RU2809386C1 - Способ диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени - Google Patents
Способ диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809386C1 RU2809386C1 RU2022135395A RU2022135395A RU2809386C1 RU 2809386 C1 RU2809386 C1 RU 2809386C1 RU 2022135395 A RU2022135395 A RU 2022135395A RU 2022135395 A RU2022135395 A RU 2022135395A RU 2809386 C1 RU2809386 C1 RU 2809386C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- name
- value
- Prior art date
Links
- 206010042938 Systemic candida Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 208000036732 invasive candidiasis Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract description 37
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 89
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 2
- 241000168411 Corynebacterium auris Species 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 31
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 23
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 21
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 21
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 21
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 description 17
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 16
- 241000235048 Meyerozyma guilliermondii Species 0.000 description 16
- 244000197813 Camelina sativa Species 0.000 description 15
- 241000645784 [Candida] auris Species 0.000 description 14
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 13
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 5
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 5
- 244000000190 yeast pathogen Species 0.000 description 5
- 241001508813 Clavispora lusitaniae Species 0.000 description 4
- 208000037026 Invasive Fungal Infections Diseases 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 4
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 3
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 208000017773 candidemia Diseases 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000144583 Candida dubliniensis Species 0.000 description 2
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241000235035 Debaryomyces Species 0.000 description 2
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 206010052366 systemic mycosis Diseases 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 240000006409 Acacia auriculiformis Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000985933 Arthroderma gertleri Species 0.000 description 1
- 241001260017 Arthroderma insingulare Species 0.000 description 1
- 241000033579 Arthroderma phaseoliforme Species 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 241000203233 Aspergillus versicolor Species 0.000 description 1
- 241000204852 Aureobasidium melanogenum Species 0.000 description 1
- 240000008213 Brosimum alicastrum Species 0.000 description 1
- 241000033335 Cladophialophora bantiana Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000433975 Corallomycetella repens Species 0.000 description 1
- 241001527609 Cryptococcus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001262649 Emmonsia crescens Species 0.000 description 1
- 241000045671 Falciformispora senegalensis Species 0.000 description 1
- 241001365745 Fonsecaea monophora Species 0.000 description 1
- 241000159512 Geotrichum Species 0.000 description 1
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001047783 Homo sapiens Histone PARylation factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- 241000989306 Lophophyton gallinae Species 0.000 description 1
- 241000555688 Malassezia furfur Species 0.000 description 1
- 241000818707 Nannizzia incurvata Species 0.000 description 1
- 241000921804 Nannizzia persicolor Species 0.000 description 1
- 206010050346 Oropharyngeal candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000909534 Penicillium chermesinum Species 0.000 description 1
- 241001009201 Phialophora macrospora Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 208000005384 Pneumocystis Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010073755 Pneumocystis jirovecii pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 239000006159 Sabouraud's agar Substances 0.000 description 1
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000190542 Sarocladium kiliense Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000893962 Trichophyton equinum Species 0.000 description 1
- 241000223229 Trichophyton rubrum Species 0.000 description 1
- 241000893982 Trichophyton simii Species 0.000 description 1
- 241000223230 Trichosporon Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010061418 Zygomycosis Diseases 0.000 description 1
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 208000037815 bloodstream infection Diseases 0.000 description 1
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 1
- 229940055022 candida parapsilosis Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000007524 mucormycosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000005828 ramon Nutrition 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики. Предложен способ диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Способ включает две мультиплексные реакции на базе уникальных наборов праймеров и зондов. Изобретение обеспечивает точную диагностику инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей, обладает высокой аналитической чувствительностью и 100% специфичностью на панели тестируемых образцов. 5 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики и может быть использовано в медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической лабораторной диагностике для диагностики инвазивного кандидоза (ИК), вызванного актуальными возбудителями - Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii и C. auris, их видовой идентификации, эпидемиологического расследования внутрибольничных вспышек ИК, решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств дрожжевых патогенов. В дальнейшем изобретение предлагается к внедрению в лечебно-диагностическую практику клинических микробиологических лабораторий при обследовании пациентов отделений интенсивной терапии, в том числе COVID-центров, а также отделений онкологии, гематологии и трансплантологии и др.
За последние два десятилетия инфекционные заболевания, обусловленные микроскопическими грибами, стали важной проблемой здравоохранения. Миллионы людей (более 300 млн.) страдают тяжелыми острыми или хроническими грибковыми инфекциями [1-5]. Внедрение в практику новых медицинских технологий (трансплантации органов и тканей, высокодозной цитостатической и иммуносупресивной терапии и пр.) наряду с пандемией ВИЧ/СПИД и COVID-19 привело к увеличению частоты микотических поражений, при этом инвазивные микозы характеризуются тяжестью клинических проявлений и очень высокой летальностью. По данным Всемирного фонда борьбы с грибковыми инфекциями (GAFFI), инвазивные грибковые инфекции являются причиной более 1,5 миллионов летальных исходов в год [6-8], что сопоставимо с летальностью от туберкулеза и в четыре раза превышает летальность от малярии. Проблему усугубляет новый фактор развития инвазивных микозов - COVID-19. Установлено, что у больных тяжелой формой COVID-19 на фоне выраженного нарушения местного и системного иммунитета, обусловленного как самой вирусной инфекцией, так и применением глюкокортикостероидов и иммуносупрессоров, могут также возникать тяжелые грибковые инфекции (инвазивный кандидоз, аспергиллез, мукоромикоз).
Наиболее частыми возбудителями грибковых инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются грибы рода Candida. Инвазивный кандидоз (ИК) - самый распространенный внутрибольничный микоз. Ежегодно в мире регистрируется более 400000 случаев ИК. Распространенность ИК составляет от 2,4 - 29 / 100000 населения в год. По данным многоцентровых исследований, частота развития ИК в стационарах различных стран составляет от 0,33 до 24 случаев на 1000 госпитализированных. В РФ внутрибольничный ИК в многопрофильном стационаре встречается с частотой 0,3 на 1000 госпитализированных больных, в отделениях реанимации и интенсивной терапии - 2,6 на 1000 [9-11].
Методы идентификации на основе культуральных технологий до недавних пор были золотым стандартом диагностики грибковой инфекции, но, к сожалению, требуют не только много времени и трудозатрат, но и допускают ошибочную идентификацию. Проблемы в диагностике инфекций кровотока в ОРИТ и ХОРИТ приводят к необоснованному применению антибиотиков (вместо антимикотиков) у больных ИК, что способствует не только высокой летальности при инвазивных микозах, но и нарастанию бремени антибактериальной резистентности [12].
