the faecal supernatant of OM1 injected Tg mice promoted differentiation to Th2 and inhibited differentiation to Th1 (Figure 11a), indicating that gut microbial metabolites influence the differentiation of naive T cells into Th1 and Th2 cells.
Причинно-следственная связь между аминокислотами в метаболитах кишечных микробов и дифференцировкой наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в нихCausal relationship between amino acids in gut microbial metabolites and Th1/Th2 naïve T cell differentiation and intervention
Авторы изобретения далее использовали способ нецелевой метаболомики для охарактеризации фекального метаболома. Всего 11289 метаболитов было идентифицировано в фекальных образцах от мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (фиг.11b-c). Среди этих метаболитов содержание 124 метаболитов, аннотированных в базе данных METLIN, значительно изменялось, снижалось или повышалось у мышей Tg относительно мышей WT, что указывает на то, что они связаны с AD. Поразительно, все эти изменения метаболитов могут быть в значительной степени обращены вспять посредством обработки OM1 (фиг.11d-f), что указывает на то, что лечение AD восстанавливало аномальное состояние этих связанных с AD метаболитов. Эти измененные метаболиты далее аннотировали с использованием базы данных Human Metabolome Database (HMDB) и Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) с получением всего 31 метаболита, которые дифференциально регулировались у мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1, которые могли быть сопоставлены со всеми тремя базами данных (HMDB, METLIN, KEGG). Анализ обогащения каскадов для этих метаболитов с использованием MBROLE или MetaboAnalyst далее продемонстрировал значимые изменения связанных с аминокислотами метаболических каскадов и ферментов, особенно связанных с фенилаланином каскадов (фиг.5a).The inventors further used a non-targeted metabolomics method to characterize the fecal metabolome. A total of 11289 metabolites were identified in faecal samples from WT, Tg mice and Tg mice injected with OM1 (Fig. 11b-c). Among these metabolites, 124 metabolites annotated in the METLIN database were significantly altered, decreased, or increased in Tg mice relative to WT mice, indicating that they are associated with AD. Strikingly, all of these metabolite changes can be largely reversed by OM1 treatment (FIGS. 11d-f), indicating that AD treatment restored the abnormal state of these AD-related metabolites. These altered metabolites were further annotated using the Human Metabolome Database (HMDB) and the Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) to yield a total of 31 metabolites that were differentially upregulated in WT, Tg and OM1 injected Tg mice, which could be compared to all three databases (HMDB, METLIN, KEGG). Analysis of the enrichment cascades for these metabolites using MBROLE or MetaboAnalyst further demonstrated significant changes in amino acid-related metabolic cascades and enzymes, especially phenylalanine-related cascades (FIG. 5a).
Таким образом, авторы изобретения решили сфокусироваться на аминокислотах для дальнейшего испытания. Проводили скрининг концентраций в плазме всего 36 аминокислот (таблица 3) как у мышей WT, так и у мышей Tg. Для классификации этих аминокислот использовали алгоритм случайного леса, и некоторые из них были отсортированы, как показано на фиг.19 и представлено в таблице 4. Фенилаланин был оценен в качестве наивысшего результата, за которым следовали изолейцин, серотонин, гистидин и ацетилорнитин. Многопараметрический поисковый анализ этих пяти аминокислот выявил значимые различия между мышами WT и Tg в соответствии с кривой операционных характеристик приемника (ROC) (фиг.5b; фиг.11h), что указывает на то, что они являются тесно связанными с прогрессированием заболевания. Затем авторы изобретения исследовали концентрацию выбранных аминокислот в образцах фекалий и крови в мышей Tg, которым вводили OM1 или не проводили введение, и сравнили ее с мышами WT. Ссылаясь на фиг.20 и фиг.21, авторы изобретения обнаружили, что OM1 влиял на различные аминокислоты, и они восстанавливались от паттерна Tg к паттерну дикого типа. В частности, концентрации фенилаланина и изолейцина были значимо более высокими в фекалиях мышей Tg, чем в фекалиях мышей WT, и введение OM1 значимо снижало их концентрации до уровня, сравнимого с уровнем у мышей WT (фиг.5c). Сходные изменения содержания фенилаланина и изолейцина были обнаружены в крови (фиг.5d). Следует отметить, что фенилаланин и изолейцин являются типичными представителями метаболитов кишечных микробов, которые изменяются при прогрессировании заболевания и обращаются вспять посредством OM1. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что после введения OM1 цитокины мышей имеют тенденцию к восстановлению до паттерна дикого типа (фиг.22). Это соответствует статусу цитокинов у мышей WT, имеющему тенденцию к изменению до паттерна у мышей Tg, как показано на фиг.2g, при совместном содержании с мышами Tg.Thus, the inventors decided to focus on amino acids for further testing. Plasma concentrations of a total of 36 amino acids were screened (Table 3) in both WT and Tg mice. A random forest algorithm was used to classify these amino acids, and some of them were sorted as shown in Figure 19 and presented in Table 4. Phenylalanine was ranked as the highest, followed by isoleucine, serotonin, histidine, and acetylornithine. Multivariate exploratory analysis of these five amino acids revealed significant differences between WT and Tg mice according to the receiver operating characteristics (ROC) curve (Fig. 5b; Fig. 11h), indicating that they are closely associated with disease progression. The inventors then examined the concentration of selected amino acids in faecal and blood samples in Tg mice treated with OM1 or not and compared it with WT mice. Referring to FIG. 20 and FIG. 21, the inventors found that OM1 affected various amino acids and they recovered from the Tg pattern to the wild type pattern. In particular, the concentrations of phenylalanine and isoleucine were significantly higher in the feces of Tg mice than in the faeces of WT mice, and administration of OM1 significantly reduced their concentrations to a level comparable to that of WT mice (Fig. 5c). Similar changes in the content of phenylalanine and isoleucine were found in the blood (fig.5d). Of note, phenylalanine and isoleucine are typical gut microbial metabolites that change with disease progression and are reversed by OM1. In addition, the inventors also found that after administration of OM1, mouse cytokines tend to recover to the wild-type pattern (FIG. 22). This corresponds to the cytokine status in WT mice tending to change to a pattern in Tg mice as shown in FIG. 2g when co-habitated with Tg mice.
Для тестирования того, было ли повышение уровня этих аминокислот результатом изменения кишечной микробиоты, тем самым обеспечивающего вмешательство в аминокислоты путем препятствования кишечной микробиоте, авторы изобретения исследовали концентрацию аминокислот в исследовании FMT. Фекалии мышей WT в возрасте 2 месяцев могли значительно снижать уровень фенилаланина и изолейцина у мышей Tg (фиг.11i). Аналогично, у совместно содержащихся мышей WT, описанных на фиг. 2, концентрации фенилаланина и изолейцина в крови также повышались, что было сравнимым с мышами Tg (фиг.11j). Таким образом, можно было определить, что, когда мышей WT совместно содержали с мышами Tg для преобразования их собственного паттерна кишечных микробов WT в паттерн Tg, происходило аномальное продуцирование фенилаланина и изолейцина и уровень фенилаланина и изолейцина возрастал. Напротив, трансплантация фекалий мышей WT, содержавших нормальную кишечную микробиоту WT, мышам Tg вызывала сдвиг кишечной микробиоты мышей Tg в сторону паттерна WT, что приводило к восстановлению аномального продуцирования фенилаланина и изолейцина, и уровень фенилаланина и изолейцина снижался. Это подтверждало, что уровни метаболитов кишечных микробов фенилаланина и изолейцина могут быть восстановлены путем восстановления кишечной микробиоты мышей Tg.To test whether the increase in these amino acids was the result of an alteration in the gut microbiota, thereby allowing interference with amino acids by obstructing the gut microbiota, the inventors examined the concentration of amino acids in the FMT study. Feces from 2-month-old WT mice could significantly reduce phenylalanine and isoleucine levels in Tg mice (FIG. 11i). Similarly, co-housed WT mice described in FIG. 2, blood concentrations of phenylalanine and isoleucine also increased, which was comparable to Tg mice (FIG. 11j). Thus, it could be determined that when WT mice were co-housed with Tg mice to convert their own WT gut microbial pattern into a Tg pattern, abnormal production of phenylalanine and isoleucine occurred and levels of phenylalanine and isoleucine increased. In contrast, transplantation of faeces from WT mice containing normal WT gut microbiota into Tg mice caused the gut microbiota of Tg mice to shift towards the WT pattern, resulting in the restoration of abnormal phenylalanine and isoleucine production, and phenylalanine and isoleucine levels decreased. This confirmed that levels of the gut microbial metabolites phenylalanine and isoleucine could be restored by restoring the gut microbiota of Tg mice.
