RU2805195C2

RU2805195C2 - Method and device for implementing colorimetric amplification analysis of nucleic acids in real time

Info

Publication number: RU2805195C2
Application number: RU2021115271A
Authority: RU
Inventors: Георгиос ПАПАДАКИС; Электра ГИЗЕЛИ; Александрос ПАНТАЗИС
Original assignee: Байопикс Дна Текнолоджи П.К.
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2023-10-12

Abstract

FIELD: analysis of nucleic acids.

SUBSTANCE: group of inventions is related to implementation and monitoring of colorimetric amplification analysis of nucleic acids in real time. A method for performing real-time colorimetric nucleic acid amplification analysis of a liquid sample contained in a reaction tube includes heating the liquid sample by bringing the bottom of the reaction tube into thermal contact with a heating element and applying pressure to the reaction tube in the direction of the heating element. The device comprises a heating element, a reaction tube made of a translucent or transparent material, means for applying pressure to the reaction tube in the direction of the heating element, a digital colour photo-video camera, and a processing module configured to process an image obtained using a digital colour photo-video camera.

EFFECT: implementation of a group of inventions allows for real-time monitoring of colorimetric amplification analysis of nucleic acids while ensuring increased efficiency of sample heating.

23 cl, 6 dwg, 3 ex

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к осуществлению и мониторингу колориметрических амплификационных анализов нуклеиновых кислот в реальном времени.The present invention relates to the implementation and monitoring of colorimetric nucleic acid amplification assays in real time.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

Понимание живых организмов в терминах их молекулярного состава привело к дизайну все более быстрых и точных диагностических тестов, в основном, на основе амплификации и количественного анализа нуклеиновых кислот. Оно также привело к новой тенденции в молекулярной диагностике, состоящей в необходимости наличия конкретного диагностического анализа в центре, в котором образец получают или в котором лечат пациента (тестирование "в месте оказания медицинской помощи"). В случае тестирования в месте оказания медицинской помощи дизайн все более быстрых и точных диагностических анализов, в основном, на основе амплификации и количественного анализа нуклеиновой кислоты в настоящее время является развивающейся областью с обширным использованием в здравоохранении, сельскохозяйственной/пищевой безопасности, исследованиях и т.д. Одним из наиболее широко распространенных анализов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой используют фермент полимеразу, с помощью которого экспоненциально амплифицируют специфическую мишень после нескольких циклов нагревания. Каждый цикл включает три стадии: 1. Нагревание при 92-98°C для денатурации двухцепочечной ДНК 2. Отжиг специфических праймеров при 50-65°C; и 3. Элонгацию цепей с помощью полимеразы при 72°C. Эффективного нагревания, необходимого для быстрого и корректного образования продукта, достигают посредством помещения реакционного сосуда (как правило, пробирки Eppendorf) в нагревательный (металлический) блок, как правило, располагаемый на нагревательном элементе. ПЦР, хотя и является золотым стандартом лабораторной детекции нуклеиновых кислот и подходит для детекции по конечной точке и количественной детекции в реальном времени, неидеальна для использования в месте оказания медицинской помощи или полевых (реальных) условиях. Причиной этого является то, что в случае ПЦР необходимо оборудование для усовершенствованного контроля температуры и оптического (флуоресцентного) мониторинга, являющегося дорогостоящим и/или трудным для перемещения вместе с пользователем. Один из альтернативных способов амплификации ДНК, петлевую изотермическую амплификацию (LAMP), считают идеальным для использования в месте оказания медицинской помощи (POC), т.к. в нем необходима только одна температура для амплификации (65°C), и с помощью него можно достигать визуальной детекции ДНК по изменению цвета (колориметрически). В колориметрических условиях LAMP-амплификации реакционный сосуд помещают внутрь нагревательного блока, схожего с используемым для ПЦР. Существующие форматы колориметрического способа LAMP основаны только на измерении по конечной точке. Однако они имеют два основных недостатка; во-первых, изменение цвета зачастую трудно определить невооруженным взглядом, и, во-вторых, измерения по конечной точке можно использовать в качестве качественных тестов (да или нет), что может не соответствовать многим важным областям использования. В настоящее время, нет доступного решения этих проблем.Understanding living organisms in terms of their molecular composition has led to the design of increasingly rapid and accurate diagnostic tests, primarily based on nucleic acid amplification and quantitation. It has also led to a new trend in molecular diagnostics to require a specific diagnostic test to be available at the center where the sample is obtained or where the patient is treated (point-of-care testing). In the case of point-of-care testing, the design of increasingly rapid and accurate diagnostic assays, primarily based on nucleic acid amplification and quantitation, is currently an emerging field with extensive use in healthcare, agricultural/food safety, research, etc. . One of the most widely used tests is the polymerase chain reaction (PCR), which uses the enzyme polymerase to exponentially amplify a specific target after several heating cycles. Each cycle includes three stages: 1. Heating at 92-98°C to denature double-stranded DNA 2. Annealing of specific primers at 50-65°C; and 3. Chain elongation using polymerase at 72°C. Effective heating, necessary for rapid and correct formation of the product, is achieved by placing the reaction vessel (usually an Eppendorf tube) in a heating (metal) block, usually located on a heating element. PCR, although the gold standard for laboratory detection of nucleic acids and suitable for endpoint detection and quantitative real-time detection, is not ideal for use in point-of-care or field (real-life) settings. The reason for this is that PCR requires advanced temperature control and optical (fluorescence) monitoring equipment that is expensive and/or difficult to carry with the user. One alternative DNA amplification method, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), is considered ideal for point-of-care (POC) use because it requires only one temperature for amplification (65°C) and can achieve visual detection of DNA by color change (colorimetrically). In colorimetric LAMP amplification conditions, the reaction vessel is placed inside a heating block similar to that used for PCR. Existing LAMP colorimetric formats are based on endpoint measurement only. However, they have two main disadvantages; firstly, color change is often difficult to detect with the naked eye, and secondly, endpoint measurements can be used as qualitative tests (yes or no), which may not be appropriate for many important applications. Currently, there is no available solution to these problems.

