RU2804111C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования - Google Patents
Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2804111C1 RU2804111C1 RU2022135017A RU2022135017A RU2804111C1 RU 2804111 C1 RU2804111 C1 RU 2804111C1 RU 2022135017 A RU2022135017 A RU 2022135017A RU 2022135017 A RU2022135017 A RU 2022135017A RU 2804111 C1 RU2804111 C1 RU 2804111C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- 2ccr5
- ccr5 gene
- gene promoter
- samples
- oligonucleotide primers
- Prior art date
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 101100438883 Homo sapiens CCR5 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 title claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 14
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 title description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 34
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 2
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 2
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017088 CCR5 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150090288 DMBT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 description 1
- 101100102599 Homo sapiens VGLL3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101100149887 Mus musculus Sox10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150061038 NLRP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150117329 NTRK3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 101150083915 cdh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Представлен набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала. Набор включает прямой праймер 2CCR5-Fp - TAT GAT TGA TTT GTA TAG TTT ATT TGG TTA, обратный праймер 2CCR5-Rp - CTC АТС TCA AAA ACT AAC TAA С, секвенирующий праймер 2CCR5-S - GGT TAG AAG AGT TGA GAT ATT. Синтезированные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с другими последовательностями генома, амплифицируют последовательность, включающую целевые метилированные локусы в промоторе гена CCR5 со 100% специфичностью. 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению метилирования промотора гена CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования. Изобретение предназначено для оценки уровня метилирования промоторных областей гена CCR5 и может применяться в исследованиях по изучению влияния метилирования генов хозяина на жизненный цикл вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
ВИЧ-инфекция длительно текущая инфекционная болезнь, развивающаяся в результате инфицирования ВИЧ, поражающего и вызывающего гибель клеток иммунной системы. Вирус передается от человека к человеку половым путем, при переливании крови или ее компонентов, пересадке органов, парентеральных вмешательствах, а также от инфицированной матери к плоду во время беременности, при прохождении ребенка по родовому пути и грудном вскармливании. Проникновение ВИЧ в клетку регулируется рецепторами CCR5 и CXCR4, располагающихся на поверхности CD4+ клеток. Метилирование цитозина в промоторе гена является одним из механизмов регуляции экспрессии белка. Гиперметилирование определенных локусов в промоторе гена CCR5 может ингибировать работу данного рецептора.
Определение потенциальных мишеней для создания отечественных персонализированных подходов при разработке генотерапевтических препаратов является перспективной задачей. С целью определения таких потенциальных мишеней предложено определить статус метилирования промотора гена CCR5 методом пиросеквенирования.
Известны протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках, в частности: для определения уровня метилирования в промоторе гена NTRK3 [патент CN 113265464, дата подачи 12.05.2021, дата публикации 17.08.2021]; для определения уровня метилирования гена. Sox 10 [патент CN 108753958, дата подачи 30.08.2018, дата публикации 06.11.2018]; для обнаружения метилирования промотора гена NLRP3 [патент CN 113416783, дата подачи 08.07.2021, дата публикации 21.09.2021]; для определения уровня метилирования гена CDH1 [патент CN 109136375, дата подачи 12.09.2018, дата публикации 04.01.2019]; для определения уровня метилирования гена VGLL3 [патент CN 113249486, дата подачи 28.06.2021, дата публикации 13.08.2021]; для количественного определение уровня метилирования гена DMBT1 [патент CN 103276095, дата подачи 07.06.2013, дата публикации 04.09.2013]. Решения, описанные в упомянутых изобретениях, не предусматривают определение метилирования промотора гена человека CCR5.
Из уровня техники также известен набор реагентов «АмплиСенс® Пироскрин CCR5del32-скрин. Профиль генетического исследования «CCR5del32» [https://www.amplisens.ra/catalog/nabory-reagentov-dlya-vyyavleniya-geneticheskikh-polimorfizmov-snpanaliz/nabory-reagentov-dlya-detektsii-snp-metodom-pirosekvenirovaniya/amplisens-piroskrin-ccr5del32skrin-profil-geneticheskogo-issledovaniya-ccr5del32/] а также способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 [патент RU 2563172, дата приоритета 12.11.2014], посредством которых определяют полиморфизм CCR5 delta 32 методом пиросеквенирования. Однако, данные решения не предназначены для определения уровня метилирования указанного гена CCR5.