В настоящее время молекулярные технологии, такие как ИФА и ПЦР в реальном времени (с коротким временем проведения анализа), представляют альтернативные методы культуральной диагностики микотической инфекции. В таблице 1 приведена сравнительная характеристика некультуральных диагностических тестов, используемых для постановки диагноза «кандидемия» и других типов инвазивных кандидозов [13].
| Таблица 1. Использование некультуральных тестов для диагностики инвазивного кандидоза [модифицировано по Clancy C.J., Nguyen M.H., 2018] | ||||
| Подход | Используемая тест-система | Изучаемые группы пациентов | Чувствитель-ность (%) |
Специфич-ность (%) |
| Определение маннана-антиманнана | PLATELIA™ Candida Ab/Ag PLUS, Bio-Rad, США | с интраабдоминальным кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК | 40 | 67 |
| Непрямой иммунофлуорес-центный метод определения антител к маннопротеину | Candida sp. IFA Ig G; Vircell Laboratories, Испания | с интраабдоминальным или урологическим кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК и здоровые лица | 73 | 54 |
| Определение 1,3-β-D-глюкана | Fungitell STAT® Assay | с интраабдоминальным кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК | 56 | 73 |
| с интраабдоминальным кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК | 65 | 78 | ||
| с интраабдоминальным или урологическим кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК и здоровые лица | 64 | 83 | ||
| ПЦР в реальном времени | Candida real-time PCR panel1 | с интраабдоминальным кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК | 88 | 70 |
| Multiplex Candida real-time PCR2 | с интраабдоминальным или урологическим кандидозом vs ОРИТ с факторами риска ИК и здоровые лица | 91 | 97 | |
| 1 Candida real-time PCR panel Компании Viracor Eurofins (США) определяет виды C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C.tropicalis, и C. krusei.. 2 Multiplex Candida real-time PCR Испанского Национального Микробиологического центра Госпиталя Рамона и Кахала (Мадрид, Испания) определяет виды C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C.tropicalis, C. krusei. и C. guilliermondii. |
||||
Несмотря на самую высокую чувствительность и специфичность ПЦР-тестов среди некультуральных методов диагностики, повышение их чувствительности и специфичности необходимо. В настоящее время не существует ни одного мультиплексного диагностикума на основе ПЦР, одобренного FDA (управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США), но коммерческие «домашние» тест-системы и структуры праймеров, применяемые для научных исследований, широко доступны.
Ниже приведены аналоги, представляющие собой методы диагностики микозов, вызванных дрожжевыми патогенами, на основе ПЦР.
Известен патент РФ № RU 2510856 (опубл. 10.04.2014) «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans методом полимеразной цепной реакции».
Известен патент РФ № RU 2663454 (опубл. 06.08.2018) «Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища».
Известен патент РФ № RU 2676099 (опубл. 26.12.2018) «Способ идентификации дрожжей рода Pichia на основе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда».
Известен способ диагностики с использованием набора "АмплиСенс® Candida albicans-FL" с детекцией в режиме "реального времени" ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия). Позволяет определять вид C. albicans.
Известен способ диагностики с использованием ПЦР-панели в реальном времени Candida Компании Viracor Eurofins (США). Позволяет определять виды C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C.tropicalis, и C. krusei. Анализ не предлагается на коммерческой основе.
Известен способ диагностики с использованием мультиплексной ПЦР в реальном времени Candida Испанского Национального Микробиологического центра Госпиталя Рамона и Кахала (Мадрид, Испания). Позволяет определять виды C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C.tropicalis, C. krusei. и C. guilliermondii.
Известен способ диагностики с использованием ПЦР-теста «YEAST PANEL multiplex PCR assays» Института грибного биоразнообразия имени Вестердейк (Нидерланды). Позволяет определять 21 вид клинически важных дрожжей Candida, Trichosporon, Rhodotorula, Cryptococcus, Geotrichum в ходе трехмультиплексных реакций с электрофоретической детекцией [14].
Известен способ диагностики с использованием ПЦР тест-системы в реальном времени для идентификации клинических изолятов Candida spp. на основе анализа кривых плавления с высоким разрешением Университет медицинских наук Кермана (Иран). Позволяет определять 8 видов (C. glabrata, C. parapsilosis, C.tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii , C. kefyr, C. albicans,C. lusitaniae) [15].
Известен способ диагностики с использованием ПЦР тест-системы в реальном времени для идентификации клинических изолятов Candida spp. на основе анализа кривых плавления с высоким разрешением Центр оценки и биологических исследований (FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США), США). Позволяет определять 8 видов (C. glabrata, C. parapsilosis, C.tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, C. dubliniensis, C. albicans,C. lusitaniae) [16].
Однако большинство опубликованных наборов праймеров для ПЦР, как и зарегистрированных тест-систем либо не являются видоспецифичными для грибов рода Candida, либо разработаны исключительно для диагностики инфекции, вызываемой Candida albicans [17-20]. Количество мультиплексных диагностикумов, присутствующих на современном рынке, ограничено, интерпретация получаемых результатов затруднена, осложняется неоднородностью анализов и дизайнов исследования, зачастую достаточна сложна (требует большого количества проставляемых контролей в случае анализа кривых плавления с использованием красителя SYBR Green для дифференциации видов) и исполнение тестов трудозатратно (из-за большого количества отдельных реакций проставляемых в рамках одного теста возможно допущение ошибок) и требует высокой квалификации персонала [14-16, 21].
В настоящее время нет ни одного ПЦР-теста, который был бы валидирован для диагностики инвазивного кандидоза в многоцентровых исследованиях, и нет убедительных доказательств преимущества какого-либо коммерческого теста, несмотря на несомненный потенциал ПЦР-диагностики микозов даже по сравнению с тестами дающими 100% идентификацию (MALDI-TOFF масс-спектрометрия и таргетное секвенирование рДНК) за счет сокращения времени исполнения и стоимости проводимого исследования. Кроме того, поскольку этиология микозов может иметь географические особенности и отличаться между медицинскими центрами, тест-системы, используемые в клинических лабораториях, должны учитывать локальные эпидемиологические данные.
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ диагностики инвазивного кандидоза с использованием мультиплексного диагностикума на основе ПЦР - набора реагентов для выявления и типирования возбудителей грибковых инфекций рода Candida, Malassezia, Saccharomyces и Debaryomyces методом ПЦР в реальном времени (МИКОЗОСКРИН) ООО "ДНК-Технология" [23]. Заявленный способ диагностики имеет регистрационное удостоверение и предназначен для выявления и типирования возбудителей грибковых инфекций рода Candida, Malassezia, Saccharomyces и Debaryomyces: Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii), Candida albicans, Pichia kudriavzevii (C. krusei), Saccharomyces cerevisiae, Candida auris, Candida tropicalis, Clavispora lusitaniae (C. lusitaniae), Debaryomyces hansenii (C. famata), Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Malassezia spp., Kluyveromy cesmarxianus (C. kefyr), Malassezia furfur.