Ключевой признак, который, при его разрешении, позволил бы преодолеть указанные препятствия и осуществлять колориметрическую амплификацию нуклеиновой кислоты в реальном времени, относится к изобретению способа мониторинга изменения цвета раствора во время протекания процесса при комбинировании с одновременным эффективным нагреванием реакционной смеси. Все используемые в настоящее времени форматы основаны на помещении реакционного сосуда внутрь нагревательного блока, что делает возможной эффективную амплификацию при необходимой повышенной температуре. Это означает, что визуального мониторинга, такого как осмотр и детекция, можно достигать только для верхней части сосуда. Однако, т.к. в течение реакции амплификации сосуд нагревают, часть жидкого образца преобразуется в пар, что мешает каким-либо образом осуществлять колориметрический мониторинг в реальном времени сверху реакционного сосуда. По этой причине, существующие форматы колориметрического способа LAMP основаны только на измерении по конечной точке после того, как образцу позволяют охладиться до комнатной температуры. Это означает, что при использовании существующих форматов невозможно осуществлять колориметрический мониторинг в реальном времени.The key feature, which, if resolved, would allow one to overcome these obstacles and perform colorimetric nucleic acid amplification in real time, relates to the invention of a method for monitoring the color change of the solution during the process when combined with simultaneous effective heating of the reaction mixture. All currently used formats are based on placing the reaction vessel inside a heating block, allowing efficient amplification at the required elevated temperature. This means that visual monitoring such as inspection and detection can only be achieved for the top of the vessel. However, because During the amplification reaction, the vessel is heated and some of the liquid sample is converted to vapor, preventing any real-time colorimetric monitoring from above the reaction vessel. For this reason, existing LAMP colorimetric method formats are based only on end point measurements after the sample is allowed to cool to room temperature. This means that real-time colorimetric monitoring is not possible using existing formats.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Авторы настоящего изобретения разработали способ преобразования в ином случае качественных колориметрических амплификационных анализов нуклеиновой кислоты, например, анализов LAMP, в количественные способы и, как правило, способы анализа в реальном времени. Для достижения этого они разработали способ и устройство для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Одним из важных аспектов настоящего изобретения является нагревание жидкого образца без помещения образца в нагревательный блок. Этого достигают посредством приведения дна реакционной пробирки, содержащей образец, в термический контакт с нагревательным элементом. Способ облегчает визуальный мониторинг, т.к. он делает возможной визуализацию содержимого сосуда через боковую стенку реакционной пробирки. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу мониторинга колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот с использованием указанного выше способа нагревания и с использованием визуального мониторинга, например, с использованием фотовидеокамеры.The present inventors have developed a method for converting otherwise qualitative colorimetric nucleic acid amplification assays, such as LAMP assays, into quantitative and typically real-time assay methods. To achieve this, they developed a method and apparatus for performing colorimetric real-time nucleic acid amplification analysis. One important aspect of the present invention is heating a liquid sample without placing the sample in a heating block. This is achieved by bringing the bottom of the reaction tube containing the sample into thermal contact with a heating element. The method facilitates visual monitoring, because it makes it possible to visualize the contents of the vessel through the side wall of the reaction tube. The present invention further relates to a method for monitoring a colorimetric nucleic acid amplification assay using the above heating method and using visual monitoring, for example, using a camera.

Кроме того, настоящее изобретение относится к устройству для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени.In addition, the present invention relates to a device for performing colorimetric amplification analysis of nucleic acids in real time.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На фигуре 1 показаны разные части реакционной пробирки и след дна реакционной пробирки.Figure 1 shows different parts of the reaction tube and a trace of the bottom of the reaction tube.

На фигуре 2 показана схема устройства по настоящему изобретению.Figure 2 shows a diagram of the device according to the present invention.

На фигуре 3 показан вариант осуществления устройства по настоящему изобретению.Figure 3 shows an embodiment of the device of the present invention.

На фигуре 4 показано расположение реакционных пробирок в устройстве по настоящему изобретению.Figure 4 shows the arrangement of reaction tubes in the device of the present invention.

На фигуре 5 показаны экспериментальные данные анализа LAMP, осуществленного по настоящему изобретению, с использованием фенолового красного и гидроксинафтол синего (HNB) в качестве цветных веществ-индикаторов.Figure 5 shows experimental data from a LAMP assay performed in accordance with the present invention using phenol red and hydroxynaphthol blue (HNB) as color indicator substances.

На фигуре 6 показаны экспериментальные данные анализа LAMP, осуществленного по настоящему изобретению, с использованием фенолового красного в качестве цветного вещества-индикатора под разным давлением.Figure 6 shows the experimental data of the LAMP assay carried out according to the present invention using phenol red as a color indicator substance under different pressures.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В амплификационных анализах нуклеиновых кислот, жидкий образец, как правило, содержится в реакционной пробирке, зачастую названной пробиркой Eppendorf. Как правило, такую пробирку получают из полимерного материала, такого как полипропелен, и она имеет объем от 10 мл до 200 мл. Реакционные пробирки, схожие с коммерчески доступными пробирками Eppendorf, можно производить с использованием оптически прозрачных/полупрозрачных материалов и 3D-печати.In nucleic acid amplification assays, a liquid sample is typically contained in a reaction tube, often called an Eppendorf tube. Typically, such a tube is made of a polymeric material such as polypropylene and has a volume of 10 ml to 200 ml. Reaction tubes similar to commercially available Eppendorf tubes can be produced using optically transparent/translucent materials and 3D printing.

В системах на предшествующем уровне техники для нагревания жидкой фазы до необходимой температуры пробирку помещают в нагревательный блок.In prior art systems, the test tube is placed in a heating block to heat the liquid phase to the required temperature.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что помещение сосуда внутрь нагревательного блока не является обязательным для эффективной амплификации, и что жидкую фазу можно нагревать посредством приведения дна пробирки, содержащей жидкую фазу, в термический контакт с нагревательным элементом.The inventors of the present invention have surprisingly discovered that placing the vessel inside a heating block is not necessary for efficient amplification, and that the liquid phase can be heated by bringing the bottom of the tube containing the liquid phase into thermal contact with the heating element.

В рамках изобретения "верх пробирки" или "верх реакционной пробирки" представляет собой отверстие, через которое жидкий образец помещают в пробирку. "Дно пробирки" или "дно реакционной пробирки" является частью пробирки, противоположной верху пробирки. На фигуре 1a показан верх (1), дно (2) и боковая стенка (3) реакционной пробирки.As used herein, a "tube top" or "reaction tube top" is an opening through which a liquid sample is introduced into the tube. The "bottom of the test tube" or "bottom of the reaction tube" is the part of the test tube opposite the top of the test tube. Figure 1a shows the top (1), bottom (2) and side wall (3) of the reaction tube.

В рамках изобретения реакционную пробирку можно располагать непосредственно на поверхности нагревательного элемента. Кроме того, нагревательный элемент может содержать поверхность, полученную из теплопроводного материала, на котором можно располагать реакционную пробирку. Нагревательный элемент, как правило, представляет собой резистивный нагреватель или элемент Пельтье.Within the scope of the invention, the reaction tube can be placed directly on the surface of the heating element. In addition, the heating element may include a surface made of a thermally conductive material on which the reaction tube can be placed. The heating element is typically a resistive heater or Peltier element.

