RU2802498C1 - Pseudomonas helmanticensis polyhydroxyalkanoate producer resistant to sodium dodecyl sulfate - Google Patents
Pseudomonas helmanticensis polyhydroxyalkanoate producer resistant to sodium dodecyl sulfate Download PDFInfo
- Publication number
- RU2802498C1 RU2802498C1 RU2022123980A RU2022123980A RU2802498C1 RU 2802498 C1 RU2802498 C1 RU 2802498C1 RU 2022123980 A RU2022123980 A RU 2022123980A RU 2022123980 A RU2022123980 A RU 2022123980A RU 2802498 C1 RU2802498 C1 RU 2802498C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polyhydroxyalkanoate
- sodium dodecyl
- dodecyl sulfate
- producer
- resistant
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и связано с выделением устойчивого к додецилсульфату натрия (SDS) штамма-продуцента полигидроксиалканоата (ПГА).The invention relates to the field of biotechnology and is associated with the isolation of a sodium dodecyl sulfate (SDS)-resistant polyhydroxyalkanoate (PHA) producing strain.
ПГА представляют собой полиэфиры, получаемые биосинтетическим путем с помощью бактерий Bacillus, Cupriavidus, Pseudomonas и т.д. (Zinn, Witholt, Egli, Advanced Drug Delivery Reviews, 2001, V. 53, N.1, P. 5-21) Они обладают множеством применений как в качестве упаковочных материалов, так и при производстве изделий медицинского назначения. ПГА обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными полимерами, получаемыми путем переработки нефти. В частности, они быстро разлагаются как в природных экосистемах, так и в организме человека без образования токсичных продуктов (Bonartsev, Bonartseva, Reshetov, Kirpichnikov, Shaitan, Acta Naturae, 2019, V. 11, N. 2, P. 4-16).PHAs are polyesters produced biosynthetically by bacteria Bacillus , Cupriavidus , Pseudomonas , etc. (Zinn, Witholt, Egli, Advanced Drug Delivery Reviews, 2001, V. 53, N.1, P. 5-21) They have many applications both as packaging materials and in the production of medical products. PHAs have a number of advantages over traditional polymers obtained by petroleum refining. In particular, they quickly decompose both in natural ecosystems and in the human body without the formation of toxic products (Bonartsev, Bonartseva, Reshetov, Kirpichnikov, Shaitan, Acta Naturae, 2019, V. 11, N. 2, P. 4-16) .
Однако высокая стоимость производства ПГА значительно ограничивает их использование. Большие производственные издержки связаны, среди прочего, с высокими энергозатратами. Неотъемлемой стадией большинства процессов производства ПГА служит паровая стерилизация сред. Для получения нескольких килограмм полимера требуется не менее тонны стерильной среды. Очевидно, что при стерилизации культуральных сред в промышленных масштабах расходуется значительное количество электроэнергии.However, the high cost of producing PHAs significantly limits their use. High production costs are associated, among other things, with high energy costs. An integral stage of most PHA production processes is steam sterilization of media. To obtain several kilograms of polymer, at least a ton of sterile medium is required. It is obvious that sterilizing culture media on an industrial scale consumes a significant amount of electricity.
Избежать паровой стерилизации можно при использовании селективных сред, которые способен метаболизировать исключительно продуцент ПГА. Повысить селективность среды можно добавлением в нее какого-либо антимикробного агента, к которому у продуцента имеется толерантность. Таким агентом может быть поверхностно-активное вещество, например, SDS. SDS предотвращает рост большинства микроорганизмов (Johnston, Simons, Lambert, Journal of Applied Microbiology, 2000, V. 88, N. 2, P. 237-242), однако некоторые продуцирующие полигидроксиалканоат бактерии Pseudomonas устойчивы к его действию (Zubkov, Nepomnyshchiy, Kondratyev, Sorokoumov, Sivak, Ramsay, Shishlyannikov, Journal of Microbiology, 2021, V. 59, N. 12, P. 1104 – 1111). Таким образом, добавление SDS в среду позволяет проводить культивирование в неаксеничных условиях и, тем самым, снизить стоимость производства ПГА.Steam sterilization can be avoided by using selective media that can only be metabolized by the PHA producer. The selectivity of the medium can be increased by adding to it any antimicrobial agent to which the producer has tolerance. Such an agent may be a surfactant such as SDS. SDS prevents the growth of most microorganisms (Johnston, Simons, Lambert, Journal of Applied Microbiology, 2000, V. 88, N. 2, P. 237-242), however, some polyhydroxyalkanoate-producing Pseudomonas bacteria are resistant to its action (Zubkov, Nepomnyshchiy, Kondratyev , Sorokoumov, Sivak, Ramsay, Shishlyannikov, Journal of Microbiology, 2021, V. 59, N. 12, P. 1104 – 1111). Thus, the addition of SDS to the medium allows cultivation under non-axenic conditions and thereby reduces the cost of PHA production.