К недостаткам ближайшего аналога можно отнести унификацию тестирования - предназначение для выявления и типирования широкого спектра дрожжевых грибов - возбудителей грибковых инфекций как поверхностных микозов (вульвовагинальный кандидоз, орофарингеальный, а также дерматозы, ассоциированные с дрожжевыми грибами), так и инвазивной инфекции - затрудняет процесс интерпретации результатов; отсутствие пан-грибковых или родоспецифичных диагностических конструкций в составе данного способа диагностики - возможность получения ложноотрицательных результатов (в случаях, если микоз вызван редким возбудителем); большое количество независимых реакционных смесей (комплекс из восьми пробирок) - повышает риск инструментальных ошибок, усложняет процесс диагностики; совместимость набора только с детектирующими амплификаторами фирмы ДНК-технология - ограничение возможностей пользователя.
Технической проблемой является необходимость разработки точного и простого в использовании способа диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, лишенной вышеприведенных недостатков.
Технический результат состоит в обеспечение возможности точной диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Технический результат достигается тем, что в способе диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени осуществляют две мультиплексные реакции, причем используют ПЦР-смесь I реакции со следующим составом: в объеме 50 мкл содержится 50 нг ДНК, 2,5мМ MgCl2, 75mM Tris-HCl с pH 8,8, 20mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,25 mM каждого dNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, а также пять пар праймеров и пять зондов по 40 fM каждого за исключением диагностической конструкции для C. auris, содержащейся в объеме 20 fM), со следующими нуклеотидными последовательностями:
C. auris_F - CAGACGTGAATCATCGAATCT (SEQ:NO1)
C. auris_R - TTTCGTGCAAGCTGTAATTT (SEQ:NO2)
C. auris_Proba - FAM-AATCTTCGCGGTGGCGTTGCATTCA-RTQ1 (SEQ:NO3)
C. guilliermondii_For - AGTGCTGTCGACCTCTCAAT (SEQ:NO4)
C. guilliermondii_Rev - CCGGGCCAACAATACCAGA (SEQ:NO5)
C. guilliermondii_Proba - R6G-TCCAACTCGTTGAATGGTGTGGC-BHQ1 (SEQ:NO6)
C. glabrata_For - GCGGCGGGGGTTAATACTG (SEQ:NO7)
C. glabrata_Rev - TTAAAGACGTCTGTCTGCCCA (SEQ:NO8)
C. glabrata_Proba - ROX-ATAAGTGAGTGTTTTGTGCGTGC-RTQ2 (SEQ:NO9)
C. tropicalis_For - CTTAGGTTTATCCAAAAACGCTT (SEQ:NO10)
C. tropicalis_Rev - CGGGTAGTCCTACCTGATTT (SEQ:NO11)
C. tropicalis_Proba - Cy5-TTGCTAGTGGCCACCACAATTTAT-BHQ3 (SEQ:NO12)
Glob_For - GTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCT (SEQ:NO13)
Glob_Rev - CCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCT (SEQ:NO14)
Glob_Proba - Cy5.5-ACCTCAACCAGACACCATGGTGCACCT-BHQ3 (SEQ:NO15),
кроме того, используют ПЦР-смесь II реакции со следующим составом: в объеме 50 мкл содержится 50 нг ДНК, 2,5мМ MgCl2, 75mM Tris-HCl c pH 8,8, 20mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,25 mM каждого dNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, четыре пары праймеров и четыре зонда по 40 fM каждого со следующими нуклеотидными последовательностями:
C. parapsilosis_For - GGTTTGGTGTTGAGCGATACG (SEQ:NO16)
C. parapsilosis_Rev - TTTGGAGTTTGTACCAATGAGTG (SEQ:NO17)
C. parapsilosis_Proba - FAM-GTTTGCTTGAAAGAAAGGCGGAGT-RTQ1 (SEQ:NO18)
C. albicans_For - GGGTTTGCTTGAAAGACGGT (SEQ:NO19)
C. albicans_Rev - TTACCGCCGCAAGCAATGTT (SEQ:NO20)
C. albicans_Proba - R6G-GATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCT-BHQ1 (SEQ:NO21)
C. krusei_For - CTTGCGCGTGCGCAGAGTT (SEQ:NO22)
C. krusei_Rev - TAGTTCGCTCGGCCAGCTTC (SEQ:NO23)
C. krusei_Proba - ROX- CGGACGACGTGTAAAGAGCGTC-RTQ2 (SEQ:NO24)
Pan_Fun_For - CAACGGATCTCTTGGTTCT (SEQ:NO25)
Pan_Fun_Rev - GGCGCAATGTGCGTTCAAAG (SEQ:NO26)
Pan_Fun_Proba - Cy5-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA-BHQ3 (SEQ:NO27).
Спектр идентифицируемых микроскопических грибов рода Candida: C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. auris, наличие грибковой инфекции в общем (применение универсальных пангрибковых праймеров) - спектр возбудителей ИК, определяемых предлагаемым способом диагностики, является оптимальным, что упрощает и ускоряет проведения исследования, при этом он включает все наиболее распространенные этиологические агенты ИК, встречающиеся на территории РФ, и микромицеты любой родовой принадлежности. В случае, если заболевание будет вызвано редким видом дрожжевого патогена или грибом другой родовой принадлежности, не включенным в диагностический профиль, то диагноз инвазивный микоз будет подтвержден с помощью универсальных пангрибковых праймеров.
Использование низкоспецифичных универсальных пангрибковых праймеров и зондов позволяет не только диагностировать инвазивный микоз, вызванный редким возбудителем, но и использовать данную диагностическую конструкцию в качестве контроля выделения ДНК и прохождения реакции для идентификации основных возбудителей ИК при работе с культурами дрожжевых патогенов, полученными из стерильных в норме субстратов.
Точная диагностика инвазивного кандидоза обеспечивается за счет флуорогенных зондов Taq-Man при проведении ПЦР в реальном времени и мультиплицирования фрагментов-мишеней изучаемых грибов рода Candida в двух пробирках с использованием четырех и пяти пар олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов с не пересекаемыми спектральными зонами: FAM, VIC, ROX, Су5 и Су5.5), соответственно. Кроме видоспецифичных конструкций (прямой, обратный праймер и Taq-Man зонд), необходимых для видовой идентификации, в реакции были использованы олигонуклетидные последовательности специфичные для гена β-глобина человека Glob - в качестве эндогенного контроля реакции при работе с биосубстратами, и пан-грибковая конструкция, которая работала и как эндогенный контроль реакции при работе с культурами дрожжевых грибов, и как маркер ИК, вызванного другими видами дрожжевых грибов, при анализе клинического материала.