Предпочтительно, при помещении на нагревательный элемент продольная ось пробирки образует угол с нагревательным элементом, составляющий от 60 до 120 градусов. Более предпочтительно, угол, предпочтительно является прямым углом.Preferably, when placed on the heating element, the longitudinal axis of the tube forms an angle with the heating element of 60 to 120 degrees. More preferably, the angle is preferably a right angle.

Для эффективного амплификационного анализа нуклеиновых кислот эффективное нагревание жидкой фазы является одним из наиболее важным условий. На существующем уровне техники известно, что для эффективного нагревания жидкой фазы большая площадь реакционной пробирки должна находиться в термическом контакте с нагреваемым корпусом. По этой причине реакционную пробирку необходимо помещать в металлический блок, окружающий почти всю пробирку, и она находится в термическом контакте с дном и боковой стенкой пробирки. Это означает, что на предшествующем уровне техники известно, что для эффективного нагревания почти вся поверхность пробирки должна находиться в термическом контакте с нагреваемым корпусом. Теперь неожиданно обнаружено, что эффективного нагревания можно достигать посредством приведения только дна пробирки, т.е. очень небольшой части пробирки, в термический контакт с нагревательным элементом.For efficient amplification analysis of nucleic acids, effective heating of the liquid phase is one of the most important conditions. It is known in the prior art that in order to effectively heat the liquid phase, a large area of the reaction tube must be in thermal contact with the heated body. For this reason, the reaction tube must be placed in a metal block that surrounds almost the entire tube and is in thermal contact with the bottom and side wall of the tube. This means that it is known in the prior art that for effective heating, almost the entire surface of the tube must be in thermal contact with the heated body. It has now surprisingly been discovered that effective heating can be achieved by bringing only the bottom of the test tube, i.e. a very small part of the test tube is in thermal contact with the heating element.

Предпочтительно, площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте, с нагревательным элементом, составляет до 12 мм². Более предпочтительно, площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом, составляет до 6 мм². Даже более предпочтительно, площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом, составляет до 3 мм². Площадь пробирки, находящаяся в термическом контакте с нагревательным элементом, можно определять посредством установления следа дна пробирки, как показано на фигуре 1 b. Сначала дно пробирки окрашивают, например, маркером, а затем пробиркой давят на кусок бумаги (4) для получения кольцевого следа (5) дна пробирки. Площадь следа является площадью пробирки, находящейся в термическом контакте с нагревательным элементом.Preferably, the area of the tube in thermal contact with the heating element is up to 12 mm ² . More preferably, the area of the tube in thermal contact with the heating element is up to 6 mm ² . Even more preferably, the area of the tube in thermal contact with the heating element is up to 3 mm ² . The area of the tube in thermal contact with the heating element can be determined by establishing a trace of the bottom of the tube, as shown in Figure 1 b. First, the bottom of the test tube is colored, for example, with a marker, and then the test tube is pressed onto a piece of paper (4) to obtain a circular mark (5) of the bottom of the test tube. The trace area is the area of the test tube in thermal contact with the heating element.

Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что эффективность способа нагревания по настоящему изобретению можно повышать, прилагая давление к пробирке в направлении нагревательного элемента. Например, делая так, значительно уменьшают количество времени, необходимое до начала реакции амплификации. Этот аспект очень важен, особенно при использовании в месте оказания медицинской помощи, где анализ необходимо осуществлять за как можно более короткое время. Предпочтительно, давление, прилагаемое к реакционной пробирке, является таким, что давление, прилагаемое к нагревательному элементу с помощью пробирки, составляет от 0,4 мПа до 15 мПа. Более предпочтительно, давление, прилагаемое к нагревательному элементу с помощью пробирки, составляет от 1 мПа до 10 мПа. Даже более предпочтительно, давление, прилагаемое к нагревательному элементу с помощью пробирки, составляет от 1 мПа до 3 мПа. Давление можно корректировать разными способами, хорошо известными специалисту в этой области. Например, давление можно корректировать, прилагая разные веса к пробирке, или с использованием системы винтов, или с использованием системы магнитов. Давление можно определять способами, хорошо известными специалисту в этой области. Например, давление можно вычислять посредством измерения перпендикулярной силы, прилагаемой к нагревательному элементу с помощью пробирки, затем измеряя площадь пробирки, находящуюся в контакте с нагревательным элементом, как описано выше, и, в конечном итоге, разделяя значение перпендикулярной силы на площадь.The inventors of the present invention have also surprisingly discovered that the efficiency of the heating method of the present invention can be increased by applying pressure to the test tube in the direction of the heating element. For example, by doing so, the amount of time required before the amplification reaction begins is significantly reduced. This aspect is very important, especially for point-of-care applications where the analysis must be carried out in the shortest possible time. Preferably, the pressure applied to the reaction tube is such that the pressure applied to the heating element by the test tube is from 0.4 MPa to 15 MPa. More preferably, the pressure applied to the heating element by the test tube is 1 mPa to 10 mPa. Even more preferably, the pressure applied to the heating element by the test tube is 1 MPa to 3 MPa. The pressure can be adjusted in a variety of ways well known to one skilled in the art. For example, the pressure can be adjusted by applying different weights to the test tube, or by using a screw system, or by using a magnet system. Pressure can be determined by methods well known to one skilled in the art. For example, pressure can be calculated by measuring the perpendicular force applied to the heating element using a test tube, then measuring the area of the test tube in contact with the heating element as described above, and finally dividing the perpendicular force value by the area.

Амплификационный анализ нуклеиновых кислот может являться, например, изотермическим амплификационным анализом, таким как транскрипционно-опосредованная амплификация, амплификация, основанная на последовательности нуклеиновой кислоты, технология сигнал-опосредованной амплификации РНК, амплификация с замещением цепей, амплификация по типу катящегося кольца, LAMP, изотермическая амплификация с множественным замещением, рекомбиназная полимеразная амплификация, хеликаза-завивисмая амплификация, изотермическая амплификация одиночным праймером и хеликаза-зависимая амплификация по типу катящегося кольца. Предпочтительно, анализ является анализом LAMP.The nucleic acid amplification assay may be, for example, an isothermal amplification assay such as transcription-mediated amplification, nucleic acid sequence-based amplification, signal-mediated RNA amplification technology, strand displacement amplification, rolling ring amplification, LAMP, isothermal amplification multiple displacement, recombinase polymerase amplification, helicase-dependent amplification, isothermal single primer amplification and helicase-dependent rolling circle amplification. Preferably, the assay is a LAMP assay.

