RU2803119C2 - Способы предотвращения окисления метионина в иммуноконъюгатах - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования аномального клеточного роста, в которой степень окисления метионина сведена к минимуму, содержащей от 1,5 мг/мл до 2,5 мг/мл иммуноконъюгата, от 1 мМ до 4 мМ метионина, от 40 мкМ до 60 мкМ бисульфита натрия, 5-10% (масс./об.) трегалозы и от 10 мМ до 20 мМ сукцината, и имеющая pH от 4,0 до 4,4, где иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль; CBA представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие: а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6; и b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3; W_C равно 2. Изобретение позволяет получить стабильную во время процесса производства и/или хранения фармацевтическую композицию, содержащую вышеуказанный иммуноконъюгат и метионин. 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 4 пр.

Description

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по дате подачи в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) по предварительной заявке США № 62/562049, поданной 22 сентября 2017 г.; и предварительной заявке США № 62/573322, поданной 17 октября 2017 г. и предварительной заявке США № 62/712584, поданной 31 июля 2018. Полное содержание каждой из вышеуказанных заявок включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение в целом относится к способам предотвращения окисления метионина в иммуноконъюгатах. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям иммуноконъюгатов, в которых степень окисления метионина сведена к минимуму.

Уровень техники

Конъюгаты связывающего клетки агента и лекарственного средства (такие как конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC)) становятся мощным классом противоопухолевых агентов, обладающих эффективностью при различных видах рака. Конъюгаты связывающий клетки агент-лекарственный препарат (такие как ADC) обычно состоят из трех отдельных элементов: связывающий клетки агент (например, антитело); линкер и цитотоксический фрагмент. Цитотоксический фрагмент может быть ковалентно присоединен к лизинам на антителе, что приводит к получению конъюгатов, которые представляют собой гетерогенные смеси ADC, несущих различное количество лекарственных препаратов, прикрепленных в разных положениях на молекуле антитела. в альтернативном варианте цитотоксический фрагмент может быть ковалентно связан с тиоловыми группами цистеина в антителе посредством тиолреактивной группы, такой как малеимидная группа, с образованием сайт-специфических ADC.

Бензодиазепиновые соединения, в том числе трициклические бензодиазепины, такие как пирролобензодиазепины (ПБД), и тетрациклические бензодиазепины, такие как индолинобензодиазепины, использовали в качестве цитотоксических агентов в сочетании с антителами для получения ADC, которые проявляют многообещающую противоопухолевую активность. Эти бензодиазепиновые соединения содержат иминные связи, которые могут связываться с малой бороздкой ДНК и препятствовать функции ДНК, что приводит к гибели клеток.

Следовательно, существует необходимость в разработке новых способов получения конъюгатов связывающего клетки агента и иминсодержащих бензодиазепиновых лекарственных средств, а также новых фармацевтических композиций этих конъюгатов, которые являются стабильными во время процесса производства и/или хранения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданных результатах, заключающихся в том, что иммуноконъюгаты, содержащие бензодиазепиновые цитотоксические агенты, могут быть склонны к окислению метионина, особенно в присутствии света. Сравнительные данные с оголенными антителами позволяют предположить, что окисление метионина вызвано, по крайней мере, частично, присутствием бензодиазепинового цитотоксического агента. Неожиданно было обнаружено, что присутствие метионина в фармацевтических композициях иммуноконъюгатов антитело-бензодиазепин может снизить количество наблюдаемого окисления метионина. Кроме того, присутствие метионинового антиоксиданта в реакции конъюгации между антителами и бензодиазепиновыми цитотоксическими агентами может значительно снизить степень окисления метионина в полученных иммуноконъюгатах.

Один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, описанный в данном документе, и от 0,1 до 20 мМ метионина.

В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению представлен следующей формулой:

(IA),

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

W_C равно 1 или 2; и

Cy^Cys представлен следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой –H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R₁ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков;

R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -H, (C₁-C₃)алкил или заряженный заместитель, или ионизируемую группу Q;

m равно целому числу от 1 до 6;

L_C представлен , s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с CBA, и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -C(=O)- группой на Cy^Cys; где:

R₂ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

R₃ и R₄, в каждом случае независимо представляют собой -Н или (C₁-C₃)алкил; и

n равно целому числу от 1 до 10.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, иммуноконъюгат в фармацевтической композиции настоящего изобретения представлен следующей формулой:

(IB),

где:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

W_L равно целому числу от 1 до 20; и

Cy^Lys1 представлен следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, и Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R^x независимо представляет собой (C₁-C₆)алкил;

W’ представляет собой -NR^e,

R^e представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n1-R^k;

n1 равно целому числу от 2 до 6;

R^k представляет собой -H или -Me;

Z^s выбран из любой из следующих формул:

(b1); (b2); (b3);

(b4); (b5),

(b6),

(b7); (b8); (b9); и

(b10),

или их фармацевтически приемлемой соли, где q равно целому числу от 1 до 5.

В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей от 1 до 4 ммоль метионина и иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_C равно 2; и

CBA представляет собой антитело к CD123, содержащее: а) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8; и b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей от 1 мМ до 4 мМ метионина и иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_L равно целому числу от 1 до 10; и

CBA представляет собой антитело к CD33, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу снижения степени окисления метионина в иммуноконъюгате, описанном в данном документе, включающему смешивание иммуноконъюгата с от 0,1 мМ до 20 мМ метионина с получением фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и метионин.

В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен формулой (IA), описанной выше.

В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен формулой (IB), описанной выше.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгатов, описанному в данном документе, включающему приведение в контакт связывающего клетки агента (CBA) с цитотоксическим агентом или с соединением цитотоксического агента и линкера, описанного в данном документе, в присутствии антиоксиданта для уменьшения количества окисления метионина в иммуноконъюгатах.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

(IA),

включающий приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом, представленным следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью в присутствии антиоксиданта, где:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

W_C равно 1 или 2; и

Cy^Cys представлен следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой –H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R₁ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков;

R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -H, (C₁-C₃)алкил или заряженный заместитель, или ионизируемую группу Q;

m равно целому числу от 1 до 6;

L_C представлен , s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с CBA, и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -C(=O)- группой на Cy^C1;

R₂ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

R₃ и R₄, в каждом случае независимо представляют собой -Н или (C₁-C₃)алкил; и

n равно целому числу между 1 и 10; и

L_C’ представлен .

В определенном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

,

при этом:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

W_L равно целому числу от 1 до 20; и

Cy^Lys1 представлен следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой –H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, и Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R^x независимо представляет собой (C₁-C₆)алкил;

W’ представляет собой -NR^e,

R^e представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n1-R^k;

n1 равно целому числу от 2 до 6;

R^k представляет собой -H или -Me;

Z^s выбран из любой из следующих формул:

(b1); (b2); (b3);

(b4); (b5),

(b6),

(b7); (b8); (b9); и

(b10),

или его фармацевтически приемлемой соли, где q равно целому числу от 1 до 5,

включающему стадию:

(а) приведение в контакт цитотоксического агента, представленного следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой солью с бифункциональным сшивающим агентом, выбранным из следующего:

(a1L); (a2L); (a3L); (a4L); (a5L),

(a6L),

(a7L); (a8L); (a9L); и (a10L),

с образованием соединения цитотоксического агента-линкера, где X представляет собой галоген; J_D –SH, –SSR^d или -SC(=O)R^g; R^d представляет собой фенил, нитрофенил, динитрофенил, карбоксинитрофенил, пиридил или нитропиридил; R^g представляет собой алкил; q равно целому числу от 1 до 5; и U представляет собой -H или SO₃H; и

(B) приведение в контакт CBA с соединением цитотоксического агента-линкера в присутствии антиоксиданта с образованием иммуноконъюгата.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой солью, включающему приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом, представленным следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью в присутствии антиоксиданта, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_C равно 2; и

CBA представляет собой антитело к CD123, содержащее: а) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8; и b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли, включающий стадии:

(а) приведение в контакт цитотоксического агента, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли с бифункциональным сшивающим агентом N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноатом (сульфо-SPDB), представленным следующей формулой:

с образованием соединения цитотоксического агента-линкера, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью; и

(b) приведение в контакт CBA с соединением цитотоксического агента-линкера в присутствии антиоксиданта с образованием иммуноконъюгата, при этом:

Y представляет собой -SO₃H;

W_L равно целому числу от 1 до 10; и

CBA представляет собой антитело к CD33, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20.

Предполагается, что любой один вариант осуществления, описанный в данном документе, включая те, которые описаны только в одном аспекте изобретения (но не в других или не повторяются в других), и те, которые описаны только в примерах, может быть объединен с любым одним или более другими вариантами осуществления изобретения, если явно не отказано или не применимо.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 показывает процент окисления метионина в образцах IMGN632 с метионином и без него в течение 72 ч.

Фиг. 2 показывает процентное содержание мономера в образцах IMGN632 с метионином и без него в течение 72 ч.

Фиг. 3 показывает процентное содержание высокомолекулярных частиц в образцах IMGN632 с метионином и без него в течение 72 ч.

Фиг. 4 показывает количество свободного лекарственного средства в образцах IMGN632 с метионином и без него в течение 72 ч.

ФИГ. 5А и 5В показаны хроматограммы окисленных и нативных триптических пептидов, обнаруженных с помощью масс-спектрометрии СВЭЖХ (A) и УФ-обнаружения (B). % окисления Met (измеренный в позиции 252 нумерации EU) рассчитывается как [100 x окисленная зона/(окисленная зона + нативная зона)].

Фиг. 6 показывает процент окисления метионина в образцах IMGN632 и IMGN779 с метионом и без него в течение 7 дней.

Подробное описание сущности изобретения

1. Определения

Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, ряд терминов и фраз определены ниже.

Термины «(человеческий) IL-3Rα», «альфа-рецептор интерлейкина-3» или «CD123», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к любому нативному (человеческому) IL-3Rα или CD123, если не указано иное. Белок CD123 представляет собой интерлейкин-3-специфическую субъединицу гетеродимерного рецептора цитокинов (рецептор IL-3 или IL-3R). IL-3R состоит из лиганд-специфической альфа-субъединицы и сигнальной трансдуцирующей общей бета-субъединицы (также известной как CD131), общей для рецепторов интерлейкина 3 (IL3), колониестимулирующего фактора 2 (CSF2 / GM-CSF) и интерлейкина 5 (IL5). Связывание CD123/IL-3Rα с IL3 зависит от бета-субъединицы. Бета-субъединица активируется связыванием лиганда и требуется для биологической активности IL3.

Все вышеперечисленные термины для CD123 могут относиться к последовательности белка или нуклеиновой кислоты, как указано в данном документе. Термин «CD123/IL-3Rα» охватывает «полноразмерный» необработанный CD123/IL-3Rα, а также любую форму CD123/IL-3Rα, которая возникает в результате обработки внутри клетки. Термин также охватывает встречающиеся в природе варианты белка или нуклеиновой кислоты CD123/IL-3Rα, например сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы. Полипептиды и полинуклеотиды CD123/IL-3Rα, описанные в данном документе, могут быть выделены из множества источников, таких как типы тканей человека или из другого источника, или получены рекомбинантными или синтетическими методами. Примеры последовательностей CD123/IL-3Rα включают регистрационные номера NCBI NP_002174 & NM_002183 (последовательности белков и нуклеиновых кислот для человеческого варианта CD123 1) и NP_001254642 & NM_001267713 (последовательности белков и нуклеиновых кислот для варианта человеческого CD123 2), но не ограничиваются перечисленными.

Термин «антитело» означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или их комбинации, по меньшей мере, через один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин «антитело» охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)₂ и Fv), одноцепочечные мутанты Fv (scFv), мультиспецифичные антитела, такие как биспецифичные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антигенопределяющую часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, при условии, что антитела проявляют желаемую биологическую активность. Антитело может относиться к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2) на основе идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют различные и хорошо известные структуры субъединиц и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть оголенными или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т.д.

В некоторых вариантах осуществления антитело является не встречающимся в природе антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают от природных компонентов. В некоторых вариантах осуществления антитело получают рекомбинантно. В некоторых вариантах осуществления антитело продуцируется гибридомой.

«Блокирующее» антитело или «антагонистическое» антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, который оно связывает, такого как CD123/IL-3Rα. В определенном варианте осуществления изобретения блокирующие антитела или антагонистические антитела по существу или полностью ингибируют биологическую активность антигена. Желательно, чтобы биологическая активность была снижена на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже на 100%.

