RU2797114C2 - Nanoparticle and pharmaceutical composition for treatment of eye diseases or cancer - Google Patents
Nanoparticle and pharmaceutical composition for treatment of eye diseases or cancer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2797114C2 RU2797114C2 RU2020101917A RU2020101917A RU2797114C2 RU 2797114 C2 RU2797114 C2 RU 2797114C2 RU 2020101917 A RU2020101917 A RU 2020101917A RU 2020101917 A RU2020101917 A RU 2020101917A RU 2797114 C2 RU2797114 C2 RU 2797114C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- albumin
- bevacizumab
- monoclonal antibodies
- cancer
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES
Настоящее изобретение относится к наноразмерным системам доставки лекарственных препаратов, более конкретно - к наночастицам, содержащим матрицу альбумина и моноклональные антитела, для применения для лечения рака и глазных заболеваний. The present invention relates to nanoscale drug delivery systems, more specifically to nanoparticles containing an albumin matrix and monoclonal antibodies for use in the treatment of cancer and eye diseases.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Моноклональные антитела представляют собой интересную группу гликопротеинов для применения в различных областях терапии, таких как лечение рака, аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний и лечение отторжения трансплантата. В настоящее время регулирующими органами (FDA и ЕМЕА) утверждено 30 моноклональных антител.Monoclonal antibodies are an interesting group of glycoproteins for use in various therapeutic areas such as the treatment of cancer, autoimmune and chronic inflammatory diseases, and the treatment of transplant rejection. There are currently 30 monoclonal antibodies approved by regulatory authorities (FDA and EMEA).
Одним из этих моноклональных антител является бевацизумаб, иммуноглобулин G (immunoglobulin G, IgG), который воздействует на VEGF-A (фактор роста эндотелия сосудов) и включает четыре основные изоформы VEGF. Он был утвержден Управлением по контролю за качеством лекарственных средств и пищевых продуктов США (FDA) в 2004 году для применения в качестве терапии первой линии метастатического колоректального рака, а впоследствии также утвержден для лечения других видов рака, таких как немелкоклеточный рак легкого или метастатический рак молочной железы. Недавно бевацизумаб начали применять для лечения глазных заболеваний, в том числе неоваскуляризации роговицы или сетчатки, диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации.One of these monoclonal antibodies is bevacizumab, immunoglobulin G (immunoglobulin G, IgG), which acts on VEGF-A (vascular endothelial growth factor) and includes four major isoforms of VEGF. It was approved by the US Food and Drug Administration (FDA) in 2004 for use as a first-line therapy for metastatic colorectal cancer and subsequently also approved for the treatment of other cancers such as non-small cell lung cancer or metastatic breast cancer. glands. Recently, bevacizumab has been introduced for the treatment of eye conditions, including corneal or retinal neovascularization, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration.
Местное нанесение на поверхность глаза является распространенным способом применения лекарственных препаратов. Тем не менее, защитные механизмы (слезотечение, слезоотделение и слезоотведение) снижают биодоступность лекарственного препарата за счет быстрого удаления композиции. В последние несколько лет было установлено, что интравитреальная инъекция бевацизумаба является очень эффективным вариантом лечения при влажной форме возрастной макулярной дегенерации, пролиферативной диабетической ретинопатии и неоваскуляризации хориоидеи. Краткосрочные результаты показывают, что интравитреальный бевацизумаб хорошо переносится и связан с улучшением остроты зрения, снижением толщины сетчатки и ангиографическим истечением у большинства пациентов. Тем не менее, для достижения и поддержания улучшения остроты зрения требуются многократные инъекции и визиты последующего наблюдения. Это влечет за собой высокий риск осложнений, таких как эндофтальмит, а также повторяющаяся боль, ощущение тревоги и дискомфорт, связанные с введением игл в глаза. Кроме того, период полувыведения бевацизумаба при интравитреальном введении составляет всего около 3 суток.Topical application to the surface of the eye is a common way to administer drugs. However, defense mechanisms (lacrimation, lacrimation and lacrimation) reduce drug bioavailability by rapidly removing the composition. In the past few years, intravitreal injection of bevacizumab has been found to be a very effective treatment option for wet age-related macular degeneration, proliferative diabetic retinopathy, and choroidal neovascularization. Short-term results indicate that intravitreal bevacizumab is well tolerated and is associated with improved visual acuity, reduced retinal thickness, and angiographic bleed in most patients. However, multiple injections and follow-up visits are required to achieve and maintain improvement in visual acuity. This entails a high risk of complications such as endophthalmitis, as well as recurring pain, anxiety, and discomfort associated with inserting needles into the eye. In addition, the half-life of intravitreal bevacizumab is only about 3 days.
В случае лечения рака текущие стратегии лечения, как правило, связаны с инвазивными процессами, включающими применение катетеров для химиотерапии для сокращения размеров опухоли перед ее хирургическим удалением. Программы исследований по улучшению эффективности терапии рака привели к существенному улучшению выживаемости пациентов, тем не менее, проблемы, связанные с токсичными побочными действиями и низким качеством жизни пациентов, остаются актуальными.In the case of cancer treatment, current treatment strategies typically involve invasive procedures, including the use of chemotherapy catheters to shrink the tumor prior to surgical removal. Research programs to improve the effectiveness of cancer therapy have led to a significant improvement in patient survival, however, problems associated with toxic side effects and a poor quality of life for patients remain relevant.
Таким образом, требуется разработка эффективного способа доставки лекарственного препарата, который сделает доставку бевацизумаба, а также других моноклональных антител менее инвазивной и более длительной для лечения рака и глазных заболеваний.Thus, there is a need to develop an efficient drug delivery method that will make the delivery of bevacizumab, as well as other monoclonal antibodies, less invasive and longer for the treatment of cancer and eye diseases.
В этом отношении наночастицы представляют собой подходящий наполнитель для введения лекарственных препаратов и дают многообещающие результаты в области офтальмологии, а также терапии рака. Для подготовки таких наноразмерных систем доставки можно использовать широкий ряд материалов. Например, моноклональные антитела бевацизумаб были включены в наночастицы ПЛГК для лечения возрастной макулярной дегенерации [Нао et al., American Association of Pharmaceutical Scientists (AASP) Annual Meeting and Exposition, Los Angeles, California, November 2009; Li, F. et al., The Open Ophthalmology Journal, 2012, 6, 54-58], а также для лечения неоваскуляризации сетчатки и хориоидеи [Pan CK et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 2011, 27(3), 219-224; Varshochian, R. et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 50, 341-352].In this regard, nanoparticles are a suitable vehicle for drug administration and show promising results in the fields of ophthalmology as well as cancer therapy. A wide range of materials can be used to prepare such nanoscale delivery systems. For example, the monoclonal antibody bevacizumab has been incorporated into PLGA nanoparticles for the treatment of age-related macular degeneration [Hao et al., American Association of Pharmaceutical Scientists (AASP) Annual Meeting and Exposition, Los Angeles, California, November 2009; Li, F. et al., The Open Ophthalmology Journal, 2012, 6, 54-58], as well as for the treatment of retinal and choroidal neovascularization [Pan CK et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 2011, 27(3), 219-224; Varshochian, R. et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 50, 341-352].
Тем не менее, натуральные биополимеры являются более предпочтительными, чем синтетические материалы. В данном отношении для получения наночастиц для доставки лекарственных препаратов человеческий сывороточный альбумин широко применяется в связи с тем фактом, что они являются биосовместимыми, биоразлагаемыми, нетоксичными и неиммуногенными. Наночастицы альбумина привлекли значительное внимание в связи с их высокой способностью к связыванию различных лекарственных препаратов и хорошей переносимостью без серьезных побочных действий.However, natural biopolymers are preferred over synthetic materials. In this respect, human serum albumin has been widely used to prepare nanoparticles for drug delivery due to the fact that they are biocompatible, biodegradable, non-toxic and non-immunogenic. Albumin nanoparticles have attracted considerable attention due to their high drug-binding capacity and good tolerability without serious side effects.