Эффективность способа нагревания по настоящему изобретению является такой же, как у способов на предшествующем уровне техники, в которых пробирку помещают в нагревательный блок. С другой стороны, способ нагревания по настоящему изобретению имеет более высокую эффективность в отношении потребления электроэнергии, т.к. количество энергии, необходимое для нагревания жидкой фазы, является меньшим.The efficiency of the heating method of the present invention is the same as that of prior art methods in which a test tube is placed in a heating block. On the other hand, the heating method of the present invention has higher efficiency in terms of power consumption because the amount of energy required to heat the liquid phase is less.

Другое преимущество способа нагревания по настоящему изобретению состоит в том, что, если пробирку получают из полупрозрачного или прозрачного материала, содержимое пробирки является видимым не только сверху пробирки, но, что более важно, через боковую стенку. Это означает, что визуальный мониторинг параметра анализа, такого как изменение цвета в колориметрическом анализе LAMP, становится возможным во время анализа. Это является результатом того, что испарение образца во время реакции амплификации не мешает мониторингу. Таким образом, способ нагревания по настоящему изобретению делает возможным мониторинг анализа в реальном времени.Another advantage of the heating method of the present invention is that if the tube is made of a translucent or transparent material, the contents of the tube are visible not only from the top of the tube, but more importantly through the side wall. This means that visual monitoring of an assay parameter, such as color change in a LAMP colorimetric assay, becomes possible during the assay. This is a result of the fact that sample evaporation during the amplification reaction does not interfere with monitoring. Thus, the heating method of the present invention makes it possible to monitor the analysis in real time.

Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способу осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, где способ включает нагревание жидкой фазы посредством приведения дна пробирки, содержащей жидкую фазу, в термический контакт с нагревательным элементом и использование визуального мониторинга параметра анализа в реальном времени.Thus, another aspect of the present invention relates to a method of performing a colorimetric real-time nucleic acid amplification assay, where the method includes heating a liquid phase by bringing the bottom of a tube containing the liquid phase into thermal contact with a heating element and using real-time visual monitoring of the assay parameter .

Визуальный мониторинг включает мониторинг с помощью зрения пользователя, а также мониторинг с помощью фотовидеокамеры. Предпочтительно, мониторинг осуществляют с помощью фотовидеокамеры.Visual monitoring includes monitoring using the user's vision, as well as monitoring using a photo/video camera. Preferably, monitoring is carried out using a photo and video camera.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором использую цифровую цветную фотовидеокамеру для мониторинга изменений цвета жидкого образца в реальном времени из-за образования, реакции или изменения цвета окрашенного вещества.In a preferred embodiment, the present invention relates to a method that uses a digital color video camera to monitor changes in color of a liquid sample in real time due to the formation, reaction or color change of a colored substance.

В этом предпочтительном варианте осуществления способ включает использование цифровой цветной фотовидеокамеры для регистрации одного или более изображений жидкого образца, обработку для каждого изображения одного или более из данных по красному каналу, данных по зеленому каналу и данных по синему каналу, полученных из изображения, и, таким образом, получение параметра анализа.In this preferred embodiment, the method includes using a digital color video camera to capture one or more images of a liquid sample, processing for each image one or more of red channel data, green channel data and blue channel data obtained from the image, and thus Thus, obtaining the analysis parameter.

При анализе по конечной точке способ, как правило, включает регистрацию и обработку отдельного изображения. Если способ включает регистрацию и обработку данных, полученных для множества изображений, серия изображений может образовывать видео.In endpoint analysis, the method typically involves recording and processing a single image. If the method includes recording and processing data obtained from a plurality of images, the series of images may form a video.

Параметром анализа, например, может являться наличие аналита, или его количество, или эффективность реакции амплификации нуклеиновых кислот, такой как LAMP.An assay parameter, for example, may be the presence of an analyte, or its quantity, or the efficiency of a nucleic acid amplification reaction such as LAMP.

Окрашенное вещество содержит вещество, образующееся, или потребляемое, или изменяющее свой цвет во время анализа. Изменение цвета, например, может происходить в ответ на изменение pH или химическую реакцию. Изменение цвета может включать изменение из одного цвета в другой или из цвета в прозрачное состояние или наоборот.A colored substance contains a substance that is produced or consumed or changes color during analysis. The color change, for example, may occur in response to a change in pH or a chemical reaction. The color change may include a change from one color to another or from a color to a transparent state or vice versa.

Примеры цветных веществ, используемых в амплификационных анализах нуклеиновых кислот, включают гидроксинафтол синий (HNB), феноловый красный, кальцеин, кристалл-виолет, SYBR green I, крезоловый красный, нейтральный красный, m-крезоловый фиолетовый, наночастицы золота, липосомы полидиацетилен (PDA) и другие вещества, хорошо известные специалисту в этой области.Examples of colored substances used in nucleic acid amplification assays include hydroxynaphthol blue (HNB), phenol red, calcein, crystal violet, SYBR green I, cresol red, neutral red, m-cresol violet, gold nanoparticles, polydiacetylene (PDA) liposomes and other substances well known to one skilled in the art.

Регистрация изображений и/или обработка данных, полученных из изображений, может включать одну или более стадий обработки изображений, такую как одно или более из изменения цветового режима, калибровки изображения и гамма-коррекции.Capturing images and/or processing data obtained from the images may include one or more image processing steps, such as one or more of color mode changing, image calibration, and gamma correction.

Как правило, изображение содержит пиксели, и стадия обработки включает извлечение уровня света, например его интенсивности, одного или более из красного, зеленого и синего из пикселей изображения и, таким образом, получая одно или более из данных красного, зеленого и синего канала, соответственно. Регистрируемый уровень (например, интенсивность) света можно представлять в пикселях изображения. Уровень может представлять собой интенсивность, например, интенсивность, регистрируемую по каналам фотовидеокамеры. Уровень может представлять собой значение цвета RGB, например, 8 бит, 16 бит, 24 бит или 32 бит.Typically, an image contains pixels, and the processing step involves extracting a light level, such as its intensity, one or more of red, green and blue from the pixels of the image and thereby obtaining one or more of red, green and blue channel data, respectively . The recorded level (eg intensity) of light can be represented in image pixels. The level may represent an intensity, for example, the intensity recorded through the channels of a photo/video camera. The level can be an RGB color value, such as 8 bits, 16 bits, 24 bits or 32 bits.

Как правило, пиксель изображения, регистрируемый цифровой фотовидеокамерой, содержит элементы, каждый из которых представляет собой разные цветовые компоненты изображения. Цветовые компоненты, как правило, представляют собой красный, зеленый и синий, что соответствует красному, зеленому и синему каналам соответственно, хотя с помощью фотовидеокамеры можно регистрировать и/или изображения можно хранить с использованием данных в соответствии с разными цветовыми режимами, такими как CIECAM02, в которых используют яркость, цветность и цвет в качестве измерений.Typically, an image pixel captured by a digital video camera contains elements, each of which represents different color components of the image. The color components are typically red, green and blue, corresponding to the red, green and blue channels respectively, although with a still camera, images can be captured and/or stored using data according to different color modes such as CIECAM02, which use brightness, chrominance and color as measurements.