Термин «антитело к CD123», «антитело к IL-3Rα» или «антитело, которое (специфически) связывается с CD123/IL-3Rα» относится к антителу, которое способно связывать CD123/IL-3Rα с достаточной аффинностью, тем самым делая антитело полезным в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеливания на CD123/IL-3Rα. Если не указано иное, степень связывания анти-CD123/IL-3Rα-антитела с неродственным, не-CD123/IL-3Rα-белком составляет менее около 10% от связывания антитела с CD123/IL-3Rα, как измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с CD123/IL-3Rα, имеет константу диссоциации ((K_d) ≤ 0,5 нМ, ≤ 0,3 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,05 нМ или ≤ 0,01 нМ. В одном варианте осуществления антитело к CD123/IL-3Rα не связывает общую бета-цепь CD131. В одном варианте осуществления антитело к CD123/IL-3Rα не связывается с тем же эпитопом CD123, который связан с известными и коммерчески доступными антителами к CD123, такими как 7G3 (мышиный IgG_2a), 6H6 (мышиный IgG₁) и 9F5 (мышиные IgG₁) (Sun et al., Blood 87(1): 83-92, 1996).

Последовательности антител к CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающих фрагментов согласно изобретению представлены в данном документе. Номенклатура для различных антител и иммуноконъюгатов согласно изобретению приведена отдельно ниже.

Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и относится к антигенопределяющим вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)₂ и F_v, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими. Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела включает один или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться определенными фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (без ограничения): (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1 (например, антитело, расщепленное папаином, дает три фрагмента: два антигенсвязывающих фрагмента Fab и один фрагмент Fc, который не связывает антиген); (ii) фрагмент F(ab’)₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области (например, антитело, расщепленное пепсином, дает два фрагмента: двухвалентный антигенсвязывающий фрагмент F(ab’)₂ и фрагмент pFc’, который не связывает антиген) и его связанную моновалентную единицу F(ab’); (iii) фрагмент F_d состоящий из доменов V_H и C_H1 (то есть, той части тяжелой цепи, которая включена в Fab); (iv) фрагмент F_v, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела и связанного с ним дисульфида F_v; (v) фрагмент dAb (доменное антитело) или sdAb (однодоменное антитело) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), который состоит из домена V_H; и (vi) изолированная определяющая комплементарность область (CDR).

«Моноклональное антитело» относится к гомогенной популяции антител, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании одной антигенной детерминанты или эпитопа. Этим они отличаются от поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант. Термин «моноклональное антитело» охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab’, F(ab’)₂, F_v), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт узнавания антигена. Кроме того, «моноклональное антитело» относится к антителам, полученным любыми способами, включая, но не ограничиваясь ими, гибридому, отбор фага, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных.

Термин «гуманизированное антитело» относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител, которые представляют собой специфические цепи иммуноглобулинов, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат минимальные нечеловеческие (например, мышиные) последовательности. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) заменены остатками из CDR нечеловеческого вида (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемую специфичность, аффинность, и способность (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988).

В некоторых случаях остатки каркасной области F_v (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками в антителе, отличном от человеческого, который обладает желаемой специфичностью, аффинностью и способностью. Гуманизированное антитело может быть дополнительно модифицировано путем замены дополнительных остатков либо в каркасной области F_v, либо внутри замещенных нечеловеческих остатков для уточнения и оптимизации специфичности, аффинности и/или способности антитела. В общем, гуманизированное антитело будет включать, по существу, все, по меньшей мере один, и, как правило, два или три вариабельных домена, содержащие все или, по существу, все области CDR, которые соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину, тогда как все или, по существу, все области FR представляют собой консенсусные последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть константной области или домена иммуноглобулина (F_c), обычно иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемых для получения гуманизированных антител, описаны в патентах США. 5225539 и 5639641, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3):969-973, 1994; и Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904, 1996 (все они включены в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления «гуманизированное антитело» представляет собой антитело с измененной поверхностью. В некоторых вариантах осуществления «гуманизированное антитело» представляет собой CDR-привитое антитело.

«Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR, в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR, и, с CDR, из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего участка антител. Существует по меньшей мере два способа определения CDR: (1) подход, основанный на изменчивости межвидовой последовательности (т.е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273:927-948, 1997). Кроме того, иногда в данной области техники для определения CDR используются комбинации этих двух подходов.

Система номенклатуры по Кабату обычно используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5^th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Нумерация аминокислотных положений, как в Кабат, относится к системе номенклатуры, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи при компиляции антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (включена в настоящий документ посредством ссылки). При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительное количество аминокислот, что соответствует укорочению FR или CDR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну аминокислотную вставку (остаток 52a по Кабату) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т.д. по Кабату) после тяжелой цепи FR остаток 82. Номенклатура остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Кабату. Чотиа, вместо этого, относится к расположению структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917,1987). Конец цикла Чотиа CDR-H1 при нумерации с использованием соглашения о номенклатуре по Кабату варьируется между H32 и H34 в зависимости от длины цикла. Это происходит потому, что схема номенклатура по Кабату размещает вставки в H35A и H35B - если нет ни 35A, ни 35B, цикл заканчивается на 32; если присутствует только 35А, цикл заканчивается на 33; если присутствуют и 35А, и 35В, цикл заканчивается на 34. Гипервариабельные области AbM представляют собой компромисс между CDR Кабата и структурными петлями Чотиа и используются программным обеспечением Oxford Molecular для моделирования антител AbM.

Петля	Кабат	AbM	Чотиа
L1	L24-L34	L24-L34	L24-L34
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L56
L3	L89-L97	L89-L97	L89-L97
H1	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32..34
		(номенклатура по Кабату)
H1	H31-H35	H26-H35	H26-H32
		(номенклатура по Чотиа)
H2	H50-H65	H50-H58	H52-H56
H3	H9S-H102	H95-H102	H95-H102

Термин «человеческое антитело человека» означает антитело, продуцируемое человеком, или антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую антителу, продуцируемому человеком, полученному с использованием любой методики, известной в данной области техники. В определенных вариантах осуществления изобретения человеческое антитело не содержит нечеловеческую последовательность. Это определение человеческого антитела включает интактные или полноразмерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена из двух или более видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с желаемой специфичностью, аффинностью и способностью, в то время как константные области являются гомологичными последовательностям антител, полученных от другого вида (обычно человека), чтобы избежать или уменьшить вероятность возникновения иммунного ответа у этого вида (например, человека). В некоторых вариантах осуществления химерное антитело может включать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один полипептид тяжелой и/или легкой цепи человека, такой как, например, антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека.

Термины «эпитоп» или «антигенная детерминанта» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к той части антигена, которая способна распознаваться и специфически связываться с конкретным антителом. Когда антиген является полипептидом, «эпитопы» могут образовываться как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, сформированными укладкой третичной структуры белка. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при денатурации белка, тогда как эпитопы, образованные третичной структурой, как правило, теряются при денатурации белка. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 и более, обычно, по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

Термин «аффинность связывания» обычно относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, «аффинность связывания» относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно может быть представлено константой диссоциации (K_d) или половинной максимальной эффективной концентрацией (EC₅₀). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области техники, включая описанные в данном документе. Низкоаффинные антитела обычно связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области техники известен ряд способов измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать в целях данного изобретения. Конкретные иллюстративные варианты осуществления изобретения описаны в данном документе.

«Или лучше» при использовании в данном документе для обозначения аффинности связывания относится к более сильному связыванию между молекулой и ее партнером по связыванию. «Или лучше» при использовании в данном документе относится к более сильному связыванию, представленному меньшим числовым значением K_d. Например, у антитела, которое имеет сродство к антигену «0,3 нМ или лучше», сродство антитела к антигену составляет ≤0,3 нМ, например, 0,29 нМ, 0,28 нМ, 0,27 нМ и т.д., или любое значение, равное или менее чем 0,3 нМ. В одном варианте осуществления изобретения аффинность антитела, определяемая с помощью K_d, будет составлять от около 10^-3 до около 10^-12 М, от около 10^-6 до около 10^{-1 1} М, от около 10^-6 до около 10^-10 М, от около 10^-6 до около 10^-9 М, от около 10^-6 до около 10^-8 М или от около 10^-6 до около 10^-7 М.

Под «специфическим связыванием» обычно подразумевается, что антитело связывается с эпитопом через его антигенсвязывающий домен и что связывание влечет за собой некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению, считается, что антитело «специфически связывается» с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом через его антигенсвязывающий домен более легко, чем оно связывается со случайным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используется в данном документе для определения относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно считать, что антитело «А» обладает более высокой специфичностью к данному эпитопу, чем антитело «В», или можно сказать, что антитело «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем у родственного эпитопа «D».

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению «специфически связывается» с антигеном CD123, так как оно обладает более высокой специфичностью связывания с антигеном CD123 (из любого вида), чем специфичность к антигену не-CD123. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению «специфически связывается» с человеческим антигеном CD123 в том смысле, что оно обладает более высокой специфичностью связывания с человеческим антигеном CD123, чем специфичностью к нечеловеческому антигену CD123 (например, CD123 мыши или крысы).

Под «предпочтительно связывается» подразумевается, что антитело специфически связывается с эпитопом более легко, чем оно связывается с родственным, сходным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое «предпочтительно связывается» с данным эпитопом, скорее связывалось бы с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если такое антитело может перекрестно реагировать с родственным эпитопом. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению «предпочтительно связывается» с человеческим антигеном CD123 чем с мышиным CD123.

Говорят, что антитело «конкурентно ингибирует» связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом в той степени, в какой оно в некоторой степени блокирует связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным в данной области техники, например, конкурентным ИФА. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 50%.

Фраза «по существу похожий» или «по существу такой же», используемая в данном документе, обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (обычно одно связано с антителом согласно изобретению, а другое - с эталонным/сравнительным антителом) так, чтобы специалист в данной области техники считал, что различие между этими двумя значениями имеет небольшую или не имеет биологической и/или статистической значимости в контексте биологических характеристик, измеренных указанными значениями (например, значениями K_d). Разница между указанными двумя значениями составляет менее чем около 50%, менее чем около 40%, менее чем около 30%, менее чем около 20% или менее чем около 10% в зависимости от значения для эталонного/сравнительного антитела.

Используемый в данном документе термин «иммуноконъюгат», «конъюгат» или «ADC» относится к соединению или его производному, которое связано со связывающим клетки агентом (то есть антителом против CD123/IL-3Rα или его фрагментом), и определяется общей формулой: A-L-C, где C = цитотоксин, L = линкер и A = связывающий клетки агент (CBA), такой как антитело к CD123/IL-3Rα или фрагмент антитела. Иммуноконъюгаты также могут быть определены с помощью общей формулы в обратном порядке: C-L-A.

«Линкер» представляет собой любой химический фрагмент, который способен связывать соединение, обычно лекарственное средство, такое как цитотоксический агент, описанный в данном документе (например, соединения IGN (индолинобензодиазепин)), с связывающим клетки агентом, таким как антитело или его фрагмент стабильным, ковалентным способом. Линкеры могут быть восприимчивыми или быть по существу устойчивыми к кислотно-индуцированному расщеплению, светоиндуцированному расщеплению, пептидазноиндуцированному расщеплению, эстеразоиндуцированному расщеплению и расщеплению дисульфидной связи в условиях, при которых соединение или антитело остаются активными. Подходящие линкеры хорошо известны в данной области техники и включают, например, дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, пептидазолабильные группы и эстеразолабильные группы. Линкеры также включают заряженные линкеры и их гидрофильные формы, как описано в данном документе и известно в данной области техники.

Термины «рак» и «раковый» относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. «Опухоль» и «новообразование» относятся к одной или более клеткам, которые возникают в результате чрезмерного роста или пролиферации клеток, либо доброкачественных (нераковых), либо злокачественных (раковых), включая предраковые поражения.

Примеры рака включают лимфому и лейкоз. Примеры раковых или онкогенных заболеваний, которые можно лечить и/или предотвращать способами и реагентами (например, антителом к CD123, его антигенсвязывающим фрагментом или его иммуноконъюгатом) согласно изобретению, включают AML, CML, ALL (например, B-ALL), CLL, миелодиспластический синдром, основное плазмоцитоидное новообразование DC (BPDCN), лейкоз, B-клеточные лимфомы, включая неходжкинские лимфомы (NHL), предшественники B-клеточных лимфобластных лейкозов/лимфом и зрелые B-клеточные новообразования, такие как B-клеточная хроническая лимфоцитарная лейкемия (B-CLL)/малая лимфоцитарная лимфома (SLL), B-клеточная пролимфоцитарная лейкемия, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома мантийных клеток (MCL), фолликулярная лимфома (FL), в том числе слабо выраженная, средне выраженная и высокозлокачественная FL, лимфома центра кожного фолликула, B-клеточная лимфома маргинальной зоны (тип MALT, узловой и селезеночный тип), лейкоз ворсистых клеток (HCL), диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL), лимфома Беркитта, плазмоцитома, плазмоклеточная миелома, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемия Вальденстрема, анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL) и лейкемия Ходжкина (HL).

Термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая людей, нечеловеческих приматов, грызунов и тому подобное, но не ограничиваясь ими, которое должно быть получателем конкретного лечения. Как правило, термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо применительно к человеку.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к составу, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться композиция. Такая рецептура может быть стерильной.

«Эффективное количество» антитела или иммуноконъюгата, раскрытое в данном описании, представляет собой количество, достаточное для достижения конкретно заявленной цели. «Эффективное количество» может быть определено эмпирически и обычным образом в соответствии с заявленной целью.

Термин «алкил» в данном описании относится к насыщенному одновалентному углеводородному радикалу с линейной или разветвленной цепью, содержащему от одного до двадцати атомов углерода. Примеры алкила включают, но не ограничиваются этим, метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-метил-1-пропил, -CH₂CH(CH₃)₂), 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2-метил-2-бутил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил 2,3-диметил-2-бутил, 3,3-диметил-2-бутил, 1-гептил, 1-октил и тому подобное. Предпочтительно алкил имеет от одного до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкил имеет от одного до четырех атомов углерода.

Число атомов углерода в группе может быть указано в данном документе приставкой «C_x-xx», где x и xx являются целыми числами. Например, «C_1-4алкил» представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода.

Термин «соединение» или «цитотоксическое соединение» используются взаимозаменяемо. Предполагается, что они включают соединения, для которых структура или формула или любое их производное были описаны в настоящем изобретении, или структура или формула, или любое их производное, которые были включены путем ссылки. Термин также включает стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, метаболиты и соли (например, фармацевтически приемлемые соли) соединения всех формул, раскрытых в настоящем изобретении. Термин также включает любые сольваты, гидраты и полиморфы любого из вышеперечисленного. Специфическое перечисление «стереоизомеров», «геометрических изомеров», «таутомеров», «сольватов», «метаболитов», «солей», «конъюгатов», «солей конъюгатов», «сольватов», «гидратов» или «полиморфов» в определенных аспектах изобретения, описанные в настоящей заявке, не следует толковать как намеренное упущение этих форм в других аспектах изобретения, где термин «соединение» используется без перечисления этих других форм.

Термин «хиральный» относится к молекулам, которые обладают свойством не наложения на партнера зеркального изображения, в то время как термин «ахиральный» относится к молекулам, которые накладываются на их партнера зеркального изображения.

Термин «стереоизомер» относится к соединениям, которые имеют одинаковую химическую конституцию и связность, но разные ориентации их атомов в пространстве, которые не могут быть взаимопревращены вращением вокруг одинарных связей.

«Диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности, молекулы которого не являются зеркальным отражением друг друга. Диастереомеры имеют разные физические свойства, например, точки плавления, точки кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереомеров могут разделяться при аналитических процедурах высокого разрешения, таких как кристаллизация, электрофорез и хроматография.

«Энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединения, которые не являются наложенными друг на друга зеркальными изображениями.

Используемые в данном документе стереохимические определения и условные обозначения, как правило, соответствуют S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill, Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения изобретения могут содержать асимметричные или хиральные центры и, следовательно, существовать в разных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединений изобретения, включая, но не ограничиваясь ими, диастереомеры, энантиомеры и атропоизомеры, а также их смеси, такие как рацемические смеси, составляют часть настоящего изобретения. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, то есть они способны вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения префиксы D и L или R и S используются для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального центра(ов). Префиксы d и I или (+) и (-) используются для обозначения знака вращения плоскополяризованного света соединением, где (-) или 1 означает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для заданной химической структуры эти стереоизомеры идентичны, за исключением того, что они являются зеркальными отображениями друг друга. Конкретный стереоизомер также может называться энантиомером, а смесь таких изомеров часто называется энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров в соотношении 50:50 называется рацемической смесью или рацематом, которые могут возникать в тех случаях, когда в химической реакции или процессе не было стереоселективности или стереоспецифичности. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных видов, лишенной оптической активности.

Термин «таутомер» или «таутомерная форма» относится к структурным изомерам с различными энергиями, которые взаимопревращаемы через низкоэнергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимопревращения посредством миграции протона, такие как изомеризация кето-енола и имин-енамина. Валентные таутомеры включают взаимопревращения путем реорганизации некоторых связывающих электронов.

Используемая в данном документе фраза «фармацевтически приемлемая соль» относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения изобретения. Типичные соли включают, но не ограничиваются ими, сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат «мезилат», этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, соли памоата (например, 1,1’-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтаноат)), соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония. Фармацевтически приемлемая соль может включать включение другой молекулы, такой как ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоион может быть любым органическим или неорганическим фрагментом, который стабилизирует заряд исходного соединения. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь более одного заряженного атома в своей структуре. В случаях, когда несколько заряженных атомов являются частью фармацевтически приемлемой соли, может присутствовать несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или более заряженных атомов и/или один или более противоионов.

Если соединение изобретения представляет собой основание, желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, доступным в данной области, например обработкой свободного основания неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и тому подобное, или органической кислотой, такой как уксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидиловая кислота, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, альфа-гидрокси кислота, такая как лимонная кислота или винная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или коричная кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота, или тому подобное.

Если соединение изобретения представляет собой кислоту, желаемую фармацевтически приемлемую соль можно получить любым подходящим способом, например обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный), гидроксидом щелочного металла или гидроксидом щелочноземельного металла или тому подобное. Иллюстративные примеры подходящих солей включают, но не ограничиваются ими, органические соли, полученные из аминокислот, таких как глицин и аргинин, аммиак, первичные, вторичные и третичные амины, и циклические амины, такие как пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

Используемый в данном документе термин «сольват» означает соединение, которое дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, такого как вода, изопропанол, ацетон, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусная кислота и этаноламин дихлорметана, 2-пропанол или тому подобное, связанное нековалентными межмолекулярными силами. Сольваты или гидраты соединений легко получают добавлением к соединению по меньшей мере одного молярного эквивалента гидроксильного растворителя, такого как метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол или вода, чтобы привести к сольватации или гидратации иминной части.

Фраза «фармацевтически приемлемый» указывает на то, что вещество или композиция должны быть химически и/или токсикологически совместимыми с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и/или млекопитающим, который поддается лечению.

Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе аминокислотам или не встречающимся в природе аминокислотам. В одном варианте осуществления аминокислота представлена NH₂-C(R^aa’R^aa)-C(=O)OH, где R^aa и R^aa’, каждый независимо, представляет собой Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, арил, гетероарил или гетероциклил или R^aa и N-концевой атом азота могут вместе образовывать гетероциклическое кольцо (например, как в пролине). Термин «аминокислотный остаток» относится к соответствующему остатку, когда один атом водорода удален из аминного и/или карбокси-конца аминокислоты, такого как -NH-C(R^aa’R^aa)-C(=O)O-.

Термин «катион» относится к иону с положительным зарядом. Катион может быть одновалентным (например, Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺ и т.д.), двухвалентным (например, Ca²⁺, Mg²⁺ и т.д.) или многовалентным (например, Al³⁺ и т.д.). Предпочтительно, катион является одновалентным.

Термин «окисление метионина» относится к окислению одного или более остатков метионина, расположенных на связывающем клетки агенте (например, антителе или его антигенсвязывающем фрагменте). В некоторых вариантах осуществления окисление происходит в одном или более метиониновых остатках, расположенных в области Fc антитела (например, в Met252, Met358, Met428 по нумерации ЕС). В определенном варианте осуществления окисление метионина, в частности окисление метионина в Fc-области антитела, может снижать связывание антитела с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), что, в свою очередь, может влиять на период полувыведения из антитела.

Следует понимать, что в тех случаях, когда варианты осуществления описаны в данном документе с формулировкой «содержащий», в противном случае аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах «состоящий из» и/или «состоящий в основном из», также обеспечены.

Термин «и/или», используемый в такой фразе, как «А и/или В», предназначен для обозначения «А и В», «А или В», «А» и «В». Аналогично, термин «и/или», используемый в такой фразе, как «A, B и/или C», предназначен для охвата каждого из следующих вариантов осуществления: A, B, и C; A, B, или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (отдельно); B (отдельно); и C (отдельно).

Номенклатура антител, соединений и иммуноконъюгатов

Как используется в данном документе, номенклатура, используемая для антител, цитотоксических соединений и их иммуноконъюгатов, обычно принимает следующие значения.

Типичные антитела или их антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению приведены в таблице ниже. Например, антитело G4723A представляет собой гуманизированное антитело к CD123 с цистеином в позиции нумерации ЕС 442, имеющее полную длину тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:8; и последовательность полной длины легкой цепи SEQ ID NO:10.

Название	Последовательность
huCD123-6 LC-CDR1	RASQDINSYLS (SEQ ID NO:1)
huCD123-6 LC-CDR2	RVNRLVD (SEQ ID NO:2)
huCD123-6 LC-CDR3	LQYDAFPYT (SEQ ID NO:3)
huCD123-6 HC-CDR1	SSIMH (SEQ ID NO:4)
huCD123-6 HC-CDR2	YIKPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO:5)
huCD123-6 HC-CDR3	EGGNDYYDTMDY (SEQ ID NO:6)
huCD123-6Gv7 вариабельная область тяжелой цепи	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFT SSIMH WVRQAPGQGLEWIG YIKPYNDGTKYNEKFKG RATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EGGNDYYDTMDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7)
huCD123-6Gv7-C442 полноразмерная тяжелая цепь	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFT SSIMH WVRQAPGQGLEWIG YIKPYNDGTKYNEKFKG RATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EGGNDYYDTMDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLCLSPG (SEQ ID NO:8)
huCD123-6Gv4 вариабельная область легкой цепи	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDINSYLS WFQQKPGKAPKTLIY RVNRLVD GVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYC LQYDAFPYT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:9)
huCD123-6Gv4 полноразмерная легкая цепь	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDINSYLS WFQQKPGKAPKTLIY RVNRLVD GVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYC LQYDAFPYT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:10)

Название	Последовательность
huMy9-6 LC-CDR1	KSSQSVFFSSSQKNYLA (SEQ ID NO:11)
huMy9-6 LC-CDR2	WASTRES (SEQ ID NO:12)
huMy9-6 LC-CDR3	HQYLSSRT (SEQ ID NO:13)
huMy9-6 HC-CDR1	SYYIH (SEQ ID NO:14)
huMy9-6 HC-CDR2	VIYPGNDDISYNQKFQG (SEQ ID NO:15)
huMy9-6 HC-CDR3	EVRLRYFDV (SEQ ID NO:16)
huMy9-6 вариабельная область тяжелой цепи	QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFT SYYIH WIKQTPGQGLEWVG VIYPGNDDISYNQKFQG KATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR EVRLRYFDV WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:17)
huMy9-6 полноразмерная тяжелая цепь	QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFT SYYIH WIKQTPGQGLEWVG VIYPGNDDISYNQKFQG KATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR EVRLRYFDV WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:18)
huMy9-6 вариабельная область легкой цепи	EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSC KSSQSVFFSSSQKNYLA WYQQIPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYC HQYLSSRT FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:19)
huMy9-6 полноразмерная легкая цепь	EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSC KSSQSVFFSSSQKNYLA WYQQIPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYC HQYLSSRT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:20)

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению могут быть конъюгированы с некоторыми цитотоксическими агентами либо посредством связи с аминогруппой боковой цепи Lys, либо с тиольной группой боковой цепи Cys. Некоторые типичные (не ограничивающие) цитотоксические агенты и иммуноконъюгаты, раскрытые в описании (включая примеры), перечислены ниже для иллюстрации. Обратите внимание, что большинство соединений, таких как DGN462, DGN549-C и DGN549-L, могут быть сульфированными (показаны как sDGN462 и sDGN549-C соответственно).

