CN112567052A - 预后和治疗响应预测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于预测哺乳动物癌症患者对抗癌免疫治疗的治疗响应的方法，所述方法包括：a)测量获自所述患者的肿瘤的样品中至少2种以下癌症促进基因的基因表达：PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A；b)测量获自所述患者的肿瘤的样品中至少2种以下癌症抑制基因的基因表达：CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A；c)计算所述至少2种癌症促进基因的基因表达与所述至少2种癌症抑制基因的基因表达的比率；以及d)基于在步骤c)中计算的基因表达比率对所述患者的治疗响应和/或预后作出预测。还提供了用于对患者进行分层和用于治疗患者的相关方法，包括利用免疫检查点阻断治疗。

Description

预后和治疗响应预测方法

本申请要求于2018年6月21日提交的GB1810190.7的优先权，出于所有目的，其内容和要素通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于预测癌症患者，特别是接受免疫检查点阻断治疗的患者对癌症治疗的响应和总体存活的材料和方法。

背景技术

癌症诱导炎症并且肿瘤部位的炎性细胞可支持癌症进展的概念已得到充分地确认(Coussens et al.，2013；Hanahan和Weinberg，2011；Mantovani et al.，2008)。众所周知，常见于临床上明显的肿瘤中的数种细胞和分子炎症介质具有促肿瘤发生作用，并且在临床前模型和癌症患者二者中与侵袭性和入侵性肿瘤的许多特征相关。这些包括普遍的肿瘤浸润性白细胞例如巨噬细胞、中性粒细胞、未成熟的骨髓细胞或调节性T细胞，以及由这些和其他白细胞、基质细胞或直接由癌细胞产生的分子。IL-6、IL-8、CCL2、CXCL1或VEGF是具有可促进癌症生长和扩散的多效性作用的可溶性因子的经典实例(Coussens et al.，2013；Mantovani et al.，2008)。

肿瘤部位的炎症也可具有抗癌作用，部分地通过促进癌细胞的免疫识别和消除。特别地，细胞毒性T细胞(CTL)在临床前癌症模型中被认为是抗肿瘤效应物，并且其肿瘤内丰度与改善的患者结局和对癌症治疗的响应相关(Binnewies et al.，2018；Fridman etal.，2012；Galon，2006；Thorsson et al.，2018)。因此，更有利的预后还与CTL化学引诱物(如CXCL9或CXCL10)或促进I型免疫、CTL分化和效应物功能的细胞因子(例如IL-12或者I和II型干扰素(IFN))的高肿瘤内水平相关(Gajewski et al.，2013；Spranger和Gajewski，2018；Vesely et al.，2011)。肿瘤微环境(TME)中这些因子的水平可以根据整体系统和/或局部炎性状态而变化，并且其综合作用有助于抗肿瘤免疫应答的强度和程度。除传统的辅助CD4⁺和细胞毒性CD8⁺T细胞外，进一步的证据表明，通过其他炎性细胞的肿瘤浸润同样有利于免疫攻击，并且与良好的预后相关。自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、固有类淋巴细胞和Batf3依赖性常规I型树突细胞(cDC1)构成了通常与改善的结局相关的免疫亚群中的一些(

et al.，2018；Broz et al.，2014；Gentles et al.，2015；Mittal et al.，2017；Morvan和Lanier，2016；Ruffell et al.，2014；Sánchez-Paulete et al.，2016；Sprangeret al.，2015；2017)。这在自发的和治疗诱导的抗肿瘤响应如施用免疫检查点抑制剂引起的那些中都是如此，施用免疫检查点抑制剂是彻底改变癌症治疗、在多种癌症类型中引发有益响应(包括长期缓解)的治疗方式(Ribas和Wolchok，2018)。尤其是在免疫检查点阻断(ICB)治疗中，所选免疫细胞或炎性介质的丰度与治疗响应正相关或负相关(Ayers etal.，2017；De Henau et al.，2016；Herbst et al.，2014；Roh et al.，2017；Rooney etal.，2015；Tumeh et al.，2014)。

然而，在癌症发生和发展过程中拮抗的癌症促进或癌症抑制炎性TME是如何建立的尚不清楚。而且，调节炎性浸润的不同要素的质量和数量的信号和途径没有很好地确定。增进我们对这些过程的理解具有重大的临床相关性，因为其可以增强我们预测治疗响应的能力，并进一步提供有吸引力的治疗靶标以改善抗癌治疗的效力。

在多种癌症中上调并且涉及恶性生长的多个方面(Wang和Dubois，2010)的环氧合酶(COX)-2/前列腺素E₂(PGE₂)途径构成了肿瘤的炎性表型的候选支点(fulcrum)。在黑素瘤、结直肠癌或乳腺癌小鼠模型中，该途径在加速癌症促进炎症和实现免疫逃逸中起主要作用(Zelenay et al.，2015)。因此，其在癌细胞中的遗传消融削弱了其在免疫活性宿主中形成进行性肿瘤的能力，但是在免疫缺陷宿主中则没有。在一些模型中显示出不变的完全缓解的肿瘤生长控制取决于cDC1和适应性免疫，并且伴随着COX-2驱动的肿瘤内免疫谱的移动，其特征在于已知癌症促进和癌症抑制炎性因子的水平明显改变(Zelenay et al.，2015)。

McDermott et al.，Nature Medicine，2018，Vol.24，pp.749-757描述了在肾细胞癌中对单独的或与贝伐单抗(bevacizumab)联合的阿特珠单抗(atezolizumab)相对于舒尼替尼的响应的临床活性和分子相关性。探索性生物标志物分析表明，肿瘤突变和新抗原负荷与无进展存活(progression-free survival，PFS)不相关。血管生成、T效应物/IFN-γ应答和骨髓炎性基因表达标记在治疗内和治疗之间与PFS强烈且差异相关。

Mariathasan et al.，Nature，2018，Vol.554，pp.544-548描述了尿路上皮癌中TGFβ介导的对PD-L1阻断的肿瘤响应的减弱。对治疗的响应与CD8+T效应细胞表型相关，并且在甚至更大程度上与高的新抗原或肿瘤突变负荷相关。缺乏响应与成纤维细胞中转化生长因子β(TGFβ)信号转导的标记相关。这尤其发生在患有这样的肿瘤的患者中，所述肿瘤显示从肿瘤实质中排除了CD8+T细胞，而相反地在富成纤维细胞和胶原蛋白的肿瘤周围基质中发现；这是患有转移性尿路上皮癌的患者中的常见表型。

尽管先前描述的癌症预测模型显示出希望，但是对于能够预测癌症患者的治疗响应和/或存活的其他模型仍然存在未满足的需求。本发明寻求满足这些需求并提供进一步的相关优点。

发明概述

本发明人使用通用小鼠癌症模型以确定为随后的T细胞依赖性肿瘤生长控制打好基础的事件和关键免疫细胞亚群的时间顺序。NK细胞被确定为是在cDC1和CTL介导的肿瘤根除之前建立癌症抑制性微环境的主要参与者。基于具有明确的进行性或消退性命运的这些鼠肿瘤的免疫基因谱分析，本发明人获得了COX-2调节的炎性基因标记(signature)，其显示出作为总患者存活时间和对抗PD-1/PD-L1治疗的响应的生物标志物的显著能力。实际上，发现本文所述的COX-2比率优于CD8⁺T细胞(Spranger et al.，2015)、IFN-γ相关(Ayers et al.，2017)和cDC1基因标记(

et al.，2018)，强调了“COX-2标记”的价值以及在单个生物标志物中整合促肿瘤发生和抗肿瘤发生因子的益处。

因此，在第一方面，本发明提供了用于预测哺乳动物癌症患者对抗癌免疫治疗的治疗响应的方法，所述方法包括：

a)测量获自所述患者的肿瘤的样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种(例如全部)以下癌症促进基因的基因表达：PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A；

b)测量获自所述患者的肿瘤的样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种(例如全部)以下癌症抑制基因的基因表达：CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A；

c)计算所述至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种癌症促进基因的基因表达与所述至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种癌症抑制基因的基因表达的比率(“COX-2比率”)；以及

d)基于在步骤c)中计算的基因表达比率对所述患者的治疗响应和/或预后作出预测。

在一些实施方案中，所述比率是全部所述癌症促进基因PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A与全部所述癌症抑制基因CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A的基因表达的比率。

如本文中详细描述的，发现所述癌症促进基因具有与PTGS2表达、肿瘤生长和对免疫治疗的不良治疗响应正相关的肿瘤基因表达。相反地，发现所述癌症抑制基因具有与PTGS2表达、肿瘤生长和对免疫治疗的不良治疗响应负相关的肿瘤基因表达。本发明人发现，相对于仅基于癌症促进基因或仅基于癌症抑制基因的预测，通过形成比率来整合这些相反信号增强了基因标记的预测能力。如本领域技术人员将意识到的，用癌症促进基因的基因表达作为分子并且用癌症抑制基因的基因表达作为分母形成比率意味着，较高的比率指示更差的对免疫治疗的响应和更差的存活时间。然而，比率可以替代地用癌症抑制基因的基因表达作为分子并且用癌症促进基因的基因表达作为分母来形成。在这样的替代情况下，较低的比率指示更差的对免疫治疗的响应和更差的存活时间。

在一些实施方案中，所述比率根据下式计算：

其中n_p是所述癌症促进基因的数目并且nn是所述癌症抑制基因的数目，G_i ^pos和G_i ^neg分别是在(i)单位值区间(interval of unitary values)内的正相关和负相关基因，(e)表示基因表达值，表示为log2每百万计数(counts per million，CPM)。

在一些实施方案中，G_i ^pos(e)＝阳性基因的log2转化的每百万计数(Reads PerKilobase Million(FPKM))的平均表达，并且G_i ^neg(e)＝阴性基因的log2转化的每百万计数(FPKM)的平均表达。

在一些实施方案中，通过将log2转化的每百万计数(或FPKM)的G_i ^pos(e)平均表达除以G_i ^neg(e)平均表达以得到癌症促进基因和癌抑制基因的比率来计算COX2比率。

表达值可以以例如RPKM(Reads Per Kilobase Million)、FPKM(Fragments PerKilobase Million)、CPM(每百万计数)和/或nanostring计数中的任一种来表示。

在一些实施方案中，所述基因中每一种的表达水平是归一化的基因表达水平，例如，相对于一种或更多种管家基因的基因表达归一化。在一些实施方案中，基因表达水平可以是对数转化的(例如，log2转化的)。

在一些实施方案中，可以将在步骤c)中计算的基因表达比率以患有与所述癌症患者相同类型癌症(并且任选地年龄匹配的、自诊断起的时间匹配的和/或疾病阶段匹配的)的癌症患者样品组群的中位基因表达比率作为参照或者与后者进行比较，所述中位基因表达比率用作阈值，并且其中：

计算的基因表达比率高于所述阈值(例如1.1倍、1.2倍或1.5倍或更高)指示所述癌症患者对所述抗癌免疫治疗具有不良治疗响应的风险高和/或与癌症患者的所述样品组群的中位存活时间相比具有更短存活时间的风险高；并且

计算的基因表达比率低于所述阈值(例如0.9倍、0.8倍或0.7倍或更低)指示所述癌症患者对所述抗癌免疫治疗具有不良治疗响应的风险低和/或与癌症患者的所述样品组群的中位存活时间相比具有更短存活时间的风险低。

在一些实施方案中，所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分(Z-score)和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中给定基因的平均表达，并且σ是训练集中给定基因的基因表达的标准偏差；以及

从所述至少2种癌症促进基因的z评分中减去所述至少2种癌症抑制基因的z评分。

在一些实施方案中，所述比率通过以下计算：

计算包含多个癌症对象的训练集中所述至少两种癌症促进基因和所述至少两种癌症抑制基因中每一种的中位基因表达值，

对于所述基因中的每一种，当所述癌症患者的表达值大于训练集中该基因的中位值时，赋予+1值，

将癌症抑制基因评分相加，并且将癌症促进基因评分相加，以及

从总癌症促进基因评分中减去总癌症抑制基因评分，之前任选地先进行归一化以分别考虑癌症抑制基因的数目和癌症促进基因的数目。例如，如果癌症促进(CP)标记具有10种基因并且癌症抑制(CI)标记具有15种基因，则可以将CP标记评分乘以15/10，以将其相对于较高的CI基因数目进行归一化。

在一些实施方案中，所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中给定基因的平均表达，并且σ是训练集中给定基因的基因表达的标准偏差；

对于所述基因中的每一种，当z评分大于0.1时赋予+1值，当z评分小于-0.1时赋予-1值，并且当z评分在0.1与-0.1之间时赋予0值；

将癌症抑制基因赋予值相加，并且将癌症促进基因赋予值相加，以及

从总癌症促进基因赋予值中减去总癌症抑制基因赋予值。

在一些实施方案中，所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中给定基因的平均表达，并且σ是训练集中给定基因的基因表达的标准偏差；

对于所述基因中的每一种，当z评分大于0.3时赋予+1值，当z评分小于-0.3时赋予-1值，并且当z评分在0.3与-0.3之间时赋予0值；

将癌症抑制基因赋予值相加，并且将癌症促进基因赋予值相加，以及

从总癌症促进基因赋予值中减去总癌症抑制基因赋予值。在一些实施方案中，所述方法包括进行归一化以分别考虑癌症抑制基因的数目和癌症促进基因的数目。例如，如果癌症促进(CP)标记具有10种基因并且癌症抑制(CI)标记具有15种基因，则可以将CP标记评分乘以15/10，以将其相对于较高的CI基因数目进行归一化。

在一些实施方案中，所述方法还包括评估可能为COX-2比率的预测能力增加益处的其他肿瘤特征，例如癌症患者的肿瘤负荷和/或新抗原流行率。

在一些实施方案中，癌症可以是实体瘤。特别地，癌症可以是黑素瘤(例如转移性黑素瘤)、肾癌(例如肉瘤样或透明细胞肾细胞癌)或膀胱癌(例如转移性尿路上皮癌)。如本文中所述，在涉及黑素瘤、膀胱癌和肾细胞癌的数据集中，发现COX-2比率与治疗响应结果密切相关。无论两种基因标记如何计算和组合在一起，COX-2比率都是预测性的，所述方法同样能够区分具有不同临床响应和总体存活的患者。发现当所述方法与典型的临床参数(例如分期)组合时，以及当与已公开的基因组和转录物组生物标志物(例如肿瘤突变负荷、PD-L1免疫组织化学和其他基因标记)组合时，所述方法在多种组群中保持了独立的预测和预后能力。

