RU2808965C1 - Рекомбинантный белок для иммунизации против коронавируса кошек - Google Patents
Рекомбинантный белок для иммунизации против коронавируса кошек Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808965C1 RU2808965C1 RU2023122759A RU2023122759A RU2808965C1 RU 2808965 C1 RU2808965 C1 RU 2808965C1 RU 2023122759 A RU2023122759 A RU 2023122759A RU 2023122759 A RU2023122759 A RU 2023122759A RU 2808965 C1 RU2808965 C1 RU 2808965C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- fcov
- recombinant
- feline
- coronavirus
- Prior art date
Links
- 241000725579 Feline coronavirus Species 0.000 title claims abstract description 66
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 claims abstract description 8
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 22
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 11
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 5
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 abstract description 3
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 abstract description 3
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 abstract description 3
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 208000005098 feline infectious peritonitis Diseases 0.000 description 25
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 7
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 6
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 5
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 3
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 208000009714 Severe Dengue Diseases 0.000 description 3
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 201000002950 dengue hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 2
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 208000009724 equine infectious anemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 101150011498 lad gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000004177 Alphacoronavirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 208000030820 Ebola disease Diseases 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282323 Felidae Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241001292005 Nidovirales Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N gamma-cyhalothrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](\C=C(/Cl)C(F)(F)F)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001296 transplacental effect Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению иммуногенного белка коронавируса кошек, и может быть использовано в ветеринарии для получения вакцины против коронавируса кошек. Предложена новая стратегия вакцинации, основанная на применении профилактического препарата на основе консервативного рекомбинантного белка нуклеокапсида коронавируса кошек (N-FCoV) с SEQ ID NO:2 и специфического адъюванта, представляющего собой смесь сквалана, α-токоферола (витамина Е) и полисорбата-80, который эффективно индуцирует Т-клеточный ответ в отношении коронавируса кошек. 6 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 6 пр.
Description
Область изобретения
Группа изобретений относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к иммуногенным генетическим конструкциям, направленным на стимулирование иммунного ответа против коронавируса кошек FCoV.
Описание предшествующего уровня техники
Коронавирус кошек (FCoV) - это сложный РНК-содержащий вирус, входящий в семейство Coronaviridae. Вирус по структуре состоит из нуклеокапсида, содержащего вирусный геном, и внешней оболочки. Эти два элемента стабилизируют и защищают РНК-геном [Masters P.S., Perlman S. Coronaviridae. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields Virology, 6th ed. Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp.825-858, 2013]. Геном FCoV кодирует четыре основных структурных белка: поверхностный белок шипа (S), белок нуклеокапсида (N), белок оболочки (Е) и мембранный белок (М); и семь неструктурных белков: два белка репликазы (1а и 1b) и пять вспомогательных белков (3а, 3b, 3c, 7а и 7b) [de Barros B.D.C.V., Castro C.M.O.D., Pereira D., et al. First complete genome sequence of a feline Alphacoronavirus 1 strain from Brazil. Microbiol Resour Announc. 2019; 8:e01535-18; Tekes G., Thiel H.J. Feline Coronaviruses: Pathogenesis of Feline Infectious Peritonitis. Adv Virus Res. 2016; 96:193-218].
На основании различий в структуре гена, кодирующего поверхностный белок шипа S (спайк), коронавирус кошек разделяют на два патотипа: менее летальный возбудитель коронавирусного энтерита (FECV - Feline enteritis coronavirus), который широко распространен среди диких и домашних животных, а вызванная им болезнь протекает относительно легко и может хронизироваться; и вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV Feline infectious peritonitis virus), встречающийся реже, но способный вызывать системное летальное заболевание [Щелканов М.Ю., Попова А.Ю., Дедков В.Г. и др. История изучения и современная классификация коронавирусов (Nidovirales: Coronaviridae). Инфекция и иммунитет.2020; 10(2): 221-246].
Белок S представляет собой крупный гликопротеин (180-220 кДа), образующий пепломеры, которые выступают с поверхности вирионов и отвечают за связывание рецепторов, индукцию межклеточного слияния, слияние вирусной оболочки с клеточными мембранами-мишенями и индукцию нейтрализующих антител [Jaimes J.A., Whittaker G.R. Feline coronavirus: Insights into viral pathogenesis based on the spike protein structure and function. Virology. 2018; 517: 108-121]. В зависимости от аминокислотной последовательности данного белка и нейтрализующих антител вирус разделяют на I и II серотипы [Kipar A., Meli M.L. Feline infectious peritonitis: still an enigma? Veterinary pathology. 2014; 51(2): 505-526; Lewis C.S., Porter E., Matthews D., et al. Genotyping coronaviruses associated with feline infectious peritonitis. Journal of General Virology. 2015; 96:1358-1368]. Серотип I является первоначальным и преобладающим типом с S-белком, произошедшим из FCoV. Штаммы из этого серотипа распространены шире и имеют более высокую эпидемиологическую значимость [Benetka V., Kubber-Heiss A., Kolodziejek J., et al. Prevalence of feline coronavirus types I and II in cats with histopathologically verified feline infectious peritonitis. Vet Microbiol. 2004; 99(1): 31-42; Pedersen N.C. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. Journal of Feline Medicine & Surgery. 2009; 11(4): 225-258]. Вирусы серотипа II встречаются реже, и в отличие от вирусов серотипа I, их геном сформирован рекомбинацией между по меньшей мере двумя различными вирусами, что подтверждается экспериментами in vitro и in vivo [Herrewegh A.A.P.M., Smeenk I., Horzinek M.C., et al. Feline Coronavirus Type II Strains 79-1683 and 79-1146 Originate from a Double Recombination between Feline Coronavirus Type I and Canine Coronavirus. Journal of Virology. 1998; 72(5): 4508-4514]. Серотип I распространен преимущественно в Европе и Северной Америке, а серотип II чаще встречается в азиатских и африканских странах. Также имеются данные о коинфекциях FCoV I и II [An D. J., Jeoung H.Y., Jeong W., et al. Prevalence of Korean cats with natural feline coronavirus infections. Virol J. 2011; 8: 455]. Оба серотипа FCoV могут встречаться в двух антигенно и морфологически неразличимых патотипах: FECV и FIPV [Shiba N., Maeda K., Kato Н., et al. Differentiation of feline coronavirus type I and II infections by virus neutralization test. Veterinary Microbiology. 2007; 124(3-4): 348-352]. Белок S является основным регулятором инфекционного процесса FCoV в клетке-хозяине и определяет вирулентность FCoV: мутации данного белка (вместе с мутациями ORF неструктурных белков) определяют переход FECV в FIPV [Jaimes J.А., Whittaker G.R. Feline coronavirus: Insights into viral pathogenesis based on the spike protein structure and function. Virology. 2018; 517: 108-121].
