RU2809375C1 - WHOLE VIRION INACTIVATED VACCINE AGAINST SARS-Cov-2 INFECTION AND ITS USE - Google Patents
WHOLE VIRION INACTIVATED VACCINE AGAINST SARS-Cov-2 INFECTION AND ITS USE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809375C1 RU2809375C1 RU2023109996A RU2023109996A RU2809375C1 RU 2809375 C1 RU2809375 C1 RU 2809375C1 RU 2023109996 A RU2023109996 A RU 2023109996A RU 2023109996 A RU2023109996 A RU 2023109996A RU 2809375 C1 RU2809375 C1 RU 2809375C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccine
- cov
- virus
- sars
- cpg
- Prior art date
Links
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title abstract description 28
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 title description 13
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 title description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 title description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 100
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 71
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 48
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 46
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 23
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 21
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 21
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 12
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 9
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 claims description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 3
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 abstract 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 22
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 22
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 13
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 11
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 10
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- -1 oil emulsions Chemical class 0.000 description 9
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 6
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 5
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 4
- 229910014130 Na—P Inorganic materials 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 4
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940025291 Sinovac-CoronaVac COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 3
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940025280 BBV152 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 229940125620 CoviVac Drugs 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000812663 Homo sapiens Endoplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010084333 N-palmitoyl-S-(2,3-bis(palmitoyloxy)propyl)cysteinyl-seryl-lysyl-lysyl-lysyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241001678558 SARS-like-CoVZXC21 Species 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229940125574 Sinopharm COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001423 beryllium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011692 calcium ascorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010376 calcium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229940047036 calcium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 1
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 1
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 1
- BLORRZQTHNGFTI-ZZMNMWMASA-L calcium-L-ascorbate Chemical compound [Ca+2].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] BLORRZQTHNGFTI-ZZMNMWMASA-L 0.000 description 1
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BHRQIJRLOVHRKH-UHFFFAOYSA-L calcium;2-[bis[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl]amino]acetate;hydron Chemical compound [Ca+2].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O BHRQIJRLOVHRKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 108010041649 chymopsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011035 continuous diafiltration Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004460 liquid liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002790 naphthalenes Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001093 no immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940126581 whole-virion vaccine Drugs 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и иммунологии, конкретно к получению цельновирионной инактивированной вакцины против инфекции, вызываемой SARS-CoV-2. Предложенная вакцина может быть использована для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, такой как COVID-19.The invention relates to the field of medical biotechnology and immunology, specifically to the production of a whole-virion inactivated vaccine against infection caused by SARS-CoV-2. The proposed vaccine could be used to prevent or treat coronavirus infections such as COVID-19.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), который стал причиной глобальной пандемии COVID-19, был впервые обнаружен в Китае в конце 2019 года. Вирус SARS-CoV-2, также называемый как 2019-nCoV (далее - вирус) относится к семейству Coronaviridae, роду Betacoronavirus (betaCoV), его природным резервуаром являются летучие мыши. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК, состоящей из 29903 п.н. (эталонная полноразмерная последовательность генома вируса штамма Wuhan-Hu-1 размещена в Базе данных Genbank под номером NC_045512.2), который кодирует полипептид из 9860 аминокислот, включающий 25 неструктурных белков и 4 структурных белка, таких как белки шипа (S), оболочки (E), мембраны (M) и нуклеокапсида (N). Нуклеотидная последовательность вирусного генома на 89% идентична SARS-подобному CoVZXC21 вирусу летучей мыши и на 82% идентична SARS-CoV вирусу человека (Chan J.F.-W. et al., Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan, 2020, Emerg Microbes Infect,., 2020 Jan 28;9(1):221-236). Вирус чувствителен к ультрафиолетовому излучению, теплу и липидным растворителям.Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which caused the global COVID-19 pandemic, was first detected in China in late 2019. The SARS-CoV-2 virus, also called 2019-nCoV (hereinafter referred to as the virus), belongs to the family Coronaviridae, genus Betacoronavirus (betaCoV), and its natural reservoir is bats. The genome of the virus is represented by single-stranded RNA, consisting of 29903 bp. (the reference full-length genome sequence of the Wuhan-Hu-1 virus strain is located in the Genbank Database under number NC_045512.2), which encodes a polypeptide of 9860 amino acids, including 25 non-structural proteins and 4 structural proteins, such as spike (S) proteins, envelope ( E), membrane (M) and nucleocapsid (N). The nucleotide sequence of the viral genome is 89% identical to the SARS-like CoVZXC21 bat virus and 82% identical to the human SARS-CoV virus (Chan J.F.-W. et al., Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan, 2020, Emerg Microbes Infect,., 2020 Jan 28;9(1):221-236). The virus is sensitive to ultraviolet radiation, heat and lipid solvents.
Передача инфекции SARS-CoV-2 осуществляется воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Ведущим путем передачи SARS-CoV-2 является воздушно-капельный, который реализуется при кашле, чихании и разговоре на близком расстоянии. Возможен контактный путь передачи, который реализуется во время рукопожатий и других видах непосредственного контакта с инфицированным человеком, а также через поверхности и предметы, контаминированные вирусом. Кроме того, вирус может передаваться при переливании крови, трансплацентарно и половым путем. Хотя инфекция SARS-CoV-2 может проявляться только легкими симптомами, такими как, как правило, лихорадка и кашель, или даже протекать бессимптомно; в другой крайности это может быть фатальным. Основными симптомами обычно являются высокая температура, кашель и затрудненное дыхание. Transmission of SARS-CoV-2 infection occurs through airborne droplets, airborne dust and contact. The leading route of transmission of SARS-CoV-2 is airborne, which occurs when coughing, sneezing and talking at close range. A contact route of transmission is possible, which occurs during handshakes and other types of direct contact with an infected person, as well as through surfaces and objects contaminated with the virus. In addition, the virus can be transmitted through blood transfusion, transplacentally and sexually. Although SARS-CoV-2 infection may only present with mild symptoms, typically fever and cough, or even be asymptomatic; at the other extreme it can be fatal. The main symptoms are usually fever, cough and difficulty breathing.
В настоящее время SARS-CoV-2 представляет значительную угрозу для здоровья населения. Начиная с 2019 года, вирус быстро распространился по миру и по данным ВОЗ на конец февраля 2023 года привел уже к более чем 757 млн. подтвержденных случаев COVID-19, включая почти 7 млн. смертельных случаев (https://covid19.who.int/). В связи с этим продолжаются поиски терапевтических средств, которые могли бы окончательно остановить переход от инфицирования к развитию тяжелой формы COVID-19.SARS-CoV-2 currently poses a significant threat to public health. Since 2019, the virus has rapidly spread throughout the world and, according to WHO, at the end of February 2023 has already led to more than 757 million confirmed cases of COVID-19, including almost 7 million deaths (https://covid19.who.int /). In this regard, the search continues for therapeutic agents that could finally stop the transition from infection to the development of a severe form of COVID-19.
Внимание исследователей направлено на разработку различных терапевтических стратегий, среди которых предотвращение связывания SARS-CoV-2 с рецепторами на клетках человека, блокировка синтеза и репликации вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК), восстановление врожденного иммунитета хозяина и регуляция специфических рецепторов или ферментов хозяина. Однако, наиболее многообещающим подходом для сдерживания пандемии считаются вакцины, предотвращающие инфицирование SARS-CoV-2 (Вакцины против SARS-CoV-2: светлые и темные стороны, перевод Савицкая Р., размещено 09.08.2021 по адресу https://medach.pro/post/2680).Researchers are focusing on developing various therapeutic strategies, including preventing SARS-CoV-2 from binding to receptors on human cells, blocking viral ribonucleic acid (RNA) synthesis and replication, restoring host innate immunity, and regulating specific host receptors or enzymes. However, the most promising approach to containing the pandemic is considered to be vaccines that prevent infection by SARS-CoV-2 (Vaccines against SARS-CoV-2: bright and dark sides, translation by Savitskaya R., posted 08/09/2021 at https://medach.pro /post/2680).
На сегодняшний день разработаны различные типы вакцин против COVID-19, включая цельновирионные аттенуированные и инактивированные вакцины, пептидные и векторные вакцины, ДНК- и РНК-вакцины, которые направлены на стимуляцию нейтрализующего вирус иммунного ответа организма. По данным ВОЗ на конец февраля 2023 г. известно о разработке 199 вакцин-кандидатов против COVID-19, находящихся на стадии доклинических испытаний, и о 180 вакцинах на стадии клинических испытаний, из них только 22 относятся к инактивированных вакцинам (https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).To date, various types of COVID-19 vaccines have been developed, including whole-virion attenuated and inactivated vaccines, peptide and vector vaccines, DNA and RNA vaccines, which are aimed at stimulating the body's immune response to neutralize the virus. According to WHO, at the end of February 2023, it is known that 199 vaccine candidates against COVID-19 are in preclinical testing and 180 vaccines are in clinical trials, of which only 22 are inactivated vaccines (https://www .who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).
Доступны к применению для профилактики COVID-19, как минимум, шесть цельновирионных инактивированных вакцин, пять из которых применяются для человека и одна для плотоядных животных, такие как: российские вакцины для человека - КовиВак («Институт полиомиелита им. Чумакова») и для животных - Карнивак-Ков (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), китайские вакцины - CoronaVac и PiCoVacc (Sinovac), а также BBIBP-CorV/COVILO (Sinopharm) и индийская вакцина Covaxin/BBV152 (Bharat Biotech).At least six whole virion inactivated vaccines are available for use for the prevention of COVID-19, five of which are used for humans and one for carnivores, such as: Russian vaccines for humans - CoviVac (“Chumakov Institute of Poliomyelitis”) and for animals - Carnivac-Cove (FSBI "ARRIAH"), Chinese vaccines - CoronaVac and PiCoVacc (Sinovac), as well as BBIBP-CorV/COVILO (Sinopharm) and the Indian vaccine Covaxin/BBV152 (Bharat Biotech).
В качестве аналогов предлагаемого изобретения могут быть рассмотрены следующие документы, относящиеся к цельновирионным вакцинным препаратам против инфекции, вызванной SARS-CoV-2, полученные на основе инактивированных вирусных штаммов.As analogues of the proposed invention, the following documents relating to whole-virion vaccine preparations against infection caused by SARS-CoV-2, obtained on the basis of inactivated viral strains, can be considered.
Международная патентная заявка WO 2022038642 A1, опубликованная 24.02.2022, в которой раскрыта цельновирионная инактивированная вакцина на основе вирусного антигена из штамма NIV-2020-770 вируса SARS-CoV-2. Вакцина содержит активный ингредиент - инактивированный очищенный SARS-CoV-2 в фосфатно-солевом буфере и адъюванты. В качестве адъювантов в составе вакцины могут быть использованы CpG олигонуклеотиды и гидроксид алюминия. С целью индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и его вариантов у млекопитающих, в том числе людей, вакцинную композицию с антигеном вируса SARS-CoV-2 вводят в эффективной дозе в диапазоне от 0,125 до 100 мкг на дозу с адъювантом или без него, либо в виде однократной дозы или в двух или более дозах, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающих. Гидроксид алюминия присутствует в диапазоне концентраций от 0,1 мг до 1,5 мг алюминия на дозу вакцины.International patent application WO 2022038642 A1, published on 02/24/2022, which discloses a whole-virion inactivated vaccine based on a viral antigen from the NIV-2020-770 strain of the SARS-CoV-2 virus. The vaccine contains the active ingredient - inactivated purified SARS-CoV-2 in phosphate-buffered saline and adjuvants. CpG oligonucleotides and aluminum hydroxide can be used as adjuvants in the vaccine. For the purpose of inducing an immune response against SARS-CoV-2 and its variants in mammals, including humans, a vaccine composition with a SARS-CoV-2 virus antigen is administered at an effective dose ranging from 0.125 to 100 μg per dose with or without adjuvant , either as a single dose or in two or more doses to induce an immune response in mammals. Aluminum hydroxide is present in concentrations ranging from 0.1 mg to 1.5 mg aluminum per vaccine dose.
Международная патентная заявка WO 2021209060 A1, опубликованная 21.10.2021, относящаяся к инактивированной вакцине PiCoVacc против SARS-Cov-2 на основе вирусного антигена из штамма CN3 вируса SARS-CoV-2. Также предложен способ лечения, профилактики или иммунизации против заболеваний, связанных с инфекцией вирусами SARS-CoV-2, включающий введение субъекту фармацевтической композиции или вакцины, содержащей фармацевтически эффективное количество инактивированного вируса SARS-Cov-2, адъюванты и фармацевтически приемлемый носитель. Вакцина в дозе 0,5-8 мкг, предпочтительно 2-6 мкг, обеспечивает защиту субъекта от заражения SARS-CoV-2.International patent application WO 2021209060 A1, published on 10/21/2021, relating to the inactivated PiCoVacc vaccine against SARS-Cov-2 based on a viral antigen from the CN3 strain of the SARS-CoV-2 virus. Also proposed is a method of treating, preventing, or immunizing against diseases associated with infection with SARS-CoV-2 viruses, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition or vaccine containing a pharmaceutically effective amount of an inactivated SARS-Cov-2 virus, adjuvants, and a pharmaceutically acceptable carrier. The vaccine at a dose of 0.5-8 μg, preferably 2-6 μg, provides protection to the subject against infection with SARS-CoV-2.