Подтверждение того, что фенилаланин и изолейцин влияют на дифференцировку наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в нихConfirmation that phenylalanine and isoleucine influence and interfere with naive T-cell differentiation into Th1/Th2
Для оценки эффектов фенилаланина и изолейцина на клетки, эти два соединения добавляли непосредственно в культуру наивных CD4+ T-клеток. Происходило повышение как дифференцировки Th0-клеток в Th1-клетки (фиг.5e), так и пролиферации Th1-клеток (фиг.5f). Напротив, введение OM1 может ингибировать дифференцировку Th1, индуцированную фенилаланином и изолейцином и стимуляцию пролиферации Th1-клеток, что указывает на то, что OM1 не только влияет на кишечные микробы, но также прямо влияет на саму их аминокислоту-метаболит. Кроме того, авторы изобретения проводили мышам WT внутрибрюшинную инъекцию фенилаланина и изолейцина и обнаружили, что количество Th1-клеток в крови значительно возрастало (фиг. 5g), подтверждая, что аминокислоты способствуют дифференцировке Th0 в Th1 in vivo. Эти результаты указывают на то, что накопление фенилаланина и изолейцина может повышать количество Th1-клеток в крови.To assess the effects of phenylalanine and isoleucine on cells, these two compounds were added directly to a culture of naive CD4 + T cells. There was an increase in both differentiation of Th0 cells into Th1 cells (Fig. 5e) and proliferation of Th1 cells (Fig. 5f). In contrast, administration of OM1 can inhibit phenylalanine and isoleucine-induced Th1 differentiation and stimulation of Th1 cell proliferation, indicating that OM1 not only affects gut microbes, but also directly affects their amino acid metabolite itself. In addition, the inventors gave WT mice an intraperitoneal injection of phenylalanine and isoleucine and found that the number of Th1 cells in the blood increased significantly (Fig. 5g), confirming that amino acids promote differentiation of Th0 into Th1 in vivo . These results indicate that the accumulation of phenylalanine and isoleucine can increase the number of Th1 cells in the blood.
Вмешательство в дифференцировку наивных T-клеток путем препятствования захвату аминокислот наивными T-клеткамиInterfering with naive T cell differentiation by interfering with amino acid uptake by naive T cells
Аминокислоты могут захватываться иммунными клетками через специализированные переносчики. Авторы изобретения далее исследовали уровни экспрессии SLC7A5, переносчика фенилаланина и изолейцина, в наивных CD4+ T-клетках и обнаружили, что SLC7A5 экспрессировался в CD4+ T-клетках. Инкубация CD4+ T-клеток с 13C-меченным фенилаланином продемонстрировала захват фенилаланина CD4+ T-клетками, который мог блокироваться фармакологическим ингибитором SLC7A5, JPH 203 (фиг.11k), указывая на то, что он способен ингибировать захват аминокислот иммунными клетками посредством ингибирования переносчиков аминокислот. Авторы изобретения далее протестировали полученное изменение соотношения Th1-клеток. Мышам 5XFAD в возрасте 6 месяцев вводили 50 мг/кг JPH 203 или контроль в виде носителя посредством внутрибрюшинной инъекции каждые сутки. Через один месяц после введения мышей умерщвляли и долю провоспалительных Th1-клеток в головном мозге мышей в контрольной группе и группе введения JPH 203 анализировали посредством проточной цитометрии. Это было репрезентативным, отражая нейровоспаление в головном мозге. Результаты представлены на фиг.13. По сравнению с группой контроля в виде носителя, введение JPH203 в течение одного месяца значительно снижало долю провоспалительных Th1-клеток в головном мозге мыши, демонстрируя, что посредством ингибирования переносчика аминокислот поглощение аминокислот иммунными клетками ингибируется, тем самым предотвращая способствование аминокислотами дифференцировке иммунных клеток и снижая нейровоспаление в головном мозге.Amino acids can be taken up by immune cells through specialized transporters. The inventors further examined the expression levels of SLC7A5, the transporter of phenylalanine and isoleucine, in naive CD4 + T cells and found that SLC7A5 was expressed in CD4 + T cells. Incubation of CD4 + T cells with 13 C-labeled phenylalanine demonstrated uptake of phenylalanine by CD4 + T cells, which could be blocked by the pharmacological inhibitor of SLC7A5, JPH 203 (Fig. 11k), indicating that it is able to inhibit amino acid uptake by immune cells through inhibition carriers of amino acids. The inventors further tested the resulting change in the ratio of Th1 cells. 5XFAD mice aged 6 months were injected with 50 mg/kg JPH 203 or vehicle control via intraperitoneal injection every day. One month after administration, mice were sacrificed, and the proportion of pro-inflammatory Th1 cells in the brain of mice in the control group and the JPH 203 administration group was analyzed by flow cytometry. This was representative, reflecting neuroinflammation in the brain. The results are presented in Fig.13. Compared with the vehicle control group, administration of JPH203 for one month significantly reduced the proportion of pro-inflammatory Th1 cells in the mouse brain, demonstrating that through inhibition of the amino acid transporter, amino acid uptake by immune cells is inhibited, thereby preventing amino acids from promoting immune cell differentiation and reducing neuroinflammation in the brain.