在某些实施方案中，当在步骤c)中计算的基因表达比率指示癌症患者被预测为响应于抗癌免疫治疗时，所述方法可还包括选择所述癌症患者以进行抗癌免疫治疗。特别地，所述抗癌免疫治疗可以包括免疫检查点阻断治疗。示例性的免疫检查点阻断治疗包括程序性死亡-1(PD-1)阻断、程序性死亡配体1(PD-L1)阻断和/或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)阻断。被认为是免疫检查点阻断治疗的试剂(例如单克隆抗体)的实例包括纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)和/或伊匹单抗(Ipilimumab)。

在第二方面，本发明提供了根据多个癌症患者的该方法预测的抗癌免疫治疗响应来对所述多个癌症患者进行分层的方法，所述方法包括对所述多个癌症患者中的每一个实施本发明第一方面的方法。

在第三方面，本发明提供了用于预测哺乳动物癌症患者对抗癌免疫治疗的治疗响应的计算机实施方法，所述方法包括：

a)提供包含先前在获自所述患者的肿瘤的样品中测量的至少2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种(例如全部)以下癌症促进基因的表达水平的基因表达数据：PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A；

b)提供包含获自所述患者的肿瘤的样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种(例如全部)以下癌症抑制基因的表达水平的基因表达数据：CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A；

c)计算所述至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种癌症促进基因的基因表达与所述至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种癌症抑制基因的基因表达的比率；

d)将来自步骤c)的计算的比率与来源于患有与所述癌症患者相同类型癌症的癌症患者样品组群的参考中位基因表达比率进行比较；以及

e)基于在步骤d)中进行的比较来对所述癌症患者的治疗响应和/或预后作出预测。

在一些实施方式中，基因表达数据可以已预先确定和/或可以通过从易失性或非易失性计算机存储器或数据存储(包括云存储)中检索来提供。

在一些实施方案中，所述比率是全部所述癌症促进基因PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A与全部所述癌症抑制基因CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A的基因表达的比率。

在一些实施方案中，所述比率根据下式计算：

其中n_p是所述癌症促进基因的数目并且nn是所述癌症抑制基因的数目，G_i ^pos和G_i ^neg分别是在(i)单位值区间内的正相关和负相关基因，(e)表示基因表达值，表示为log2每百万计数(CPM)。

在一些实施方案中，G_i ^pos(e)＝阳性基因的log2转化的每百万计数(Reads PerKilobase Million(FPKM))的平均表达，并且G_i ^neg(e)＝阴性基因的log2转化的每百万计数(FPKM)的平均表达。

在一些实施方案中，通过将log2转化的每百万计数(或FPKM)的G_i ^pos(e)平均表达除以G_i ^neg(e)平均表达以得到癌症促进基因与癌抑制基因的比率来计算COX2比率。

表达值可以以例如RPKM(Reads Per Kilobase Million)、FPKM(Fragments PerKilobase Million)、CPM(每百万计数)和/或nanostring计数中的任一种来表示。

在一些实施方案中，所述基因中每一种的表达水平是归一化的基因表达水平和/或对数转化的(例如，log2转化的)基因表达水平。

在一些实施方案中，如针对本发明第一方面的任何实施方案所限定地来计算所述比率。

在第四方面，本发明提供了在哺乳动物患者中治疗癌症的方法，其包括：

(a)实施本发明第一方面的方法；

(b)确定在步骤c)中计算的基因表达比率指示癌症患者被预测为响应于抗癌免疫治疗；以及

(c)向有此需要的患者施用免疫治疗(例如免疫检查点阻断治疗)。

在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断治疗包括程序性死亡-1(PD-1)阻断、程序性死亡配体1(PD-L1)阻断和/或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)阻断。

在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断治疗包括用治疗有效量的纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗和/或伊匹单抗进行的治疗。

根据本发明的任何方面，在一些实施方案中，免疫检查点阻断治疗可以与抗血管生成治疗例如抗血管内皮生长因子(抗VEGF)治疗(例如贝伐单抗)组合。如本文中详细示出的(参见例如图11G和11H)，发现在用抗PD-L1抗体与抗VEGFA抗体的组合进行治疗的组中，在非响应者(NR)与响应者(R)之间COX-IS具有显著差异。

根据本发明的任何方面，对象可以是人、伴侣动物(例如狗或猫)、实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、猪或非人灵长类)、家养或农场动物(例如猪、牛、马或羊)。优选地，对象是人患者。在一些情况下，患者可以是多个患者。特别地，本发明的方法可用于将一组患者基于其基因表达谱分层(例如用于临床试验)为高和低风险亚组或者高、中和低风险亚组。

现在将参照附图通过实例而非限制的方式描述本发明的实施方案。然而，鉴于本公开内容，本发明的多种其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许的或被指出要明确避免的。在下面并参考所附实例和附图更详细地描述本发明的这些和另一些方面和实施方案。

附图简述

图1：癌细胞固有COX的消融改变了所选固有免疫细胞亚群的肿瘤内积聚。(A)在免疫活性小鼠中sc注射的Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX-2Braf^V600E黑素瘤细胞(1×10⁵)的肿瘤生长谱。(B)上清液中的PGE₂水平以及Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX-2Braf^V600E黑素瘤细胞中的COX-2蛋白质表达。(C)细胞注射(2×10⁶，sc)之后4天分析的Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX Braf^V600E黑素瘤的肿瘤重量。(D和E)Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX-2 Braf^V600E黑素瘤注射(2×10⁶个细胞，sc)之后4天通过流式细胞术分析的肿瘤浸润。显示了肿瘤内中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)(D)和NK细胞(NK1.1⁺)(E)的频率和数目。细胞注射之后4天收获的Ptgs^+/+和Ptgs^-/-黑素瘤中中性粒细胞(F)和NK细胞(G)的免疫荧光分析。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，配对(A)或未配对(C至G)Student t检验。

图S1：COX的遗传消融改变了固有免疫细胞的肿瘤内积聚。(A)代表性门控策略。(B至F)Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX Braf^V600E黑素瘤注射(2×10⁶，sc)之后4天通过流式细胞术分析的肿瘤浸润。显示了肿瘤内单核细胞(CDllb^-Ly6C^-)(B)、巨噬细胞(CD11b⁺F4/80⁺Ly6G^-Ly6C^-)(C)、嗜酸性粒细胞(D)、CD11c⁺MHC II⁺细胞(E)和cDC₁(E)的频率和数目。(G)在肿瘤细胞接种(2×10⁶，sc)之后指定的时间点，户tgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤肿瘤中中性粒细胞(左图)和NK细胞(右图)积聚的动力学。(H)肿瘤细胞接种(1×10⁵，sc)之后第30天的肿瘤浸润白细胞的频率。频率显示为亲本门(parental gate)的百分比。从CD45⁺细胞中门控出中性粒细胞、NK细胞、CD3⁺细胞和CD11c⁺MHCII⁺细胞；从CD3⁺细胞门控CD8⁺T细胞，并且从CD11c⁺MHCII⁺细胞门控cDC1。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，未配对Student t检验。

图2：TME内中性粒细胞和NK细胞积聚受癌细胞固有COX活性的调节，而不依赖于肿瘤类型。(A)上清液中的PGE₂水平以及Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX-2 MC38结直肠癌细胞中的COX-2蛋白质表达。(B)免疫活性Rag1^-/-和Batf3^-/-小鼠中s.c.注射的Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX MC38结直肠癌细胞(1×10⁵)的肿瘤生长谱。(C)细胞注射(2×10⁶，sc)之后4天分析的Ptgs^+/+、Ptgs^-/-MC38结直肠癌(红色)、4T1乳腺癌(绿色)和CT26结直肠癌(蓝色)的肿瘤重量。(D)Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX MC38结直肠癌(红色)、Ptgs^+/+和Ptgs^-/-4T1乳腺癌(绿色)以及Ptgs^+/+和Ptgs^-/-CT26结直肠癌(蓝色)细胞注射(2×10⁶，s.c.)之后4天通过流式细胞术分析的肿瘤浸润。显示了肿瘤内中性粒细胞(上图)和NK细胞群(下图)的频率。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，配对(B)或未配对(C和D)Student t检验。

图S2：TME内中性粒细胞和NK细胞的积聚受COX活性控制，而不依赖于肿瘤类型。Ptgs^+/+、Ptgs^-/-和Ptgs^-/-+COX-2MC38结直肠癌(红色)、Ptgs^+/+和Ptgs^-/-4T1乳腺癌(绿色)以及Ptgs^+/+和Ptgs^-/-CT26结直肠癌(蓝色)细胞注射(2×10⁶，sc)之后4天通过流式细胞术分析的肿瘤浸润。显示了总浸润白细胞(A)和分析的所有其他固有免疫细胞群(B)的频率。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，未配对Student t检验。

图3：NK细胞耗竭消除了自发的和ICB诱导的肿瘤生长控制。NK细胞耗竭之后免疫活性小鼠中Ptgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤(A)和MC38结直肠癌(D)肿瘤(2×10⁶个细胞，sc)中的NK细胞和中性粒细胞频率。肿瘤细胞注射(2×10⁶个细胞，sc)之后4天分析的Ptgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤(B)和MC38结直肠癌(E)的肿瘤重量。接受耗竭NK细胞的抗体的免疫活性小鼠中Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤(C)和MC38结直肠癌(F)细胞(1×10⁵个细胞，sc)的肿瘤生长谱。(G)在Ragl^-/-或Batf3^-/-小鼠中，接受耗竭NK细胞、CD4⁺细胞、CD8-细胞的抗体的免疫活性小鼠中接种的Ptgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤细胞(1×10⁵个细胞，sc)的肿瘤生长谱。(H)细胞接种之前一天(青绿色)或之后七天(蓝色)接受耗竭NK细胞的抗体的免疫活性小鼠中，Ptgs^-/-Bra^V600E黑素瘤细胞的个体生长谱的比较。用载剂(黑色)、抗PD-1(200μgi.p./每周两次)+塞来昔布(每天30mg/kg)(红色)或在耗竭NK细胞的小鼠中抗PD-1+塞来昔布(蓝色)处理的免疫活性小鼠中，Ptgs^+/+Braf^V600E黑素瘤细胞(1×10⁵，sc注射)的(I)肿瘤生长谱和(J)肿瘤直径(第20天)。(K)抗PD-1+塞来昔布处理的小鼠相对于抗PD-1+塞来昔布处理/NK细胞耗竭的小鼠的存活分析。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，配对(C、F和G)或未配对(A、B、D、E和J)Student t检验。^**p＜0.01，^***p＜0.001，对数秩检验(K)。

图S3：NK细胞耗竭不会改变肿瘤中其他固有免疫群的积聚。(A)接受抗GR-1抗体的小鼠中在细胞移植之后4天分析的黑素瘤肿瘤中的肿瘤重量、总白细胞、中性粒细胞和NK细胞频率。(B)接受抗GR-1抗体的小鼠中在细胞移植之后4天分析的黑素瘤肿瘤中的单核细胞(CD11b⁺Ly6C⁺)、TAM(CD11b⁺F4/80⁺Ly6G^-Ly6C^-)、CD11c⁺MHC II⁺细胞和cDC₁频率。(C)接受耗竭NK细胞的抗体的小鼠中在细胞移植之后4天分析的Ptgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤(黑色)和MC38结直肠癌(红色)的单核细胞、TAM、CD11c⁺MHC II⁺细胞和cDC₁频率。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，未配对Student t检验。

图4：NK细胞驱动TME向I型免疫重编程。(A)NK细胞耗竭之后通过RT-PCR对本体Ptgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤肿瘤的分析。在细胞接种之后4天对肿瘤进行分析。显示了与癌症促进(红色)和抑制炎症(蓝色)相关的标志物。数据相对于hprt表达，并且在热图中显示为行z评分。(B和C)通过RT-PCR对来自NK细胞耗竭(N＝9)、Rag1^-/-(N＝9)和Batf3^-/-(N＝9)小鼠的Ptgs^+/+(N＝12)和Ptgs^-/-(N＝12)Braf^V600E黑素瘤肿瘤中的癌症抑制基因(B)、cd3e和cDC1相关分子(C)的分析。数据相对于hprt，根据Ptgs^+/+肿瘤的平均表达归一化，并且表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，未配对Student t检验。所有的比较都是相对于Ptgs^-/-肿瘤。(D)NK细胞耗竭之后来自Ptgs^+/+和Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤肿瘤的cDCl上DC活化标志物CD40和CD86表达的FACS分析以及cDCl频率。数据表示为平均值±SEM。^***p＜0.001，未配对Student t检验。

图5：COX-2表达在人癌症中区分癌症促进与癌症抑制炎症。(A)TCGA数据集中PTGS2相对于NK细胞驱动的小鼠源性炎性基因标记的相关性分析：LUAD(n＝522)、HNSC(n＝530)、TN_BRCA(n＝320)、UCEC(n＝548)、MESO(n＝87)、P_SKCM(n＝119)、KIRC(n＝538)、M_SKCM(n＝360)、LUSC(n＝504)、STAD(n＝295)、ESCA(n＝186)、PDAC(n＝186)、BLCA(n＝413)、HER2_BRCA(n＝184)、LAML(n＝200)、ER_BRCA(n＝1165)、PRAD(n＝499)、COAD(n＝633)、LIHC(n＝442)和UVMM(n＝80)。热图显示了PTGS2与所指出的基因之间的正(红色)或负(蓝色)皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)。(B)LUAD和HNSC数据集中COX-2标记的相关性图。显示了各个基因的皮尔逊系数和p值。(C)LUAD和HNSC数据集中PTGS2与中性粒细胞或NK细胞标记(参见方法)之间的相关性分析。

图6：COX-2标记在人癌症中与患者预后和免疫细胞肿瘤浸润组成密切相关。(A)根据COX-2比率分层的LAUD(n＝522)、HNSC(n＝530)、TN_BRCA(n＝320)和M_SKCM(n＝360)患者的存活分析。Kaplan-Maier图数据解析为高(红色基因/蓝色基因)比率相对于低(红色基因/蓝色基因)比率表达者。通过对数秩(Mantel-Cox)检验比较患者总体存活。(B)COX-2标记中包含的每种基因的个体贡献的分析，以及与先前公开的标记的比较。(C和D)LAUD(n＝522)、HNSC(n＝530)、TN_BRCA(n＝320)和M_SKCM(n＝360)数据集中的高和低COX-2比率患者中免疫细胞分数(immune cell fraction)的比较。使用针对RNAseq数据校正的CIBERSORT算法估计免疫细胞分数。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，未配对Student t检验。