Международная патентная заявка WO 2021176434 A1, опубликованная 10.09.2021, раскрывает вакцину против SARS-CoV-2, содержащую: (i) инактивированную частицу SARS-CoV-2, где количество инактивированного вируса SARS-CoV-2 на дозу в вакцине составляет примерно от 0,01 до 25 мАЕ (миллиабсорбционных единиц x минуты), предпочтительно от примерно 0,25 до 2,5 мАЕ по оценке SEC-HPLC; ii) CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) от 0,25 до 6 мг/мл, предпочтительно примерно 2 мг/мл, т.е. 1 мг/доза; и iii) гидроксид алюминия от 0,1 до 2 мг/мл, предпочтительно 1 мг/мл, т.е. 0,5 мг/доза, при этом вакцина доставляется в объеме 0,5 мл. Эффективное количество вакцины против SARS-CoV-2 на дозу составляет от 0,05 до 50 мг общего белка, предпочтительно около 5 мкг общего белка/доза, т.е. как измерено (p)BCA. Вакцина обеспечивает профилактику инфекции SARS-CoV-2 без индукции антителозависимого усиления (ADE) SARS-CoV-2-ассоциированного заболевания (COVID-19) или иммунопатология у субъекта.International patent application WO 2021176434 A1, published on 09/10/2021, discloses a vaccine against SARS-CoV-2 containing: (i) an inactivated SARS-CoV-2 particle, where the amount of inactivated SARS-CoV-2 virus per dose in the vaccine is approximately from 0.01 to 25 mAU (milliabsorptive units x minutes), preferably from about 0.25 to 2.5 mAU as assessed by SEC-HPLC; ii) CpG-containing oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) from 0.25 to 6 mg/ml, preferably about 2 mg/ml, i.e. 1 mg/dose; and iii) aluminum hydroxide from 0.1 to 2 mg/ml, preferably 1 mg/ml, i.e. 0.5 mg/dose, with the vaccine delivered in a volume of 0.5 ml. An effective amount of SARS-CoV-2 vaccine per dose is from 0.05 to 50 mg total protein, preferably about 5 μg total protein/dose, i.e. as measured by (p)BCA. The vaccine provides prevention of SARS-CoV-2 infection without inducing antibody-dependent enhancement (ADE) of SARS-CoV-2-associated disease (COVID-19) or immunopathology in the subject.
Следует отметить преимущества инактивированных вакцин перед живыми, которые заключаются в отсутствии риска инфицирования, поскольку убитые вирусы не могут мутировать, соответственно, в них нет потенциальной опасности как у живых вакцин, в ходе репликации которых в организме хозяина возможен возврат к дикому типу или рекомбинация с вирусом дикого типа. По сравнению с векторными и мРНК-вакцинами преимущества инактивированных вакцин состоят в том, что пациенту вводится цельный вирусный капсид, что приводит к формированию иммунитета против всего комплекса вирусных белков, а не только фрагмента S-белка, ранее считавшегося консервативным у мутировавших штаммов, но реальные условия пандемии показали иное, что привело к снижению эффективности как векторных, так и мРНК-вакцин, нацеленных исключительно на S-белок.It should be noted that the advantages of inactivated vaccines over live ones are that there is no risk of infection, since killed viruses cannot mutate; therefore, they do not have the potential danger of live vaccines, during the replication of which in the host’s body a return to the wild type or recombination with the virus is possible wild type. Compared to vector and mRNA vaccines, the advantages of inactivated vaccines are that the patient is injected with the entire viral capsid, which leads to the formation of immunity against the entire complex of viral proteins, and not just a fragment of the S-protein, previously considered conservative in mutated strains, but real pandemic conditions have shown otherwise, leading to reduced effectiveness of both vector and mRNA vaccines targeting the S protein alone.
У известных инактивированных вакцин есть и недостатки, связанные с недостаточной иммуногенной активностью, а именно, недостаточным формированием Т-клеточного противовирусного иммунитета, что требует использования адъювантов для повышения их эффективности, сложностями их производства и нежелательными побочными явлениями.Known inactivated vaccines also have disadvantages associated with insufficient immunogenic activity, namely, insufficient formation of T-cell antiviral immunity, which requires the use of adjuvants to increase their effectiveness, difficulties in their production and undesirable side effects.
В связи с этим существует потребность в разработке новых вакцинных препаратов, эффективных против COVID-19. Идеальная вакцина-кандидат против SARS-CoV-2 должна обладать высокой иммуногенностью, надежной способностью вызывать эффективный иммунный ответ с помощью нейтрализующих антител, обеспечивать практически полную защиту от тяжелых форм COVID-19 и быть безопасной - то есть не нести значительных побочных эффектов.In this regard, there is a need to develop new vaccine drugs effective against COVID-19. An ideal SARS-CoV-2 vaccine candidate should be highly immunogenic, reliably able to elicit an effective immune response with neutralizing antibodies, provide virtually complete protection against severe forms of COVID-19, and be safe—that is, without significant side effects.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) предлагаемого изобретения может быть выбрана цельновирионная инактивированная вакцина против SARS-CoV-2, раскрытая в WO 2021176434 A1, 10.09.2021. В качестве недостатков прототипа можно отметить следующие: As the closest analogue (prototype) of the proposed invention, the whole virion inactivated vaccine against SARS-CoV-2, disclosed in WO 2021176434 A1, 09.10.2021, can be selected. The disadvantages of the prototype include the following:
- использование исходного уханьского штамм коронавируса, который уже не актуален с эпидемической точки зрения; - use of the original Wuhan strain of coronavirus, which is no longer relevant from an epidemic point of view;
- количество действующего вещества - инактивированного вирусного антигена в составе вакцинного препарата выражено в условных единицах, которые не отражают абсолютное количество антигена и препятствуют обеспечению воспроизводимости и масштабированию процесса в условиях GMP;- the amount of active substance - inactivated viral antigen in the vaccine preparation is expressed in arbitrary units, which do not reflect the absolute amount of antigen and prevent the reproducibility and scaling of the process under GMP conditions;
- относительно высокое содержание такого адъюванта как CpG-ODN, что несет в себе определенные риски по безопасности препарата при массовом применении.- relatively high content of such an adjuvant as CpG-ODN, which carries certain risks for the safety of the drug when used on a mass scale.
Таким образом, в данной области техники существует проблема в недостаточном ассортименте цельновирионных инактивированных вакцин, эффективных против инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.Thus, a problem in the art is that there is a lack of whole virion inactivated vaccines effective against SARS-CoV-2 infection.
Задача предлагаемого изобретения состоит в получении вакцины, эффективной против инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.The objective of the present invention is to obtain a vaccine effective against infection caused by SARS-CoV-2.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Если не определено иное, все термины и понятия, применяемые в раскрытии настоящего изобретения, включая технические и научные термины, имеют значение, которое обычно понятно среднему специалисту в технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, вирусологии, аналитической, препаративной, медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Методики получения вирусов и культивирования клеток-продуцентов, выделения целевого белка, очистки и проверки активности целевого белка осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как это подробно описано в настоящем документе.Unless otherwise defined, all terms and concepts used in the disclosure of the present invention, including technical and scientific terms, have a meaning that is commonly understood by one of ordinary skill in the technical field to which the present invention belongs. In general, the classification used and the methods of cellular and molecular biology, immunology, microbiology, virology, analytical, preparative, medicinal and pharmaceutical chemistry described herein are well known to those skilled in the art and are widely used in the art. Procedures for obtaining viruses and culturing producer cells, isolating the target protein, purifying and testing the activity of the target protein are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is usually carried out in the art, or as described in detail herein.
Все документы, цитируемые или приводимые в качестве ссылок в настоящем описании изобретения, и все документы, цитируемые или приводимые в качестве ссылок в документах, цитируемых в настоящем описании изобретения, вместе с любыми инструкциями производителя, описаниями и режимами использования способа или продуктов, упомянутых в настоящем документе или в любом документе, включенном в настоящий документ посредством ссылки, включены в предложенный документ посредством ссылки и могут быть использованы при осуществлении предложенного изобретения на практике.All documents cited or referenced in this specification, and all documents cited or referenced in documents cited in this specification, together with any manufacturer's instructions, descriptions and modes of use of the method or products mentioned herein document or any document incorporated by reference herein are incorporated by reference herein and may be used in practicing the proposed invention.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширении ассортимента цельновирионных инактивированных вакцин против коронавирусной инфекции SARS-Cov-2, а именно в создании цельновирионной инактивированной вакцины на основе уникального штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339, эффективной против коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2.The technical result of the proposed invention is to expand the range of whole-virion inactivated vaccines against coronavirus infection SARS-Cov-2, namely, to create a whole-virion inactivated vaccine based on the unique strain nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 of the SARS-Cov-2 virus deposited in a specialized collection of reference cultures of strains of pathogenicity groups II-IV (arboviruses and others) of the Federal State Budgetary Institution “48 Central Research Institute” of the Russian Ministry of Defense under registration No. 1339, effective against coronavirus infection caused by the SARS-Cov-2 virus.
Также следует отметить дополнительные преимущества предложенного изобретения перед ближайщим аналогом, которые заключаются в:It should also be noted additional advantages of the proposed invention over the closest analogue, which are:
- использовании высоковирулентного штамма, который сохраняется таковым среди известных вариантов вируса и является высоко патогенным для человека, что обеспечивает высокую иммуногенность и эффективность вакцины, в том числе перекрестную;- the use of a highly virulent strain, which remains the same among known variants of the virus and is highly pathogenic for humans, which ensures high immunogenicity and effectiveness of the vaccine, including cross-validation;
- использовании оптимально низких концентраций адъювантов в комбинации, прежде всего CpG-ODN, что значительно снижает риски по безопасности препарата при массовом применении;- the use of optimally low concentrations of adjuvants in combination, primarily CpG-ODN, which significantly reduces the safety risks of the drug during mass use;
- однозначном определении дозы инактивированного вируса, что позволяет проводить исследования и разработку (GLP), а также масштабировать производство (GMP);- unambiguous determination of the dose of the inactivated virus, which allows for research and development (GLP), as well as scaling up production (GMP);
- снижении рисков возникновения нежелательных побочных эффектов при использовании вакцинного препарата на основе инактивированного вирусного антигена за счет повышения степени его очистки.- reducing the risk of unwanted side effects when using a vaccine preparation based on an inactivated viral antigen by increasing the degree of its purification.
Указанный технический результат достигается за счет предложенной вакцины против инфекции, вызываемой вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-Cov-2, включающей очищенный инактивированный вирусный антиген возбудителя указанной инфекции в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые эксципиенты. This technical result is achieved by the proposed vaccine against infection caused by the severe acute respiratory syndrome virus SARS-Cov-2, which includes purified inactivated viral antigen of the causative agent of this infection in an effective amount and pharmaceutically acceptable excipients.
В качестве очищенного инактивированного вирусного антигена возбудителя инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2, в составе предложенной вакцины используют вирусный антиген из уникального штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339. As a purified inactivated viral antigen of the causative agent of infection caused by the SARS-Cov-2 virus, the proposed vaccine uses a viral antigen from the unique strain nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 of the SARS-Cov-2 virus, deposited in a specialized collection of reference cultures of strains of pathogenicity groups II-IV (arboviruses and others) of the Federal State Budgetary Institution “48 Central Research Institute” of the Russian Ministry of Defense under registration No. 1339.
Вирусный антиген используют в эффективном количестве в составе фармацевтической композиции, в частности, вакцины, которая представляет собой средство, вызывающее специфический иммунный ответ против вируса SARS-Cov-2.The viral antigen is used in an effective amount as part of a pharmaceutical composition, in particular a vaccine, which is a means of inducing a specific immune response against the SARS-Cov-2 virus.
Термин «фармацевтическая композиция», «вакцинная композиция», «вакцина» и подобные им используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к составу, содержащему терапевтически эффективный агент, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Указанная фармацевтическая композиция полезна для лечения, предотвращения или снижения тяжести заболевания или расстройства путем введения указанной фармацевтической композиции субъекту, предпочтительно для профилактики, предотвращения или предупреждения возникновения коронавирусного заболевания, вызванного коронавирусом 2 острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), путем индукции специфического иммунитета.The terms "pharmaceutical composition", "vaccine composition", "vaccine" and the like are used interchangeably herein and refer to a formulation containing a therapeutically effective agent, preferably together with pharmaceutically acceptable excipients. Said pharmaceutical composition is useful for treating, preventing or reducing the severity of a disease or disorder by administering said pharmaceutical composition to a subject, preferably for preventing, preventing or preventing the occurrence of coronavirus disease caused by acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by inducing specific immunity .
Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и подобные им используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, поддающемуся воздействию предложенными средствами и способами. Предпочтительно субъект, пациент или индивидуум является человеком любого пола и любого возраста.The terms "subject", "patient", "individual" and the like are used interchangeably herein and refer to any animal amenable to the proposed means and methods. Preferably, the subject, patient or individual is a person of any gender and any age.
Термин «профилактика», «предотвращение» или «предупреждение» и подобные им означает замедление или предотвращение появления симптомов заболевания или инфекции, предпочтительно симптомов заболевания COVID-19 или инфекции, вызванной вирусом SARS-Cov-2.The term “prevention,” “avoidance,” or “warning,” and the like, means slowing or preventing the onset of symptoms of a disease or infection, preferably symptoms of COVID-19 disease or infection caused by the SARS-Cov-2 virus.
Термин «индукция иммунитета» или «индукция иммунного ответа», как используют в настоящем изобретении, относится к специфическому контролю или к влиянию на активность иммунного ответа и включает активацию иммунного ответа, стимуляцию иммунного ответа, усиление иммунного ответа.The term "immune induction" or "induction of an immune response" as used in the present invention refers to the specific control or influence on the activity of an immune response and includes activation of an immune response, stimulation of an immune response, enhancement of an immune response.
Термин «специфический иммунитет», согласно настоящему документу, относится к состоянию невосприимчивости к заболеванию вследствие индукции иммунного ответа, предпочтительно, к невосприимчивости к COVID-19 вследствие индукции иммунного ответа против вируса SARS-Cov-2.The term “specific immunity” as used herein refers to a state of immunity to disease due to the induction of an immune response, preferably immunity to COVID-19 due to the induction of an immune response against the SARS-Cov-2 virus.
Термин «заболевание» относится к состоянию здоровья субъекта, при котором нарушаются функции поддержания гомеостаза, и в том случае, если заболевание не облегчают, то здоровье субъекта продолжает ухудшаться или не улучшается.The term "disease" refers to a state of health of a subject in which the functions of maintaining homeostasis are impaired and, if the disease is not alleviated, the subject's health continues to deteriorate or does not improve.
Термин «инфекция», как указано в настоящем документе, относится к заражению живого организма инфекционным агентом, процессу его размножения или развития в организме, а также реакции организма на присутствие в нем инфекционного агента и на выделяемые им токсины, предпочтительно инфекция вызывается вирусом SARS-Cov-2. The term "infection" as defined herein refers to the infection of a living organism by an infectious agent, the process of its reproduction or development in the body, and the body's response to the presence of an infectious agent in it and to the toxins produced by it, preferably the infection is caused by the SARS-Cov virus -2.