2. Фармацевтические композиции

В первом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, описанный в данном документе (например, иммуноконъюгат с 1-го по 26-й конкретный вариант осуществления изобретения, описанные ниже), и от 0,1 до 20 мМ метионина. Неожиданно было обнаружено, что во время приготовления и/или хранения иммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению происходит значительное окисление метионина. В частности, воздействие света в течение длительного периода времени, такого как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 24, 48, 72 ч или дольше, приводит к значительному окислению метионина в иммуноконъюгатах. В аналогичных условиях не наблюдается значительного окисления метионина для соответствующих оголенных антител под воздействием света и/или при хранении. Присутствие метионина в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, содержащей иммуноконъюгаты, описанные в данном документе, снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгатах по сравнению с фармацевтическими композициями без метионина, в частности, при воздействии света.

В первом варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит иммуноконъюгат, описанный в данном документе (например, иммуноконъюгаты формулы (IA), (IB) или (IC), или иммуноконъюгат с 1-го по 26-й конкретный вариант осуществления, описанные ниже), и от 0,1 мМ до 10 мМ метионина.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит иммуноконъюгат, описанный в данном документе (например, иммуноконъюгаты формулы (IA), (IB) или (IC), или иммуноконъюгат с 1-го по 26-й конкретный вариант осуществления, описанные ниже), и от 0,5 мМ до 5 мМ метионина.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит иммуноконъюгат, описанный в данном документе (например, иммуноконъюгаты формулы (IA), (IB) или (IC), или иммуноконъюгат с 1-го по 26-й конкретный вариант осуществления, описанные ниже), и от 1,0 мМ до 4,0 мМ метионина. В определенных вариантах осуществления изобретения концентрация метионина в фармацевтической композиции составляет 3 мМ.

В определенных вариантах осуществления, когда фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, описанная выше, подвергается воздействию света при комнатной температуре в течение 6 ч или более, иммуноконъюгат имеет менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 35 %, менее чем 30%, менее чем 25 %, менее чем 20% или менее чем 15 %, менее чем 10%, менее чем 5 %, менее чем 4 %, менее чем 3 %, менее чем 2 % или менее чем 1 % окисления метионина.

Во втором варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит от 1 мМ до 4 мМ метионина и иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

(IIA);

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_C равно 2; и

CBA представляет собой антитело к CD123, содержащее: а) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8; и b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10.

В третьем варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит от 1 мМ до 4 мМ метионина и иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_L равно целому числу от 1 до 10; и

CBA представляет собой антитело к CD33, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20.

В четвертом варианте осуществления фармацевтическая композиция первого, второго или третьего варианта осуществления изобретения содержит 3 мМ метионина

В пятом варианте осуществления, когда фармацевтическая композиция по первому, второму, третьему или четвертому варианту осуществления изобретения подвергается воздействию света при комнатной температуре в течение 6 ч, иммуноконъюгат содержит менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1% окисления метионина.

В шестом варианте осуществления фармацевтическая композиция по первому, второму, третьему, четвертому или пятому варианту осуществления изобретения находится в контейнере, который защищает фармацевтическую композицию от воздействия света. Можно использовать любой подходящий контейнер (например, флакон или шприц). Например, светостойкий (например, янтарный, желто-зеленый или синий) контейнер, такой как цветной стеклянный или цветной пластиковый контейнер (например, флакон или шприц), может использоваться для минимизации воздействия света. В качестве альтернативы можно использовать бесцветный или полупрозрачный контейнер, если он защищен светостойким непрозрачным покрытием, таким как бумажная коробка, пластиковая коробка или алюминиевая фольга. Кроме того, любой контейнер, фильтр или флакон, который блокирует свет ниже 400-435 нм для предотвращения попадания в фармацевтическую композицию источников света с длиной волны, аналогичной спектру поглощения цитотоксической полезной нагрузки (например, DGN462, DGN549), полезен для изобретения. Кроме того, в состав могут быть добавлены светопоглощающие добавки для защиты фармацевтической композиции от воздействия света.

В седьмом варианте осуществления фармацевтическая композиция по первому, второму, третьему, четвертому, пятому или шестому варианту осуществления содержит от 1 мг/мл до 10 мг/мл, от 1 мг/мл до 5 мг/мл, от 1 мг/мл до 3 мг/мл или от 1,5 до 2,5 мг/мл иммуноконъюгата. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по второму, третьему, четвертому, пятому или шестому варианту осуществления содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата.

В восьмом варианте осуществления фармацевтическая композиция первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого или седьмого варианта осуществления дополнительно содержит бисульфит натрия. В некоторых вариантах осуществления концентрация бисульфита натрия в фармацевтических композициях составляет от 10 мкМ до 100 мкМ, от 20 мкМ до 90 мкМ, от 30 мкМ до 80 мкМ, от 30 мкМ до 70 мкМ, от 40 мкМ до 60 мкМ или от 45 мкМ до 55 мкМ бисульфита натрия. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по второму, третьему, четвертому, пятому, шестому или седьмому варианту осуществления дополнительно содержит 50 мкМ бисульфита натрия.

В девятом варианте осуществления фармацевтическая композиция по первому, второму, третьему, четвертому, пятому, шестому, седьмому или восьмому варианту осуществления дополнительно содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей (например, носитель, вспомогательное вещество) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Edition Mack Publishing, 2000). Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, такие как фосфатный, цитратный, сукцинатный, гистидиновый и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (например, менее чем около 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по первому, второму, третьему, четвертому, пятому, шестому, седьмому или восьмому варианту осуществления дополнительно содержит бисульфит натрия, буфер, сахар и неионное поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения дополнительно содержит бисульфит натрия, сукцинатный или гистидиновый буфер, трегалозу и полисорбат 20.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, сукцинатного или гистидинового) в фармацевтической композиции находится в диапазоне от 5 мМ до 50 мМ, от 5 мМ до 25 мМ, от 5 мМ до 15 мМ, от 10 мМ до 25 мМ или 15 мМ до 25 мм. В определенных вариантах осуществления концентрация буфера составляет 10 мМ или 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления концентрация сахара (например, трегалозы) в фармацевтической композиции находится в диапазоне 5-10%, 6-8%, 6,5-7,5%, 7,0-7,4%, 7,1-7,3% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация сахара (например, трегалозы) в фармацевтической композиции составляет 7,2% (масс./об.).

В некоторых вариантах осуществления концентрация неионного поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 20) в фармацевтической композиции находится в диапазоне 0,01-0,1%, 0,01-0,05% или 0,01-0,03% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация неионного поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 20) в фармацевтической композиции составляет 0,02% (масс./об.).

В десятом варианте осуществления фармацевтическая композиция первого, второго, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого или девятого варианта осуществления имеет рН от 4 до 5, от 4 до 4,5, от 4 до 4,4 или от 4,1 до 4,3. В определенных вариантах осуществления pH составляет 4,2.

В одиннадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция по первому, третьему, четвертому, пятому, шестому, седьмому, восьмому или девятому варианту осуществления имеет рН от 5,5 до 6,5, от 5,9 до 6,3 или от 6,0 до 6,2. В определенных вариантах осуществления pH составляет 6,1.

В двенадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата формулы (IIA), 3 мМ метионина, 10 мМ сукцинатного буфера, 50 мкМ бисульфита натрия, 7,2% (масс./об.) трегалозы (или 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы) и 0,01% (масс./об.) полисорбата 20, а рН фармацевтической композиции составляет 4,2.

В тринадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата формулы (IIB), 3 мМ метионина, 20 мМ гистидинового буфера, 50 мкМ бисульфита натрия, 7,2% (масс./об.) трегалозы (или 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы), 0,02% (масс./об.) полисорбата 20 и рН фармацевтической композиции составляет 6,1.

3. Способы снижения окисления метионина

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения степени окисления метионина в иммуноконъюгате, описанном в данном документе (например, иммуноконъюгаты формулы (IA), (IB) или (IC), или иммуноконъюгаты с 1 по 26-й конкретный вариант осуществления, описанные ниже), включающий смешивание иммуноконъюгата с от 0,1 мМ до 20 мМ метионина с получением фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и метионин.

В первом варианте осуществления способ согласно второму аспекту изобретения включает смешивание иммуноконъюгата, описанного в данном документе (например, иммуноконъюгатов формулы (IA), (IB) или (IC), или иммуноконъюгата с 1-го по 26-й конкретный вариант осуществления, описанные ниже), с от 0,5 мМ до 5 мМ метионина.

В некоторых вариантах осуществления способ согласно второму аспекту изобретения включает смешивание иммуноконъюгата, описанного в данном документе (например, иммуноконъюгатов формулы (IA), (IB) или (IC), или иммуноконъюгата с 1-го по 26-й конкретный вариант осуществления, описанные ниже), с от 1,0 мМ до 4,0 мМ метионина.

В определенных вариантах осуществления, когда фармацевтическая композиция, полученная способом согласно второму аспекту настоящего изобретения, описанному выше, подвергается воздействию света при комнатной температуре в течение 6 ч или более, иммуноконъюгат имеет менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 35 %, 30%, менее чем 25 %, менее чем 20% или менее чем 15 %, менее чем 10%, менее чем 5 %, менее чем 4 %, менее чем 3 %, менее чем 2 % или менее чем 1 % окисления метионина.

Во втором варианте осуществления способ согласно второму аспекту изобретения включает смешивание от 1 мМ до 4 мМ метионина и иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

(IIA);

или его фармацевтически приемлемой соли, с получением фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и метионин, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_C равно 2; и

CBA представляет собой антитело к CD123, содержащее: а) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8; и b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10.

В третьем варианте осуществления способ согласно второму аспекту изобретения включает смешивание от 1 мМ до 4 мМ метионина и иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_L равно целому числу от 1 до 10; и

CBA представляет собой антитело к CD33, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20.

В четвертом варианте осуществления способ первого, второго или третьего варианта осуществления второго аспекта изобретения включает смешивание 3 мМ метионина с иммуноконъюгатом.

В пятом варианте осуществления, когда фармацевтическая композиция, полученная способом согласно первому, второму, третьему или четвертому варианту осуществления второго аспекта изобретения, подвергается воздействию света при комнатной температуре в течение 6 ч, иммуноконъюгат содержит менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1% окисления метионина.

В шестом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому варианту осуществления второго аспекта изобретения, находится в контейнере, который защищает фармацевтическую композицию от воздействия света. Можно использовать любой подходящий контейнер (например, флакон или шприц). Например, светостойкий (например, янтарный, желто-зеленый или синий) контейнер, такой как цветной стеклянный или цветной пластиковый контейнер (например, флакон или шприц), может использоваться для минимизации воздействия света. В качестве альтернативы можно использовать бесцветный или полупрозрачный контейнер, если он защищен светостойким непрозрачным покрытием, таким как бумажная коробка или пластиковая коробка.

В седьмом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому или шестому варианту осуществления второго аспекта изобретения, содержит от 1 мг/мл до 10 мг/мл, от 1 мг/мл до 5 мг/мл, 1 мг/мл до 3 мг/мл или от 1,5 до 2,5 мг/мл иммуноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно второму, третьему, четвертому, пятому или шестому варианту осуществления второго аспекта изобретения, содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата.

В восьмом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому, шестому или седьмому варианту осуществления второго аспекта, дополнительно содержит бисульфит натрия. В некоторых вариантах осуществления концентрация бисульфита натрия в фармацевтической композиции составляет от 10 мкМ до 100 мкМ, от 20 мкМ до 90 мкМ, от 30 мкМ до 80 мкМ, от 30 мкМ до 70 мкМ, от 40 мкМ до 60 мкМ или от 45 мкМ до 55 мкМ бисульфита натрия. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно второму, третьему, четвертому, пятому, шестому или седьмому варианту осуществления второго аспекта, дополнительно содержит 50 мкМ бисульфита натрия.

В девятом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому, шестому, седьмому или восьмому варианту осуществления второго аспекта изобретения, дополнительно содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей (например, носитель, вспомогательное вещество) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Edition Mack Publishing, 2000). Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, такие как фосфатный, цитратный, сукцинатный, гистидиновый и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (например, менее чем около 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому, шестому, седьмому или восьмому варианту осуществления второго аспекта, дополнительно содержит бисульфит натрия, буфер, сахар и неионное поверхностно-активное вещество. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по способу первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого или восьмого варианта осуществления второго аспекта дополнительно содержит бисульфит натрия, сукцинатный или гистидиновый буфер, трегалозу и полисорбат 20.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, сукцинатного или гистидинового) в фармацевтической композиции находится в диапазоне от 5 мМ до 50 мМ, от 5 мМ до 25 мМ, от 5 мМ до 15 мМ, от 10 мМ до 25 мМ или 15 мМ до 25 мм. В определенных вариантах осуществления концентрация буфера составляет 10 мМ или 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления концентрация сахара (например, трегалозы) в фармацевтической композиции находится в диапазоне 5-10%, 6-8%, 6,5-7,5%, 7,0-7,4%, 7,1-7,3% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация сахара (например, трегалозы) в фармацевтической композиции составляет 7,2% (масс./об.).