Целью изобретения является получение SDS-устойчивого продуцента ПГА, способного накапливать биомассу и полимер в присутствии токсических (до нескольких десятых г/л) концентраций SDS.The purpose of the invention is to obtain an SDS-resistant PHA producer capable of accumulating biomass and polymer in the presence of toxic (up to several tenths of g/l) concentrations of SDS.
Штамм Pseudomonas helmanticensis P1 выделен из образца загрязненной почвы, отобранного в городской черте г. Гатчина Ленинградской области. Для выделения штамма суспензию образца почвы наносили на агаризованную среду, содержащую 5 г/л SDS в качестве единственного источника углерода, и культивировали при 28°С. The Pseudomonas helmanticensis P1 strain was isolated from a sample of contaminated soil collected within the city of Gatchina, Leningrad Region. To isolate the strain, a suspension of the soil sample was applied to an agar medium containing 5 g/L SDS as the sole carbon source and cultivated at 28°C.
На поверхности агаризованных сред (МПА) через 24 часа при 28°С P. helmanticensis P1 образует бежевые, выпуклые, гладкие колонии с ровными краями диаметром до 3 мм. Граморицательные бактерии, бесспоровые, клетки палочковидной формы размером 0,5-1,0×1,5-2,5 мкм, образующие окруженные защитным матриксом агрегаты в присутствии SDS.On the surface of agar media (MPA) after 24 hours at 28°C, P. helmanticensis P1 forms beige, convex, smooth colonies with smooth edges up to 3 mm in diameter. Gram-negative bacteria, non-spore-bearing, rod-shaped cells measuring 0.5-1.0×1.5-2.5 µm, forming aggregates surrounded by a protective matrix in the presence of SDS.
Оптимальная температура роста 27-31°С, оптимальный диапазон рН 5,5-7,0. Не растет при температуре ниже 4°С и выше 37°С. Способен к росту в присутствии до 5 г/л SDS. Не гидролизует крахмал. Не восстанавливает нитраты.The optimal growth temperature is 27-31°C, the optimal pH range is 5.5-7.0. Does not grow at temperatures below 4°C and above 37°C. Capable of growth in the presence of up to 5 g/l SDS. Does not hydrolyze starch. Does not reduce nitrates.
По нуклеотидной последовательности вариабельного участка V3-V4 гена 16S рРНК наиболее близок к виду P. helmanticensis (степень родства 99 %). Хранится на скошенных агаризованных средах (МПА) при температуре 4°С в течение двух месяцев и при -80°С в присутствии 20% глицерина в течение двух лет.According to the nucleotide sequence of the variable region V3-V4 of the 16S rRNA gene, it is closest to the species P. helmanticensis (degree of relationship 99%). Stored on slanted agar media (SMA) at 4°C for two months and at -80°C in the presence of 20% glycerol for two years.
Сведения о патогенности P. helmanticensis в научной литературе отсутствуют.There is no information about the pathogenicity of P. helmanticensis in the scientific literature.
Использование штамма P. helmanticensis P1 иллюстрируется следующими примерами.The use of the P. helmanticensis P1 strain is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение полигидроксиалканота с помощью P. helmanticensis P1 в среде, содержащей глицерин и SDSExample 1. Preparation of polyhydroxyalkanote using P. helmanticensis P1 in a medium containing glycerol and SDS
P. helmanticensis P1 культивировали на жидкой среде, содержащей 10 г/л глицерина, 0,5 г/л NH4Cl, 0,5 г/л (NH4)2SO4, 3 г/л Na2HPO4·12H2O, 2 г/л KH2PO4·H2O, 0,01 г/л MgSO4 и 0,5 г/л SDS, в конических колбах объемом 750 мл. Объем среды для культивирования в колбе составлял 90 мл, объем добавляемого инокулята – 10 мл. Среда для культивирования не подвергалась предварительной стерилизации. Культивирование проводилось в шейкере-инкубаторе при 28°С и скорости перемешивания 250 об/мин в течение 96 ч. По окончании культивирования биомассу отделяли центрифугированием (10 мин при 6800 × g), высушивали при 70°С до постоянной массы и измельчали в ступке. P. helmanticensis P1 was cultivated in a liquid medium containing 10 g/l glycerol, 0.5 g/l NH 4 Cl, 0.5 g/l (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g/l Na 2 HPO 4 12H 2 O, 2 g/l KH 2 PO 4 ·H 2 O, 0.01 g/l MgSO 4 and 0.5 g/l SDS, in 750 ml conical flasks. The volume of cultivation medium in the flask was 90 ml, the volume of added inoculum was 10 ml. The culture medium was not pre-sterilized. Cultivation was carried out in an incubator shaker at 28°C and a stirring speed of 250 rpm for 96 hours. At the end of cultivation, the biomass was separated by centrifugation (10 min at 6800 × g), dried at 70°C to constant weight and crushed in a mortar.
