RU2800949C1 - СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ОСНОВЕ НАНО- И/ИЛИ МИКРОЧАСТИЦ ZnO2 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОМ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ АНАЛИЗЕ С УЧАСТИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ - Google Patents
СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ОСНОВЕ НАНО- И/ИЛИ МИКРОЧАСТИЦ ZnO2 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОМ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ АНАЛИЗЕ С УЧАСТИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2800949C1 RU2800949C1 RU2022118324A RU2022118324A RU2800949C1 RU 2800949 C1 RU2800949 C1 RU 2800949C1 RU 2022118324 A RU2022118324 A RU 2022118324A RU 2022118324 A RU2022118324 A RU 2022118324A RU 2800949 C1 RU2800949 C1 RU 2800949C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peroxidase
- spectrophotometric
- hydrogen peroxide
- sample
- luminescent
- Prior art date
Links
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 113
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 47
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 28
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 claims description 9
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 9
- VZPGINJWPPHRLS-UHFFFAOYSA-N phenazine-2,3-diamine Chemical compound C1=CC=C2N=C(C=C(C(N)=C3)N)C3=NC2=C1 VZPGINJWPPHRLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DLINORNFHVEIFE-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide;zinc Chemical compound [Zn].OO DLINORNFHVEIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 6
- 229940105296 zinc peroxide Drugs 0.000 claims description 6
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 claims description 5
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 4
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 4
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- 150000005839 radical cations Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 3
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 claims description 3
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 claims description 3
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 3
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 3
- PFTAWBLQPZVEMU-ZFWWWQNUSA-N (+)-epicatechin Natural products C1([C@@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-ZFWWWQNUSA-N 0.000 claims description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-UKRRQHHQSA-N (-)-epicatechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-UKRRQHHQSA-N 0.000 claims description 2
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 claims description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- LPTRNLNOHUVQMS-UHFFFAOYSA-N epicatechin Natural products Cc1cc(O)cc2OC(C(O)Cc12)c1ccc(O)c(O)c1 LPTRNLNOHUVQMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000012734 epicatechin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 claims description 2
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 2
- 150000002990 phenothiazines Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 claims description 2
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 claims description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- -1 tin halides Chemical class 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000011066 ex-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SPAGIJMPHSUYSE-UHFFFAOYSA-N Magnesium peroxide Chemical compound [Mg+2].[O-][O-] SPAGIJMPHSUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 229940087373 calcium oxide Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229960004995 magnesium peroxide Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 2
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006230 acetylene black Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100001240 inorganic pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910000000 metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004692 metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004972 metal peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009428 plumbing Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000007870 radical polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N zafuleptine Chemical compound OC(=O)CCCCCC(C(C)C)NCC1=CC=C(F)C=C1 YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Настоящее изобретение относится к аналитической химии, в частности, к композициям и комплектам для использования в спектрофотометрическом (в том числе колориметрическом) и люминесцентном (флуоресцентном, хемилюминесцентном, биолюминесцентном) анализе, в том числе биоаналитических, биосенсорных и медицинских технологиях. Раскрывается применение нано- и/или микрочастиц ZnO2 для генерации пероксида водорода для использования в системах с пероксидазой для спектрофотометрического и люминесцентного обнаружения и/или определения как самой пероксидазы, так и её субстратов. Также в изобретении описан способ генерации пероксида водорода на основе нано- и/или микрочастиц ZnO2 для применения в спектрофотометрическом и люминесцентном анализе с участием пероксидазы. Техническим результатом изобретения является возможность экспресс-определения широкого круга биологически активных веществ, а также пероксидазы по активности фермента, которая контролируется по накоплению окрашенных или люминесцирующих продуктов окисления индикаторных веществ (ТМБ, АБТС, ФДА). При этом достигается воспроизводимость результатов не менее 99 % в случае спектрофотометрического метода анализа и не менее 98% в случае люминесцентого, а время единичного анализа составляет менее 7 мин, что в случае 96-луночного планшета эквивалентно времени анализа 1 пробы менее 5 с. Скорость протекания реакции ферментативного окисления индикаторных субстратов на 30% выше при использовании наночастиц ZnO2, чем при внесении пероксида водорода извне. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к аналитической химии, в частности, к композициям и комплектам для использования в спектрофотометрическом (в том числе колориметрическом) и люминесцентном (флуоресцентном, хемилюминесцентном, биолюминесцентном) анализе, в том числе биоаналитических, биосенсорных и медицинских технологиях. Область применения данной разработки - создание биоаналитических и биосенсорных систем, аналитические исследования, медицинская диагностика, иммуноферментный и ДНК анализ (в том числе за счёт маркирования метками на основе пероксидаз), определение фермент-зависимых биологически активных веществ. Изобретение может быть использовано также при создании биосенсоров на основе ферментов-оксидаз, требующих пероксид водорода в качестве субстрата.
Уровень техники
Генерация пероксида водорода внутри реакционной среды является важной задачей для разработки новых и усовершенствования существующих методов качественного и количественного анализа, основанных на использовании ферментов, в том числе в качестве метки, в биологии, медицине, а также клинической диагностике. Использование пероксида водорода позволяет эффективно совмещать биохимическую и физико-химическую реакции при создании биосенсоров на основе ферментов оксидаз, которые повсеместно применяют в ферментных биосенсорах, в том числе в качестве метки, и катализируемых ими реакциях для определения биологически активных веществ за счёт их связывания со специфическими лигандами.