Технический результат заявляемого решения направлен на выявление метилированных участков промотора гена CCR5 в образцах биологического материала посредством таких олигонуклеотидов - праймеров которые позволяют эффективно определять уровень метилирования промотора гена CCR5 с использованием метода пиросеквенирования.
Заявленный технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения метилированных участков промотора гена CCR5, имеющих следующий состав:
прямой праймер 2CCR5-Fp - SEQ ID NO: 1,
обратный праймер 2CCR5-Rp - SEQ ID NO: 2,
секвенирующий праймер 2CCR5-S - SEQ ID NO: 3.
Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего промотор гена CCR5 в образцах биологического материала.
Олигонуклеотиды, входящие в состав заявляемого набора, разработаны на основе проведенного анализа конвертированных последовательностей промотора гена CCR5 человека, (взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)), в результате выбран фрагмент для детекции метилированного участка промотора гена CCR5 к которому подобраны прямой и обратный праймеры для амплификации фрагмента длиной 121 пара оснований, а также праймер для пиросеквенирования (прямой праймер 2CCR5-Fp - SEQ ID NO: 1; обратный праймер 2CCR5-Rp - SEQ ID NO: 2; секвенирующий праймер 2CCR5-S - SEQ ID NO: 3).
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов человека из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для поиска промоторов гена используют данные базы Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php). Составляют перечень мишеней для детекции метилированных участков промотора гена CCR5 с помощью базы данных UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) путем наложения последовательности CpG-островков на последовательность промотора гена. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также праймера для пиросеквенирования с учетом проведения бисульфитной конверсии исследуемых последовательностей. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.
Анализ результатов секвенирования продемонстрировал, что прямой праймер 2CCR5-Fp (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 2CCR5-Rp (SEQ ID NO: 2) в реакции пиросеквенирования с секвенирующим праймером 2CCR5-S (SEQ ID NO: 3) амплифицируют участок промотора гена человека CCR5 со 100% специфичностью.
В качестве материала используется обработанная бисульфитом ДНК, экстрагированная из цельной (венозной) крови человека.
ПЦР-исследование проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор/комплект реагентов для выделения ДНК. Оптимальная концентрация ДНК - 103 - 105 копий в 10 мкл. Реакцию бисульфитной конверсии проводят с помощью комплекта реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» (QIAGEN, Германия) или аналогичного коммерчески-доступного комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя.
Пиросеквенирование - метод определения нуклеотидной последовательности в режиме реального времени, основанный на детекции высвобождающегося пирофосфата после цепочки ферментативных реакций. Определение осуществляется в ходе следующего процесса: в начале проводится наработка ампликона специфического фрагмента последовательности исследуемого гена методом полимеразной цепной реакции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.
Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С) - праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.
Затем проводится инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимер азы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5'-фосфосульфата (APS) и люциферина. Затем проводят добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов. АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата.
Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, невстроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид. Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме. Процент метилирования искомых CpG-нуклеотидов в анализируемой последовательности определяется программным обеспечением прибора автоматически.
Для детекции метилированных участков промотора гена человека CCR5 проводят ПЦР с применением представленных в Таблице 1 олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1,2.
ПЦР проводят при следующих условиях:
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 5 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,7 мМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя.
(c) ПЦР-буфер, содержащий Сульфат аммония и MgCl2, например, 10,0 мкл ПЦР-буфера «ПЦР-буфер blue» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.
(d) полученная методом бисульфитной конверсии ДНК 10 мкл.
Амплификацию проводят на любом амплификаторе в соответствии с инструкцией производителя. При постановке реакции амплификации на приборе «Терцик» (НПО «ДНК-технология», Протвино, Россия) перед добавлением образцов необходимо добавить 10 мкл минерального масла для ПЦР.
Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд.
Реакцию пиросеквенирования проводят с применением секвенирующего праймера SEQ ID NO: 3, представленного в Таблице 1. Количество реагентов для работы с прибором рассчитывается программным обеспечением прибора автоматически. Пробоподготовку образцов перед реакцией пиросеквенирования проводят на наборе реагентов ПИРО-преп (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любом аналогичном коммерческом наборе в соответствии с инструкцией производителя согласно инструкции производителя.
Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках внутреннего гранта «Влияние статуса метилирования ДНК у ВИЧ-1 положительных лиц на реактивацию вирусных резервуаров» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия), номер 122053000056-2.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных прайм срок для определения метилирования промотора гена CCR5.
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, использовали фрагменты референсных геномов человека из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для поиска промоторов гена использовали данные базы Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php). Составили перечень мишеней для детекции метилированных участков промотора гена CCR5 с помощью базы данных UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) путем наложения последовательности CpG-островков на последовательность промотора гена, на основании которых подобраны олигонуклеотидные последовательности прямого 2CCR5-Fp и обратного 2CCR5-Rp праймеров, а также секвенирующего праймер 2CCR5-S.
Олигонуклеотиды для определения метилированного участка промотора гена человека CCR5 - прямой праймер 2CCR5-Fp, обратный праймер 2CCR5-Rp, праймер для пиросеквенирования 2CCR5-S, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.
Пример 2. Подтверждение присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CCR5 методом ПЦР с детекцией в агарозном геле.
Подтверждение присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CCR5 проводили методом ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 5 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 - по 0,7 мМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.
(c) 10,0 мкл ПЦР-буфера «2.5х ПЦР-буфер blue» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl2.
(d) 10,0 мкл минерального масла для ПЦР (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).
(e) 10,0 мкл ДНК, подвергшейся бисульфитной конверсии.
ПЦР проводили с детекцией результата в агарозном геле. Длина получившегося фрагмента соответствовала ожидаемой (121 пара нуклеотидов).
Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности (SEQ ID NO:l, 2) участка промотора гена CCR5, использовали для определения метилирования участка промотора гена CCR5 при помощи пиросеквенирования в образцах биологического материала.
Пример 3. Определение метилирования промотора гена CCR5 методом пиросеквенирования.
Для определения метилированного участка промотора гена человека CCR5 выбрано 20 образцов ДНК человека, обработанных методом бисульфитной конверсии.
Для исследования использовали клинический материал - цельная венозная кровь человека.
Выделение ДНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Выделение ДНК осуществляли методом преципитации нуклеиновых кислот с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.
Бисульфитную обработку проводили с применением набора реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1,2.
Амплификацию проводили на приборе «Терцик» («НПО ДНК-Технология», Протвино, Россия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд.
Пиросеквенирование проводили на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) с набором реагентов, рекомендованным производителей (PyroMark Gold Q24 Reagents («Qiagen», Germany)), при инкубации использовался секвенирующий праймеро 2CCR5-S (SEQ ID NO: 3). Прибор запускался по следующей программе:
SA: YGTTTTTTTATAAGAAATTTTTTTYGGTAAG;
DO: ATCGTTATAGTATTCGTA.
Расчет количества реагентов автоматически произведен программным обеспечением прибора.
Во всех образцах при проведении пиросеквенирования последовательность читаема, полученные пики ожидаемой высоты, заданная прибору последовательность совпадает с полученной.
Таким образом, во всех 20 образцах, содержащих метилированные участки промотора гена человека CCR5, удается проанализировать результаты и получить при помощи программного обеспечения прибора процент метилирования.
Набор уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-3 не дает перекрестных реакций с другими последовательностями генома, амлифицирует последовательность, включающую целевые метилированные локусы в промоторе гена CCR5 со 100% специфичностью, что подтверждено вышеуказанными условиями секвенирования.
Claims (11)
1. Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, имеющий следующий нуклеотидный состав:
прямой праймер SEQ ID NO: 1
2CCR5-Fp - TAT GAT TGA TTT GTA TAG TTT ATT TGG TTA,
обратный праймер SEQ ID NO: 2
2CCR5-Rp - CTC АТС TCA AAA ACT AAC TAA С,
секвенирующий праймер SEQ ID NO: 3
2CCR5-S - GGT TAG AAG AGT TGA GAT ATT.
2. Набор по п. 1, где прямой праймер 2CCR5-Fp и обратный праймер 2CCR5-Rp применяют на этапе проведения ПЦР для подтверждения присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CCR5.
3. Набор по п. 1, где секвенирующий праймер 2CCR5-S применяют для проведения реакции пиросеквенирования.