В некоторых вариантах осуществления концентрация неионного поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 20) в фармацевтической композиции находится в диапазоне 0,01-0,1%, 0,01-0,05% или 0,01-0,03% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация неионного поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 20) в фармацевтической композиции составляет 0,02% (масс./об.)

В десятом варианте осуществления фармацевтическая композиция по способу первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого или девятого варианта осуществления второго аспекта имеет рН от 4 до 5, от 4 до 4,5, от 4 до 4,4 или от 4,1 до 4,3. В определенных вариантах осуществления pH составляет 4,2.

В одиннадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция по способу первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого или восьмого или девятого варианта осуществления второго аспекта имеет рН от 5,5 до 6,5, от 5,9 до 6,3 или от 6,0 до 6,2 В определенных вариантах осуществления pH составляет 6,1.

В двенадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом согласно второму, четвертому, пятому, шестому, седьмому, восьмому или девятому варианту осуществления второго аспекта изобретения, содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата формулы (IIA), 3 мМ метионина, 10 мМ сукцинатного буфера, 50 мкМ бисульфита натрия, 7,2 % (масс./об.) трегалозы (или 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы) и 0,01 % (масс./об.) полисорбата 20, и рН фармацевтической композиции составляет 4,2.

В тринадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого или девятого варианта осуществления второго аспекта изобретения, содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата формулы (IIB), 3 мМ метионина, 20 мМ гистидинового буфера, 50 мкМ бисульфита натрия, 7,2 % (масс./об.) трегалозы (или 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы), 0,02 % (масс./об.) полисорбата 20, и pH фармацевтической композиции составляет 6,1.

4. Способы получения иммуноконъюгатов

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата согласно настоящему изобретению, включающему приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом или соединением цитотоксическим агентом-линкером в присутствии антиоксиданта.

В первом варианте осуществления третьего аспекта настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

(IA),

включающему приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом, представленным следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью в присутствии антиоксиданта, где L_C’ представлен ; и остальные переменные являются такими, как описано выше для формулы (IA) или 1-13-го конкретного варианта осуществления изобретения, описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгате.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант представляет собой производные метионина с амино и/или карбоксильными защитными группами (например, N-ацетил, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc) и карбоксибензил (Cbz)), водорастворимый, не нуклеофильный тиоэфир или диметилсульфид.

В определенных вариантах осуществления антиоксидант представляет собой N-ацетилметионин.

Во втором варианте осуществления третьего аспекта настоящее изобретение предлагает способ получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

(IB),

включающему стадию:

(а) приведение в контакт цитотоксического агента, представленного следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой соли с бифункциональным сшивающим агентом, выбранным из следующего:

(a1L); (a2L); (a3L); (a4L); (a5L),

(a6L),

(a7L); (a8L); (a9L); и(a10L),

с образованием соединения цитотоксического агента-линкера, где X представляет собой галоген; J_D –SH, –SSR^d или -SC(=O)R^g; R^d представляет собой фенил, нитрофенил, динитрофенил, карбоксинитрофенил, пиридил или нитропиридил; R^g представляет собой алкил; q равно целому числу от 1 до 5; и U представляет собой -H или SO₃H; и

(b) приведение в контакт CBA с соединением цитотоксического агента-линкера в присутствии антиоксиданта с образованием иммуноконъюгата, где остальные переменные являются такими, как описано выше для формулы (IB) или 14-19-го конкретных вариантов осуществления изобретения.

В некоторых вариантах осуществления соединение цитотоксического агента-линкера не очищают перед реакцией с CBA на стадии (b).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгате.

В некоторых вариантах осуществления антиоксидант представляет собой производные метионина с амино и/или карбоксильными защитными группами (например, N-ацетил, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc) и карбоксибензил (Cbz)), водорастворимый, не нуклеофильный тиоэфир или диметилсульфид

В определенном варианте осуществления антиоксидант представляет собой метиловый эфир N-ацетилметионина.

В третьем варианте осуществления третьего аспекта настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

(IC),

включающему приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом, представленным следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой солью, где C(=O)E представляет собой реакционноспособную сложноэфирную группу, такую как N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, нитрофенильный (например, 2 или 4-нитрофенил) эфир, динитрофенильный (например, 2, 4-динитрофенил) сложный эфир, сульфотетрафторфенильный (например, 4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенильный) сложный эфир или пентафторфенильный сложный эфир, предпочтительно N-гидроксисукцинимидный сложный эфир; и остальные переменные являются такими, как описано выше в 20-26-м конкретных вариантах осуществления.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгате.

В некоторых вариантах осуществления антиоксидант представляет собой производные метионина с амино и/или карбоксильными защитными группами (например, N-ацетил, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc) и карбоксибензил (Cbz)), водорастворимый, не нуклеофильный тиоэфир или диметилсульфид.

В некоторых вариантах осуществления антиоксидант представляет собой метиловый эфир N-ацетилметионина.

В четвертом варианте осуществления третьего аспекта настоящее изобретение предлагает способ получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой соли, включающему приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом, представленным следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью в присутствии антиоксиданта, где:

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

W_C равно 2; и

CBA представляет собой антитело к CD123, содержащее: а) полную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO:8; и b) полную последовательность легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгате.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант представляет собой производные метионина с амино и/или карбоксильными защитными группами (например, N-ацетил, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc) и карбоксибензил (Cbz)), водорастворимый, не нуклеофильный тиоэфир или диметилсульфид.

В определенном варианте осуществления изобретения антиоксидант представляет собой N-ацетилметионин.

В пятом варианте осуществления третьего аспекта настоящее изобретение предлагает способ получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли, включающий стадии:

(а) приведение в контакт цитотоксического агента, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли с бифункциональным сшивающим агентом сульфо-SPDB, представленным следующей формулой:

с образованием соединения цитотоксического агента-линкера, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли; и

(b) приведение в контакт CBA с соединением цитотоксического агента-линкера в присутствии антиоксиданта с образованием иммуноконъюгата, при этом:

Y представляет собой -SO₃H;

W_L равно целому числу от 1 до 10; и

CBA представляет собой антитело к CD33, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20.

В некоторых вариантах осуществления соединение цитотоксического агента-линкера не очищают перед реакцией с CBA на стадии (b).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгате.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант представляет собой производные метионина с амино и/или карбоксильными защитными группами (например, N-ацетил, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc) и карбоксибензил (Cbz)), водорастворимый, не нуклеофильный тиоэфир или диметилсульфид.

В определенном варианте осуществления антиоксидант представляет собой метиловый эфир N-ацетилметионина.

В шестом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммуноконъюгата, представленного следующей формулой:

(IIC),

или его фармацевтически приемлемой соли, включающему приведение в контакт CBA с цитотоксическим агентом, представленным следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой соли, где:

Y представляет собой -SO₃H;

W_L равно целому числу от 1 до 10; и

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант снижает степень окисления метионина в иммуноконъюгате.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиоксидант представляет собой производные метионина с амино и/или карбоксильными защитными группами (например, N-ацетил, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc) и карбоксибензил (Cbz)), водорастворимый, не нуклеофильный тиоэфир или диметилсульфид.

В некоторых вариантах осуществления антиоксидант представляет собой метиловый эфир N-ацетилметионина.

В седьмом варианте осуществления способ по первому, второму, третьему, четвертому, пятому или шестому варианту осуществления третьего аспекта дополнительно включает очистку иммуноконъюгата в буферной смеси с получением фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и от 0,1 мМ до 20 мМ, от 0,1 мМ до 10 мМ, от 0,5 мМ до 5 мМ или от 1 мМ до 4 мМ метионина. В определенных вариантах осуществления буферная смесь содержит 3 мМ метионина.

В восьмом варианте осуществления фармацевтическая композиция по седьмому варианту осуществления третьего аспекта дополнительно содержит бисульфит натрия. В некоторых вариантах осуществления концентрация бисульфита натрия в фармацевтической композиции составляет от 10 мкМ до 100 мкМ, от 20 мкМ до 90 мкМ, от 30 мкМ до 80 мкМ, от 30 мкМ до 70 мкМ, от 40 мкМ до 60 мкМ или от 45 мкМ до 55 мкМ бисульфита натрия. В определенных вариантах осуществления концентрация бисульфита натрия в фармацевтической композиции составляет 50 мкМ.

В девятом варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно седьмому или восьмому варианту осуществления третьего аспекта изобретения дополнительно содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей (например, носитель, наполнитель) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20^th Edition Mack Publishing, 2000). Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, такие как фосфатный, цитратный, сукцинатный, гистидиновый и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (например, менее чем около 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по девятому варианту осуществления третьего аспекта дополнительно содержит бисульфит натрия, буфер, сахар и неионное поверхностно-активное вещество. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по девятому варианту осуществления третьего аспекта дополнительно содержит бисульфит натрия, сукцинатный или гистидиновый буфер, трегалозу и полисорбат 20.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, сукцинатного или гистидинового) в фармацевтической композиции находится в диапазоне от 5 мМ до 50 мМ, от 5 мМ до 25 мМ, от 5 мМ до 15 мМ, от 10 мМ до 25 мМ или от 15 мМ до 25 мм. В определенных вариантах осуществления концентрация буфера составляет 10 мМ или 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления концентрация сахара (например, трегалозы) в фармацевтической композиции находится в диапазоне 5-10%, 6-8%, 6,5-7,5%, 7,0-7,4%, 7,1-7,3% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация сахара (например, трегалозы) в фармацевтической композиции составляет 7,2% (масс./об.).

В некоторых вариантах осуществления концентрация неионного поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 20) в фармацевтической композиции находится в диапазоне 0,01-0,1%, 0,01-0,05% или 0,01-0,03% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация неионного поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 20) в фармацевтической композиции составляет 0,02% (масс./об.).

В десятом варианте осуществления для способа седьмого, восьмого или девятого варианта осуществления третьего аспекта концентрация иммуноконъюгата в фармацевтической композиции находится в диапазоне от 1 мг/мл до 10 мг/мл, от 1 мг/мл до 5 мг/мл, от 1 мг/мл до 3 мг/мл или от 1,5 мг/мл до 2,5 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация иммуноконъюгата составляет 2 мг/мл.

В одиннадцатом варианте осуществления для способа седьмого, восьмого, девятого или десятого варианта осуществления третьего аспекта фармацевтическая композиция имеет рН от 4 до 5, от 4 до 4,5, от 4 до 4,4 или от 4,1 до 4,3. В определенных вариантах осуществления pH составляет 4,2.

В двенадцатом варианте осуществления для способа седьмого, восьмого, девятого или десятого варианта осуществления третьего аспекта фармацевтическая композиция имеет рН от 5,5 до 6,5, от 5,9 до 6,3 или от 6,0 до 6,2. В определенных вариантах осуществления pH составляет 6,1.

В тринадцатом варианте осуществления для способа седьмого, восьмого или девятого варианта осуществления третьего аспекта фармацевтическая композиция содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата формулы (IIA), 3 мМ метионина, 10 мМ сукцината, 50 мкМ бисульфита натрия 7,2% (масс./об.) трегалозы (или 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы) и 0,01% (масс./об.) полисорбата 20, а рН фармацевтической композиции составляет 4,2.

В четырнадцатом варианте осуществления фармацевтическая композиция, полученная способом по седьмому, восьмому или девятому варианту осуществления третьего аспекта, содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата формулы (IIB), 3 мМ метионина, 20 мМ гистидина, 50 мкМ бисульфита натрия 7,2% (масс./об.) трегалозы (или 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы, 0,02% (масс./об.) полисорбата 20, и pH фармацевтической композиции составляет 6,1.

В некоторых вариантах осуществления для способов, описанных выше, любое подходящее количество антиоксиданта может быть использовано в привидении в контакт CBA и цитотоксического агента или соединения-цитотоксического агента-линкера. В определенных вариантах осуществления может использоваться избыточное количество антиоксиданта относительно CBA. Примерное молярное соотношение антиоксиданта относительно CBA находится в диапазоне от 200:1 до 1,5:1, от 150:1 до 1,5:1, от 100:1 до 1,5:1, от 50:1 до 1,5:1, от 20:1 до 2:1, от 15:1 до 2:1, от 10:1 до 2:1 или от 10:1 до 5:1. В определенном варианте осуществления отношение антиоксиданта к CBA составляет 10:1.