Изображения могут являться мультипиксельными изображениями областей жидкой фазы. Изображения могут являться однопиксельными изображениями областями жидкой фазы, которые, например, можно получать с использованием оптического волокна или оптического волокна на цветовой канал. Изображения можно демонстрировать на экране компьютера, например, или любым другим способом, известным специалисту в области отображения изображений.The images may be multipixel images of regions of the liquid phase. The images may be single-pixel images of regions of the liquid phase, which, for example, can be obtained using an optical fiber or an optical fiber per color channel. The images may be displayed on a computer screen, for example, or in any other manner known to one skilled in the art of image display.

Стадия обработки по настоящему изобретению может включать вычисление значения из одного или более из данных по красному каналу, данных по зеленому каналу и данных по синему каналу, например, с выполнением математических действий.The processing step of the present invention may include calculating a value from one or more of the red channel data, the green channel data and the blue channel data, for example, performing mathematical operations.

Предпочтительно, стадия обработки включает вычисление различий между двумя из трех из данных по красному каналу, данных по зеленому каналу и данных по синему каналу. Более предпочтительно, стадия обработки включает вычисление различий между данными по красному каналу и данными по зеленому каналу или между данными по синему каналу и данными по зеленому каналу.Preferably, the processing step includes calculating differences between two of three of the red channel data, the green channel data and the blue channel data. More preferably, the processing step includes calculating differences between red channel data and green channel data or between blue channel data and green channel data.

Можно получать запись видеоизображения жидкой фазы с помощью цифровой фотовидеокамеры. Затем такую запись видеоизображения можно разбивать на изображения-компоненты с использованием, например, аппаратного процессора. Видеоизображение может делать возможным мониторинг анализа жидкой фазы в реальном времени.You can record a video image of the liquid phase using a digital photo and video camera. This video recording can then be broken down into component images using, for example, a hardware processor. Video imaging can make it possible to monitor liquid phase analysis in real time.

Другой аспект настоящего изобретения относится к устройству для осуществления способа по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к устройству для осуществления колориметрического амплификационного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, где устройство содержитAnother aspect of the present invention relates to an apparatus for carrying out the method of the present invention. Thus, the present invention relates to a device for performing colorimetric real-time nucleic acid amplification analysis, where the device contains

нагревательный элемент,a heating element,

реакционную пробирку, полученную из полупрозрачного или прозрачного материала и расположенную таким образом, что дно пробирки находится в термическом контакте с нагревательным элементом,a reaction tube made of translucent or transparent material and positioned such that the bottom of the tube is in thermal contact with the heating element,

цифровую цветную фотовидеокамеру, расположенную таким образом, что с помощью нее можно регистрировать изображения через боковую стенку реакционной пробирки, иa digital color photo/video camera positioned in such a way that it can be used to record images through the side wall of the reaction tube, and

обрабатывающий модуль, сконфигурированный для обработки изображения, полученного с помощью цифровой цветной фотовидеокамеры, и обработки одного или более из данных по красному, зеленому и синему каналу изображения, чтобы, таким образом, получить параметр анализа.a processing module configured to process an image captured by a digital color video camera and process one or more of the red, green and blue channel data of the image, thereby obtaining an analysis parameter.

Предпочтительно, устройство дополнительно содержит средства для приложения давления к реакционной пробирке в направлении нагревательного элемента.Preferably, the device further comprises means for applying pressure to the reaction tube in the direction of the heating element.

Схема устройства по настоящему изобретению приведена на фигуре 2. Амплификацию нуклеиновых кислот осуществляют в реакционных пробирках (18), расположенных на нагревательном элементе (10) таким образом, что только дно пробирки находится в термическом контакте с нагревательным элементом. Фотовидеокамеру (13) располагают таким образом, что с помощью нее можно регистрировать изображения через боковую стенку реакционных пробирок. Выходной сигнал фотовидеокамеры (13) проходит через обрабатывающий модуль (22), такой как компьютер, имеющий процессор (23), устройство памяти (24) для хранения данных об изображениях и компьютерную программу, выполняемую процессором. Обрабатывающий модуль (22) может являться отдельным модулем, как показано на фигуре 2, или может являться интегральным компонентом фотовидеокамеры или другого устройства, включающего фотовидеокамеру.A diagram of the device according to the present invention is shown in Figure 2. Amplification of nucleic acids is carried out in reaction tubes (18) located on the heating element (10) in such a way that only the bottom of the tube is in thermal contact with the heating element. The photo/video camera (13) is positioned in such a way that it can be used to record images through the side wall of the reaction tubes. The output signal of the camera (13) passes through a processing module (22), such as a computer having a processor (23), a memory device (24) for storing image data, and a computer program executed by the processor. The processing module (22) may be a separate module, as shown in Figure 2, or may be an integral component of a photo-video camera or other device including a photo-video camera.

На фигуре 3 показан вариант осуществления устройства по настоящему изобретению, которое можно использовать для осуществления и мониторинга амплификационного анализа нуклеиновых кислот, такого как колориметрический анализ LAMP.Figure 3 shows an embodiment of a device of the present invention that can be used to perform and monitor a nucleic acid amplification assay, such as a colorimetric LAMP assay.

Устройство содержит главный корпус (6), содержащий главный переключатель (8) и гнездо питания (9). Он дополнительно содержит нагревательный элемент (10), прикрепленный к главному корпусу (6) через держатель нагревательного элемента (11). Главный корпус (6) дополнительно содержит держатель фотовидеокамеры (12) для удержания модуля фотовидеокамеры (13) и светодиодные лампы (14) для подсвечивания содержимого реакционной пробирки. Главный корпус (6) дополнительно содержит микропроцессор и электронную плату (не показана) для обработки изображений, регистрируемых фотовидеокамерой.The device contains a main body (6) containing a main switch (8) and a power socket (9). It further includes a heating element (10) attached to the main body (6) through a heating element holder (11). The main body (6) additionally contains a photo-video camera holder (12) for holding the photo-video camera module (13) and LED lamps (14) for illuminating the contents of the reaction tube. The main body (6) additionally contains a microprocessor and an electronic board (not shown) for processing images recorded by a photo/video camera.

