RU2802141C1 - Способ прогнозирования развития метастазов у больных нерезектабельным трижды негативным раком молочной железы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития отдаленных метастазов в ближайшие четыре недели у больных нерезектабельным трижды негативным раком молочной железы. В микроокружении опухоли определяют лимфоциты, экспрессирующие маркеры FOXP3 и CD8. В культуре лимфоцитов определяют уровень спонтанной продукции IL-10 и IL-8 в пг/мл. В крови определяют абсолютную концентрацию клеток с маркерами LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-. По полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции и прогнозируют развитие отдаленных метастазов в ближайшие четыре недели. Способ обеспечивает возможность прогнозирования появления отдаленных метастазов у больных трижды негативным раком молочной железы за счет оценки иммунологических параметров в крови и микроокружении опухоли методом проточной цитометрии. 9 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, точнее, к онкологии, и может найти применение при лечении злокачественных новообразований.

Рак молочной железы (РМЖ) - гетерогенное заболевание с вариабельными биологическими характеристиками и различным клиническим течением. Он занимает первое место в мире (около 25%) по заболеваемости и смертности среди других опухолей у женщин. Согласно информации глобальной базы данных по онкологическим заболеваниям (GLOBOCAN), в 2020 году в мире выявлен 34650951 случай, и 11210413 человек умерли от этого заболевания (Pharmacol. There. 2019, 199: 30-57). В Российской Федерации в 2019 году выявлено 66990 новых случаев РМЖ. Распространенность составила 489,6 случаев на 100000 человек.

Основными биомаркерами, отражающими свойства РМЖ, являются:

1) рецепторы эстрогенов (α-субъединица, ERα);

2) рецепторы прогестерона (PR);

3) рецепторов эпидермального фактора роста второго типа (HER2/new);

4) рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR);

5) сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF);

6) цитокератины (CK5/6, CK14, CK17);

7) ядерный белок, отражающий уровень пролиферативной активности (Ki-67).

В 2000 году С.Perou, использую технологию ДНК - микрочипа, выявил четыре молекулярных подтипа РМЖ, отличавшихся друг от друга экспрессией первых трех биомаркеров, выявляемой методами иммуногистохимии: люминальный А (PR+, ER+, Her-2-), люминальный В (PR±, ER+, Her-2+), с гиперэкспрессией Her-2 (PR-, ER-, гиперэкспрессия Her-2), базально-подобный или тройной негативный (PR-, ER-, Her-2-, а также CK5/6+, CK14+, CK17+, EGFR+). Позднее, в работах других исследователей, а также самого С.Perou с соавторами, позволили выделить еще несколько молекулярных вариантов рака молочной железы. Один из них по профилю экспрессии сходен с нормальной тканью (PR-и/или ER-, Her-2-, CK5/6-, CK14-, CK17-, EGFR-), второй характеризуется низкой экспрессией генов клаудина, обеспечивающего взаимодействие между эпителиальными клетками (Mol. Oncol. 2011; 5: 5-23). Последний вариант относится к тройному негативному раку. Он характеризуется низкой экспрессией Е - кадгерина, наличием маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (EMT, epithelial-mesenchymal transition) и стволовых опухолевых клеток (CSC, cancer stem cells), выраженной лимфоидной инфильтрацией, плохим прогнозом и высокой вероятностью появления отдаленных метастазов.

Базально-подобный трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ) в разных странах составляет 12 - 20% среди других гистологических типов, и имеет ряд клинико-патологических и молекулярных особенностей, которые влияют на тактику лечения. Он встречается у женщин младше 50 лет и характеризуется высокой частотой рецидивирования, а также высоким риском метастазирования в паренхиматозные органы и головной мозг. По сравнению с другими вариантами опухоли чаще выявляется лимфоидная инфильтрация, центральные некрозы и фиброз.

В настоящее время прогнозирование вероятности появления метастазов и отдаленных результатов осуществляется путем оценки гистологического строения и молекулярного подтипа опухоли, а также биомаркеров периферической крови и микроокружения опухоли.

К настоящему времени предложено несколько классификаций ТНРМЖ. В основу их положены гистологические признаки, паттерны мутаций или экспрессия РНК.

В прошлом десятилетии, до первых работ по молекулярному анализу ТНРМЖ, были попытки изучить прогностическую значимость различных гистологических подтипов опухоли. По современным представлениям, основным вариантом является неспецифический тип (NST, no special type) и характеризуется высоким пролиферативным индексом, наличием полиморфным ядер и низкой степенью дифференцировки (Ann. Diagn. Pathol. 2020; 46: 151490). По сравнению с другими гистологическими вариантами он характеризуются меньшей агрессивностью. Медиана времени до появления местного рецидива или отдаленных метастазов по разным данным составляет от 31,4 до 34 мес.Медуллярная аденокарцинома составляет менее 1% среди всех гистологических вариантов и характеризуется наилучшим прогнозом. Метапластическая карцинома обладает уникальными морфологическими характеристиками. Железистые компоненты в ряде случаев частично или полностью замещаются не железистыми. В зависимости от дифференцировки этот вариант подразделяется на 4 подтипа, различающихся по прогнозу:

1) плоскоклеточный тип с кератинизацией и плоскоклеточной дифференцировкой (время до появления рецидива или метастазов - 21 - 24 мес.);

2) матрикс- продуцирующий тип (29 - 32 мес.);

3) смешанный тип, сочетающий плоскоклеточную дифференцировку с большими клетками, содержащими крупные ядра (25 - 27 мес.);

4) веретеноклеточный тип (8 - 10 мес.).

Слизистая кистозная аденокарцинома содержит миоэпителиальные и эпителиальные клетки, продуцирующие слизь и экспрессирующие цитокератины 5, 6, 14. Она составляет 0,1% среди других морфологических вариантов и характеризуется наихудшим прогнозом (время до появления рецидива или отдаленных метастазов составляет около 2 мес.). Секреторная карцинома имеет солидное или железистое строение и крупные вакуолизированные опухолевые клетки, продуцирующие большое количество секрета. Этот вариант встречается чаще у молодых пациенток, менее, чем в 1% случаев, и является одним из прогностически благоприятных. Гликогенсодержащая светлоклеточная карцинома состоит из полигональных клеток со светлой цитоплазмой, содержащей большое количество гликогена. С прогностической точки зрения он занимает промежуточное положение среди других подтипов (время до появления рецидива или отдаленных метастазов - 10 -16 мес.).

Недостатком методов прогнозирования, основанных на иммуногистохимическом исследовании, является низкая точность, так как, помимо строения опухоли, на отдаленные результаты и появление метастазов оказывают влияние также противоопухолевая резистентность организма.

Классификации, основанные на профилях экспрессии генов, представляют собой более совершенный инструмент с прогностической точки зрения по сравнению с иммуногистохимическим исследованием.

В 2012 году Curtis C. с соавторами разработал классификацию, основанную на оценки частоты точечных мутаций и дупликаций ряда генов. Модель была разработана при анализе образцов 997 первичных опухолей и валидирована с использованием 995 образцов, полученных от международного консорциума по молекулярной таксономии РМЖ (Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium, METABRIC) (Biomed. Rep.2014; 2 (1): 41-52). В результате анализа авторы выделили 10 интегративных кластеров, различающихся по превалирующему характеру мутаций. Опухоли базально-подобного типа, в основном (80%), имеют характеристики интегративных кластеров 4 и 10. Интегративный кластер 4 характеризуется наличием выраженной лимфоидной инфильтрации, а 10 - множественными хромосомными аберрациями.

В 2014 году Lehmann B.D. с соавторами проанализировали профили экспрессии 2188 генов 587 больных и выявили 6 типов опухолей, различающихся по биологическим свойствам: базально-подобный 1, 2 (BL1, BL2); мезенхимальный (М), мезенхимально-стволовой (MSL), иммуномодуляторнпторныый (IM), андрогенорецепторный (LAR) (J. Pathol. 2014; 232 (2): 142-150).