Подтверждение аномальных уровней фенилаланина и изолейцина у людей с ADConfirmation of abnormal levels of phenylalanine and isoleucine in people with AD
Наконец, автор изобретения подтверждает это у человека, исследуя, могут ли указанные выше данные быть воспроизведены у пациентов с MCI вследствие AD (см. способ, использованный в этом исследовании для определения MCI, использованного в этом исследовании). Действительно, концентрации фенилаланина и изолейцина, а также количества Th1-клеток в крови индивидуумов с MCI вследствие AD (n=9) были значимо более высокими, чем у совпадающих по возрасту здоровых индивидуумов (n=18) (фиг.5h, i). Повышенные уровни как фенилаланина, так и изолейцина в крови также были подтверждены в другой небольшой группе с MCI вследствие AD (фиг.5j), таким образом обеспечивая планирование стратегий диагностики и лечения у человека на основе этого.Finally, the inventor confirms this in humans by investigating whether the above data can be replicated in patients with MCI due to AD (see the method used in this study for the definition of MCI used in this study). Indeed, the concentrations of phenylalanine and isoleucine, as well as the number of Th1 cells in the blood of individuals with MCI due to AD (n=9) were significantly higher than in age-matched healthy individuals (n=18) (Fig.5h, i). Elevated blood levels of both phenylalanine and isoleucine were also confirmed in another small group with MCI due to AD (FIG. 5j), thus allowing planning strategies for human diagnosis and treatment based on this.
В общем, авторы изобретения обнаружили, что несколько метаболитов кишечных микробов вовлечено в последующий переход иммунных клеток в состояние преобладания Th1. Авторы изобретения, в частности, исследовали аминокислоты в метаболитах, особенно фенилаланин и изолейцин, и подтвердили причинно-следственную взаимосвязь между изменениями состава кишечной микробиоты, аномальным продуцированием фенилаланина и изолейцина, и чрезмерной дифференцировкой в Th1 наивных T-клеток. Посредством введения фекальных бактерий WT и OM1, для которых выше подтверждено, что они восстанавливают аномальную микробиоту мышей Tg в сторону нормальной кишечной микробиоты WT, аномально высокие уровни фенилаланина и изолейцина снижались и восстанавливались до нормального уровня. Более того, дифференцировка Th0 клеток в Th1-клетки ингибировалась, обращая вспять болезненное состояние с преобладанием Th1, подтверждая, что метаболиты кишечных микробов являются мостиком между аномальным составом микробиоты кишечника и аномальным состоянием иммунных клеток, и они являются частью взаимосвязей в оси головной мозг-кишечник при AD. Авторы изобретения также протестировали другие способы препятствования метаболитам, такие как снижение уровня метаболитов или препятствование поглощению метаболитов иммунными клетками, для вмешательства в последующее аномальное состояние иммунных клеток посредством метаболитов кишечных микробов, и, таким образом, в когнитивное состояние.In general, the inventors have found that several gut microbial metabolites are involved in the subsequent transition of immune cells to a Th1-dominated state. The inventors specifically investigated amino acids in metabolites, especially phenylalanine and isoleucine, and confirmed a causal relationship between changes in gut microbiota composition, abnormal production of phenylalanine and isoleucine, and overdifferentiation into Th1 naïve T cells. Through the administration of WT and OM1 faecal bacteria, which were confirmed above to restore the abnormal microbiota of Tg mice towards normal WT intestinal microbiota, abnormally high levels of phenylalanine and isoleucine were reduced and restored to normal levels. Moreover, differentiation of Th0 cells into Th1 cells was inhibited, reversing the Th1-dominated disease state, suggesting that gut microbial metabolites are a bridge between abnormal gut microbiota composition and abnormal immune cell status, and they are part of the brain-gut axis interconnections. with AD. The inventors have also tested other ways of interfering with metabolites, such as reducing the level of metabolites or preventing the uptake of metabolites by immune cells, to interfere with the subsequent abnormal state of immune cells via gut microbial metabolites, and thus the cognitive state.