В определенных вариантах осуществления приведение в контакт CBA и цитотоксического агента, или соединения цитотоксического агента-линкера проводят в подходящем растворителе или растворителях. В некоторых вариантах осуществления растворитель(и) включает N,N-диметилацетамид (DMA) и/или пропиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт CBA и цитотоксического агента, или соединения цитотоксического агента-линкера проводят в DMA, пропиленгликоле и водном буферном растворе. Может быть использован любой подходящий водный буфер. Типичные буферы включают, но не ограничиваются ими, фосфатный, цитратный, сукцинатный и гистидиновый буфер.

В определенных вариантах осуществления приведение в контакт CBA и цитотоксического агента, или соединения цитотоксического агента-линкера проводят при подходящей температуре. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт проводят при температуре между от 15 °C до 25 °C, между от 5 °C до 15 °C, между от 20 °C до 25 °C. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт проводят при комнатной температуре.

5. Агенты, связывающие клетки

Агенты, связывающие клетки в иммуноконъюгатах согласно настоящему изобретению могут быть любого типа, известного в настоящее время, или который становится известным, включая пептиды и непептиды. Как правило, это могут быть антитела (такие как поликлональные антитела и моноклональные антитела, особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины (такие как фолат и т.д., которые могут связываться с его рецептором на клеточной поверхности, например, рецептор фолата), молекулы, переносящие питательные вещества (такие как трансферрин), или любая другая связывающая клетки молекула или вещество.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий клетки агент представляет собой антитело, одноцепочечное антитело, фрагмент антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело, фрагмент моноклонального антитела (или «антигенсвязывающую часть»), который специфически связывается с клеткой-мишенью, химерное антитело, фрагмент химерного антитела (или «антигенсвязывающую часть»), который специфически связывается с клеткой-мишенью, доменное антитело (например, sdAb) или фрагмент доменного антитела, которое специфически связывается с клеткой-мишенью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий клетки агент представляет собой гуманизированное антитело, гуманизированное одноцепочечное антитело или фрагмент гуманизированного антитела (или «антигенсвязывающую часть»).

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий клетки агент представляет собой наружное антитело, наружное одноцепочечное антитело или фрагмент наружного антитела (или «антигенсвязывающую часть»).

В определенных вариантах осуществления изобретения, где связывающий клетки агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть (включая производные антитела), CBA может связываться с лигандом на клетке-мишени, таким как лиганд на клеточной поверхности, включая рецепторы клеточной поверхности.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий клетки агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые: (а) связывают эпитоп в пределах аминокислот с 101 по 346 человеческого антигена CD123/IL3-Rα и (b) ингибируют IL3-зависимую пролиферацию в антиген-позитивных клетках TF-1 (см. WO2017/004026, включенную в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте).

В определенных вариантах осуществления изобретения связывающий клетки агент представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в WO2017/004026, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD123- или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать: а) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность области (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6; и b) по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, содержащий три последовательные определяющие комплементарность области (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 имеет полноразмерную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и полноразмерную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:10.
В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий клетки агент представляет собой антитело к CD33 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в патенте США 7342110 и 7557189, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD33- или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать: а) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность области (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15 и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16; и b) по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, содержащий три последовательные определяющие комплементарность области (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD33 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD33 имеет полноразмерную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:18 и полноразмерную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:20.

В определенных вариантах осуществления изобретения антитело к CD33 представляет собой антитело huMy9-6.

В определенных вариантах осуществления изобретения антитело, описанное в данном документе, представляет собой антитело мыши, млекопитающего, не являющегося человеком, химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Например, гуманизированное антитело может представлять собой антитело с привитой CDR или антитело с наружной поверхностью. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab’, F(ab’)₂, F_d, одноцепочечный Fv или scFv, дисульфидносвязанный F_v, домен V-NAR, IgNar, внутритело, IgGΔCH₂, минитело, F(ab’)₃, тетратело, тритело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb₂, (scFv)₂ или scFv-Fc.

6. Иммуноконъюгаты

Иммуноконъюгаты по настоящему изобретению содержат связывающий клетки агент, описанный в данном документе (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), ковалентно связанный с одной или более молекулами цитотоксического агента, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент представляет собой бензодиазепиновое соединение, такое как пирролобензодиазепиновое (PBD) или индолинобензодиазепиновое (IGN) соединение.

Используемый в данном документе термин «бензодиазепиновое» соединение представляет собой соединение, имеющее структуру ядра бензодиазепина. Бензодиазепиновое ядро может быть замещенным или незамещенным и/или конденсированным с одной или более кольцевыми структурами. Он также включает соединение, имеющее два бензодиазепиновых ядра, связанных линкером. Функциональность имина (-C=N-) в составе бензодиазепинового ядра может быть снижена.

Используемое в данном документе соединение «пирролобензодиазепин» (PBD) представляет собой соединение, имеющее структуру ядра пирролобензодиазепина. Пирролобензодиазепин может быть замещенным или незамещенным. Он также включает соединение, имеющее два пирролобензодиазепиновых ядра, связанных линкером. Функциональность имина (-C=N-) в составе индолинобензодиазепинового ядра может быть снижена.

В определенных вариантах осуществления соединение пирролобензодиазепина содержит структуру ядра, представленную , которая может быть необязательно замещенной.

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепиновые соединения содержат структуру ядра, представленную , которая может быть необязательно замещена.

Используемое в данном документе соединение «индолинобензодиазепин» (IGN) представляет собой соединение, имеющее структуру ядра индолинбензодиазепина. Индолинобензодиазепин может быть замещенным или незамещенным. Он также включает соединение, имеющее два индолинобензодиазепиновых ядра, связанных линкером. Функциональность имина (-C=N-) в составе индолинобензодиазепинового ядра может быть снижена.

В некоторых вариантах осуществления соединение индолинбензодиазепина содержит структуру ядра, представленную, которая может быть необязательно замещена.

В некоторых вариантах осуществления соединение индолинбензодиазепина содержит структуру ядра, представленную , которая может быть необязательно замещена.

В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгаты настоящего изобретения содержат связывающий клетки агент (включая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), описанный в данном документе, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом, описанным в данном документе, через тиоловую группу (-SH) одного или более остатков цистеина, расположенных на связывающем клетки агенте (таком как те, что описаны в 1-13-м конкретных вариантах осуществления ниже).

В 1-м конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

(IA),

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где CBA связан с Cy^Cys через тиоловую группу из одного или более остатков цистеина, расположенных на CBA;

W_C равно 1 или 2; и

Cy^Cys представлен следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой –H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R₁ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков;

R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -H, (C₁-C₃)алкил или заряженный заместитель, или ионизируемую группу Q;

m равно целому числу от 1 до 6;

L_C представлен , s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с CBA, и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -C(=O)- группой на Cy^Cys; где:

R₂ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

R₃ и R₄, в каждом случае независимо представляют собой -Н или (C₁-C₃)алкил; и

n равно целому числу от 1 до 10.

Во втором конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) R_a и R_b оба представляют собой Н; и R₁ представляет собой H или Me; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-м конкретном варианте осуществления.

В 3-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) P выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:21), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:22), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:23), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, и Met-Ala; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-м или 2-м конкретном варианте осуществления.

В 4-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) P представляет собой Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-м или 2-м конкретном варианте осуществления.

В 5-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) Q представляет собой –SO₃H; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-ом, 2-ом, 3-ем или 4-ом конкретном варианте осуществления.

В 6-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) Q представляет собой Н; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-ом, 2-ом, 3-ем или 4-ом конкретном варианте осуществления.

В 7-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) R₃ и R₄ оба представляют собой Н; n равно целому числу от 1 до 6; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-том, 5-ом или 6-ом конкретном варианте осуществления.

В 8-ом конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) -L_C - представлен следующей формулой:

;

и остальные переменные являются такими, как описано в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом конкретном варианте осуществления.

В 9-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой солью, причем двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -H, и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -OH или -SO₃H; и остальные переменные являются такими, как описано в 1-ом конкретном варианте осуществления.

В некоторых вариантах осуществления двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -SO₃H.

В 10-м конкретном варианте осуществления изобретения для иммуноконъюгатов согласно 1-9-му конкретному варианту осуществления связывающий клетки агент (CBA) представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который (а) связывает эпитоп в пределах аминокислот от 101 до 346 антигена человеческого CD123/IL3-Rα и (b) ингибирует IL3-зависимую пролиферацию в антиген-позитивных клетках TF-1.

В 11-м конкретном варианте осуществления изобретения для иммуноконъюгатов согласно 1-10-му конкретным вариантам осуществления CBA представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:

а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:4, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:5, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:6; и

b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:2, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3.

В 12-м конкретном варианте осуществления изобретения для иммуноконъюгатов от 1-го до 11-го конкретных вариантов осуществления CBA представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее последовательность V_H SEQ ID NO:7 и последовательность V_L SEQ ID NO:9.

В 13-м конкретном варианте осуществления изобретения для иммуноконъюгатов от 1-го до 11-го конкретных вариантов осуществления CBA представляет собой антитело к CD123, содержащее: а) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8; и b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления изобретения для иммуноконъюгатов, описанных в 11-13 конкретных вариантах осуществления выше, w_C равно 2.

В определенном варианте осуществления изобретения для иммуноконъюгатов, описанных в данном документе (например, иммуноконъюгатов, описанных в 1-13-м конкретных вариантах осуществления, описанных выше), среднее отношение числа молекул цитотоксического агента, представленного Cy^Cys, на молекулу антитела (то есть, среднее значение w_C, также указанное как «DAR») в композиции, содержащей иммуноконъюгаты, находится в диапазоне от 1,5 до 2,1, от 1,6 до 2,1, от 1,7 до 2,1, от 1,8 до 2,1, от 1,5 до 2,0, от 1,6 до 2,0, от 1,7 до 2,0 или от 1,8 до 2,0. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 или 2,1.

В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат согласно настоящему изобретению содержит связывающий клетки агент (включая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), описанный в данном документе, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом, описанным в данном документе, через ε-аминогруппу одного или более остатков лизина, расположенных на связывающем клетки агенте (CBA) (такой как иммуноконъюгаты, описанные в 14-26-м конкретных вариантах осуществления изобретения ниже).

В 14-м конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

(IB),

где:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;

W_L равно целому числу от 1 до 20; и

Cy^Lys1 представлен следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой –H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, и Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R^x независимо представляет собой (C₁-C₆)алкил;

W’ представляет собой -NR^e,

R^e представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n1-R^k;

n1 равно целому числу от 2 до 6;

R^k представляет собой -H или -Me;

Z^s выбран из любой из следующих формул:

(b1); (b2); (b3);

(b4); (b5),

(b6),

(b7); (b8); (b9); и

(b10),

где:

q равно целому числу от 1 до 5; и

M⁺ представляет собой -H⁺ или катион.

В 15-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IB) R^x независимо представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где R^f и R^g каждый независимо представляет собой -H или (C₁-C₄)алкил; и р равно 0, 1, 2 или 3; а остальные переменные описаны в 14-м конкретном варианте осуществления.

В 16-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IB) R^f и R^g являются одинаковыми или разными, и выбраны из -H и -Me; и остальные переменные являются такими, как описано в 15-ом конкретном варианте осуществления.

В 17-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IB) иммуноконъюгат представлен:

или его фармацевтически приемлемой солью, где W_L равно целому числу от 1 до 10; двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -H; и когда он представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой –OH, или -SO₃H; а остальные переменные описаны в 14-м конкретном варианте осуществления.

В некоторых вариантах осуществления двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -SO₃H.

В 18-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IB) иммуноконъюгат представлен:

или его фармацевтически приемлемой солью, причем переменные описаны в 13-м конкретном варианте осуществления.

В 19-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгатов 14-18-ого конкретных вариантов осуществления CBA представляет собой антитело к CD33, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:20.

В 20-м конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

(IC),

где:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где CBA связан с Cy^Lys1 через ε-аминогруппу одного или более остатков лизина, расположенных на CBA;

W_L равно целому числу от 1 до 20; и

Cy^Lys1 представлен следующей формулой:

,

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой –H, или (C₁-C₄)алкил; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защитную группу аминогруппы, Y представляет собой -OH или -SO₃H;

R₁ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков;

R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -H, (C₁-C₃)алкил или заряженный заместитель, или ионизируемую группу Q;

m равно целому числу от 1 до 6.