BL является наиболее распространенным молекулярным подтипом (BL1 - 22%, BL2 - 12%). BL1 характеризуется нарушением экспрессии генов, регулирующих клеточный цикл и репарацию ДНК: амплификация MYC, PIK3CA, CDK6, KRAS, FGFR1, IGF1R, CCNE1, CDKN2A/B; делеции BRCA2, PTEN, MDM2, RB1, TP53. M (21%) характеризуется дезорганизацией сигнальных путей, регулирующих клеточную миграцию, взаимодействие рецепторов с экстрацеллюляным матриксом, а также дифференцировку. Большинство опухолей, имеющих гистологическую структуру метапластической карциномы, относятся к М подтипу. MSL (10%) связан с низкой экспрессией генов, регулирующих пролиферацию, и высокой - генов, ассоциированных со стволовыми клетками (ABCA8, PROCR, ENG, ALDHA1, PER1, ABCB1, BCL2, BMP2). Кроме того, клетки часто экспрессируют маркеры стволовых клеток (BMP2, ENG, KDR, NGFR, NTSE, PDGFR, VCAM1). IM (18%) характеризуется гиперэкспрессией генов, связанных с реализацией иммунного ответа: метаболические пути натуральных киллеров (NK), Т-хелперов (Th), В -клеток, дендритных клеток (DC), а также сигнальных путей, связанных с IL-7 и IL-12. IM подтип по биологическим свойствам в большинстве случаев соответствует медуллярной карциноме. LAR (9%) существенно отличается от других вариантов опухолей. Он отличается высоким уровнем экспрессии андрогеновых рецепторов (в 10 раз выше по сравнению с другими подтипами) и гиперэкспрессией генов, ассоциированных с биосинтезом стероидных гормонов.

В 2015 году Burstein M.D. с соавторами провели исследование, целью которого было модификация критериев и уточнение числа молекулярных подтипов ТНРМЖ в соответствии с профилями экспрессии 80 генов (Clin. Cancer Res. 2015; 21(7): 1688-1698). В работе проводился анализ мутаций ДНК и экспресии РНК. Всего было проанализировано 198 образцов (84 для разработки метода и 114 для валидации). В результате анализа было выделено 4 молекулярных подгруппы, определяемых гиперэкспрессией или амплификацией ряда генов, а также обозначены специфические биомаркеры для каждой из них: 1) люминальный -АР (LAR): андрогеновые рецепторы, муцин (MUC 1); 2) мезенхимальный (MES): IGF-1, ADRB2, EDBRB, PTGER 3/4, PTGFR, PTGFRA; 3) базально-подобный иммуносупрессивный (BLIS): VTCN1; 4) базально-подобный иммуноактивированный (BLIA): CTLA-4. Подгруппы обладают прогностической значимостью в отношении вероятности появления рецидива (p=0,019). В обоих случаях прогноз ухудшается в следующем порядке: BLIS>MES>LAR>BLIA.

В 2016 году Liu Y.R. с соавторами провели интегральный траскрипционный анализ матричных (mRNA) и длинных не кодирующих РНК (IncRNA) 165 образцов ткани, и предложили классификацию, основанную на превалирующих нарушениях в ключевых процессах канцерогенеза. Иммуномодулирующий подтип (IM, кластер А) ассоциирован с процессами иммуногенеза: экспрессия цитокинов, компонентов Т и В-клеточного рецепторов, хемокинов, элементов трансдукции сигнала внутрь клетки. Люминальный - AR подтип (LAR, кластер В) связан с активацией биосинтеза андрогенов и эстрогенов. Мезенхимальный подтип (MES, кластер С) ассоциирован с активацией компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Базально-подобный иммуносупрессивный подтип (BLIS, кластер D) в отличие от мезенхимального, связан с гиперактивацией процессов пролиферации клеток, что обусловлено гиперэкспрессией ряда регуляторных генов: CENPF, BUB1, PRC1. При этом процессы регуляции иммунного ответа в этом подтипе резко подавлены. С точки зрения прогнозирования рецидива BLIS подтип наименее благоприятный (Breast Cancer Res. 2016; 18(1): 33).

В настоящее время продолжаются работы по выявлению и описанию молекулярных подтипов ТНРМЖ. Большинство исследований базируются на оценке уровня mRNA различных генов. Недостаток подобного подхода связан с тем, что этот показатель далеко не всегда коррелирует со спектром и количеством белков, структура которых закодирована в mRNA. Связано это с многоуровневой регуляцией пептидного синтеза. Кроме того, методы оценки mRNA дороги и трудоемки, что затрудняет их внедрение в клиническую практику.

Молекулярные биомаркеры ТНРМЖ включают мутации генов, связанных с системами репарации ДНК, мутации сигнальных путей, экспрессия ростовых факторов и их рецепторов, циркулирующие опухолевые клетки и ДНК, микросателлитная нестабильность, мутационная нагрузка, молекулы - мишени для стандартных и разрабатываемых иммуноонкологических препаратов. Отдельную группу составляют иммунологические биомаркеры. К ним относятся микроокружение опухоли, периферические иммунологические компоненты и третичные лимфоидные структуры.

BRCA 1 и BRCA2 - аутосомно-доминантные гены, имеющие критическое значение в репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации (homologus recombination repair, HRR). BRCA1 локализуется на хромосоме 17q21. Он контролирует различные компоненты сигнальной трансдукции, вовлеченные в репарацию ДНК, включая распознавание геномных повреждений, активацию белков, связывающих ДНК, и оценку двойных разрывов, требующих репарации. Кроме того, он принимает участие в ремоделировании хроматина и контроле транскрипции. BRCA2 локализуется на хромосоме 13 и играет ключевую роль в активации рекомбиназы RAD 51 и выявлении локализации повреждения ДНК. Наследственные мутации BRCA 1 и BRCA2 (gBRCAm) встречаются в небольшой популяции (примерно 1 на 400 тыс.или 0,25%), в то время как у женщин с ТНРМЖ их частота составляет, по разным данным, от 11% до 31%. Риск развития рецидивов и отдаленных метастазов ТНРМЖ с наследственными мутациями BRCA1 и BRCA2 составляет 65% и 45% соответственно (J. Exp.Clin. Cancer Res. 2019; 38 (1): 195).

Общим недостатком методов прогнозирования рецидивов путем оценки мутаций в генах, связанных с репарацией ДНК, является отсутствие четкого алгоритма, который бы позволял точно спрогнозировать рецидив, что обусловлено вовлечением множества генов и многих этапов посттрасляционной модификации, влияющих на клинические проявления.

Циркулирующие опухолевые клетки. Циркулирующие опухолевые клетки (CTC, circulating tumor cell) потенциально являются биомаркером, связанным с предсказанием рецидивов и отдаленных метастазов ТНРМЖ.

В 2004 году Cristofanilli M. с соавторами на группе из 177 больных с метастатическим РМЖ продемонстрировали, что более 5 CTC/7,5 мл крови является независимым прогностическим фактором в отношении прогрессирования в виде появления локальных рецидивов и отдаленных метастазов (N. Engl. J. Med. 2004; 351 (8): 781-791).

Несмотря на длительную историю изучения, данные касающиеся роли CTC в качестве фактора прогноза у больных ТНРМЖ, противоречивы. Munzone E. с соавторами в ретроспективном анализе данных 203 больных продемонстрировали, что число CTC коррелирует с показателями общей выживаемости, но не с прогрессированием и ранними рецидивами (Clin. Breast Cancer. 2012; 12 (5): 340-346).

Циркулирующие нуклеиновые кислоты. Помимо CTC, опухолевая ткань является источником экзосом, циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) и РНК (miRNA). ctDNA в крови - потенциальный биомаркер, с помощью которого можно прогнозировать прогрессирование и появление рецидивов. Идентификация опухоль-специфических мутаций в ctDNA может служить фактором персонализации лечения, а при наличии метастатических поражений - хорошей альтернативой биопсии. Stover D.G. c соавторами в ретроспективном анализе 164 больных метастатическим ТНРМЖ продемонстрировали, что ctDNA является независимым прогностическим фактором общей выживаемости. Медиана общей выживаемости в подгруппе, где опухолевая фракция ctDNA превышает 10% составила 6,4 мес., в альтернативной - 15,9 мес.(J. Clin. Oncol. 2018; 36 (6): 543-553). В исследовании Parsons H.A. показана 70% конкордантность генетических изменений в метастатических очагах и в ctDNA (62). В исследовании Riva F. с соавторами у 27 из 36 больных (75%) до лечения была выявлена ctDNA. Идентичность ее с опухолью оценивалась путем выявления мутаций в гене TP53. Выявление ctDNA коррелировало метастатическим индексом (p=0,003), степенью дифференцировки опухоли (p=0,003) и стадией (p=0,03). У всех больных с ctDNA отмечалось прогрессирование на фоне неоадъювантной химиотерапии. При этом корреляции между полным ответом на лечение и ctDNA не было выявлено (Clin. Chem. 2017; 63 (3): 691-699).