Заболеванию FCoV подвержены популяции домашних и диких кошек по всему миру. Серопозитивность к FCoV составляет 20-60% среди домашних кошек и до 90% в домохозяйствах с несколькими кошками или приютах [Гильмутдинов Р.Я., Малев А.В. Коронавирусные инфекции диких животных кошачьи (Felidae). Актуальные вопросы зоологии, экологии и охраны природы. 2021; 3: 36-41; Пальцева Е.Д., Плешакова В.И. Коронавирусы в популяции домашних кошек. Вестник Омского ГАУ. 2022; 1(45): 94-101]. Пути передачи FCoV могут быть как вертикальные (трансплацентарный путь), так и горизонтальные (фекально-оральный путь). Сезонность не регистрируется. Источником возбудителя инфекции являются больные, переболевшие животные и вирусоносители, у которых выделение вируса происходит с фекалиями и слюной. Котята чаще всего заражаются через молозиво или фекалии. Молодых и возрастных животных болезнь поражает чаще [Пальцева Е.Д., Плешакова В.И. Коронавирусы в популяции домашних кошек. Вестник Омского ГАУ. 2022; 1(45): 94-101].
Коронавирусный энтерит кошек - это заболевание, вызванное патотипом FECV. Он имеет низкую патогенность и не угрожает жизни животного. Клиническим признаком заболевания является диарея, но инфекция также может протекать и бессимптомно [Pedersen N.C. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. Journal of Feline Medicine & Surgery. 2009; 11(4): 225-258].
Однако в 8-10% случаев низкопатогенный FECV мутирует в FIPV, вызывая вирусный инфекционный перитонит кошек, смертность при котором составляет до 90% [Pedersen N.C. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. Journal of Feline Medicine & Surgery. 2009; 11(4): 225-258].
Инфекционный перитонит кошек (FIP), вместе с геморрагическими лихорадками Денге и Эбола, инфекционной анемией лошадей, инфекцией дыхательных путей RSV и некоторыми другими болезнями человека и животных, относится к заболеваниям, для которых характерно антителозависимое усиление инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE) [Миронов А.А., Супотницкий М.В., Лебединская Е.В. Феномен антитело-зависимого усиления инфекции у вакцинированных и переболевших. Биопрепараты. 2013; 3:1225].
ADE возникает, когда антитела, образующиеся во время иммунного ответа, распознают и связываются с патогеном, но не могут предотвратить инфекцию. Вместо этого антитела действуют как «троянский конь», позволяя возбудителю проникнуть в клетки (моноциты и макрофаги). В составе данных клеток вирус быстро распространяется в мезентериальные лимфатические узлы и по организму. Высокая степень виремии приводит к отложению иммунных комплексов и макрофагов, содержащих вирусные частицы, вокруг небольших венул, вызывая иммуноопосредованный васкулит и фокальное гранулематозное поражение всех органов [Cloutier М., Nandi М., flisan A.U., et al. ADE and hyperinflanimation in SARS-CoV2 infection-comparison with dengue hemorrhagic fever and feline infectious peritonitis. Cytokine. 2020; 136:155256]. Это приводит к таким осложнениям FIP как почечная недостаточность, сопровождающиеся неврологической симптоматикой повреждения головного и спинного мозга, паренхиматозная желтуха и токсическая дистрофия печени, интерстициальная пневмония, ателектаз и эмфизема легких, общая интоксикация организма, стойкая лихорадка и смерть [Куликов Е.В., Ватников Ю.А., Сахно Н.В. и др. Патологоанатомическая характеристика вирусного перитонита кошек. Российский журнал сельскохозяйственных и социально-экономических наук. 2017; 64(4): 270-280.].
Современных исследований, посвященных разработке идеальной и эффективной вакцины против коронавируса кошек, практически не ведется, в связи с длительным изучением классических подходов по разработке вакцин, которые или не оказывали защитного действия или наоборот вызывали усиление инфекции [Pedersen N.C. Animal virus infections that defy vaccination: equine infectious anemia, caprine arthritis-encephalitis, maedi-visna, and feline infectious peritonitis. Adv. Vet. Sci. Сотр. Med. 1989; 3:413-428]. Вакцинация близкородственными гетерологичными живыми штаммами CoV вообще не обеспечивала защиты [Barlough J.E., Johnson-Lussenburg СМ., Stoddart С.A., et al. Experimental inoculation of cats with human coronavirus 229E and subsequent challenge with feline infectious peritonitis virus. Can. J. Сотр. Med. 1985; 49: 303-307]. Подобно инактивированным и рекомбинантным субъединичным вакцинам против FCoV [Напета B.J., Rottier P.J.M., de Groot R.J. Coronaviruses. Caister Academic Press; UK: Norfolk. Caister Academic Press: 2007. Feline coronaviruses: a tale of two-faced types], иммунизация FECV, низковирулентным FIPV или сублетальными количествами вирулентного FIPV вызывала лишь частичную защиту [Pedersen N.C, Black J.W. Attempted immunization of cats against feline infectious peritonitis, using avirulent live virus or sublethal amounts of virulent virus. Am. J. Vet. Res. 1983; 44: 229-234; Pedersen N.C, Floyd K. Experimental studies with three new strains of feline infectious peritonitis virus: FIPV-UCD2 FIPV-UCD3, and FIPV-UCD4. Compend. Contin. Educ. Pract. Vet. 1985; 7:1001-1011], что часто приводило к ADE и так называемому синдрому ранней смерти. Наиболее многообещающие результаты были получены с рекомбинантными мутантами FIPV, лишенными областей ORF3abc или ORF7ab, которые обеспечивали 100% и 80% защиту после летального гомологичного заражения [Haijema В.J., Volders Н., Rottier P.J. Live, attenuated coronavirus vaccines through the directed deletion of group-specific genes provide protection against feline infectious peritonitis. J. Virol. 2004; 78: 3863-3871], соответственно. Однако никаких последующих исследований с использованием этих вакцин-кандидатов опубликовано не было.
Единственная зарегистрированная вакцина для профилактической иммунизации здоровых кошек против вирусного перитонита Vanguard® Feline FIP Intranasal производства компании Zoetis (ранее Pfizer Animal Health, США), известная также под названиями Примуцел FIP® и FELOCELL FIP, не рекомендована к использованию многими ветеринарными организациями, такими как «Американская ассоциация практикующих врачей-фелинологов» [Scherk М.А., Ford R.B., Gaskell R.M., et al. 2013 AAFP feline vaccination advisory panel report. Journal of feline medicine and surgery. 2013; 15(9): 785-808], и может вызывать ADE эффект. В состав вакцины Vanguard® Feline FIP Intranasal входит аттенуированный штамм вируса перитонита кошек DF2-FIPV. Поскольку известно, что стимулирование системного ответа IgG только усугубляет течение FIP, не давая должной защиты [Cloutier М., Nandi М., Ihsan A.U., et al. ADE and hyperinflammation in SARS-CoV2 infection-comparison with dengue hemorrhagic fever and feline infectious peritonitis. Cytokine. 2020; 136: 155256], была принята альтернативная стратегия местной вакцинации. Вакцина Vanguard® Feline FIP Intranasal вводится интраназально для стимуляции ответа с иммуноглобулинами IgA, предотвращающими вирусную инвазию в ротоглотке и при этом не вызывающими интенсификацию патологического процесса [Tizard I.R. Vaccination against coronaviruses in domestic animals. Vaccine. 2020; 38(33):5123-5130]. Согласно инструкциям по применению, препарат можно использовать только для вакцинации животных, достигших 16-недельного возраста. В высокоэндемичных ситуациях, когда котята заражаются FCoV в раннем возрасте или внутриутробно, такой режим применения вакцины является неэффективным. Кроме того, фактически интраназальная вакцинация повышает как локальные титры антител IgA, так и титры IgG к S-белку FCoV в сыворотке крови. По данным исследования Fred W. Scott у 48 из 49 кошек, вакцинированных интраназально вакциной Примуцел FIP®, в сыворотке крови обнаруживалось увеличение титра IgG [Scott F.W. Evaluation of risks and benefits associated with vaccination against coronavirus infections in cats. Advances in Veterinary Medicine. 1999; 41: 347]. Это также может приводить к ADE у вакцинированных животных и является лимитирующим фактором использования интраназальных вакцин.