В 21-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IC) R_a и R_b оба представляют собой Н; и R₁ представляет собой H или Me; и остальные переменные являются такими, как описано в 20-м конкретном варианте осуществления.

В 22-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IC) P выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:21), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:22), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:23), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, и Met-Ala; и остальные переменные являются такими, как описано в 20-м или 21-м конкретном варианте осуществления.

В 23-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IC) P представляет собой Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala; и остальные переменные являются такими, как описано в 20-м или 21-м конкретном варианте осуществления.

В 24-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IC) Q представляет собой –SO₃H; и остальные переменные являются такими, как описано в 20-м, 21-м, 22-м или 23-м конкретном варианте осуществления.

В 25-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IA) Q представляет собой Н; и остальные переменные являются такими, как описано в 20-м, 21-м, 22-м или 23-м конкретном варианте осуществления.

В 26-м конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгата формулы (IC) иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

(IIC);

или его фармацевтически приемлемой солью, причем двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -H, и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -OH или -SO₃H; и остальные переменные являются такими, как описано в 20-м конкретном варианте осуществления.

В некоторых вариантах осуществления двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -SO₃H. В определенных вариантах осуществления изобретения CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления изобретения для иммуноконъюгатов, описанных в данном документе (например, иммуноконъюгатов, описанных в 14-26-м конкретных вариантах осуществления, описанных выше), среднее отношение числа молекул цитотоксического агента, представляющего собой Cy^Lys1 или Cy^Lys2, на молекулу антитела (т.е. среднее значение w_L) в композиции (также называемое «DAR»), содержащей иммуноконъюгаты, находится в диапазоне от 1,0 до 5,0, от 1,5 до 4,0, от 2,0 до 3,5 или от 2,5 до 3,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения, DAR равно 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения, DAR равно 2,8 или 2,7.

В одном варианте осуществления значение DAR для иммуноконъюгата, описанного в 19-м конкретном варианте, находится в диапазоне от 2,4 до 3,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения, DAR равно 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В другом варианте осуществления значение DAR составляет 2,8.

7. Способы использования

Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть введены любым количеством способов для местного или системного лечения. Введение может быть местным (например, на слизистые оболочки, включая вагинальную и ректальную доставку), таким как трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки; легочным (например, путем вдыхания или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе посредством небулайзера; интратрахеально, интраназально, эпидермально и трансдермально); пероральным; или парентеральным, включая внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию, или инфузию; или внутричерепным (например, интратекальное или интравентрикулярное) введение. В некоторых конкретных вариантах осуществления введение является внутривенным. Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, также могут быть использованы in vitro или ex vivo.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может использоваться со вторым соединением, таким как соединение, о котором известно, что оно эффективно для лечения интересующего заболевания или расстройства, в качестве комбинированной терапии. В некоторых вариантах осуществления второе соединение представляет собой противораковое средство. В некоторых вариантах осуществления способы охватывают введение второго соединения и фармацевтической композиции по настоящему изобретению, что приводит к лучшей эффективности по сравнению с введением одной фармацевтической композиции. Второе соединение может быть введено любым количеством способов, включая, например, местное, легочное, пероральное, парентеральное или внутричерепное введение. В некоторых вариантах осуществления введение является пероральным. В некоторых вариантах осуществления введение является внутривенным. В некоторых вариантах осуществления введение является как пероральным, так и внутривенным.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно комбинировать в составе фармацевтической комбинированной композиции или схемы дозирования в качестве комбинированной терапии с анальгетиком или другими лекарственными средствами.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть объединена в виде фармацевтической комбинированной композиции или схемы дозирования в качестве комбинированной терапии со вторым соединением, обладающим противораковыми свойствами. Второе соединение фармацевтической комбинированной композиции или схемы дозирования может оказывать комплементарную активность по отношению к ADC комбинации, так что они не оказывают неблагоприятного влияния друг на друга.

Настоящее изобретение включает способ ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего (например, человека), включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по настоящему изобретению, отдельно или в сочетании со вторым терапевтическим средством.

В определенных вариантах осуществления аномальный клеточный рост или пролиферативное расстройство у млекопитающего представляет собой рак, включая гематологический рак, лейкоз или лимфому. В некоторых вариантах осуществления пролиферативное расстройство представляет собой рак лимфатического органа или гематологическое злокачественное образование.

Например, рак может быть выбран из группы, состоящей из: острой миелоидной лейкемии (AML, включая CD33 с низким уровнем AML, P-гликопротеин-положительную AML, рецидивирующую AML или рефрактерную AML), хронического миелогенного лейкоза (CML), включая бластный криз CML и онкоген Абельсона, связанных с CML (транслокация Bcr-ABL), миелодиспластического синдрома (MDS), острого лимфобластного лейкоза (ALL), включая, но не ограничиваются перечисленными острый B-лимфобластный лейкоз или B-клеточный острый лимфобластный лейкоз (B-ALL ), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), включая синдром Рихтера или трансформацию CLL Рихтера, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), B-клеточное хроническое лимфопролиферативное заболевание (B-CLPD), атипичный хронический лимфобластный лейкоз (предпочтительно с выраженной экспрессией CD11c), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), бластное плазмацитоидное дендритное клеточное новообразование (BPDCN), неходжкинские лимфомы (NHL), включая лейкемию мантийных клеток (MCL) и малую лимфоцитарную лимфому (SLL), лимфому Ходжкинса, системный мастоцитоз и лимфому Беркитта.

В некоторых вариантах осуществления изобретения B-ALL представляет собой CD19-положительный B-ALL. В некоторых других вариантах осуществления изобретения B-ALL представляет собой CD19-отрицательный B-ALL.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рак имеет по меньшей мере один негативный прогностический фактор, например, сверхэкспрессию P-гликопротеина, сверхэкспрессию EVI1, изменение p53, мутацию DNMT3A, дублирование внутреннего тандема FLT3.

Методы лечения рака и их дозировки, пути введения и рекомендуемое применение известны в данной области техники и описаны в такой литературе, как Physician's Desk Reference (PDR). PDR раскрывает дозировки агентов, которые были использованы при лечении различных видов рака. Режим дозирования и дозы этих вышеупомянутых химиотерапевтических лекарственных средств, которые являются терапевтически эффективными, будут зависеть от конкретного рака, подлежащего лечению, степени заболевания и других факторов, известных врачу в данной области техники, и могут быть определены врачом. Содержание PDR прямо включено в настоящий документ в качестве ссылки. Специалист в данной области техники может проанализировать PDR, используя один или более из следующих параметров, для определения режима дозирования и доз химиотерапевтических агентов и конъюгатов, которые можно использовать в соответствии с положениями настоящего изобретения. Эти параметры включают: Комплексный индекс; Производитель; Продукты (по названию компании или торговой марки); Указатель категории; Общий/химический индекс (не являющиеся товарными знаками названия лекарственных средств); Цветные изображения лекарств; Информация о продукте, соответствующая маркировке FDA; Химическая информация; Функция/действие; Показания и противопоказания; Пробные исследования, побочные эффекты, предупреждения.

Примеры использования in vitro включают лечение аутологичного костного мозга до его трансплантации одному и тому же пациенту с целью уничтожения больных или злокачественных клеток: лечение клеток костного мозга до их трансплантации с целью уничтожения компетентных Т-клеток и предотвращения болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD); обработки клеточных культур для уничтожения всех клеток, за исключением желаемых вариантов, которые не экспрессируют целевой антиген; или убить варианты, которые экспрессируют нежелательный антиген.

Условия неклинического применения in vitro легко определяются специалистом в данной области техники.

Примерами клинического использования ex vivo являются удаление опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга перед аутологичной трансплантацией при лечении рака или лечении аутоиммунного заболевания, или удаление Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологичного или аллогенного костного мозга, или ткани до пересадки с целью предотвращения GVHD. Лечение может проводиться следующим образом. Костный мозг отбирают у пациента или другого человека, и затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, к которой добавляют фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, с концентрациями для иммуноконъюгатов в диапазоне от около 10 мкМ до около 1 пМ, в течение от около 30 минут до около 48 ч, при около 37 °С. Точные условия концентрации и время инкубации, то есть доза, легко определяются специалистом в данной области техники. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают пациенту внутривенно в соответствии с известными способами. В тех случаях, когда пациент получает другое лечение, такое как курс аблятивной химиотерапии или облучение всего тела между временем сбора костного мозга и реинфузией обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте с использованием стандартного медицинского оборудования.

Для клинического применения in vivo цитотоксические соединения или конъюгаты согласно настоящему изобретению будут поставляться в виде раствора или лиофилизированного порошка, которые проверяются на стерильность и уровни эндотоксина.

Способ согласно настоящему изобретению для индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, для ингибирования роста клеток и/или для лечения рака может быть осуществлен in vitro, in vivo или ex vivo.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Добавление антиоксидантов на основе метионина в реакции конъюгации IMGN632

Антитело G4723A, несущее два сконструированных остатка цистеина (в положении C442 в области CH3 тяжелой цепи) в восстановленном состоянии, получали полным восстановлением и повторным окислением межцепочечных дисульфидных связей известными способами. К раствору этого промежуточного соединения в 50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида натрия, рН 6,0, добавляли 10 молярных эквивалентов N-ацетилметионина, N,N-диметилацетамида (DMA), пропиленгликоля и 10 молярных эквивалентов sDGN549-C, чтобы получить реакционную смесь с конечным составом растворителя 2% об/об DMA и 38% об./об. пропиленгликоля в 50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида натрия, рН 6,0. Реакции позволяли протекать в течение ночи при 25 °С.

Конъюгат очищали в 10 мМ сукцинате, 8% дигидрате трегалозы, 1 мМ метионина, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфера для приготовления бисульфита натрия pH 4,2 с использованием обессоливающих колонок Sephadex G25, концентрированных ультрафильтрацией через регенерированную целлюлозную мембрану с молекулярной массой 10 кД, отсекают массу и фильтруют через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Конъюгат подвергали диализу против того же самого буфера для состава с использованием диализной кассеты с отсечением по молекулярной массе 10 кДа и снова фильтровали через шприцевой фильтр 0,22 мкм.

Обнаружено, что очищенный конъюгат имеет концентрацию в среднем 2 моль sDGN549/моль антитела согласно UV-Vis; 97,7 % мономера согласно SEC; и 0,7 % неконъюгированного DGN549 согласно тандему SEC-C18 RPLC. Как видно из Таблицы 1, добавки метионина не влияют на выход конъюгации или качество конъюгата по сравнению с реакцией конъюгации без добавок. Кроме того, включение метиониновых добавок в реакцию и метионина в рецептуру, по-видимому, снижает процент окисления Met256 (абсолютная нумерация или Met252 в нумерации EU).

Связанное с лизином конъюгирование антитела с цитотоксическим агентом следует аналогичным условиям реакции, за исключением 10 молярных эквивалентов метилового эфира N-ацетилметионина и 5 молярных эквивалентов DGN549-L (предварительно обработанных 5-кратным избытком бисульфита натрия в 95:5 смеси DMA и 50 мМ сукцината, рН 5,5 в течение 4 ч при 25 °С).

Таблица 1. Конъюгация IMGN632 +/- N-ацетилметионин в реакции и

+/- метионин в составе

Тестируемый продукт	N-ацетилметионин в реакции	Метионин в составе	Хранение	Окисление Met253 (%)
IMGN632	0	0	-80 оС немедленно	10
IMGN632	10 экв	1 мМ	-80 оС немедленно	4
IMGN632	0	0	4 оС в течение ~ 1 месяца	18
IMGN632	10 экв	1 мМ	4 оС в течение ~ 1 месяца	4
G4723A	Нет данных	0	4 оС в течение ~ 1 месяца	3

Пример 2. Исследование окисления и фотостабильности метионина IMGN632

Для дальнейшего изучения причины высоких уровней окисления метионина, наблюдаемых в образцах IMGN632, и для определения методов снижения уровней окисления метионина были проведены три эксперимента: 1) исследование оттаивания и стабильности, 2) исследование метионина и 3) экспериментальное исследование с использованием белого света.

В исследовании 1 было оценено возможное влияние типов флаконов для хранения на уровни окисления, было определено использование наложения азота для снижения уровней окисления, было оценено влияние температуры на окисление, было оценено воздействие различных длин волн света и влияние циклов замораживания-оттаивания. Как видно из Таблицы 2, первоначальные экспериментальные тенденции показывают, что не наблюдалось явного значительного влияния типов флаконов на уровни окисления метионина. Азотное покрытие может быть защитным, но результаты этих экспериментов не были убедительными. Также не было значительного влияния температуры на окисление метионина. В Таблице 3 приведены результаты воздействия ультрафиолета и настольного освещения на уровни окисления метионина. Воздействие света на столешницу или ультрафиолетовое излучение вызывает высокий уровень окисления метионина через 6 ч. Эти результаты свидетельствуют о том, что защита от света путем упаковки флаконов в алюминиевую фольгу может быть эффективным способом предотвращения уровня окисления с течением времени. Таблица 4 показывает, что воздействие света во время замораживания-оттаивания (2 ч на цикл) вызывает окисление, но само замораживание-оттаивание с защитой от света не оказывает существенного влияния на окисление метионина.

Таблица 2. Тип флакона и наложение азота

	Тип виалы	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло	Пластиковые пробирки
	Температура	-80°С	-80°С	25°С	25°С	25°С	25°С
	Наложение азота	Нет	Нет	Нет	Нет	Да	Нет
Анализ	Параметры	Нулевое время	1 неделя	1 неделя	1 неделя	1 неделя	1 неделя
Окисление метионина СВЭЖХ-УФ	Окисление (%)	12	12	16	17	13	20
Связывание FcRn	Относительная эффективность (%)	91	115	103	123	126	126

Таблица 3. УФ и настольное освещение

	Тип виалы	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло
	Температура	-80°С	Комнатная	Комнатная	Комнатная	Комнатная	Комнатная	Комнатная
	Воздействие светом	Нет данных	Рабочий стол	Рабочий стол	Рабочий стол	УФ (BSC)	УФ (BSC	УФ (BSC)
Анализ	Параметры	Нет данных	Нет (покрыты)	6 ч	24 ч	Нет (покрыты)	6 ч	24 ч
Окисление метионина СВЭЖХ-УФ	Окисление (%)	15	15	68	76	17	64	76
Связывание FcRn	Относительная эффективность (%)	117	124	93	90	126	103	93

Таблица 4. Результаты цикла замерзание-оттаивание

	Тип виалы	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло	Стекло
	Защита от света	Нет	Нет	Нет	Да	Да
Анализ	Параметры	-80°С (контроль)	3FT	5FT	-80°С (контроль)	5FT
Окисление метионина	Окисление (%)	12	25	37	11	12
Связывание FcRn	Относительная эффективность (%)	115	103	108	NT	NT

В исследовании 2, пики различных концентраций метионина в составе IMGN632 и одного антитела (G4723A) и его влияние на окисление были протестированы при комнатной температуре с 6-вым воздействием ультрафиолета. Как видно из Таблицы 5, выброс метионина в концентрации 1-3 мМ в буфере состава может предотвратить окисление метионина в составе иммуноконъюгата. Неожиданно было обнаружено, что одно антитело G4723A, разведенное в буфере иммуноконъюгатной композиции и подвергшееся воздействию света, не подвергалось окислению, что указывает на то, что окисление метионина в антителе связано с процессом конъюгации или наличием полезной нагрузки, когда антитело присутствует в растворе в качестве иммуноконъюгата.

Таблица 5. Проникновение метионина и контроль антител

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Стекло

Материал

IMGN632

IMGN632

IMGN632

IMGN632

IMGN632

IMGN632

IMGN632

IMGN632

IMGN632

G4723A

G4723A

Температура

-80°C

кт

кт

кт

кт

кт

кт

кт

кт

кт

кт

Воздействие светом

Нет

Нет

BSC (УФ) – 6 ч

BSC (УФ) – 6 ч

BSC (УФ) – 6 ч

BSC (УФ) – 6 ч

BSC (УФ) – 6 ч

BSC (УФ) – 6 ч

BSC (УФ) – 6 ч

Нет

BSC (УФ) – 6 ч

Анализ

Параметры

контроль

Без добавок

Без добавок

0 мМ

0.1 мМ

0.5 мМ

1 мМ

2 мМ

3.5 мМ

2 мг/мл G Ат в исходном коньюгате FB (без Met)

Окисление метионина

Окисление (%)

13

15

63

64

32

16

13

12

12

8

9

В исследовании 3 образцы иммуноконъюгатов подвергали воздействию 4 kLux белого света при 25 °C в течение 72 ч с 0 мМ, 1 мМ или 3 мМ метионина в составе. Был измерен процент окисления метионина, процент мономера, процент высокой молекулярной массы, концентрация свободного лекарственного средства и DAR.

На Фиг.1 показано, что добавление по меньшей мере 1 мМ метионина в композицию может снизить уровни окисления метионина с течением времени, когда раствор подвергается воздействию света. Эти результаты также подтверждают добавление метионина (от 1 до 3 мМ метионина) в состав иммуноконъюгатов, содержащих ДНК-алкилирующие полезные нагрузки, такие как DGN549. На Фигурах 2 и 3 показано, что воздействие света с течением времени приводит к незначительному снижению процента мономера в присутствии или отсутствии метионина в композиции и увеличению процента высокомолекулярных частиц в присутствии или отсутствии метионина в композиции. На Фигуре 4 показано, что воздействие света вызывает ухудшение полезной нагрузки (DGN549), что приводит к увеличению количества свободного лекарства. Однако, как видно из Таблицы 6, воздействие света на концентрацию/DAR минимально или отсутствует.

Таблица 6. Концентрация (мг/мл) и результаты DAR

Время (ч)	Контроль Темнота	Контроль Темнота	Без Метионина	Без Метионина	3 мМ Метионина	3 мМ Метионина
	Конц.	DAR	Конц.	DAR	Конц.	DAR
0	2,06	1,88	2,06	1,88	2,06	1,88
4	2,08	1,88	1,95	1,99	1,96	1,9
24	2,03	1,88	2,06	2,01	1,98	1,93
72	2,06	1,89	2,21	1,97	2,05	1,88

Пример 3. Мониторинг окисления метионина в иммуноконъюгатах с помощью УФ-детекции

Был разработан аналитический метод мониторинга окисления метионина антитела G4723A, несущего два сконструированных остатка цистеина (в положении 442 в области СН3 тяжелой цепи), с помощью УФ-детекции. Условия для картирования пептидов на платформе с помощью метода масс-спектрометрического обнаружения были оптимизированы для замены стадии масс-спектрометрического обнаружения УФ-детектированием. Как видно на Фиг. 5А и 5В, окисленные и нативные триптические пептиды, в принципе, могут быть идентифицированы с использованием масс-спектрометрии, а также методов УФ-обнаружения, поэтому оптимизация платформенного метода позволит взаимозаменяемо использовать УФ-детектирование для мониторинга окисления метионина. Оптимизированные условия для платформенного метода состояли из следующих шагов:

• Денатурация образца с использованием 4,5 М гуанидина HCl, 1,2 М Трис, 10 мМ ЭДТА, 7 мМ DTT, pH 7,8 в течение 10-15 минут при 70 ºC.

• Алкилирование образца с использованием 7 мкл 1М индол-3-уксусной кислоты (IAA) в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре без гашения DTT

• Замена буфера с очищающей колонной Illustra NAP-5 с загрузкой полного реакционного объема (507 мкл), промывкой 400 мкл и элюированием 300 мкл в 50 мМ Трис, 10 мМ хлорида кальция, 5 мМ метионина, рН 8,0

• Расщепление трипсином с соотношением трипсин:антитело 1:33 в течение 1 ч при 37 ºC, закалка образца ТФК и перенос во флаконы для ВЭЖХ

• Анализ образцов на СВЭЖХ с УФ-обнаружением

Используя вышеописанные стадии, окисление метионина можно успешно количественно определить с помощью СВЭЖХ-УФ-обнаружения с аналогичными результатами в диапазоне окисления, представляющем интерес для метода масс-спектрометрического обнаружения с картированием пептидов. В частности, стадии картирования пептидов были оптимизированы применительно к подготовке образца и времени прогона образца (то есть, более короткого периода подготовки и времени прогона). Кроме того, чувствительность стадий УФ-обнаружения была улучшена за счет оптимизации объема элюирования/сбора буферного обмена (то есть более концентрированного собранного образца) и увеличения объема впрыскиваемого образца (то есть между 10-50 мкл объема для инъекции).

Пример 4. Исследования фотостабильности IMGN632 и IMGN779

Образцы иммуноконъюгатов IMGN 632 и IMGN779 с метионином или без него подвергали воздействию ~ 1000 люкс белого света при комнатной температуре в течение продолжительного времени. Процент окисления метиона при Met252 измеряли спустя некоторое время. Тестировали фотостабильность следующих образцов иммуноконъюгатов:

(1) IMGN779 без метионина: 2 мг/мл IMGN779, 20 мМ гистидина, 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы (также называемый 7,2 % масс./об. трегалозы), 0,02 % (масс./об.) полисорбата 20 и 50 мкМ бисульфита натрия, рН 6,1

(2) IMGN779 с метионином: 2 мг/мл IMGN779, 20 мМ гистидина, 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы (также называемый 7,2 % масс./об. трегалозы), 0,02 % (масс./об.) полисорбата 20, 50 мкМ бисульфита натрия и 3 мМ метионина, рН 6,1.

(3) IMGN632 без метионина: 2 мг/мл IMGN632, 10 мМ сукцината, 50 мкМ бисульфита натрия, 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы (также называемый 7,2 % (масс./об.) трегалозы) и 0,01 % (масс./об.) полисорбата 20 рН 4,2.

(4) IMGN632 с метионином: 2 мг/мл IMGN632, 10 мМ сукцината, 50 мкМ бисульфита натрия, 8,0% (масс./об.) дигидрата трегалозы (также называемый 7,2 % (масс./об.) трегалозы), 0,01 % (масс./об.) полисорбата 20 и 3 мМ метионина, рН 4,2.

Как показано на Фиг. 6, когда состав IMGN779 (без 3 мМ метионина) подвергается воздействию ~1000 люкс белого света при комнатной температуре, окисление остатка Met252 увеличивается с 18 до 74% в течение 7 дней. В аналогичных условиях небольшое или полное отсутствие окисления метионина наблюдалось для композиции IMGN779, содержащей 3 мМ метионина. Аналогичные результаты наблюдались для иммуноконъюгатов IMGN632.

Claims (26)

1. Фармацевтическая композиция для ингибирования аномального клеточного роста, содержащая от 1,5 мг/мл до 2,5 мг/мл иммуноконъюгата, от 1 мМ до 4 мМ метионина, от 40 мкМ до 60 мкМ бисульфита натрия, 5-10% (масс./об.) трегалозы и от 10 мМ до 20 мМ сукцината, и имеющая pH от 4,0 до 4,4, причем иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где

Y представляет собой -SO₃H или его натриевую соль;

CBA представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:

а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6; и

b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3;

W_C равно 2;

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность V_H SEQ ID NO: 7 и последовательность V_L SEQ ID NO: 9.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой антитело содержит:

a) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8; и

b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция содержит 3,0 мМ метионина.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой при условии, когда фармацевтическая композиция подвергается воздействию света при комнатной температуре в течение 6 ч или более, иммуноконъюгат характеризуется менее чем 40%, менее 35%, 30%, менее 25%, менее 20% или менее 15% окислением метионина.

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция находится в контейнере, который защищает фармацевтическую композицию от воздействия света.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция содержит 50 мкМ бисульфита натрия.

8. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой при условии, когда фармацевтическая композиция подвергается воздействию света при комнатной температуре в течение 6 ч, иммуноконъюгат имеет менее 15% окисления метионина.

9. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция содержит 2 мг/мл иммуноконъюгата.

10. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция содержит 10 мМ сукцината.

11. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция содержит 7,2% (масс./об.) трегалозы.

12. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция дополнительно содержит полисорбат 20.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, в которой концентрация полисорбата 20 в фармацевтической композиции находится в диапазоне 0,01-0,1% (масс./об.).

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, в которой концентрация полисорбата 20 в фармацевтической композиции находится в диапазоне 0,01-0,05% (масс./об.).

15. Фармацевтическая композиция по п. 13, в которой концентрация полисорбата 20 в фармацевтической композиции находится в диапазоне 0,01-0,03% (масс./об.).

16. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция имеет рН 4,2.

17. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой фармацевтическая композиция содержит 10 мМ сукцината, 50 мкМ бисульфита натрия, 7,2% (масс./об.) трегалозы, 0,01% (масс./об.) полисорбата 20, и pH фармацевтической композиции составляет 4,2.