MiRNA - небольшие молекулы РНК, которые регулируют экспрессию mRNA. Дополнительной функцией miRNA являются участие в трансляции mRNA путем рекрутинга протеинового комплекса формирования рибосом. У человека в настоящее время описано 2654 последовательности miRNA. Роль miRNA в канцерогенезе ТНРМЖ в последние годы интенсивно изучается. PubMed в настоящее время включает более 500 публикаций, касающихся роль miRNA (из них более 30 касаются циркулирующей miRNA) в ТНРМЖ. Исторически первой RNA, выявленной у больных ТНРМЖ, была has-miR-210. Она была ассоциирована с плохим прогнозом. Li H.Y. с соавторами в 2017 году провели сравнение уровня экспрессии miRNA в 204 образцах ТНРМЖ и 1095 образцах других РМЖ других молекулярных подтипов. Авторы выявили 376 miRNA с различающейся экспрессией, но лишь 10 из них были связаны с плохим прогнозом в отношении рецидива при ТНРМЖ: а) усилена экспрессия hsa-miR-301b, hsa-miR-181a-2-3p, hsa-miR-105-5p, hsa-miR-93-3p; б) снижена экспрессия hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-135a, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-638, hsa-miR-3173, hsa-miR-4245. Сходные данные с дифференцированной экспрессией различных типов miRNA в тканях и периферической крови были получены рядом других авторов (J. Cell Physiol. 2019; 234 (7): 11768-11779).

Недостатками методов оценки вероятности рецидивов ТНРМЖ путем оценки ctDNA и MiRNA являются отсутствие стандартизованных методов оценки и четких алгоритмов, связывающих уровень DNA и RNA в крови с вероятностью рецидива.

Предикторы эффективности иммунотерапии. Биомаркеры, являющиеся предикторами эффективности иммунотерапии у больных ТНРМЖ включают ко-ингибирующие молекулы - мишени иммуноонкологических препаратов, микросателлитную нестабильность, мутационную нагрузку, а также опухоль-инфильтрирующие лимфоциты. Они также обладают прогностическим потенциалом в отношении появления рецидивов и отдаленных метастазов.

PD-1 - ко-ингибирующая молекула, регулирующая функции компонентов врожденного и адаптивного иммунного ответа. Она экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов, В - лимфоцитов, МФ, моноцитов, DC. В физиологических условиях она способствует формировании толерантности к аутоантигенам, в микроокружении опухоли - опухолевой иммунологической толерантности (Blood. 2009; 114 (8): 1537-1544.). PD-L1 экспрессируется в 20% случаев ТНРМЖ. PD-L1 выявляется примерно на 10% на опухолевых клеток, и на 40-65% компонентов микроокружения опухоли. Экспрессия PD-L1 на злокачественных клетках является предиктором позднего рецидива и маркером чувствительности к химиотерапии (2018; 70 (2): 73-86. Engl. J. Med. 2016; 375 (18): 1767-1778).

Микросателлитная нестабильность (MSI, microsatellite instability) - фенотип, обусловленный дефицитом механизмов репарации ДНК (dMMR, deficient mismatch repair). MSI ассоциирована с высокой частотой образования неоантигенов, и, как следствие, чувствительностью к иммуноонкологическим препаратам. Частота MSI-H/dMMR при ТНРМЖ очень низка (0%-1,5%), и ее прогностическая и предиктивная значимость продолжает изучаться (Cancer Res. 2018; 78, PD6-03).

Общим недостатком использования предикторов эффективности иммунотерапии для прогнозирования ранних рецидивов ТНРМЖ является отсутствие достаточных клинических данных. Во всех исследованиях делается акцент на прогнозировании эффективности иммунотерапии, а информация о влиянии на прогноз раннего рецидива или метастазирования является дополнительной, а иногда и просто случайной находкой.

Изучение иммунологических биомаркеров включают количественную и качественную оценку компонентов иммунной системы. Прогностическое и предсказательное значение имеют клетки в микроокружении опухоли и в крови. В обоих случаях могут оцениваться количественные характеристики и соотношение популяций, а также концентрация и продукция цитокинов (спонтанная и индуцированная). В микроокружении прогностическим и предсказательным потенциалом обладают также третичные лимфоидные структуры и паттерны экспрессии генов, ассоциированных с генерацией иммунного ответа.

В первых работах, связанных с изучением прогностического потенциала биомаркеров у больных ТНРМЖ, проводилась оценка лимфоцитов или мононуклеаров периферической крови, а также соотношений разных субпопуляций лейкоцитов.

В 2016 году He J. с соавторами на группе из 230 больных с локальными и местнораспространенными формами ТНРМЖ выявили, что благоприятными прогностическими факторами в отношении общей и безрецидивной выживаемости являются лимфоцитоз (p<0,005), моноцитоз (p<0,005), а также соотношение лимфоцитов и моноцитов (LMR ≥ 4,7; p<0,001). Кроме того, LMR коррелировало с размером опухоли (p<0,005) и стадией заболевания (p=0,013). Сходные данные получены в исследовании Jia W. с соавторами (Tumor Biol. 2016; 37 (7): 9037-9043. PLOS. 2015; 10 (11): 1371). В то же время, в работе Losada B. с соавторами, оценивая абсолютное количество лимфоцитов (ALC), NLR, LMR и PLR (тромбоцитарно-лимфоцитарное соотношение) на группе больных ≥ 65 лет (104 человека) при проведении одномерного анализа продемонстрировали, что только PLR является независимым предсказательным фактором в отношении раннего рецидива (p=0,04) и общей трехлетней выживаемости (p=0,03), а при многомерном анализе в подгруппе, пережившей трехлетний период (69 человек), из иммунологических факторов предиктивные свойства есть лишь у ALC (p=0,04) (Clin. Transl. Oncol. 2019; 21 (1): 855-863).

Оценка субпопуляций клеток миелоидного и лимфоидного ряда как в периферической крови, так и в микроокружении является более точным методом оценки прогноза. Среди клеток лимфоидного ряда изучалась роль лимфоцитов (цитотоксические лимфоциты, T-регуляторные клетки, В-лимфоциты), моноцитов/макрофагов (M1,2), дендритных клеток (DC), супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). Прогностическое значение, кроме того, имеют компоненты врожденного иммунитета: натуральные киллеры (NK), нейтрофилы, эозинофилы (Cancers. 2021; 13 (6): 1305).

К настоящему времени показано, что моноциты и клетки моноцитарной линии связаны с канцерогенезом РМЖ, а также с прогнозом и эффективностью различных вариантов лечения. В микроокружении опухоли и периферической крови существует две субпопуляции МФ - М1 и М2. М1 - классически активируемые МФ, поляризация которых из предшественников происходит под действием липополисахарида, IFN-γ и TNF-α. М2 - сборное название группы клеток макрофагального ряда, индуцирующихся под влиянием IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, Fc-рецепторов, комплемента и глюкокортикоидов. М2 образуются из моноцитов периферической крови, рекрутированных в очаг хемокиновыми лигандами (CCL-2, MCP-1), колоние-стимулирующими факторами (M-CSF, CSF-1) и сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), концентрация которых повышена в зонах с низким давлением кислорода. В зонах хронический гипоксии в макрофагах синтезируются гипоксия - индуцированные факторы (HIF-1 и HIF-2). Они дерепрессируют синтез ряда белков, повышающих ангиогенный потенциал опухоли (VEGF, bFGF, PDGF), инвазивный потенциал, метастазирование и ЕМТ (MMP, CCL2, CCL18). Кроме того, в них отмечается избыточная экспрессия аргиназы (Arg) и IDO, снижающих концентрацию аргинина и триптофана, необходимых для нормального функционирования Т - лимфоцитов и NK (BMC Cancer. 2018; 18 (1): 366).

В периферической крови больных ТНРМЖ концентрация М2 существенно выше по сравнению с М1, что коррелирует с коротким безрецидивным периодом. М2 макрофаги чаще встречаются в крови больных с отдаленными метастазами (Front. Immunol. 2019; 10: 1767).