Под термином «инфекционное заболевание» в настоящем документе понимается развитие заболевания в результате инфекции, предпочтительно инфекционное заболевание представляет собой коронавирусное заболевание, а именно COVID-19, вызванное таким инфекционным агентом как вирус SARS-Cov-2.The term “infectious disease” as used herein refers to the development of a disease as a result of an infection, preferably the infectious disease is a coronavirus disease, namely COVID-19, caused by an infectious agent such as the SARS-Cov-2 virus.
Термин «эффективное количество», в том числе «фармакологически эффективное количество», «профилактически эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое обеспечивает желательную реакцию или желательный эффект отдельно или вместе с дополнительными дозами, в частности, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение. The term "effective amount", including a "pharmacologically effective amount", "prophylactically effective amount" or "therapeutically effective amount" refers to an amount that provides a desired response or effect, alone or together with additional doses, in particular, which will relieve to a certain extent from one or more symptoms of the disease for which treatment is being carried out.
Желательная реакция предпочтительно связана с профилактикой, а именно с ингибированием или предупреждением возникновения коронавирусного заболевания, вызванного вирусом SARS-Cov-2. Желательным эффектом может быть отсрочка начала или предотвращение наступления COVID-19.The desired response is preferably related to prevention, namely inhibiting or preventing the occurrence of coronavirus disease caused by the SARS-Cov-2 virus. The desired effect may be to delay the onset or prevent the onset of COVID-19.
Также желательная реакция связана с лечением коронавирусного заболевания, вызванного вирусом SARS-Cov-2, а именно с ингибированием течения заболевания, облегчении тяжести инфекции, уменьшения одного или нескольких симптомов заболевания, ускорении процесса выздоровления, снижении осложнений основного заболевания и уменьшении выраженности сопутствующих патологических состояний. Желательный эффект включает замедление прогрессирования заболевания, в частности, прекращение заболевания или бессимптомное течение COVID-19.Also, the desired reaction is associated with the treatment of coronavirus disease caused by the SARS-Cov-2 virus, namely with inhibiting the course of the disease, alleviating the severity of the infection, reducing one or more symptoms of the disease, accelerating the recovery process, reducing complications of the underlying disease and reducing the severity of concomitant pathological conditions. Desired effects include slowing disease progression, such as disease resolution or asymptomatic progression of COVID-19.
Эффективное количество описанных в данном документе вакцинных композиций может зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и массу, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии в случае ее наличия, конкретного способа введения и других факторов. Соответственно, вводимые дозы вакцинных композиций, описанных в данном документе, могут зависеть от множества таких параметров. В том случае, когда реакция пациента или достигаемый эффект недостаточны при исходной дозе, могут использоваться более высокие дозы или эффективно более высокие дозы, достигнутые с помощью другого более точно локализованного пути введения. The effective amount of the vaccine compositions described herein may depend on the condition being treated, the severity of the disease, individual patient characteristics, including age, physiological condition, size and weight, duration of treatment, type of concomitant therapy, if any, specific route of administration and other factors. . Accordingly, the administered doses of the vaccine compositions described herein may depend on a variety of such parameters. In the event that the patient's response or effect is insufficient at the initial dose, higher doses or effectively higher doses achieved through another more precisely localized route of administration may be used.
Предпочтительно эффективное количество, согласно настоящему документу, представляет собой количество, достаточное для образования у субъекта вируснейтрализующих антиген-специфических антител, а именно, антител против SARS-CoV-2.Preferably, the effective amount herein is an amount sufficient to produce virus-neutralizing antigen-specific antibodies, namely anti-SARS-CoV-2 antibodies, in the subject.
Указанное количество рассчитывается на одну дозу вакцины, которая предпочтительно составляет от 0,5 до 10 мл, наиболее предпочтительно 0,5 мл на одно введение субъекту.This amount is calculated per dose of the vaccine, which is preferably from 0.5 to 10 ml, most preferably 0.5 ml per administration to the subject.
Количество указанного вирусного антигена в составе вакцины составляет от 3 до 60 мкг на одну дозу, предпочтительно 7,5-30 мкг на одну дозу, наиболее предпочтительно 15 мкг на одну дозу.The amount of said viral antigen in the vaccine composition is from 3 to 60 μg per dose, preferably 7.5-30 μg per dose, most preferably 15 μg per dose.
Концентрация указанного вирусного антигена в составе вакцины составляет от 6 до 120 мкг/мл, предпочтительно 15-60 мкг/мл, наиболее предпочтительно 30 мкг/мл.The concentration of the specified viral antigen in the vaccine composition is from 6 to 120 μg/ml, preferably 15-60 μg/ml, most preferably 30 μg/ml.
Используемые в составе фармацевтической композиции по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые эксципиенты представляют собой один или несколько адъювантов и фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель. Примеры эксципиентов включают, без ограничения указанными, носители, связующие, разбавители, смазывающие вещества, загустители, поверхностно-активные агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы. The pharmaceutically acceptable excipients used in the pharmaceutical composition of the present invention are one or more adjuvants and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier. Examples of excipients include, but are not limited to, carriers, binders, diluents, lubricants, thickeners, surfactants, preservatives, stabilizers, emulsifiers, buffers.
Фармацевтические композиции могут содержать один или несколько адъювантов или могут вводиться с одним или несколькими адъювантами. Pharmaceutical compositions may contain one or more adjuvants or may be administered with one or more adjuvants.
Термин «адъювант» относится к соединению, которое продлевает, усиливает или ускоряет иммунный ответ. Адъюванты включают гетерогенную группу соединений, таких как масляные эмульсии, например, адъюванты Фрейнда, минеральные соединения, такие как квасцы, например, гидроксид алюминия (например, не ограничиваясь указанными, коммерчески доступные гели гидроксида алюминия - Alhydrogel™ (Brenntag Biosector), Rehydragel™ (Reheis), Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical) и др.), бактериальные продукты, такие как токсин Bordetella pertussis или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают, без ограничения указанными: LPS, GP96, CpG-содержащие олигодезоксинуклеотиды (CpG-ODN, например, не ограничиваясь указанными, такие как CPG-ODN 1018 (Dynavax Technologies), CpG-ODN 1826 (Синтол), CpG-ODN 2006 (Invivogen), CpG-ODN 2216 (Invivogen) и др.), липопептиды, такие как Pam3Cys, факторы роста и цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины, хемокины, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF и другие.The term "adjuvant" refers to a compound that prolongs, enhances or accelerates the immune response. Adjuvants include a heterogeneous group of compounds such as oil emulsions, e.g. Freund's adjuvants, mineral compounds such as alum, e.g. aluminum hydroxide (e.g., but not limited to, commercially available aluminum hydroxide gels - Alhydrogel™ (Brenntag Biosector), Rehydragel™ ( Reheis), Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical), etc.), bacterial products such as Bordetella pertussis toxin or immunostimulating complexes. Examples of adjuvants include, but are not limited to: LPS, GP96, CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG-ODN, for example, but not limited to, such as CPG-ODN 1018 (Dynavax Technologies), CpG-ODN 1826 (Synthol), CpG-ODN 2006 (Invivogen), CpG-ODN 2216 (Invivogen), etc.), lipopeptides such as Pam3Cys, growth factors and cytokines such as monokines, lymphokines, interleukins, chemokines such as IL-1, IL-2, IL-3 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF and others.
Термин «наполнитель» означает агент, который может быть добавлен к композиции для обеспечения требуемой консистенции, например, изменения объемных свойств, улучшения стабильности и/или регулирования осмоляльности. Примеры обычно используемых наполнителей включают, не ограничиваясь ими, хлорид натрия; сахара, например, сахарозу; полиолы, например, маннит; аминокислоты, например, гистидин, аргинин; поверхностно-активные вещества, например, полисорбат 80 и полимеры.The term "excipient" means an agent that can be added to a composition to provide a desired consistency, such as changing bulk properties, improving stability and/or adjusting osmolality. Examples of commonly used excipients include, but are not limited to, sodium chloride; sugars, such as sucrose; polyols, eg mannitol; amino acids, for example, histidine, arginine; surfactants such as polysorbate 80 and polymers.
Термин «носитель» относится к компоненту, который может быть натуральным, синтетическим, органическим, неорганическим, в котором активный компонент объединен для облегчения, усиления или обеспечения возможности введения фармацевтической композиции. Используемый в настоящем документе носитель может быть представлен одним или несколькими совместимыми твердыми или жидкими наполнителями, разбавителями или инкапсулирующими веществами, которые подходят для введения субъекту. Подходящий носитель включает, без ограничения указанными, стерильную воду, раствор Рингера, лактат Рингера, стерильный раствор хлорида натрия, изотонический солевой раствор, полиалкиленгликоли, гидрогенизированные нафталины и, в частности, биосовместимые полимеры лактида, сополимеры лактида/гликолида или сополимеры полиоксиэтилена/полиоксипропилена.The term "carrier" refers to a component, which may be natural, synthetic, organic, inorganic, in which the active component is combined to facilitate, enhance or enable administration of the pharmaceutical composition. The carrier used herein may be one or more compatible solid or liquid fillers, diluents, or encapsulating agents that are suitable for administration to a subject. Suitable carriers include, but are not limited to, sterile water, Ringer's solution, lactated Ringer, sterile sodium chloride solution, isotonic saline, polyalkylene glycols, hydrogenated naphthalenes and, in particular, biocompatible lactide polymers, lactide/glycolide copolymers or polyoxyethylene/polyoxypropylene copolymers.
Термин «разбавитель» относится к разбавляющему и/или разжижающему агенту. Более того, термин «разбавитель» включает любую одну или несколько из жидкости, жидкой или твердой суспензии и/или смешивающей среды. Примеры подходящих разбавителей включают буферный раствор, например, фосфатно-солевой буфер (PBS), раствор NaCl (0,9%), этанол, глицерин или воду.The term "diluent" refers to a diluting and/or liquefying agent. Moreover, the term "diluent" includes any one or more of a liquid, liquid or solid suspension and/or mixing medium. Examples of suitable diluents include a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS), NaCl solution (0.9%), ethanol, glycerol or water.
Фармацевтические композиции, согласно настоящему изобретению, могут содержать подходящие добавки, соли, буферы, антиоксиданты, консерванты, агенты, регулирующие осмоляльность, и агенты, регулирующие рН, и, возможно, другие терапевтические агенты, например, другие иммунорегуляторные средства.The pharmaceutical compositions of the present invention may contain suitable additives, salts, buffers, antioxidants, preservatives, osmolality adjusting agents and pH adjusting agents, and optionally other therapeutic agents, for example other immunoregulatory agents.
Подходящие добавки включают хелатирующие агенты, например, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), DTPA-бисамид и другие или кальциевые хелатные комплексы, например, кальция DTPA, CaNaDTPA-бисамид и другие, или, возможно, добавки кальциевой или натриевой солей, например, хлорида кальция, аскорбата кальция, глюконата кальция, лактата кальция и другие. Suitable additives include chelating agents, e.g. diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), DTPA-bisamide and others, or calcium chelating complexes, e.g. calcium DTPA, CaNaDTPA-bisamide and others, or optionally calcium or sodium salt additives, e.g. calcium chloride, calcium ascorbate, calcium gluconate, calcium lactate and others.
Подходящие буферы для применения в фармацевтических композициях по настоящему изобретению включают физиологически биосовместимые буферные растворы, например, PBS и другие. Suitable buffers for use in the pharmaceutical compositions of the present invention include physiologically biocompatible buffer solutions, for example, PBS and others.
Фосфатно-солевой буфер (PBS) представляет собой физиологически приемлемый буферный солевой раствор на водной основе (pH ~ 7,4), содержащий динатриевый гидрофосфат, хлорид натрия и, в некоторых составах, хлорид калия и дигидрофосфат калия, который помогает поддерживать постоянный рН. Типичный химический состав 1X PBS имеет конечную концентрацию NaCl - 137 мМ/л, KCl - 2.7 мМ/л, Na2HPO4 - 10 мМ/л, KH2PO4 - 1.8 мМ/л.Phosphate-buffered saline (PBS) is a physiologically acceptable water-based buffered saline solution (pH ~ 7.4) containing disodium hydrogen phosphate, sodium chloride and, in some formulations, potassium chloride and potassium dihydrogen phosphate, which helps maintain a constant pH. A typical 1X PBS chemistry has a final concentration of NaCl - 137 mM/L, KCl - 2.7 mM/L, Na 2 HPO 4 - 10 mM/L, KH 2 PO 4 - 1.8 mM/L.
При необходимости состав фармацевтических композиций по настоящему изобретению может быть дополнен подходящими консервантами, например, без ограничения указанными, хлоридом бензалкония, хлорбутанолом, парабеном и тимеросалом и другими.If necessary, the composition of the pharmaceutical compositions of the present invention can be supplemented with suitable preservatives, for example, without limitation, benzalkonium chloride, chlorobutanol, paraben and thimerosal and others.
Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут быть выбраны с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики.Pharmaceutically acceptable excipients may be selected based on the intended route of administration and standard pharmaceutical practice.
Описанные в данном документе фармацевтические композиции можно вводить подкожно, внутрикожно или внутримышечно. В предпочтительном варианте фармацевтические композиции составлены для системного введения путем внутримышечной инъекции.The pharmaceutical compositions described herein can be administered subcutaneously, intradermally, or intramuscularly. In a preferred embodiment, the pharmaceutical compositions are formulated for systemic administration by intramuscular injection.