При разработке заявляемого способа диагностики ИК первоначально был проведен биоинформационный анализ вариабельных участков генома актуальных возбудителей инвазивного кандидоза - C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii и C. auris, обладающих уникальной последовательностью, позволяющей проводить межвидовую дискриминацию. Среди отобранных нами последовательностей-мишеней по мировым литературным данным наиболее часто используемой последовательностью является ядерная рибосомная ДНК (рДНК), поскольку (1) ITS1 и ITS2 регионы рДНК обладают высокими межвидовыми вариациями; (2) она присутствует в геноме грибов в виде тандемно повторяющихся копий, что обеспечивает большое количество изучаемой матрицы. На основании этих данных в качестве «мишени» определения вида возбудителей инвазивного кандидоза был использован ITS2 регион рибосомальных генов. Целевые локусы геномов дрожжевых грибов для дизайна праймеров были взяты из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/), и затем сопоставлены с полученными в ходе работы нуклеотидными последовательностями. Праймеры первоначально были подобраны с помощью программного пакета Vector NTI 10, позволяющего автоматически рассчитывать температуру плавления (Tm), GC-состав (GC%) и степень комплементарности по 3' концу. Вторым этапом был отбор более оптимальных наборов олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на основании следующих критериев:
1. Видоспецифичные праймеры не должны давать перекрестную реакцию с другими видами грибов,
2. Совместимость размеров ампликонов одного целевого вида с остальными целевыми видами для проведения мультиплексной ПЦР,
3. Совместимость праймеров по температуре плавления в рамках одной мультиплексной реакции;
4. Расположение праймеров в наиболее стабильном сегменте целевых локусов,
5. Высокая комплементарность по 3' региону (для предотвращения перекрестных реакций с нецелевыми областями геномов).
Затем эмперическим путем были определены для каждого анализируемого вида дрожжевых грибов комбинации из олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, обладающие наибольшей аналитической чувствительностью и 100% специфичностью на панели тестируемых образцов.
С использованием положительных контролей для каждого вида изучаемых дрожжевых патогенов эмперическим путем подобрана оптимальная температура отжига диагностических конструкций, которая отличалась от теоретической, рассчитанной с использованием компьютерных программ. Также эмпирическим путем установлена аналитическая чувствительность заявляемого способа диагностики ИК и идентификации его ключевых возбудителей. Используемые диагностические конструкции обладают 100%-ной специфичностью на панели отрицательных образцов, не имеют гомологии и не взаимодействуют с геномной ДНК человека.
Таким образом, из приведенных доводов заявителя следует, что заявленный способ диагностики ИК и идентификации его основных возбудителей методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно-меченых зондов соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ диагностики ИК и идентификации его ключевых возбудителей осуществляют в три лабораторных этапа:
1. Выделение ДНК из культур дрожжевых патогенов, возбудителей ИК, или биологического материала стерильных в норме субстратов;
2. Проведение мультиплексной ПЦР;
3. Анализ и интерпретация результатов.
Материалы и реактивы. В работе были использованы следующие материалы и реактивы: 25Мм MgCl2 (НПК «Синтол», Россия), 2,5Мм дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) (НПК «Синтол», Россия), Taq ДНК-полимераза (New England BioLabs, США).
Штаммы грибов, возбудителей инвазивного кандидоза. В качестве положительных контролей были использованы клинические изоляты грибов рода Candida (C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii и C. auris) из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ФГБУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова, выделенные из стерильных в норме биосубстратов пациентов с подозрением на ИК, с экспертно подтвержденной методами MALDI-TOF-MS (Autoflex, Bruker Daltonics) и таргетного ДНК-секвенирования видовой принадлежностью. В работе использовали агаризованную питательную среду Сабуро с хлорамфениколом. Культивирование штаммов грибов рода Candida проводили при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.
Выделение ДНК возбудителей инвазивного кандидоза. ДНК, используемую в качестве матрицы для постановки реакции, выделяли из биологического материала стерильных в норме субстратов и культур грибов рода Candida с помощью солевого метода [22] и коммерческого набора Monarch® Genomic DNA purification Kit (New England BioLabs, США), соответственно. Концентрацию измеряли с помощью флуориметра Qubit 4.0 и коммерческого набора для количественной оценки ДНК Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Рабочая концентрация образцов ДНК, выделенных из культур грибов рода Candida, достигалась путем разведения и составляла 10 нг ДНК/мкл. Количество копий генома рассчитывали с помощью формулы:
Количество копий генома = (количество ДНК [нг]*6.022×1023) / (длина генома [п.о.]*1×109*650),
Расчёты производились исходя, что размер генома для C. albicans составляет 14.69 Mb, C. krusei - 10.92 Mb, C. glabrata - 12.51 Mb, C. tropicalis - 14.61 Mb, C. parapsilosis - 13.03 Mb, C. guilliermondii - 10.64 Mb и C. auris - 12.37 Mb.
Проведение мультиплексной ПЦР. Способ осуществляют с использованием амплификаторов Rotor Gene 6000 (“Corbett Research”, Австралия), CFX96 (“BioRad”, США) и ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия) в ходе двух мультиплексных реакций.