В последние годы предложено большое число различных физико-химических процессов для получения наночастиц альбумина, включая тепловое гелеобразование, эмульгирование и десольватацию (коацервацию). В любом случае процедуры на основе десольватации представляются наиболее популярными благодаря их простоте и воспроизводимости. Тем не менее, недавно полученные наночастицы являются нестабильными и требуют выполнения дополнительного этапа физической, химической или ферментативной стабилизации для продления периода полувыведения в водной среде и/или предотвращения образования макроагрегатов белка.In recent years, a large number of different physicochemical processes have been proposed for the production of albumin nanoparticles, including thermal gelation, emulsification, and desolvation (coacervation). In any case, desolvation-based procedures seem to be the most popular due to their simplicity and reproducibility. However, newly produced nanoparticles are unstable and require an additional step of physical, chemical or enzymatic stabilization to extend the half-life in the aquatic environment and/or prevent the formation of protein macroaggregates.
В целом одной из самых популярных стратегий стабилизации наночастиц альбумина является сшивка альбумина. В публикации Elzoghby et al. [Journal of Controlled Release, 2012, 157, 168-182] используются различные способы получения наночастиц альбумина и их применения в качестве активных систем доставки лекарственных препаратов. Особое внимание уделяется вопросу нестабильности наночастиц в водной среде, для решения которого предусматривается их сшивка с использованием глутаральдегида - химического сшивающего агента, широко известного в данной области техники. В публикации Lohcharoenkal W. et al. [BioMed Research International, 2014] также рассматривается нестабильность наночастиц альбумина при их растворении или коагуляции для образования отдельной фазы, если они находятся в несшитом состоянии. В публикации Llabot et al. [19th International Symposium on Microencapsulation, 2013] описаны наночастицы альбумина, сшитые с полимером Gantrez, который обволакивает бевацизумаб, а также их применение при васкуляризации роговицы.In general, one of the most popular strategies for stabilizing albumin nanoparticles is albumin crosslinking. Elzoghby et al. [Journal of Controlled Release, 2012, 157, 168-182] uses various methods to obtain albumin nanoparticles and their use as active drug delivery systems. Particular attention is paid to the issue of the instability of nanoparticles in an aqueous medium, for the solution of which their crosslinking is provided using glutaraldehyde, a chemical crosslinking agent widely known in the art. Lohcharoenkal W. et al. [BioMed Research International, 2014] also considers the instability of albumin nanoparticles when they are dissolved or coagulated to form a separate phase if they are in an uncrosslinked state. In a publication by Llabot et al. [19th International Symposium on Microencapsulation, 2013] describes albumin nanoparticles crosslinked with the Gantrez polymer that envelops bevacizumab, as well as their use in corneal vascularization.
Таким образом, сшивка стабилизирует наночастицы альбумина и снижает ферментативное расщепление, а также доставку активного ингредиента из наночастицы.Thus, crosslinking stabilizes the albumin nanoparticles and reduces enzymatic degradation as well as delivery of the active ingredient from the nanoparticle.
Тем не менее, несмотря на высокую эффективность глутаральдегида в стабилизации наночастиц, его применение сомнительно, главным образом в связи с токсичностью, которая препятствует применению для доставки in vivo. Таким образом, важное значение имеет максимально полное удаление сшивающего агента. Кроме того, глутаральдегид может отрицательно влиять на стабильность биомакромолекул, в частности белковые лекарственные препараты, антитела и пептиды в наночастицах, поскольку он вступает в реакцию с функциональными группами в составе макромолекул (такими как остатки первичных аминов), вызывая значительную потерю их активности.However, despite the high efficiency of glutaraldehyde in stabilizing nanoparticles, its use is questionable, mainly due to toxicity, which precludes application for in vivo delivery. Thus, the most complete removal of the cross-linking agent is important. In addition, glutaraldehyde can adversely affect the stability of biomacromolecules, in particular protein drugs, antibodies, and peptides in nanoparticles, because it reacts with functional groups in macromolecules (such as primary amine residues), causing a significant loss of their activity.
Для устранения этого важного недостатка были предложены различные стратегии для укрепления или стабилизации только что образовавшихся наночастиц альбумина без необходимости использования токсичных реактивов. Помимо прочего, стабилизация наночастиц может быть достигнута путем тепловой обработки, высокого гидродинамического давления или ферментативной сшивки с генипином или трансглутаминазой.To address this important shortcoming, various strategies have been proposed to strengthen or stabilize newly formed albumin nanoparticles without the need for toxic reagents. Among other things, the stabilization of nanoparticles can be achieved by heat treatment, high hydrodynamic pressure or enzymatic crosslinking with genipin or transglutaminase.
Для стабилизации наночастиц альбумина также использовалось поверхностное покрытие. Например, для покрытия наночастиц бычьего сывороточного альбумина использовались катионные полимеры, такие как полилизин или полиэтелинимин, для улучшения их стабильности [Wang et al., Pharm. Res., 2008, 25(12), 2896-2909],A surface coating was also used to stabilize the albumin nanoparticles. For example, cationic polymers such as polylysine or polyetheliminine have been used to coat bovine serum albumin nanoparticles to improve their stability [Wang et al., Pharm. Res., 2008, 25(12), 2896-2909],
В публикации WO 2013/042125 описано получение сшитых глутаральдегидом наносфер бычьего сывороточного альбумина, включающих бевацизумаб и последующее обволакивание указанных наносфер слоем ионной ПЛГК.WO 2013/042125 describes the preparation of glutaraldehyde crosslinked bovine serum albumin nanospheres comprising bevacizumab and subsequent coating of said nanospheres with an ionic PLGA layer.
В публикации WO 2011/053803 также описаны наночастицы с полимерной оболочкой, обволакивающей лекарственное средство, такое как бевацизумаб, для лечения глазных заболеваний.WO 2011/053803 also describes drug-encapsulated polymer-coated nanoparticles, such as bevacizumab, for the treatment of eye diseases.
С учетом всего вышеуказанного требуются соответствующие системы доставки, обеспечивающие сохранение целостности и активности моноклональных антител и контролирующие их высвобождение из наночастиц.Considering all of the above, appropriate delivery systems are required to maintain the integrity and activity of monoclonal antibodies and control their release from nanoparticles.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что включение моноклональных антител, таких как бевацизумаб, в матрицу альбумина обеспечивает получение наночастиц с высокой стабильностью в водном растворе, и неожиданно установили, что указанные наночастицы не требуют сшивки или стабилизации другими способами, таким образом обеспечивая сохранение трехмерной структуры и биологической активности антител после доставки. Напротив, как указано в экспериментальной части ниже, применение глутаральдегида (наиболее распространенного сшивающего агента, используемого в предшествующем уровне техники для стабилизации наночастиц альбумина) инактивирует антитела, таким образом делая неосуществимым использование сшитых наночастиц для включения активных ингредиентов данного типа.The present inventors have found that incorporation of monoclonal antibodies such as bevacizumab into an albumin matrix provides nanoparticles with high stability in aqueous solution, and surprisingly found that these nanoparticles do not require cross-linking or stabilization by other means, thus maintaining the three-dimensional structure and biological antibody activity after delivery. On the contrary, as stated in the experimental section below, the use of glutaraldehyde (the most common cross-linking agent used in the prior art to stabilize albumin nanoparticles) inactivates antibodies, thus making it impractical to use cross-linked nanoparticles to incorporate active ingredients of this type.