MDSC представляют собой гетерогенную группу клеток, образующихся из кроветворного предшественника - не зрелых миелоидных клеток (IMC, CD31+CD11b+CD15+). В норме созревание происходит в костном мозге и селезенке. В микроокружении опухоли под действием гуморальных факторов (VEGF, IL-3, IL-4, IL-6) и лигандов хемокинов (CXCL2, 5,12; CCL2, 5) блокируется их дальнейшая дифференцировка, и они накапливаются в первичных и метастатических очагах. У человека выявляется две субпопуляции MDSC: гранулоцитарные MDSC (gMDSC, CD11b+CD14-CD15+CD33+) и моноцитарные MDSC (mMDSC, CD11b+CD14+CD15-CD33+HLADR-/low). MDSC - ключевые компоненты в индукции иммуносупрессии на фоне хронического воспаления. За счет активных метаболитов кислорода и азота они индуцируют анергию эффекторных клеток, способствуя рекрутингу Treg в опухоль и поляризации предшественников МФ в сторону М2. Кроме того, они стимулируют ангиогенез и способствуют поддержанию популяции CSC (Oncotarget. 2017; 8(2):3649-65).

Высокая концентрация MDSC коррелирует с объемом опухолевой массы. У больных ТНРМЖ их концентрация значительно выше по сравнению с другими молекулярными вариантами РМЖ. MDSC обладают предиктивной значимостью в плане эффективности химиотерапии. Вероятность положительного эффекта связана с увеличением соотношения gMDSC/mMDSC. Вместе с другими показателями (CTL (CD8+)) mMDSC являются положительным прогностическим фактором в отношении раннего рецидива (Cancer Immunol. Immunother. 2020; 69(3):435-448).

DC - это высокоспециализированная субпопуляция, основной функцией которой является поглощение, процессинг и презентация антигенов в составе главного комплекса гистосовместимости I и II типа (MHC I и II) в комбинации с ко-стимулирующими молекулами Th (CD4+) непосредственно, и опосредованно - CTL. Их активация происходит под действием «сигналов опасности», исходящих от опухолевых клеток, включающих хемокины и неоантигены. «Созревание» DC, помимо презентации антигенов, включает экспрессию ко-стимулирующих молекул (CD40, ICAM I, CD80/86, CD83), секрецию широкого спектра цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) и миграцию в лимфатические узлы, где происходит запуск программы активации Th. У человека морфологически и функционально различают две субпопуляции DC: миелоидные (mDC) и плазмацитоидные (pDC). mDC - классические DC, имеющие фенотип CD11c+CD4+CD45RO+, экспрессирующие MHC I, II и запускающие иммунный ответ при контакте с растворимыми антигенами. pDC с фенотипом CD11c-CD4+CD45RA+CD123+и экспрессией MHC I поглощают клеточно-ассоциированные антигены. У больных ТНРМЖ под влиянием IL-10 и TGF-β в DC снижается экспрессия цитокинов (IL-12), ко-стимулирующих молекул (CD80, CD86), активационных маркеров (HLA-DR) и способность к презентации антигенов (Nat. Rev. Immunol. 2020; 20(1):7-24.).

Данные о прогностической и предсказательной роли DC у больных ТНРМЖ противоречивы. По данным ряда исследователей, их высокий уровень в крови является благоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости и раннего рецидива (In Vivo. 2018; 32(6):1561-1569). Требуются дальнейшие исследования для выявления их потенциала в качестве биомаркеров ТНРМЖ.

Treg - субпопуляция, составляющая примерно 5 - 10% от общего числа периферических лимфоцитов здорового человека и примерно 50% от популяции лимфоцитов с маркерами CD4+CD25+. В настоящее время им отводят ключевую роль в предотвращении развития аутоиммунных реакций и иммуносупрессии в процессе канцерогенеза. Treg имеют фенотип CD4+CD25+FoxP3. Среди CD4+CD25+FoxP3 выделяются две субпопуляции. Одна из них имеет фенотип CD4+CD25^hiCTLA^hiFoxP3 и образуется в тимусе из недифференцированных лимфоцитов, другая, с фенотипом CD4+CD25^variable CTLA^hi FoxP3, возникает из периферических Th под действием избыточной концентрации глюкокортикоидов, эстрогенов, IL-2 и TGF-β. Однако по функциям они идентичны. Механизм действия их связан с контактным ингибированием, секрецией супрессорных цитокинов (IL-10, IL-35, TGF-β), а также прямым лизисом иммунокомпетентных клеток (Cancer Microenviron. Off J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 2019; 12(23):119-132).

В 2019 году Peng G.L. с соавторами на группе из 122 человек продемонстрировали, что низкое соотношение Treg/CTL (экспрессия в опухоли, определяемой иммуногистохимическим методом) по сравнению с высоким является благоприятным прогностическим фактором в отношении раннего рецидива (Am. J. Trans. Res. 2019; 11(8):5039-5053). Wang L. с соавторами на группе из 118 больных исследовал экспрессию Treg, Th1 и Th2 одновременно в опухолевых очагах и периферической крови больных ТНРМЖ. Авторам удалось доказать, что эти клетки идентичны по спектру поверхностных маркеров и экспрессируемых цитокинов, а также продемонстрировать что высокая концентрация Treg является предиктором раннего рецидива и отдаленного метастазирования (Nat. Immunol. 2019; 20 (9): 1220-1230).

Прогностическая значимость субпопуляций Т-лимфоцитов при разных опухолях отражена во многих публикациях. При ТНРМЖ авторами отмечается выраженность молекулярных дефектов этих клеток, приводящих к снижению цитолитической функции и ухудшению распознавания чужеродных антигенов. Высокая вероятность раннего рецидива и метастазирования при ТНРМЖ связан с высоким уровнем CTC и коррелирующими с ними низкими уровнями CD4+и CD8+(J. Cancer. 2016; 7 (9): 1095-1104).

Оценка субпопуляций лимфоцитов в крови больных ТНРМЖ является наиболее перспективным методом оценки риска раннего рецидива. Преимущество его перед другими методами заключается в простоте использования и высокой информативности. Недостаток всех предложенных методов является отсутствие четкого алгоритма, который бы связывал количественные параметры с вероятностью рецидива.

Изучение микроокружения опухоли при ТНРМЖ является важным компонентом оценки прогноза заболевания. С клинической точки зрения микроокружение можно оценивать количественно, качественно, с учетом субпопуляционного состава, а также по присутствию третичных лимфоидных структур. Кроме того, в настоящее время имеется возможность оценивать концентрацию и продукцию цитокинов лимфоидными элементами крови и микроокружения.

Наличие лимфоидной инфильтрации, составляющей 50-60% от объема стромы при всех молекулярных подтипах ТНРМЖ, как правило, говорит о хорошем прогнозе, низкой вероятности рецидивирования и потенциальной чувствительности к иммуноонкологическим препаратам и химиотерапии (BMJ Cancer. 2018; 18 (1): 556).

В 2014 году Adams S. с соавторами опубликовали данные исследования о влиянии плотности стромальных и интраэпителиальных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (sTIL, iTIL) на отдаленные результаты лечения ТНРМЖ. В работе были проанализированы образцы 506 больных, которые получали лечение в рамках протоколов ECOG E2197 (191 человек) и E1199 (291 человек). В 481 образце были выявлены TIL (sTIL - 80%, iTIL - 15%). В результате многомерного анализа выявлено, что плотность sTIL является независимым прогностическим фактором ранних рецидивов, общей выживаемости и времени до появления отдаленных метастазов. Повышение плотности sTIL на каждые 10% приводит к уменьшению риска локального рецидива на 14% (p=0,02), риска отдаленных метастазов на 18% (p=0,04) и риска смерти на 19% (p=0,01) (J. Clin. Oncol. 2014; 32 (27): 2959- 2967).

В 2020 году He L. с соавторами провели метаанализ 22 отобранных публикаций, в которых отражены результаты лечения 15 676 больных РМЖ (из них ТНРМЖ - 3847). Были отобраны публикации, где проводились рандомизированные исследования и оценка TIL согласно рекомендациям международной рабочей группы. Результаты многомерного анализа выявили, что увеличение плотности TIL на каждые 10% приводит к увеличению показателей общей выживаемости и частоты полных морфологических ответов при всех молекулярных подтипах. Высокая плотность TIL (≥ 50%) приводит к увеличению частоты полных морфологических ответов (pCR) в 2,7 раза и снижению риска рецидивов в 1,8 раза при ТНРМЖ (BMC Womens Health. 2020; 20 (1): 194).