Состав ПЦР-смеси I реакции: в объеме 50 мкл содержится 50 нг ДНК, 2,5мМ MgCl2, 75mM Tris-HCl (pH 8,8), 20mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,25 mM каждого dNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (New England BioLabs, США), пять пар праймеров и зондов (НПК «Синтол», Россия) по 40 fM каждого (исключение - диагностическая конструкция для C.auris - 20 fM) со следующими нуклеотидными последовательностями:
| C. auris_F | CAGACGTGAATCATCGAATCT |
| C. auris_R | TTTCGTGCAAGCTGTAATTT |
| C. auris_Proba | FAM-AATCTTCGCGGTGGCGTTGCATTCA-RTQ1 |
| C. guilliermondii_For | agtgctgtcgacctctcaat |
| C. guilliermondii_Rev | ccgggccaacaataccaga |
| C. guilliermondii_Proba | R6G-tccaactcgttgaatggtgtggc-BHQ1- |
| C. glabrata_For | gcggcgggggttaatactg |
| C. glabrata_Rev | ttaaagacgtctgtctgccca |
| C. glabrata_Proba | ROX-ataagtgagtgttttgtgcgtgc-RTQ2 |
| C. tropicalis_For | CTTAGGTTTATCCAAAAACGCTT |
| C. tropicalis_Rev | cgggtagtcctacctgattt |
| C. tropicalis_Proba | Cy5-TTGCTAGTGGCCACCACAATTTAT-BHQ3 |
| Glob_For | gtcagggcagagccatctaTTgct |
| Glob_Rev | ccacatgcccagtttctattggtct |
| Glob_Proba | Cy5.5-acctcaaccagacaccatggtgcacct-BHQ3 |
Состав ПЦР-смеси II реакции: в объеме 50 мкл содержится 50 нг ДНК, 2,5мМ MgCl2, 75mM Tris-HCl (pH 8,8), 20mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,25 mM каждого dNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (New England BioLabs, США), пять пар праймеров и зондов (НПК «Синтол», Россия) по 40 fM каждого со следующими нуклеотидными последовательностями:
| C. parapsilosis_For | ggtttggtgttgagcgatacg |
| C. parapsilosis_Rev | tttggagtttgtaccaatgagtg |
| C. parapsilosis_Proba | FAM-gtttgcttgaaagaaaggcggagt-RTQ1 |
| C. albicans_For | gggtttgcttgaaagacggt |
| C. albicans_Rev | ttaccgccgcaagcaatgtt |
| C. albicans_Proba | R6G-gatcgctttgacaatggcttaggtct-BHQ1 |
| C. krusei_For | CTTGCGCGTGCGCAGAGTT |
| C. krusei_Rev | tagttcgctcggccagcttc |
| C. krusei_Proba | ROX- CGGACGACGTGTAAAGAGCGTC-RTQ2 |
| Pan_Fun_For | caacggatctcttggttct |
| Pan_Fun_Rev | GGCGCAATGTGCGTTCAAAG |
| Pan_Fun_Proba | Cy5-tgaagaacgcagcgaaatgcgata-BHQ3 |
Для двух мультиплексных реакций был подобран единый оптимальный режим амплификации (таблица 2):
| Таблица 2. Программа проведения ПЦР в реальном времени | ||
| Температура (°С) | Время (минуты:секунды) | Количество циклов |
| 95 | 05:00 | 1 |
| 95 | 00:30 | 35 |
| 55 | 00:30 | |
| 72 | 00:30 | |
| 72 | 07:00 | 1 |
| 4 | ∞ | хранение |
Анализ и интерпретация результатов.
Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции (характерной сигмовидной формы) для каждого из 5 используемых каналов флуоресцентной детекции пороговой линии (таблица 3).
Анализ данных для ПЦР-смеси I и II следует проводить индивидуально, выделив область лунок, относящихся к анализируемому комплекту реагентов (ПЦР-смеси).
| Таблица 3. Соответствие наименование ПЦР-смеси и каналов детекции возбудителей ИК | ||||||
| № ПЦР-смеси | Канал детекции флуорофора | FAM | HEX | ROX | Cy5 | Cy5.5 |
| I | ДНК-мишень | ДНК C. auris | ДНК C. guilliermondii |
ДНК C. glabrata | ДНК C. tropicalis |
ДНК человека |
| Область амплификации | ITS-2 | ITS-2 | ITS-2 | ITS-2 | ген Glob | |
| II | ДНК-мишень | ДНК C. parapsilosis | ДНК C. albicans | ДНК C. krusei | ДНК | - |
| Область амплификации | ITS-2 | ITS-2 | ITS-2 | 5.8S | ||
Принцип интерпретации результатов следующий:
- ДНК возбудителей ИК обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по соответствующему каналу определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
- ДНК возбудителей ИК не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по соответствующему каналу не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для флуорофора Cy5.5определено значение порогового цикла Ct
- результат анализа считается невалидным, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла по соответствующему каналу детекции возбудителей ИК (см. табл. 3). И по каналу значение также отсутствует или превышает указанное граничное значение. В этом случае необходимо повторно провести ПЦР-исследование соответствующего клинического образца с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и результатов по гену Glob (контроль экстракции ДНК из биологического материала) и фрагменту 5.8S рибосомальной ДНК грибов (контроль экстракции ДНК из культур микромицетов).
Диагностические конструкции (праймеры и флуорогенные зонды), используемые в заявляемом способе диагностике инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей обладают уникальными последовательностями (исключение составляют олигонуклеотидные последовательности, используемые для идентификации C. auris и гена Glob, заимствованные из литературных источников [24, 25]). Предлагаемые диагностические конструкции никогда не использовались вместе в мультиплексных реакциях. Основной задачей при подборе комплекса праймеров и флуорогенных зондов было проведение нескольких независимых ПЦР в одной пробирке, с целью одновременной идентификации всех распространенных в РФ этиологических агентов ИК. Решение данной задачи позволяет уменьшить в лаборатории затраты труда и времени на проведение анализа и повысить экономическую эффективность метода.
Заявленный способ подтверждается примерами.
Пример 1. Оценка аналитической специфичности способа диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей
Аналитическая специфичность заявляемого способа диагностики была оценена на ДНК микроскопических грибов, депонированных в Российскую коллекцию патогенных грибов (НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина), в концентрации 60 нг ДНК/реакцию (около 5×106 копии/реакция). Было протестировано по 10 штаммов каждого из детектируемых/идентифицируемых данным способом диагностики видов грибов рода Candida: C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii и C. auris и 20 штаммов других видов грибов, потенциальных патогенов человека: Nannizzia persicolor, Arthroderma gertleri, Trichophyton simii, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Lophophyton gallinae, Sarocladium kiliense, Corallomycetella repens, Nannizzia incurvata, Arthroderma phaseoliforme, Arthroderma insingulare, Falciformispora senegalensis, Aureobasidium melanogenum, Cladophialophora bantiana, Phialophora macrospora, Fonsecaea monophora, Aspergillus versicolor, Emmonsia crescens, Aspergillus fumigatus, Penicillium chermesinum.
Анализ данных для ПЦР-смеси I и II показал высокую аналитическую специфичность разрабатываемого способа диагностики: отсутствие перекрестных реакций на ДНК других видов грибов, и специфические кинетические кривые флуоресценции на ДНК детектируемых/идентифицируемых видов грибов рода Candida, в реакции с универсальными пангрибковыми праймерами и зондом положительный сигнал был зарегистрирован для всех анализируемых грибов.