Авторы также провели испытания несшитых наночастиц, покрытых неионными полимерами, такими как фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (hydroxypropyl methyl cellulose phthalate, HPMC-P) и полиэтиленгликоль 35000 (polyethylenglycol 35,000, PEG35), а также Eudagrit® S-100, и установили, что целостность антител также сохраняется.The authors also tested non-crosslinked nanoparticles coated with non-ionic polymers such as hydroxypropyl methyl cellulose phthalate (HPMC-P) and polyethylene glycol 35000 (polyethylenglycol 35,000, PEG35), as well as Eudagrit® S-100, and found that antibody integrity was also is saved.
Кроме того, в соответствии с описанным ниже методом наночастицы альбумина, связанные с моноклональными антителами, можно получить в виде сухого порошка, готового к диспергированию и разведению путем простого добавления воды или водного раствора.In addition, according to the method described below, albumin nanoparticles bound to monoclonal antibodies can be obtained as a dry powder, ready to be dispersed and diluted by simply adding water or an aqueous solution.
Кроме того, наночастицы изобретения обеспечивают возможность пролонгированного высвобождения моноклональных антител и представляют собой систему доставки лекарственных препаратов, представляющих большой интерес для применения in vivo в соответствии с данными по биологической активности, полученными в животной модели неоваскуляризации роговицы.In addition, the nanoparticles of the invention allow sustained release of monoclonal antibodies and are a drug delivery system of great interest for in vivo use according to biological activity data obtained in an animal model of corneal neovascularization.
Кроме того, анализы биораспределения, выполненные с использованием наночастиц альбумина, покрытых неионными полимерами, указывают на то, что они способны концентрироваться в опухолевых тканях, что делает их очень многообещающими системами наночастиц для высвобождения моноклональных антител в пораженные ткани.In addition, biodistribution analyzes performed using albumin nanoparticles coated with non-ionic polymers indicate that they are able to concentrate in tumor tissues, making them very promising nanoparticle systems for releasing monoclonal antibodies into diseased tissues.
Эксперименты in vivo показали, что наночастицы изобретения способны высвобождать моноклональные антитела в опухолевую ткань в связи с присутствием сниженной концентрации указанных антител в сыворотке по сравнению с введением тех же моноклональных антител в водном растворе. Кроме того, достигается значительное сокращение объема опухоли.In vivo experiments have shown that the nanoparticles of the invention are capable of releasing monoclonal antibodies into tumor tissue due to the presence of a reduced serum concentration of said antibodies compared to administration of the same monoclonal antibodies in aqueous solution. In addition, a significant reduction in tumor volume is achieved.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.Thus, the first aspect of the present invention relates to a nanoparticle for use in medicine, in which the specified nanoparticle contains a solid core, the specified solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and in which the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, the specified solid core is optional coated with non-ionic polymer.
Второй аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей:The second aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition containing:
множество наночастиц, указанные наночастицы, содержащие твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером;a plurality of nanoparticles, said nanoparticles containing a solid core, said hard core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is optionally coated with a non-ionic polymer;
вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.excipient, pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
В другом аспекте изобретение относится к указанной фармацевтической композиции изобретения для применения в медицине.In another aspect, the invention relates to said pharmaceutical composition of the invention for use in medicine.
Другой аспект изобретения включает наночастицу для применения в лечении глазных заболеваний, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.Another aspect of the invention includes a nanoparticle for use in the treatment of ocular diseases, wherein said nanoparticle comprises a solid core, said solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and wherein the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is optionally coated with a non-ionic polymer .
Еще один аспект изобретения включает наночастицу для применения в лечении рака, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.Another aspect of the invention includes a nanoparticle for use in cancer treatment, wherein said nanoparticle comprises a solid core, said solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and wherein the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is optionally coated with a non-ionic polymer .
И наконец, еще один аспект изобретения относится к наночастице, содержащей твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.Finally, another aspect of the invention relates to a nanoparticle containing a solid core, said solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is coated with a non-ionic polymer.
Ниже приведен полный объем притязаний по настоящему изобретению.Below is the full scope of the claims of the present invention.
Согласно настоящему изобретению заявлено применение наночастицы для лечения глазных заболеваний или рака, включающей твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.According to the present invention, the use of a nanoparticle for the treatment of eye diseases or cancer is claimed, comprising a solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies distributed throughout the volume of the albumin matrix, while said solid core is optionally coated with a non-ionic polymer.
Согласно одному из вариантов изобретения указанное твердое ядро может иметь покрытие, а в составе наночастицы отсутствуют любые другие полимерные покрытия, кроме неионного полимера.According to one of the embodiments of the invention, the specified solid core can be coated, and the composition of the nanoparticle does not contain any other polymeric coatings, except for a non-ionic polymer.
Согласно одному из вариантов изобретения весовое отношение моноклональные антитела / альбумин составляет от 0,01 до 0,5.According to one embodiment of the invention, the weight ratio of monoclonal antibodies/albumin is from 0.01 to 0.5.
Согласно одному из вариантов изобретения весовое отношение неионный полимер / альбумин составляет от 0,02 до 5 по массе.According to one embodiment of the invention, the non-ionic polymer/albumin weight ratio is from 0.02 to 5 by weight.
Согласно одному из вариантов изобретения альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин.In one embodiment, the albumin is human serum albumin or bovine serum albumin.
Согласно одному из вариантов изобретения моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба, ранибизумаба, трастузумаба, цетуксимаба и ритуксимаба.In one embodiment, the monoclonal antibodies are selected from bevacizumab, ranibizumab, trastuzumab, cetuximab, and rituximab.
Согласно одному из вариантов изобретения неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталатаAccording to one embodiment of the invention, the non-ionic polymer is a water-soluble cellulose selected from hydroxyethylcellulose, hydroxy-n-propylcellulose, hydroxy-n-butylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, phthalate
гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмала; декстрана; поливинилпирролидона, полиэфира, выбранного из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоля.hydroxypropylmethylcellulose and ethylhydroxyethylcellulose; starch; dextran; polyvinylpyrrolidone, a polyester selected from compounds under the trademark Eudagrit, or polyalkylene glycol.
Согласно одному из вариантов изобретения указанная наночастица получена способом, содержащим:According to one of the embodiments of the invention, the specified nanoparticle is obtained by a method containing:
a) получение водного раствора альбумина и моноклональных антител;a) obtaining an aqueous solution of albumin and monoclonal antibodies;
b) титрование водного раствора, полученного на этапе а), до рН от 4 до 5;b) titration of the aqueous solution obtained in step a) to a pH of 4 to 5;
c) добавление десольватирующего средства к водному раствору, полученному на этапе Ь), с получением наночастиц альбумина / моноклональных антител;c) adding a desolvating agent to the aqueous solution obtained in step b) to obtain albumin/monoclonal antibody nanoparticles;
d) дополнительно инкубацию наночастиц альбумина/моноклональных антител, полученных на этапе с), с неионным полимером; и дополнительноd) further incubation of the albumin nanoparticles/monoclonal antibodies obtained in step c) with a non-ionic polymer; and additionally
e) сушку наночастиц путем вакуумной сушки, сушки распылением или сублимационной сушки.e) drying the nanoparticles by vacuum drying, spray drying or freeze drying.