Устройство дополнительно содержит кожух (7), содержащий четыре крупных магнита (15), взаимодействующие с соответствующими крупными магнитами (16) главного корпуса (6) и удерживающие кожух (7) в заданном положении при его размещении на главном корпусе (6).The device additionally contains a casing (7) containing four large magnets (15) that interact with the corresponding large magnets (16) of the main body (6) and hold the casing (7) in a given position when it is placed on the main body (6).

Устройство дополнительно содержит держатель реакционной пробирки (17), содержащий слоты для удержания реакционных пробирок (18). Реакционные пробирки (18) получают из полупрозрачного материала. Держатель реакционной пробирки (17) дополнительно содержит фоновую стенку (19), имеющую белый цвет на стороне, обращенной к пробиркам (18), что облегчает мониторинг изменения цвета во время анализа.The device further includes a reaction tube holder (17) containing slots for holding reaction tubes (18). Reaction tubes (18) are made of translucent material. The reaction tube holder (17) further includes a background wall (19) having a white color on the side facing the tubes (18) to facilitate monitoring of color changes during analysis.

Для осуществления анализа жидкий образец добавляют в реакционные пробирки (18), помещаемые в соответствующие слоты. Держатель реакционной пробирки (17) помещают на нагревательный элемент (10) (фигура 4a) таким образом, что дно реакционных пробирок (18) приводят в термический контакт с нагревательным элементом (10). Это позволяет с помощью фотовидеокамеры видеть жидкую фазу через боковую стенку пробирок (фигура 4b). Кожух (7) закрепляют в его положении посредством сцепления крупных магнитов (15) кожуха с крупными каналами (16) главного корпуса (6). Таким образом, держатель реакционной пробирки (17) закрепляют в его положении с помощью небольших магнитов (20), сцепляющихся с соответствующими небольшими магнитами (21) кожуха (7). Давление, прилагаемое с помощью дна пробирки (18) к нагревательному элементу (10), можно корректировать посредством модификации размера и/или количества крупных магнитов (15) и (16) на кожухе (7) и главном корпусе (6).To perform the analysis, the liquid sample is added to reaction tubes (18) placed in the appropriate slots. The reaction tube holder (17) is placed on the heating element (10) (Figure 4a) such that the bottom of the reaction tubes (18) is brought into thermal contact with the heating element (10). This allows the liquid phase to be seen through the side wall of the tubes using a video camera (Figure 4b). The casing (7) is secured in its position by engaging large magnets (15) of the casing with large channels (16) of the main body (6). Thus, the reaction tube holder (17) is secured in its position by small magnets (20) engaging with corresponding small magnets (21) of the housing (7). The pressure applied by the bottom of the tube (18) to the heating element (10) can be adjusted by modifying the size and/or number of large magnets (15) and (16) on the housing (7) and the main body (6).

Во время анализа с помощью цифровой фотовидеокамеры регистрируют изображения, передаваемые в обрабатывающий модуль. Обрабатывающий модуль сконфигурирован для вычисления различий между красным и зеленым или синим и зеленым каналами. Изменения этих значений со временем обрабатывают для вычисления изменения цвета жидкой фазы.During analysis, images transmitted to the processing module are recorded using a digital photo/video camera. The processing module is configured to calculate the differences between the red and green or blue and green channels. Changes in these values over time are processed to calculate the change in color of the liquid phase.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1Example 1

Бактериальные клетки, ресуспендированные в буфере PBS, лизировали в течение 1 мин при 95°C. Ген инвазии invA Salmonella являлся мишенью для набора из шести праймеров, двух внешних (F3 и B3), двух внутренних (FIP и BIP) и двух петлевых (петля-F и петля-B).Bacterial cells resuspended in PBS buffer were lysed for 1 min at 95°C. The Salmonella invasion gene invA was targeted by a set of six primers, two external (F3 and B3), two internal (FIP and BIP) and two loop primers (loop-F and loop-B).

FIP: GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGFIP: GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG

BIP: CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGGBIP: CCGGTGAAATTTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG

F3: GGCGATATTGGTGTTTATGGGGF3: GGCGATATTGGTGTTTATGGGG

B3: AACGATAAACTGGACCACGGB3:AACGATAAACTGGACCACGG

Петля F: GACGAAAGAGCGTGGTAATTAACLoop F: GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC

Петля B: GGGCAATTCGTTATTGGCGATAGLoop B: GGGCAATTCGTTATTGGCGATAG

Смесь реагентов LAMP в общем объеме 25 мкл содержала 12,5 мкл стандартного или колориметрического 2-кратного мастер-микса WarmStart (New England BioLabs), в котором используют феноловый красный в качестве цветного вещества, 1,8 мМ FIP и BIP, 0,1 мМ F3 и B3, 0,4 мМ петля-F и петля-B и 1 мкл лизированных клеток в PBS. Реакции проводили в реакционных пробирках, помещенных в устройство, как показано на фигурах 3-4. Мониторинг анализа осуществляли посредством регистрации изображений содержимого пробирок с помощью цифровой фотовидеокамеры устройства.The LAMP reagent mixture, in a total volume of 25 μl, contained 12.5 μl of standard or colorimetric 2× WarmStart master mix (New England BioLabs), which uses phenol red as a color substance, 1.8 mM FIP and BIP, 0.1 mM F3 and B3, 0.4 mM loop-F and loop-B, and 1 μl of lysed cells in PBS. Reactions were carried out in reaction tubes placed in the device, as shown in Figures 3-4. Monitoring of the analysis was carried out by recording images of the contents of the tubes using a digital photo-video camera of the device.

Пример 2Example 2

Полученные изображения из примера 1 обрабатывали следующим образом.The resulting images from example 1 were processed as follows.

Во-первых, получают последовательность изображений жидкой фазы, как описано выше. Исходные красный (R), зеленый (G) и синий (B) каналы от фотовидеокамеры можно подвергать обработке изображений, включая, например, гамма-коррекцию, калибровку цвета и т.д. Во-вторых, данные по красному, зеленому и синему каналам извлекают из одного или более пикселей каждого изображения.First, a sequence of images of the liquid phase is acquired as described above. The original red (R), green (G) and blue (B) channels from the camera can be subjected to image processing, including, for example, gamma correction, color calibration, etc. Second, red, green, and blue channel data is extracted from one or more pixels in each image.

На третьей стадии для каждого из красного, зеленого и синего каналов, для каждого момента времени, исходное значение красного, зеленого и синего канала вычитают для получения данных, начинающихся с нуля. Значение, которое вычитают, может являться значением красного, зеленого или синего, соответственно, в первом моменте времени, хотя, как правило, значения для ряда исходных моментов времени можно усреднять, или можно строить кривую и вычислять и вычитать интерцепт для нуля оси времени.In the third stage, for each of the red, green and blue channels, for each time point, the original value of the red, green and blue channel is subtracted to obtain data starting from zero. The value that is subtracted may be the red, green, or blue value, respectively, at the first time point, although typically the values for a number of reference times can be averaged, or a curve can be plotted and the intercept for the time axis zero calculated and subtracted.