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности способа диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей
Для определения предела обнаружения заявляемого способа диагностики проводили серийные 10-кратные разведения ДНК от 106 до 10 копий генома на реакцию. Было протестировано минимум по 5 штаммов детектируемых/идентифицируемых видов грибов рода Candida в двух повторах, процент тестируемых штаммов грибов рода обнаруженный заявляемым способом диагностики для каждой из анализируемых концентраций представлен в таблице 4. Для грибов C. krusei, C. guilliermondii и C. tropicalis предел обнаружения составил 10 копий генома на реакцию, для 20, 100 и 80% тестируемых штаммов; для 20% штаммов C. auris и C. albicans - 100 копий/реакция; для 60% C. glabrata - 103 копий/реакция и самый низкий порог обнаружения был зарегистрирован для C. parapsilosis - порог для 40% тестируемых штаммов составил 104 копий/реакция.
| Таблица 4. Результаты оценки аналитической чувствительности (порог обнаружения) заявляемого способа диагностики исходя из копий генома на реакцию | ||||||
| Анализируемые виды грибов рода Candida | 10-кратные разведения ДНК (количество копий генома на реакцию) | |||||
| 106 | 105 | 104 | 103 | 102 | 10 | |
| C. albicans | 100% | 100% | 60% | 40% | 20% | н/о |
| C. krusei | 100% | 100% | 100% | 100% | 60% | 20% |
| C. glabrata | 100% | 100% | 80% | 60% | н/о | н/о |
| C. tropicalis | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 80% |
| C. parapsilosis | 100% | 100% | 40% | н/о | н/о | н/о |
| C. guilliermondii | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
| C. auris | 100% | 100% | 100% | 20% | 20% | н/о |
Также было оценено влияние ДНК человека и компонентов крови на эффективность работы заявляемого способа диагностики инвазивного кандидоза. Подготовленные суспензии анализируемых грибов в физрастворе (натрия хлорид 0,9%) эквивалентные стандарту McFarland 0,5 (106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл) добавляли в кровь человека в соотношении 1:10 и готовили последовательные 10-кратные разведения цельной кровью, в качестве контроля для разведений использовали физраствор. Предварительные эксперименты показали, что получаемые растворы имели концентрации от 10 до 105 КОЕ/мл. Точные концентрации КОЕ/мл определяли путем посева 100 мкл образцов крови с добавлением суспензий грибов на агаризованную питательную среду Сабуро с хлорамфениколом, подсчет колоний осуществляли после 48-часовой инкубации при 37°С. ДНК выделяли из 500 мкл соответствующих образцов крови с использованием солевого метода [22] c предварительным лизисом эритроцитов по методу Канкеля (29 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 1% тритон Х100), элюировали в 50 мкл буфера, 10 мкл которого использовали в качестве матрицы для проведения реакции амплификации без дополнительных этапов разведений (расчётная концентрация составляла 104 -1.0 КОЕ на реакцию).
| Таблица 5. Результаты оценки аналитической чувствительности (порог обнаружения) заявляемого способа диагностики исходя из копий генома на реакцию | |||||||
| Анализируемые виды грибов рода Candida | |||||||
| C. albicans | C. krusei | C. glabrata | C. tropicalis | C. parapsilosis | C. guilliermondii | C. auris | |
| Порог чувствительности (кровь) (КОЕ/мл) | 102 | 102 | 104 | 105 | 102 | 103 | 104 |
| Порог чувствительности (физраствор) (КОЕ/мл) | 10 | 10 | 103 | 103 | 102 | 102 | 103 |
Результаты оценки эффективности представляемого способа диагностики инвазивного кандидоза приведены в таблице 5: предел обнаружения патогенов в крови составил 1.0-104 КОЕ/мл анализируемого биосубстрата в зависимости от вида гриба. Для большинства анализируемых видов кровь на порядок снижала порог детекции возбудителей инвазивного кандидоза за счет естественной микробицидной/микростатической активности. Образцы чистой крови, взятые в качестве контроля, не приводили к ложноположительным результатам или полному ингибированию ПЦР анализа. Для инактивации микробицидных свойств крови и повышения чувствительности заявляемого способа диагностики (за счет увеличения концентрации потенциальных возбудителей) при подозрении на кандидемию рекомендуется использовать для анализа подращённые гемокультуры на селективных средах.
Пример 3. Апробация способа диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей на клиническом материале пациентов
Пациент КЛА № 11865/5
29.03.2022 у пациента, находящегося на стационарном лечение в отделение ОРИТ неврологического профиля (по основному диагнозу G70.2 врожденная или приобретенная миостения), была зарегистрирована клиническая картина сепсиса. Для исключения инвазивного кандидоза (кандидеимии) взят клинический материал (венозная кровь, забранная в вакумтейнер с ЭДТА) и апробирован заявляемый способ диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей. Получен технический результат - положительный результат на микромицеты в целом и C. parapsilosis. Результаты апробации способа диагностики совпали с результатами культурального метода: рост дрожжевых грибов из среды накопления гемокультиватора на кровяном агаре и среде Сабуро.
Таким образом, в результате апробации предложенного способа диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей получен обеспечиваемый заявленным образом технический результат, а именно показана возможность одновременной индикации в биологическом материале и идентификации культур актуальных возбудителей инвазивного кандидоза - Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii и C. auris.
Убедительно продемонстрировано, что для проведения диагностики инвазивного кандидоза в рутинной клинической практике в РФ наиболее доступным, быстрым и простым в исполнении является предложенный способ диагностики.
Список литературы
1. de Boer MGJ, Walzer PD, Mori S. Healthcare related transmission of Pneumocystis pneumonia: From key insights toward comprehensive prevention // Transpl Infect Dis. 2018 Oct;20(5):e12942. doi: 10.1111/tid.12942. Epub 2018 Jun 28.
2. Patel G, Greenberger PA. Allergic bronchopulmonary aspergillosis // Allergy Asthma Proc. 2019 Nov 1;40(6):421-424. doi: 10.2500/aap.2019.40.4262.
3. Arastehfar A, Carvalho A, van de Veerdonk FL, Jenks JD, Koehler P, Krause R, Cornely OA, S Perlin D, Lass-Flörl C, Hoenigl M. COVID-19 Associated Pulmonary Aspergillosis (CAPA)-From Immunology to Treatment // J Fungi (Basel). 2020 Jun 24;6(2):91. doi: 10.3390/jof6020091.
4. McCarty T.P., White C.M., Pappas P.G. Candidemia and Invasive Candidiasis // Infect Dis Clin North Am. 2021 Jun;35(2):389-413. doi: 10.1016/j.idc.2021.03.007.
5. Suleyman G, Alangaden GJ. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Infection Control, and Prevention // Infect Dis Clin North Am. 2021 Dec;35(4):1027-1053. doi: 10.1016/j.idc.2021.08.002.