Согласно одному из вариантов изобретения глазное заболевание выбрано из макулярной дегенерации, неоваскуляризации или ангиогенеза роговицы, неоваскуляризации или ангиогенеза радужки, неоваскуляризации или ангиогенеза сетчатки, диабетической пролиферативной ретинопатии, недиабетической пролиферативной ретинопатии, глаукомы, инфекционного конъюнктивита, аллергического конъюнктивита, язвенного кератита, неязвенного кератита, эписклерита, склерита, диабетической ретинопатии, увеита, эндофтальмита, инфекционных процессов и воспалительных процессов.According to one embodiment of the invention, the eye disease is selected from macular degeneration, corneal neovascularization or angiogenesis, iris neovascularization or angiogenesis, retinal neovascularization or angiogenesis, diabetic proliferative retinopathy, non-diabetic proliferative retinopathy, glaucoma, infectious conjunctivitis, allergic conjunctivitis, ulcers. keratitis, non-ulcerative keratitis, episcleritis , scleritis, diabetic retinopathy, uveitis, endophthalmitis, infectious processes and inflammatory processes.
Согласно одному из вариантов изобретения рак представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак поджелудочной железы, множественную миелому, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, меланому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, почек и ЖКТ, рак мочевого пузыря или плоскоклеточный рак.In one embodiment, the cancer is breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, multiple myeloma, renal cell carcinoma, prostate cancer, melanoma, colon cancer, colorectal cancer, kidney cancer, cervical cancer, ovarian cancer, cancer of the liver, kidneys and gastrointestinal tract, bladder cancer or squamous cell carcinoma.
Согласно настоящему изобретению также заявлена наночастица, включающая твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.The present invention also claims a nanoparticle comprising a solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core being coated with a non-ionic polymer.
Согласно настоящему изобретению также заявлена фармацевтическая композиция, включающая:The present invention also claims a pharmaceutical composition comprising:
- группу наночастиц, содержащих твердое ядро, включающее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером;- a group of nanoparticles containing a solid core, including a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies distributed throughout the volume of the albumin matrix, while the specified solid core is optionally coated with a non-ionic polymer;
- вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.excipient, pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Согласно одному из вариантов изобретения указанное твердое ядро имеет покрытие, при этом оно покрыто неионновым полимером.According to one embodiment of the invention, said hard core is coated, wherein it is coated with a non-ionic polymer.
Согласно одному из вариантов изобретения композиция является глазной или противораковой фармацевтической композицией.According to one embodiment of the invention, the composition is an ophthalmic or anti-cancer pharmaceutical composition.
Согласно одному из вариантов изобретения наночастицы находятся в виде сухого порошка.According to one embodiment of the invention, the nanoparticles are in the form of a dry powder.
Согласно одному из вариантов изобретения вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель подходит для перорального, местного или парентерального введения.According to one embodiment of the invention, the excipient, pharmaceutically acceptable carrier or excipient is suitable for oral, topical or parenteral administration.
Согласно одному из вариантов изобретения альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин.In one embodiment, the albumin is human serum albumin or bovine serum albumin.
Согласно одному из вариантов изобретения моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба, ранибизумаба, трастузумаба, цетуксимаба и ритуксимаба.In one embodiment, the monoclonal antibodies are selected from bevacizumab, ranibizumab, trastuzumab, cetuximab, and rituximab.
Согласно одному из вариантов изобретения неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмала; декстрана; поливинилпирролидона, полиэфира, выбранного из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоля.According to one embodiment of the invention, the non-ionic polymer is a water-soluble cellulose selected from hydroxyethylcellulose, hydroxy-n-propylcellulose, hydroxy-n-butylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, and ethylhydroxyethylcellulose; starch; dextran; polyvinylpyrrolidone, a polyester selected from compounds under the trademark Eudagrit, or polyalkylene glycol.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Фигура 1. Влияние отношения бевацизумаб / альбумин на полезную нагрузку полученных наночастиц. Наночастицы были получены после инкубации моноклональных антител и белка в течение 10 минут. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).Figure 1. Effect of the bevacizumab/albumin ratio on the payload of the obtained nanoparticles. Nanoparticles were obtained after incubation of monoclonal antibodies and protein for 10 minutes. Data are expressed as mean ± SD (n=3).
Фигура 2. Фотография ПЭМ наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом (bevacizurnab-loaded nanoparticles, B-NP).Figure 2. TEM photograph of bevacizumab-loaded nanoparticles (B-NP) of albumin nanoparticles.
Фигура 3. А) ИК-спектр с Фурье-преобразованием человеческого сывороточного альбумина (human serum albumin, HSA), глутаральдегида (glutaraldehyde, GLU), механической смеси HSA и глутаральдегида (glutaraldehyde, HSA-GLU) и наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde, NP-GLU). В) ИК-спектр с Фурье-преобразованием человеческого сывороточного альбумина (HSA), бевацизумаба (bevacizumab, BEVA), механической смеси HSA и бевацизумаба (HSA-BEVA) и наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP).Figure 3. A) Fourier transform IR spectrum of human serum albumin (HSA), glutaraldehyde (glutaraldehyde, GLU), a mechanical mixture of HSA and glutaraldehyde (glutaraldehyde, HSA-GLU) and nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde (nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde, NP-GLU). C) Fourier transform IR spectrum of human serum albumin (HSA), bevacizumab (bevacizumab, BEVA), mechanical mixture of HSA and bevacizumab (HSA-BEVA) and bevacizumab-filled nanoparticles (B-NP).
Фигура 4. Рентгеновские спектры бевацизумаба (BEVA), наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP), и человеческого сывороточного альбумина (HSA).Figure 4. X-ray spectra of bevacizumab (BEVA), bevacizumab-filled nanoparticles (B-NP) and human serum albumin (HSA).
Фигура 5. Термограммы ДТА: А) нативного человеческого сывороточного альбумина (HSA) и бевацизумаба (BEVA); В) механической смеси (РМ) человеческого сывороточного альбумина (HSA), бевацизумаба (BEVA) и наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом (B-NP); С) нативного человеческого сывороточного альбумина (HSA) и глутаральдегидом (GLU); D) механической смеси (РМ) человеческого сывороточного альбумина (HSA), глутаральдегида (GLU) и наночастиц альбумина, сшитых с глутаральдегидом (NP-GLU).Figure 5. DTA thermograms: A) native human serum albumin (HSA) and bevacizumab (BEVA); C) mechanical mixture (PM) of human serum albumin (HSA), bevacizumab (BEVA) and albumin nanoparticles filled with bevacizumab (B-NP); C) native human serum albumin (HSA) and glutaraldehyde (GLU); D) mechanical mixture (PM) of human serum albumin (HSA), glutaraldehyde (GLU) and albumin nanoparticles crosslinked with glutaraldehyde (NP-GLU).
Фигура 6. Динамика изменения среднего размера пустых наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (NP-GLU), и наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP), после их диспергирования в водном растворе при рН 7,4. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).Figure 6. Dynamics of changes in the average size of empty nanoparticles crosslinked with glutaraldehyde (NP-GLU) and nanoparticles filled with bevacizumab (B-NP) after their dispersion in an aqueous solution at pH 7.4. Data are expressed as mean ± SD (n=3).
Фигура 7. Профиль высвобождения бевацизумаба из наночастиц человеческого сывороточного альбумина после инкубации в PBS (рН 7,4). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).Figure 7. Bevacizumab release profile from human serum albumin nanoparticles after incubation in PBS (pH 7.4). Data are expressed as mean ± SD (n=3).
Фигура 8. Микрофотография ПЭМ наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, пегилированных PEG35 (B-NP-PEG35).Figure 8. TEM micrograph of bevacizumab-loaded albumin nanoparticles pegylated with PEG35 (B-NP-PEG35).