Современные исследования включают анализ не только плотности лимфоидного инфильтрата, но и субпопуляционного состава микроокружения опухоли, изучение особенностей третичных лимфоидных структур, а также «иммунологических подписей», отражающих активацию генов, связанных с иммунной системой.

В 2015 году Miashita M. с соавторами провели исследование с участием 101 пациентки с ТНРМЖ. Они изучали влияние различного субпопуляционного состава микроокружения, оцениваемого иммуногистохимическим методом, на отдаленные результаты лечения, а также на вероятность появления рецидивов и отдаленных метастазов. В результате многофакторного анализа было выявлено, что прогностической значимостью обладают цитотоксические лимфоциты (CD8+) и Т-регуляторные клетки (Foxp3+) (Breast Cancer Research. 2015; 17(1): 124).

В 2016 году Yu X. c соавторами провели метаанализ 17 публикаций с участием 12968 больных РМЖ, включая ТНРМЖ. В отличие от исследований Adams S. и He L., критерием отбора было наличие анализа субпопуляционного состава, включавший лимфоциты с маркерами CD8+(CTL), PD-1+, Foxp3+(Treg). Авторы пришли к заключению, что наличие TIL является благоприятным прогностическим фактором в отношении безрецидивной выживаемости и предиктором ответа на неоадьювантную терапию. Последняя закономерность не воспроизводится в группе с ТНРМЖ. Наличие PD-1+TIL и Foxp3+TIL является неблагоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости, а CD8+TIL - благоприятным в отношении общей выживаемости, позднего рецидива и метастазирования (Clin. Transl. Oncol. 2016; 18(5): 497-506).

Dieci M. с соавторами в 2020 году провели исследование с участием 244 больных с локальными формами ТНРМЖ, в котором интегрировали показатели TIL, а также клеток, экспрессирующих PD-L1, FOXP3 и CD8 в прогностическую модель, включающую клинико-патологические факторы (возраст, стадия на момент диагностики, степень дифференцировки). Наибольший прогностический вклад в модель, связанную с безрецидивной выживаемостью, принадлежит PD-L1: критерий согласия Пирсона 4,6 (p=0,032) в случае включения в качестве параметра 10% увеличения содержания TIL после неоадъювантной химиотерапии и 6,5 (p=0,011) в случае включения параметра TIL с пороговым значением 30% (TIL ≥ 30%, TIL<30%. Таблица 1 - многофакторный анализ, включающий клинические параметры и иммунологические компоненты микроокружения опухоли, где КФ - клинические факторы (возраст, стадия, степень дифференцировки)).

Таблица 1.
Параметры модели	Критерий согласия Пирсона (χ2)	p
КФ+TIL10% прирост против КФ	17,08	<0,001
КФ+TIL10% прирост+PD-L1 против КФ+TIL10% прирост	4,6	0,032
КФ+TIL10% прирост+CD8 против КФ+TIL10% прирост	2,45	0,116
КФ+TIL10% прирост+FOXP3 против КФ+TIL10% прирост	2,58	0,108
КФ+TIL30% против КФ	13,77	<0,001
КФ+TIL30%+PD-L1 против КФ+TIL30%	6,5	0,011
КФ+TIL30%+CD8 против КФ+TIL30%	5,89	0,015
КФ+TIL30%+FOXP3 против КФ+TIL30%	3,95	0,047

В классическом варианте генерация эффективного адаптивного иммунного ответа, включающая все этапы созревания DC и презентацию антигенов в составе MHC эффекторным клеткам, происходит во вторичных лимфоидных органах (селезенка, лимфатические узлы). Детальное изучение микроокружения позволило выявить, что непосредственно в опухоли образуются третичные лимфоидные органы (TLO), в которых дублируются эти процессы. TLO состоят из Т-зон, содержащих в большом количестве DC и В - герминогеных центров. В них происходит активация, пролиферация и дифференцировка Т и В клетки, в результате чего происходит образование CTL, эффекторных Th и В-клеток, продуцирующих антитела, а также клеток памяти. Структурно TLO схожи с лимфатическими узлами. Помимо зон созревания, они включают стромальные клетки и венулы с высоким эндотелием (HEV). TLO чаще локализуются по периферии опухоли (Front. In immunol. 2019; 10: 1398).

В большинстве поведенных исследований авторы приходят к выводу о том, что формирование TLO является благоприятным прогностическим фактором ТНРМЖ. Но методология исследования до настоящего времени не является универсальной. Поэтому в публикациях оцениваются разные компоненты TLO: плотность HEV, количество TLO в биоптате, субпопуляционный состав, профиль экспрессии генов. В 2018 году Song I.H. с соавторами провели исследование с использованием данных 108 больных ТНРМЖ. Они оценивали число TIL, TLS, плотность HEV, субпопуляционный состав (CD3+, CD8+, CD20+), а также экспрессию CXCL13. В результате многомерного анализа выявлено, что благоприятными прогностическими факторами полного морфологического ответа являются плотность HEV, CD3+, CD20+, экспрессия CXCL13, а позднего рецидива - плотность HEV, CD8+и экспрессия CXCL13 (J. Clin. Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013)).

Оценка микроокружения опухоли, включая субпопуляционный состав и третичные лимфоидные органы - важный источник прогностической информации у больных ТНРМЖ. Достоинством методов оценки микроокружения связаны с возможностью получения наиболее достоверных данных о взаимодействии опухоли и иммунной системы. Основным недостатком является техническая сложность оценки.

Цитокины в настоящее время рассматриваются как универсальные регуляторы, контролирующие гомеостаз многих клеток. При ТНРМЖ они участвуют в регуляции ангиогенеза, формирования иммуносупрессивной сети, метастазировании, а также в интеграции метаболических процессов, связанных с ожирением, хроническим воспалением и канцерогенезом. Вовлеченность в процессы канцерогенеза делает возможным использование цитокинов в качестве прогностических факторов. Цитокины могут оцениваться в крови или микроокружении опухоли. В обоих случаях может оцениваться их концентрация (в микроокружении - экспрессия), а также спонтанная и индуцированная продукция. В канцерогенез ТНРМЖ вовлечены IL-1, 6, 8, 10, 11, 17, 19, 20, 23; TNF-α. Многие из них обладают прогностическим потенциалом (Таблица 2 - прогностическая роль гиперэкспрессии в микроокружении или повышения уровня цитокинов в плазме у больных трижды негативным раком молочной железы).

Таблица 2.
Цитокин, группа, продуценты	Микроокружение(М); плазма (П)	Предиктивная/ прогностическая роль	Прогноз рецидива, безрецидивная выживаемость
IL-1. Монокины. Моноциты, МФ, B - лимфоциты, фибробласты, эндотелиоциты	М, П	Повышенный инвазивный потенциал	Нет данных
IL-6. Семейство IL-6. Лимфоциты, МФ, миоциты, фибробласты, опухолевые клетки	М, П	Предиктор низкой эффективности химиотерапии	Не благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости
IL-8. Хемокины. моноциты, МФ, лимфоциты, эндотелиоциты, нейтрофилы, фибробласты, опухолевые клетки	М, П	Повышение инвазивности и метастатического потенциала	Не благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости
IL-10. Семейство IL-10. Treg, Th0, Th1, Th2, NK, CD8+, МФ, опухолевые клетки	П	Разнонаправленное влияние. Ингибирует пролиферацию за счет супрессии IL-6. В высоких концентрациях увеличивает инвазивный потенциал	Нет данных
IL-19. Семейство IL-10. Моноциты, В-лимфоциты	М	Увеличивает риск раннего рецидива	Не благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости
IL-20 (IL-20RA). Семейство IL-10. Моноциты, кератиноциты	М	Увеличивает инвазивный потенциал	Не благоприятный прогноз в отношении безрецидивной выживаемости
TNF-α. Семейство TNF-α. Моноциты, МФ, нейтрофилы, CTL, Th1	П, М	Разнонаправленное влияние. Предиктор поражения лимфатических узлов. Ассоциирован с активацией эффекторных клеток	Нет данных
TGF-β. Суперсемейство факторов роста Семейство TGF	М, П	Предиктор раннего рецидива и метастазирования. Неблагоприятный прогноз в отношении метастазов в лимфатические узлы	Благоприятный прогноз на ранних стадиях. Не благоприятный прогноз при метастатическом поражении

Наиболее изученными цитокинами, связанными с канцерогенезом и прогнозом ТНРМЖ являются: IL- 6, 8, 10, TNF-α и TGF-β. IL-6 - цитокин с широким спектром биологических активностей, осуществляющий «интеграцию» иммунной и нейроэндокринной системы. Основными его источниками являются Т-лимфоциты, МФ, миоциты, эндотелиоциты, фибробласты и опухолевые клетки. В физиологических условиях он играет центральную роль в гемопоэзе, а также в регуляции роста и дифференцировки эндотелиоцитов, кератиноцитов, остеобластов и нейронов. В иммунной системе IL-6 активирует пролиферацию и синтез антител В-лимфоцитами, пролиферацию CTL, стимулирует гранулоцитарный росток кроветворения, а также индуцирует экспрессию острофазных белков в печени. IL-6 является проангиогенным фактором и стимулирует экспрессию гена множественной лекарственной устойчивости. Гиперэкспрессия IL-6 в опухоли и повышение концентрации в периферической крови является не благоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости и рецидивов (J. Immunol. Res. 2020; 2020: 5618786). Ожирение является одним из основных факторов риска РМЖ.

