RU2803069C1 - Kit of specific oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the canine morbillivirus (canine distemper virus, cdv) nucleocapsid protein (n) gene fragment for the detection of canine distemper (carré disease, distemper) in dogs - real-time pcr test system - Google Patents

Kit of specific oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the canine morbillivirus (canine distemper virus, cdv) nucleocapsid protein (n) gene fragment for the detection of canine distemper (carré disease, distemper) in dogs - real-time pcr test system Download PDF

Info

Publication number
RU2803069C1
RU2803069C1 RU2022132324A RU2022132324A RU2803069C1 RU 2803069 C1 RU2803069 C1 RU 2803069C1 RU 2022132324 A RU2022132324 A RU 2022132324A RU 2022132324 A RU2022132324 A RU 2022132324A RU 2803069 C1 RU2803069 C1 RU 2803069C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
canine
cdv
distemper
canine distemper
dogs
Prior art date
Application number
RU2022132324A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Евгеньевич Гришечкин
Иван Григорьевич Каменский
Original Assignee
Исаев Сергей Александрович
Filing date
Publication date
Application filed by Исаев Сергей Александрович filed Critical Исаев Сергей Александрович
Application granted granted Critical
Publication of RU2803069C1 publication Critical patent/RU2803069C1/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: set of specific oligodeoxyribonucleotide primers VT-CDV-F 5`-TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA-3` and VT-CDV-R 5`-TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC-3`, and a fluorescently labeled probe VT-CDV-P 5`-(R6G)-CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC-(BHQ2)-3` to a gene fragment encoding the Canine Distemper nucleocapsid N protein for the detection of Canine Distemper virus in dogs.
EFFECT: kit allows to carry out real-time identification of RNA, cDNA encoding the Canine Distemper virus nucleocapsid N protein, which has a higher homology to the currently circulating strains of Canine morbillivirus, which increases the reliability and reliability of the analyzes.
1 cl, 3 dwg, 3 tbl

Description

Область техники, к которой относится изобретение: Field of technology to which the invention relates:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент консервативной области гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) – возбудителя Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак, что позволяет выявлять животных, инфицированных Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Чума плотоядных, болезнь Карре, чумка) у собак на любых стадиях заболевания.The invention relates to the field of biotechnology and concerns a set of highly specific primers and a fluorescently labeled probe for detecting genetic material (RNA, cDNA) of a fragment of the nucleocapsid protein (N) gene Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) for detection of Canine distemper (Carré disease, distemper) in dogs. The presented set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled DNA probe contains a pair of oligonucleotides that have the activity of forward and reverse primers in the polymerase chain reaction, as well as one fluorescently labeled DNA probe. The presented invention allows for more reliable and reliable detection of genetic material (RNA, cDNA) of the Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) nucleocapsid protein (N) gene fragment for the detection of Canine distemper (Carré disease, distemper) in dogs and can be used in veterinary medicine . The method makes it possible to detect a fragment of the conserved region of the nucleocapsid protein (N) gene of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) – the causative agent of Canine Distemper (Carré disease, distemper) in dogs, which makes it possible to identify animals infected with Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) ( Canine distemper, Carré's disease, distemper) in dogs at any stage of the disease.

Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Чума плотоядных, болезнь Карре, чумка), в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Чума плотоядных, болезнь Карре, чумка), и может быть использовано в ветеринарии.The invention relates to sets of primers for identifying genetic material (RNA, cDNA) of a fragment of the nucleocapsid protein (N) gene Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Canine distemper, Carré disease, distemper), in clinical samples, sectional samples, cultural fluids and other biological products for the purpose of diagnosis, correction of treatment, epidemiological investigation, as well as for solving research problems of the properties of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Canine distemper, Carré disease, distemper), and can be used in veterinary medicine.

Чума собак (чума плотоядных, болезнь Карре, чумка) - острая или подострая контагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек, поражениями кожи, центральной нервной системы или сочетанием этих признаков.Canine distemper (canine distemper, Carré's disease, distemper) is an acute or subacute contagious viral disease manifested by fever, catarrhal inflammation of the mucous membranes, skin lesions, central nervous system, or a combination of these symptoms.

Чума известна со времён одомашнивания собак. Распространена повсеместно. В Российской империи появилась в 1762 году в Крыму и получила название «крымской болезни». Вирусную природу чумы собак в 1905 году впервые доказал учёный Карре.Plague has been known since the domestication of dogs. Distributed everywhere. In the Russian Empire it appeared in 1762 in Crimea and was called the “Crimean disease”. The viral nature of canine distemper was first proven by the scientist Carré in 1905.

Возбудителем болезни является вирус Canine Distemper, который также называется Canine Morbillivirus. Этот вирус принадлежит семейству парамиксовирусы. Заражение чумой происходит через дыхательные пути и пищеварительный аппарат. Попав в организм, вирус чумы попадает в кровь и ткани. Способствуют и предрасполагают к заболеванию чумой простуда, неполноценное кормление, недостаток витаминов в корме, плохие условия содержания собак. В окружающую среду вирус выделяется с истечениями из глаз, носа и рта, с калом, мочой, отмершим эпителием кожи. Основной источник заражения - больные животные, предметы ухода, кормушки, инвентарь, помещения и подстилка, где содержались больные животные, а также механические переносчики - человек, транспортные средства.The causative agent of the disease is the Canine Distemper virus, also called Canine Morbillivirus. This virus belongs to the Paramyxovirus family. Plague infection occurs through the respiratory tract and digestive system. Once in the body, the plague virus enters the blood and tissues. Colds, inadequate feeding, lack of vitamins in food, and poor living conditions for dogs contribute and predispose them to the disease. The virus is released into the environment through discharge from the eyes, nose and mouth, feces, urine, and dead skin epithelium. The main source of infection is sick animals, care items, feeders, equipment, premises and bedding where sick animals were kept, as well as mechanical carriers - humans, vehicles.

К чуме восприимчивы домашние собаки и дикие собакообразные, а среди кошкообразных - некоторые представители кошачьих и виверровых. В Восточной Африке домашние или одичавшие собаки передают вирус чумы львам, пятнистым гиенам и гиеновидным собакам, что приводит к высокой смертности среди этих диких видов.Domestic dogs and wild canines are susceptible to plague, and among felines - some representatives of felids and viverrids. In East Africa, domestic or feral dogs transmit distemper virus to lions, spotted hyenas and wild dogs, resulting in high mortality rates in these wild species.

От момента заражения до появления первых признаков происходит скрытый период болезни, который продолжается от трех до 21-го дня. В этот период болезни собака кажется здоровой, но может заражать других собак. Начало заболевания определить трудно. Первые признаки: небольшое угнетение, вялость, легкая утомляемость, взъерошенная шерсть, уменьшение аппетита, иногда рвота, частичный отказ от работы, покраснение слизистых оболочек глаз, носа, рта, незначительное прозрачное истечение из носа и глаз, появление небольшого поноса. Эти признаки выражены у одних собак сильнее, у других слабее. В самом начале заболевания температура повышенная (39,5 - 40), держится 2-3 дня, а затем снижается до нормальной. У наиболее крепких собак на этом заканчивается течение болезни и наступает выздоровление. У слабых - повышается температура и ухудшается самочувствие. В разгаре болезни или при начавшемся улучшении появляются поражения нервной системы. К симптомам также относятся периодические судороги у собак.From the moment of infection to the appearance of the first signs, a latent period of illness occurs, which lasts from three to 21 days. During this period of illness, the dog appears healthy, but can infect other dogs. The onset of the disease is difficult to determine. The first signs: slight depression, lethargy, easy fatigue, tousled hair, decreased appetite, sometimes vomiting, partial refusal to work, redness of the mucous membranes of the eyes, nose, mouth, slight transparent discharge from the nose and eyes, the appearance of slight diarrhea. These signs are more pronounced in some dogs, less so in others. At the very beginning of the disease, the temperature is elevated (39.5 - 40), lasts 2-3 days, and then drops to normal. In the strongest dogs, this ends the course of the disease and recovery begins. In the weak, the temperature rises and their health worsens. At the height of the disease or when improvement begins, lesions of the nervous system appear. Symptoms also include intermittent seizures in dogs.

Чума плотоядных может протекать молниеносно, сверхостро, остро, подостро, абортивно, типично и атипично. По клиническим признакам различают катаральную, легочную, кишечную, кожную, нервную и смешанную (генерализованную) формы болезни. Развитие той или иной формы чумы определяется реактивностью организма животного. Один и тот же штамм возбудителя может вызывать у собак разнотипные клинические признаки.Carnivore plague can occur at lightning speed, hyperacute, acute, subacute, abortive, typical and atypical. According to clinical signs, catarrhal, pulmonary, intestinal, skin, nervous and mixed (generalized) forms of the disease are distinguished. The development of one form or another of plague is determined by the reactivity of the animal’s body. The same pathogen strain can cause different types of clinical signs in dogs.

Чаще заболевание протекает с патологией в различных тканях, так как вирус чумы плотоядных является пантропным вирусом, то есть поражает клетки всех систем организма. Поэтому разделение на различные формы болезни весьма условно.More often, the disease occurs with pathology in various tissues, since the canine distemper virus is a pantropic virus, that is, it affects cells of all body systems. Therefore, the division into various forms of the disease is very arbitrary.

Летальность среди щенков до 3-месячного возраста составляет 30-100 %.Mortality among puppies up to 3 months of age is 30-100%.

Вирус чумы, проникнув в организм, вначале попадает в кровяное русло, обусловливает появление лихорадки и угнетённое состояние. С кровью вирус разносится во внутренние органы, центральную нервную систему, вызывая в последних воспалительные и дегенеративные изменения. В дальнейшем развивается катаральное воспаление слизистых оболочек, вследствие чего в организм может проникнуть различная микрофлора и вызвать тяжёлые осложненияThe plague virus, having penetrated the body, first enters the bloodstream, causing the appearance of fever and a depressed state. The virus spreads through the blood to the internal organs and central nervous system, causing inflammatory and degenerative changes in the latter. Subsequently, catarrhal inflammation of the mucous membranes develops, as a result of which various microflora can penetrate into the body and cause serious complications.

Для лабораторной диагностики чумы плотоядных, в частности для обнаружения (индикации) возбудителя и его идентификации (определение видовой принадлежности) применяют следующие методы:For laboratory diagnosis of canine distemper, in particular for detection (indication) of the pathogen and its identification (determination of species), the following methods are used:

метод флуоресцирующих антител прямой (МФА) - для установления раннего прижизненного диагноза, материалом служат мазки-отпечатки; в основе люминесцентная микроскопия соединений антигена, с меченным антителом. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.direct fluorescent antibody (DFA) method - to establish an early intravital diagnosis, the material is fingerprint smears; It is based on fluorescent microscopy of antigen compounds with a labeled antibody. When studying recently vaccinated people, false positive results are possible.

иммуноферментный анализ (ИФА) - для установления раннего прижизненного диагноза; разработаны промышленные диагностикумы на полистироловых пластинах для выявления специфического антигена вируса; материал - пробы крови, смывы из глаз и глотки. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) - to establish an early lifetime diagnosis; industrial diagnostic kits on polystyrene plates have been developed to detect the specific antigen of the virus; material - blood samples, swabs from the eyes and throat. When studying recently vaccinated people, false positive results are possible.

реакция нейтрализации (РН) - для идентификации вируса в культуре клеток;neutralization reaction (RN) - to identify the virus in cell culture;

реакция диффузной преципитации (РДП) - позволяет обнаруживать возбудитель на 3-4-й день болезни;diffuse precipitation reaction (DPR) - allows you to detect the pathogen on the 3-4th day of illness;

реакция связывания комплемента (РСК) - для обнаружения антигена в органах и тканях больных животных и в культуре клеток;complement fixation reaction (FFR) - for detecting antigen in organs and tissues of sick animals and in cell culture;

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) - для выявления специфических антител к возбудителю;indirect hemagglutination reaction (IRHA) - to identify specific antibodies to the pathogen;

реакция пассивной гемагглютинации (РПГА);passive hemagglutination reaction (RPHA);

биопроба на восприимчивость животных.biological test for animal susceptibility.

цитологические исследования по обнаружению телец-включений в мазках со слизистых и аутопсийных тканях.cytological studies to detect inclusion bodies in smears from mucous membranes and autopsy tissues.

экспресс-тесты на выявление антигена. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.rapid antigen detection tests. When studying recently vaccinated people, false positive results are possible.

полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выделению РНК вируса. Высокая специфичность и чувствительность. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.polymerase chain reaction (PCR) to isolate the RNA of the virus. High specificity and sensitivity. When studying recently vaccinated people, false positive results are possible.

Уровень техникиState of the art

При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для детекции РНК, кДНК фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) - возбудителя Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак, был проведен сравнительный анализ структуры нуклеотидных последовательностей гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).When developing a set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for detection of RNA, cDNA fragment of the nucleocapsid protein (N) gene Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) - the causative agent of Canine distemper (Carré disease, distemper) in dogs, a comparative analysis of the structure of nucleotide sequences of the nucleocapsid protein (N) gene of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), posted on the NCBI web resource https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, and then primers and a fluorescent-labeled probe were designed by computer modeling using computer programs Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, USA) and Vector NTI 11 (Invitrogen, USA). Alignment of genomic sequences was carried out using the Clustal W method, phylogenetic analysis was performed using the unweighted pairwise average method - UPGMA. Quality control and thermodynamic analysis of the selected primers and fluorescently labeled probe were performed using OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 and BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (USA).

Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.The amplified cDNA region, being a marker, makes it possible to identify the viral agent in the test sample. Effective real-time PCR requires a fluorescently labeled DNA probe and DNA primers (synthetic oligonucleotides) that are strictly specific to the cDNA of the viral genome. The complexity of choosing primers and probes is due to the requirement of their strict species specificity. Primers must be complementary to the DNA nucleotide sequences, limiting the amplified region on the right and left so that DNA synthesis by DNA polymerase occurs strictly in the selected region. The fluorescently labeled DNA probe, in turn, must lie within the DNA region delimited by the primers. The correct choice of primers allows for an exponential increase in the number of copies of the target DNA region. The correct choice of a combination of a pair of primers and a DNA probe allows detection of the accumulation of amplification products in real time. In general, the specificity of the RT-PCR, and therefore the reliability of the study, depends on the correct choice of oligodeoxyribonucleotide primers and probes.

При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.In the computer design of primers and fluorescently labeled DNA probe, the main criteria were: the absolute degree of homology (complementarity) with the selected gene region; the absence of self-complementary regions in the structure of the primers and their complementarity to each other, in order to prevent the formation of stable secondary structures (dimers); maximum proximity of primer annealing temperatures.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени ДНК фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), что повышает достоверность и надежность анализов.The technical result of the claimed invention is the creation of a set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe that makes it possible to identify in real time the DNA fragment of the nucleocapsid protein (N) gene of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) and has higher homology to currently circulating strains of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), which increases the reliability and reliability of the analyses.

Указанный технический результат достигается разработкой набора высокоспецифических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для ДНК детекции фрагмента гена Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:This technical result is achieved by developing a set of highly specific oligodeoxyribonucleotide primers for DNA detection of a fragment of the Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) gene, containing a pair of oligonucleotides with the activity of forward and reverse primers in the polymerase chain reaction, as well as a fluorescently labeled DNA probe. These oligonucleotides have the following structure:

Последовательности олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV).Sequences of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) gene fragment.

Прямой праймер (Forward primer) 5'→3'Forward primer 5'→3'

VT-CDV-F 5'- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3'VT-CDV-F 5'- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3'

Обратный (Reverse primer) 5'→3'Reverse primer 5'→3'

VT-CDV-R 5'- TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3'VT-CDV-R 5'- TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3'

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'Fluorescently labeled DNA probe (Probe) 5'→3'

VT-CDV-P 5'- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) -3'VT-CDV-P 5'- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) -3'

Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зондаTable 1. Characteristics of the developed primers and fluorescently labeled DNA probe ПоказательIndex VT-CDV-FVT-CDV-F VT-CDV-RVT-CDV-R Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CDV-PFluorescently labeled DNA probe VT-CDV-P Структура от 5’ к 3’Structure from 5' to 3' TCGGAGATGAGAAGGTGGATTATCGGAGATGAGAAGGTGGATTA TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCCTCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC (R6G)- CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2)(R6G)- CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) Длина, нуклеотидыLength, nucleotides 2222 2222 2323 Т отжига с учетом Т плавления, °CAnnealing temperature taking into account melting temperature, °C 6060 6060 7171 GC состав, %GC composition, % 4545 4545 5656 Т работы фермента, °CEnzyme work temperature, °C 67,167.1 67,467.4 76,276.2

Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV).The design of the primers and probe proposed for patenting includes all data from the international GenBank database on the nucleocapsid protein (N) gene sequences of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) as of May 2022. The primers and probe used in the work have greater homology to currently circulating strains of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), which in turn increases the sensitivity of the proposed set of diagnostic primers and probe. The target for the primers and probe used in this work is a highly conserved region of the Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) nucleocapsid protein (N) gene.

Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуорсцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце фргамент РНК, кДНК гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) - возбудителя Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак. Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.The oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labeled DNA probe being submitted for patenting make it possible to detect in a sample an RNA fragment, cDNA of the Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) nucleocapsid protein (N) gene in real time, as well as to amplify a DNA fragment, which makes it possible to sequence the resulting amplicon, with which it is possible to carry out molecular biological work, and therefore a more in-depth study of the properties of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) - the causative agent of Canine Distemper (Carré disease, distemper) in dogs. In addition, the use of a plasmid construct carrying a specific insert as a positive control (as described below) allows the development of quantitative PCR, which in turn makes it possible to assess the viral load in the test sample.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.Testing of the primers was carried out using a biotechnological design, which is based on a plasmid with the insertion of a specific DNA fragment. It was experimentally shown that the selected primers and DNA probe ensure reliable synthesis of target DNA fragments. The specificity of the amplification was further confirmed by sequencing.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущей типоспецифический фрагмент гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV).Positive control samples were obtained by the TOPO-T/A method of cloning virus-specific DNA duplexes into the PC DNA 3.1 plasmid (Invitrogen, USA). After that, competent E. coli cells of the TOP 10 line (Invitrogen, USA) were transformed with the resulting plasmid carrying a type-specific fragment of the Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) nucleocapsid protein (N) gene.

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.It is important to note that the optimization of PCR conditions was carried out using sets of commercially available reagents, instruments and enzymes intended for mass use in laboratory practice, which allows the rapid and reliable use of this invention in medical and research laboratories.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.Analysis of the efficiency of the transformation was carried out by real-time PCR in accordance with the protocol described below, where a 1×TE buffer containing recombinant plasmids with the insertion of a virus-specific synthesized DNA duplex was added to the reaction mixture as a positive sample. As a negative control, 1×TE buffer was added to the reaction mixture.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.Amplification conditions were optimized for the concentration of magnesium ions, the concentration of primers and probes in the reaction mixture, and the primer annealing temperature.

Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).The composition of the reaction mixture was modeled in such a way that the concentration of MgCl 2 ions ensured the optimal speed and accuracy of the Mut-3 Taq polymerase enzyme, the concentration of dNTPs did not exceed 0.4 mM, the concentration of primers was 10 pmol/μl, fluorescently labeled DNA probe 5 pmol/µl, and the sample volume was 5 µl (to increase the specificity of the reaction).

Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку):Table 2. PCR mixture for the reaction (per tube): КомпонентComponent Объем на 1 реакцию (20 мкл), мклVolume per reaction (20 µl), µl ПЦР-буфер ×10PCR buffer ×10 2,52.5 дНТФ (25 мМ)dNTP (25 mM) 0,20.2 MgCl2 (50 мМ)MgCl 2 (50 mM) 11 Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл)Polymerase Taq-pol Mut-3 (5 units/µl) 0.50.5 Прямой праймер - VT-CDV -F (10 пмоль/мкл)Forward primer - VT-CDV -F (10 pmol/µl) 11 Обратный праймер - VT-CDV-R (10 пмоль/мкл)Reverse primer - VT-CDV-R (10 pmol/µl) 11 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CDV-P (5 пмоль/мкл)Fluorescently labeled DNA probe VT-CDV-P (5 pmol/µl) 11 Образец (проба с ДНК)Sample (DNA sample) 55 diH2O (бидистилированная)diH 2 O (bidistylated) 66 Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦРTable 3. Temperature-time regime for PCR ЭтапStage Т, °СT, °C Время, сек.Time, sec. Количество повторовNumber of repetitions Амплификатор планшетного типаTablet type amplifier Амплификатор роторного типаRotary amplifier Начальная денатурацияInitial denaturation 9595 300300 300300 11 ДенатурацияDenaturation 9595 1010 1010 45 циклов с флуоресцентной детекцией45 cycles with fluorescence detection ОтжигAnnealing 5858 25 измерение25 dimension 25 измерение25 dimension ЭлонгацияElongation 7272 2525 4040 ХранениеStorage 44

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).Testing of PCR conditions using developed primers and a fluorescently labeled DNA probe was carried out on tablet-type amplifiers “DT-96”, “DT-Prime”, “DT-Light” (“DNA-Technology”, Russia) and rotary type “Rotor” Gene Q" (QIAGEN, Germany).

Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10-1 до 10-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.To determine the sensitivity of the method, isolated DNA samples (smears and washes) were subjected to tenfold dilutions from 10 -1 to 10 -5 . The resulting dilutions were studied by PCR using developed specific oligonucleotide primers and a fluorescently labeled DNA probe.

Специфичность разработанного способа проверяли на образцах Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV). а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».The specificity of the developed method was tested on samples of Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), as well as on samples of biological material obtained from intact and seronegative animals for Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV). and also using the Sanger sequencing method on an automatic sequencer ABI PRISM 3500 (USA) Fig.1, Fig.2, Fig.3 in the “Scheme” appendix.

Claims (1)

Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-CDV-F 5'- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3', VT-CDV-R 5'-TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3', и флуоресцентно-меченого зонда VT-CDV-P 5'- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) -3', к фрагменту гена, кодирующего белок нуклеокапсида N вируса Чумы плотоядных для детекции вируса Чумы плотоядных у собак.A set of specific oligodeoxyribonucleotide primers VT-CDV-F 5'- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3', VT-CDV-R 5'-TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3', and fluorescently labeled probe VT-CDV-P 5'- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -( BHQ2) -3', to a fragment of the gene encoding the N nucleocapsid protein of the Canine Distemper virus for the detection of Canine Distemper virus in dogs.
RU2022132324A 2022-12-09 Kit of specific oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the canine morbillivirus (canine distemper virus, cdv) nucleocapsid protein (n) gene fragment for the detection of canine distemper (carré disease, distemper) in dogs - real-time pcr test system RU2803069C1 (en)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2803069C1 true RU2803069C1 (en) 2023-09-06

Family

ID=

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
БИКБУЛАТОВА С.М., и др., Способы детекции результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, Вестник Башкирск. ун-та. - 2012., No1, с. 59-60. СЕМАГИНА Ю.В., Лечение чумы плотоядных в условиях частной клиники и.п. мухаметзянова г. БЕЛОРЕЦКА, Международная научно-практическая студенческая конференция посвященная 85-летию УГАВМ и 80-летию факультета биотехнологии "Актуальные вопросы науки, технологии и производства", 21-22 апреля 2015, с.136-138. APPEL M., Canine distemper virus in domesticated cats and pigs, American Journal of Veterinary Research, - 1974. - Vol. 35., p. 803-80. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Oura et al. Virological diagnosis of African swine fever—comparative study of available tests
Redkar et al. Real-time detection of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis
Geens et al. Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR
US7598061B2 (en) Mold infections
JP7072385B2 (en) Means for Diagnosing, Predicting or Monitoring Pneumocystis Pneumonia
Schatzberg et al. Use of a multiplex polymerase chain reaction assay in the antemortem diagnosis of toxoplasmosis and neosporosis in the central nervous system of cats and dogs
Merdja et al. Detection and genotyping of Chlamydia species responsible for reproductive disorders in Algerian small ruminants
Karakuş et al. Evaluation of conjunctival swab sampling in the diagnosis of canine leishmaniasis: A two-year follow-up study in Çukurova Plain, Turkey
KR20210122632A (en) PNA Probe and Primer for Detecting SARS-CoV-2 Causing Covid-19 Using RT-LAMP and Method for Detecting SARS-CoV-2 Infection Using Thereof
US20060003350A1 (en) Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR
CN103276099A (en) Primer and kit for fluorescent quatititive PCR (polymerase chain reaction) detection of helicobacter pylori
Faizal et al. Diagnosis and molecular characterization of Anaplasma platys in dog patients in Yogyakarta area, Indonesia
RU2803069C1 (en) Kit of specific oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the canine morbillivirus (canine distemper virus, cdv) nucleocapsid protein (n) gene fragment for the detection of canine distemper (carré disease, distemper) in dogs - real-time pcr test system
JP2012531908A (en) Methods and / or primers for detecting Mycobacterium tuberculosis
KR102219895B1 (en) Composition for diagnosis of Tsutsugamushi disease and kit comprising the same
RU2802929C1 (en) SET OF SPECIFIC OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDE PRIMERS AND A FLUORESCENTLY LABELED PROBE FOR IDENTIFYING THE N GENE FRAGMENT ENCODING THE NUCLEOCAPSID PROTEIN OF THE FELINE CORONAVIRUS/FELINE INFECTIOUS PERITONITIS VIRUS (FCoV, FIP)
Islam et al. Molecular Detection of Brucellosis, Leptospirosis and Campylobacteriosis by Multiplex PCR and Screening by ELISA Assays in Buffalo Breeding Bulls.
RU2799416C1 (en) Set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the dna fragment of the 16s ribosomal rna gene of ureaplasma genus of mycoplasmataceae family of mycoplasmatales order (ureaplasma spp.) of mollicutes class for the detection of pathogenic ureaplasmas of cats and dogs
RU2802065C1 (en) Set of specific oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the orf1 (non-structural protein 1) gene fragment of feline calicivirus (fcv) rna (cdna) for the detection of feline calicivirus (fcv).
RU2794778C1 (en) Set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the 5.8s-25s ribosomal rna gene fragment and an intergenic spacer for the detection of pathogenic fungi of cats and dogs of the genus cryptococcus
RU2802937C1 (en) Set of primers and a fluorescent probe for detecting the genetic material (dna) of 16s ribosomal rna gene fragment of the 16s ribosomal rna gene fragment of bartonella henselae, bartonella clarridgeiae, bartonella koehlerae for the detection of pathogenic feline bartonella
RU2808816C1 (en) Set of specific oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labeled probe for pertactin bordetella parapertussis and bordetella bronchiseptica gene fragment for detection of bordetellosis pathogens in animals
RU2595373C1 (en) Kit for dna detection of bovine immunodeficiency provirus containing a pair of specific primers and probe and diagnostic technique for cattle immunodeficiency virus by polymerase chain reaction in real time
US20220235399A1 (en) Use of p44 as marker for diagnosing anaplasmosis
EP4056718B1 (en) Composition for detection of sars-cov-2 virus gene and covid-19 diagnosismethod using real-time rt-pcr