Предпочтительно в состав вакцины входят такие адъюванты как гидроксид алюминия и/или CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) в фармацевтически приемлемом разбавителе, предпочтительно комплексный адъювант - гидроксид алюминия и CpG-ODN в фосфатно-солевом буфере (PBS). При этом гидроксид алюминия используют предпочтительно в количестве 100 - 1000 мкг на одну дозу (в концентрации 200 - 2000 мкг/мл), а CpG-ODN в количестве 1 - 100 мкг на одну дозу (в концентрации 2-200 мкг/мл), наиболее предпочтительно гидроксид алюминия в количестве 500 мкг на одну дозу (в концентрации 1000 мкг/мл) и CpG-ODN в количестве 10 мкг на одну дозу (в концентрации 20 мкг/мл).Preferably, the vaccine contains adjuvants such as aluminum hydroxide and/or CpG-containing oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) in a pharmaceutically acceptable diluent, preferably a complex adjuvant of aluminum hydroxide and CpG-ODN in phosphate-buffered saline (PBS). In this case, aluminum hydroxide is preferably used in an amount of 100 - 1000 μg per dose (at a concentration of 200 - 2000 μg/ml), and CpG-ODN in an amount of 1 - 100 μg per dose (at a concentration of 2-200 μg/ml), most preferably aluminum hydroxide in an amount of 500 μg per dose (at a concentration of 1000 μg/ml) and CpG-ODN in an amount of 10 μg per dose (at a concentration of 20 μg/ml).
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предложенная композиция вакцины содержит вирусный антиген в концентрации 30 мкг/мл в сочетании с гидроксидом алюминия в концентрации 1000 мкг/мл и CpG-ODN в концентрации 20 мкг/мл с доведением объема раствора фосфатно-солевым буфером (PBS) до 1 мл, и используется в дозе 0,5 мл на одно введение субъекту.In the most preferred embodiment of the invention, the proposed vaccine composition contains a viral antigen at a concentration of 30 μg/ml in combination with aluminum hydroxide at a concentration of 1000 μg/ml and CpG-ODN at a concentration of 20 μg/ml, adjusting the volume of the solution with phosphate-buffered saline (PBS) up to 1 ml, and is used at a dose of 0.5 ml per administration to the subject.
В расчете на одну дозу для введения субъекту, например, в дозе 0,5 мл на одно внутримышечное введение субъекту предложенная композиция вакцины содержит 15 мкг вирусного антигена; 500 мкг гидроксида алюминия; 10 мкг CpG-ODN и PBS до 0,5 мл.Per one dose for administration to a subject, for example, at a dose of 0.5 ml per intramuscular injection to a subject, the proposed vaccine composition contains 15 μg of viral antigen; 500 mcg aluminum hydroxide; 10 µg CpG-ODN and PBS to 0.5 ml.
Также указанный технический результат достигается за счет применения предложенной вакцины для индукции специфического иммунного ответа против инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2.Also, the specified technical result is achieved through the use of the proposed vaccine to induce a specific immune response against infection caused by the SARS-Cov-2 virus.
Способ применения предложенной вакцины для индукции специфического иммунного ответа против инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2, включает однократное или многократное введение нуждающемуся в этом субъекту вакцинной композиции в дозе, эффективной для лечения инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2.A method of using the proposed vaccine for inducing a specific immune response against an infection caused by the SARS-Cov-2 virus includes a single or multiple administration of a vaccine composition to a subject in need in a dose effective for treating an infection caused by the SARS-Cov-2 virus.
Предложенное применение вакцины обеспечивает индукцию устойчивого иммунного ответа против инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2, который позволяет предупредить развитие указанной инфекции или ослабить по меньшей мере один из ее симптомов. The proposed use of the vaccine ensures the induction of a stable immune response against infection caused by the SARS-Cov-2 virus, which allows preventing the development of this infection or reducing at least one of its symptoms.
Несмотря на то, что предпочтительным является стимуляция устойчивого иммунитета путем однократного или двукратного введения, для достижения требуемого эффекта возможно вводить дополнительные дозы с помощью такого же или отличающегося пути введения. Например, у детей для достижения достаточных уровней иммунитета могут потребоваться многократные введения дозы вакцины с определенными интервалами на протяжении всего детского возраста при необходимости поддержания достаточных уровней защиты против инфекции. Аналогично для взрослых, которые особенно восприимчивы к повторному возникновению или тяжелому протеканию коронавирусной инфекции, например, медицинские или социальные работники, пожилые и субъекты с хроническими заболеваниями, могут потребоваться множественные иммунизации для установления и/или поддержания защитных иммунных ответов. Уровни индуцированного иммунитета возможно отслеживать, например, путем измерения количеств нейтрализующих секреторных и сывороточных антител, и при необходимости производят коррекцию дозировок или повторяют вакцинации для вызова или поддержания требуемых уровней защиты от инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2.Although it is preferred to stimulate sustained immunity by a single or double dose, additional doses may be administered by the same or a different route of administration to achieve the desired effect. For example, in children, achieving sufficient levels of immunity may require multiple doses of the vaccine at regular intervals throughout childhood while maintaining sufficient levels of protection against infection. Similarly, for adults who are particularly susceptible to re-emergence or severe coronavirus infection, such as health or social care workers, the elderly and those with chronic diseases, multiple immunizations may be required to establish and/or maintain protective immune responses. Levels of induced immunity may be monitored, for example, by measuring levels of neutralizing secretory and serum antibodies, and dosage adjustments or repeat vaccinations may be made as necessary to induce or maintain required levels of protection against SARS-Cov-2 virus infection.
Предложенное применение вакцины заключается в однократном или многократном введении, предпочтительно двух- или трехкратном введении дозы вакцины для индукции устойчивого иммунитета, достаточного для предупреждения развития указанной инфекции или ослабления по меньшей мере одного из ее симптомов.The proposed use of the vaccine consists of a single or multiple administration, preferably two or three times, dose of the vaccine to induce durable immunity sufficient to prevent the development of the infection or reduce at least one of its symptoms.
Вакцинные составы можно вводить на основе схемы многократного введения, например, осуществляя первичное введение вакцинной композиции с последующими бустерными введениями. Повторную дозу композиции вводят в пределах от двух недель до одного года, предпочтительно от двух недель до шести месяцев, наиболее предпочтительно от двух до трех недель после первичного введения. При необходимости после второй дозы можно вводить третью и последующие дозы с интервалом от трех недель до трех лет, наиболее предпочтительно от трех недель до одного года после первичного введения.Vaccine compositions can be administered on a multiple-dose schedule, for example, by administering a primary administration of the vaccine composition followed by booster administrations. A repeat dose of the composition is administered within a range of two weeks to one year, preferably two weeks to six months, most preferably two to three weeks after the initial administration. If necessary, after the second dose, a third and subsequent doses may be administered at intervals of three weeks to three years, most preferably three weeks to one year after the initial administration.
Способ профилактики или лечения инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2, может предусматривать проведение комбинированной терапии, например, использование предложенной вакцинной композиции совместно с другими активными агентами, например, иммуногенными композициями и/или противовирусными препаратами.A method for preventing or treating an infection caused by the SARS-Cov-2 virus may involve combination therapy, for example, using the proposed vaccine composition together with other active agents, for example, immunogenic compositions and/or antiviral drugs.
Для получения вакцины согласно настоящему документу используют уникальный штамм nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, который выделен из биопробы от больного в ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России и депонирован в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339.To obtain the vaccine according to this document, a unique strain nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 of the SARS-Cov-2 virus is used, which is isolated from a biosample from a patient at the Federal State Budgetary Institution “48 Central Research Institute” of the Russian Ministry of Defense and deposited in a specialized collection of reference cultures of strains II -IV pathogenicity groups (arboviruses and others) FSBI “48 Central Research Institute” of the Russian Ministry of Defense under registration No. 1339.
Способ получения вакцины против инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2, включает культивирования указанного штамма возбудителя COVID-19 в монослое клеток Vero с последующей инактивацией вируса, очисткой вирусного антигена и дополнением состава вакцины фармацевтически приемлемыми эксципиентами, предпочтительно комплексным адъювантом и фосфатно-солевым буферным раствором с получением, таким образом, вакцины против указанной инфекции.A method of obtaining a vaccine against infection caused by the SARS-Cov-2 virus involves cultivating the specified strain of the COVID-19 pathogen in a monolayer of Vero cells, followed by inactivation of the virus, purification of the viral antigen and addition of the vaccine composition with pharmaceutically acceptable excipients, preferably a complex adjuvant and phosphate-buffered saline solution, thereby obtaining a vaccine against said infection.
В соответствии с настоящим изобретением, термин «очистка вирусного антигена» означает основные способы очистки или основные стадии очистки, такие способы очистки, как хроматография или ультрафильтрация/диафильтрация, при необходимости могут быть использованы различные методы концентрирования и доочистки, например, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (периодическое центрифугирование). Используемой хроматографией может быть ионообменная хроматография, например, анионобменная или катионобменная хроматография, мультимодальная хроматография (хроматография на мультимодальных матрицах), хроматография гидрофобного взаимодействия, комбинированная хроматография, псевдоаффинная хроматография, аффинная хроматография, жидкостно-жидкостная хроматография и тому подобное. In accordance with the present invention, the term "purification of viral antigen" means the main purification methods or main purification steps, purification methods such as chromatography or ultrafiltration/diafiltration, if necessary, various concentration and purification methods can be used, for example, sucrose density gradient centrifugation (batch centrifugation). The chromatography used may be ion exchange chromatography, for example, anion exchange or cation exchange chromatography, multimodal chromatography (chromatography on multimodal matrices), hydrophobic interaction chromatography, combination chromatography, pseudoaffinity chromatography, affinity chromatography, liquid-liquid chromatography and the like.
В использованном в настоящем документе значении термин «ультрафильтрация» или «UF» означает метод, в соответствии с которым раствор или суспензию фильтруют через полупроницаемую мембрану, которая задерживает макромолекулы, пропуская растворитель и мелкие молекулы растворенного вещества. Ультрафильтрация может быть использована для увеличения концентрации макромолекул в растворе или суспензии.As used herein, the term "ultrafiltration" or "UF" means a method in which a solution or suspension is filtered through a semi-permeable membrane that retains macromolecules while allowing solvent and small solute molecules to pass through. Ultrafiltration can be used to increase the concentration of macromolecules in a solution or suspension.
В использованном в настоящем документе термин «диафильтрация» или «DF» означает специальный класс фильтрации, в соответствии с которым задержанное вещество разбавляется растворителем и повторно фильтруется, в результате чего уменьшается концентрация растворимых компонентов проникающего вещества. Диафильтрация может вызывать или не вызывать увеличения концентрации задержанных компонентов, включая, например, белки. Например, в случае диафильтрации в непрерывном режиме растворитель постоянно добавляется к задержанному веществу со скоростью образования фильтрата. В таком случае объем задержанного вещества и концентрация удерживаемых компонентов не изменяется во время данного процесса. С другой стороны, в случае диафильтрации в периодическом режиме или диафильтрации с последующим разбавлением за стадией ультрафильтрации следует добавление растворителя со стороны задержанного вещества; если объем растворителя, добавляемого со стороны задержанного вещества, не равен или превышает объем образованного фильтрата, то концентрация удерживаемых компонентов увеличивается. Диафильтрация может быть использована для изменения значения рН, ионной силы, состава соли, состава буфера или других свойств раствора или суспензии макромолекул.As used herein, the term "diafiltration" or "DF" refers to a special class of filtration in which the retained substance is diluted with a solvent and filtered again, thereby reducing the concentration of the soluble components of the permeate. Diafiltration may or may not cause an increase in the concentration of retained components, including, for example, proteins. For example, in continuous diafiltration, solvent is continuously added to the retained material at the rate of filtrate formation. In this case, the volume of the retained substance and the concentration of the retained components do not change during this process. On the other hand, in the case of batch diafiltration or diafiltration followed by dilution, the ultrafiltration step is followed by the addition of solvent on the retained side; if the volume of solvent added from the retained substance side is not equal to or greater than the volume of the formed filtrate, then the concentration of retained components increases. Diafiltration can be used to change the pH value, ionic strength, salt composition, buffer composition, or other properties of a solution or suspension of macromolecules.
Термин «ультрафильтрация/диафильтрация» или «UF/DF» означает любой процесс, метод или комбинацию методов последовательного или одновременного выполнения ультрафильтрации и/или диафильтрации.The term "ultrafiltration/diafiltration" or "UF/DF" means any process, method or combination of methods of performing ultrafiltration and/or diafiltration sequentially or simultaneously.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ предусматривает проведение очистки вирусного антигена с использованием анионообменной и мультимодальной хроматографии с дополнительной ультрафильтрацией/диафильтрацией. Наиболее предпочтительно очистку вирусного антигена осуществляют путем последовательного проведения начального этапа ультрафильтрации/диафильтрации, анионообменной и мультимодальной хроматографии и заключительного этапа ультрафильтрации/диафильтрации.In a preferred embodiment of the invention, the method involves purifying the viral antigen using anion exchange and multimodal chromatography with additional ultrafiltration/diafiltration. Most preferably, viral antigen purification is accomplished by sequentially performing an initial ultrafiltration/diafiltration step, anion exchange and multimodal chromatography, and a final ultrafiltration/diafiltration step.
Полученную вакцину расфасовывают во флаконы для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде. В жидком виде препарат вакцины предпочтительно представляет собой суспензию для внутримышечного введения и имеет следующее соотношение компонентов: The resulting vaccine is packaged in vials for freeze-drying or sale in liquid form. In liquid form, the vaccine preparation is preferably a suspension for intramuscular administration and has the following ratio of components:
- инактивированный очищенный вирусный антиген штамма «nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021» в количестве 3 - 60 мкг на одну дозу (в концентрации 6-120 мкг/мл), наиболее предпочтительно в количестве 15 мкг на одну дозу (в концентрации 30 мкг/мл);- inactivated purified viral antigen of the strain “nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021” in an amount of 3 - 60 μg per dose (at a concentration of 6-120 μg/ml), most preferably in an amount of 15 μg per dose (in concentration 30 µg/ml);
- гидроксид алюминия в количестве 100 - 1000 мкг на одну дозу (в концентрации 200 - 2000 мкг/мл), предпочтительно в количестве 500 мкг на одну дозу (в концентрации 1000 мкг/мл);- aluminum hydroxide in an amount of 100 - 1000 μg per dose (at a concentration of 200 - 2000 μg/ml), preferably in an amount of 500 μg per dose (at a concentration of 1000 μg/ml);
- CpG-ODN в количестве 1 - 100 мкг на одну дозу (в концентрации 2-200 мкг/мл), наиболее предпочтительно в количестве 10 мкг на одну дозу (в концентрации 20 мкг/мл);- CpG-ODN in an amount of 1 - 100 μg per dose (at a concentration of 2-200 μg/ml), most preferably in an amount of 10 μg per dose (at a concentration of 20 μg/ml);
- PBS (натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, натрия хлорид, вода для инъекций) - остальное.- PBS (sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride, water for injection) - the rest.