На сегодня FIP является высоколетальным и повсеместно распространенным заболеванием кошек, для которого не разработаны эффективные вакцины и не существует лечения, одобренного контролирующими организациями ведущих стран. Это приводит к незаконному распространению на «черном рынке» экспериментальных образцов лекарств, не прошедших полномасштабные доклинические и клинические исследования [https://abc7.com/cats-covid-coronavirus-cure/6253361/, дата обращения 22.07.2023].
Различные данные свидетельствуют о том, что для придания долговременного иммунитета против FCoV необходим надежный опосредованный Т-клетками иммунитет. Животные, пережившие острую инфекцию, имели устойчивые Т-клеточные реакции на более поздних стадиях инфекции. Кроме того, выжившие особи были устойчивы к последующему заражению патогенным вирусом FCoV [Mustaffa-Kamal F., Liu FL, Pedersen N.C, Sparger E.E. Characterization of antiviral T cell responses during primary and secondary challenge of laboratory cats with feline infectious peritonitis virus (FIPV). BMC Vet Res. 2019; 15 (1): 165]. При FIP происходит ингибирование Т-клеточно-опосредованных процессов, чего не происходит у FCoV серопозитивных кошек, не болеющих FIP [Malbon A. J., Russo G., Burgener С, et al. The Effect of Natural Feline Coronavirus Infection on the Host Immune Response: A Whole-Transcriptome Analysis of the Mesenteric Lymph Nodes in Cats with and without Feline Infectious Peritonitis. Pathogens. 2020; 9(7): 524]. А у когорты лабораторных кошек, устойчивых к развитию FIP, как при первичном инфицировании, так и при вторичном реинфицировании вирусом наблюдались схожие вирус-специфические Т-клеточные иммунологические корреляты протективности, возможно, обеспечивающие долговременную защиту от вируса [Mustaffa-Kamal F., Liu Н., Pedersen N.C. et al. Characterization of antiviral T cell responses during primary and secondary challenge of laboratory cats with feline infectious peritonitis virus (FIPV). BMC Vet Res. 2019; 15: 165].
Так в работах до 2003 года упоминается исследование N-белка коронавируса кошек как антигена в составе вирусных векторов (оспа вирус - Vennema Н., de Groot R.J., Harbour D. A. et al. Primary structure of the membrane and nucleocapsid protein genes of feline infectious peritonitis virus and immunogenicity of recombinant vaccinia viruses in kittens. Virology. 1991; 181: 327-335; вирус оспы енотов - Wasmoen T.L., KadakiaN.P., Unfer R.C. et al. Protection of cats from infectious peritonitis by vaccination with a recombinant raccoon poxvirus expressing the nucleocapsid gene of feline infectious peritonitis virus. Adv. Exp.Med. Biol. 1995; 280: 221-228; плазмидного вектора - Glansbeek H.L., Haagmans B.L., te Lintelo E.G. et al. Adverse effects of feline IL-12 during DNA vaccination against feline infectious peritonitis virus. J. Gen. Virol. 2002; 83: 1-10; или клеточного лизата, содержащего экспрессированный бакуловирусом белок - Hohdatsu Т., Yamato Н., Ohkawa Т. et al. Vaccine efficacy of a cell lysate with recombinant baculovirus-expressed feline infectious peritonitis (FIP) virus nucleocapsid protein against progression of FIP. Vet Microbiol. 2003 Dec 2; 97(1): 31-44; заявка на патент US 20120107390 A1). Векторная вакцина, исследованная группой Vennema et al., как и ДНК-вакцина Glansbeek et al. не обладали протективным действием. Векторная вакцина Wasmoen et al. была эффективна против низкодозового заражения вирусом FIPV, однако, оценить вклад именно вакцины в данный эффект затруднительно, так как после иммунизации авторы вначале проводили инфицирование не вызывающим тяжелых последствий коронавирусом FECV, а уже после этого коронавирусом FIPV, вызывающим перитонит.Наиболее многообещающие данные были получены группой Т. Hohdatsu et al. После вакцинации лизатом клеток насекомых SF-9 (Spodoptera frugiperda), содержащим экспрессированный бакуловирусом N-белок FIPV, совместно с адъювантом (инактивированная вакцина для кошек Felidovac PCR, содержащая адъювант гидроксид алюминия), кошки получали 62,5% защиту от летального инфицирования FIPV. Достаточно низкую (62,5%), но все-таки эффективность клеточного лизата можно объяснить присутствием в его составе адъюванта на основе гидроксида алюминия, который эффективно стимулирует гуморальный иммунный ответ, но не эффективно стимулирует антигенспецифический Т-клеточный ответ, кроме этого в составе лизата параллельно вводилась вакцина Felidovac PCR, которая также стимулировала гуморальный иммунный ответ.
Таким образом, техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в создании средства для иммунизации против коронавируса кошек.
Сущность изобретения
Одной из технических проблем, на решение которой направлено настоящее изобретение, является создание иммуногена против коронавируса кошек (FCoV).
Решением проблемы может стать разработка новой эффективной стратегии вакцинации, основанной на применении профилактического препарата на основе консервативного рекомбинантного белка нуклеокапсида коронавируса кошек (N-FCoV) и специфического адъюванта, представляющего собой смесь сквалана, а-токоферола (витамина Е) и полисорбата-80, который эффективно индуцирует Т-клеточный ответ.
Техническим результатом является иммунный ответ в отношении коронавируса кошек.
Настоящая группа изобретений предлагает рекомбинантный белок нуклеокапсида коронавируса кошек, далее называемый также N-FCoV, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, который может быть использован для иммунизации кошек против FCoV. Рекомбинантный белок по настоящему изобретению может дополнительно содержать 6-10 остатков гистидина, называемых гистидиновой меткой (His-tag).
Также предлагается рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок по настоящему изобретению. Упомянутая нуклеиновая кислота в одном из вариантов осуществления изобретения содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:l длиной 1128 п. н.
Упомянутая нуклеиновая кислота может быть включена в состав любого из плазмидных экспрессионных векторов семейства рЕТ или аналогичных. Указанные плазмидные экспрессионные векторы используются для трансформации штаммов клеток Escherichia coli с целью экспрессии рекомбинантного белка N-FCoV.