IL-8 относится к семейству хемокинов. Главные продуценты - МФ и эндотелиальные клетки, дополнительные - лимфоциты, нейтрофилы, фибробласты. Индукторы синтеза - провоспалительные цитокины. Основная биологическая функция связана с регуляцией миграции клеток. В процессе канцерогенеза IL-8 может выступать как аутокринный фактор роста, а также стимулировать ангиогенез. IL-8 в сыворотке - не благоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости и раннего рецидива (Acta Histochemika. 2012; 114 (6): 571-576. Breast Cancer Res. 2013; 15 (4): 210).

IL-10 является ключевым регулятором противоопухолевого иммунного ответа. Семейство IL-10 включает, помимо самого цитокина, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26. Несмотря на длительную историю изучения, функции его до конца не ясны, а экспериментальные данные противоречивы. Он был выделен и охарактеризован в 1989 году. Первоначально его назвали «фактор, ингибирующий синтез цитокинов» (CSIF, cytokine synthesis inhibitory factor), однако в дальнейшем стало очевидно, что он обладает также иммуностимулирующими свойствами. У человека основными продуцентами IL-10 являются: Treg, Th0, Th1, Th2, CTL, моноциты, МФ, опухолевые клетки, ТАМ и NK. Свойства IL-10 зависят от фазы взаимодействия опухоли и иммунной системы, концентрации цитокина, а также от локализации его клеток мишеней. В лимфоидных органах реализуются его имуносупрессорные эффекты, а в микроокружении опухоли также и иммуностимулирующие. IL-10 подавляет созревание DC путем редукции экспрессии MHC II, молекул адгезии и цитокинов (IL-12), а также снижая чувствительность рецепторов, реагирующих на «сигналы опасности». DC в микроокружении опухоли сами могут стать источником IL-10, генерируя при этом Treg. IL-10 ингибирует пролиферативную активность и продукцию цитокинов Th1. Высокая сывороточная концентрация IL-10 и высокий уровень экспрессии в ткани - предиктор раннего рецидива (Tzu. Chi. Med. J. 2021; 33 (3): 203-211).

TNF-α относится к семейству фактора некроза опухолей, сформированному на основании сходства строения лигандов и рецепторов. Основные биологические эффекты TNF-α в канцерогенезе связаны с поддержанием перитуморальной воспалительной реакции, усилением проницаемости капилляров и стимуляцией ангиогенеза. В фазе надзора он способствует повышению содержания эффекторных клеток и химиопрепаратов в очаге, а в фазах равновесия и ускользания - прогрессии за счет образования новых сосудов и запуска каскадных реакций хронического воспаления. Роль TNF-α в ТНРМЖ двояка. С одной стороны, он способствует EMT, с другой - активирует противоопухолевые CTL. TNF-α по данным некоторых авторов - предиктор раннего рецидива при ТНРМЖ (BMC Cancer. 2011; 11: 130).

Оценка экспрессии цитокинов в микроокружении и концентрации в крови является наиболее перспективным методом прогнозирования рецидивов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, предложенный группой авторов, которые анализировали взаимосвязь уровня экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток в микроокружении опухоли (CD4, CD8, FOXP3, CD20, CD68, CD163, PD-1, PD-L1, PTEN и STAT1) с отдаленными результатами лечения больных ТНРМЖ (Tavares M.C., Sampaio C.D., Lima G.E. et al. A high CD8 to FOXP3 ratio in the tumor stroma and expression of PTEN in tumor cells are associated with improved survival in non-metastatic triple-negative breast carcinoma // BMC Cancer - 2021. - Vol.21, №1 - P. 901), который взят нами в качестве прототипа.

В исследование были включены больные с не метастатическим (стадии I, II и III) ТНРМЖ, которые лечились в онкологическом центре Кармаго в Бразилии в период с 2002 по 2014 годы. В исследование было включено 76 больных со средним возрастом 48,4 года, у которых были доступны данные биопсии и парафиновые блоки. Характеристика клинической группы отражена в таблице (Таблица 3 - клинико-патологическая характеристика клинической группы, включенной в исследование (N=76)).

Таблица 3.
Параметр	Описание	Число больных	%
Стадия	IA	13	17,1
	IB	2	2,6
	IIA	29	38,2
	IIB	14	18,4
	IIIA	7	9,2
	IIIB	9	11,8
	IIIC	2	2,7
Гистологический тип опухоли	IDC	79	87,5
	ILC	11	12,5
	Метапластический	4	5,3
Гистологическая градация	G1	3	3,9
	G2	27	35,6
	G3	46	60,5
BRCA статус	+	7	9,2
	-	1	1,3
	Не известно	68	89,5
Химиотерапия	Адъювантная	62	81,6
	Неоадъювантная	14	18,4
Ответ на неоадъювантную химиотерапию	Полный ответ	2	14,2
	Частичный ответ	6	42,8
	Прогрессирование	3	21,5
	Не известно	3	21,5
Рецидив	Да	18	23,7
	Нет	57	75
	Не известно	3	21,6
Статус заболевания	Нет признаков опухоли	59	77,6
	Прогрессирование	10	13,2
	Нет данных	7	9,2
Смерть от прогрессирования	Да	11	14,5
	Нет	65	85,5

Интенсивность и характер лимфоидной инфильтрации оценивалась по методике, разработанной Denkert C. и Loi S. с соавторами (J. Clin. Oncol. 2010; 28 (1): 105-113. J. Clin. Oncol. 2013; 31 (7): 860 - 867), и стандартизованной Salgado R. с соавторами (Ann. Oncol. 2015; 26 (2): 259 -271). Исследование биомаркеров проводилось с использованием стандартных алгоритмов оценки экспрессии внутриклеточных и внеклеточных маркеров. Для снижения степени субъективности оценки визуальных данных исследование проводилось двумя опытными патологами в разное время. Исследование проводилось в три этапа. На первом оценивалась экспрессия маркеров в гистологических образцах. На втором проводился корреляционный анализ с целью выявления минимально необходимого набора параметров для дальнейшего исследования. На третьем проводилась оценка взаимосвязи отобранных параметров с отдаленными результатами лечения.

В работе оценивалась экспрессия маркеров B-лимфоцитов (CD20), Т-хелперов (CD4), цитотоксических лимфоцитов (CD8), Т-регуляторных клеток (FOXP3), М1 и М2 субпопуляций макрофагов (CD68, CD163), ко-ингибирующих молекул в строме и опухоли (PD-1, PD-L1), антионкогенов (PTEN) и активаторов транскрипции (STAT). В результате оценки содержания клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры, выяснилось, что образцы ТНРМЖ содержат большое количество обоих субпопуляций макрофагов и лимфоцитов, но слабо инфильтрированы Т - регуляторными клетками (Таблица 4 - частота и распределение опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов и биомаркеров в клетках опухоли и строме).

Таблица 4.
Параметр	Число больных	M, клеток/мм2	SD	% (M)
CD8	76	1513,53	1353,5	-
FOXP3	76	26,37	42,87	-
CD20	76	530,54	1093,47	-
CD4	76	1288,91	1354,23	-
CD163	76	2001,41	1630,75	-
CD68	76	2853,62	2247,43	-
PTEN	76	119,58	48,47	-
pSTAT1	76	119,76	197,67	-
PD1	76	252,59	365,51	-
PD-L1 опухоль	62	-	-	4,53
PD-L1 строма	48	-	-	12,17
TIL	71	-	-	28,34

Корреляционный анализ, проведенный с использованием критерия корреляции Спирмена, выявил сильную положительную корреляционную связь между экспрессией CD4 и CD8, CD68, FOXP3; CD68 и CD163, CD8 и FOXP3, PD-L1 в строме и опухоли; а также умеренные положительные корреляционные связи между CD163 и CD4, FOXP, PD-L1 в строме, отсутствием экспрессии PTEN, а также между FOXP3 и CD8, CD163 (Таблица 5 - корреляционный анализ, включающий опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (%) и биомаркеры в строме и опухолевых клеток, где P - коэффициент корреляции Спирмена).