Фигура 9. Профиль высвобождения бевацизумаба из наночастиц альбумина после инкубации в PBS (рН 7,4) наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP); наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых PEG35 (B-NP-PEG35); (…) наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых Eudagrit® S-100 (B-NP-S-100); наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых НРМС-Р (B-NP-HPMC-P). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).Figure 9. Release profile of bevacizumab from albumin nanoparticles after incubation in PBS (pH 7.4) nanoparticles filled with bevacizumab (B-NP); nanoparticles filled with bevacizumab and coated with PEG35 (B-NP-PEG35); (…) nanoparticles filled with bevacizumab and coated with Eudagrit® S-100 (B-NP-S-100); nanoparticles filled with bevacizumab and coated with HPMC-P (B-NP-HPMC-P). Data are expressed as mean ± SD (n=3).
Фигура 10. Автоматизированный электрофорез наночастиц на микрофлюидном чипе (L - маркер длин; 1 - пустые наночастицы, покрытые PEG35 (NP-PEG35); 2 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (B-NP); 3 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35); 4 - человеческий сывороточный альбумин (HSA); 5 - бевацизумаб).Figure 10. Automated electrophoresis of nanoparticles on a microfluidic chip (L - length marker; 1 - empty nanoparticles coated with PEG35 (NP-PEG35); 2 - albumin nanoparticles filled with bevacizumab (B-NP); 3 - albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated PEG35 (B-NP-PEG35); 4 - human serum albumin (HSA); 5 - bevacizumab).
Фигура 11. Сравнение изображений ОФЭКТ-КТ in vivo 99mTc-меченых В-NP (верхний ряд) и 99mTc-меченых B-NP-PEG35 (нижний ряд) после введения в глаз крысам Вистар. Изображения в каждом ряду соответствуют тем же животным, исследованным во временных точках, указанных на фигуре. Активность исчезает через 4-8 ч. после введения в глаз, тогда как в B-NP-PEG35 она сохраняется в глазу как минимум 8 ч.Figure 11. Comparison of in vivo SPECT-CT images of 99mTc-labeled B-NP (top row) and 99mTc-labeled B-NP-PEG35 (bottom row) after injection into the eye of Wistar rats. The images in each row correspond to the same animals examined at the time points indicated in the figure. Activity disappears 4-8 hours after injection into the eye, while in B-NP-PEG35 it persists in the eye for at least 8 hours.
Фигура 12. Кривая активность - время для динамики количества радиоактивности в различных областях после введения в глаз наночастиц 99mTc-B-NP. Исследуемые объемные области (volumes of interest, VOI) были получены для зон, обозначенных на графиках, и средних количеств, полученных для каждой VOI, данные приведены с поправкой на затухание и нанесены на график.Figure 12. Curve activity - time for the dynamics of the amount of radioactivity in different areas after injection of 99mTc-B-NP nanoparticles into the eye. Volumes of interest (VOI) were obtained for the zones indicated on the graphs, and the average amounts obtained for each VOI, the data are corrected for attenuation and plotted on the graph.
Фигура 13. Сравнение изображений ОФЭКТ-КТ in vivo 99mTc-меченых В-NP (верхний ряд) и 99mTc-меченых B-NP-PEG35 (нижний ряд) после внутривенного введения крысам Вистар. Изображения в каждом ряду соответствуют тем же животным, исследованным во временных точках, указанных на фигуре.Figure 13. Comparison of in vivo SPECT-CT images of 99mTc-labeled B-NP (top row) and 99mTc-labeled B-NP-PEG35 (bottom row) after intravenous administration to Wistar rats. The images in each row correspond to the same animals examined at the time points indicated in the figure.
Фигура 14. Схематическое представление плана-графика, на котором показано прижигание роговицы в 0 ч. (0-е сутки) и первое лечение через 24 ч. (1-е сутки).Figure 14. Schematic representation of a schedule showing corneal cauterization at 0 hours (Day 0) and
Фигура 15. Фотографии роговиц животных, получавших лечение: (А) физиологическим раствором [контроль (-)]; (В) Авастином® (4 мг/мл бевацизумаба); (С) наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом (В-NP); (D) наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом и покрытыми PEG 35,000 (B-NP-PEG35); (Е): раствором человеческого сывороточного альбумина (HSA); (F): Эйлеа® (EYLEA); (G): дексаметазоном (DEXA).Figure 15. Photographs of the corneas of animals treated with: (A) saline [control (-)]; (B) Avastin® (4 mg/ml bevacizumab); (C) bevacizumab-loaded albumin nanoparticles (B-NP); (D) albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated with PEG 35,000 (B-NP-PEG35); (E): human serum albumin (HSA) solution; (F): EYLEA® (EYLEA); (G): dexamethasone (DEXA).
Фигура 16. Площадь очага поражения в процентах площади роговицы, пораженной ожогом. Статистически значимые различия между очагами поражения в различных группах не выявлены. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=9).Figure 16. The area of the lesion as a percentage of the area of the cornea affected by the burn. There were no statistically significant differences between lesions in different groups. Data are expressed as mean ± SD (n=9).
Фигура 17. Площадь инвазии (invasion area, IA), доля площади роговицы с присутствием сосудов. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=9).Figure 17. The area of invasion (invasion area, IA), the proportion of the area of the cornea with the presence of vessels. Data are expressed as mean ± SD (n=9).
* р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-).* p<0.01 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from control (-).
** р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от BEVA.** p<0.01 - results of analysis of variance using Tukey's test are significantly different from BEVA.
*** р<0,005 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от B-NP.*** p<0.005 - results of analysis of variance using Tukey's test are significantly different from B-NP.
Фигура 18. Площадь неоваскуляризации, нормализованная по очагу поражения. Данные выражены в виде среднего значениям ± СО (n=9).Figure 18. Area of neovascularization normalized by lesion. Data are expressed as mean ± SD (n=9).
* р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-).* p<0.01 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from control (-).
** р<0,005 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от BEVA.** p<0.005 - results of analysis of variance using Tukey's test are significantly different from BEVA.
Фигура 19. Микрофотографии срезов нормальной и неоваскуляризованной роговицы, для лечения которой применяли бевацизумаб (е - эпителиальный слой; s - строма; ас - передняя камера; v - стромальные микрососуды). А) Микрофотография нормальной роговицы крыс, на которой показан интактный эпителий (е), строма, содержащая правильные параллельные коллагеновые пластинки с уплощенными кератоцитами между ними; В) Микрофотография роговицы крысы из группы, получавшей лечение наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом (B-NP). Толщина роговицы находится в пределах нормы, интактный эпителий и немного нечеткая и рыхлая строма с небольшой инфильтрацией. С) Микрофотография роговицы крысы из группы, получавшей лечение наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом и покрытыми PEG35 (B-NP-PEG35). Нормальный эпителий, многочисленные стромальные микрососуды (v). Толщина роговицы в пределах нормы; D и Е): микрофотографии роговицы крыс из группы, получавшей лечение бевацизумабом. Сохраняющий структуру и гипертрофированный эпителий, который отделяется от стромы. Утолщение стромы с многочисленными и беспорядочно расположенными фибробластами (*); F) Микрофотография роговицы крысы из группы, получавшей лечение физиологическим раствором. Серьезные изменения роговицы, центральная эрозия и увеличение толщины. Выраженный фиброз с большими беспорядочно расположенными фибробластами, умеренной воспалительной инфильтрацией и неоваскуляризацией (v). Образование кисты (с) из клеток эпителия, что демонстрирует попытку ненормального восстановления. Масштаб - 200 мкм, т.е. 100-кратное увеличение.Figure 19. Micrographs of sections of normal and neovascularized cornea treated with bevacizumab (e - epithelial layer; s - stroma; ac - anterior chamber; v - stromal microvessels). A) Micrograph of normal rat cornea showing intact epithelium (e), stroma containing regular parallel collagen plates with flattened keratocytes in between; B) Micrograph of the cornea of a rat from the group treated with albumin nanoparticles filled with bevacizumab (B-NP). The thickness of the cornea is within the normal range, intact epithelium and a slightly fuzzy and loose stroma with little infiltration. C) Micrograph of the cornea of a rat from the group treated with albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated with PEG35 (B-NP-PEG35). Normal epithelium, numerous stromal microvessels (v). The thickness of the cornea is within the normal range; D and E): micrographs of the cornea of rats from the group treated with bevacizumab. Retaining the structure and hypertrophied epithelium, which is separated from the stroma. Stroma thickening with numerous and randomly arranged fibroblasts (*); F) Micrograph of the cornea of a rat from the saline treated group. Severe corneal changes, central erosion and thickening. Severe fibrosis with large, irregular fibroblasts, moderate inflammatory infiltration, and neovascularization (v). Cyst formation (c) from epithelial cells, demonstrating an attempt at abnormal repair. Scale - 200 µm, i.e. 100x magnification.