Также, в группе изобретений предлагается рекомбинантный плазмидный экспрессионный вектор pET-28a(+)-N-FCoV, предназначенный для получения рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента рекомбинантного белка N-FCoV. Упомянутый рекомбинантный плазмидный экспрессионный вектор размером 6406 п. н., согласно карте, представленной на Фиг. 1, содержит:
KanR - ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов Е. coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 5032-5847);
ori (ori, origin of replication) участок инициации репликации (координаты 4322 4910);
lad - транскрипционный репрессор lad связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в Е. coli (координаты 1810 2892). Это ингибирование можно снять, добавив лактозу или изопропил-р-О-тиогалактопиранозид (ИПТГ);
lad promoter - промотор для связывания РНК-полимеразы, транскрибирующей ген lad (координаты 1732-1809);
Т7 promoter промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 1405 1423);
lac operator оператор для связывания LacI (координаты 1380-1404);
RBS (ribosome binding site) - эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 1344-1349);
Т7 terminator - терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 26-73);
NcoI/XhoI фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO: 1, используемый для получения белка N-FCoV, кодирующий искусственный белок-иммуноген (координаты 164-1336). Нуклеотидная последовательность плазмидного экспрессионного вектора рЕТ-28a(+)-N-FCoV включает последовательность SEQ ID NO: 3.
Также группа изобретений предлагает штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка N-FCoV, полученный трансформацией компетентных клеток. Е'. coli штамма BL21[DE3] плазмидным экспрессионный вектором по настоящему изобретению.
Также группа изобретений предлагает композицию для иммунизации против коронавируса кошек, содержащую рекомбинантный белок N-FCoV, сквалан, α-токоферол и полисорбат 80 в весовом соотношении 1: 750: 250: 50.
Также группа изобретений предлагает способ применения упомянутой композиции для профилактики коронавирус ной инфекции у кошек, заключающийся в том, что кошкам вводят композицию из расчета 25 мкг белка на кошку двукратно с интервалом в 21 день.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 представлена карта плазмидного экспрессионного вектора pET-28a(+)-N-FCoV.
На Фиг. 2 представлена электрофореграмма лизатов клеток Е. coli, содержащих плазмидную ДНК pET-28a-N-FCoV, после индукции экспрессии и без индукции. 1 - маркер Bio-Rad Precision Plus Protein Standards; 2 - отрицательный контроль без индукции экспрессии; 3 общий лизат клеток после индукции экспрессии 1 мМ ИПТГ. Стрелкой показан целевой белок.
На Фиг. 3 представлена электрофореграмма растворимой и нерастворимой фракций лизатов клеток Е. coli, содержащих плазмидную ДНК pET-28a-N-FCoV, после индукции экспрессии и последующего разделения на фракции центрифугированием. 4 маркер Bio-Rad Precision Plus Protein Standards; 5 общий клеточный лизат без центрифугирования; 6
- растворимая фракция (супернатант после центрифугирования); 7 - нерастворимая фракция (осадок после центрифугирования). Стрелкой показан целевой белок.
На Фиг. 4 представлен результат оценки Th1-клеточного (Т-хелперы 1) иммунного ответа на стимуляцию рекомбинантным белком N-FCoV мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs), выделенных из иммунизированных кошек. Контроль -среда, N-FCoV+T-адъювант - N-FCoV с Т-клеточным адъювантом, N-FCoV+B-адъювант - N-FCoV с В-клеточным адъювантом.
Детальное описание изобретения
Настоящая группа изобретений предлагает рекомбинантный белок нуклеокапсида коронавируса кошек N-FCoV, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, который может быть использован для иммунизации кошек против FCoV.
Упомянутый белок N-FCo V может использоваться в качестве антигена для получения вакцины или иммуногенной композиции, предназначенной для выработки иммунитета против коронавируса кошек.
Входящий в состав вакцины рекомбинантный белок N-FCoV является консервативным и общим для обоих серотипов и патотипов коронавируса кошек, то есть создание вакцины на его основе может обеспечить наиболее полную защиту животных вне зависимости от их географического проживания, а также в условиях как моно-, так и коинфекции I и II серотипами. Рекомбинантный белок по настоящему изобретению может быть получен любым известным из уровня техники способом получения полипептидов и белков, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, такие как синтез в клетках, трансфицированных или трансдуцированных экспрессионными векторами, кодирующими упомянутый полипептид, и другими, а также способами химического синтеза. Рекомбинантный белок по настоящему изобретению вызывает иммунный ответ, как гуморальный, так и клеточный, против коронавируса кошек, таким образом, он обеспечивает достижение технического результата изобретения.
В одном из вариантов осуществления, рекомбинантный белок по настоящему изобретению может дополнительно содержать 6 10 остатков гистидина, называемых гистидиновой меткой (His-tag). Гистидиновая метка позволяет дополнительно использовать для очистки рекомбинантного белка по настоящему изобретению аффинную хроматографию [см., например, Spriestersbach A, Kubicek J, Schafer F, et al. Purification of His-Tagged Proteins. Methods Enzymol. 2015;559:1-15. doi: 10.1016/bs.mie.2014.11.003].
Также предлагается рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая упомянутый рекомбинантный белок. Рекомбинантный белок N-FCoV по настоящему изобретению может кодироваться нуклеиновыми кислотами с различными нуклеотидными последовательностями ввиду вырожденности генетического кода в соответствии с таблицей стандартного генетического кода [см., например, Griffiths A.J.F. et al., An Introduction to Genetic Analysis. New York: W.H. Freeman; 2000]. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается искусственная нуклеиновая кислота, предназначенная для получения рекомбинантного белка N-FCoV. Упомянутая нуклеиновая кислота кодирует рекомбинантный белок N-FCoV и содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1 длиной 1128 п. н. Упомянутая нуклеиновая кислота может быть включена в состав известных из уровня техники экспрессионных векторов для получения рекомбинантного белка - РСоV, таких как плазмидные экспрессионные векторы, вирусные экспрессионные векторы и т.п.
Упомянутая нуклеиновая кислота может быть включена в состав любого из плазмидных экспрессионных векторов семейства рЕТ или аналогичных. Указанные плазмидные экспрессионные векторы используются для трансформации штаммов клеток Escherichia coli с целью экспрессии рекомбинантного белка N-FCoV.
Также, в группе изобретений предлагается рекомбинантный плазмидный экспрессионный вектор pET-28a(+)-N-FCoV, предназначенный для получения рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента рекомбинантного белок N-FCoV. Упомянутый рекомбинантный плазмидный экспрессионный вектор размером 6406 п. н., согласно карте, представленной на Фиг. 1, содержит:
KanR ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов Е. coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 5032-5847);
ori (ori, origin of replication) - участок инициации репликации (координаты 4322-4910);
lad транскрипционный репрессор lad связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в Е. coli (координаты 1810-2892). Это ингибирование можно снять, добавив лактозу или изопропил-р-О-тиогалактопиранозид (ИПТГ);
lad promoter промотор для связывания РНК полимеразы, транскрибирующей ген lad (координаты 1732-1809);
Т7 promoter - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 1405-1423);
lac operator - оператор для связывания LacI (координаты 1380-1404);
RBS (ribosome binding site) эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 1344 1349);
Т7 terminator - терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 26-73);
NcoI/XhoI - фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO: 1, кодирующий рекомбинантный белок N-FCoV (координаты 164-1336).