图S6：基于COX-2比率的患者分层描述了具有不同免疫细胞组成的肿瘤。(A)CD8+T细胞-Treg比率。使用CIBERSORT算法计算的值。(B)LAUD(n＝522)、HNSC(n＝530)、TN_BRCA(n＝320)和M_SKCM(n＝360)数据集中高和低COX-2比率患者中免疫细胞分数的比较。使用xCELL算法估计免疫细胞分数。(C)根据COX-2比率分层的患者中使用xCELL算法计算的浸润LUAD、HNSC、TN_BRCA和M_SKCM的免疫群的总结热图。数据表示为平均值±SEM。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，未配对Student t检验。

图7：COX-2比率预测了对PD-1和PD-L1阻断的响应。分别接受抗PD-1或抗PD-L1处理的黑素瘤(Riaz et al.，Chen et al.，和Roh et al.)和膀胱癌(Mariathasan et al.)患者中基线处COX-2比率的分析(A)。R＝响应者，NR＝非响应者，NPD＝非进行性疾病，PD＝进行性疾病。(B)根据COX-2比率、癌症促进标记和癌症抑制标记的中位值分层的来自Riazetal.和Mariathasan et al.的患者的存活分析。Kaplan-Maier图数据解析为高(红色基因/蓝色基因)比率相对于低(红色基因/蓝色基因)比率表达者。通过对数秩(Mantel-Cox)检验比较患者总体存活。(C)来自Mariathasan et al.的PD＝进展性疾病、SD＝稳定疾病、PR＝部分响应、CR＝完全响应患者中的COX-2比率值。(D)根据COX-2比率四分位数分层的来自Mariathasan et al.的患者总体存活。

图S7：COX-2比率预测了对PD-1和PD-L1阻断的响应。(A)黑素瘤(Riaz et al.，Chen et al.，和Roh et al.)和膀胱癌(Mariathasan et al.)数据集中COX-2标记中包含的每种基因的个体贡献的分析。(B)根据T细胞、IFNγ和cDC1标记的中位值分层的来自Riazet al.和Mariathasan et al.的患者的存活分析。Kaplan-Maier图数据解析为高(红色基因/蓝色基因)比率相对于低(红色基因/蓝色基因)比率表达者。通过对数秩(Mantel-Cox)检验比较患者总体存活。

图8：COX-2标记与患者存活密切相关，而不依赖于肿瘤浸润CD8⁺T细胞丰度。(A和B)根据COX-IS分层的LUAD(n＝512)、HNSC(n＝517)、TNBC(n＝320)、MSKCM(n＝357)和CESC(n＝305)患者的存活分析(参见方法)。(A)Kaplan-Maier存活(KM)图在75％(LUAD和CESC)或50％(HNSC、TNBC和MSKCM)严格度下解析为高COX-IS表达者相对于低COX-IS表达者。(B)与所指出的基因标记或COX-IS的单个基因元件相关的危险比(Hazard ratio)。(C-D)来自所有TCGA样品的IFNγ优势患者(n＝2884)的KM图，其根据癌症抑制(CI)标记(C)或癌症促进(CP)/CI(D)标记的组合进行分层(根据中位值定义为高或低)。(E)基于D中所示患者亚组中CD8A、CD8B和CD3E表达的CD8⁺T细胞评分。危险比(95％C.I.)、对数秩(Mantel-Cox)检验(A-D)。

图9：COX-IS是所选癌症类型中的独立预后因素。(A)来自LUAD、HNSC、MSKCM、TNBC和CESC数据集中的多元Cox回归分析的显示危险比及相关置信区间的森林图。阶段被转换为连续变量。性别指示男性相对于女性的相对风险。COX-IS指示低COX-IS患者相对于高COX-IS患者的相对风险。对于HNSC，HPV状态比较了阳性和阴性患者。对于CESC，将每种组织学亚型与粘液癌进行比较。(B)根据COX-IS分层的所有TCGA患者(n＝10718)的存活分析。Kaplan-Maier图数据解析为高COX-IS表达者相对于低COX-IS表达者(50％严格度)。

图10：COX-IS预测了来自不同肿瘤类型的免疫检查点阻断的响应。(A)原始研究中定义的黑素瘤(数据集#1：Riaz et al.，#2：Van Allen et al.，#3：Hugo et al.，#4：Gideet al.)、膀胱癌(数据集#5：Mariathasan et al.，#6：Snyder et al.)、肾癌(数据集#7：McDermott et al.)和胃癌(数据集#8：Kim et al.)患者中的响应者(R)和非响应者(NR)组的基线处COX-IS的分析(参见方法)。(B)A中所示的R和NR患者中COX-IS的配对分析。(C)根据其COX-IS按分位数分层的来自数据集#5的患者的存活。(D和H)来自数据集#5和#7的进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分响应(PR)和完全响应(CR)患者组中的COX-IS。(E、F、I和J)使用单指数(E和I)或其组合(F和J)作为输入变量的广义线性模型拟合的患者响应的解释方差(偏差)。使用卡方检验(Chi-squared test)对嵌套模型(nested model)进行比较。作为单指数，COX-IS解释了数据集#5和#7二者(E和I)中患者响应的显著水平变化。(G和K)来自利用100个重复的10倍(G)或5倍(K)交叉验证的Cohen Kappa小提琴图。使用SMOTE方法平衡重采样中的类别(参见方法)。显示了来自交叉验证的Kappa值。

图11：COX-IS预测了来自不同肿瘤类型的免疫检查点阻断的响应。(A)根据其NK细胞丰度按分位数分层(根据中位值定义为高或低)的来自数据集#5的患者的存活。(B)数据集#5的多元Cox回归分析。COX-IS指示比较低COX-IS相对于高COX-IS的危险比。性别是指男性与女性相比。内脏和肝转移二者指示相对于仅患有淋巴结转移的那些的相对风险。(C)来自数据集#5的PD相对于CR患者中指定参数的接受者操作特征(Receiver operaingcharacteristic，ROC)分析。(D)根据其COX-IS以4分位数分层的来自组合的所有数据集的黑素瘤患者的Kaplan-Mayer_存活图。(E)显示了组合的黑素瘤数据集的多元Cox回归分析的森林图。(F)根据CP、CI或COX-IS分层的来自数据集#2的黑素瘤患者的Kaplan-Mayer_存活图。(G)来自数据集#7的R和NR组中的基线处COX-IS的分析。将患者根据接受的处理分为TKI(经舒尼替尼处理)、抗PD-L1(单药剂)或抗PD-L1联合抗VEGFA(贝伐单抗)。(H)数据集#7中PD相对于CR患者中指定参数的ROC分析。使用ROC曲线下面积(AUC)量化响应预测。通过对数秩(Mantel-Cox)检验比较患者总体存活。

图12.用于计算COX-2比率的替代方法的比较。利用方法1、2、3、4和5计算的数据集#5(Mariathasan et al.)和数据集#7(McDermott et al.)的非响应者(NR)和响应者(R)的COX-IS评分。

发明详述

现在将参照附图讨论本发明的一些方面和实施方案。其他方面和实施方案对于本领域技术人员将会变得明显。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。

在描述本发明时，将采用以下术语并且意欲如下所示对其进行定义。

样品

本文中使用的“测试样品”可以是细胞或组织样品(例如活检物)、生物流体、提取物(例如从对象获得的蛋白质或DNA提取物)。特别地，样品可以是肿瘤样品，例如实体瘤，例如胃食管肿瘤、黑素瘤、膀胱肿瘤或肾肿瘤。样品可以是从对象新鲜获得的样品，或者可以是在进行确定之前已经加工和/或储存的样品(例如，冷冻、固定或经历一个或更多个纯化、富集或提取步骤)。

在本文中使用的“和/或”应被视为对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B中的每一种的具体公开，就像每一种在本文中单独列出一样。

COX-2比率

本文中使用的术语“COX-2比率”、“COX-IS”和“与环氧合酶相关的炎性评分”(“ISAC”)可互换使用。如本文中详细描述的，发现癌症促进基因(参见表1)具有与PTGS2表达、肿瘤生长和对免疫治疗的不良治疗响应正相关的肿瘤基因表达。相反地，发现癌症抑制基因(参见表2)具有与PTGS2表达、肿瘤生长和对免疫治疗的不良治疗响应负相关的肿瘤基因表达。本发明人发现，相对于仅基于癌症促进基因或仅基于癌症抑制基因的预测，通过形成比率来整合这些相反信号增强了基因标记的预测能力。本文中使用的例如在“COX-2比率”中的术语“比率”旨在具有广泛的含义，不仅涵盖一个值除以另一个值，而且还包括了组合相反信号的任何关系，例如从另一个评分减去一个评分(例如CI与CP基因表达评分之间的差异)。

*NCBI基因ID(截至2018年6月17日的版本)。可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene获得。在2018年6月17日以该NCBI基因ID号公开的每种基因的核苷酸序列明确地通过引用并入本文。

*NCBI基因ID(截至2018年6月17日的版本)。可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene获得。在2018年6月17日以该NCBI基因ID号公开的每种基因的核苷酸序列明确地通过引用并入本文。

在一些实施方案中，COX-2比率(也称为COX-IS/ISAC)根据下式计算：

其中n_p是所述癌症促进基因的数目并且nn是所述癌症抑制基因的数目，G_i ^pos和G_i ^neg分别是在(i)单位值区间内的正相关和负相关基因，(e)表示基因表达值，表示为log2每百万计数(CPM)。

在一些实施方案中，G_i ^pos(e)＝阳性基因的log2转化的每百万计数(Reads PerKilobase Million(FPKM))的平均表达，并且G_i ^neg(e)＝阴性基因的log2转化的每百万计数(FPKM)的平均表达。

在一些实施方案中，通过将log2转化的每百万计数(或FPKM)的G_i ^pos(e)平均表达除以G_i ^neg(e)平均表达以得到癌症促进基因和癌症抑制基因的比率来计算COX2比率。

表达值可以以例如RPKM(Reads Per Kilobase Million)、FPKM(Fragments PerKilobase Million)、CPM(每百万计数)和/或nanostring计数中的任一种来表示。

基因表达

提及确定表达水平是指确定基因的表达产物的表达水平。表达水平可以在核酸水平或蛋白质水平上确定。

确定的基因表达水平可以被认为提供表达谱。“表达谱”意指与个体中一种或更多种相关基因的表达水平有关的一组数据，其形式允许与可比较的表达谱(例如，来自已经知道预后的个体)进行比较，以帮助确定预后以及为个体患者选择合适的治疗。

基因表达水平的确定可涉及确定癌细胞样品中mRNA的存在或量。用于这样做的方法是技术人员公知的。基因表达水平可以使用任何常规方法，例如使用核酸微阵列或使用核酸合成(例如定量PCR)在癌细胞样品中确定。例如，基因表达水平可以使用NanoStringnCounter分析系统(参见，例如，US7,473,767)确定。

作为替代或补充，基因表达水平的确定可以涉及在获自个体的包含癌细胞的样品中确定从基因表达的蛋白质水平。蛋白质表达水平可以通过任何可用的手段，包括使用免疫测定来确定。例如，表达水平可以通过免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、ELISA、免疫电泳、免疫沉淀、流式细胞术、大量细胞计数法(mass cytometry)和免疫染色来确定。使用这些方法中的任何一种，都可以确定从表1和2中列出的基因表达的蛋白质的相对表达水平。

可以将如本文中详述的基因表达水平和由其获得的比率与来自存活时间和/或治疗响应已知的患者组的癌症中相同基因的表达水平和相应比率进行比较。进行比较的患者可以称为“对照组”。因此，可以将确定的基因表达水平和比率与患有癌症的个体的对照组中的表达水平进行比较。可以与在对照组癌细胞中确定的表达水平进行比较。可以与在来自对照组的癌细胞样品中确定的表达水平进行比较。对照组中的癌症可与个体中的癌症类型相同。例如，如果确定患有黑素瘤的个体的表达，则可以将表达水平和比率与也患有黑素瘤的患者的癌细胞中的表达水平和比率进行比较。

对照组与所测试个体和癌症之间其他因素也可匹配。例如，癌症的阶段可以相同，对象和对照组可以是年龄匹配的和/或性别匹配的。

另外，对照组可已用相同形式的手术和/或相同的化学治疗进行了治疗。

因此，可以根据其基因表达比率分别与具有良好或不良预后的组的相似性对个体进行分层或分组。

基于基因表达的分类方法

在一些实施方案中，本发明提供了用于在对象中对癌症进行分类、预测或监测的方法。特别地，可以使用一种或更多种模式识别算法来评价从基因表达分析获得的数据。这样的分析方法可用于形成预测模型，该预测模型可用于对测试数据进行分类。例如，一种方便且特别有效的分类方法采用多元统计分析建模，首先使用来自已知亚组(例如，来自已知具有特定癌症预后亚组的对象：高风险和低风险)的样品的数据(“建模数据”)形成模型(“预测数学模型”)，以及其次根据亚组对未知样品(例如，“测试样品”)进行分类。

模式识别方法已被广泛用于表征许多不同类型的问题，例如遍及语言学、指纹法、化学和心理学。在本文中所述方法的情况下，模式识别是使用多元统计(参数和非参数二者)来分析数据，并且从而基于一系列观察到的测量值对样品进行分类并预测一些因变量的值。有两种主要方法。一组方法称为“不受监督”的，并且这些以合理的方式简单地降低了数据复杂性，并且还产生了可以由人眼解释的显示图。但是，这种类型的方法可能不适用于开发可用于对来源于对象的样品进行分类而不依赖于用于训练预测算法的初始样品群的临床测定。

另一种方法称为“受监督”的，其中使用具有已知类别或结果的样品训练集来产生数学模型，然后使用独立的验证数据集对该数学模型进行评价。这里，基因表达数据的“训练集”用于构建统计模型，该统计模型正确地预测每个样品的“亚组”。然后，利用独立的数据(称为测试或验证集)对该训练集进行测试，以确定基于计算机的模型的稳健性(robustness)。这些模型有时称为“专家系统”，但可基于一系列不同的数学程序，例如支持向量机、决策树、k最近邻和朴素贝叶斯(