Фигура 20. Отношения опухоль / нормальная ткань для опухолей ноги и шеи у животных, получавших лечение наночастицами альбумина, покрытыми PEG35 (NP-PEG35). Значения соответствуют среднему значению для трех животных, полученному через 1 час (синие столбики) и 4 часа (красные столбики) после внутривенного (в/в) введения наночастиц, меченых радиоактивным изотопом.Figure 20 Tumor/normal tissue ratios for leg and neck tumors in animals treated with PEG35 coated albumin nanoparticles (NP-PEG35). Values correspond to the average value for three animals obtained after 1 hour (blue bars) and 4 hours (red bars) after intravenous (IV) administration of nanoparticles labeled with a radioactive isotope.
Фигура 21. Объем опухоли (мм 3). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n≥6).Figure 21. Tumor volume (mm3). Data are expressed as mean ± SD (n≥6).
* р<0,05 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от физиологического раствора.* p<0.05 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from saline.
** р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от физиологического раствора.** p<0.01 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from saline.
Фигура 22. Зависимость концентрации бевацизумаба в сыворотке (мкг/мэ) от времени (сутки).Figure 22. Bevacizumab serum concentration (µg/me) versus time (day).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯIMPLEMENTATION OF THE INVENTION
Как указано выше, первый аспект настоящего изобретения относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.As indicated above, the first aspect of the present invention relates to a nanoparticle for use in medicine, in which the specified nanoparticle contains a solid core, the specified solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and in which the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, the specified solid core optionally coated with a non-ionic polymer.
В частном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.In a particular embodiment, the present invention relates to a nanoparticle for use in medicine, in which the specified nanoparticle contains a solid core, the specified solid core, consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and in which the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, the specified solid core optionally coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте, осуществления настоящее изобретение относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица состоит из твердого ядра, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.In yet another particular embodiment, the present invention relates to a nanoparticle for use in medicine, wherein said nanoparticle consists of a solid core, said solid core containing an uncrosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and wherein the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said the solid core is optionally coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица состоит из твердого ядра, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.In another particular embodiment, the present invention relates to a nanoparticle for use in medicine, in which the specified nanoparticle consists of a solid core, the specified solid core, consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, and in which the monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is optionally coated with a non-ionic polymer.
Используемый здесь термин «наночастица» относится к коллоидной системе, имеющей сферическую или квазисферическую форму и средний размер меньше 1 мкм. В конкретном варианте осуществления наночастица имеет средний размер в диапазоне от 100 до 900 нм, более предпочтительно от 150 до 800 нм, еще более предпочтительно от 200 до 500 нм и наиболее предпочтительно от 200 до 400 нм.The term "nanoparticle" as used herein refers to a colloidal system having a spherical or quasi-spherical shape and an average size of less than 1 µm. In a particular embodiment, the nanoparticle has an average size in the range of 100 to 900 nm, more preferably 150 to 800 nm, even more preferably 200 to 500 nm, and most preferably 200 to 400 nm.
Под «средним размером» понимается средний диаметр популяции наночастиц, перемещающихся вместе в водной среде. Средний размер этих систем можно измерить стандартными способами, известными специалистам в данной области техники и описанными, например, в экспериментальной части ниже.By "average size" is meant the average diameter of a population of nanoparticles moving together in an aquatic environment. The average size of these systems can be measured by standard methods known to those skilled in the art and described, for example, in the experimental section below.
В контексте настоящего изобретения термин «наночастица» относится к наносфере или наносфере с покрытием.In the context of the present invention, the term "nanoparticle" refers to a coated nanosphere or nanosphere.
Под «наносферой» понимается твердая несшитая матрица альбумина или сплошной материал альбумина, в котором по объему указаннойой матрицы распределены моноклональные антитела, так что выраженная структура ядро/оболочка отсутствует.By "nanosphere" is meant a solid, uncrosslinked matrix of albumin or a continuous material of albumin, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of said matrix, so that there is no pronounced core/shell structure.
Под «наносферой с покрытием» понимается наносфера согласно определению выше, в которой твердая несшитая матрица альбумина покрыта неионным полимером.By "coated nanosphere" is meant a nanosphere as defined above in which a solid non-crosslinked matrix of albumin is coated with a non-ionic polymer.
Соответственно, наночастицы изобретения не содержат любые другие полимерные покрытия, кроме неионных полимеров.Accordingly, the nanoparticles of the invention do not contain any other polymeric coatings other than non-ionic polymers.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, наночастица представляет собой наночастицу, в которой при нанесенном на твердое ядро покрытии в составе наночастицы отсутствуют любые другие полимерные покрытия, кроме неионных полимеров. Несмотря на то что для наночастиц изобретения не требуется полимерное покрытие, авторы изобретения установили, что при отсутствии в составе наночастицы любых других полимерных покрытий, кроме неионных полимеров, указанные частицы демонстрируют полезный эффект по сравнению с теми же частицами при использовании ионного покрытия. Например, когда наночастицы изобретения покрыты ионным полимером, частицы демонстрируют очень быстрый профиль высвобождения антител (взрывное высвобождение).In a preferred embodiment of the present invention, the nanoparticle is a nanoparticle in which, when coated on a hard core, the nanoparticle contains no other polymeric coatings other than non-ionic polymers. Although the nanoparticles of the invention do not require a polymer coating, the inventors have found that in the absence of any other polymer coatings other than non-ionic polymers in the composition of the nanoparticles, these particles show a beneficial effect compared to the same particles when using an ionic coating. For example, when the nanoparticles of the invention are coated with an ionic polymer, the particles exhibit a very rapid antibody release profile (explosive release).
Так что когда используемые в изобретении наночастицы не покрыты неионным полимером, указанные наночастицы следует рассматривать как наносферы согласно приведенному выше определению, тогда как когда используемые в изобретении наночастицы покрыты неионным полимером, указанные наночастицы следует рассматривать как наносферы с покрытием согласно приведенному выше определению.Thus, when the nanoparticles used in the invention are not coated with a nonionic polymer, said nanoparticles should be considered as nanospheres according to the above definition, while when the nanoparticles used in the invention are coated with a nonionic polymer, said nanoparticles should be considered as coated nanospheres according to the above definition.
В отличие от наночастиц, используемых в предшествующем уровне техники, в котором матрица альбумина является сшитой или стабилизированной другими способами, наночастицы, используемые в изобретении, характеризуются наличием твердого ядра из несшитой матрицы альбумина, под которой понимается организационная структура или конфигурация, обусловленная местными взаимодействиями между альбумином и моноклональными антителами. Таким образом, в объеме настоящего изобретения наночастицы образуют твердые матричные системы.Unlike the nanoparticles used in the prior art, in which the albumin matrix is cross-linked or otherwise stabilized, the nanoparticles used in the invention are characterized by the presence of a solid core of an uncrosslinked albumin matrix, which is understood as an organizational structure or configuration due to local interactions between albumin and monoclonal antibodies. Thus, within the scope of the present invention, the nanoparticles form solid matrix systems.