Подобные методики основаны на способности биологических молекул (рецепторов, антител, нуклеиновых кислот, ферментов) связываться с высокой степенью специфичности с соответствующей ответной частью лиганда-партнёра. Они получили широкое распространение при определении биологически активных веществ, и стали одним из основных инструментов в биологических исследованиях и медицинской диагностике.
Сенсорные системы, основанные на ферментах как в качестве распознающего лиганда, так и в качестве метки получили наибольшее распространение в современном биохимическом анализе.
Одним из классов ферментов, получивших широкое коммерческое распространение, в частности, в иммунноферментом анализе (ИФА или ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), определении олигонуклеотидов, методах гибридизации нуклеиновых кислот - является пероксидаза, которая обладает специфичностью к широкой группе соединений с различными свойствами и структурами. Пероксидаза является двухсубстратным ферментом и катализирует 2 типа связанных реакций: (а) восстановление пероксида водорода до воды и (б) окисление второго субстрата, к которым относятся ароматические амины, фенольные соединения, а также другие вещества.
Содержание указанных выше соединений оценивают по активности фермента пероксидазы, которую, в свою очередь, определяют по накоплению поглощающих или люминесцирующих продуктов окисления индикаторных веществ - субстратов пероксидазы, например, таких как 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонновая кислота (АБТС) и о-фенилендиамин (ФДА), но при этом круг субстратов не ограничивается перечисленными примерами. Выбор субстратов зависит от способа детектирования (спектрофотометрического или люминесцентного), а также от требований к чувствительности анализа.
Несмотря на многочисленные преимущества и широкое применение пероксидазы в биосенсорных технологиях и биоаналитических приложениях системы на ее основе имеют ключевой недостаток. Они требуют добавления извне основного субстрата пероксидазы - пероксида водорода или H2O2, поскольку чрезвычайно сложно включить этот реагент в состав сенсорного устройства на стадии его изготовления. К тому же, пероксид водорода неустойчив при хранении, что требует применения различных методов его стабилизации: с помощью пероксида мочевины [Jones R.M. Stable peroxide substrate formulation // European Patent Office. Vol. 0 279 614], галогенидов олова , с использованием системы стабилизаторов, состоящей из хелатирующего агента фосфоновой кислоты, оловянного стабилизатора, и ароматического хелатирующего соединения [Wang X., Genco K.R. Stabilization of alkaline hydrogen peroxde // United States Patent. 2007. Vol. 2, №12]. При этом описанные методы стабилизации не обеспечивают необходимой для рутинного анализа стабильности сенсоров, а также отрицательно влияют на чувствительность и воспроизводимость аналитического сигнала [Kornienko V.L. et al. The Prospects of the in situ and ex situ Use of Aqueous Solutions of Hydrogen Peroxide Electrogenerated from Oxygen // Russ. J. Electrochem. © Pleiades Publishing, 2020. Vol. 56, №5. P. 427-441]. Альтернативным способом решения обозначенной проблемы может быть разработка способа генерация пероксида водорода непосредственно в реакционной смеси, в составе биоаналитической системы или сенсорного устройства.
Из уровня техники известен способ внутренней генерации пероксида водорода из кислорода на газодиффузионных электродах (ГДЭ) из технического углерода [V. L. Kornienko, G. A. Kolyagin, G. V. Kornienko and T. A. Kenova “The prospects of the in-situ and ex-situ use of aqueous solutions of hydrogen peroxide electrogenerated from oxygen”, Russian Journal of Electrochemistry, 2020, 56, 427-441]. Использование ГДЭ на основе технологического углерода А-437Е (ацетиленовая сажа) и мезоструктурированного углерода ЦМК-3 позволяет получить раствор Н2О2 с концентрацией выше 3 М, который может быть использован с высокой эффективностью как в косвенном электросинтезе важных органических и неорганических целевых продуктов, так и в разрушении органических и неорганических загрязнителей, присутствующих в сточных водах различного происхождения.
Однако известное решение предполагает использование углеродного черного электрода, что из-за окраски инструмента будет осложнять детектирование. При этом при электролизе возможно побочное окисление и разрушение молекул хромогенных субстратов, мешающее контролируемому процессу окисления сгенерированным пероксидом водорода. Наконец, генерация пероксида водорода с эффективностью 96% по данной методике занимает 30 мин, что ухудшает точность анализа, его воспроизводимость и экспрессность. Последнее ограничивает применение такой системы при определении нестабильных во времени аналитов.
Из уровня техники известен способ фотокаталитической внутренней генерации пероксида водорода из пероксосоединений [Lanchuk Y. v. et al. “Towards sustainable diagnostics: replacing unstable H 2 O 2 by photoactive TiO 2 in testing systems for visible and tangible diagnostics for use by blind people”, RSC Advances, Royal Society of Chemistry, 2018. Vol. 8, № 66. P. 37735-37739]. Авторы работы предлагают заменить нестабильный H2O2 на стабильный TiO2 в качестве альтернативного источника инициаторов радикальной полимеризации акриламида с целью создания визуального и тактильного портативного датчика для обнаружения биологически важных молекул (ДНК, РНК, АТФ). Пероксид водорода генерируется непосредственно в среде реакции путём восстановления растворённого в водном растворе кислорода воздуха фотогенерированными электронами, образующимися при УФ-облучении водного раствора наночастиц TiO2. TiO2 разрушает структуру воды под действием облучения, что приводит к образованию высокой концентрации активных форм кислорода, в том числе и пероксида водорода, а также свободных радикалов.
Однако данный способ неспецифичен и неселективен: процесс УФ-облучения будет приводить к окислению большинства компонентов системы, а не только требуемых аналитов. При этом УФ излучение также может приводить и к разрушению некоторых участвующих в процессе органических молекул. Кроме того, количество получаемого по данной методике пероксида водорода (на уровне единиц микромолярных концентраций) недостаточно для проведения реакции пероксидазного окисления индикаторных веществ - вторых субстратов фермента.