Нуклеотидная последовательность плазмидного экспрессионного вектора рЕТ-28a(+)-N-FCoV включает последовательность SEQ ID NO:3. Упомянутый плазмидный экспрессионный вектор по настоящему изобретению позволяет получить трансформированные клеточные линии Е. coli, синтезирующие белок N-FCoV, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:2. Таким образом, рекомбинантный белок N-FCoV по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 376 а.к.о. и может быть получен с помощью плазмидного экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
Также группа изобретений предлагает штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка N-FCoV, полученный трансформацией компетентных клеток. Е'. coli штамма BL21[DE3] плазмидным экспрессионным вектором по настоящему изобретению. Полученный штамм-продуцент демонстрирует стабильный рост в суспензионной культуре и экспрессию рекомбинантного белка по настоящему изобретению в растворимой форме.
Рекомбинантный белок N-FCoV по настоящему изобретению может быть использован для получения вакцины в отношении FCoV в виде композиции, содержащей растворитель, а также адъювант и иные вспомогательные вещества, например, стабилизаторы или консерванты, буферные растворы, или в виде лиофилизата, например, с применением лиопротектора или без него.
Также группа изобретений предлагает композицию для иммунизации против коронавируса кошек, содержащую рекомбинантный белок N-FCoV, сквалан, а-токоферол и полисорбат 80 в весовом соотношении 1: 750: 250: 50.
Сквалан, а-токоферол и полисорбат 80 представляют собой адъювант в виде эмульсии «масло в воде». Подобные адъюванты, содержащие полностью метаболизируемый липид сквалан, формирующий эмульсию, и иммуностимулятор а-токоферол (витамин Е) эффективно вызывают развитие Т-клеточного иммунного ответа на совместно вводимый антиген [Del Giudice G, Rappuoli R., Didierlaurent A.M. Correlates of adjuvanticity: A review on adjuvants in licensed vaccines. Seminars in Immunology. 2018; 39: 14-21]. Адъювантные свойства данной эмульсии обусловлены ее способностью к рекрутированию и активации антигенпрезентирующих клеток. При введении такого адъюванта происходит усиление антиген-специфического синтеза цитокинов Th1 (IFN-γ) и Th2 (IL-5 и IL-13), что обеспечивает активацию Т-клеточного иммунного ответа на вводимый антиген [Андреев Ю.Ю., Топтыгина А.П. Адъюванты и иммуномодуляторы в составе вакцин. Иммунология. 2021; 42(6): 720-729; Morel S. et al. Adjuvant System AS03 containing a-tocopherol modulates innate immune response and leads to improved adaptive immunity. Vaccine. 2011; 29(13): 2461-2473].
Также группа изобретений предлагает способ применения упомянутой композиции для профилактики коронавирус ной инфекции у кошек, заключающийся в том, что кошкам вводят композицию из расчета 25 мкг белка на кошку двукратно с интервалом в 21 день.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые не носят ограничительный характер.
Пример 1. Получение плазмидного экспрессионного вектора, содержащей ген белка
Из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/al1/, дата обращения 18.07.2023) были выгружены все полноразмерные аминокислотные последовательности белка нуклеокапсида коронавируса кошек FCoV. Последовательности были выровнены в программе Geneious Prime 2023.1, после чего была определена консенсусная последовательность белка (SEQ ID NO:2). Консенсусная последовательность -искусственная последовательность белка, содержащая в каждой позиции остаток аминокислоты, наиболее часто встречающийся у нескольких гомологичных последовательностей. Она представляет собой результат множественного выравнивания последовательностей, в которых гомологичные последовательности сравниваются друг с другом. Соответственно, консенсусная последовательность рекомбинантного белка N-FCoV по настоящему изобретению обладает свойствами последовательностей, используемых при выравнивании.
Полученная консенсусная аминокислотная последовательность была использована для дизайна искусственной нуклеотидной последовательности с учетом кодонового предпочтения и предпочтения пар кодонов для Е. coli. Полученная нуклеотидная последовательность на 5'- и 3'-концах фланкировалась последовательностями для распознавания эндонуклеазами Ncol (CCATGG) и XhoI (CTCGAG), необходимыми для встраивания в плазмидную ДНК. Синтез нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность по настоящему изобретению, и встраивание по указанным сайтам рестрикции в плазмидный экспрессионный вектор рЕТ-28а(+) проводили по стандартной методике.
Полученный плазмидный экспрессионный вектор секвенировали с помощью праймеров Т7 promotor (TAATACGACTCACTATAGGG), Т7 Terminator (GCTAGTTATTGCTCAGCGG) для подтверждения нуклеотидной последовательности, последовательность не содержала вставок, делеций и замен.
Нуклеотидная последовательность полученной ДНК соответствовала последовательности SEQ ID NO: 1.
Пример 2. Создание штамма продуцента рекомбинантного белка N-FCoV
Для получения штамма - продуцента рекомбинантного белка N-FCoV проводили трансформацию компетентных клеток Е. coli штамма BL21[DE3] методом электропорации по стандартной методике. Вектор рЕТ28а, приведенный в SEQ ID NO:3, содержит промотор для Т7 РНК полимеразы, а используемый штамм содержит в геноме ген Т7 РНК полимеразы под контролем lacUV5 промотора, что позволяет индуцировать экспрессию рекомбинантного белка с помощью ИПТГ или лактозы.
Таким образом получали штамм-продуцент Е. coli с включением нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Полученный штамм-продуцент из рабочего банка высевали на чашки Петри с селективной агаризованной средой LB. После инкубирования чашек Петри в течение 16 часов при плюс 37°С пересевали единичную колонию в жидкую среду LB24, содержащую 30 мкг/мл сульфата канамицина, 1% глюкозы и 1% глицерина. Культивировали в шейкер-инкубаторе при плюс 37°С, 250 об/мин в течение 16 часов. На следующий день ночную культуру разводили средой LB24, содержащей 30 мкг/мл сульфата канамицина и 0,2% глюкозы, до ОП600нм≈0,1. После чего культивировали 1,5 3 часа при плюс 30°С, 220 об/мин в термошейкере до достижения ОП600нм≈0,6-0,8. По достижении клетками начала логарифмической фазы роста температуру в шейкере-инкубаторе снижали до 25°С и добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. После внесения индуктора бактерии культивировали 16-18 часов при плюс 25°С, 220 об/мин. После окончания процесса культивирования проводили анализ уровня экспрессии методом вертикального диск-электрофореза в полиакрил амид ном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях.
На электрофореграмме клеток Е. coli, содержащих плазмидную ДНК pET-28a-N-FCoV, после индукции экспрессии и без индукции (Фиг. 2) видно, что целевой белок присутствует в пробе общего лизата клеток после индукции экспрессии 1 мМ ИПТГ. Это свидетельствует о том, что полученный штамм-продуцент экспрессирует рекомбинантный плазмидный экспрессионный вектор и синтезирует, а также секретирует в культуральную жидкость рекомбинантный белок N-FCoV. Экспрессия ДНК с оптимизированной последовательностью нуклеотидов обеспечило высокий уровень целевого белка - около 20% от общих клеточных белков. В качестве контроля использовали лизат клеток штамма-продуцента без индукции ИПТГ, полоса целевого белка на электрофореграмме отсутствует, что говорит об отсутствии неконтролируемой экспрессии целевой последовательности.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка N-FCoV
Биомассу Е. coli, содержащую синтезированный белок N-FCoV, лизировали на льду в буфере 20 мМ Трис - HCl, рН 8,5, 0,5 М NaCl из расчета 10 мл буфера на 1 г влажной биомассы клеток с использованием ультразвукового гомогенизатора И10-840 при следующих условиях: время воздействия 4 мин, мощность 100%, частота 43,5 кГц, импульс - 10 сек., пауза - 5 сек. В чистую пробирку отбирали общий лизат для последующего анализа методом вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Лизированную биомассу осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 10000 g при плюс 4°С. Супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и использовали для дальнейшей очистки. Пробу супернатанта отбирали в чистую пробирку для последующего анализа растворимой фракции методом вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Осадок в пробирках повторно ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, центрифугировали в течение 30 мин при 10000 g при плюс 4°С. Супернатант сливали, а образовавшийся осадок ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, в чистую пробирку отбирали пробу суспензии для последующего анализа нерастворимой фракции методом вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях.