Затем вычисляют различия между двумя каналами. В случае примера протокола ниже с использованием фенолового красного вычисляют различия между значениями зеленого и синего (т.е. значения синего, полученные на предыдущей стадии, вычисляют из значений зеленого). Это осуществляют для каждого момента времени. В случае HNB вычисляют различия между значениями зеленого и красного.The differences between the two channels are then calculated. In the case of the example protocol below, using phenol red, the differences between the green and blue values are calculated (ie, the blue values obtained in the previous step are calculated from the green values). This is done for each point in time. In the case of HNB, the differences between the green and red values are calculated.

Затем, необязательно, строят график различий, а затем анализируют для определения одного или более параметров анализа. Время, в котором вычисленное значение различий превышает пороговое значение, можно использовать для определения наличия или количества аналита, например, со ссылкой на контроль (который может представлять собой параллельное измерение одной или более реакций с известными концентрациями аналита и/или предварительно введенными в память данными). Колебания значений различий с течением времени также можно анализировать для определения эффективности реакции амплификации, а также для улучшения оценки количества аналита, например, посредством экстраполяции обратно к начальному времени.The differences are then optionally plotted and then analyzed to determine one or more analysis parameters. The time at which the calculated difference value exceeds a threshold value can be used to determine the presence or amount of the analyte, for example with reference to a control (which can be a parallel measurement of one or more reactions with known analyte concentrations and/or pre-memorized data) . Fluctuations in difference values over time can also be analyzed to determine the efficiency of the amplification reaction, as well as to improve the estimate of analyte quantity, for example by extrapolating back to the starting time.

На фиг. 5 показаны результаты сравнения мониторинга амплификации LAMP в реальном времени 2 положительных (инфицированных/присутствует 10 бактерий) образцов с использованием 2 разных цветных веществ; фенолового красного, являющегося индикатором pH, и, HNB, являющегося металл-связывающим индикатором. Изображения жидкой фазы регистрируют и анализируют автоматически как функцию времени с течением анализа. В каждом случае вычисляют различия между зеленым и синим каналами или зеленым и красным каналами. Давление, прилагаемое с помощью реакционных пробирок к нагревательному элементу в течение анализа, составляло 2 мПа.In fig. Figure 5 shows the results of a comparison of real-time LAMP amplification monitoring of 2 positive (infected/10 bacteria present) samples using 2 different color substances; phenol red, which is a pH indicator, and HNB, which is a metal-binding indicator. Images of the liquid phase are recorded and analyzed automatically as a function of time as the analysis progresses. In each case, the differences between the green and blue channels or the green and red channels are calculated. The pressure applied by the reaction tubes to the heating element during the analysis was 2 mPa.

На фигуре 5 показаны кривые в реальном времени во время амплификации LAMP 10 бактерий с использованием цветовых индикаторов фенолового красного или HNB. Различия между зеленым и синим каналами вычисляют для индикатора фенолового красного, в то время как для HNB используют различия между зелеными и красными пикселями. Из графиков видно, что в обоих случаях положительный сигнал можно наблюдать до 15-ой минуты реакции. Таким образом, можно определять, присутствует или отсутствует аналит (в этом случае - клетки Salmonella), и размер различий в указанный момент времени можно использовать для определения количества аналита, например, по сравнению с одним или более контролями.Figure 5 shows real-time traces during LAMP amplification of 10 bacteria using the color indicators phenol red or HNB. The differences between the green and blue channels are calculated for the phenol red indicator, while for HNB the differences between the green and red pixels are used. It is clear from the graphs that in both cases a positive signal can be observed up to the 15th minute of the reaction. In this way, it can be determined whether an analyte (in this case, Salmonella cells) is present or absent, and the size of the differences at a given time point can be used to determine the amount of analyte, for example, compared to one or more controls.

Пример 3Example 3

В этом примере проиллюстрирован второй набор результатов сравнения положительного образца (инфицированного/присутствует Salmonella) и отрицательного образца (неинфицированного/Salmonella отсутствует) способом обработки изображений из примера 2. Цветным веществом, используемым в этом случае, является феноловый красный. Изображения жидкой фазы регистрируют как функцию времени с течением анализа. Вычисляют различия между зеленым и синим каналами.This example illustrates a second set of results comparing a positive sample (infected/ Salmonella present) and a negative sample (uninfected/ Salmonella absent) by the image processing method of Example 2. The color substance used in this case is phenol red. Images of the liquid phase are recorded as a function of time as the analysis progresses. Calculate the differences between the green and blue channels.

На фигуре 6a показана колориметрическая детекция LAMP в реальном времени клеток Salmonella (положительный и отрицательный образец), осуществляемая в реакционных пробирках, помещенных в устройство, как показано на фигурах 3-4. Давление, прилагаемое с помощью пробирок к нагревательному элементу, составляло 0,4 мПа. Изменение цвета в случае положительной кривой начиналось на 23-й минуте. Максимальное изменение цвета (единицы цветового индекса), измеренное на минуте 30, составляет 17 единиц.Figure 6a shows colorimetric real-time LAMP detection of Salmonella cells (positive and negative sample) performed in reaction tubes placed in the device as shown in Figures 3-4. The pressure applied to the heating element using test tubes was 0.4 mPa. The color change in the case of a positive curve began at the 23rd minute. The maximum color change (color index units) measured at minute 30 is 17 units.

На фигуре 6b показан пример колориметрической детекции LAMP в реальном времени клеток Salmonella (положительный и отрицательный образец), осуществляемая так же, как описано в предыдущем абзаце. Однако, в этом случае давление, прилагаемое с помощью пробирок к нагревательному элементу, составляло 2 мПа. Изменение цвета в случае положительной кривой начинается на 17-ой минуте. Максимальное изменение цвета (единицы цветового индекса), измеренное на минуте 30, составляет 28 единиц. Детекция на 6 мин раньше в случае анализа экспоненциальной амплификации может приводить к чувствительности, улучшенной на 1-2 порядка величины.Figure 6b shows an example of real-time colorimetric LAMP detection of Salmonella cells (positive and negative sample), performed in the same way as described in the previous paragraph. However, in this case, the pressure applied by the test tubes to the heating element was 2 mPa. The color change in the case of a positive curve begins at the 17th minute. The maximum color change (color index units) measured at minute 30 is 28 units. Detection 6 min earlier in the case of exponential amplification analysis can result in sensitivity improved by 1-2 orders of magnitude.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> FOUNDATION FOR RESEARCH AND TECHNOLOGY HELLAS<110> FOUNDATION FOR RESEARCH AND TECHNOLOGY HELLAS