Из уровня техники известен способ электролиза воды для получения пероксида водорода по мере необходимости: водород и кислород смешиваются в электролизере, и затем их смесь в воде подается в реактор для получения целевого реагента [Патент KR20090014396A, 10.02.2009]. Раствор производится без необходимости добавления дополнительных реагентов. Настоящее изобретение обеспечивает производство водного раствора пероксида водорода в виде потока последовательно или параллельно стандартному водопроводу. Газообразный водород и кислород, полученные из водопроводной воды в электролитической ячейке, направляют в реактор, сообщающийся с электролизером и расположенном между электролизером и выпускным отверстием, где затем они реагируют в присутствии катализатора (на основе платины, палладия, рутения, родия, иридия, осмия и золота) с образованием перекиси водорода в водной фазе, которая затем выводится через выпускное отверстие. Датчики обнаружения пероксида водорода в данном изобретении включают спектроскопические методы, такие как методы ультрафиолетовой или инфракрасной спектроскопии, а также потенциометрические методы.
Тем не менее данный способ генерации пероксида водорода не подходит для создания компактных биосенсорных и биоаналитических систем. К тому же, как было показано выше, электрохимическая генерация требует определённого времени для накопления необходимого количества пероксида водорода и может сопровождаться разрушением органических молекул и биологических объектов.
Наиболее близким к заявляемому является способ генерации пероксида водорода с помощью пероксида кальция и магния [Waite, A. J., Bonner, J. S., Austenite, R. «Kinetics and stoichiometry of oxygen release from solid peroxides». Environ. Eng. Sci. 1999, 16, 187-199]. Данный способ заключается во внесении твёрдых частиц пероксида кальция и магния в водный раствор щелочей с рН от 8 до 10, в результате поверхностной реакции выделяется пероксид водорода в количестве до 50% от содержащегося в системе.
Эти твердые формы пероксидов широко используются для экологических целей благодаря их стабильности в водных растворах с высоким pH. Сообщается о стабильности пероксидов кальция и магния, которую можно сравнить с гидроксидом металла, который создает растущий барьер массопереноса, что замедляет дальнейшее высвобождение пероксида водорода, а также помогает сохранить высокий рН в слоях вблизи пероксосоединения.
Однако, транспортный барьер, образующийся при осаждении гидроксида в наночастицах, слишком тонок, чтобы заметно замедлить выделение пероксида водорода и позволить осуществлять процесс более контролируемо. Тем более в области, близкой к нейтральному рН, а также при кислом pH предпочтительно быстрое растворение за счет реакции MO2 (тв) + 2H+ (жидк) → M2+ (жидк) + H2O2 (жидк).
Кроме того, данный способ ограничен в применении только в щелочных условиях, так как пероксиды кальция и магния высвобождают пероксид водорода только при рН = 9, что не совместимо с областью максимальной активности пероксидазы из корней хрена (рН ~ 6) и не подходит для целей анализа, где она применяется.
Таким образом существует потребность в разработке способа генерации пероксида водорода, который, во-первых, основывается на недорогих материалах стабильных при длительном хранении (чистый пероксид водорода не стабилен), во-вторых, протекает при рН, близких к рН максимальной активности пероксидаз (улучшение кинетических параметров биохимических реакций), в-третьих, не имеет значительного поглощения и/или флуоресценции в ближней ультрафиолетовой и видимой части спектра (требования для спектрофотометрического и флуориметрического детектирования).
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа внутренней (in-situ) генерации H2O2 по требованию (on-demand) с помощью регулировки pH системы буферным раствором для непосредственного использования в сенсорных системах, требующих присутствия пероксида водорода для своей работы, в частности, в системах, которые содержат пероксидазу. Для решения данной задачи предлагается использовать наночастицы ZnO2, стабильные как при хранении, так и при приготовлении раствора с рН выше 7.
Заявляемое изобретение устраняет вышеперечисленные недостатки аналогов.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом изобретения является возможность экспресс-определения широкого круга биологически активных веществ, а также пероксидазы по активности фермента, которая контролируется по накоплению окрашенных или люминесцирующих продуктов окисления индикаторных веществ (ТМБ, АБТС, ФДА). При этом достигается воспроизводимость результатов не менее 99 % в случае спектрофотометрического метода анализа и не менее 98% в случае люминесцентого, а время единичного анализа составляет менее 7 мин, что в случае 96-луночного планшета эквивалентно времени анализа 1 пробы менее 5 с. Скорость протекания реакции ферментативного окисления индикаторных субстратов на 30% выше при использовании наночастиц ZnO2, чем при внесении пероксида водорода извне.
При этом нано- и микрочастицы ZnO2 стабильны в течение длительного времени (более года) при хранении на воздухе без доступа CO2. В чистом виде пероксид водорода не стабилен при длительном хранении, поэтому для его стабилизации используют специальные вещества, которые, в том числе, могу влиять на протекание процессов пероксидазного окисления. Таким образом, использование стабильных при длительном хранении частиц ZnO2 позволяет улучшить воспроизводимость получаемых результатов и повысить скорость протекания реакции пероксидазного оксиления.
Технический результат достигается применением нано- и/или микрочастиц ZnO2 для генерации пероксида водорода для использования в системах с пероксидазой для спектрофотометрического и люминесцентного обнаружения и/или определения как самой пероксидазы, так и её субстратов. Нано- и/или микрочастицы ZnO2 используют в виде суспензии как в водных, так и не водных растворителях, на поверхности или в объёме полимерных плёнок.
Также технический результат достигается способом генерации пероксида водорода на основе нано- и/или микрочастиц ZnO2 для применения в спектрофотометрическом и люминесцентном анализе с участием пероксидазы, включающий добавление раствора фермента в буферном растворе с рН < 6 в количестве, обеспечивающем проведения реакции перекисного окисления, внесении пробы, содержащей индикаторный субстрат, с последующим добавлением в полученную смесь заранее приготовленной суспензии наночастиц пероксида цинка, после чего проводят обнаружение и определение активности пероксидазы и/или содержания окисленных продуктов окисления индикаторных субстратов спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом в кювете и/или микропланшете. При этом качественное и количественное определение пероксидазы проводят спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом. В качестве индикаторного субстрата используют вещества - красители или биологически-активные вещества, являющиеся субстратами пероксидазы и изменяющие свою окраску в ходе реакции окисления, для их спектрофотометрического и/или флуорометрического определения, а в качестве красителя используют вещества, выбранные из группы, включающей ТМБ, ФДА, АБТС. В качестве биологически-активных веществ используют аскорбиновую кислоту, флавоноиды (такие как эпикатехин и кверцетин, но не ограничиваются ими), витамин В1 (тиамин), гидропероксиды различного строения, фенотиазины, катехоламины и их метаболиты. В качестве пероксидазы используют пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, при этом это не ограничивает применение пероксидаз грибов и животного происхождения, в том числе человека. Пероксидазы содержится в количестве от 0,05 до 1 нМ. В качестве буферного раствора используют буфер с рН в диапазоне 5-6 единиц, в том числе фосфатный буфер, фталатный буферный раствор, ацетатный буферный раствор. Для определения пероксидазы от 5 до 7 минут регистрируют сигналы оптической плотности и интенсивности люминесценции, возбуждения люминесценции в пробе, и при выявлении максимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце. Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 3, 3',5, 5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в диапазоне 370-380 нм и 650-660 нм в случае образования промежуточного продукта окисления ТМБ (мерихиноидный комплекс); 450-460 нм в случае полного окисления ТМБ до конечного продукта (хинондиимин, ХДИ). Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне а также 420-450 нм в случае перекисного окисления ФДА до финального продукта (2,3-диаминофеназин, ДАФ). Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС) в диапазоне 410-420 нм в случае перекисного окисления АБТС с образованием катион-радикала. Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума интенсивности люминесценции в спектрах испускания её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне от 560 до 580 нм. Для получения сигнала люминесценции (2,3-диаминофеназина, ДАФ) пробу облучают монохроматичным излучением с длиной волны 430 нм.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где:
На фиг. 1 представлено схематическое представление процесса добавления H2O2 извне (верхняя панель) и внутрисистемной генерации (нижняя панель) в объеме образца.
На фиг. 2 представлена схема реакции перекисного окисления рассматриваемых классических субстратов пероксидазы: ТМБ, ФДА и АБТС.
На фиг. 3 представлены рН-зависимости оптической плотности продуктов перекисного окисления указанных хромогенных субстратов, основанные на спектрофотометрических данных в УФ и видимом диапазонах. Проводилось сравнение эффективности окисления субстратов с помощью H2O2, полученным путём внутренней генерации и с помощью добавления H2O2 извне. Позициями на фигурах обозначены: 1 - зависимость оптической плотности от величины рН в случае образования ХДИ с максимумом поглощения при λ = 450 нм и мерихиноидного комплекса с максимумом поглощения при λ = 375/655 нм) при pH = 5,5, 8 и 10; 2 - зависимость оптической плотности от величины рН в случае образования ДАФ с максимумом поглощения при λ = 430 нм при pH = 5.5, 8, 10.
На фиг. 4 представлены данные сравнения кинетики окисления ФДА, катализируемого пероксидазой), при помощи H2O2, добавленным извне, и H2O2, полученного заявляемым способом внутренней генерации путем регулировки pH наночастиц ZnO2. Кинетические кривые построены на основе данных спектров люминесценции при окислении ФДА.
На фиг. 5 представлены данные сравнения кинетики окисления АБТС катализируемого пероксидазой, при помощи H2O2, добавленным извне, и H2O2, полученного заявляемым способом внутренней генерации путем регулировки pH наночастиц ZnO2. Кинетические кривые построены на основе данных спектров поглощения продуктов окисления АБТС.
На фиг. 6 представлены временные зависимости оптической плотности продуктов перекисного окисления субстратов от концентрации пероксидазы в условиях внутренней генерации пероксида водорода, основанные на спектрофотометрических данных в УФ и видимом диапазонах. Позициями на фигурах обозначены: 1 - зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в случае образования ХДИ с максимумом поглощения при λ = 450 нм; 2 - зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в случае образования ДАФ с максимумом поглощения при λ = 430 нм; 3 - зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в случае образования АБТС•+ с максимумом поглощения при λ = 415 нм в период времени 0-10 мин.
На фиг. 7 представлена временная зависимость интенсивности люминесценции продукта перекисного окисления ФДА в условиях внутренней генерации пероксида водорода от концентрации пероксидазы в период времени 0-10 мин.
Осуществление изобретения
Замена добавляемой извне (ex-situ) H2O2 на наночастицы ZnO2, генерирующих пероксид водорода непосредственно в тест-системе под действием буферного раствора с рН < 6 позволяет улучшить воспроизводимость результатов при определении фермент-зависимых биологически активных веществ и повысить скорость протекания реакции пероксидазного оксиления.
Способ внутренней генерации пероксида водорода с помощью наночастиц ZnO2 для определения биологически активных веществ по активности пероксидазы включает смешение пробы, содержащей индикаторный субстрат, с раствором пероксидазы и коллоидным раствором наночастиц ZnO2 с последующим добавлением буферного раствора с рН < 6 в количестве, обеспечивающем проведения реакции перекисного окисления с образованием окрашенных и/или люминесцирующих продуктов.
Предпочтительно в качестве пероксидазы использовать пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, при этом это не ограничивает применение пероксидаз грибов и животного происхождения, в том числе человека.
Среди стабильных пероксидов металлов пероксид цинка ZnO2 перспективен в качестве источника пероксида водорода, поскольку его производство дешево, он имеет длительный срок хранения и количественно выделяет H2O2 при pH ниже 6, что соответствует диапазону pH максимальной активности пероксидазы, согласно реакции:
Таким образом, наночастицы ZnO2 предлагается использовать в качестве материала для внутрисистемной генерации H2O2 как альтернатива добавлению H2O2 извне.
Наночастицы были синтезированы в соответствие с методикой, представленной в публикации [Wolanov Y. et al. Zinc Dioxide Nanoparticulates: A Hydrogen Peroxide Source at Moderate pH // Environ. Sci. Technol. 2013. Vol. 47. P. 8769−8774]: 1,0 г (4,6 ммоль) дигидрата ацетата цинка растворяли в 12 мл 1,1 масс. % раствора пероксида водорода. 25 мл 0,4M (10 ммоль) медленно добавляли до достижения pH = 8-9. В результате были получены сферические агрегаты пероксида цинка со средним диаметром 30-40 нм согласно результатам сканирующей электронной микроскопии.
В случае спектрофотометрического детектирования необходимо присутствие субстрата пероксидазы, в ходе реакции дающее окрашенное соединение. Для этого раствор пробы в кювете или прозрачном микропланшете помещают в спектрофотометр и регистрируют значения оптической плотности в диапазоне от 200 до 900 нм. Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума поглощения её окисленного субстрата в диапазоне: 370-380 нм и 650-660 нм в случае образования промежуточного продукта окисления ТМБ (мерихиноидный комплекс); 450-460 нм в случае полного окисления ТМБ до конечного продукта (хинондиимин, ХДИ); 410-420 нм в случае образования катион-радикала АБТС•+, а также 420-450 нм в случае перекисного окисления ФДА до финального продукта (2,3-диаминофеназин, ДАФ).
В случае люминесцентного детектирования (на примере использования ФДА) пробу облучают монохроматическим излучением с длиной волны в диапазоне 420-450 нм (в нашем случае 430 нм). Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума интенсивности люминесценции её окисленного субстрата 2,3-диаминофеназина в диапазоне от 560 до 580 нм (если быть точнее, то 570 нм). Кинетические данные были получены при измерении флюоресценции через 1, 2, 3, 5 и 10 мин после начала реакции.
Для определения количественного содержания аналитов в исследуемых образцах измеряют интенсивность полученного сигнала (спектрофотометрическое и люминесцентное определение), вывод о количественном содержании делают по предварительно рассчитанным градуировочным зависимостям.
Эффективность такого подхода была продемонстрирована на классических субстратах пероксидазы: 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновая кислота) (АБТС) (спектрофотометрическое), а также о-фенилендиамин (ФДА) (спектрофотометрическое и люминесцентное определение). Система, использующая данный способ генерации пероксида водорода, характеризуется низким пределом обнаружения, высокой селективностью, широким линейным диапазоном определяемых содержаний (концентраций) субстратов пероксидазы, а также высокой воспроизводимостью и экспрессностью.
Получение поглощающих и люминесцирующих продуктов перекисного окисления субстратов пероксидазы как показатель эффективности внутренней генерации пероксида водорода (фиг. 1, 6, 7), включает окисление исходных соединений в присутствии биокатализатора - пероксидазы растительного происхождения, в частности пероксидазы из корней хрена. Для типичных хромо и флуорогенных субстратов пероксидазы (ТМБ, АБТС или ФДА) схемы таких реакций окисления представлены на фиг. 2.
Окисление исходных соединений проводят за счёт внутренней генерации пероксида водорода в биосенсорной и/или биоаналитической системах вместо внесения раствора пероксида водорода извне, при этом возрастает скорость реакции перекисного окисления. Данная схема изобретения существенно упрощает процедуру массового экспрессного анализа - 96 проб за 7 мин, т.е. около 5 с на одну пробу.
Данный способ генерации пероксида водорода может быть использован как при детектировании в кювете (пластиковой, стеклянной или кварцевой), стеклянной пластинке, оптоволокне, так и с любыми цельными или сборными полимерными (например, полистирольными, полипропиленовыми и др.) планшетами с любым количеством лунок, из которых наиболее применимыми являются 6, 12, 24, 48, 72, 96-луночные (но ими не ограничивается), подходящие для проведения спектрофотометрического и люминесцентного анализа. При этом их химическая и термическая устойчивости не имеют значения, поскольку анализ проводится в водной среде при комнатной температуре.
Способ определения продуктов перекисного окисления субстратов пероксидазы, описанного в заявляемом изобретении, включает в себя последовательное введение компонентов реакции: фосфатный буферный раствор (ФБР), раствор пероксидазы, раствор субстрата (ТМБ, АБТС или ФДА), раствор наночастиц ZnO2.
Предпочтительно компоненты реакции вводить поочередно в следующем порядке:
• Наночастицы ZnO2 (100 - 1000 мкМ, растворенные в буферном растворе)
• ФБР (фосфатный буферный раствор; 0,1 - 1 М, pH 4.0 - 5.9)
• Пероксидаза (0.5 - 1 нМ, растворенная в буферном растворе)
После добавления всех перечисленных компонентов реакционную смесь тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность или интенсивность люминесценции (в случае образования люминесцирующего продукта) по истечении 7 мин, так как это соответствует выходу кинетической кривой процесса окисления на плато (фиг. 4, 5).
Фигура 3 представляет сравнение рН-зависимости сигнала (спектрофотометрического и люминесцентного) при добавлении пероксида водорода извне и его внутренней генерации с помощью наночастиц ZnO2.
Исходные зарегистрированные спектры люминесценции представляли собой зависимость интенсивности (I) испускания от длины волны (λ). Для построения кинетической кривой окисления ФДА была использована дополнительная математическая обработка интенсивности люминесцентного сигнала: для описания кинетический кривых ферментативно-катализируемого процесса перекисного окисления использовался алгоритм интегрирования с экспоненциальной моделью.
Предлагаемое изобретение также позволяет сократить время проведения единичного анализа на 30%, что может быть использовано в аналитических исследованиях, массовых анализах биологических жидкостей в целях медицинской диагностики, иммуноферментном и ДНК анализе, биохимических исследованиях для определения широкого круга аналитов.
Качественное и количественное определение и вывод о присутствии того или иного субстрата пероксидазы делают по наличию максимумов в спектрах поглощения и испускания и их интенсивности, как было описано выше.
В настоящем изобретении приняты следующие обозначения и термины:
R - коэффициент корреляции,
λem - длина волны испускания (эмиссии),
λex - длина волны возбуждения люминесценции,
ПКХ - пероксидаза из корней хрена,
ФБР - фосфатный буферный раствор,
ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин,
ФДА - о-фенилендиамин,
ХДИ - хинондиимин,
ДАФ -2,3-диаминофеназин,
АБТС - 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновая кислота),
АБТС•+ - катион-радикал АБТС.
Химические символы / сокращения имеют свои обычные значения: °С (градус (градусы) Цельсия), нм (нанометр (нанометры)), мм (миллиметр (миллиметры)), мин (минута (минуты)), с (секунда (секунды)), мкл (микролитр (микролитры)), М (моль (моли) в литре), л (литр (литры)), мкл (микролитр (микролитры)), мг (миллиграмм (миллиграммы)), нмоль (наномоль (наномоли)), нМ (наномоль (наномоли) в литре), мкМ (микромоль (микромоли) в литре), мМ (миллимоль (миллимоли) в литре), В (вольт (вольты)).
Наночастицы - частицы материала размером от 0.1 до 100 нм, микрочастицы - частицы размером от 100 нм и до 100 микрометров.
Индикаторный субстрат - вещество, являющиеся субстратом пероксидазы и способное изменять свою окраску в ходе реакции окисления, что делает возможным спектрофотометрическое и/или флуорометрическое обнаружение и/или определение данного вещества. Примерами индикаторных субстратов являются ТМБ, ФДА, АБТС, но ими не ограничиваются.
Представленные ниже примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, но не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.
Все приведенные ниже реагенты, кюветы и планшеты являются коммерчески доступными. Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C; в ходе всех экспериментов для приготовления водных растворов использовали деионизированную воду высокой чистоты, очищенную с использованием установки «Milli-Q», «Millipore»; измерение рН буферного раствора проводили на рН - милливольтметре «Hanna Instruments» (Германия); для фиксирования времени проведения индикаторных реакций применяли секундомер фирмы «Агат» (Россия) с погрешностью ±0.2 с. Спектры поглощения в УФ и видимой областях регистрировали с использованием спектрофотометра SPECTROstar Nano («BMG Labtech», Германия) с точностью ±0.003 опт. ед. Сбор данных и обработку спектров проводили с помощью програмного обеспечения SPECTROstar Nano MARS («BMG Labtech», Германия); интенсивность люминесценции и спектры испускания регистрировали на спектрофлуориметре Cary Eclipce («Agilent Technologies», США); для измерений в растворе использовали 96-луночный полистирольном планшет белого цвета («Costar», США) (объем ячейки 300 мкл); ультразвуковую обработку проводили с использованием ультразвуковой ванны «Сапфир 680» (ПКФ Сапфир, Россия); взвешивание препаратов проводили с точностью ±0.02 мг на аналитических весах «Discovery», «OHAUS»; точные объемы жидкостей отбирали с использованием автоматических дозаторов «Eppendorf» с диапазонами объемов: 2 - 20, 10 - 100, 20 - 200, 100 - 1 000 и 500 - 5 000 мкл.
Пример 1. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления ТМБ в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью спектрофотометрического детектирования.
Способ определения концентрации пероксидазы, при которой достигается наибольшая эффективность перекисного окисления ТМБ, подразумевает получение оптического сигнала при образовании окрашенного продукта (ХДИ).
В 96-луночный прозрачный полистирольный планшет последовательно вводят 204 мкл 0,1 М ФБР с рН = 5.5, 36 мкл 50 мкМ спиртового раствора ТМБ и 30 мкл 100 мкМ раствора наночастиц пероксида цинка в ФБР. Затем вводили от 12 до 60 мкл раствора ПКХ в ФБР, что позволяло варьировать концентрации в диапазоне 0,05 - 1 нМ (фиг. 6). После чего реакционную смесь тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность регулярно каждую минуту до 10 мин. Контрольный опыт проводили аналогично вышеописанной методике за исключением того, что вместо ПКХ вводили ФБР (табл. 1).
Пример 2. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления ФДА в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью спектрофотометрического детектирования.
Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в систему добавляли 32 мкл 50 мкМ водного раствора ФДА (фиг. 6, табл. 1).
Пример 3. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления АБТС в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью спектрофотометрического детектирования.
Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в систему добавляли 48 мкл 50 мкМ водного раствора ФДА (фиг. 6, табл. 1).
Пример 4. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления ФДА в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью люминесцентного детектирования
Способ определения концентрации пероксидазы, при которой достигается наибольшая эффективность перекисного окисления ФДА, подразумевает получение сигнала флюоресценции и его дальнейшей оценки при образовании окрашенного продукта (ДАФ).
В 96-луночный белый полистирольный планшет последовательно вводят 207 мкл 0,1 М ФБР с рН = 5.5, 32 мкл 50 мкМ водного раствора ФДА и 30 мкл 100 мкМ раствора наночастиц пероксида цинка в ФБР. Затем вводили от 12 до 60 мкл раствора ПКХ в ФБР, что позволяло варьировать концентрации в диапазоне 0,05 - 1 нМ (фиг. 7). После чего реакционную смесь тщательно перемешивали и измеряли интенсивность люминесценции регулярно в течение 10 мин. Контрольный опыт проводили аналогично вышеописанной методике за исключением того, что вместо ПКХ вводили ФБР (табл. 2).
| Таблица 1. Временная зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в реакциях перекисного окисления рассматриваемых хромогенных субстратов (ТМБ, ФДА, АБТС) с образованием окрашенных продуктов хинондиимина (ХДИ), 2,3-диаминофеназина (ДАФ), катион-радикала АБТС (АБТС•+) | |||||||||||||||
| СПКХ, нМ | Оптическая плотность (ТМБ, λ = 450 нм) |
Оптическая плотность (ФДА, λ = 430 нм) |
Оптическая плотность (АБТС, λ = 415 нм) |
||||||||||||
| 0 мин | 3 мин | 5 мин | 7 мин | 10 мин | 0 мин | 3 мин | 5 мин | 7 мин | 10 мин | 0 мин | 3 мин | 5 мин | 7 мин | 10 мин | |
| 1,00 | 0,77 | 1,81 | 2,13 | 2,35 | 2,51 | 0,19 | 0,31 | 0,37 | 0,41 | 0,43 | 0,13 | 0,22 | 0,28 | 0,33 | 0,34 |
| 0,50 | 0,36 | 0,74 | 0,86 | 0,94 | 0,99 | 0,16 | 0,22 | 0,27 | 0,30 | 0,32 | 0,10 | 0,14 | 0,17 | 0,20 | 0,21 |
| 0,10 | 0,08 | 0,10 | 0,09 | 0,08 | 0,09 | 0,07 | 0,07 | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,07 | 0,07 | 0,08 | 0,08 | 0,08 |
| 0,05 | 0,07 | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,07 | 0,07 | 0,08 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | 0,07 |
Таблица 2. Временная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации пероксидазы в реакции перекисного окисления ФДА с образованием 2,3-диаминофеназина (ДАФ)
| СПКХ, нМ | Интенсивность флуоресценции, о. е. (ФДА λem = 570 нм: λex = 430 нм) |
||||
| 0 мин | 3 мин | 5 мин | 7 мин | 10 мин | |
| 1,00 | 0,19 | 0,31 | 0,37 | 0,41 | 0,43 |
| 0,50 | 0,16 | 0,22 | 0,27 | 0,30 | 0,32 |
| 0,10 | 0,07 | 0,07 | 0,08 | 0,08 | 0,08 |
| 0,05 | 0,07 | 0,07 | 0,08 | 0,07 | 0,07 |
Claims (16)
1. Применение нано- и/или микрочастиц ZnO2 для генерации пероксида водорода для использования в системах с пероксидазой для спектрофотометрического и люминесцентного обнаружения и/или определения как самой пероксидазы, так и её субстратов.
2. Применение по п.1, характеризующееся тем, что нано- и/или микрочастицы ZnO2 используют в виде суспензии как в водных, так и не водных растворителях, на поверхности или в объёме полимерных плёнок.
3. Способ генерации пероксида водорода на основе нано- и/или микрочастиц ZnO2 для применения в спектрофотометрическом и люминесцентном анализе с участием пероксидазы, включающий добавление раствора фермента в буферном растворе с рН < 6 в количестве, обеспечивающем проведения реакции перекисного окисления, внесении пробы, содержащей индикаторный субстрат, с последующим добавлением в полученную смесь заранее приготовленной суспензии наночастиц пероксида цинка, после чего проводят обнаружение и определение активности пероксидазы и/или содержания окисленных продуктов окисления индикаторных субстратов спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом в кювете и/или микропланшете.
4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что качественное и количественное определение пероксидазы проводят спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом.
5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве индикаторного субстрата используют вещества - красители или биологически-активные вещества, являющиеся субстратами пероксидазы и изменяющие свою окраску в ходе реакции окисления, для их спектрофотометрического и/или флуорометрического определения.
6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что в качестве красителя используют вещества, выбранные из группы, включающей ТМБ, ФДА, АБТС.
7. Способ по п.5, характеризующийся тем, что в качестве биологически-активных веществ используют аскорбиновую кислоту, флавоноиды - такие как эпикатехин и кверцетин, витамин В1, гидропероксиды различного строения, фенотиазины, катехоламины и их метаболиты.
8. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве пероксидазы используют пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, при этом это не ограничивает применение пероксидаз грибов и животного происхождения, в том числе человека.
9. Способ по п.3, характеризующийся тем, что пероксидазы содержится в количестве от 0,05 до 1 нМ.
10. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве буферного раствора используют фосфатный буфер, фталатный буферный раствор, ацетатный буферный раствор.
11. Способ по п.3, характеризующийся тем, что для определения пероксидазы от 5 до 7 минут регистрируют сигналы оптической плотности и интенсивности люминесценции, возбуждения люминесценции в пробе, и при выявлении максимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце.
12. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 3, 3’,5, 5’-тетраметилбензидина (ТМБ) в диапазоне 370-380 нм и 650-660 нм в случае образования промежуточного продукта окисления ТМБ (мерихиноидный комплекс); 450-460 нм в случае полного окисления ТМБ до конечного продукта (хинондиимин, ХДИ).
13. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне а также 420-450 нм в случае перекисного окисления ФДА до финального продукта (2,3-диаминофеназин, ДАФ).
14. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС) в диапазоне 410-420 нм в случае перекисного окисления АБТС с образованием катион-радикала.
15. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума интенсивности люминесценции в спектрах испускания её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне от 560 до 580 нм.
16. Способ по п.13, характеризующийся тем, что для получения сигнала люминесценции (2,3-диаминофеназина, ДАФ) пробу облучают монохроматичным излучением с длиной волны 430 нм.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2800949C1 true RU2800949C1 (ru) | 2023-08-01 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YITZHAK WOLANOV ET AL. ZINC DIOXIDE NANOPARTICULATES: A HYDROGEN PEROXIDE SOURCE AT MODERATE PH. ENVIRON. SCI. TECHNOL. 2013. V. 47. P. 8769−8774;. WAITE, A. J., BONNER, J. S., AUSTENITE, R. "KINETICS AND STOICHIOMETRY OF OXYGEN RELEASE FROM SOLID PEROXIDES". ENVIRON. ENG. SCI. 1999. V 16. N.3. P.187-199. КУРОПТЕВА А.Е. И ДР. IN-SITU ГЕНЕРАЦИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА. ДОКЛАД НА КОНФЕРЕНЦИИ (XXVIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ "ЛОМОНОСОВ 2021"): 2021. МАТЕРИАЛЫ СТЕНДА. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Motomizu et al. | Trace and ultratrace analysis methods for the determination of phosphorus by flow-injection techniques | |
| Sunil et al. | Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide in water and cream samples | |
| CN110057801B (zh) | 一种基于聚集诱导发光性质的荧光比率探针及其过氧化氢和葡萄糖检测应用 | |
| Qiao et al. | A novel colorimetric and fluorometric dual-signal identification of organics and Baijiu based on nanozymes with peroxidase-like activity | |
| CN103048287B (zh) | 基于纳米金模拟过氧化物酶的硫离子测定方法 | |
| Ge et al. | Human serum albumin templated MnO 2 nanosheets as an efficient biomimetic oxidase for biomolecule sensing | |
| CN119044085B (zh) | 一种基于Mn-CDs纳米酶比色传感技术检测谷胱甘肽的方法 | |
| Li et al. | Glucose biosensor based on the room-temperature phosphorescence of TiO2/SiO2 nanocomposite | |
| Matos et al. | Flow-injection system with enzyme reactor for differential amperometric determination of hydrogen peroxide in rainwater | |
| Ahmed et al. | Strong nanozymatic activity of thiocyanate capped gold nanoparticles: an enzyme–nanozyme cascade reaction based dual mode ethanol detection in saliva | |
| CN103760160A (zh) | 一种过氧化氢的比色检测方法 | |
| Tang et al. | A novel sensitive colorimetric sensor for Cu2+ based on in situ formation of fluorescent quantum dots with photocatalytic activity | |
| CN105973879A (zh) | 一种汞离子检测用的纸芯片比色分析系统及其构建方法和应用 | |
| CN111487242A (zh) | 一种基于铁卟啉二维MOFs类酶催化的过氧化氢检测方法 | |
| RU2800949C1 (ru) | СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ОСНОВЕ НАНО- И/ИЛИ МИКРОЧАСТИЦ ZnO2 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОМ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ АНАЛИЗЕ С УЧАСТИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ | |
| Salinas-Castillo et al. | Immobilization of a trienzymatic system in a sol–gel matrix: A new fluorescent biosensor for xanthine | |
| Wang et al. | Diacetyl as a new-type of artificial enzyme to mimic oxidase mediated by light and its application in the detection of glutathione at neutral pH | |
| Ghavamipour et al. | The application of the QDs/H2O2 chemiluminescence system in HRP assay and HRP-based immunoassay | |
| CN114275806A (zh) | 一种镉锌硒量子点及其制备方法和应用、alp检测方法 | |
| JPS63219398A (ja) | 過酸化水素の定量法 | |
| Yao et al. | Modulation of inner filter effect between persistent luminescent particles and 2, 3-diaminophenazine for ratiometric fluorescent assay of ascorbic acid and ascorbate oxidase activity | |
| Liang et al. | A novel method for determination of peroxynitrite based on hemoglobin catalyzed reaction | |
| CN114280024B (zh) | 一种基于铜纳米簇和氧化反应的特异性亚硝酸盐荧光检测方法 | |
| Demirkol et al. | Microfluidic devices and true‐color sensor as platform for glucose oxidase and laccase assays | |
| Zhu et al. | Application ofo-Hydroxyphenylfluorone as a Fluorogenic Indicator to the Determination of Hydrogen Peroxide and Oxidase Substrates Based on the Catalytic Effect of Hemin |