В связи с этим термин «твердое ядро» относится к твердой несшитой структуре матричного типа, в которой альбумин образует непрерывную структуру, в которой моноклональные антитела распределены, предпочтительно равномерно распределены, по всему объему матрицы.In this regard, the term "solid core" refers to a solid, non-crosslinked matrix-type structure in which albumin forms a continuous structure in which monoclonal antibodies are distributed, preferably evenly distributed, throughout the volume of the matrix.
Так что твердое ядро наночастиц, используемых в изобретении, не имеет дифференцированных внешней и внутренней структур, в связи с чем моноклональные антитела распределены, более предпочтительно равномерно распределены, по всему объему матрицы альбумина, а не заключены или ограничены в ее центральной полости.So, the solid core of the nanoparticles used in the invention does not have differentiated external and internal structures, and therefore the monoclonal antibodies are distributed, more preferably evenly distributed, throughout the entire volume of the albumin matrix, and not enclosed or limited in its central cavity.
В частном варианте осуществления изобретения, наночастица, используемая в изобретении, представляет собой наносферу согласно приведенному выше определению. Более конкретно, в указанных наночастицах твердое ядро не покрыто неионным полимером. Как описано по всему тексту настоящего документа, а также показано на примерах, наночастицы изобретения являются стабильными и не требуют заключения в оболочку. В контексте настоящего изобретения, термин «стабильный» относится к повышению уровня стабильности частиц таким образом, что частицы можно использовать в медицине без распада материала. Таким образом, в конкретном варианте осуществления наночастица настоящего изобретения представляет собой стабильную наночастицу с дополнительным полимерным покрытием или без покрытия.In a particular embodiment of the invention, the nanoparticle used in the invention is a nanosphere as defined above. More specifically, in said nanoparticles, the solid core is not coated with a non-ionic polymer. As described throughout this document, and also shown in the examples, the nanoparticles of the invention are stable and do not require encapsulation. In the context of the present invention, the term "stable" refers to increasing the level of stability of the particles so that the particles can be used in medicine without degradation of the material. Thus, in a specific embodiment, the nanoparticle of the present invention is a stable nanoparticle with or without an additional polymer coating.
В еще одном частном варианте осуществления изобретения, наночастица, используемая в изобретении, представляет собой наносферу с покрытием согласно приведенному выше определению, т.е. содержит или состоит из твердого ядра из твердой матрицы альбумина или сплошного материала альбумина, в которой по всем объему указанной матрицы распределены моноклональные антитела и в которой твердое ядро покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of the invention, the nanoparticle used in the invention is a coated nanosphere according to the above definition, i.e. contains or consists of a solid core of a solid matrix of albumin or a solid material of albumin, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of said matrix and in which the solid core is coated with a non-ionic polymer.
Дополнительный аспект изобретения относится к наночастице, содержащей твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.An additional aspect of the invention relates to a nanoparticle containing a hard core, said hard core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is coated with a non-ionic polymer.
Более конкретно, изобретение также относится к наночастице, содержащей твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.More specifically, the invention also relates to a nanoparticle containing a hard core, said hard core consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is coated with a non-ionic polymer.
Также, в частности, изобретение относится к наночастице, состоящей из твердого ядра, указаннойого твердого ядра, содержащего несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.Also, in particular, the invention relates to a nanoparticle consisting of a solid core, said solid core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is coated with a non-ionic polymer.
Еще более конкретно, изобретение также относится к наночастице, состоящей из твердого ядра, указаннойого твердого ядра, состоящего из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.Even more specifically, the invention also relates to a nanoparticle consisting of a solid core, said solid core consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is coated with a non-ionic polymer.
Альбумин.Albumen.
Используемый здесь термин «альбумин» относится к семейству глобулярных отрицательно заряженных белков, наиболее распространенными из которых являются сывороточные альбумины. Все белки семейства альбуминов являются водорастворимыми, умеренно растворимыми в концентрированных растворах солей и подверженными тепловой денатурации. Альбумины широко распространены в плазме крови и отличаются от других белков крови тем, что они не гликозилируются.As used herein, the term "albumin" refers to a family of globular, negatively charged proteins, the most common of which are serum albumins. All proteins of the albumin family are water-soluble, sparingly soluble in concentrated salt solutions, and subject to heat denaturation. Albumins are widely distributed in blood plasma and differ from other blood proteins in that they are not glycosylated.
Общая структура альбумина характеризуется несколькими длинными спиралями, позволяющими им сохранять относительно статическую форму, которая очень важна для регулирования артериального давления.The overall structure of albumin is characterized by several long coils, allowing them to maintain a relatively static shape, which is very important for blood pressure regulation.
В конкретном варианте осуществления альбумин представляет собой сывороточный альбумин. Сывороточный альбумин продуцируется в печени и растворяется в плазме крови, представляя собой наиболее распространенный белок у млекопитающих.In a specific embodiment, the albumin is serum albumin. Serum albumin is produced in the liver and dissolved in blood plasma, being the most abundant protein in mammals.
Более предпочтительно сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA) или бычий сывороточный альбумин (BSA), еще более предпочтительно сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин.More preferably the serum albumin is human serum albumin (HSA) or bovine serum albumin (BSA), even more preferably the serum albumin is human serum albumin.
Человеческий сывороточный альбумин кодируется геном ALB, тогда как формы других млекопитающих, такие как бычий сывороточный альбумин, химически подобны.Human serum albumin is encoded by the ALB gene, while other mammalian forms, such as bovine serum albumin, are chemically similar.
Человеческий сывороточный альбумин имеет молекулярную массу приблизительно 65000 Да и состоит из 585 аминокислот. Последовательность аминокислот HSA содержит 17 дисульфидных мостиков, один свободный тиол (Cys34) и один триптофан (Trp214).Human serum albumin has a molecular weight of approximately 65,000 Da and consists of 585 amino acids. The amino acid sequence of HSA contains 17 disulfide bridges, one free thiol (Cys34) and one tryptophan (Trp214).
Моноклональные антитела.monoclonal antibodies.
Используемый здесь термин «моноклональные антитела» (monoclonal antibody, mAb или moAb) относится к антителам или фрагментам антител, продуцируемым одним клоном В-лимфоцитов или одной клеткой, именуемой гибридомой, которая секретирует молекулу антител всего одного типа. Моноклональные антитела получают способами, известными специалистам в данной области техники, например путем получения гибридных антителообразующих клеток за счет слияния антителообразующей клетки и миеломы или другой самопроникающей клеточной линии.The term "monoclonal antibody" (mAb or moAb) as used herein refers to antibodies or antibody fragments produced by a single clone of B-lymphocytes or a single cell, called a hybridoma, that secretes only one type of antibody molecule. Monoclonal antibodies are produced by methods known to those skilled in the art, for example by generating hybrid antibody producing cells by fusion of an antibody producing cell and a myeloma or other self-penetrating cell line.
Моноклональные антитела имеют моновалентную аффинность в том отношении, что они связываются с одним эпитопом (частью антигена, которая распознается антителами). Практически для любого вещества можно получить моноклональные антитела, специфически связывающиеся с этим веществом.Monoclonal antibodies have monovalent affinity in that they bind to a single epitope (the part of the antigen that is recognized by the antibodies). For almost any substance, it is possible to obtain monoclonal antibodies that specifically bind to this substance.