На электрофореграмме фракций лизата клеток Е. coli, содержащих плазмидную ДНК pET-28a-N-FCoV, после индукции экспрессии и последующего разделения на фракции центрифугированием (Фиг. 3) видно, что целевой белок присутствует в пробе общего клеточного лизата до центрифугирования и в растворимой фракции (супернатант после центрифугирования) и отсутствует в нерастворимой фракции (осадок после центрифугирования). Таким образом, было показано, что при экспрессии в клетках Е. coli белок N-FCoV находится в растворимой фракции, что косвенно свидетельствует о его правильной трехмерной структуре.
Для проведения хроматографической очистки супернатант наносили на колонку, содержащую 20 мл сорбента Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare, США), уравновешенную десятью объемами буферного раствора А (20 мМ Трис HCl, рН 8,5, 0,5 М NaCl), с использованием хроматографа АКТА Explorer. После нанесения образца на колонку, ее промывали буферным раствором А со скоростью 3 мл/мин до выхода значений поглощения при длине волны 280 нм на плато. После этого на колонку подавали 10% буферного раствора Б (20 мМ Трис - HCl, рН 8,5, 0,15 М NaCl, 0,5 М имидазола) для того, чтобы смыть слабо связанные примеси, при этом скорость потока составляла 3 мл/мин. После выхода пика колонку промывали 100% буферным раствором Б для того, чтобы смыть целевой продукт. Фракции с поглощением более 50 mAU (единицы оптической плотности) анализировали методом вертикального диск-электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
Выход целевого белка происходит при концентрации имидазола 0,5 М (100% буферного раствора Б). Фракции, в которых присутствует целевой белок, объединяли.
Сконцентрированные фракции объемом 30 мл наносили на колонку, содержащую сорбент для эксклюзионной хроматографии Sephacryl S-200HR (GE Healthcare, США), уравновешенный буферным раствором В (20 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 100 мМ NaCl). Скорость потока составляла 0,75 мл/мин, объем элюции - 1000 мл.
Фракции с поглощением более 50 mAU анализировали методом вертикального диск-электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
Полученный после второй стадии раствор белка N-FCoV диализировали против буфера (NaH2PO4 0,010 М, KH2PO4 0,0018 М, NaCl 0,137 М, KCl 0,0027 М, рН 7,4).
Выход белка составил 50 мг/л с чистотой более 95%.
Пример 4. Определение защитных свойств белка N-FCoV
Исследование протективных (защитных) свойств белка N-FCoV проводили на лабораторных животных. Исследование проводили на нелинейных, не SPF (Specific Pathogen Free) кошках обоего пола. Возраст кошек - 14-18 недель к моменту иммунизации, вес 800-1200 г. Животные содержались в раздельных группах в условиях вивария с соблюдением основных зоогигиенических требований. Перед началом иммунизации кошки были проверены на отсутствие вирусов FCoV, FPV, FHV, FCV, FIV, FELV методом ИФА и ПЦР с использованием коммерческих наборов.
Лабораторных животных разделили на 6 групп:
группа 10М 5 самок, иммунизированных белком с водно-масляным адъювантом; группа 20М - 5 самцов, иммунизированных белком с водно-масляным адъювантом; группа 30А - 5 самок, иммунизированных белком с адъювантом гидроксидом алюминия;
группа 40А 5 самцов, иммунизированных белком с адъювантом гидроксидом алюминия;
группа 5Кк и - 3 не иммунизированных самки; группа 3 не иммунизированных самца.
Животных из групп 10М, 20М, 30А, 40А иммунизировали двукратно с интервалом в 21 день композицией, содержащей в 1 мл 25 мкг белка и 18,75 мг сквалана, 6,25 мг α-токоферола и 1,25 мг полисорбата 80 для групп 10М и 20М, или композицией, содержащей в 1 мл 25 мкг белка и адъювант на основе гидроксида алюминия (Alhydrogel® 2%, Brenntag Biosector A/S) в соотношении 1: 2 (адъювант: антиген) для групп 30А и 40А. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Через 21 день после последней иммунизации животным ороназально вводили вирус FCoV в дозе 1000 (3,0 lg) ТЦД50 на животное (доза, инфицирующая 50% культуры клеток с цитопатическим действием в 50% клеток монослоя). За 1 сутки до введения вируса у лабораторных животных проводили прижизненный отбор крови для определения титра специфических антител и анализа индукции специфического Т-клеточного иммунного ответа.
Животных наблюдали в течение 6 месяцев. Определяли день наступления смерти и коэффициент проявления клинических признаков наступления заболевания (инфекционного перитонита). Каждый день анализировали и оценивали следующие параметры:
- депрессия (неактивность в течение 3 дней подряд, 1 балл);
- анорексия (неупотребление пищи в течение 3 дней подряд, 1 балл);
- неврологические расстройства (1 балл).
Каждую неделю анализировали и оценивали следующие параметры:
- лихорадка (40,1°С, 1 балл);
- желтуха (желтая плазма, 1 балл);
- лимфопения (количество лимфоцитов менее 0,5*109/л, 1 балл);
- потеря в весе (потеря 2,5% веса тела, 1 балл).
Результаты расчета коэффициента проявления клинических признаков наступления заболевания (инфекционного перитонита) и день смерти после инфицирования представлены в Таблице 1.
В ходе анализа полученных данных было установлено, что у кошек, иммунизированных белком по настоящему изобретению вместе с водно-масляным адъювантом, стимулирующим Т-клеточный ответ, смертность во всех группах отсутствует, протективная (защитная) эффективность составила 100%, средний коэффициент проявления заболевания составил всего 0,60±0,55 и 0,80±0,50. В группе, иммунизированной белком по настоящему изобретению вместе с адъювантом гидроксидом алюминия, стимулирующим гуморальный В-клеточный иммунный ответ, смертность и протективная эффективность составили 50%, средний коэффициент проявления заболевания составил 3,60±4,10 и 4,40±4,04. Все животные в контрольных группах погибли.
Пример 5. Определение титра антител
Титр антител, вырабатываемых после введения белка согласно изобретению, определяли по следующей методике.
После проведения двух иммунизаций на 41-й день у всех животных забирали кровь. Кровь центрифугировали при 4000 об/мин и отбирали сыворотку для проведения ИФА.