Таблица 5.
Маркеры	CD20	CD4	CD163	CD8	CD68	FOXP3	PD-L1 строма	PD-L1 опухоль	PD-1	PTEN(-)
TIL, P	0,227	0,143	0,214	0,209	0,163	-0,027	0,35	0,29	0,139	0,072
p	0,057	0,234	0,073	0,08	0,176	0,825	0,02	0,027	0,259	0,55
CD20, P	-	0,049	0,01	-0,001	-0,141	-0,021	0,21	0,213	-0,1	0,01
p	-	0,677	0,933	0,99	0,226	0,858	0,153	0,097	0,378	0,93
CD4, P	-	-	0,419	0,658	0,791	0,52	0,13	0,003	0,046	0,207
p	-	-	0,0002	<0,0001	<0,0001	<0,0001	0,38	0,998	0,6999	0,073
CD163, P	-	-	-	0,263	0,544	0,31	0,234	0,169	0,41	0,07
p	-	-	-	0,022	<0,0001	0,006	0,001	0,152	<0,001	0,551
CD8, P	-	-	-	-	0,604	0,374	0,084	-0,041	-0,031	0,056
p	-	-	-	-	0,001	0,001	0,569	0,753	0,794	0,633
CD68, P	-	-	-	-	-	0,517	0,087	-0,061	0,087	0,249
p	-	-	-	-	-	<0,0001	0,555	0,638	0,465	0,03
FOXP3, P	-	-	-	-	-	-	0,181	-0,278	0,033	0,281
p	-	-	-	-	-	-	0,218	0,029	0,78	0,014
PD-L1 Строма, P	-	-	-	-	-	-	-	0,519	0,188	0,451
p	-	-	-	-	-	-	-	<0,001	0,206	0,001
PD-L1 Опухоль, P	-	-	-	-	-	-	-	-	0,11	0,87
p	-	-	-	-	-	-	-	-	0,399	0,145
PD-1, P	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,042
p	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,726

Авторами сделан вывод, что параметры, характеризующиеся сильной положительной корреляционной связью, обладают сходной прогностической значимостью, что учитывалось на следующем этапе исследования.

На третьем этапе исследователи выявили, что прогностической значимостью в отношении общей выживаемости обладает соотношение CD8/FOXP3. Минимальное значение этого показателя, при котором выявляются различия в отдаленных результатах, составляют 1,34. Максимальных значений разница в общей выживаемости достигается при уровне этого показателя, составляющего 71. В подгруппе, где соотношение CD8/FOXP3>71 пятилетняя выживаемость составила 89%, а при CD8/FOXP3 ≤ 71 - 35%.

Существенным достоинство этого способа по сравнению с аналогами являются: 1) применение стандартизованных методов оценки экспрессии маркеров; 2) использование минимального набора параметров для анализа. Оба подхода позволяют снизить вероятность ошибки при интерпретации результатов.

Недостатком способа, который отмечают сами авторы, является отсутствие предсказательного потенциала в используемых параметрах, что делает невозможным их применение для прогнозирования метастазирования и, как следствие, коррекции тактики лечения.

Технический результат настоящего изобретения состоит в прогнозировании появления отдаленных метастазов у больных трижды негативным раком молочной железы за счет оценки иммунологических параметров в крови и микроокружении опухоли методом проточной цитометрии.

Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем определение в микроокружении опухоли лимфоцитов, экспрессирующих маркеры FOXP3 (Х3) и CD8 (Х4), согласно изобретению, дополнительно в культуре лимфоцитов определяют уровень спонтанной продукции IL-10 (X1) и IL-8 (X2) в пг/мл и абсолютную концентрацию клеток с маркерами LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X5) в крови, затем по полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции:

F1=0,0164 х Х1+0,1407 х Х2+0,0172 х Х3 - 0,1223 х Х4+0,1209 х Х5 - 12,6451;

F2=0,001 х Х1+0,0763 х Х2+0,0964 х Х3+0,3725 х Х4+0,094 х Х5 - 7,9143;

и при F1 ≥ F2 прогнозируют развитие метастазов.

Занимаясь профессионально в течение ряда лет лечением больных ТНРМЖ, мы изучали различные варианты лекарственной терапии, а также фундаментальные и клинические аспекты взаимодействия опухоли и иммунной системы. С 2017 года у всех больных ТНРМЖ мы изучали иммунный статус и содержание иммунокомпетентых клеток в микроокружении опухоли с целью оценки прогностической, предсказательной значимости различных параметров. У больных в крови оценивалось содержание лимфоцитов, их субпопуляций и цитокинов. Анализы проводились в иммунологической лаборатории ФГУЗ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России на лазерном проточном цитометре Cytomics FC 500 (BECKMAN COULTER Inc., USA) с использованием моноклональных антител и расходных материалов компаний BECKMAN COULTER Inc., IMMUNOTECH S.A.S., ООО «Протеиновый контур» и ООО «Цитокин». Спектр исследуемых параметров и их референсные интервалы отражены в таблице. 6 - субпопуляции лимфоцитов периферической крови и в таблице 7 -параметры цитокинового профиля.

Таблица 6.
Фенотип	Субпопуляция лимфоцитов	Референсный интервал (кровь). Относительное содержание (%)	Референсный интервал (кровь). Абсолютное содержание (х 109/л)
CD3+CD16-	Зрелые Т-лимфоциты	52 - 76	950 - 1800
CD3+CD8+	Цитотоксические лимфоциты	23 - 40	450 - 850
CD3+CD4+	Т-хелперы	31 - 46	570 - 1100
CD4+CD8+	Дубль-позитивные Т-клетки	0,1 - 1,1	5 - 15
CD3-CD16+CD56+	Натуральные киллеры	9 - 19	180 - 420
CD3-CD8+;	Активированные натуральные киллеры	1,5 - 6	18 - 150
CD16+CD56+HLA DR+		0 - 5	0 - 120
CD3+CD16+CD56+	TNK - Клетки	0,1 - 8	5 - 200
CD3 -CD19+	В-лимфоциты	6 - 18	150 - 450
CD4+CD25+CD127-FOXP3	Т- регуляторные клетки (Treg)	0,3 - 10	0 - 110
CD3+HLA DR+	Активированные Т-клетки	0 - 5	0 - 120
HLA DR+	Активированные антиген-презентирующие клетки	6 - 22	150 - 550
αβ -Т	Альфа/бета Т - клетки	60 - 80	925 - 1965
γδ - Т	Гамма/дельта Т - клетки	2 - 7	- 115
LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-	Супрессорные клетки миелоидного происхождения	0,2 - 11	0 - 120

Таблица 7.
Цитокин	Референсный интервал
	Спонтанная продукция	Индуцированная продукция	Концентрация в сыворотке
Интерлейкин-1β (IL-1, пг/мл)	0 - 50	1000 - 5000	0 - 50
Интерлейкин-2 (IL-2, пг/мл)	0 - 5	10 - 100	0
Интерлейкин-4 (IL-4, пг/мл)	0 - 50	100 - 400	0 - 50
Интерлейкин-6 (IL-6, пг/мл)	0 - 50	1000 - 3000	0 - 50
Интерлейкин-8 (IL-8, пг/мл)	0 - 100	1000 - 5000	0 - 50
Интерлейкин-10 (IL-10, пг/мл)	0 - 50	100 -400	0 - 50
Интерлейкин-12(IL-12, пг/мл)	0 - 50	100 - 600	0 - 50
Интерферон-α (IFN-α, пг/мл)	0 - 50	100 - 500	0 - 50
Интерферон-γ (IFN-γ, пг/мл)	0 - 50	1000 - 5000	0 - 50
Фактор некроза опухолей-α (TNF-α, пг/мл)	0 - 50	500 - 1500	0 - 50
Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β, пг/мл)	0 - 50	- 1000	0 - 20
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF, пг/мл)	0 - 20	500 - 1500	0 - 50

Уровень лимфоцитов и их субпопуляций оценивался в периферической крови. Анализ цитокинового профиля проводился в два этапа. На первом этапе определялась сывороточная концентрация. На втором проводилось исследование в культуре клеток, где определялся их потенциал путем оценки спонтанной и индуцированной продукции цитокинов. Оценка лимфоцитов, их субпопуляций и цитокинового профиля проводилась в одно и то же время суток, чтобы избежать влияния циркадных колебаний.

В микроокружении опухоли иммунологический профиль оценивался однократно, что связано с доступностью материала для анализа. Референсных интервалов для определения концентрации иммунокомпетентных клеток, а также концентрации, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в микроокружении в настоящее время не существует.

Опухолевый материал объемом около 10 мм³ помещался в два флакона, в одном из которых находилась питательная среда DMEM-F12 для определения спонтанной продукции, а в другом - та же питательная среда с комплексом поликлональных активаторов (фитогемагглютинин 4 мкг/мл, конканавалин А 4 мкг/мл, липополисахарид 2 мкг/мл). Далее происходило инкубирование при 37°С в течение 72 часов. Клетки опухоли осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. После осаждения клеток иммуноферментным методом определяли концентрацию цитокинов и факторов роста.

Алгоритм разработки метода дифференциальной диагностики включал три этапа. На первом этапе проводился однофакторный анализ, где в качестве переменных были включены все иммунологические параметры (таблицы 6, 7), выявлялась взаимосвязь отдельных компонентов с появлением метастазов у больных с не резектабельным трижды негативным раком молочной железы. На втором проводился многофакторный анализ, в котором исключались взаимовлияющие компоненты. Результаты однофакторного и многофакторного анализа приведены в таблице 8 - иммунологические параметры, связанные с появлением отдаленных метастазов.

Таблица 8.
Однофакторный анализ	Многофакторный анализ
IL-10 (спонтанная продукция в культуре лимфоцитов, спонтанная продукция в микроокружении опухоли)	IL-10 (спонтанная продукция в культуре лимфоцитов)
IL-8 (спонтанная продукция в культуре лимфоцитов, индуцированная продукция в культуре лимфоцитов, спонтанная продукция в микроокружении опухоли, концентрация в сыворотке)	IL-8 (спонтанная продукция в культуре лимфоцитов)
CD4+CD25+CD127-FoxP3 (T-регуляторные клетки в крови и микроокружении опухоли)	CD4+CD25+CD127-FoxP3 (T-регуляторные клетки в микроокружении опухоли)
CD4+CD8+(цитотоксические лимфоциты в микроокружении опухоли и в крови)	CD4+CD8+(цитотоксические лимфоциты в микроокружении опухоли)
LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (супрессорные клетки миелоидного происхождения в микроокружении опухоли и в крови)	LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (супрессорные клетки миелоидного происхождения в крови)
IL-4 (спонтанная продукция в микроокружении опухоли и культуре лимфоцитов, индуцированная продукция в микроокружении опухоли и культуре лимфоцитов)
TNF-α (спонтанная продукция в микроокружении опухоли, индуцированная продукция в культуре лимфоцитов)
γδ - Т лимфоциты (гамма/дельта в крови)
IL-6 (спонтанная продукция в микроокружении опухоли, индуцированная продукция в микроокружении опухоли и культуре лимфоцитов, концентрация в сыворотке)
IL-12 (спонтанная продукция в микроокружении опухоли и культуре лимфоцитов)

На третьем этапе проводился дискриминантный анализ с использованием параметров, выявленных при многофакторном.

Спонтанная продукция IL-10 (X1) и IL-8 (X2) в культуре лимфоцитов, Т-регуляторные клетки в микроокружении опухоли (FOXP3 (X3)), цитотоксические клетки в микроокружении опухоли (CD8 (X4)), супрессорные клетки миелоидного происхождения в крови (LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X5)) были использованы в качестве переменных для проведения дискриминантного анализа. По полученным данным были созданы линейные классификационные функции:

F1=0,0164 х Х1+0,1407 х Х2+0,0172 х Х3 - 0,1223 х Х4+0,1209 х Х5 - 12,6451;

F2=0,001 х Х1+0,0763 х Х2+0,0964 х Х3+0,3725 х Х4+0,094 х Х5 - 7,9143, где F1 соответствует высокой вероятности появления метастазов, а F2 соответствует высокой вероятности появления метастазов, а вероятность их появления оценивают по наибольшему значению функции.

Для разработки метод были использованы данные 43 пациенток с ТНРМЖ, находившихся под наблюдением с 2017 по 2022 годы, для валидации - 21 пациентки, получавших лечение в период 2020 - 2022 годов (таблица 9 - частота прогнозируемого и наблюдаемого появления метастазов у пациенток с трижды негативным раком молочной железы в группах разработки и валидации).

Таблица 9.
	Группа разработки (43 пациентки)			Группа валидации (21 пациентка)
	Прогноз	Наблюдение	% совпадений	Прогноз	Наблюдение	% совпадений
Появление отдаленных метастазов в течение четырех недель после прогноза	28	28	100	14	13	92,9%
Отсутствие отдаленных метастазов в течение четырех недель после прогноза	15	15	100	7	8	87,5%

Лишь у одной пациентки из группы валидации предсказанное появление метастазов не совпало с наблюдаемым. Точность положительного прогноза составила 92,9%, отрицательного - 87,5%.

Сущность способа заключатся в следующем.

Пациентке с иммуногистохимически подтвержденным ТНРМЖ в микроокружении опухоли методом проточной цитометрии определяют уровень экспрессии маркеров Т-регуляторных клеток (FOXP3 (Х3)) и цитотоксических лимфоцитов (CD8 (Х4)), в крови - абсолютную концентрацию супрессорных клеток миелоидного происхождения (LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X5)), а также уровни спонтанной продукции IL-10 (X1) и IL-8 (X2) в культуре лимфоцитов, затем по полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции:

F1=0,0164 х Х1+0,1407 х Х2+0,0172 х Х3 - 0,1223 х Х4+0,1209 х Х5 - 12,6451;

F2=0,001 х Х1+0,0763 х Х2+0,0964 х Х3+0,3725 х Х4+0,094 х Х5 - 7,9143;

и при F1 ≥ F2 прогнозируют развитие метастазов.

Далее пациентка получает лечения согласно принятым стандартам. Данные, полученные при использовании предлагаемого метода, могут быть учтены при коррекции тактики наблюдения и лечения по решению лечащего врача или врачебной комиссии.

К настоящему времени предложенный способ прошел клиническую апробацию у 64 пациенток ТНРМЖ: данные 43 пациенток использованы для разработки метода и 21 - для валидации. Лишь у одной пациентки из группы валидации прогноз не совпал с наблюдением.

Способ по сравнению с известными аналогами имеет ряд существенных преимуществ:

Позволяет с использованием четкого алгоритма прогнозировать возникновение отдаленных метастазов.

Основан на использовании современных достижений молекулярной биологии и клеточной иммунологии.

Позволяет индивидуализировать лечение с учетом полученных данных о вероятности прогрессирования.

Способ прогнозирования развития метастазов у больных не резектабельным трижды негативным раком молочной железы разработан в группе молекулярно-биологического прогнозирования и индивидуализации лечения ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» МЗ РФ и к настоящему времени прошел клиническую апробацию у 64 пациенток с положительным результатом.

Claims (3)

1. Способ прогнозирования развития отдаленных метастазов в ближайшие четыре недели у больных нерезектабельным трижды негативным раком молочной железы, включающий определение в микроокружении опухоли лимфоцитов, экспрессирующих маркеры FOXP3 (Х3) и CD8 (Х4), определение в культуре лимфоцитов уровня спонтанной продукции IL-10 (X1) и IL-8 (X2) в пг/мл и определение в крови абсолютной концентрации клеток с маркерами LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X5), где по полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции:
2. F1 = 0,0164 × Х1 + 0,1407 × Х2 + 0,0172 × Х3 - 0,1223 × Х4 + 0,1209 × Х5 – 12,6451;
3. F2 = 0,001 × Х1 + 0,0763 × Х2 + 0,0964 × Х3 + 0,3725 × Х4 + 0,094 × Х5 – 7,9143; и при значении F1 ≥ F2 прогнозируют развитие отдаленных метастазов в ближайшие четыре недели.