6. Brown G. D. et al. Hidden killers: human fungal infections // Sci Transl Med 4: 165rv13. - 2012.
7. GAFFI (Global Action Fund for Fungal Infections). Improving outcomes for patients with fungal infections across the world // A road map for the next decade. 20158. Esher et al., 2018
9. Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, А.Г. Полищук, Е.В. Шагдилеева, Д.М. Лавникевич, М.В. Руднева, Ю.В. Михайлова, Н.Н. Климко. Определение видов возбудителей инвазивного кандидоза: в поиске быстрых решений // Проблемы медицинской микологии. 2013. Т. 15, №4. С. 87-91.
10. Vasilyeva N. V. et al. Etiology of invasive candidosis agents in Russia: a multicenter epidemiological survey // Frontiers of medicine. - 2018. - Т. 12. - №. 1. - С. 84-91.
11. Климко Н. Н., Козлова О. П. Инвазивный кандидоз у детей // Журнал инфектологии. 2021. 13(2):14-26. https://doi.org/10.22625/2072-6732-2021-13-2-14-26
12. Denning D. W. et al. Delivering on antimicrobial resistance agenda not possible without improving fungal diagnostic capabilities //Emerging infectious diseases. - 2017. - Т. 23. - №. 2. - С. 177.
13. Clancy C.J., Nguyen M.H. Diagnosing invasive candidialis // Journal of Clin Microbiol. 2018. 56 (5): e01909-17.
14. Arastehfar A., Fang W., Pan W., Lackner M., Liao W., Badiee P., Zomorodian K., Badali H., Hagen F., Lass-Florl C., Boekhout T. YEAST PANEL multiplex PCR for identification of clinical important yeast species: stepwise diagnostic strategy, useful for developing countries // Diagnostic Microbiol & Inf Disease. 2019. 93: 112-119.
15. Nejad E.E., Almani P.G.N., Mohammadi M.A., Salari S. Molecular identification of Candida isolates by Real-time PCR-high-resolution melting analysis and investigation of the genetic diversity of Candida species // J Clin Lab Anal. 2020. 34: e23444.
16. Zhang J., Hung G.-C., Nagamine K., Li B., Tsai S., Lo S.-C. Development of Candida-specific real-time PCR assay for the detection and identification of eight medically important Candida species // Microbiology Insights. 2016. 9: 21-28.
17. Kanbe T., Kurimoto K., Hattori H., Iwata T., Kikuchi A. Rapid identification of Candida albicans and its related species Candida stellatoidea and Candida dubliniensis by a single PCR amplification using primers specific for the repetitive sequence (RPS) of Candida albicans // Journal of Dermatolog Sci. 2005. 40: 43-50.
18. Galan A., Veses V., Murgui A., Casanova M., Martinez J.P. Rapid PCR-based test for identifying Candida albicans by using primers derived from the pH-regulated KER1 gene // FEMS Yeast Res. 2006. 6: 1094-1100.
19. Alonso G.C., Pavarina A.C., Sousa T.V., Klein M.I. A quest to find good primers for gene expression analysis of Candida albicans from clinical samples // Journal of Microbiol Methods. 2018. 147: 1-13.
20. Busser F.D., Coelho V.C., Fonseca C. de A., Negro G.M.B.D., Shikanai-Yasuda M.A., Lopes M.H., Magri M.M.C., de Freitas V.L.T. A real time PCR strategy for the detection and quantification of Candida albicans in human blood // Rev Inst Trop Sao Paulo. 2020. 62: e9.
21. Innings A., Ullberg M., Johansson A., Rubin C.J., Noreus N., Isaksson M., Herrmann B. Multiplex real-time PCR targeting the RNasy P RNA gene for detection and identification of Candida species in blood // Journal of Clin Microbiol. 2007. 45(3): 874-880.
22. Sambrook, J., Fritsch, E. R., & Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4nd ed.). 2012. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press
23. https://www.dna-technology.ru/equipmentpr/nabory-reagentov-dlya-pcr-vozbuditeli-gribkovyh-infekciy/mikozoskrin
24. Leach L., Zhu Y., Chaturvedi S. Development and validation of real-time PCR assay for rapid detection of Candida auris from surveillance samples // Journal of Clin Microbiol. 2018. 56(2): e01223-17.
25. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Киселев В.И., Молочков В.А. разработка и апробация количественного метода определения концентрации вета-папилломавирусов в коже // Молекулярная медицина. 2007. № 4. С. 33-40.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"
fileName="/Users/fedorivanov/Downloads/Seq.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.2.0" productionDate="2022-12-30">
<ApplicantFileReference>SZGMU Mycology</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Северо-Западный государственный медицинский университет им.
И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения РФ</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>North-Western State Medical University named
after I.I. Mechnikov</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ диагностики инвазивного
кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом
ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального
времени</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>27</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagacgtgaatcatcgaatct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttcgtgcaagctgtaattt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatcttcgcggtggcgttgcattca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agtgctgtcgacctctcaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccgggccaacaataccaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tccaactcgttgaatggtgtggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcggcgggggttaatactg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttaaagacgtctgtctgccca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ataagtgagtgttttgtgcgtgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttaggtttatccaaaaacgctt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgggtagtcctacctgattt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttgctagtggccaccacaatttat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcagggcagagccatctattgct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccacatgcccagtttctattggtct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acctcaaccagacaccatggtgcacct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtttggtgttgagcgatacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttggagtttgtaccaatgagtg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtttgcttgaaagaaaggcggagt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gggtttgcttgaaagacggt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttaccgccgcaagcaatgtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatcgctttgacaatggcttaggtct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q44">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttgcgcgtgcgcagagtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tagttcgctcggccagcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cggacgacgtgtaaagagcgtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caacggatctcttggttct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcgcaatgtgcgttcaaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaagaacgcagcgaaatgcgata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (4)