<120> СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО<120> METHOD AND DEVICE FOR IMPLEMENTING COLORIMETRICA

АМПЛИФИКАЦИОННОГО АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИREAL-TIME AMPLIFIATION ANALYSIS OF NUCLEIC ACIDS

<130> 270119<130> 270119

<140> EPPCT/2019/079845<140> EPPCT/2019/079845

<141> 2019-10-31<141> 2019-10-31

<150> EP18203833.1<150> EP18203833.1

<151> 2018-10-31<151> 2018-10-31

<160> 6<160> 6

<170> BiSSAP 1.3.6<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1<210> 1

<211> 42<211> 42

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella<213> Salmonella

<220> <220>

<223> Внутренний праймер FIP для гена инвазии Salmonella invA<223> Internal FIP primer for the Salmonella invA invasion gene

<400> 1<400> 1

gacgactggt actgatcgat agtttttcaa cgtttcctgc gg 42gacgactggt actgatcgat agtttttcaa cgtttcctgc gg 42

<210> 2<210> 2

<211> 37<211> 37

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella<213> Salmonella

<220> <220>

<223> Внутренний праймер BIP для гена инвазии Salmonella invA<223> BIP internal primer for the Salmonella invA invasion gene

<400> 2<400> 2

ccggtgaaat tatcgccaca caaaacccac cgccagg 37ccggtgaaat tatcgccaca caaaacccac cgccagg 37

<210> 3<210> 3

<211> 22<211> 22

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella<213> Salmonella

<220> <220>

<223> Внешний праймер F3 для гена инвазии Salmonella invA<223> External primer F3 for the Salmonella invA invasion gene

<400> 3<400> 3

ggcgatattg gtgtttatgg gg 22ggcgatattg gtgtttatgg gg 22

<210> 4<210> 4

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella<213> Salmonella

<220> <220>

<223> Внешний праймер B3 для гена инвазии Salmonella invA<223> External primer B3 for the Salmonella invA invasion gene

<400> 4<400> 4

aacgataaac tggaccacgg 20aacgataaac tggaccacgg 20

<210> 5<210> 5

<211> 23<211> 23

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella<213> Salmonella

<220> <220>

<223> Праймер петля-F для гена инвазии Salmonella invA<223> Loop-F primer for Salmonella invA invasion gene

<400> 5<400> 5

gacgaaagag cgtggtaatt aac 23gacgaaagag cgtggtaatt aac 23

<210> 6<210> 6

<211> 23<211> 23

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella<213> Salmonella

<220> <220>

<223> Праймер петля-B для гена инвазии Salmonella invA<223> Loop-B primer for Salmonella invA invasion gene

<400> 6<400> 6

gggcaattcg ttattggcga tag 23gggcaattcg ttattggcga tag 23

<---<---

Claims

1. A method of performing a colorimetric real-time nucleic acid amplification assay in a liquid sample contained in a reaction tube (18) made of a translucent or transparent material, where the method includes

heating the liquid sample by bringing the bottom (2) of the reaction tube (18) into thermal contact with the heating element (10) and applying pressure to the reaction tube (18) in the direction of the heating element (10), and

visual monitoring of the analysis parameter through the side wall (3) of the reaction tube (18).

2. The method according to claim 1, wherein the pressure applied by the reaction tube (18) to the heating element (10) is from 0.4 MPa to 15 MPa.

3. The method according to claim 2, wherein the pressure applied by the reaction tube (18) to the heating element (10) is from 1 mPa to 10 mPa.

4. The method according to claim 3, wherein the pressure applied by the reaction tube (18) to the heating element (10) is from 1 MPa to 3 MPa.

5. A method according to any one of the preceding claims, wherein the longitudinal axis of the reaction tube (18) forms an angle of 60 to 120 degrees with the heating element (10).

6. The method according to claim 5, where the longitudinal axis of the reaction tube (18) forms an angle of 90 degrees with the heating element (10).

7. The method according to any of the preceding paragraphs, where the area of the reaction tube (18) in thermal contact with the heating element (10) is up to 12 mm ² .

8. The method according to claim 7, where the area of the reaction tube (18) in thermal contact with the heating element (10) is up to 6 mm ² .

9. Method according to claim 8, where the area of the reaction tube (18) in thermal contact with the heating element (10) is up to 3 mm ² .

10. Method according to any one of the preceding claims, wherein the reaction tube (18) is made of a transparent material.

11. The method according to any of the previous paragraphs, where monitoring is carried out using a digital photo and video camera.

12. The method as claimed in any one of the preceding claims, wherein the nucleic acid amplification assay is an isothermal nucleic acid amplification assay.

13. The method of claim 12, wherein the nucleic acid amplification assay is a loop isothermal amplification assay.

14. A device for performing colorimetric amplification analysis of nucleic acids in real time by the method according to any one of claims 1 to 13, where the device contains

heating element (10),

a reaction tube (18) made of a translucent or transparent material and positioned such that the bottom (2) of the tube (18) is in thermal contact with the heating element (10),

means (15, 16) for applying pressure to the reaction tube (18) in the direction of the heating element (10),

a digital color photo/video camera positioned in such a way that it can be used to record images through the side wall (3) of the reaction tube (18), and

a processing module configured to process an image captured by a digital color video camera and to process one or more of the red, green and blue channel data of the image, thereby obtaining an analysis parameter.

15. The device according to claim 14, wherein the pressure applied by the reaction tube (18) to the heating element (10) is from 0.4 MPa to 15 MPa.

16. The device according to claim 15, wherein the pressure applied by the reaction tube (18) to the heating element (10) is from 1 mPa to 10 mPa.

17. The device according to claim 16, wherein the pressure applied by the reaction tube (18) to the heating element (10) is from 1 MPa to 3 MPa.

18. Device according to any one of claims 14 to 17, wherein the reaction tube (18) is made of a transparent material.

19. Device according to any one of claims 14 to 18, where the area of the reaction tube (18) in thermal contact with the heating element (10) is up to 12 mm ² .

20. Device according to claim 19, where the area of the reaction tube (18) in thermal contact with the heating element (10) is up to 6 mm ² .

21. Device according to claim 20, where the area of the reaction tube (18) in thermal contact with the heating element (10) is up to 3 mm ² .

22. Device according to any one of claims 14 to 21, where the longitudinal axis of the reaction tube (18) forms an angle of 60 to 120 degrees with the heating element (10).

23. The device according to claim 22, where the longitudinal axis of the reaction tube (18) forms an angle of 90 degrees with the heating element (10).