Инактивированный очищенный вирусный антиген штамма «nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021» представляет собой суспензию, содержащую очищенные цельновирионные капсиды возбудителя COVID-19, которые полностью сохранили свою белковую и антигенную структуру, но в результате разрушения генетического аппарата потерявшие вирулентность и способность к размножению.The inactivated purified viral antigen of the strain “nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021” is a suspension containing purified whole-virion capsids of the COVID-19 pathogen, which have completely retained their protein and antigenic structure, but as a result of the destruction of the genetic apparatus have lost their virulence and ability to reproduction.
Для приготовления сухого препарата жидкую вакцину высушивают путем вакуумной лиофилизации. Готовую вакцину контролируют на физические свойства, стерильность, иммуногенность, безвредность, авирулентность и т.п.To prepare a dry preparation, the liquid vaccine is dried by vacuum lyophilization. The finished vaccine is controlled for physical properties, sterility, immunogenicity, harmlessness, avirulence, etc.
Вакцину, содержащую инактивированный вирусный материал возбудителя COVID-19, хранят при температуре 2-8°.The vaccine containing inactivated viral material of the COVID-19 pathogen is stored at a temperature of 2-8°.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Перед тем как описать конкретные примеры осуществления изобретения, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами, используемыми средствами и методами, продуктами или комбинациями, поскольку такие способы, средства и методы, продукты или комбинации, без сомнения, могут варьироваться. Также следует отметить, что терминология, используемая в настоящей заявке, не подразумевается как ограничивающая, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только предлагаемой формулой изобретения.Before describing specific embodiments of the invention, it should be noted that the present invention is not limited to the specific methods, means and methods, products or combinations used, since such methods, means and methods, products or combinations, of course, may vary. It should also be noted that the terminology used in this application is not intended to be limiting, since the scope of the present invention will be limited only by the proposed claims.
Пример 1. Получение инактивированного вирусного антигена, входящего в состав предложенной композиции вакцины против инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2Example 1. Preparation of an inactivated viral antigen included in the proposed composition of a vaccine against infection caused by the SARS-Cov-2 virus
1.1. Получение культуры клеток1.1. Preparation of cell culture
В данном примере показано использование клеток линии Vero (В) и специально подобранные для этого условия, но могут быть использованы другие клетки млекопитающих, подходящие для культивирования коронавирусов, например, линии клеток Vero, Vero С1008, Vero E6, Vero-TMPRSS2, GMK, СПЭВ, MDCK, COS, ВНК-21 и другие подходящие условия (см. Руководство по вирусологии: вирусы и вирусные инфекции человека и животных / ред. Д. К. Львов, Москва: Медицинское информационное агентство, 2013. - 1197 с.;. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник в 2-х т. / ред. В. В. Зверев, М.Н. Бойченко, Москва, ГЭОТАР-Медиа, 2014. - Т. 1 - 447 с.; Т. 2 - 477 с.; Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. А. А. Воробьева, 2-е изд., испр. и доп. - Москва: МИА, 2006. - 702 с.).This example shows the use of Vero (B) cell lines and specially selected conditions for this, but other mammalian cells suitable for cultivating coronaviruses can be used, for example, Vero cell lines, Vero C1008, Vero E6, Vero-TMPRSS2, GMK, SPEV , MDCK, COS, VNK-21 and other suitable conditions (see Guide to Virology: Viruses and Viral Infections of Humans and Animals / ed. D. K. Lvov, Moscow: Medical Information Agency, 2013. - 1197 pp.; Medical microbiology, virology and immunology: textbook in 2 volumes / edited by V. V. Zverev, M. N. Boychenko, Moscow, GEOTAR-Media, 2014. - T. 1 - 447 pp.; T. 2 - 477 pp.; Medical microbiology, virology and immunology: textbook / edited by A. A. Vorobyov, 2nd ed., revised and supplemented - Moscow: MIA, 2006. - 702 pp.).
Получение монослойной культуры клеток линии Vero (В), включает в себя следующие стадии: расконсервация культуры клеток, получение посевной культуры, пересев культуры клеток в пластиковый роллерный флакон.Obtaining a monolayer cell culture of the Vero (B) line includes the following stages: re-preservation of the cell culture, obtaining a seed culture, reseeding the cell culture into a plastic roller bottle.
В качестве исходного объекта используют культуру клеток Vero (В), хранящуюся в ампулах при температуре минус 196°С (жидкий азот), в виде взвеси замороженных клеток в фетальной телячьей сыворотке (ФТС) с добавлением консерванта - ДМСО. As the starting object, a Vero (B) cell culture is used, stored in ampoules at a temperature of minus 196°C (liquid nitrogen), in the form of a suspension of frozen cells in fetal calf serum (FCS) with the addition of a preservative - DMSO.
1.1.1. Для разведения оттаянной суспензии клеток применяют питательную среду 199 с солями Эрла, дополненную ФТС (Gibco), 200мМ раствором глутамина и раствором гентамицина сульфата. Ампулу с замороженным посевным материалом клеток Vero (В) оттаивают на водяной бане при температуре от 35 до 37°С пока вся суспензия клеток не перейдет в жидкую фазу. После этого ампулу вскрывают в асептических условиях в ламинарном шкафу и переносят ее содержимое в пластиковую пробирку объемом 50 см3 с постепенным добавлением питательной среды. Не позднее 20 минут после разведения из пробирки с расконсервированной суспензией клеток отбирают пробу, в которой определяют долю жизнеспособных клеток и микробиологическую чистоту методом микроскопии. Расконсервированная культура должна быть микробиологически чистой и содержать не менее 85% жизнеспособных клеток.1.1.1. To dilute the thawed cell suspension, use nutrient medium 199 with Earle's salts, supplemented with FBS (Gibco), 200 mM glutamine solution and gentamicin sulfate solution. The ampoule with frozen seed material of Vero cells (B) is thawed in a water bath at a temperature of 35 to 37 ° C until the entire cell suspension passes into the liquid phase. After this, the ampoule is opened under aseptic conditions in a laminar flow hood and its contents are transferred into a plastic tube with a volume of 50 cm3 with the gradual addition of a nutrient medium. No later than 20 minutes after dilution, a sample is taken from a test tube with a re-preserved cell suspension, in which the proportion of viable cells and microbiological purity are determined by microscopy. The re-preserved culture must be microbiologically pure and contain at least 85% viable cells.
1.1.2. Получение посевной культуры1.1.2. Obtaining seed culture
Для выращивания клеток в пластиковых флаконах и роллерах также применяют среду 199 с солями Эрла, дополненную фетальной телячьей сывороткой (ФТС) (Gibco), 200 мМ раствором глутамина и раствором гентамицина сульфата. Расконсервированную суспензию клеток переносят в пластиковый флакон с площадью рабочей поверхности 75 см2 в посевной концентрации 4,0*104 кл*см2. Флаконы в горизонтальном положении помещают в СО2 - инкубатор и культивируют 4 суток при температуре около 37 °C с заменой питательной среды на свежую через 24 часа после внесения суспензии клеток в пластиковый флакон. Состояние формирующегося монослоя контролируют путем его просмотра под микроскопом. В течение пассажа должен сформироваться ровный, сплошной монослой без признаков дегенерации клеток.To grow cells in plastic flasks and rollers, medium 199 with Earle's salts supplemented with fetal bovine serum (FCS) (Gibco), 200 mM glutamine solution and gentamicin sulfate solution is also used. The unpreserved cell suspension is transferred into a plastic bottle with a working surface area of 75 cm2 in a seed concentration of 4.0*10 4 cells* cm2 . The bottles are placed in a horizontal position in a CO2 incubator and cultured for 4 days at a temperature of about 37 °C, replacing the nutrient medium with a fresh one 24 hours after adding the cell suspension to a plastic bottle. The state of the developing monolayer is monitored by viewing it under a microscope. During the passage, an even, continuous monolayer without signs of cell degeneration should form.
По окончании пассажа сформировавшийся монослой клеток переводят в суспендированное состояние с использованием стерильного раствора Версена и раствора химопсина. В суспензии определяют количество клеток и долю жизнеспособных. Конечная концентрация клеток должна быть не менее 0,9*106 кл*см3. Суспензию в посевной концентрации не менее 4*104 кл*см2 переносят в пластиковый матрас (175 см2) и доводят объем среды до 75 см3. После этого начинают второй пассаж выращивания монослойной культуры с длительностью культивирования 3 суток.At the end of the passage, the formed monolayer of cells is transferred to a suspended state using a sterile Versene solution and a chymopsin solution. The number of cells and the proportion of viable cells in the suspension are determined. The final cell concentration must be at least 0.9*10 6 cells*cm 3 . The suspension in a seed concentration of at least 4 * 10 4 cells * cm 2 is transferred to a plastic mattress (175 cm 2 ) and the volume of the medium is adjusted to 75 cm 3 . After this, the second passage of growing a monolayer culture begins with a cultivation duration of 3 days.
1.1.3. Пересев культуры клеток в пластиковый роллерный флакон1.1.3. Reseeding the cell culture into a plastic roller bottle
Выращивание монослойной культуры клеток проводят в пластиковых роллерных флаконах с площадью рабочей поверхности 800 см2 и 4250 см2, соответственно, в которые путем последовательного пересева переносят клетки с предыдущей стадии в посевной концентрации не менее 4*104 кл*см2. Сначала проводят культивирование в течение 3 суток в роллерных флаконах с площадью рабочей поверхности 800 см2, которые в горизонтальном положении помещают на роллерную установку в СО2 - инкубатор при температуре около 37°C со скоростью вращения - 0,4 оборота в минуту. Growing a monolayer cell culture is carried out in plastic roller bottles with a working surface area of 800 cm 2 and 4250 cm 2 , respectively, into which cells from the previous stage are transferred by sequential subculture in a seed concentration of at least 4 * 10 4 cells * cm 2 . First, cultivation is carried out for 3 days in roller bottles with a working surface area of 800 cm 2 , which are placed in a horizontal position on a roller unit in a CO 2 incubator at a temperature of about 37°C with a rotation speed of 0.4 revolutions per minute.
Состояние формирующегося монослоя контролируют путем его просмотра под микроскопом. В течение пассажа должен сформироваться ровный, сплошной монослой без признаков дегенерации клеток. Микробиологическую чистоту контролируют методом микроскопии.The state of the developing monolayer is monitored by viewing it under a microscope. During the passage, an even, continuous monolayer should form without signs of cell degeneration. Microbiological purity is controlled by microscopy.
Затем осуществляют пересев клеток в посевной концентрации 1,4*104кл.*см2 - 1,6*104 кл.*см2 на ребристые роллеры с площадью поверхности 4250 см2 и инкубируют 1 сутки.Then the cells are reseeded at a seeding concentration of 1.4 * 10 4 cells * cm 2 - 1.6 * 10 4 cells * cm 2 on ribbed rollers with a surface area of 4250 cm 2 and incubated for 1 day.
1.2. Получение биомассы вируса1.2. Obtaining virus biomass
Получение биомассы вируса включает в себя следующие стадии: получение биомассы вируса, оценка качества полученной биомассы и инактивация биомассы вируса.Obtaining virus biomass includes the following stages: obtaining virus biomass, assessing the quality of the resulting biomass and inactivating the virus biomass.
1.2.1. Для получения биомассы используют штамм nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-CoV-2 относящийся к генетической линии В.1.617.3 (Депонирован в Специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, инвентарный номер штамма 1339). 1.2.1. To obtain biomass, the nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 strain of the SARS-CoV-2 virus belonging to the genetic line B.1.617.3 is used (Deposited in the Specialized Collection of Reference Cultures of Strains of II-IV Pathogenicity Groups (arboviruses and others) of the Federal State Budgetary Institution "48 Central Research Institute" of the Russian Ministry of Defense, inventory number of strain 1339).
Рабочую (посевную) культуру вируса получают культивированием на суточном монослое клеток Vero (В) в пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2. При инфицирующей дозе 0,1 БОЕ*кл-1, время культивирования составляет 24 часа (контролируется по наступлению цитопатического эффекта). Биологическая активность вируса SARS-CoV-2 в полученной биомассе составляет не менее 6,0 lg БОЕ*мл-1, при отсутствии посторонней микрофлоры.A working (seed) culture of the virus is obtained by cultivating a daily monolayer of Vero (B) cells in plastic bottles with a surface area of 25 cm 2 . At an infectious dose of 0.1 PFU*cell -1 , the cultivation time is 24 hours (controlled by the onset of a cytopathic effect). The biological activity of the SARS-CoV-2 virus in the resulting biomass is at least 6.0 lg PFU*ml -1 , in the absence of foreign microflora.
Затем для получения биомассы вируса используют ребристые роллеры с площадью поверхности 4250 см2 с монослоем клеток Vero (В) возрастом 1 сутки. Для инфицирования монослоя применяют поддерживающую среду 199 с солями Хенкса, дополненную ФТС (Gibco), 200 мМ раствором глутамина и раствором Antibiotic-antimecotic (100х) (Gibco). Объем заполнения роллера составляет 600 мл, непосредственно в среду добавляют культуру вируса с инфицирующей дозой 0,1 БОЕ*кл-1. С роллеров с суточным монослоем сливают ростовую среду и заливают поддерживающую с культурой вируса, культивируют при температуре около 37 °C и скорости вращения - 0,4 оборота в минуту в течение приблизительно 50 часов (контролируется по наступлению цитопатического эффекта путем микроскопии). По достижении активности вируса не менее 6,0 lg БОЕ*мл-1 извлекают культуральную жидкость, содержащую биомассу вируса SARS-CoV-2 в концентрации не менее 108 вирусных частиц/мл.Then, to obtain virus biomass, ribbed rollers with a surface area of 4250 cm 2 are used with a monolayer of Vero (B) cells 1 day old. To infect the monolayer, maintenance medium 199 with Hanks salts supplemented with FBS (Gibco), 200 mM glutamine solution and Antibiotic-antimecotic solution (100x) (Gibco) is used. The filling volume of the roller is 600 ml; a virus culture with an infectious dose of 0.1 PFU*cell -1 is added directly to the medium. The growth medium is drained from rollers with a daily monolayer and the supporting medium is filled with a virus culture, cultivated at a temperature of about 37 °C and a rotation speed of 0.4 revolutions per minute for approximately 50 hours (monitored by the onset of a cytopathic effect by microscopy). Once the virus activity reaches at least 6.0 lg PFU*ml -1, a culture liquid containing biomass of the SARS-CoV-2 virus in a concentration of at least 10 8 viral particles/ml is extracted.