Bayes)。受监督的方法可以使用具有降低的维数的数据集(例如，前面数个主要组分)，但通常使用具有所有维数的未减少的数据。在所有情况下，这些方法都允许定量描述根据其内在基因表达谱来表征和分隔每种亚型的多元边界。也可以获得任何预测的置信限(confidence limit)，例如，处于拟合优度上的概率水平。预测模型的稳健性也可以使用交叉验证通过从分析中省略选定的样品来检查。

根据亚型对训练样品进行分层后，可以使用基于质心(centroid)的预测算法根据表1和表2中描述的基因集的表达谱来构建质心。

描述符坐标轴的“平移(translation)”可能是有用的。这样的平移的实例包括归一化和均值中心化(mean-centering)。“归一化”可用于去除样品之间的差异。用于计算归一化因子的一些常用方法包括：(i)使用微阵列或nanostring编码集(codeset)上的所有基因的全局归一化；(ii)使用持续表达的管家/不变基因的管家基因归一化；以及(iii)使用在杂交过程中添加的已知量的外源对照基因的内部对照归一化(Quackenbush(2002)Nat.Genet.32(Suppl.)，496-501)。在一个实施方案中，可以将表1和2中列出的基因相对于一种或更多种对照管家基因进行归一化。示例性管家基因包括ACTB(60)、GAPDH(2597)和TBP(6908)，每个基因名称后括号中的数字是该基因的NCBI基因ID号；在2018年6月18日以该NCBI基因ID号公开的每种基因的核苷酸序列明确地通过引用并入本文。本领域技术人员将理解，本文中公开的方法不受相对于任何特定管家基因进行归一化的限制，并且可以使用本领域已知的任何合适的管家基因。许多归一化方法都是可行的，并且它们通常可以应用于分析中数个点中的任一个。在一个实施方案中，使用LOWESS方法对微阵列数据进行归一化，该方法是全局局部加权散点图平滑归一化函数。在另一个实施方案中，将qPCR和NanoString nCounter分析数据相对于多个管家基因的组的几何平均值进行归一化。此外，可以使用倍数变化法分析qPCR。

“均值中心化”也可用于简化数据可视化和计算的解释。通常，对于每个描述符，减去所有样品的该描述符的平均值。以此方式，描述符的平均值与原点重合，并且所有描述符都“集中”于零。在“单位方差缩放(unit variance scaling)”中，可以将数据缩放为相等的方差。通常，每个描述符的值按1/StDev缩放，其中StDev是对于所有样品的该描述符的标准偏差。在某种意义上，“帕累托缩放(Pareto scaling)”介于均值中心化和单位方差缩放之间。在帕累托缩放中，每个描述符的值都按1/sqrt(StDev)缩放，其中StDev是对于所有样品的该描述符的标准偏差。以此方式，每个描述符具有在数值上等于其初始标准偏差的方差。可以例如对原始数据或均值中心化的数据进行帕累托缩放。

当数据具有正偏态和/或当数据跨越大范围(例如，数个数量级)时，“对数缩放(Logarithmic scaling)”可用于辅助解释。通常，对于每个描述符，将值替换为该值的对数。在“相等范围缩放(equal range scaling)”中，对于所有样品，每个描述符都除以该描述符的范围。以此方式，所有描述符都具有相同的范围，即，1。但是，此方法对离群值点的存在敏感。在“自动缩放(autoscaling)”中，每个数据向量都进行均值中心化和单位方差缩放。此技术非常有用，因为每个描述符随后被等加权，并且大值和小值被同等重视。这对于以非常低但仍可检测的水平表达的基因可能是重要的。

当比较来自多个分析的数据时(例如，将一个或更多个测试样品的表达谱与根据独立研究中收集和分析的样品构建的质心进行比较)，有必要对这些数据集的数据进行归一化。在一个实施方案中，使用距离加权辨别(Distance Weighted Discrimination，DWD)将这些数据集组合在一起(Benito et al.(2004)Bioinformatics 20(1)：105-114，通过引用整体并入本文)。DWD是多变量分析工具，其能够鉴别单独数据集中存在的系统性偏差，然后进行全局调整以补偿这些偏差；从本质上讲，每个单独数据集都是多维的数据点云，而DWD获取两个点云并且移动一个点云以使其更佳地与另一个重叠。

在本文中所述的一些实施方案中，可以利用Cox比例危险模型分析(CoxProportional Hazards Model Analysis)来评估基因表达比率的预后性能，Cox比例危险模型分析是用于存活数据的回归方法，其提供了风险比及其置信区间的估计。Cox模型是用于探索患者存活与特定变量之间关系的公认的统计技术。该统计方法允许估计给定其预后变量(例如，如本文中所述的基因表达比率)的个体的危险(即，风险)。“危险比”是显示特定预后变量的患者在任何给定时间点的死亡风险。

预后

可以将分组为良好预后组的个体鉴定为患有对免疫治疗(例如免疫检查点阻断治疗)敏感的癌症。其也可以被称为对免疫治疗(例如免疫检查点阻断治疗)响应良好的个体。可以将分组为不良预后组的个体鉴定为患有对免疫治疗(例如免疫检查点阻断治疗)具有抗性的癌症。

在将个体分组为良好预后组的情况下，可以选择将该个体用合适的免疫治疗(例如免疫检查点阻断治疗)进行治疗，如下文进一步详细描述的。在将个体分组为不良预后组的情况下，可以取消选择将该个体用前述免疫治疗进行治疗，并且可以例如接受手术治疗、放射治疗和/或另一种形式的抗癌剂(例如一种或更多种非免疫化学治疗剂或抗血管生成剂)。

预后是否被认为是良好或不良可在癌症和疾病阶段之间变化。一般而言，良好预后是其中总体存活(overall survival，OS)和/或无进展存活(PFS)比该阶段和癌症类型的平均值长的预后。如果PFS和/或OS低于该癌症阶段和类型的平均值，则可认为预后不良。平均值可以是中位存活OS或PFS。

例如，如果PFS＞6个月和/或OS＞18个月，则可以认为预后良好。类似地，PFS＜6个月和/或OS＜18个月可以认为是不良。特别地，对于晚期癌症，PFS＞6个月和/或OS＞18个月可以认为是良好。

一般而言，“良好预后”是其中个体患者的存活(OS和/或PFS)与可比较的疾病环境中患者群体的预期相比可能有利的预后。这可以定义为优于中位存活(即，存活超过了群体中50％患者的存活)。

“预测癌症患者对所选治疗的响应”旨在意指评估患者在特定治疗的情况下将经历阳性或阴性结果的可能性。

本文中使用的“指示阳性治疗结果”是指患者将从所选治疗中获得有益结果(例如，肿瘤尺寸减小、′良好′预后结果、疾病相关症状和/或生活质量的改善)的可能性提高。

“指示阴性治疗结果”旨在意指患者将无法获得上述阳性治疗结果的益处的可能性提高。

以下通过实施例的方式给出，并且不应解释为对权利要求范围的限制。

实施例

材料和方法

动物。使用的野生型小鼠是在C57BL/6J或Balb/C遗传背景(ENVIGO)下的。将C57BL/6背景中的Ragl^-/-和Batf3^-/-在英国曼彻斯特癌症研究所(Cancer Research UKManchester Institute)在无特定病原体条件下在通风笼中单独饲养并繁殖。雄性和雌性小鼠二者均用于程序中，并且将其随机分配到实验组中。涉及动物的所有程序均根据ARRIVE指南和1986年《动物(科学程序)法》(Animals(Scientific Procedures)Act 1986)下的国家内政部(National Home Office)规定在PPL-70/7701和PDCC31AAF许可下进行。这些程序已由CRUK曼彻斯特研究所的动物福利与伦理审查机构(Animal Welfare andEthical Review Bodies，AWERB)批准，并且肿瘤体积不超过AWERB规定的国家癌症研究所委员会(Committee of the National Cancer Research Institute)设置的指南(Br JCancer.2010May 25；102(11)：1555-77.doi：10.1038/sj.bjc.6605642.)。

癌细胞系。在标准条件下培养细胞，并且确定无支原体。从C57BL/6Braf^+/LSL-V600E；Tyr：：CreERT2^+/o；p16^INK4a-/-(Dhomen et al.，2009)建立Braf^V600E黑素瘤细胞系。CT26、4T1和MC38细胞可商购获得。如先前所述(Zelenay et al.，2015)，通过CRISPR/Cas9介导的基因组工程产生Ptgs2^-/-和Ptgs1/Ptgs2^-/-细胞。为了在Ptgs2^-/-和Ptgs1/Ptgs2^-/-细胞中恢复COX-2表达，将ptgs2小鼠的完整开放阅读框从亲本Braf^V600E黑素瘤细胞系克隆到逆转录病毒载体pFB中。通过标准逆转录病毒转导将所得构建体引入Ptgs缺陷型细胞中。Ptgs1、Ptgs2的敲除和COX-2表达的重新获得通过使用抗COX-1和COX-2特异性抗体(CellSignaling)的免疫印迹以及通过ELISA(R&D或Cayman chemical)监测细胞上清液中PGE₂的浓度来验证。

小鼠程序。通过胰蛋白酶消化收获肿瘤细胞，用PBS洗涤3次，在70μm细胞过滤器上过滤，并且皮下注射到接受者小鼠的侧胁中。通过注射100μLPBS中的1×10⁵个细胞来进行生长谱实验。从注射了100μLPBS中的2×10⁶个细胞的小鼠中收获在第4天分析的肿瘤组织。如通过台盼蓝排除确定的，在注射时肿瘤细胞＞95％存活。将肿瘤尺寸量化为最长直径及其垂线的平均值，并且表示为肿瘤直径。对于体内COX-2抑制，从肿瘤细胞注射之后第5天开始，通过每天经口强饲30mg/Kg(在50％PEG400、10％DMSO中)施用塞来昔布(LCLaboratories)，持续3周。从肿瘤细胞接种之后第5天开始，每周两次腹膜内(i.p.)施用抗PD-1单克隆抗体(克隆RMP1-14，BioXCell)(200μg/小鼠)，最多六次注射。在耗竭实验中，在肿瘤细胞注射i.p.之前一天或之后第7天开始用200μg特异性Ab(对照大鼠或小鼠IgG、抗Grl克隆RB6-8C5、抗NK1.1克隆PK136、抗ASIALO GM-1、抗CD4克隆GK1.5和抗CD8α克隆YTS169.4，全部来自BioXCell或Biolegend)对小鼠进行处理，然后在整个实验期间每三天用200μg所示抗体进行处理。分别使用抗CD49b-APC(克隆DX5)、抗Ly6G-PE-CF594(克隆1A8)、抗CD4-Alexa700(RM4-5)和抗CD8α-PE(克隆53-6.7)通过FACS检查中性粒细胞、NK细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞的耗竭。

定量RT-PCR。将肿瘤收集并匀浆，并且使用RLT裂解缓冲液(QIAGEN)按照制造商的建议提取总RNA。使用RNeasy RNA分离试剂盒(QIAGEN)进一步纯化RNA。使用High CapacitycDNA archive试剂盒(Applied Biosystems)通过逆转录使用3μg总RNA合成cDNA，并且使用QS5快速实时PCR系统(Applied Biosystems)或

HD系统(FLUIDIGM)使用TaqMan探针(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。利用Δ²CT方法(Applied Biosystems，实时PCR应用指南(Real-Time PCR Applications Guide))分析数据。

FACS分析。为了分析肿瘤浸润白细胞，收集肿瘤，切成小块，并且在37℃下用胶原酶IV(200U/ml)和DNase I(0.2mg/ml)消化30至40分钟，用FACS缓冲液(含2％FCS、2mM EDTA和0.01％叠氮化钠的PBS)洗涤，在70μm细胞过滤器上过滤并且沉淀。使用来自BDBioscience、eBioscience或BioLegend的以下抗体的组合通过流式细胞术确定肿瘤浸润的组成：CD45-BV605(克隆30-F11)；CD11b-BV785(克隆M1/70)；Ly6G-PE-CF594(克隆1A8)；Ly6C-FITC(克隆AL-21)；F4/80-PE-Cy7(克隆CI：A3-1)；抗MHCII I-A/I-E-Alexa700(克隆M5/114.15.2)，抗CD11c-PerCP/Cy5.5(克隆N418)，抗CD103 APC或PE(克隆2E7)NK1.1-APC或PE(克隆PK136)；CD49b-APC(克隆DX5)，XCR1-BV421或Alexa647(克隆ZET)Siglec-H-BV711(克隆E50-2440)。在染色之前5分钟，用抗CD16/32(克隆2.4G2)使Fc受体饱和。通过Aqua LIVE/Dead-405nm染色(Invitrogen)确定细胞生存力。从与已知体积的未被染色细胞悬液混合的固定数量的10μm乳胶珠(Coulter)的获取计算活细胞计数。在Fortessa X-20(BD Bioscience)上分析细胞。

共聚焦分析。将肿瘤组织装片在OCT包埋培养基(Thermo Scientific)中，并在-80℃下储存。切下8mm连续切片，装片在Superffost plus载片(Thermo Scientific)上，并在4％多聚甲醛中固定15分钟，在PBS中再水化，并且在PBS中的5％正常山羊或驴(Sigma-Aldrich)血清、2％BSA中在室温(RT)下封闭2小时。将肿瘤切片与以下一抗在RT下孵育2小时或在4℃下孵育过夜：亲和纯化的抗Ly6G(克隆1A8；BD Bioscience)和亲和纯化的抗NK1.1生物素化(克隆PK136)。然后将切片与以下物种特异性交叉吸附的检测抗体在RT下孵育1小时：分别来自Jackson ImmunoResearch Laboratories和Invitrogen-MolecularProbes的Alexa647缀合的驴抗大鼠和FITC缀合的链霉亲和素。对于DNA检测，使用DAPI(300nM；Invitrogen-Molecular Probes)。每个步骤之后，将切片用含0.01％(v/v)Tween20的PBS(VWR Chemicals)洗涤，并且最后用抗褪色装片介质FluorPreserve Reagent(Calbiochem)装片，并且使用Aperio VERSA 200扫描仪(Leica)进行分析。通过省略一抗获得阴性对照。使用Fiji软件版本2.0.0-rc14/1.49计算每个高倍视野(high power field，HPF)的细胞数目。

患者组群数据集的生物信息学分析。在2017年5月从Broad Firehose(http://gdac.broadinst主tute.org/runs/stddata_2016_01_28)和cBioportal(http://www.cbioportal.org)下载了来自代表20种癌症类型的7811个肿瘤样品的临床和全基因组mRNA(3级RSEM归一化)表达数据(Illumina mRNA-seq)。为了获得COX-2比率，如下计算在小鼠模型中其表达受COX-2活性调节的‘癌症促进’和‘癌症抑制’炎性基因(图5A和Zelenayet al.2015)：PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL1、CXCL2、CSF3、IL6、IL1B和IL1A是正相关的(pos)，并且表示为：

CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL12A、IL12B、IFNG、CD8A、CD8B、GZMA、GZMB、EOMES、PRF1、STAT1和TBX21是负相关的(neg)，并定义为：

其中n_p和n_n分别是pos和neg组中的基因数目。

最后，如下计算COX-2比率：

在每种肿瘤类型的最大随访阈值下产生总体存活的Kaplan-Meier图，并且使用COX-2比率将高风险与低风险患者区分开。使用可用的在线工具(https://cibersort.stanford.edu；http://xcell.ucsf.edu)进行CIBERSORT和xCELL分析。根据(Jin et al.2017)，分位数归一化不能用于通过CIBERSORT分析的RNA-seq数据。在图5C中，中性粒细胞和NK细胞标记定义为LUAD和HNSC数据集中CSF3R、CXCL1、CXCL2、IL8、CXCR1、CXCR2(中性粒细胞)和EOMES、KLRB1、NCR1、NCR3、NKG7、TBX21、CD160、PRF1、GZMA、GZMB、IFNG(NK细胞)的平均表达。在某些情况下，NK基因细胞标记可以包含以下基因：KLRF1、CD160、SAMD3、CTSW、NCR1、NCR3和PTGDR(参见图10E、10G、10I和图11A)。

分析了来自(Riaz et al.2017)和(Mariathasan et al.2018)的RNA测序数据集以确定COX-2比率与临床结果之间的关联。对于黑素瘤组群，从基因表达综合数据库(omnibus database)(GSE91061)下载原始计数。对于患有尿路上皮癌的患者组群(Mariathasan et al.2018)，通过将包IMvigor210CoreBiologies加载到R统计计算环境中获得原始计数和源代码。为了整个数据集的一致性，使用edgeR包对计数数据进行归一化，并生成每百万读段计数(count per million reads)(CPM 0值。将10％患者群体中0.25CPM的最小值用作基因纳入的截止值。然后，将转换的CPM值(log2(CPM+1))用于下游分析。从(Chen et al.2016)下载nanostring数据，并且从(Roh et al.2017)下载随附的存活数据。(Chen et al.2016)数据集中存在的另外8种前抗PD1样品也包含在COX-2比率与响应之间的关联的分析中，尽管尚无可用于这些患者的存活数据。将Log2转换的计数用于进一步分析。一旦如上所述产生了COX-2比率值，则通过在GraphPad Prism上计算的ROUT方法(Q＝1％)定义患者离群值。将这些患者排除在进一步分析以及与其他基因标记进行比较之外。将患者SAM09c84ec0cf34、SAM85f0a3ac1c45、SAM563d6233dfa2和SAM7c67b05aa109从尿路上皮癌组群中排除，并且将患者3、76、85、9和36从Riaz et al.黑素瘤组群中排除。在这两个组群中，具有全转录物组数据但无响应数据的患者未包括在存活分析中。

统计分析。对于所有研究，基于癌症模型的以往经验确定样本量，以检测组之间20％或更大的差异(10％显著性水平和80％功效)。如指定的，值表示为平均值±SEM或生物学重复的中位值。

如指定的，使用未配对Student t检验、皮尔逊相关、卡方检验、单因素和双因素ANOVA。在非高斯分布(non-Gaussian distribution)的情况下，使用Mann-Whitney U检验。用对数秩(Mantel-Cox)检验计算存活曲线和危险比。ROUT检验用于排除离群值。p值≤0.05(^*p≤0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)被认为是显著的。使用GraphPad Prism版本7.0a(GraphPad软件)计算统计量。

实施例1-由COX缺陷细胞形成的肿瘤中中性粒细胞减少并且NK细胞积聚提高

如先前报道(Zelenay et al.，2015)，使用CRISPR-Cas技术产生的COX缺陷型Braf^V600E驱动的黑素瘤细胞总是无法在免疫活性小鼠中形成进行性肿瘤，而其COX活性的亲本对应物则有效地逃避了免疫消除并且不受控制地生长(图1A)。为了明确证明这些绝对相反的肿瘤命运是由受损的COX活性引起并且排除它们是由于未预见到的脱靶CRISPR效应引起的可能性，我们通过逆转录病毒转导恢复了COX-1和COX-2双重缺陷(Ptgs1^-/-Ptgs2^-/-)细胞中的COX-2表达(图1A)。与其亲本系一样，COX-2恢复的黑素瘤细胞在体外分泌大量PGE₂，并且重新获得了在野生型同基因小鼠中进行性生长的能力(图1A、B)。

已经证实了COX缺陷细胞的提高的免疫原性可以通过恢复COX-2表达来恢复并且因此不依赖于潜在脱靶CRISPR介导的靶抗原的引入，我们利用该实验系统来表征肿瘤浸润的炎性细胞组成。由于适应性免疫T细胞介导的肿瘤生长控制仅在黑素瘤细胞植入之后7至10天明显((Zelenay et al.，2015)以及参见下文)，因此我们有意选择了较早的时间点以查明负责协调后续T细胞应答的候选免疫细胞亚群。COX缺陷肿瘤在第4天时已明显更小，并且这种作用被COX-2恢复所逆转(图1C)。通过多色荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)分析对多种免疫细胞类型的检查(图S1A)显示，在由亲本或COX-2恢复的黑素瘤细胞形成的肿瘤中中性粒细胞增多并且NK细胞浸润明显减少(图1D、E)。其他免疫细胞群未改变，或仅受癌细胞COX-2活性适度和/或不一致影响(图S1B-F)。通过免疫荧光对肿瘤切片的分析证实了以上结果，表明在COX缺陷肿瘤中不存在Ly6G⁺中性粒细胞和明显的NK1.1⁺NK细胞浸润簇(图1F、G)。

实施例2-COX缺陷结直肠癌和乳腺癌模型中中性粒细胞减少并且NK细胞数目升高

为了评估肿瘤部位处的免疫细胞组成的COX依赖性变化是否是Braf^V600E黑素瘤模型所独有的，我们将我们的分析扩展到了MC38结肠癌细胞。这些细胞表达COX-2并且产生PGE₂，尽管其水平明显低于黑素瘤细胞(图2A)。尽管如此，CRISPR介导的COX-2消融完全消除了PGE₂产生并且削弱了其在免疫活性宿主中形成进行性肿瘤的能力(图2A、B)。与Braf^V600E黑素瘤模型中一样，T和B细胞缺陷Rag1^-/-或cDCl缺陷Batf3^-/-小鼠中COX-2缺陷(Ptgs2^-/-)MC38细胞的生长谱与亲本Ptgs2^+/+或COX-2恢复的Ptgs2^-/-细胞中的相当。这些观察结果揭示了癌细胞固有的COX-2活性在这种广泛研究的结肠癌模型中逃避cDC1和适应性免疫依赖性控制中的主导作用(图2B)。

植入之后早期MC38肿瘤的分析还显示，黑素瘤模型在肿瘤负荷和免疫浸润组成的变化方面具有保守性，其取决于癌细胞的COX-2活性(图2C、D)。在由Ptgs2^-/-MC38结直肠细胞形成的肿瘤中，中性粒细胞和NK细胞二者均明显受到影响，其中前者减少并且后者增多(图2D)。相比之下，其他髓样细胞亚群(包括单核细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或DC)的水平基本上不受影响(补充图2)。相对于其COX充足的对应物，在COX缺陷的乳腺4T1和CT26肿瘤中同样观察到了中性粒细胞的数目减少但是NK细胞的积聚更高，以及其他固有免疫细胞群的较小尺寸和较不明显或一致变化的趋势(图2C、2D，图S2)。总之，这些数据表明在数种癌症小鼠模型中癌细胞固有的COX活性有利于中性粒细胞积聚并且阻碍NK细胞向肿瘤募集，而不依赖于癌症类型或小鼠背景。

为了研究白细胞向肿瘤部位中募集的动力学，我们使用Braf^V600E驱动的黑素瘤模型表征了在多个时间点的免疫浸润。自黑素瘤细胞植入之后第2天开始，中性粒细胞和NK细胞在COX活性和缺陷的肿瘤中已显示出相异的积聚，并且这种差异维持至少一周(图S1G)。到4周时，当COX活性癌细胞已经一致地建立大而硬的肿瘤时，中性粒细胞和NK细胞的比例与在少数仍小但仍可检测到的COX缺陷肿瘤中所观察到的相当(图S1H)。然而，在这个晚的时间点，Ptgs^-/-肿瘤显示出cDC1、总CD3⁺T细胞和CD8⁺T细胞相对富集，并保持了其免疫依赖性缓解(图S1H)。

由于中性粒细胞在COX活性肿瘤中在早期是丰富的，而在COX缺陷肿瘤中不是，因此我们接下来使用单克隆抗GR1抗体耗竭它们评估了其对于肿瘤负荷和免疫细胞组成的贡献。尽管其有效消除，但是在COX活性或缺陷肿瘤中肿瘤重量和其他白细胞亚群的流行率均未改变(图S3A和S3B)。这些结果进而排除了所谓的GR-1⁺髓样来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)在COX缺陷黑素瘤细胞的早期固有控制中的重要作用。

实施例3：NK细胞对于自发或治疗诱导的肿瘤控制是必要的

然后，我们讨论了NK细胞的作用，NK细胞经常参与对血液恶性肿瘤和转移的控制，而对实体瘤的控制则较少(Imai et al.，2000)。除NK细胞本身外，COX缺陷肿瘤的整体免疫细胞组成在NK细胞耗竭之后没有明显改变(图3A和图S3C)。但是，NK细胞消融导致与COX活性肿瘤相当的Ptgs2^-/-肿瘤尺寸和重量明显增加，在癌细胞植入之后四天时已经明显(图3C)。此外，引人注目地，在耗竭NK细胞的小鼠中，COX缺陷黑素瘤细胞与其亲本细胞一样进行性生长，没有明显的固有或适应性免疫依赖性控制迹象(图3C)。使用MC38结直肠模型获得了类似的结果(图3D至F和图S3D)。因此，我们推断NK细胞对于COX缺陷肿瘤的固有和适应性控制阶段二者都是必要的。

为了进一步评估参与肿瘤根除的白细胞亚群的相对和分级贡献，我们一起比较了Rag1^-/-小鼠、缺少cDC1细胞的Batf3^-/-小鼠中或者耗竭NK细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或CD4⁺和CD8⁺T细胞二者的小鼠中Ptgs^-/-Braf^V600E黑素瘤细胞的生长谱。与NK细胞参与肿瘤控制的固有和适应性免疫阶段相一致，在耗竭NK细胞的小鼠中COX缺陷肿瘤比在仅耗竭CD8⁺T细胞的小鼠中生长更快(图3G)。尽管如此，在后一组中没有肿瘤消退强调了CTL的关键作用，这与在Rag1^-/-或Batf3^-/-小鼠中观察到的进行性肿瘤生长一致。尽管在耗竭CD4⁺T细胞的小鼠中仍然发生了肿瘤消退，但与消融仅CD8⁺T细胞的小鼠相比，CD4⁺和CD8⁺细胞二者的组合消融导致更快的肿瘤生长，突出了CD4⁺T细胞对肿瘤消除的非冗余贡献(图3G)。最后，将NK细胞清除延迟一周并没有损害COX缺陷肿瘤的根除，揭示了NK细胞在抗肿瘤免疫应答中早期至关重要且特定的作用(图3H)。总的来说，我们的数据证实了cDC1和CTL并且进一步确定了NK细胞是针对COX缺陷肿瘤的自发免疫中的早期中心参与者。

PD-1/PD-L1轴阻断与COX抑制剂的组合已显示出在对任一单一治疗响应不良的临床前模型中协同促进免疫介导的肿瘤消退(Li et al.，2016；Zelenay et al.，2015)。为了确定NK细胞是否同样是这种组合的治疗效力所需要的，我们用抗PD-1单克隆抗体和选择性COX-2抑制剂塞来昔布对耗竭或未耗竭NK细胞的具有COX活性黑素瘤的小鼠进行处理。从这种处理获得的导致超过一半的对照小鼠完全响应的明显益处在耗竭NK细胞之后完全失去(图3I至K)。与未经处理的NK细胞充足的对照小鼠相比，在缺少NK细胞的经抗PD-1和塞来昔布处理的小鼠中肿瘤生长甚至更快，意味着针对COX活性亲本肿瘤的残余NK细胞活性。总之，我们的结果证明了NK细胞在天然和治疗诱导的肿瘤控制中的基本作用，所述肿瘤通过COX-2活性的遗传或治疗性抑制而具有免疫原性。

实施例4：NK细胞协调向癌症限制性炎症的转变

接下来，我们寻求确定NK细胞如何促进cDC1和CTL依赖性肿瘤控制。由于其早期耗竭而不是晚期耗竭完全消除了Ptgs^-/-肿瘤的根除，因此我们推断NK细胞可以通过驱动COX缺陷肿瘤向抗癌免疫途径的重编程来参与该过程的启动。为了评估这一点，我们测量了数种炎性因子的表达水平，我们先前发现其中的许多在耗竭或未耗竭NK细胞的具有Ptgs^+/+或Ptgs^-/-肿瘤的小鼠中通过COX-2活性诱导(Zelenay et al.，2015)。同样，我们监测了定义I型免疫的标志物(包括NK细胞和CTL募集、分化和细胞毒性活性的介导物)的表达。被称为‘癌症促进’的癌症相关炎症特征性可溶性因子的转录本水平在COX活性肿瘤中比在COX缺陷肿瘤中明显更高，并且在没有NK细胞的情况下其表达未改变或适度提高(图4A)。相比之下，包含细胞毒性免疫印记的‘癌症抑制’因子的表达通过NK细胞的耗竭显著降低(图4A、B)。这种作用在其中这些基因的表达最高的Ptgs^-/-肿瘤中尤为明显，与其自发免疫介导的缓解相一致。

为了确定NK细胞相对于Ptgs^-/-肿瘤根除所需的其他免疫细胞群(即T细胞和cDC1)对偏向局部TME的贡献，我们在T、B和NKT细胞缺陷(Rag1^-/-)或cDC1缺陷(Batf3^-/-)小鼠中进行了平行分析。值得注意的是，大多数‘癌症抑制’基因的表达是NK细胞依赖性的，但是在Rag1^-/-或Batf3^-/-宿主中未改变，表明NK细胞在协调COX缺陷肿瘤的炎性应答中的特定、在先和主导作用(图4B)。Il12b和Cxcl10是值得注意的例外，其在没有NK细胞或cDC1的情况下同样减少。后面的发现与表明cDC1是IL12和CXCL10的主要肿瘤内来源(Ruffell et al.，2014；Spranger et al.，2017)以及其向肿瘤部位的募集受到NK细胞活性的调节(

et al.，2018)的先前研究一致。实际上，与后一份报告一致，在来自耗竭NK细胞的小鼠的肿瘤中，Xcl1和Ccl5的水平以及也涉及cDC1向TME的募集的Ccl3和Ccl4的水平(Spranger et al.，2015)全都降低(图4B、C)。但是，NK细胞消融并没有改变在Batf3^-/-小鼠中预期减少的定义cDC1的标志物Clec9a和Xcr1的表达(图4C)。这些发现与我们的FACS分析一致，后者显示NK细胞对肿瘤内cDC1积聚的适度贡献(图S1B和S2B)。因此，我们推断除了吸引cDC1以外或者不是吸引cDCl，NK细胞可以替代地在肿瘤部位处局部驱动其成熟和/或活化。为了测试这一点，我们检查了NK细胞丰富和耗竭的宿主中肿瘤浸润cDC1的活化状态。如先前报道的(Zelenay et al.，2015)，与其亲本对应物相比，在COX缺陷肿瘤中CD86⁺和CD40⁺cDC1的百分比显著更高。值得注意的是，活化的cDC1而不是总cDC1的增加在NK细胞耗竭之后完全消除(图4D)，表明NK细胞促进了肿瘤内cDC1的活化。总之，我们的数据与模型相一致，其中NK细胞通过协调Ptgs^-/-肿瘤的炎症谱中的开关启动由NK细胞、cDC1和CTL的顺序作用介导的根除肿瘤的应答。

实施例5：小鼠COX-2驱动标记在人恶性肿瘤中是保守的

为了研究COX-2途径是否影响人中TME的炎症谱，我们探询了大的癌症患者数据集。我们首先分析了COX-2与小鼠模型中其表达受COX-2活性调节的‘癌症促进’和‘癌症抑制’炎症介质的关联(图4A)。对来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://cancergenome.nih.gov)和METABRIC(Curtis et al.，2012)项目的20种不同癌症类型的分析显示了在所有癌症类型的鼠肿瘤中编码COX-2的PTGS2的转录水平与由癌细胞固有的COX-2诱导的因子之间明确的正相关性(图5A)。此外，引人注目的是，在所分析的数种癌症类型中，PTGS2显示出与在具有COX缺陷肿瘤的小鼠中表达升高的那些‘癌症抑制’介质的逆相关(图5A)。这些负相关不是特别明显，但是个别地，如在肺腺癌(lungadenocarcinoma，LUAD)或头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell cancer，HNSC)患者组群中所示，绝大多数达到统计学显著性(图5B)。此外，PTGS2表达分别与中性粒细胞或NK细胞特异性基因标记正相关或负相关(图5C)，表明取决于COX-2水平的中性粒细胞和NK细胞的肿瘤内积聚的相反模式。这些结果强调了我们在小鼠模型中的发现与人环境的平移相关性，并暗示肿瘤内COX-2活性可以改变多种人恶性肿瘤中的分子和细胞浸润组成。

实施例6：COX-2驱动的标记比率预测了总体患者存活

为了进一步评估我们的发现的临床意义并且评价小鼠来源的COX-2标记作为患者结局的生物标志物的潜在用途，我们在具有匹配的临床结果数据的患者数据集中进行了按比例的危险存活分析。为了整合‘COX-2标记’的肿瘤刺激性和限制性要素，我们计算了每位患者的‘癌症促进’基因和‘癌症抑制’基因的组合平均表达之间的比率(参见方法)。根据这种‘COX-2比率’四分位数对LUAD、HNSC、三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TN_BRCA)和转移性皮肤皮肤黑素瘤(metastatic skin cutaneous melanoma，M_SKCM)患者的分层显示，具有更高COX-2比率的那些患者总是具有差的结局(图6A)。相比之下，COX-2标记的单个要素或者组合的‘癌症促进’或‘癌症抑制’基因均没有一致地预测这四种肿瘤类型的存活(图6B)。值得注意的是，在所选数据集中，与CD8⁺T细胞(Spranger et al.，2015)、IFN-γ相关(Ayers et al.，2017)或cDC1基因标记(

et al.，2018)相比，COX-2比率是更一致且更强的预后(图6B)，强调了“COX-2标记”的价值以及在单生物标志物中整合促肿瘤发生和抗肿瘤发生因子的益处。

实施例7：COX-2比率描述了具有拮抗免疫细胞组成的肿瘤

肿瘤浸润的炎性细胞组成与患者总体存活和治疗结果相关(Blank et al.，2016；Fridman et al.，2012；Gentles et al.，2015)。因此，我们接下来凭借最近开发的推断所选免疫细胞群丰度的分析工具(CIBERSORT；https://cibersort.stanford.edu)评价了小鼠COX-2标记是否可以用作区分具有不同白细胞浸润的人癌症活检物的手段。我们专注于小鼠模型中其肿瘤内积聚通过癌细胞固有的COX-2调节和/或是免疫介导的控制所需的免疫细胞亚群。在LUAD、HNSC、TN_BRCA和M_SKCM组群中具有较高COX-2比率并且如在图6A中所示的存活分析中分层的癌症活检物具有增多的相对的中性粒细胞数目和减少的活化NK细胞(图6C)。此外，在具有较低COX-2比率的活检物中CD8 T细胞和效应物记忆CD4 T细胞始终更为丰富。同样，在那些相同的样品中，CD8 T细胞与调节性T细胞的比率(广泛使用的增强的抗肿瘤T细胞活性的指标)明显升高(图S6A)。使用独立平台(xCell；http://xcell.ucsEedu)获得了类似的结果，表明当根据其COX-2比率对样品进行分层时，中性粒细胞、NK细胞或CTL的富集或缺乏(图S6B)。

在其相对丰度可以用CIBERSORT(22)或xCell(64)平台推断的所有细胞群中，两者均无法估计cDC1浸润，其对于我们的小鼠模型中免疫介导的肿瘤控制是重要的。为了克服这一限制，我们再利用了通过单细胞RNA测序获得的公开的cDC1基因表达谱(Villani AScience2017)，并且进行了定制的CIBERSORT分析。该分析表明，在LUAD和HNSC数据集中，在具有较低COX-2比率的肿瘤样品中cDC1明显更丰富(图6D)，这与先前报道的cDC1与结果的关联(

et al.，2018；Broz et al.，2014；Ruffell et al.，2014)一致。总之，我们的数据为小鼠和人物种中TME炎症谱的COX-2依赖性调节的明显和广泛的保守性提供了证据。此外，其暗示我们的小鼠驱动的COX-2比率构成了强力的预后生物标志物和描述具有拮抗性炎性浸润的肿瘤活检物的直接方法。

实施例8：COX-2比率预测了PD-1/PD-L1阻断的结果

最后，为了研究COX-2比率是否可用于预测来自ICB的益处，我们再利用了来自经历抗PD-1阻断的癌症患者的可获得数据集。我们分析了三个独立的公开可获得数据集；其中两个是黑素瘤患者并且一个是膀胱癌患者(Chen et al.，2016；Roh et al.，2017)(Mariathasan et al.，2018；Riaz et al.，2017)。在这些患者组群中，基线处COX-2的各组分的表达水平可获得，并且因此我们可以计算每位患者的‘COX-2比率’，并确定其与患者结局的关联(参见方法)。在所有情况下，在从PD-1阻断获益的患者组中，即原始研究(Mariathasan et al.，2018；Riaz et al.，2017)中定义的“响应者”或“非进行性疾病”中，COX-2比率比“非响应者”或“进行性疾病”组中显著更低(图7A)。反映了TCGA和METABRIC数据集中的总体存活分析，在三个患者组群研究的两组患者之间，个体标记元件的表达并没有始终不同(图S7A)。这项分析强调了将COX-2标记作为整合了癌症促进和抑制特征的比率进行计算的价值，并建议了其作为对PD-1阻断的固有抗性的生物标志物的潜在用途。为了进一步评价这种可能性，我们比较了在治疗根据其在基线处的COX-2比率进行分层的患者之后的存活结果。具有较低COX-2比率的患者比具有高COX-2比率的那些明显更多地受益(图7B)，而基于仅癌症促进基因或癌症抑制基因的分层与存活没有关联或有很弱的关联(补充图7B)。COX-2预测能力不依赖于年龄和性别(未示出)，并且值得注意的是，其再次优于基于T细胞、IFN-γ相关或cDC1标记的分层(图7B)。在膀胱癌组群研究中，大量患者经历了完全缓解(Mariathasan et al.，2018)。在那些完全响应者中，约90％处于低COX-2比率组，进一步强调了COX-2标记的预测能力。此外，在进行性疾病、稳定疾病、部分和完全响应者患者组中，COX-2比率平均值表现为逐渐降低(图7C)。同样，在根据四个四分位数进行分层的患者中存活逐渐提高(图7D)，表明在所有患者亚组中COX-2标记在功能上相关连续变化。最后，使用CIBERSORT估计的活化NK细胞而非CD8 T细胞或cDC1的相对细胞丰度在四个患者临床亚组中逐渐降低(图7E和图S7C)，反映了以上COX-2比率的结果并且支持NK细胞在患者对ICB的响应中起着至关重要的作用。我们得出结论，小鼠驱动的COX-2比率构成了对PD-1/PD-L1阻断响应的强烈预测性生物标志物。

讨论

炎症在癌症中的双重相反作用是公认的(Mantovani et al.，2008)。常见于临床上明显的肿瘤中的炎性信号传导和介质能够实现侵袭性肿瘤生长的数种特征，例如癌细胞增殖、血管生成或侵袭(Hanahan和Weinberg，2011)。相反，另一些则部分地通过促进免疫介导的癌细胞识别和杀伤而具有肿瘤抑制作用。驱动或阻止建立支持或抑制癌症进展的肿瘤微环境的信号仍然知之甚少。将癌症小鼠模型的使用与患者数据集的生物信息学分析组合，我们在此将COX-2途径确定为肿瘤内炎性应答类型的广泛保守的调节物。

癌细胞固有的COX表达的遗传消融削弱了癌细胞在免疫活性宿主中形成进行性肿瘤的能力，但是在免疫缺陷宿主中则没有。这种现象的流行是绝对的，因为无论肿瘤类型或菌株背景如何，都始终观察到免疫介导的肿瘤生长控制。有趣的是，我们证明了COX缺陷细胞的免疫原性的大幅提高与通过CRISPR操作引入癌细胞的潜在抗原决定簇无关。相反，其源于COX缺陷癌细胞的免疫刺激潜能的转换，这通过对肿瘤内炎性应答进行深刻的重编程来证明。这种转变在T细胞肿瘤控制的任何证据之前很早发生，并且特征在于中性粒细胞和NK细胞的彼此相反和拮抗积聚以及良好确定的促肿瘤发生和抗肿瘤发生介质的肿瘤内水平的明显变化。在机制上，通过遗传手段或通过Ab介导的耗竭而缺乏特异性免疫亚群的小鼠的使用证明了NK细胞在快速诱导经典抗癌免疫介质以及在固有和适应性免疫依赖性肿瘤根除中起着至关重要的早期作用。

NK细胞经常涉及血液恶性肿瘤的控制，而较少涉及实体瘤的控制(Guillerey etal.，2016)。我们的发现增加了最新研究的列表，暗示了该固有淋巴细胞亚群在实体赘生物的免疫监视中的作用(Barrow et al.，2018；Lavin et al.，2017；Molgora et al.，2017)。NK细胞的肿瘤抑制作用是多效性的，从直接感应和杀伤转化细胞到协调和辅助CD8 T细胞介导的肿瘤控制(Morvan和Lanier，2016)。在我们的癌症小鼠模型中，对COX缺陷肿瘤的生长控制依赖于NK细胞，如依赖于cDC1和CTL一样。我们对缺乏NK细胞、cDC1或CTL的荷瘤小鼠的平行生长谱和浸润组成分析与事件的时间顺序相一致，其中NK细胞首先启动初始抗肿瘤发生炎性应答，并且协调后来的CTL介导的应答。有趣的是，NK细胞极大促进肿瘤免疫的固有和适应性阶段二者，而Batf3依赖性DC和T细胞、尤其是CD8⁺亚群是晚期适应性免疫控制独特需要的。然而，值得注意的是，尽管快速的NK细胞依赖性肿瘤生长阻滞是明显的，但是对于持续的生长控制是从来都不足的。后者导致在黑素瘤模型中彻底完全和长期的肿瘤根除，其总是需要NK细胞、交叉呈递cDC1和T细胞。

编码细胞因子、趋化因子和细胞毒性免疫的其他经典介质的转录本的表达水平表明其在肿瘤中的诱导在很大程度上取决于NK细胞的存在。值得注意的例外是CXCL10或IL12，其水平被NK细胞或cDC1缺陷同样降低。最近认为cDC1来源的CXCL10和IL12二者促进了肿瘤内cDC1在自发和治疗诱导的抗癌免疫中的非冗余作用(Mittal et al.，2017；Ruffell et al.，2014；Spranger et al.，2017)。因此，我们的发现暗示了NK细胞与cDC1之间影响TME情景的串扰。实际上，最近的研究发现NK细胞通过其产生CCL5和XCL1(

et al.，2018)或FLT3L(Max Krummel Nat Medicine)来在将cDC1吸引至肿瘤部位中发挥主导作用(

et al.，2018)。因此，我们发现，在NK细胞消融之后，CCL5或XCL1以及先前也涉及cDC1向TME募集的CCL4(Spranger et al.，2015)的肿瘤内水平均显著降低。然而，相反地，我们通过不同的补充方法对肿瘤浸润组成的分析未能显示出明显或一致的NK细胞对肿瘤内cDC1募集的贡献。相反，我们发现cDC1的活化而不是积聚完全取决于NK细胞的存在。我们的观察结果支持了这样的模型，其中针对COX缺陷肿瘤的自发免疫依赖于NK细胞介导的炎性应答的重编程，其先于并且驱动肿瘤内cDC1活化，然后是CTL介导的肿瘤杀伤。

这种对肿瘤生长的明显的免疫依赖性抑制受到癌细胞中COX-2的天然表达或恢复的表达的削弱。长期以来，COX-2/PGE₂途径与恶性癌症生长相关(Wang和Dubois，2010)，并且我们的数据进一步表明，其在我们的实验系统中通过促进免疫逃逸来实现这些。PGE₂作用的具体细胞靶标仍然未知，但鉴于EP2和EP4的广泛表达(Furuyashiki和Narumiya，2011)，导致PGE₂的免疫调节作用的PGE₂受体可能有数种(Kalinski，2012)。NK细胞、DC和T细胞都是已知的PGE₂直接靶标(Kalinski，2012)。值得注意的是，在缺乏NK细胞、cDC1或T和B细胞的宿主中，COX-2驱动的肿瘤促进因子(例如IL6、IL1β、CXCL1或CCL2)的诱导没有受到影响或仅受到适度影响。我们的发现与以下见解相一致：靶向肿瘤促进炎症可以是增强抗癌免疫和免疫治疗效力的手段(Coussens et al.，2013)。特别地，我们表明，将抗PD1阻断与塞来昔布(选择性COX-2抑制剂)的经口施用组合在大部分具有建立的COX活性黑素瘤小鼠中强烈限制癌症生长并促进完全响应。该数据与最近的研究(Hou et al.，2016；Li etal.，2016；Zelenay et al.，2015)相吻合，并且为临床中将COX-2途径抑制剂与ICB组合的原理提供了进一步的支持。在其他直接的治疗相关性中，我们显示NK细胞对于治疗益处是必不可少的，这表明该免疫细胞类型对基于ICB的免疫治疗的效力具有潜在的关键作用。

为了评价我们在癌症小鼠模型中的发现与人癌症之间的平移相关性，我们对大的人癌症数据集进行了生物信息学分析。通过这样做，我们发现了如在小鼠模型中与COX-2表达相关的炎性应答类型的清晰轮廓。在多种癌症类型中均可发现PTGS2转录本与促肿瘤发生和抗肿瘤发生炎症介质的这种正和负相关是保守的。不论癌症类型如何，COX-2水平均与肿瘤促进因子正相关，而与抗肿瘤介质的逆相关仅在所选恶性肿瘤中观察到。这些观察结果的基础目前仍未知。有趣的是，COX-2转录本水平与癌症抑制基因的反相关性对于三阴性乳腺癌样品是明显的，但是对于其他乳腺癌亚型则是中等的或不存在，暗示COX-2调节作用可选择性改变特定癌症亚型内的肿瘤内谱。

COX-2途径对人癌症的肿瘤内谱的影响也扩展到TME的免疫细胞组成。PTGS2转录本水平与更高的中性粒细胞数目和更低的NK细胞丰度显著相关，很容易模仿在多种癌症小鼠模型中的发现。该表型继而表明COX-2水平不仅反映了总体白细胞浸润差异，而且反映了肿瘤浸润细胞组成的性质变化。使用两种最新的和独立可获得的分析工具推断多种免疫细胞群体的相对丰度另外支持了这一结论。此外，与鼠COX活性和缺陷肿瘤的拮抗表型和命运完全一致，T细胞并且特别是CTL在具有较低COX-2比率的活检物中更为普遍。这些结果表明，确定COX-2比率可构成推断肿瘤浸润组成的直接方法，读出与总体存活和最近对ICB的响应广泛相关(Fridman et al.，2012；Gentles et al.，2015；Mandal和Chan，2016；Thorsson et al.，2018；Topalian et al.，2016)。

基于COX-2比率的癌症患者分层也揭露了该基因标记的显著预后价值，而单个基因元件或组合的癌症促进或抑制基因均未显示出强大或一致的预后能力。我们推测，COX-2比率的优越能力可能来源于将两种紧密相关的癌症印记(肿瘤促进炎症和逃避免疫破坏)(Hanahan和Weinberg，2011)的替代标志物组合成一种单一生物标志物。多基因基因标记相对于单一标志物的优点是公认的(Ayers et al.，2017；Broz et al.，2014；Chen et al.，2016)，并且在复杂系统如TME中具有特殊价值，可争辩地，没有炎症介质可以归因于排他性的肿瘤促进或抑制特性。

COX-2比率作为预测性生物标志物的有用性还扩展到了靶向PD-1的免疫治疗。基线处肿瘤具有较低COX-2比率的患者在响应者组中富集，并且具有显著改善的存活结果。在三个独立的患者组群(Mariathasan et al.，2018；Riaz et al.，2017；Roh et al.，2017)中并且无论用于确定基因表达水平的方法(Nanostring或RNA测序)或肿瘤类型(黑素瘤或膀胱癌)如何，都是如此。值得注意的是，我们发现COX-2标记在预后和预测能力方面优于先前公开的基因标记。考虑到COX-2标记完全来源于对在COX活性或无活性鼠癌细胞植入后形成的肿瘤内在早期差异表达的少数炎症介质进行的分析，这些发现甚至更令人印象深刻。因此，对于人分析，COX-2标记既未完善也未优化，从而避免了与过度拟合和暴露小鼠与人之间明显类似相关的问题。本发明人特别考虑了增强其预测能力和可显示出生物标志物价值的恶性肿瘤范围的努力。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人认为可以通过整合已知有助于免疫治疗效力的其他癌症特征如肿瘤负荷(Huang et al.，2017)或新抗原流行率(McGranahan et al.，2016；Schumacher和Hacohen，2016；Schumacher和Schreiber，2015)来实现可预测性的提高。特别地，COX-2标记是通过比较具有完全不同的免疫原性潜力和命运但可能是相同肿瘤突变负荷的鼠肿瘤获得的。初步数据表明，可以通过应用生物信息学回归方法包括弹性网络和/或随机森林分析来实现COX-2比率标记的改善。

总之，来自我们癌症小鼠模型的拮抗性炎性应答的迅速且无误的发展与相反的进行性或退化性肿瘤命运的联用为我们提供了理想的实验系统以研究调节促进或抑制TME的建立的信号和原理。结合在大的人患者数据集中进行的计算机验证，我们的分析证明了NK细胞在抗肿瘤发生炎症中的关键作用，并且认为COX-2/PGE₂途径是癌细胞调节其局部周围环境和避免免疫介导的消除的主要且保守的决定因素。特别值得注意的是，本文描述的数据表明，无论肿瘤类型(例如黑素瘤和膀胱)如何以及无论使用的具体单克隆抗体药物(例如纳武单抗或阿特珠单抗)如何，COX-2比率都具有预测性。如图11F中所示，发现COX-IS比率对于黑素瘤的伊匹单抗(抗CTLA4)治疗之后的结果具有预测性。此外，不希望受任何特定理论的束缚，本发明人认为COX-2比率将预测对其他免疫检查点抑制剂和对非免疫检查点阻断免疫治疗的治疗响应。

实施例9：与环氧合酶相关的炎性评分(COX-2比率)

背景

膀胱癌是具有高突变负荷的肿瘤类型，并且在部分患者中已经看到对ICB的强烈响应。同样，PD1靶向抗体也已在肾癌中得到批准(Motzer et al.，2015)，最近与抗CTLA4抗体以及靶向血管生成的药物组合(Mcdermott et al.，2018，Motzer et al.，2019，Rini etal.，2019)。然而，与对ICB具有相当响应的其他癌症类型(例如肺癌和膀胱癌)相比，肾癌不具有高TMB(Alexandrov et al.，Nat，2013)。肾癌可由拷贝数改变、PI3K/AKT/MTOR轴改变和导致血管生成转换的VHL突变驱动。TMB本身是肾癌响应中的不良指标，但是在膀胱癌中是潜在强力的预测性生物标志物。同样，PDL1 IHC在膀胱癌中有一定效用，但是在肾癌中几乎没有生物标志物的潜力，如在最近的3期研究中证明的，在该3期研究中在PDL1阳性群体中对于Avelumab加阿西替尼的响应率与整个群体相比是相当的(Motzer et al.，2019)。从生物标志物的角度来看，在肾癌和膀胱癌二者中仍然存在未解决的问题。(1)在膀胱癌中，一些报道表明与单独的TMB相比，基因表达标记的测量可以提供有意义的另外预测能力(Mariathasan et al.，2018)，但尚不清楚在不同组群中这在多大程度上是一致的。(2)在晚期肾癌中，尚不清楚对ICB响应的最佳生物标志物是什么，以及考虑到不同组合治疗的出现，我们如何可以为正确的患者选择正确的治疗。来自两个可用组群的原始出版物(Mariathasan et al.，2018，McDermott et al.，2018)首先证明，在膀胱癌中，通过将TMB与T细胞效应物基因标记和泛成纤维细胞TGFβ响应标记组合可以实现强大的预测。在肾癌中，已表明骨髓炎症与单药剂阿特珠单抗组中的不良结果相关，并且与高T效应物低骨髓患者相比，高T效应物标记高骨髓标记患者具有较差的PFS。

方法

所有计算分析均使用R进行。首先，过滤低表达基因(在90％的情况下CPM＜0.25)。接下来，使用edgeR包对来自Mariathasan和Mcdermott组群的原始计数矩阵进行归一化。生成Log2(CPM+1)值，并且通过获取每位患者每组基因的平均表达来计算基因标记评分。然后通过将CP炎性标记除以CI炎性标记来计算COX-2比率。caret包用于所有模型训练。使用DMwR包以将SMOTE方法用于类平衡。

Mcdermott et al：

在目的基因标记中，仅CSF3基因(CP炎症标记的一部分)未以足以满足截止标准的水平表达。总共有81名用单药剂阿特珠单抗治疗的患者有响应数据。首先，使用广义线性模型(GLM)对整个数据集进行建模，以使用单独的标记或不同的基因标记组合作为输入变量来预测响应的概率。这样做是为了使用卡方检验比较嵌套模型来询问CP标记是否为该数据集中的CI标记增加了预测值。单独CP标记和COX-2比率变量解释了患者响应中的显著水平变化，NK细胞也是如此。有趣的是，在多变量GLM中CP与CI标记之间存在显著的相互作用，表明这两个炎性评分之间存在一定的相互依赖性。

然后，以更稳健的方式测试了这些模型的预测值。为此，利用100个重复进行了5折交叉验证。使用Cohen’s Kappa作为模型性能的估计来对这些模型进行训练。此外，已知该组群中只有25％(20/81)的响应者，在模型训练过程中使用了SMOTE方法来平衡类别。通过不同模型之间的交叉验证比较了Kappa值。具有最高平均Kappa值的模型是将CP标记与T细胞炎性GEP标记组合的模型(Ayers et al.，2017)。然而，值得注意的是，该模型与单独COX-2比率之间没有显著差异。实际上，所有最佳模型都将癌症抑制性炎症要素与CP炎症基因标记组合在一起。

此外，临床分类器适用于确定基因标记模型是否比单纯利用常规临床信息更精确地预测结果。包含基因标记作为输入的最佳预测模型优于临床分类器。将逐步向后选择程序应用于临床分类器，并将其余变量组合到具有不同基因标记的模型中。随后，最佳模型并入了COX-2比率与临床信息以及一些基因组标志物(肝转移、先前的肾切除术、MSKCC分类、CD8A IHC、CD31 IHC、TMB、TNB、PBRM1、SETD2、VHL、MTOR和BAP1突变状态)。与临床分类器组合，COX-2比率再次获得了稳健的预测能力，类似于将CP标记与代表不同CI炎症方面的不同标记组合在一起的其他模型。包含临床变量、基因组标志物和COX-2比率的模型的平均Cohen’s Kappa为0.29，而单独COX-2比率的中位Kappa为0.34，因此，通过并入这些临床和基因组参数并不能获得另外的益处。总之，COX-2比率在肾癌组群中具有预测能力。

Mariathasan et al：

由于低表达，过滤出了HLA-DQA1(T细胞炎性GEP)和CD160(NK标记)。对整个组群(n＝298)建模以确定CP炎症是否再次为CI炎症增加了益处，以预测结果。使用卡方检验比较嵌套模型，本发明人能够证明CP标记在单独CI标记之上增加了显著的预测值。在这种情况下，这两个变量的相互作用项没有增加的益处。与这些观察结果一致，COX-2比率也能够解释患者响应的显著水平变化，类似于组合的CP和CI广义线性模型。接下来，本发明人询问CP炎症是否在肿瘤突变负荷(TMB)之上增加了预测值，这在预测该数据集中的结果方面特别强有力。尽管CP标记不能改善包含TMB的模型，但COX-2比率能够为该数据集中包含仅TMB的模型增加统计学上显著的预测能力(卡方P值0.0367)。

接下来，使用与Mcdermott et al完全相同的方法进行交叉验证，所不同的是进行10折交叉验证而不是5折交叉验证。这是因为Mariathasan组群是更大的数据集，以使得每折仍然可包含足够的响应者。另外，并入了将基因标记与TMB组合在一起的模型。在受试模型中，最佳中位Kappa值是TMB*COX-2比率模型(0.327)。重要的是，与单独TMB相比，TMB*COX-2比率模型在交叉验证中实现了显著更高的Kappa值，从而证明了可以通过将其与COX-2比率组合来改善TMB。

如对于先前的数据集，利用可在数据中获得的多种临床变量构建了临床分类器。向后选择之后，模型中仅保留了基线ECOG评分和TMB。接下来，构建了包含ECOG评分、TMB、COX-2比率以及TMB和COX-2比率的相互作用项的模型。卡方检验显示，COX-2比率在这两个变量之上增加了预测值(p值0.078，偏差3.1)，并且进一步向后选择未能消除COX-2比率，这再次表明COX-2比率有助于将患者分为响应者和非响应者。

结论：

总的来说，数条证据强调了将CP炎症与CI炎症的测量组合以帮助更精确地分类患者的价值。COX-2比率是并入两个不同标记评分的单变量，其优于将比率本身的各要素组合的模型。

实施例10：将COX-2比率分析扩展到另外的经历免疫检查点阻断(ICB)的患者组群

已经将上面在实施例6至8中描述的分析扩展到另外的癌症类型和另外的治疗(参见图8至11)。

对经历免疫检查点阻断(ICB)的不同患者组群的进一步生物信息学分析显示，基于其治疗前活检物中的COX-IS进行分层的患者与多种恶性肿瘤中的患者益处相关(图10A和10B)：黑素瘤、尿路上皮(膀胱)、胃和肾(肾细胞癌)。

该分析还表明，COX-IS与先前未治疗过的患者(treatment

patients)或经过大量预先治疗的患者中不同免疫检查点阻断药物及组合的结果相关。示出了以下的数据：利用抗PD-L1、抗PD1或抗CTLA4 Ab的单一治疗或者抗PD-1和抗CTLA4的组合或抗PDL-1和VEGF抑制剂的组合(参见图11M和11N)。

用抗PDL1、抗PD-1或抗CTLA4(图10A)治疗的黑素瘤、膀胱癌、肾癌和胃癌患者中的先前未治疗过的患者或预先治疗的患者的另外组群表明，非响应者和响应者患者(如那些研究中每一个中定义的)具有显著不同的COX-IS值。因此，COX-IS与多种恶性肿瘤的不同免疫检查点阻断药物的结果相关。

在每种特定肿瘤类型中的响应者和非响应者内，COX炎性标记(也称COX-2比率、COX-IS或ISAC)是可比较的(图10B)。

COX-2标记与LUAD、HNSC、TNBC、转移性SKCM(M-SKCM)和CESC(宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌)的结果(总体存活)相关(图8A和8B)。

多变量分析表明，在TCGA组群(图9)和用ICB治疗的患者(图11B)二者中，COX-IS是调整经典临床参数(阶段、性别、年龄等-取决于肿瘤类型，例如HNSC的HPV+)之后的总体存活的独立预后指标。

来自TCGA(癌症基因组图谱)的泛癌症分析表明，整合癌症促进(CP)和癌症抑制(CI)炎症介质鉴定了高风险患者(图8C和8D)，即使当其具有高的肿瘤浸润CD8+T细胞水平(图8E，例如黄色组(从左数第二个)相对于蓝色组(从左数第四个))。

来自Van Allen et al Science 2015的抗CTLA-4(伊匹单抗)治疗的黑素瘤患者(图10和图11F中的数据集2)的数据进一步强调了整合CP和CI来预测患者结局的显著效果。相反，基于CI(等同于使用IFN-γ标记)的分层与结局无关。

另外的数据表明，COX-IS为治疗响应的已确定的当前生物标志物(例如肿瘤突变负荷(TMB)或PDL1表达(在原始论文中由组织学确定)增加了预测能力。应当指出，尽管在膀胱癌(数据集#5)中，TMB(肿瘤突变负荷)与响应密切相关，但对于肾癌患者(数据集#7)却并非如此。此外，如技术人员将理解的，与获得提供COX-IS比率的肿瘤基因表达值的要求相比，确定TMB所需的测序可能是费力的或昂贵的。因此，在一些情况下，本发明的COX-IS标记可以比其他生物标志物(例如TMB)更快、更便宜、更高效和/或更有效。与作为预测因子的TMB的更高癌症特异性性质(即，TMB在膀胱癌中具有预测性，但在肾癌中没有)相反，COX-IS在本文中显示为在多种癌症类型(即，泛癌症)中具有预测性。

比较数据集#5中明确定义的响应者和非响应者组(进行性疾病相对于完全响应)，表明与其他先前发表的基因标记(包括Mariathasan et al Nature研究中报道的成纤维细胞标记)相比，COX-IS标记是结果的最佳预测因子-参见图11E。通过集中于明确定义的组(进行性疾病相对于完全响应者)，可以从对象分类中消除一定程度的临床医生主观性，从而使对结果状态的错误分类最小化或得以避免。

实施例11-用于计算COX-2比率的替代方法的比较

用于将CP和CI基因标记组合起来的方法可以利用两种标记的平均表达值，然后计算这两个值的比率。本发明人寻求将这种方法与其他评分方法进行比较，以根据预测能力和其他输出得出COX-2比率。相对于原始COX-2比率方法(方法1)测试了四种其他方法。

对于方法2，通过计算CP和CI标记的平均z评分然后从CP中减去CI来对标记进行评分。

对于方法3，计算整个组群(Mariathasan n＝348，Mcdermott n＝263)中每种基因的中位值。对于每种基因，如果表达值大于群体中该基因的中位值，则赋予+1值。然后，在将其通过基因长度进行归一化(将其乘以CI的长度除以CP的长度)之后，从CP基因评分的总和中减去CI基因评分的总和。

方法4和5使用了与方法3类似的方法，不同之处在于使用了z评分，并且不是使用中位截止值，而是使用了三部分评分系统。z评分＞0.1分配+1评分，并且＜-0.1则分配-1评分。在0.1与-0.1截止值之间，赋予0评分。同样，从CP评分的总和中减去CI评分的总和。对于方法5，使用的截止值改为0.3/-0.3。

在尿路上皮癌组群中，COX-2比率(方法1)在响应者与非响应者之间具有最显著差异(图12，顶部)。在肾癌中(图12，底部)，方法3最有效地区分了响应者和非响应者。但是，类似于Mariathasan组群，评分方法之间没有实质程度的差异，表明不同的用于确定COX-2比率的方法可以同样地提供信息。相关的点是，将CP炎症标记与CI炎症标记组合起来具有比使用任一单独的标记更大的预测值，而且这种方法似乎可提供除例如性别、年龄、种族和转移的临床特征之外的另外的预后和预测信息。此外，有证据表明，这种方法可以改善临床上已使用的基因组和转录物组生物标志物(例如肿瘤突变负荷(TMB)和PD-L1免疫组织化学)的预测能力。无论是使用基于Z评分的方法还是利用表达值本身来产生评分，这两个基因集的组合似乎都是最重要的。

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Claims (28)

1.用于预测哺乳动物癌症患者对抗癌免疫治疗的治疗响应的方法，所述方法包括：

a)测量获自所述患者的肿瘤的样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种(例如全部)以下癌症促进基因的基因表达：PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A；

b)测量获自所述患者的肿瘤的样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种(例如全部)以下癌症抑制基因的基因表达：CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A；

c)计算所述至少2种癌症促进基因的基因表达与所述至少2种癌症抑制基因的基因表达的比率；以及

d)基于在步骤c)中计算的基因表达比率对所述患者的治疗响应和/或预后作出预测。

2.权利要求1所述的方法，其中所述比率是全部所述癌症促进基因PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A与全部所述癌症抑制基因CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A的基因表达的比率。

3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述比率根据下式计算：

其中n_p是所述癌症促进基因的数目并且n_n是所述癌症抑制基因的数目，G_i ^pos和G_i ^neg分别是在(i)单位值区间内的正相关和负相关基因，(e)表示基因表达值，表示为log2每百万计数(CPM)。

4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因中每一种的表达水平是归一化的基因表达水平。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将在步骤c)中计算的所述基因表达比率以患有与所述癌症患者相同类型癌症的癌症患者样品组群的中位基因表达比率作为参照，所述中位基因表达比率用作阈值，并且其中：

计算的基因表达比率高于所述阈值指示所述癌症患者对所述抗癌免疫治疗具有不良治疗响应的风险高和/或与癌症患者的所述样品组群的中位存活时间相比具有更短存活时间的风险高；并且

计算的基因表达比率低于所述阈值指示所述癌症患者对所述抗癌免疫治疗具有不良治疗响应的风险低和/或与癌症患者的所述样品组群的中位存活时间相比具有更短存活时间的风险低。

6.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是所述给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中所述给定基因的平均表达，并且σ是所述训练集中所述给定基因的基因表达的标准偏差；以及

从所述至少2种癌症促进基因的z评分中减去所述至少2种癌症抑制基因的z评分。

7.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算包含多个癌症对象的训练集中所述至少两种癌症促进基因和所述至少两种癌症抑制基因中每一种的中位基因表达值，

对于所述基因中的每一种，当所述癌症患者的表达值大于所述训练集中该基因的中位值时，赋予+1值，

将所述癌症抑制基因评分相加，并且将所述癌症促进基因评分相加，以及

从总癌症促进基因评分中减去总癌症抑制基因评分，之前任选地先进行归一化以分别考虑癌症抑制基因的数目和癌症促进基因的数目。

8.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是所述给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中所述给定基因的平均表达，并且σ是所述训练集中所述给定基因的基因表达的标准偏差；

对于所述基因中的每一种，当z评分大于0.1时赋予+1值，当z评分小于-0.1时赋予-1值，并且当z评分在0.1与-0.1之间时赋予0值；

将癌症抑制基因赋予值相加，并且将癌症促进基因赋予值相加，以及

从总癌症促进基因赋予值中减去总癌症抑制基因赋予值。

9.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是所述给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中所述给定基因的平均表达，并且σ是所述训练集中所述给定基因的基因表达的标准偏差；

对于所述基因中的每一种，当z评分大于0.3时赋予+1值，当z评分小于-0.3时赋予-1值，并且当z评分在0.3与-0.3之间时赋予0值；

将癌症抑制基因赋予值相加，并且将癌症促进基因赋予值相加，以及

从总癌症促进基因赋予值中减去总癌症抑制基因赋予值。

10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括评估所述癌症患者的肿瘤负荷和/或新抗原流行率。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、膀胱癌、胃癌或肾细胞癌。

12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中计算的基因表达比率指示所述癌症患者被预测为响应于抗癌免疫治疗，并且所述方法还包括选择所述癌症患者以进行抗癌免疫治疗。

13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗癌免疫治疗包括单独或与VEGF抑制治疗组合的免疫检查点阻断治疗。

14.权利要求13所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括程序性死亡-1(PD-1)阻断、程序性死亡配体1(PD-L1)阻断和/或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)阻断。

15.权利要求1410所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括用纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗和/或伊匹单抗进行的治疗。

16.根据多个癌症患者的此方法预测的抗癌免疫治疗响应来对所述多个癌症患者进行分层的方法，所述方法包括对所述多个癌症患者中的每一个实施前述权利要求中任一项所述的方法。

17.用于预测哺乳动物癌症患者对抗癌免疫治疗的治疗响应的计算机实施方法，所述方法包括：

a)提供包含先前在获自所述患者的肿瘤的样品中测量的至少2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种(例如全部)以下癌症促进基因的表达水平的基因表达数据：PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A；

b)提供包含获自所述患者的肿瘤的样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种(例如全部)以下癌症抑制基因的表达水平的基因表达数据：CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A；

c)计算所述至少2种癌症促进基因的基因表达与所述至少2种癌症抑制基因的基因表达的比率；

d)将来自步骤c)的计算的比率与来源于患有与所述癌症患者相同类型癌症的癌症患者样品组群的参考中位基因表达比率进行比较；以及

e)基于在步骤d)中进行的比较对所述癌症患者的治疗响应和/或预后作出预测。

18.权利要求17所述的方法，其中所述比率是全部所述癌症促进基因PTGS2、VEGFA、CCL2、IL8、CXCL2、CXCL1、CSF3、IL6、IL1B和IL1A与全部所述癌症抑制基因CXCL11、CXCL10、CXCL9、CCL5、TBX21、EOMES、CD8B、CD8A、PRF1、GZMB、GZMA、STAT1、IFNG、IL12B和IL12A的基因表达的比率。

19.权利要求17或权利要求1814所述的方法，其中所述比率根据下式计算：

其中n_p是所述癌症促进基因的数目并且n_n是所述癌症抑制基因的数目，G_i ^pos和G_i ^neg分别是在(i)单位值区间内的正相关和负相关基因，(e)表示基因表达值，表示为log2每百万计数(CPM)。

20.权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述基因中每一种的表达水平是归一化的基因表达水平。

21.权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是所述给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中所述给定基因的平均表达，并且σ是所述训练集中所述给定基因的基因表达的标准偏差；以及

从所述至少2种癌症促进基因的z评分中减去所述至少2种癌症抑制基因的z评分。

22.权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算包含多个癌症对象的训练集中所述至少两种癌症促进基因和所述至少两种癌症抑制基因中每一种的中位基因表达值，

对于所述基因中的每一种，当所述癌症患者的表达值大于所述训练集中该基因的中位值时，赋予+1值，

将所述癌症抑制基因评分相加，并且将所述癌症促进基因评分相加，以及

从总癌症促进基因评分中减去总癌症抑制基因评分，任选地在之前通过基因长度进行归一化。

23.权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是所述给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中所述给定基因的平均表达，并且σ是所述训练集中所述给定基因的基因表达的标准偏差；

对于所述基因中的每一种，当z评分大于0.1时赋予+1值，当z评分小于-0.1时赋予-1值，并且当z评分在0.1与-0.1之间时赋予0值；

将癌症抑制基因赋予值相加，并且将癌症促进基因赋予值相加，以及

从总癌症促进基因赋予值中减去总癌症抑制基因赋予值。

24.权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述比率通过以下计算：

计算所述至少2种癌症促进基因的平均基因表达z评分和所述至少2种癌症抑制基因的平均基因表达z评分，其中所述z评分根据下式计算

其中z是给定基因的基因表达z评分，x是所述给定基因的基因表达，μ是在包含多个癌症对象的训练集中所述给定基因的平均表达，并且σ是所述训练集中所述给定基因的基因表达的标准偏差；

对于所述基因中的每一种，当z评分大于0.3时赋予+1值，当z评分小于-0.3时赋予-1值，并且当z评分在0.3与-0.3之间时赋予0值；

将癌症抑制基因赋予值相加，并且将癌症促进基因赋予值相加，以及

从总癌症促进基因赋予值中减去总癌症抑制基因赋予值。

25.在哺乳动物患者中治疗癌症的方法，其包括：

(a)实施权利要求1至15中任一项所述的方法；

(b)确定在步骤c)中计算的基因表达比率指示癌症患者被预测为响应于抗癌免疫治疗；以及

(c)向有此需要的患者施用免疫检查点阻断治疗。

26.权利要求25所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括程序性死亡-1(PD-1)阻断、程序性死亡配体1(PD-L1)阻断和/或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)阻断。

27.权利要求26所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括用治疗有效量的纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗和/或伊匹单抗进行的治疗。

28.权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗与抗VEGF治疗组合。

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