4. Набор по п. 1, где обратный праймер 2CCR5-Rp содержит модификацию biotin для иммобилизации на твердых носителях.
5. Набор по п. 1, где входящие в его состав олигонуклеотидные праймеры разработаны на основе промотора гена CCR5.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2804111C1 true RU2804111C1 (ru) | 2023-09-26 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103276095A (zh) * | 2013-06-07 | 2013-09-04 | 浙江省医学科学院 | 焦磷酸测序法定量检测人dmbt1基因特异性位点甲基化水平的引物 |
| RU2630669C1 (ru) * | 2016-07-21 | 2017-09-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа |
| CN108753958A (zh) * | 2018-08-30 | 2018-11-06 | 中国医科大学附属盛京医院 | 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 |
| CN109136375A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-04 | 黄映辉 | Cdh1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法 |
| CN113265464A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-08-17 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 检测与宫颈癌相关的神经营养受体酪氨酸激酶3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及应用 |
| RU2760573C1 (ru) * | 2021-01-20 | 2021-11-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для выявления эпигенетических маркеров рака шейки матки |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103276095A (zh) * | 2013-06-07 | 2013-09-04 | 浙江省医学科学院 | 焦磷酸测序法定量检测人dmbt1基因特异性位点甲基化水平的引物 |
| RU2630669C1 (ru) * | 2016-07-21 | 2017-09-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа |
| CN108753958A (zh) * | 2018-08-30 | 2018-11-06 | 中国医科大学附属盛京医院 | 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 |
| CN109136375A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-04 | 黄映辉 | Cdh1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法 |
| RU2760573C1 (ru) * | 2021-01-20 | 2021-11-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для выявления эпигенетических маркеров рака шейки матки |
| CN113265464A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-08-17 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 检测与宫颈癌相关的神经营养受体酪氨酸激酶3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СКРЯБИН Н.А и др., Методы исследования метилирования ДНК: возможности и перспективы использования в онкологии, Сибирский онкологический журнал, 2013, N 6 (60), с. 64-69. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3063292B1 (en) | Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification | |
| US20050084851A1 (en) | Method | |
| JP2008538496A (ja) | ウルトラディープ配列決定を用いて配列変異体を決定するための方法 | |
| WO2010075414A2 (en) | Method for detection of xmrv | |
| US20110306505A1 (en) | X-STR multiplex PCR amplification system | |
| Hadidi et al. | Polymerase chain reaction | |
| CN114317690B (zh) | 预扩增多靶核酸结合荧光定量pcr检测的方法 | |
| EP3004398B1 (en) | Real-time pcr point mutation assays for detecting hiv-1 resistance to antiviral drugs | |
| WO2016165591A1 (zh) | 基于焦磷酸测序技术的mgmt基因启动子甲基化检测 | |
| RU2612137C1 (ru) | Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica | |
| JP5258760B2 (ja) | メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 | |
| RU2804111C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования | |
| RU2471872C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов yersinia pestis различных подвидов и биоваров методами полимеразной цепной реакции и мультилокусного сиквенс-типирования | |
| RU2016136727A (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров, зондов и способ выявления мутации 35delg гена gjb2 методом аллель-специфическая пцр амплификации при наследственной несиндромальной глухоте | |
| RU2804112C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CXCR4 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования | |
| KR20110123604A (ko) | 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 ｐｃｒ 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법 | |
| RU2415948C1 (ru) | СПОСОБ ПОДВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pestis МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО СИКВЕНС-ТИПИРОВАНИЯ | |
| TWI780315B (zh) | 量化標的基因的突變型等位基因負擔的方法 | |
| KR20210113083A (ko) | SARS-CoV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-CoV-2의 진단방법 | |
| KR20200047384A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군(sfts) 바이러스 검출용 프라이머 세트 | |
| US20230416824A1 (en) | Systems for the detection of targeted gene variations and viral genomes and methods of producing and using same | |
| EP1903118A2 (en) | Method for confirming cytosine conversion treatment and nucleic acid molecule used therefor | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| RU2404256C1 (ru) | Способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования | |
| RU2806427C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации вируса герпеса человека 6А и вируса герпеса человека 6В и способ его применения |