Далее полученную биомассу вируса с роллеров сливают в отдельную ёмкость, отбирают пробы для контроля качества и передают на стадию инактивации.Next, the resulting biomass of the virus from the rollers is poured into a separate container, samples are taken for quality control and transferred to the inactivation stage.
1.2.2. Оценка качества полученной биомассы1.2.2. Assessment of the quality of the obtained biomass
Определение биологической активности проводят по образованию негативных колоний под агаровым покрытием на культуре клеток Vero С1008. Из отобранной после завершения культивирования пробы готовят последовательные десятикратные разведения на стерильном солевом растворе Хенкса с 2% ФТС и антибиотиками. Три наивысших разведения используют для инфицирования монослоя культуры клеток Vero С1008.Determination of biological activity is carried out by the formation of negative colonies under an agar coating on Vero C1008 cell culture. From the sample taken after completion of cultivation, successive tenfold dilutions are prepared in sterile Hanks' saline solution with 2% FBS and antibiotics. The three highest dilutions are used to infect a monolayer of Vero C1008 cell culture.
Флаконы с односуточным монослоем культуры клеток Vero С1008, отобранные для опыта, извлекают из термостата и удаляют из них ростовую среду. В каждый флакон вносят по 0,5 мл соответствующего разведения, расчетная концентрация вируса в которых составляет 1,0; 10,0; 100,0 БОЕ*мл-1, и оставляют в термостате при температуре около 37° С для адсорбции вируса. Через один час в каждый флакон вносят 10 мл первичного агарового покрытия и продолжают инкубирование. На 3 сутки инкубирования с целью окрашивания во флаконы добавляют вторичное агаровое покрытие, содержащее нейтральный красный. Учет результатов проводят через 1 сутки инкубирования при той же температуре.Vials with a one-day monolayer of Vero C1008 cell culture, selected for the experiment, are removed from the thermostat and the growth medium is removed from them. Add 0.5 ml of the appropriate dilution to each vial, the calculated concentration of the virus in which is 1.0; 10.0; 100.0 PFU*ml-1, and left in a thermostat at a temperature of about 37° C for virus adsorption. After one hour, 10 ml of primary agar coating is added to each bottle and incubation is continued. On the 3rd day of incubation, for the purpose of staining, a secondary agar coating containing neutral red is added to the vials. The results are recorded after 1 day of incubation at the same temperature.
Определение микробиологической чистоты проводят путём посева на тиогликолевую среду, для этого в 3 стеклянные пробирки с жидкой тиогликолевой средой вносят пробу биомассы вируса, отобранную после завершения культивирования, после инкубируют при температуре около 37° С. Заключение о микробиологической чистоте делают при отсутствии роста в пробирках с тиогликолевой средой спустя 7 суток.Determination of microbiological purity is carried out by inoculation on a thioglycollate medium; for this, a sample of the virus biomass taken after completion of cultivation is added to 3 glass test tubes with a liquid thioglycollate medium, then incubated at a temperature of about 37 ° C. A conclusion about microbiological purity is made if there is no growth in test tubes with thioglycollate medium after 7 days.
1.2.3. Инактивация биомассы вируса1.2.3. Inactivation of virus biomass
Разводят бета-пропиолактон физиологическим раствором в соотношении 1:10. К биомассе вируса SARS-CoV-2 прибавляют пипеткой разведенный бета-пропиолактон до конечной инактивирующей концентрации 0,0167 % (разведение 1:6000). Процесс инактивации проводят при перемешивании биомассы вируса SARS-CoV-2 в ёмкости при температуре от 20 до 25 °C в течение 4 часов и далее 2 часа при температуре 37 °C. Инактивированную биомассу вируса SARS-CoV-2 для передачи на стадию очистки хранят при температуре от 2 до 6 °C в условиях, исключающих случайное вскрытие емкости.Beta-propiolactone is diluted with saline solution in a ratio of 1:10. Diluted beta-propiolactone is added with a pipette to the biomass of the SARS-CoV-2 virus to a final inactivating concentration of 0.0167% (dilution 1:6000). The inactivation process is carried out by mixing the biomass of the SARS-CoV-2 virus in a container at a temperature of 20 to 25 °C for 4 hours and then 2 hours at a temperature of 37 °C. The inactivated biomass of the SARS-CoV-2 virus for transfer to the purification stage is stored at a temperature of 2 to 6 °C under conditions that prevent accidental opening of the container.
Пример 2 Очистка инактивированного вирусного антигена, входящего в состав предложенной композиции вакцины против инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2Example 2 Purification of an inactivated viral antigen included in the proposed composition of a vaccine against infection caused by the SARS-Cov-2 virus
В данном примере показано использование для очистки вирусного антигена последовательного проведения начального этапа ультрафильтрации/диафильтрации, анионообменной и мультимодальной хроматографии и заключительного этапа ультрафильтрации/диафильтрации, однако очистка может быть также проведена с использованием иной последовательности стадий, иных режимов, реагентов, материалов и оборудования (см., Комиссаров А.В., Алешина Ю.А. и другие, Применение ультрафильтрации для концентрирования и очистки антигенов, Проблемы особо опасных инфекций, вып. 1, 2015, с.79-84; международная заявка WO 2013/010797, опубликованная 24.01.2013; патент ЕАПВ EA001414B1, опубликованный 26.02.2001).This example shows the use of a sequential initial step of ultrafiltration/diafiltration, anion exchange and multimodal chromatography and a final step of ultrafiltration/diafiltration to purify a viral antigen, but purification can also be carried out using a different sequence of stages, other modes, reagents, materials and equipment (see ., Komissarov A.V., Aleshina Yu.A. and others, The use of ultrafiltration for the concentration and purification of antigens, Problems of especially dangerous infections, issue 1, 2015, pp. 79-84; international application WO 2013/010797, published 24.01 .2013; EAPO patent EA001414B1, published 02.26.2001).
2.1. Стадия ультрафильтрации/диафильтрации 1 (UF/DF 1)2.1. Ultrafiltration/diafiltration stage 1 (UF/DF 1)
Материал исходной инактивированной вирусосодержащей жидкости (ВСЖ) перед проведением процесса фильтруют при помощи системы последовательно установленных фильтра Opticap и стерилизующего фильтра. Полученный материал ВСЖ концентрируют на кассете SARTOCON Slice Cassette (Sartorius) с отсечением 300 кДа суммарно в 25 раз. После завершения концентрирования концентрат диализуют против раствора A (15 мМ Na-P, 600 мМ натрия хлорида, 0,05% полисорбата 80, pH 7,5±0,1, с удельной электропроводностью (УЭП) 55,5±3,5 мСм/см) в объёме 10 диафильтрационных объемов (DV). Следующим шагом является диализ концентрата против раствора B (15 мМ Na-P, 600 мМ натрия хлорида, pH 7,5±0,1, УЭП 55,5±3,5 мСм/см) в объёме 10 DV. Финальным этапом UF/DF стадии является переконцентрирование до 70% от объёма ретентата и вытеснением из кассеты раствором B до 100% объёма ретентата. Таким образом исключаются потери полупродукта в кассете для тангенциальной фильтрации. По завершению стадии полупродукт фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С. Выход составляет 80%. На данной стадии: происходит концентрирование материала, удаляются все низкомолекулярные примеси (менее 300 кДа), из ВСЖ удаляется краситель (за счет диализа буфером, содержащим полисорбат) и материал подготавливается к последующим стадиям хроматографической очистки.The material of the initial inactivated virus-containing liquid (VCL) is filtered before the process using a system of sequentially installed Opticap filters and a sterilizing filter. The resulting VSG material is concentrated on a SARTOCON Slice Cassette (Sartorius) with a cutoff of 300 kDa by a total of 25 times. After concentration is complete, the concentrate is dialyzed against solution A (15 mM Na-P, 600 mM sodium chloride, 0.05% polysorbate 80, pH 7.5 ± 0.1, with specific electrical conductivity (SEC) 55.5 ± 3.5 mS /cm) in a volume of 10 diafiltration volumes (DV). The next step is to dialyze the concentrate against solution B (15 mM Na-P, 600 mM sodium chloride, pH 7.5 ± 0.1, SEP 55.5 ± 3.5 mS/cm) in a volume of 10 DV. The final stage of the UF/DF stage is reconcentration to 70% of the retentate volume and displacement of up to 100% of the retentate volume from the cassette with solution B. This eliminates the loss of intermediate product in the tangential filtration cassette. At the end of the stage, the intermediate product is filtered through a filter with a pore size of 0.22 microns and stored at a temperature of 2-8°C. The yield is 80%. At this stage: the material is concentrated, all low-molecular impurities (less than 300 kDa) are removed, the dye is removed from the VSG (due to dialysis with a buffer containing polysorbate) and the material is prepared for the subsequent stages of chromatographic purification.
2.2. Анионообменная хроматография 2.2. Anion exchange chromatography
Стерильный полупродукт после стадии UF/DF 1 проверяют на значение pH и УЭП, которое должно находиться в диапазоне 7,5±0,1 и 53-57 мСм/см соответственно. УЭП титруют 1 М раствором хлорида натрия. Колонку XK 26 (GE Healthcare) с сорбентом Q Sepharose FF (GE Healthcare) санитизируют 1 М раствором гидроксида натрия и перезаряжают сорбент 1 М натрия хлоридом. Далее через колонку с сорбентом пропускают уравновешивающий буфер С (15 мМ Na-P, 600 мМ натрия хлорида, pH 7,5±0,1, УЭП 55,5±3,5 мСм/см) не менее 5-ти колоночных объёмов со скоростью 170 см/ч. Следующем шагом после предварительно уравновешенного сорбента является нанесение подготовленного материала со скоростью 170 см/ч, при этом время контакта с сорбентом составляет около 10 минут. Сбор фракции начинают сразу же после увеличения оптической плотности более 2 мОЕ (единиц оптической плотности). По окончании нанесения сорбент промывают уравновешивающим буферным раствором С со скоростью 170 см/ч до снижения оптической плотности менее 2 мОЕ, на этом этап сбора целевой фракции завершен. Полупродукт с анионообменной стадии хроматографии стерильно фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С. Данная стадия проводится в режиме фильтрации, что позволяет провести очистку материала от свободной ДНК, которая задерживается на сорбенте.The sterile intermediate after stage UF/DF 1 is checked for pH and SEP, which should be in the range of 7.5±0.1 and 53-57 mS/cm, respectively. UEP is titrated with 1 M sodium chloride solution. An XK 26 column (GE Healthcare) with Q Sepharose FF sorbent (GE Healthcare) is sanitized with 1 M sodium hydroxide solution and the sorbent is recharged with 1 M sodium chloride. Next, equilibrating buffer C (15 mM Na-P, 600 mM sodium chloride, pH 7.5 ± 0.1, SEP 55.5 ± 3.5 mS/cm) is passed through the column with the sorbent. speed 170 cm/h. The next step after the pre-equilibrated sorbent is the application of the prepared material at a speed of 170 cm/h, with a contact time of about 10 minutes with the sorbent. Fraction collection begins immediately after the optical density increases to more than 2 mOU (optical density units). Upon completion of application, the sorbent is washed with equilibrating buffer solution C at a speed of 170 cm/h until the optical density decreases to less than 2 mFU, at which point the collection of the target fraction is completed. The intermediate product from the anion exchange stage of chromatography is sterilely filtered through a filter with a pore size of 0.22 microns and stored at a temperature of 2-8°C. This stage is carried out in filtration mode, which allows the material to be purified from free DNA that is retained on the sorbent.
2.3. Мультимодальная хроматография2.3. Multimodal chromatography
Стерильный полупродукт после стадии анионообменной хроматографии проверяют на значение pH и УЭП, которое должно находиться в диапазоне 7,5±0,1 и 54-57 мСм/см соответственно. При необходимости УЭП титруют при помощи раствора 1 М хлорида натрия. Колонку ECO PLUSE TAC 35*500 (YMC) с сорбентом Capto Core 700 (Cytiva) санитизируют 0,5 М гидроксидом натрия с последующим пропусканием через сорбент 30% изопропилового спирта. Далее через колонку с сорбентом пропускают уравновешивающий буфер D (15 мМ натрия фосфата, 600 мМ натрия хлорида, pH 7,50±0,1, УЭП 55,5±3,5 мСм/см) не менее 5-ти колоночных объёмов со скоростью 124 см/ч. Следующим шагом, после уравновешивания сорбента, является нанесение подготовленного материала со скоростью 124 см/ч, при этом время контакта с сорбентом должно составлять не менее 10 минут. Сбор фракции начинают сразу же после увеличения оптической плотности более 2 мОЕ. По окончании нанесения сорбент промывают уравновешивающим буферным раствором D со скоростью 124 см/ч до снижения оптической плотности менее 2 мОЕ, на этом этап сбора целевой фракции завершен. Полупродукт с мультимодальной стадии хроматографии стерильно фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С. На данной стадии происходит удаление обрывков S- и N-белков вирусной оболочки, что позволяет получить цельнокапсидный вирусный материал.The sterile intermediate after the anion exchange chromatography stage is checked for pH and SEP, which should be in the range of 7.5±0.1 and 54-57 mS/cm, respectively. If necessary, the UEP is titrated using a solution of 1 M sodium chloride. An ECO PLUSE TAC 35*500 (YMC) column with Capto Core 700 sorbent (Cytiva) is sanitized with 0.5 M sodium hydroxide, followed by passing 30% isopropyl alcohol through the sorbent. Next, equilibrating buffer D (15 mM sodium phosphate, 600 mM sodium chloride, pH 7.50±0.1, SEP 55.5±3.5 mS/cm) is passed through the column with the sorbent for at least 5 column volumes at speed 124 cm/h. The next step, after equilibrating the sorbent, is to apply the prepared material at a speed of 124 cm/h, while the contact time with the sorbent should be at least 10 minutes. Fraction collection begins immediately after the optical density increases to more than 2 mFU. Upon completion of application, the sorbent is washed with equilibrating buffer solution D at a speed of 124 cm/h until the optical density decreases to less than 2 mFU, at which point the collection of the target fraction is completed. The intermediate product from the multimodal chromatography stage is sterilely filtered through a filter with a pore size of 0.22 microns and stored at a temperature of 2-8°C. At this stage, fragments of the S- and N-proteins of the viral envelope are removed, which makes it possible to obtain whole-capsid viral material.