- Способ диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, в ходе которого осуществляют две мультиплексные реакции, причем используют ПЦР-смесь I реакции со следующим составом: в объеме 50 мкл содержится 50 нг ДНК, 2,5мМ MgCl2, 75mM Tris-HCl с pH 8,8, 20mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,25 mM каждого dNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, а также пять пар праймеров и пять зондов по 40 fМ каждого за исключением диагностической конструкции для C. auris, содержащейся в объеме 20 fМ, со следующими нуклеотидными последовательностями:
-
C. auris_F CAGACGTGAATCATCGAATCT C. auris_R TTTCGTGCAAGCTGTAATTT C. auris_Proba FAM-AATCTTCGCGGTGGCGTTGCATTCA-RTQ1 C. guilliermondii_For AGTGCTGTCGACCTCTCAAT C. guilliermondii_Rev CCGGGCCAACAATACCAGA C. guilliermondii_Proba R6G-TCCAACTCGTTGAATGGTGTGGC-ВНQ1 C. glabrata_For GCGGCGGGGGTTAATACTG C. glabrata_Rev TTAAAGACGTCTGTCTGCCCA C. glabrata_Proba ROX-ATAAGTGAGTGTTTTGTGCGTGC-RTQ2 C. tropicalis_For CTTAGGTTTATCCAAAAACGCTT C. tropicalis_Rev CGGGTAGTCCTACCTGATTT C. tropicalis_Proba Cy5-TTGCTAGTGGCCACCACAATTTAT-BHQ3 Glob_For GTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCT Glob_Rev CCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCT Glob_Proba Cy5.5-ACCTCAACCAGACACCATGGTGCACCT-BHQ3, - кроме того, используют ПЦР-смесь II реакции со следующим составом: в объеме 50 мкл содержится 50 нг ДНК, 2,5мМ MgCl2, 75mM Tris-HCl c pH 8,8, 20mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,25 mM каждого dNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, четыре пары праймеров и четыре зонда по 40 fМ каждого со следующими нуклеотидными последовательностями:
-
C. parapsilosis_For GGTTTGGTGTTGAGCGATACG C. parapsilosis_Rev TTTGGAGTTTGTACCAATGAGTG C. parapsilosis_Proba FAM-GTTTGCTTGAAAGAAAGGCGGAGT-RTQ1 C. albicans_For GGGTTTGCTTGAAAGACGGT C. albicans_Rev TTACCGCCGCAAGCAATGTT C. albicans_Proba R6G-GATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCT-ВНQ1 C. krusei_For CTTGCGCGTGCGCAGAGTT C. krusei_Rev TAGTTCGCTCGGCCAGCTTC C. krusei_Proba ROX- CGGACGACGTGTAAAGAGCGTC-RTQ2 Pan_Fun_For CAACGGATCTCTTGGTTCT Pan_Fun_Rev GGCGCAATGTGCGTTCAAAG Pan_Fun_Proba Cy5-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA-BHQ3
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809386C1 true RU2809386C1 (ru) | 2023-12-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2663454C1 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-08-06 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстБио" | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища |
| CN110804671B (zh) * | 2019-10-31 | 2022-10-28 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | 耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2663454C1 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-08-06 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстБио" | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища |
| CN110804671B (zh) * | 2019-10-31 | 2022-10-28 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | 耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NEJAD E.E., et al. Molecular identification of Candida isolates by Real-time PCR-high-resolution melting analysis and investigation of the genetic diversity of Candida species. J Clin Lab Anal. 2020, v.34: e23444, p.1-8. ZHANG J., et al. Development of Candida-specific real-time PCR assay for the detection and identification of eight medically important Candida species. Microbiology Insights. 2016, v.9, p.21-28. FREITAS B.L. et al. Reverse Transcription-Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) Assay for the Rapid Enumeration of Live Candida auris Cells from the Health Care Environment. J Clin Microbiol. 16.02.2022, v.60, no.2:e0077921, p.1-9. doi: 10.1128/JCM.00779-21. CARVALHO A., et al. Multiplex PCR identification of eight clinically relevant Candida species, Medical Mycology, November 2007, v.45, Issue 7, p.619-627, https://doi.org/10.1080/13693780701501787. GARCIA-SALAZAR E, et al. Detection and Molecular Identification of Eight Candida Species in Clinical Samples by Simplex PCR. Micr * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vollmer et al. | Evaluation of novel broad-range real-time PCR assay for rapid detection of human pathogenic fungi in various clinical specimens | |
| Lass-Flörl et al. | Utility of PCR in diagnosis of invasive fungal infections: real-life data from a multicenter study | |
| Klingspor et al. | Aspergillus PCR formidable challenges and progress | |
| Pryce et al. | Real-time automated polymerase chain reaction (PCR) to detect Candida albicans and Aspergillus fumigatus DNA in whole blood from high-risk patients | |
| EP0422869A2 (en) | Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts | |
| Badiee et al. | Study on invasive fungal infections in immunocompromised patients to present a suitable early diagnostic procedure | |
| Scharf et al. | Introduction of a bead beating step improves fungal DNA extraction from selected patient specimens | |
| Bernal-Martínez et al. | Detection of invasive infection caused by Fusarium solani and non-Fusarium solani species using a duplex quantitative PCR-based assay in a murine model of fusariosis | |
| Powers-Fletcher et al. | Molecular diagnostic testing for Aspergillus | |
| Bezdicek et al. | Rapid detection of fungal pathogens in bronchoalveolar lavage samples using panfungal PCR combined with high resolution melting analysis | |
| Phoompoung et al. | Recent progress in the diagnosis of pathogenic Candida species in blood culture | |
| Moreira-Oliveira et al. | Diagnosis of candidemia by polymerase chain reaction and blood culture: prospective study in a high-risk population and identification of variables associated with development of candidemia | |
| Pote et al. | Distribution of pathogenic yeasts in different clinical samples: their identification, antifungal susceptibility pattern, and cell invasion assays | |
| Da Silva et al. | Evaluation of fluorescence in situ hybridisation (FISH) for the detection of fungi directly from blood cultures and cerebrospinal fluid from patients with suspected invasive mycoses | |
| Rahn et al. | A novel comprehensive set of fungal Real time PCR assays (fuPCR) for the detection of fungi in immunocompromised haematological patients—A pilot study | |
| Khlif et al. | Evaluation of nested and real-time PCR assays in the diagnosis of candidaemia | |
| Kianipour et al. | Identification of Candida albicans and Candida dubliniensis species Isolated from bronchoalveolar lavage samples using genotypic and phenotypic methods | |
| White et al. | Nucleic acid tools for invasive fungal disease diagnosis | |
| Keçeli et al. | Comparison of Vitek matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry versus conventional methods in Candida identification | |
| WO2011030091A1 (en) | Assay for candida species | |
| Badiee et al. | Early detection of systemic candidiasis in the whole blood of patients with hematologic malignancies | |
| Bigot et al. | Diagnosis of mucormycosis using an intercalating dye-based quantitative PCR | |
| Hardak et al. | Diagnostic role of polymerase chain reaction in bronchoalveolar lavage fluid for invasive pulmonary aspergillosis in immunocompromised patients–a retrospective cohort study | |
| JP7334964B2 (ja) | Ｉｌｖ３を使用した微生物の検出及び設計 | |
| RU2809386C1 (ru) | Способ диагностики инвазивного кандидоза и видовой идентификации его основных возбудителей методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |