RU2800372C1 - Протективная среда для сублимационного высушивания клеток y. pestis штамма ev - Google Patents
Протективная среда для сублимационного высушивания клеток y. pestis штамма ev Download PDFInfo
- Publication number
- RU2800372C1 RU2800372C1 RU2022122930A RU2022122930A RU2800372C1 RU 2800372 C1 RU2800372 C1 RU 2800372C1 RU 2022122930 A RU2022122930 A RU 2022122930A RU 2022122930 A RU2022122930 A RU 2022122930A RU 2800372 C1 RU2800372 C1 RU 2800372C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- drying
- protective
- cells
- pestis
- lactose
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и относится к протективной среде, разработанной и оптимизированной для процесса сублимационного высушивания клеток Y. pestis штамма EV. Эффективный стабилизирующий защитный комплекс, состоящий из лактозы, полиглюкина и гуаровой камеди, обеспечивает снижение потерь биологической активности клеток в процессе лиофилизации, а также при хранении сухих препаратов. 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к составам лабораторных прописей стабилизирующих и защитных сред, применяемых при лиофилизации бактериальных клеток с целью сохранения их жизнеспособности. Изобретение может быть использовано для получения сухих культур и препаратов, а также в коллекционной работе.
Ввиду того, что бактериальные клетки вакцинного штамма чумного микроба являются слабоустойчивыми к экстремальным воздействиям лиофилизации и хранения, продолжается поиск путей, позволяющих получать сухие высоко активные препараты, длительно сохраняющие свои биологические свойства.
Одним из таких путей является оптимизация состава сложных защитных сред, а в частности включение в состав природных высокомолекулярных, нетоксичных для микробных клеток, структурообразующих компонентов, таких, например, как желатин, агар-агар, карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпироллидон, картофельный крахмал и т.п.
Известна защитная среда, используемая для лиофилизации клеток Lactobacillus acidophilus. [Патент РФ №2169574. Способ получения биопрепарата и сухой биопрепарат. Кубатов А.А., Добролеж О.В. и др., опубл. 27.06.2021 г.]. В состав защитной среды входят: сахароза, желатин, ОСМ, а также специальные добавки полиглюкин и альгинат натрия. Структурообразователи альгинат натрия и полиглюкин, по мнению авторов, создает в водной среде сетчатую пространственную структуру, в узлах которой располагаются микроорганизмы в оболочке из защитных веществ. Такая структура обеспечивает более эффективную защиту биоматериала на стадиях обезвоживания.
Наиболее близкой к заявляемой протективной среде является пропись для высушивания клеток вакцинного штамма чумного микроба [Патент РФ №2510825. Способ получения биопрепарата на основе вакцинного штамма чумного микроба. Тетерин В.В., Ежов А.В. и др., опубл. 10.04.2014 г.]. Среда высушивания содержит: 300 г/л лактозы, 30 г/л тиомочевины, 30 г/л аскорбиновой кислоты, 30 г/л полиглюкин и дистиллированную воду - до расчетного объема. Среда позволяет получать сухие препараты с содержание живых бактерий не более 30%. К недостаткам прототипа можно отнести низкий удельный вес клеток, в получаемых сухих препаратах.
Задачей, на решение которой направлено предполагаемое изобретение, является разработка более эффективной протективной защитной среды, позволяющей снизить потери концентрации жизнеспособных клеток Y. pestis при сублимационном высушивании и повысить стабильность биопрепаратов при разнотемпературном хранении.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в состав защитной среды вводится гуаровая камедь, являющаяся структурообразователем, придающая водной фазе вязкую длинную текстуру. При замораживании гуаровая камедь увеличивает вязкость сконцентрированных замораживанием внеклеточных растворов, что ограничивает подвижность молекул воды и влияет на количество и структуру образующегося льда. Преимуществом гуаровой камеди является то, что ее рабочая концентрация не превышает 0,5%.
В сочетании с лактозой и тиомочевинной гуаровая камедь составляет эффективный протективный комплекс с повышенной криозащитной активностью.
Состав протективной защитной среды, процент (по массе):
лактоза - 11,
полиглюкин - 3,
гуаровая камедь - 0,2,
тиомочевина - 3,
аскорбиновая кислота - 3,
вода - 79,8.
Среду готовят в следующем порядке. Навески полиглюкина и гуаровой камеди замачивают в 1/6 части расчетного объема воды в течение 3-4 часов, затем хорошо перемешивают до полного растворения. Навеску аскорбиновой кислоты растворяют в 1/6 части расчетного объема воды при нагревании на водяной бане при температуре не более 30°С и перемешивании. Полученный раствор аскорбиновой кислоты охлаждают на воздухе до температуры 20-25°С и с помощью 40% раствора едкого натрия подводят величину рН до значений 6,9-7,2 ед. рН.
Навеску лактозы растворяют в оставшейся дистиллированной воде при нагревании на водяной бане до температуры не более 80°С и перемешивании. Затем раствор лактозы охлаждают на воздухе до температуры 40°С и растворяют в нем навеску тиомочевины.
В охлажденный раствор лактозы и тиомочевины вносят растворы полиглюкина, гуаровой камеди и аскорбиновой кислоты, перемешивают и определяют величину рН. При необходимости величину рН среды корректируют 5% раствором едкого натрия до значений 7,0-7,2 ед. рН.
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигнутым техническим результатом показано в таблице 1.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показано следующими примерами.
Пример 1 Контроль (защитная среда - прототип)
Контрольную среду готовили по прописи, представленной в таблице 2.
В соотношении две части к одной части концентрированную суспензию чумного микроба смешивали со средой высушивания. Смесь тщательно перемешивали. Затем стабилизированную суспензию расфасовывали во флаконы. Сублимационное высушивание проводили на установке TG -16 по режиму: температура конденсатора - минус 60°С, температура замораживания материала - минус 40°С, продолжительность выдержки материала при температуре замораживания до начала создания разрежения - 2 часа, величина рабочего вакуума в сублимационной камере - не более 100 мкм рт.ст. (13-15 Па), скорость повышения температуры материала - 3°С/ч, температура досушивания - 25-30°С, продолжительность досушивания - 6 часов.
В результате получали сухой препарат серии 1. Устойчивость клеток к лиофилизации оценивали по показателю жизнеспособности (процент живых клеток), качество процесса высушивания оценивали по показателю остаточной влажности. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Пример 2
Готовили три среды высушивания в соответствии с прописями, представленными в таблице 2. Среды отличались от прототипа сниженным расходом лактозы и различным содержанием гуаровой камеди.
К двум частям концентрированной суспензии клеток Y. pestis штамма EV добавляли одну часть защитной среды, тщательно перемешивали. Смесь охлаждали до температуры 10-15°С. Смесь еще раз перемешивали с помощью миксера со скоростью вращения 1800-2000 об/мин в течение 10-15 секунд. Стабилизированную суспензию клеток разливали во флаконы. Сублимационное высушивание проводили по режимам, указанным в примере 1. Результаты оценки свойств полученных сухих препаратов серий 2, 3, 4, представлены в таблице 2.
Из представленных в таблице 2 данных видно, что заявляемая протективная среда для сублимационного высушивания клеток Y. pestis штамма EV, среда 3, оказалась наиболее эффективной, обладала большей криозащитной активностью, что позволило получить препарат с большим выходом жизнеспособных клеток. Среда 4 была самой гидрофильной, вязкость среды превышала вязкость прототипа на 35%. Вязкость 2 среды была на уровне прототипа, а вязкость 3 среды на 15% выше, чем у прототипа.
Известно, что при существенном увеличении вязкости растворов, увеличивается время высушивания (время достижения равновесной влажности) за счет снижения скорости и интенсивности влагоотдачи [Взаимосвязь между вязкостью раствора, кинетикой процесса сублимационного высушивания и структурой сухого материала. Виноградов Е.Л., Кобатов А.И. и др. Биотехнология, №6,1990, с. 55-57]. Это привело к получению сухого препарата (4 серия) с некондиционным, высоким уровнем остаточной влажности.
Пример 3
Полученные сухие препараты, 1-4 серий, хранили в герметизировонных флаконах в стационарных условиях в трех температурно-временных режимах:
температура от минус 15 до минус 9°С в течение 6 месяцев;
температура от 0 до 4°С в течение 3 месяца;
температура от 18 до 22°С в течение 3 суток.
По завершению указанных сроков хранения оценивали выживаемость бактерий при хранении. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, заявляемый состав защитной среды позволяет повысить термостабильность клеток чумного микроба при хранении в широком диапазоне температур.
Claims (2)
- Протективная среда для сублимационного высушивания клеток Y. pestis штамма EV, представляющая собой водный раствор лактозы, полиглюкина, аскорбиновой кислоты и тиомочевины, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гуаровую камедь при следующем содержании исходных компонентов, мас.%:
-
лактоза 11 полиглюкин 3 аскорбиновая кислота 3 тиомочевина 3 гуаровая камедь 0,2 вода 79,8
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2800372C1 true RU2800372C1 (ru) | 2023-07-20 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2510825C2 (ru) * | 2012-02-27 | 2014-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение "33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Министерства обороны Российской Федерации" | Способ получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2510825C2 (ru) * | 2012-02-27 | 2014-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение "33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Министерства обороны Российской Федерации" | Способ получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ГРАЧЕВА И.В. и др. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протективное действие защитных сред. Проблемы особо опасных инфекций, 2016, 3: 5-12, DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-5-12. AMENAN Y.A., et al., Effect of protectivecompounds on the survival, electrolyte leakage, and lipid degradationof freeze-dried Weissella paramesenteroides LC11 during storage. J.Microbiol. Biotechnol. 2009; 19 (8): 810-7. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Conrad et al. | Stabilization and preservation of Lactobacillus acidophilus in saccharide matrices | |
US8877469B2 (en) | Method of drying biological material | |
CN106520633B (zh) | 一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法 | |
CA2673589C (en) | Method of drying biological material | |
JP2008044953A (ja) | 生物学的物質用の保存及び貯蔵媒体 | |
Paul et al. | Survival of alginate-entrapped cells of Azospirillum lipoferum during dehydration and storage in relation to water properties | |
RU2800372C1 (ru) | Протективная среда для сублимационного высушивания клеток y. pestis штамма ev | |
US20140193456A1 (en) | Method for Drying-Conservation of Natural Substances | |
CN108102982A (zh) | 麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法 | |
CN113881595A (zh) | 一种包含蛋白纤维的乳酸菌发酵剂及其制备方法 | |
JP2003505024A (ja) | 微生物、細胞、および組織の貯蔵 | |
RU2522811C2 (ru) | СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА Xenorhabdus, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕМАТОД ВИДА Steinernema feltiae protense, К ХРАНЕНИЮ | |
CN103329889A (zh) | β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用 | |
Magalhaes et al. | Vitrification successfully preserves hepatocyte spheroids | |
CN116536257A (zh) | 一种用于细胞肉的可食性微载体及其制备方法 | |
CN107232184B (zh) | 关中黑猪的精液常温保存稀释液 | |
Sui et al. | Cryopreservation of cells in 3D constructs based on controlled cell assembly processes | |
CN108485979A (zh) | 一种青贮饲料专用细菌冻干保护剂 | |
Holm-Hansen | Viability of lyophilized algae | |
RU2736064C1 (ru) | Защитная среда для стабилизации клеток возбудителя туляремии в процессе приготовления и хранения сухих препаратов | |
CN112831086A (zh) | 一种用于液体发酵培养的专用固体菌种制备方法及其应用 | |
JP2885805B2 (ja) | 微生物の生存性の維持方法 | |
CN112625910A (zh) | 一种可自动置核的低温保护剂 | |
RU2250781C2 (ru) | Способ изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных | |
RU2746022C1 (ru) | Способ стабилизации бактериальных клеток чумного микроба перед сублимационным высушиванием |