2.4. Стадия ультрафильтрации/диафильтрации 2 (UF/DF 2)2.4. Ultrafiltration/diafiltration stage 2 (UF/DF 2)
Фильтрат с предыдущей стадии, предварительно согретый до 18-25°, концентрируют в 2 раза. Затем материал диализуют против раствора E (15 мМ Na-P, 140 мМ натрия хлорида, pH 7,2±0,1 УЭП 15,0±2,0 мСм/см) в объёме 10 DV. Далее материал при необходимости концентрируют до объема равного 1/50 от начального объема входящей в процесс ВСЖ. Для вытеснения материала с кассеты Pellicon 2 MAXI (MERCK) активную фармацевтическую субстанцию (АФС) переконцентрируют до 70% от объёма ретентата и вытесняют из кассеты раствором Е до 100% объёма ретентата. Таким образом исключаются потери полупродукта в кассете для тангенциальной фильтрации. По завершению стадии полупродукт фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм с получением очищенного вирусного антигена в концентрации не менее 30 мкг/мл и хранят при температуре 2-8°С. На данной стадии корректируется концентрация антигена в АФС, а также проводится формуляция продукта в итоговый буфер хранения, который используют для получения готовых форм вакцинной композиции в Примере 3. The filtrate from the previous stage, pre-warmed to 18-25°, is concentrated 2 times. Then the material is dialyzed against solution E (15 mM Na-P, 140 mM sodium chloride, pH 7.2 ± 0.1 UEP 15.0 ± 2.0 mS/cm) in a volume of 10 DV. Next, if necessary, the material is concentrated to a volume equal to 1/50 of the initial volume of the VSL entering the process. To displace material from the Pellicon 2 MAXI (MERCK) cassette, the active pharmaceutical substance (API) is reconcentrated to 70% of the retentate volume and displaced from the cassette with solution E to 100% of the retentate volume. This eliminates the loss of intermediate product in the tangential filtration cassette. At the end of the stage, the intermediate product is filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm to obtain a purified viral antigen in a concentration of at least 30 μg/ml and stored at a temperature of 2-8 ° C. At this stage, the concentration of the antigen in the API is adjusted, and the product is formulated into the final storage buffer, which is used to obtain finished forms of the vaccine composition in Example 3.
Пример 3 Анализ полученного продукта и формулирование готовой вакцинной композицииExample 3 Analysis of the resulting product and formulation of the finished vaccine composition
3.1. Проводят аналитическую оценку полученного согласно Примеру 2 продукта 3.1. Conduct an analytical assessment of the product obtained according to Example 2
3.1.1. Методика «Количественное определение белка», основанная на методике ELISA с использованием моноклональных антител к шиповидному белку SARS-CoV-2 (CR3022, GTX01555, GeneTex). По данным SDS-PAGE АФС характеризовалась высокой чистотой продукта - более чем 96% и по данным SE-HPLC незначительным количеством агрегатов - менее 4%.3.1.1. “Protein Quantification” method based on the ELISA method using monoclonal antibodies to the SARS-CoV-2 spike protein (CR3022, GTX01555, GeneTex). According to SDS-PAGE data, the API was characterized by a high purity of the product - more than 96% and according to SE-HPLC data by an insignificant amount of aggregates - less than 4%.
3.1.2. Методика «Определение подлинности», основанная на методе ИФА. Продукт индуцировал образование специфических антител к коронавирусу SARS-CoV-2 при иммунизации мышей линии Balb/c. Выраженный иммунный ответ регистрировали при однократном и двукратном внутримышечном введении композиций в дозе 0,5 мл/животное с пиком титра специфических антител на 18-й день эксперимента и с сохранением до 40-го дня. Появление специфических антител регистрировали через 14 дней после первой вакцинации животных.3.1.2. Methodology “Determination of authenticity”, based on the ELISA method. The product induced the formation of specific antibodies to the SARS-CoV-2 coronavirus when immunizing Balb/c mice. A pronounced immune response was recorded with single and double intramuscular administration of the compositions at a dose of 0.5 ml/animal with a peak titer of specific antibodies on the 18th day of the experiment and persisting until the 40th day. The appearance of specific antibodies was recorded 14 days after the first vaccination of animals.
3.1.3. Методика «Определение остаточных белков культуры клеток» с использованием наборов F975 (Cygnus Technologies). На данный момент очисткой достигается остаточное содержание примесных белков менее 200 нг/мл (100 нг/доза).3.1.3. Method “Determination of residual proteins of cell culture” using F975 kits (Cygnus Technologies). At the moment, purification achieves a residual content of impurity proteins of less than 200 ng/ml (100 ng/dose).
3.1.4. Методика «Определение остаточной ДНК культуры клеток» с использованием наборов Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (Yeasen Biotechnology). На данный момент очисткой достигается остаточное содержание примесной ДНК в количестве менее 20 нг/мл (10 нг/доза).3.1.4. Method “Determination of residual DNA of cell culture” using Vero Host Cell DNA Residue Detection Kits (Yeasen Biotechnology). At the moment, purification achieves a residual contaminant DNA content of less than 20 ng/ml (10 ng/dose).
3.1.5. Методика «Специфическая безопасность (полнота инактивации) in vitro». Производят засев клеток Vero в 6 луночые планшеты/культуральные чашки. При достижении монослоя меняют питательную среду и в лунки с клетками вносят различные концентрации инактивированной вирусной суспензии. Далее каждую лунку покрывают карбоксиметилцеллюлозой и инкубируют в течение 3 дней. По окончании инкубации из всех лунок удаляют покрывающую смесь, клетки фиксируют 4% параформальдегидом и окрашивают с помощью раствора красителя кристаллического фиолетового. После окрашивания клетки промывают водой очищенной и производят подсчет БОЕ для каждой концентрации инактивированной вирусной суспензии. По результатам проверки БОЕ отсутствуют для каждой концентрации.3.1.5. Methodology “Specific safety (completeness of inactivation) in vitro.” Vero cells are seeded into 6 well plates/culture dishes. When a monolayer is reached, the nutrient medium is changed and various concentrations of inactivated viral suspension are added to the wells with cells. Each well is then coated with carboxymethylcellulose and incubated for 3 days. At the end of incubation, the coating mixture is removed from all wells, the cells are fixed with 4% paraformaldehyde and stained with crystal violet dye solution. After staining, the cells are washed with purified water and the PFU is counted for each concentration of the inactivated viral suspension. Based on the test results, there are no PFUs available for each concentration.
3.1.6. Методика «Определение токсичности in vivo».3.1.6. Methodology “Determination of toxicity in vivo”.
По результатам проведения двух доклинических исследований (ДКИ) «Доклиническое исследование токсичности, безопасности и иммуногенности вакцинного препарата при двукратном внутримышечном введении макакам резус (GLP)» и «Исследование токсичности инактивированной сорбированной вакцины против новой коронавирусной инфекции COVID-19 при повторном введении кроликам» были получены результаты, подтверждающие безопасность вакцины, поскольку не было выявлено иммунотоксичности и аллергенности вакцины. Based on the results of two preclinical studies (PCT) “Preclinical study of the toxicity, safety and immunogenicity of the vaccine preparation after double intramuscular injection in rhesus monkeys (GLP)” and “Study of the toxicity of the inactivated sorbed vaccine against the new coronavirus infection COVID-19 with repeated administration to rabbits” were obtained results confirming the safety of the vaccine, since no immunotoxicity or allergenicity of the vaccine was detected.
3.2. Получение готовых форм вакцинной композиции3.2. Obtaining finished forms of the vaccine composition
Перед розливом готового продукта в флаконы, в асептических условиях АФС смешивают с комплексным адъювантом и разбавляют формулирующим буферным раствором до получения целевой концентрации (см. Таблицы 1-3). При необходимости препарат лиофильно высушивают, концентрация компонентов в Таблицах 1-3 указана до начала сушки.Before filling the finished product into vials, under aseptic conditions, the API is mixed with a complex adjuvant and diluted with a formulation buffer solution to obtain the target concentration (see Tables 1-3). If necessary, the drug is freeze-dried; the concentration of the components in Tables 1-3 is indicated before drying begins.
Пример 4 Оценка иммуногенных и протективных свойств образцов инактивированной очищенной сорбированной ковидной вакцины, содержащих различные дозы антигенов вируса SARS-CoV-2 и различные адъюванты.Example 4 Evaluation of the immunogenic and protective properties of samples of inactivated purified sorbed Covid vaccine containing various doses of SARS-CoV-2 virus antigens and various adjuvants.
I. Используемые материалы:I. Materials used:
1. Образцы вакцины: 30/0/0; 30/500/0; 30/500/10; 15/0/0; 15/500/0; 15/500/10; 7,5/500/10, где первая цифра - концентрация вирусного антигена (мкг на дозу), вторая - концентрация гидроксида алюминия (мкг на дозу) и третья - концентрация CpG-ODN в составе образцов вакцины (мкг на дозу).1. Vaccine samples: 30/0/0; 30/500/0; 30/500/10; 15/0/0; 15/500/0; 15/500/10; 7.5/500/10, where the first number is the concentration of the viral antigen (µg per dose), the second is the concentration of aluminum hydroxide (µg per dose) and the third is the concentration of CpG-ODN in the vaccine samples (µg per dose).
2. Образцы для контроля адъювантов: 0/0/0; 0/500/0; 0/500/10, где первая цифра - концентрация вирусного антигена (мкг на дозу), вторая - концентрация гидроксида алюминия (мкг на дозу) и третья - концентрация CpG-ODN в составе образцов вакцины (мкг на дозу).2. Samples for adjuvant control: 0/0/0; 0/500/0; 0/500/10, where the first number is the concentration of the viral antigen (µg per dose), the second is the concentration of aluminum hydroxide (µg per dose) and the third is the concentration of CpG-ODN in the vaccine samples (µg per dose).
3. Сирийские хомячки массой 40-60 г - 200 голов;3. Syrian hamsters weighing 40-60 g - 200 heads;
4. Инфицирующий материал: вирус SARS-CoV-2, вариант А, штамм nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021, культура штамма прошла 3 пассажа на культуре клеток Vero В, субстрат накопления - культура клеток Vero В, хранится в криопробирках при температуре от минус 18 °C до минус 22 °C, биологическая активность - 6,8 1g БОЕ/мл.4. Infectious material: SARS-CoV-2 virus, variant A, strain nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021, strain culture passed 3 passages on Vero B cell culture, accumulation substrate - Vero B cell culture, stored in cryovials at temperatures from minus 18 °C to minus 22 °C, biological activity - 6.8 1g PFU/ml.
II. Методика проведения опытаII. Methodology for conducting the experiment
1. Иммунизация1. Immunization
Образцы вакцины приготовлены на основе разных доз антигена вируса SARS-CoV-2: 30, 15 и 7,5 мкг белка в одной дозе. Кроме того, образцы с дозами 30 и 15 мкг белка представлены в трех вариантах: без адъювантов, с гидроксидом алюминия (500 мкг), с гидроксидом алюминия (500 мкг) в сочетании с CpG (10 мкг). Сирийских хомячков разделили на 10 групп по 20 голов в каждой. Животным каждой группы вводили один из образцов вакцины внутримышечно по 0,5 мл двукратно с интервалом 21 сутки. Через 21 сутки после второй иммунизации по 5 животных из каждой группы иммунизировали теми же образцами в тех же дозах и тем же путем третий раз.Vaccine samples are prepared based on different doses of the SARS-CoV-2 virus antigen: 30, 15 and 7.5 μg of protein per dose. In addition, samples with doses of 30 and 15 μg of protein are presented in three variants: without adjuvants, with aluminum hydroxide (500 μg), with aluminum hydroxide (500 μg) in combination with CpG (10 μg). Syrian hamsters were divided into 10 groups of 20 animals each. Animals in each group were administered one of the vaccine samples intramuscularly, 0.5 ml, twice with an interval of 21 days. 21 days after the second immunization, 5 animals from each group were immunized with the same samples in the same doses and in the same way for the third time.