Экстракцию ПГА из сухой биомассы проводили по методике (Rebocho, Pereira, Freitas, Neves, Alves, Sevrin, Grandfils, Reis, Applied Food Biotechnology, 2019, V. 6, N. 1, P. 71-82). 1 г сухой биомассы трижды экстрагировали 50 мл хлороформа при 65°С в течение 6 ч. Экстракты объединяли и концентрировали в вакууме до объема 1 мл. Полимер осаждали 10 мл холодного (4°С) этанола, отделяли центрифугированием (10 мин при 6800 × g) и высушивали при комнатной температуре до постоянной массы. Из 1 г биомассы выделено 250 мг ПГА, что соответствует степени конверсии глицерина в продукт 6,5%.Extraction of PHA from dry biomass was carried out according to the method (Rebocho, Pereira, Freitas, Neves, Alves, Sevrin, Grandfils, Reis, Applied Food Biotechnology, 2019, V. 6, N. 1, P. 71-82). 1 g of dry biomass was extracted three times with 50 ml of chloroform at 65°C for 6 h. The extracts were combined and concentrated in vacuo to a volume of 1 ml. The polymer was precipitated with 10 mL of cold (4°C) ethanol, separated by centrifugation (10 min at 6800 × g) and dried at room temperature to constant weight. From 1 g of biomass, 250 mg of PHA was isolated, which corresponds to the degree of conversion of glycerol into the product of 6.5%.
Пример 2. Получение полигидроксиалканота с помощью P. helmanticensis P1 в среде, содержащей октаноат натрия и SDSExample 2: Preparation of polyhydroxyalkanote using P. helmanticensis P1 in a medium containing sodium octanoate and SDS
P. helmanticensis P1 культивировали на жидкой среде, содержащей 10 г/л октаноата натрия, 0,5 г/л NH4Cl, 0,5 г/л (NH4)2SO4, 3 г/л Na2HPO4·12H2O, 2 г/л KH2PO4·H2O, 0,01 г/л MgSO4 и 0,5 г/л SDS, в конических колбах объемом 750 мл. Объем среды для культивирования в колбе составлял 90 мл, объем добавляемого инокулята – 10 мл. Среда для культивирования не подвергалась предварительной стерилизации. Культивирование проводилось в шейкере-инкубаторе при 28°С и скорости перемешивания 250 об/мин в течение 96 ч. По окончании культивирования биомассу отделяли центрифугированием (10 мин при 6800 × g), высушивали при 70°С до постоянной массы и измельчали в ступке. P. helmanticensis P1 was cultivated in a liquid medium containing 10 g/l sodium octanoate, 0.5 g/l NH 4 Cl, 0.5 g/l (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g/l Na 2 HPO 4 12H 2 O, 2 g/l KH 2 PO 4 ·H 2 O, 0.01 g/l MgSO 4 and 0.5 g/l SDS, in 750 ml conical flasks. The volume of cultivation medium in the flask was 90 ml, the volume of added inoculum was 10 ml. The culture medium was not pre-sterilized. Cultivation was carried out in an incubator shaker at 28°C and a stirring speed of 250 rpm for 96 hours. At the end of cultivation, the biomass was separated by centrifugation (10 min at 6800 × g), dried at 70°C to constant weight and crushed in a mortar.
Экстракцию ПГА из сухой биомассы проводили по методике (Rebocho, Pereira, Freitas, Neves, Alves, Sevrin, Grandfils, Reis, Applied Food Biotechnology, 2019, V. 6, N. 1, P. 71-82). 1 г сухой биомассы трижды экстрагировали 50 мл хлороформа при 65°С в течение 6 ч. Экстракты объединяли и концентрировали в вакууме до объема 1 мл. Полимер осаждали 10 мл холодного (4°С) этанола, отделяли центрифугированием (10 мин при 6800 × g) и высушивали при комнатной температуре до постоянной массы. Затем полимер вновь растворяли в 1 мл хлороформа и осаждали 10 мл холодного (4°С) этанола. Переосаждение повторяли два раза для удаления остатка октановой кислоты. Из 1 г биомассы выделено сухого 340 мг ПГА, что соответствует степени конверсии октаноата натрия в продукт 8,5%.Extraction of PHA from dry biomass was carried out according to the method (Rebocho, Pereira, Freitas, Neves, Alves, Sevrin, Grandfils, Reis, Applied Food Biotechnology, 2019, V. 6, N. 1, P. 71-82). 1 g of dry biomass was extracted three times with 50 ml of chloroform at 65°C for 6 h. The extracts were combined and concentrated in vacuo to a volume of 1 ml. The polymer was precipitated with 10 mL of cold (4°C) ethanol, separated by centrifugation (10 min at 6800 × g) and dried at room temperature to constant weight. Then the polymer was redissolved in 1 ml of chloroform and precipitated with 10 ml of cold (4°C) ethanol. Reprecipitation was repeated twice to remove the remaining octanoic acid. From 1 g of biomass, 340 mg of dry PHA was isolated, which corresponds to the degree of conversion of sodium octanoate into the product of 8.5%.