Предварительно в каждую лунку микротитровального планшета вносили по 200 мкл 5 мкг/мл раствора рекомбинантного белка N-FCoV по настоящему изобретению (далее АГ) в карбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты инкубировали ночь при 4°С.Далее удаляли раствор АГ из лунок и вносили в каждую лунку по 200 мкл блокирующего буфера (10 мМ Н2РО4, 150 мМ NaCl, 10% казеина, 5% сахарозы). Инкубировали 30 мин при 37°С. Содержимое лунок тщательно удаляли. Вносили во все лунки планшета кроме первого ряда по 100 мкл раствора для разведения (РР) (1×ТБС, 0,1% казеин), в первый ряд вносили по 125 мкл раствора сывороток, разведенных в 100 раз РР, и титровали с шагом в х5. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С в термостате. После удаления содержимого, промывали планшеты 3 раза промывочным буфером (ПБ) (1хТБС, 0,05% Твин 20). Конъюгат козьих анти-кошачьих антител класса IgG с пероксидазой хрена (Sigma, США) разводили РР 1:20000. Вносили по 100 мкл конъюгата в лунку. Инкубировали планшеты с конъюгатом 30 минут при 37°С. После удаления конъюгата отмывали планшеты 4 раза ПБ. В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) и выдерживали 15 минут, после чего останавливали реакцию внесением в каждую лунку по 100 мкл 1М H2SO4. Считывание оптической плотности (ОП) производили на планшетном ридере спектрофотометра Epoch (Biotek) при длине волны 450 нм. Результаты приведены в таблицах 25.
Титр это максимальное разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается положительный результат. Положительным считается значение оптической плотности, более чем в 2 раза превышающее значение ОП для сыворотки от не иммунизированных животных в том же разведении.
По полученным результатам, приведенным в таблицах 2 5, можно видеть, что средний титр AT к АГ спустя месяц после начала иммунизации в группах ОМ составил 1:27500, в группах OA - 1:52500. Титр антител в группах, иммунизированных рекомбинантный белком с адъювантом, стимулирующим гуморальный ответ, значительно выше, чем в группах с адъювантом, стимулирующим Т-клеточный ответ.
Пример 6. Определение Т-клеточного иммунного ответа
После проведения двух иммунизации на 41-й день у всех животных забирали кровь. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) были выделены с использованием пробирок для центрифугирования в градиенте плотности SepMate™-15 (RUO) (STEMCELL Technologies, США).
Отобранные PBMCs инокулировали в количестве 5-106 клеток/мл в объеме 200 мкл среды RPMI 1640 с добавками 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамин, 1% неосновные аминокислоты, 1% пируват натрия, 50 Е/мл пенициллин и стрептомицин, в лунки 96-луночного культурального планшета и инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 7 дней. Для стимуляции антиген-специфического синтеза интерферона гамма (ИФНγ) добавляли белок N-FCoV по настоящему изобретению, а в качестве отрицательного контроля использовали клетки в культуральной среде.
Концентрацию ИФНγ в кондиционированной культуральной жидкости после стимуляции клеток белком N-FCoV определяли с использованием коммерческой ИФА тест-системы Feline IFN gamma ELISA Kit (Abeam, США). Чувствительность метода составляет 0,24 нг/мл, диапазон измерения 0,24 - 60 нг/мл.
Результаты измерений представлены на Фиг. 4. Белок N-FCoV совместно с Т-клеточным адъювантом достоверно (р<0,01) вызывает более сильный Т-клеточный ответ по сравнению с В-клеточным адъювантом.
Таким образом, с помощью заявленной группы изобретений можно добиться иммунного ответа в отношении коронавируса кошек, в том числе, в частном случае, клеточного иммунного ответа, в том числе, в частном случае, защитного иммунного ответа.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"
fileName="2023122759_listing.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-09-01">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023122759</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-09-01</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ИННОВА ПЛЮС"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Innova plus LLC</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантный белок для
иммунизации против коронавируса кошек</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1128</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1128</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcgacccagggtcagcgtgttaactggggtgacgaaccgtctaaacgtc
gtggtcgttctaactctcgtggtcgtaaaaacggtaacatcccgctgtcttacttcaacccgatcaccct
ggaatctggttctaaattctggaacgtttgcccgcgtgacttcgttccgaaaggtatcggtaacaaagac
cagcagatcggttactggaaccgtcaggaacgttaccgtatcgttaaaggtcagcgtaaagaactgccgg
aacgttggttcttctacttcctgggtaccggtccgcacgcggacgcgaaattcaaagacaaaatcgacgg
tgttttctgggttgcgcgtgacggtgcgatgaacaaaccgaccaccctgggtacccgtggtaccaacaac
gaatctaaaccgctgaaattcgacggtaaaatcccgccgcagttccagctggaagttaaccgttctcgta
acaactctcgttctggttctcagtctcgttctgtttctcgtaaccgttctcagtctcgtggtcgtcagca
gtctaacaaccagaacaacaacgttgaagacaccatcgttgcggttctgcagaaactgggtgttaccgac
aaacagcgttctcgttctaaatctcgtgaccgttctgactctaaatctcgtgacaccaccccgaaaaacg
cgaacaaacacacctggaaaaaaaccgcgggtaaaggtgacgttaccaacttctacggtgcgcgttctgc
gtctgcgaacttcggtgactctgacctggttgcgaacggtaacgcggcgaaatgctacccgcagatcgcg
gaatgcgttccgtctgtttcttctatgctgttcggttctcagtggtctgcggaagaagcgggtgaccagg
ttaaagttaccctgacccacacctactacctgccgaaagacgacgcgaaaacctctcagttcctggaaca
gatcgacgcgtacaaacgtccgtctcaggttgcgaaagaccagcgtcagcgtaaatctcgttctaaatct
gcggacaaaaaaccggaagaactgtctgttaccctggttgaagcgtacaccgacgttttcgacgacaccc
aggttgaaatgatcgacgaagttaccaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>376</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..376</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ATQGQRVNWGDEPSKRRGRSNSRGRKNGNIPLSYFNPITLESGSKFWNV
CPRDFVPKGIGNKDQQIGYWNRQERYRIVKGQRKELPERWFFYFLGTGPHADAKFKDKIDGVFWVARDGA
MNKPTTLGTRGTNNESKPLKFDGKIPPQFQLEVNRSRNNSRSGSQSRSVSRNRSQSRGRQQSNNQNNNVE
DTIVAVLQKLGVTDKQRSRSKSRDRSDSKSRDTTPKNANKHTWKKTAGKGDVTNFYGARSASANFGDSDL
VANGNAAKCYPQIAECVPSVSSMLFGSQWSAEEAGDQVKVTLTHTYYLPKDDAKTSQFLEQIDAYKRPSQ
VAKDQRQRKSRSKSADKKPEELSVTLVEAYTDVFDDTQVEMIDEVTN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6406</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6406</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtg
gtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttccctt
cctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatt
tagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccc
tgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactg
gaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattg
gttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttca
ggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgt
atccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcag
gattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttcca
taggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttc
ccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggca
aaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgc
atcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaagga
caattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctg
aatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatc
atcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgacc
atctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggct
tcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataa
atcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataaca
ccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttt
tcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc
aactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccg
tagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccag
tggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggc
gcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactg
agatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccgg
taagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag
tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagccta
tggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttct
ttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccg
cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctc
cttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgc
atagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaa
cacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctc
cgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctca
tcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctcca
gaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactga
tgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacg
atacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatgga
tgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttcc
acagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtt
tccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagc
agcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcc
tagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcc
tgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccga
ataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagag
cgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatg
ccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtg
ccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttt
tcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatg
agctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaat
ggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattc
agcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaa
tttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcc
cgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttca
tgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgc
aggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttg
cgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacg
ctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagac
tggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgta
attcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcacc
acgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacat
tcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgat
ggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgag
gccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacg
gggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccat
cggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtcc
ggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggata
acaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatc
atcatcatcacagcagcggcgcgacccagggtcagcgtgttaactggggtgacgaaccgtctaaacgtcg
tggtcgttctaactctcgtggtcgtaaaaacggtaacatcccgctgtcttacttcaacccgatcaccctg
gaatctggttctaaattctggaacgtttgcccgcgtgacttcgttccgaaaggtatcggtaacaaagacc
agcagatcggttactggaaccgtcaggaacgttaccgtatcgttaaaggtcagcgtaaagaactgccgga
acgttggttcttctacttcctgggtaccggtccgcacgcggacgcgaaattcaaagacaaaatcgacggt
gttttctgggttgcgcgtgacggtgcgatgaacaaaccgaccaccctgggtacccgtggtaccaacaacg
aatctaaaccgctgaaattcgacggtaaaatcccgccgcagttccagctggaagttaaccgttctcgtaa
caactctcgttctggttctcagtctcgttctgtttctcgtaaccgttctcagtctcgtggtcgtcagcag
tctaacaaccagaacaacaacgttgaagacaccatcgttgcggttctgcagaaactgggtgttaccgaca
aacagcgttctcgttctaaatctcgtgaccgttctgactctaaatctcgtgacaccaccccgaaaaacgc
gaacaaacacacctggaaaaaaaccgcgggtaaaggtgacgttaccaacttctacggtgcgcgttctgcg
tctgcgaacttcggtgactctgacctggttgcgaacggtaacgcggcgaaatgctacccgcagatcgcgg
aatgcgttccgtctgtttcttctatgctgttcggttctcagtggtctgcggaagaagcgggtgaccaggt
taaagttaccctgacccacacctactacctgccgaaagacgacgcgaaaacctctcagttcctggaacag
atcgacgcgtacaaacgtccgtctcaggttgcgaaagaccagcgtcagcgtaaatctcgttctaaatctg
cggacaaaaaaccggaagaactgtctgttaccctggttgaagcgtacaccgacgttttcgacgacaccca
ggttgaaatgatcgacgaagttaccaactaatgactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggct
gctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttg
gggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (10)
1. Рекомбинантный белок для иммунизации против коронавируса кошек, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
2. Белок по п. 1, дополнительно содержащий гистидиновую метку из 6-10 остатков гистидина.
3. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп. 1 или 2.
4. Нуклеиновая кислота по п. 3, содержащая последовательность SEQ ID NO:1.
5. Экспрессионный вектор для трансформации штаммов клеток Escherichia coli, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 3 или 4.
6. Вектор по п. 5, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор.
7. Вектор по п. 6, который включает SEQ ID NO:3.
8. Штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка по п. 1, полученный трансформацией компетентных клеток Е. coli штамма BL21[DE3] плазмидным экспрессионным вектором по п. 6.
9. Композиция для иммунизации против коронавируса кошек, содержащая рекомбинантный белок по п. 1, сквалан, α-токоферол и полисорбат 80 в весовом соотношении 1 : 750 : 250 : 50.
10. Способ применения композиции по п. 9 для профилактики коронавирусной инфекции у кошек, заключающийся в том, что кошкам вводят композицию из расчёта 25 мкг белка на кошку двукратно с интервалом в 21 день.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808965C1 true RU2808965C1 (ru) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000302692A (ja) * | 1999-04-21 | 2000-10-31 | Kyoritsu Shoji Kk | コロナウイルス感染症に対するｄｎａワクチン |
| US20050053622A1 (en) * | 2001-08-09 | 2005-03-10 | Andre Aubert | Anti-coronavirus vaccine |
| US20120107390A1 (en) * | 2002-07-04 | 2012-05-03 | Kitatsato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Feline infectious peritonitis vaccine |
| RU2784533C2 (ru) * | 2017-11-06 | 2022-11-28 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина против вируса лейкоза кошачьих |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000302692A (ja) * | 1999-04-21 | 2000-10-31 | Kyoritsu Shoji Kk | コロナウイルス感染症に対するｄｎａワクチン |
| US20050053622A1 (en) * | 2001-08-09 | 2005-03-10 | Andre Aubert | Anti-coronavirus vaccine |
| US20120107390A1 (en) * | 2002-07-04 | 2012-05-03 | Kitatsato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Feline infectious peritonitis vaccine |
| RU2784533C2 (ru) * | 2017-11-06 | 2022-11-28 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина против вируса лейкоза кошачьих |
| RU2797538C2 (ru) * | 2017-11-06 | 2023-06-07 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Поливалентная вакцина для животных семейства кошачьих |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brooksby | Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus | |
| US20220031831A1 (en) | Immunogenic compositions for african swine fever virus | |
| CN116143938B (zh) | 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用 | |
| Choi et al. | Antibody-independent protection against rotavirus infection of mice stimulated by intranasal immunization with chimeric VP4 or VP6 protein | |
| US20150165018A1 (en) | Cd2 deficient african swine fever virus as live attenuated or subsequently inactivated vaccine against african swine fever in mammals | |
| JPH07289250A (ja) | ブタ生殖呼吸症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のヨーロッパワクチン株 | |
| WO2009133054A1 (en) | Novel avian astrovirus | |
| Ivanov et al. | Vaccination with viral protein-mimicking peptides postpones mortality in domestic pigs infected by African swine fever virus | |
| CN114107228B (zh) | 缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用 | |
| Flexner et al. | Successful vaccination with a polyvalent live vector despite existing immunity to an expressed antigen | |
| CA2738664C (en) | Bovine herpes virus-1 compositions, vaccines and methods | |
| CN114015660B (zh) | 缺失十个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用 | |
| CN104628865B (zh) | 一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗 | |
| US20090017063A1 (en) | Edible vaccine | |
| TW201823466A (zh) | 新穎之啟動子 | |
| JP2022507053A (ja) | 新規ブタロタウイルス | |
| Li et al. | Surface Display of porcine circovirus type 2 antigen protein cap on the spores of Bacillus subtilis 168: An effective mucosal vaccine candidate | |
| CN113943714A (zh) | 一种猫杯状病毒毒株及其应用 | |
| US11464852B2 (en) | Modified PEDV spike protein | |
| RU2697151C2 (ru) | Рекомбинантный нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита и его применение | |
| RU2808965C1 (ru) | Рекомбинантный белок для иммунизации против коронавируса кошек | |
| CN113980101B (zh) | 一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗 | |
| Zhang et al. | Enhanced protective immune response to PCV2 adenovirus vaccine by fusion expression of Cap protein with InvC in pigs | |
| US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| JP2008127283A (ja) | ネコ伝染性腹膜炎用ワクチン |