Хотя принцип настоящего изобретения описан выше применительно к предпочтительным вариантам осуществления, должно быть хорошо понятно, что описание приводится только в качестве примера, и не для ограничения объема настоящего изобретения.Although the principle of the present invention has been described above in relation to the preferred embodiments, it should be well understood that the description is given by way of example only and not by way of limitation on the scope of the present invention.
Таблица 1. Перечень измененной флоры у пациентов с AD или мышейTable 1 List of altered flora in AD patients or mice
Таблица 2. Перечень флоры со значительными отличиями относительного содержания кишечных бактерий между пациентами с AD и здоровыми контролями (HC)Table 2. List of flora with significant differences in the relative content of intestinal bacteria between patients with AD and healthy controls (HC)
Таблица 3. В приведенном ниже перечне приводится наименование аминокислот, выявленных в крови мышей WT (2-9 месяцев) и Tg (2-9 месяцев). Связана с фиг.5b.Table 3. The list below gives the name of the amino acids identified in the blood of WT (2-9 months) and Tg (2-9 months) mice. Associated with Fig.5b.
Таблица 4. ROC-анализ всех аминокислотных маркеров в крови мышей WT и мышей Tg по порядку частоты выбораTable 4. ROC analysis of all amino acid markers in the blood of WT mice and Tg mice in order of frequency of selection
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910720450.0 | 2019-08-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2791665C1 true RU2791665C1 (en) | 2023-03-13 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005089776A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Ocean University Of China | Algin oligosaccharides and the derivatives thereof as well as the manufacture and the use of the same |
WO2019130637A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | ジェイファーマ株式会社 | Cancer therapeutic |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005089776A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Ocean University Of China | Algin oligosaccharides and the derivatives thereof as well as the manufacture and the use of the same |
WO2019130637A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | ジェイファーマ株式会社 | Cancer therapeutic |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YUPING XING ET AL. Simultaneous determination of 18 D-amino acids in rat plasma by an ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method: application to explore the potential relationship between Alzheimer's disease and D-amino acid level alterations. Anal. Bioanal. Chem. 2016 Jan; 408(1):141-50. doi: 10.1007/s00216-015-9086-3. Epub 2015 Oct 24. G.CORSO ET AL. Serum Amino Acid Profiles in Normal Subjects and in Patients with or at Risk of Alzheimer Dementia. Dement Geriatr Cogn Dis Extra. 2017 May 4; 7(1):143-159. doi: 10.1159/000466688. WEI CAO ET AL. Peripheral immune system in aging and Alzheimer’s disease. Molecular Neurodegeneration. 2018 Oct 3; 13(1):51.doi: 10.1186/s13024-018-0284-2. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Sodium oligomannate therapeutically remodels gut microbiota and suppresses gut bacterial amino acids-shaped neuroinflammation to inhibit Alzheimer’s disease progression | |
US20220280578A1 (en) | Method for treating alzheimer's disease by regulating intestinal microorganisms | |
Gacias et al. | Microbiota-driven transcriptional changes in prefrontal cortex override genetic differences in social behavior | |
JP2021501797A (en) | Treatment of subtypes of ASD | |
US20220280541A1 (en) | Method for identifying carbohydrate drug-sensitive patient in patients having alzheimer's disease | |
US20220273598A1 (en) | Method for treating alzheimer's disease by inhibiting uptake of amino acids by t cells | |
Wu et al. | Antibiotic-induced dysbiosis of gut microbiota impairs corneal development in postnatal mice by affecting CCR2 negative macrophage distribution | |
US20220280589A1 (en) | Method for treating alzheimer's disease by regulating amino acid level | |
RU2791665C1 (en) | Method for treatment of alzheimer's disease by t-cell inhibition of amino acid uptake | |
RU2801150C1 (en) | Method of treatment of alzheimer's disease through regulation of amino acid level | |
RU2810079C2 (en) | Method of treating alzheimer's disease through regulation of intestinal microorganisms | |
RU2806017C2 (en) | Method of identifying patient sensitive to medicinal product based on mannuronic acid oligosaccharides among patients with alzheimer's disease | |
CN108113999A (en) | The metabolic disease prevention included using Th17 cells as active ingredient or treatment cellular therapeutic agent composition | |
CA3103161A1 (en) | Compositions comprising bacterial strains |