Таким образом, штамм P. helmanticensis P1 может использоваться для получения ПГА в нестерильных средах, содержащих SDS. Добавление SDS подавляет рост посторонних микроорганизмов, что позволяет проводить культивирование в неаксеничных условиях. Отсутствие стадии паровой стерилизации сред снижает стоимость готового ПГА за счет уменьшения энергозатрат.Thus, P. helmanticensis P1 strain can be used to produce PHA in nonsterile media containing SDS. The addition of SDS inhibits the growth of foreign microorganisms, which allows cultivation under non-axenic conditions. The absence of a stage of steam sterilization of media reduces the cost of the finished PHA by reducing energy consumption.
Claims (1)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2802498C1 true RU2802498C1 (en) | 2023-08-29 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2196177C2 (en) * | 1995-08-21 | 2003-01-10 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Extraction of polyhydroxyalkanoates with solvent from biomass alleviated by using marginal non-solvent for polyhydroxyalkanoates |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2196177C2 (en) * | 1995-08-21 | 2003-01-10 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Extraction of polyhydroxyalkanoates with solvent from biomass alleviated by using marginal non-solvent for polyhydroxyalkanoates |
Non-Patent Citations (1)
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112458012A (en) | Bacillus belgii microbial agent and application thereof | |
Susilowati et al. | Drought resistant of bacteria producing exopolysaccharide and IAA in rhizosphere of soybean plant (Glycine max) in Wonogiri Regency Central Java Indonesia | |
CN112195130B (en) | Bacillus licheniformis, microbial agent and application thereof | |
Belal et al. | Production of Poly-β-hydroxybutyric acid (PHB) by Bacillus cereus | |
Elsayed et al. | Optimization of bioplastic (poly-β-hydroxybutyrate) production by a promising Azomonas macrocytogenes bacterial isolate P173 | |
CN106479916A (en) | A kind of enterobacter cloacae bacterial strain and its application | |
RU2482179C1 (en) | Bacillus atropheus BACTERIA STRAIN - OIL AND OIL PRODUCT DECOMPOSER | |
Satti et al. | Biodegradation of Poly (3-hydroxybutyrate) and Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by newly isolated Penicillium oxalicum SS2 in soil microcosms and partial characterization of extracellular depolymerase | |
RU2639557C1 (en) | Xanthomonas campestris bacteria strain - xanthan producer | |
Gomashe et al. | Optimization and production of Xanthan gum by Xanthomonas Campestris NRRL-B-1449 from sugar beet molasses | |
RU2802498C1 (en) | Pseudomonas helmanticensis polyhydroxyalkanoate producer resistant to sodium dodecyl sulfate | |
Petrisor et al. | Influence of abiotic factors on in vitro growth of Trichoderma strains | |
WO2020076191A1 (en) | Klebsiella pneumonia strain for producing microbial biomass | |
CN113736696B (en) | Acid bacterium delftia and application thereof in preventing and treating plant diseases | |
CN116555066A (en) | Efficient PBAT agricultural film degrading bacterium and application thereof | |
RU2257409C1 (en) | Strain rhodococcus erythropolis for decomposition of petroleum and petroleum products | |
Rekadwad et al. | Enhancing growth of Vigna radiata in the presence of Pseudomonas aeruginosa biopolymer and Metarhizium anisopliae spores | |
RU2266958C2 (en) | Destructor microorganism strains zoogloea sp.14h, arthrobacter sp.13h, arthrobacter sp.15h, bacillus sp.3h, bacillus sp.12h, useful in remediation of ponds and soils contaminated with petroleum and petroleum product, and strain association based on the same | |
Lovdina et al. | Geobacillus kastophilus as a source of thermostable amylase | |
Yahia et al. | Isolation and identification of antibiotic producing Pseudomonas fluorescens NBRC-14160 from Delta Soil in Egypt | |
Najdenski et al. | Anaerobic digestion of wheat straw and micobiological assesment of the resulted digestate | |
RU2257410C1 (en) | Strain rhodococcus erythropolis for decomposition of petroleum and petroleum products | |
CN105754908B (en) | Pseudomonas aeruginosa strain and application thereof | |
CN110343626A (en) | One plant of heat-resisting thermophilic Halomonas and its application | |
KR102454448B1 (en) | Novel microorganism having polycaprolactone decomposition activity and use thereof |