2 Оценка протективных свойств антигенов2 Assessment of the protective properties of antigens
Через 21 сутки после второй иммунизации по 10 особей из каждой группы инфицировали вирулентным штаммом интаназальным путем в дозе 1⋅105 БОЕ/особь. На 2 сутки (по 3 головы), 4 сутки (по 4 головы) и 6 сутки (по 3 головы) животных в каждой группе умерщвляли и брали пробы легких с соблюдением правил асептики. Пробы легких в каждой группе на каждый срок объединяли, ткани затем подвергали гомогенизации в стерилизованных охлаждённых фарфоровых ступках с добавлением стерилизованного речного песка. Из полученного гомогената готовили 10 % суспензию на растворе Хенкса с добавлением 2 % ФТС и антибиотиков (стрептомицина сульфата и бензилпенициллина натриевой соли по 200 ЕД/мл). Для титрования использовали суточный монослой клеток Vero В, который, после удаления ростовой среды инфицировали последовательными 10-кратными разведениями вируссодержащего материала, внося по 0,5 мл соответствующего разведения на 2 флакона с культурой клеток. Покачивая флакон, равномерно распределяли инокулят по всему монослою. Флаконы укладывали горизонтально, при этом поверхность с инфицированным клеточным монослоем находилась внизу. Флаконы инкубировали в термостате при температуре 37,0±0,5 °C в течение 60 минут. После инкубирования инокулят удаляли пипеткой и в каждый флакон вносили по 10 мл первичного агарового покрытия. Далее флаконы снова укладывали горизонтально (поверхность с инфицированным монослоем находилась внизу). После затвердевания покрытия флаконы переворачивали монослоем вверх и помещали в термостат при температуре 37,0±0,5° С на 48 часов. По истечении срока инкубации с целью окрашивания монослоя культуры клеток во флаконы вносили по 10 мл вторичного агарового покрытия, содержащего нейтральный красный, и продолжали инкубировать при температуре 37,0±0,5 °C в течение 24 часов, после чего подсчитывали количество негативных колоний.21 days after the second immunization, 10 individuals from each group were infected with the virulent strain intranasally at a dose of 1⋅10 5 PFU/individual. On the 2nd day (3 heads), 4th day (4 heads each) and 6th day (3 heads each), the animals in each group were sacrificed and lung samples were taken in compliance with aseptic rules. Lung samples from each group for each period were pooled, and the tissues were then homogenized in sterilized chilled porcelain mortars with the addition of sterilized river sand. From the resulting homogenate, a 10% suspension was prepared in Hanks' solution with the addition of 2% FBS and antibiotics (streptomycin sulfate and benzylpenicillin sodium salt, 200 U/ml). For titration, a daily monolayer of Vero B cells was used, which, after removing the growth medium, was infected with successive 10-fold dilutions of virus-containing material, adding 0.5 ml of the appropriate dilution to 2 bottles of cell culture. By rocking the bottle, the inoculum was evenly distributed throughout the entire monolayer. The vials were laid horizontally, with the surface with the infected cell monolayer at the bottom. The bottles were incubated in a thermostat at a temperature of 37.0±0.5 °C for 60 minutes. After incubation, the inoculum was removed by pipetting and 10 ml of primary agar coating was added to each bottle. Next, the vials were again laid horizontally (the surface with the infected monolayer was at the bottom). After the coating hardened, the bottles were turned over with the monolayer up and placed in a thermostat at a temperature of 37.0 ± 0.5 ° C for 48 hours. After the incubation period, in order to stain the cell culture monolayer, 10 ml of secondary agar coating containing neutral red was added to the vials and continued to incubate at a temperature of 37.0 ± 0.5 °C for 24 hours, after which the number of negative colonies was counted.
Протективные свойства к коронавирусу оценивали по концентрации вируса в легких вакцинированных сирийских хомячков на 2, 4 и 6 сутки после интраназального заражения вирулентным штаммом в дозе 105 БОЕ/особь. Защищенность животных оценивали с помощью вирусологического индекса защиты легких на 2, 4 и 6 сутки после инфицирования по снижению концентрации коронавируса в легких иммунизированных сирийских хомячков по сравнению с концентрацией в легких не иммунизированных животных. Protective properties against coronavirus were assessed by the concentration of the virus in the lungs of vaccinated Syrian hamsters on days 2, 4 and 6 after intranasal infection with the virulent strain at a dose of 10 5 PFU/individual. The protection of animals was assessed using the virological lung protection index on days 2, 4 and 6 after infection by the decrease in the concentration of coronavirus in the lungs of immunized Syrian hamsters compared to the concentration in the lungs of non-immunized animals.
3 Оценка иммуногенности антигенов3 Assessment of immunogenicity of antigens
Через 21 сутки после второй иммунизации и через 21 сутки после третьей иммунизации у 5 животных из каждой группы тотально брали кровь, из которой получали сыворотки крови для определения титра специфических вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации с вирулентным вирусом SARS-CoV-2, по снижению бляшкообразующей активности вируса на монослойной культуре клеток Vero под агаровым покрытием (вариант постановки реакции - постоянная доза вируса и разведения сыворотки).21 days after the second immunization and 21 days after the third immunization, total blood was taken from 5 animals from each group, from which blood sera were obtained to determine the titer of specific virus-neutralizing antibodies in the neutralization reaction with the virulent SARS-CoV-2 virus, to reduce plaque-forming activity virus on a monolayer culture of Vero cells under an agar coating (a variant of the reaction is a constant dose of virus and serum dilution).
Исследовали сыворотки крови опытных животных, а также положительный контрольный образец (сыворотку крови переболевшего человека, заведомо содержащую специфические антитела к вирусу SARS- CoV-2 в титре 1:40).The blood serum of experimental animals was studied, as well as a positive control sample (blood serum of a recovered person, known to contain specific antibodies to the SARS-CoV-2 virus in a titer of 1:40).
Разведения сывороток готовили на растворе Хенкса с 2% ФТС и антибиотиками (стрептомицина сульфат и бензилпенициллина натриевая соль) по 200 ЕД/мл двукратным шагом, начиная с разведения 1:10. Рабочее разведение вируса готовили на той же разводящей жидкости. В приготовленном разведении концентрация вируса SARS-CoV-2 составила 200 БОЕ/мл.Serum dilutions were prepared using Hanks solution with 2% FBS and antibiotics (streptomycin sulfate and benzylpenicillin sodium salt) at 200 U/ml in twofold steps, starting with a dilution of 1:10. A working dilution of the virus was prepared using the same dilution liquid. In the prepared dilution, the concentration of the SARS-CoV-2 virus was 200 PFU/ml.
Смесь равных объемов сыворотки и рабочего разведения культуры вируса SARS-CoV-2 инкубировали в пробирках в течение 60 минут при температуре от 36,5 до 37,5 °C, затем вносили по 0,5 мл во флаконы с монослоем клеток Vero В, предварительно удалив из них ростовую среду. После адсорбции комплекса АГ+АТ на клетках в течение 60 минут при температуре от 36,5 до 37,5 °C инокулят декантировали, затем наносили первичное агаровое покрытие, разработанное для вируса SARS-CoV-2, и проводили дальнейшее инкубирование монослоя при температуре от 36,5 до 37,5°C в течение двух суток.A mixture of equal volumes of serum and a working dilution of the SARS-CoV-2 virus culture was incubated in test tubes for 60 minutes at a temperature of 36.5 to 37.5 °C, then 0.5 ml was added to vials with a monolayer of Vero B cells, previously by removing the growth medium from them. After adsorption of the AG + AT complex on the cells for 60 minutes at a temperature of 36.5 to 37.5 °C, the inoculum was decanted, then a primary agar coating developed for the SARS-CoV-2 virus was applied, and the monolayer was further incubated at a temperature of 36.5 to 37.5°C for two days.
Через трое суток на инфицированный монослой клеток с целью окрашивания 0,1 % раствором нейтрального красного наносили вторичное агаровое покрытие и инкубировали в течение 24 часов при температуре от 36,5 до 37,5 °C, затем проводили визуальный учет негативных колоний во флаконах.After three days, a secondary agar coating was applied to the infected monolayer of cells for staining with a 0.1% neutral red solution and incubated for 24 hours at a temperature of 36.5 to 37.5 °C, then a visual count of negative colonies in the vials was carried out.
За титр антител исследуемой сыворотки принимали высшее разведение сыворотки крови, в котором выявляли подавление негативных колоний, образованных вирусом SARS-CoV-2, на 50% и более по сравнению с отрицательным контролем (вирус + разводящая жидкость).The antibody titer of the test serum was taken to be the highest dilution of blood serum, in which suppression of negative colonies formed by the SARS-CoV-2 virus was detected by 50% or more compared to the negative control (virus + dilution liquid).
III. Результаты экспериментаIII. Experiment results
Результаты оценки протективных и иммуногенных свойств антигенов представлены в таблицах 4 и 5.The results of assessing the protective and immunogenic properties of antigens are presented in tables 4 and 5.
Наиболее выраженной протективной активностью обладали образцы вакцины 30/500/10 и 15/500/10. После заражения двукратно иммунизированных данными образцами хомячков вирулентным штаммом вируса SARS-CoV-2 в дозе 105 БОЕ/особь в легких животных вирус не выделяли на протяжении всего периода наблюдения: 2, 4 и 6 сутки после заражения. Титры антител у большинства животных составляли величину >1:40 при уровне сероконверсии от 80 до 100 %.Vaccine samples 30/500/10 and 15/500/10 had the most pronounced protective activity. After infection of hamsters immunized twice with these samples with a virulent strain of the SARS-CoV-2 virus at a dose of 10 5 PFU/individual, the virus was not isolated in the lungs of the animals throughout the entire observation period: 2, 4 and 6 days after infection. Antibody titers in most animals were >1:40, with seroconversion rates ranging from 80 to 100%.
Образцы вакцины без адъювантов обладали наименьшей протективной активностью. Добавление гидроксида алюминия усиливало протективные свойства антигенов в дозах 15 и 30 мкг на дозу. Титры антител не превышали значений 1:20, сероконверсия составляла от 60 до 100 %. Оба адъюванта не влияли на уровень накопления вируса в легких, то есть не утяжеляли процесса.Vaccine samples without adjuvants had the least protective activity. The addition of aluminum hydroxide enhanced the protective properties of antigens at doses of 15 and 30 μg per dose. Antibody titers did not exceed 1:20, seroconversion ranged from 60 to 100%. Both adjuvants did not affect the level of virus accumulation in the lungs, that is, they did not aggravate the process.
По результатам данного эксперимента доза вирусного антигена 15 мкг на дозу является оптимальной по протективным и иммуногенным свойствам.According to the results of this experiment, a dose of viral antigen of 15 mcg per dose is optimal in terms of protective and immunogenic properties.
Также были изучены иммуногенные свойства исследуемой вакцины против разных штаммов вируса SARS-CoV-2, известных как «Дельта» и «Омикрон», у обезьян по уровню вируснейтрализующих антител. Согласно полученным данным по результатам ДКИ «Исследование иммуногенности и безопасности, инактивированной сорбированной вакцины от новой коронавирусной инфекции COVID-19 при моделировании заболевания SARS-CoV-2 на макаках-резус» предложенная вакцина обладает высокой иммуногенностью и эффективностью, в том числе перекрестной.The immunogenic properties of the study vaccine against different strains of the SARS-CoV-2 virus, known as “Delta” and “Omicron”, were also studied in monkeys based on the level of virus-neutralizing antibodies. According to the data obtained from the results of the DCT “Study of the immunogenicity and safety of the inactivated sorbed vaccine against the new coronavirus infection COVID-19 when modeling the SARS-CoV-2 disease in rhesus monkeys,” the proposed vaccine has high immunogenicity and effectiveness, including crossover.
Таблица 1 - Состав вакцинной композиции в расчете на 1 дозу (0,5 мл) (вариант 1) Tables
Table 1 - Composition of the vaccine composition per 1 dose (0.5 ml) (option 1)
(не иммунизированные, без заражения)Herd control
(not immunized, without infection)
флаконNumber of PFU/
bottle
132Average number of PFU-
132
Бляшки отсутствуют0
No plaques
Claims (9)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809375C1 true RU2809375C1 (en) | 2023-12-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021176434A1 (en) * | 2020-03-01 | 2021-09-10 | Valneva Austria Gmbh | Cpg-adjuvanted sars-cov-2 virus vaccine |
| RU2768749C1 (en) * | 2021-06-07 | 2022-03-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Agent for specific prevention of covid-19 for carnivores |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021176434A1 (en) * | 2020-03-01 | 2021-09-10 | Valneva Austria Gmbh | Cpg-adjuvanted sars-cov-2 virus vaccine |
| RU2768749C1 (en) * | 2021-06-07 | 2022-03-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Agent for specific prevention of covid-19 for carnivores |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ю.А.Беликова, Ю.В.Самсонов, Е.В.Абакушина, Современные вакцины и коронавирусные инфекции, Исследования и практика в медицине 2020, т.7, N4, с. 135-154. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sikes et al. | Effective protection of monkeys against death from street virus by post-exposure administration of tissue-culture rabies vaccine | |
| US7052701B2 (en) | Inactivated influenza virus vaccine for nasal or oral application | |
| RU2390351C2 (en) | Mucosal influenza virus vaccine and method for influenza prevention | |
| KR100314404B1 (en) | An attenuated japanese encephalitis virus strain adapted to vero cell and a japanese encephalitis vaccine | |
| US20240050557A1 (en) | Coronavirus vaccine and method for preparation thereof | |
| JP2004536106A (en) | Mycoplasma bovis vaccine and method for reducing pneumonia in animals | |
| CN110711247A (en) | Rabies vaccine composition containing BCG-CpG-DNA adjuvant | |
| US10590174B2 (en) | Genomic sequences encoding for an attenuated mutant Zika virus | |
| KR101846478B1 (en) | Vaccine composition comprising recombinant protein for preventing swine mycoplasma infection | |
| JP6985384B2 (en) | Vaccine composition containing attenuated mutant Zika virus | |
| NZ757651A (en) | Bovine respiratory disease vaccine | |
| RU2809375C1 (en) | WHOLE VIRION INACTIVATED VACCINE AGAINST SARS-Cov-2 INFECTION AND ITS USE | |
| RU2810740C1 (en) | Method of obtaining inactivated vaccine against covid-19 and vaccine obtained by method | |
| EA032284B1 (en) | Vaccination with canine respiratory coronavirus for protection against b. bronchiseptica infections | |
| WO2005014803A1 (en) | West nile virus vaccine | |
| JP5946453B2 (en) | Mutant rabies virus and vaccine | |
| Miyamae | Protective effects of nasal immunization in mice with various kinds of inactivated Sendai virus vaccines | |
| KR101281361B1 (en) | Vaccine composition for North American Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and mixed vaccine comprising thereof | |
| EP0386946A1 (en) | Feline infectious peritonitis Vaccine | |
| RU2423995C1 (en) | Method of preparing influenza vaccine | |
| US20220347286A1 (en) | Inactivated vaccine for chikungunya virus | |
| KR101191518B1 (en) | Vaccine composition for korean porcine reproductive and respiratory syndrome virus | |
| US9381241B2 (en) | Mucosal adjuvant composition | |
| KR100693077B1 (en) | Biological composition for preventing and treating prdc | |
| Amor et al. | Use of N‐acetylethyleneimine [AEI] for the inactivation of semliki forest virus in vitro |