Для цели настоящего изобретения моноклональные антитела, предназначенные для включения в матрицу альбумина наночастицы, должны обладать аффинностью как минимум к одной мишени в ткани глаза или раковой ткани либо должны обладать аффинностью к самой ткани. Например, мишенью может являться рецептор, связанный с заболеваниею глаз или раком, или белок, связанный с заболеваниею глаз или раком.For the purpose of the present invention, the monoclonal antibodies to be incorporated into the nanoparticle albumin matrix must have affinity for at least one target in ocular or cancerous tissue, or must have affinity for the tissue itself. For example, the target may be a receptor associated with an eye disease or cancer, or a protein associated with an eye disease or cancer.
В частном варианте осуществления изобретения, моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба (Авастин®), который ингибирует функцию натурального белка под названием «фактор роста эндотелия сосудов» (vascular endothelial growth factor, VEGF), который стимулирует образование новых кровеносных сосудов; ранибизумаба (Луцентис®), который обеспечивает сильное связывание с VEGF-A; трастузумаба (Герцептин®), который распознает рецептор HER-2, сверхэкспрессирующийся в солидных опухолях; цетуксимаба (Эрбитукс®), который распознает рецепторы EGFR, и ритуксимаба (Мабтера®), который распознает CD20.In a particular embodiment of the invention, the monoclonal antibodies are selected from bevacizumab (Avastin®), which inhibits the function of a natural protein called vascular endothelial growth factor (VEGF), which stimulates the formation of new blood vessels; ranibizumab (Lucentis®), which provides strong binding to VEGF-A; trastuzumab (Herceptin®), which recognizes the HER-2 receptor overexpressed in solid tumors; cetuximab (Erbitux®), which recognizes EGFR receptors, and rituximab (MabThera®), which recognizes CD20.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, одно или несколько антител (или фрагментов антител) против VEGF выбраны для включения в матрицу альбумина, таким образом обеспечивая направленное воздействие непосредственно на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Так в предпочтительном варианте осуществления моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба и ранибизумаба, более предпочтительно представляют собой бевацизумаб.In a preferred embodiment of the present invention, one or more anti-VEGF antibodies (or antibody fragments) are selected to be incorporated into an albumin matrix, thus targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) directly. Thus, in a preferred embodiment, the monoclonal antibodies are selected from bevacizumab and ranibizumab, more preferably bevacizumab.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одно или несколько антител (или фрагментов антител) против VEGF R2 выбраны для включения в матрицу альбумина, таким образом обеспечивая направленное воздействие на клетки, такие как клетки пигментного эпителия сетчатки, экспрессирующие фактор роста эндотелия сосудов 2 (VEGF R2).In yet another preferred embodiment of the present invention, one or more anti-VEGF R2 antibodies (or antibody fragments) are selected to be incorporated into an albumin matrix, thereby targeting cells such as retinal pigment epithelial cells expressing vascular endothelial growth factor 2 (VEGF R2).
Примеры моноклональных антител против VEGF R2 включают, помимо прочего, клон моноклональных антител Avasl2al и моноклональные антитела 2С3.Examples of anti-VEGF R2 monoclonal antibodies include, but are not limited to, the Avasl2al monoclonal antibody clone and the 2C3 monoclonal antibody.
Сверхэкспрессия рецептора VEGF и VEGFR2 клетками эпителия, такими как клетки пигментного эпителия сетчатки, связана, например, с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД).Overexpression of the VEGF receptor and VEGFR2 by epithelial cells, such as retinal pigment epithelial cells, is associated, for example, with age-related macular degeneration (AMD).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, моноклональные антитела представляют собой глазной препарат направленного действия, т.е. антитела, специфические к антигену, продуцируемому тканью глаза, непосредственно затрагиваемой заболеваниею глаз, или связанному с ней.In yet another preferred embodiment of the present invention, the monoclonal antibody is a targeted ophthalmic preparation, i. antibodies specific to an antigen produced by, or associated with, eye tissue directly affected by the eye disease.
В частном варианте осуществления изобретения, весовое отношение антитела/альбумин составляет от 0,01 до 0,5, более предпочтительно от 0,01 до 0,2. По результатам наблюдений наночастицы с весовым отношением моноклональные антитела / альбумин меньше 0,01 не сохраняют стабильность с течением времени.In a particular embodiment of the invention, the weight ratio of antibody/albumin is from 0.01 to 0.5, more preferably from 0.01 to 0.2. Nanoparticles with a monoclonal antibody/albumin weight ratio of less than 0.01 have not been observed to be stable over time.
Неионный полимер.non-ionic polymer.
Используемый здесь термин «неионный полимер» относится к гидрофильном полимеру, который в условиях получения наночастиц не обладает суммарным зарядом. Кроме того, указаннойый неионный полимер должен быть биоразлагаемым, т.е. разлагающимся при применении in vivo, а также биосовместимым, т.е. по существу не токсичным или не оказывающим вредного воздействия на живые ткани или живые системы, с которыми он вступает в контакт.The term "non-ionic polymer" as used herein refers to a hydrophilic polymer that does not have a net charge under the conditions of nanoparticle production. In addition, said non-ionic polymer must be biodegradable, i. degradable when used in vivo, as well as biocompatible, i.e. essentially non-toxic or not harmful to living tissues or living systems with which it comes into contact.
Примерами подходящих неионных полимеров для использования в настоящем изобретении являются поливиниловый спирт; поливинилпирролидон; полиаллиловый спирт; поливинилметиловый эфир; поливинилацеталь; полиалкиленовый спирт; полисахарид, необязательно замещенный по меньшей мере одной алкильной группой, гидроксиалкильной группой, алкоксиалкильной группой или комбинацией двух или более таких групп; сложные полиэфиры; полиамиды, полиуретаны и полиэфиры.Examples of suitable non-ionic polymers for use in the present invention are polyvinyl alcohol; polyvinylpyrrolidone; polyallyl alcohol; polyvinyl methyl ether; polyvinyl acetal; polyalkylene alcohol; a polysaccharide optionally substituted with at least one alkyl group, hydroxyalkyl group, alkoxyalkyl group, or a combination of two or more of these groups; polyesters; polyamides, polyurethanes and polyesters.
Предпочтительные полисахариды включают, помимо прочего, ксантановые камеди, гуаровые камеди, крахмалы, целлюлозу, декстран и комбинацию двух или более из перечисленного.Preferred polysaccharides include, but are not limited to, xanthan gums, guar gums, starches, cellulose, dextran, and a combination of two or more of the above.
Крахмалы включают, например, кукурузный крахмал и оксипропилированный крахмал.Starches include, for example, corn starch and hydroxypropylated starch.
Целлюлоза включает, например, алкилцеллюлозы, такие как С1-С6-алкилцеллюлозы, включая метилцеллюлозу, этилцеллюлозу и н-пропилцеллюлозу; замещенные алкилцеллюлозы, включая гидрокси-С1-С6-алкилцеллюлозы и гидрокси-С1-С6-алкил-С1-С6-алкилцеллюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, гидрокси-н-пропилцеллюлоза, гидрокси-н-бутилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и этилгидроксиэтилцеллюлоза.Cellulose includes, for example, alkylcelluloses such as C1-C6alkylcelluloses, including methylcellulose, ethylcellulose, and n-propylcellulose; substituted alkylcelluloses, including hydroxy-C1-C6-alkylcelluloses and hydroxy-C1-C6-alkyl-C1-C6-alkylcelluloses such as hydroxyethylcellulose, hydroxy-n-propylcellulose, hydroxy-n-butylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and ethylhydroxyethylcellulose.
В частном варианте осуществления изобретения, неионный полимер выбран из полисахарида, поливинилпирролидона, полиэфира и полиалкиленгликоля. Предпочтительно неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмал; декстран; полиэфир, выбранный из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоль, такой как полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.In a particular embodiment of the invention, the nonionic polymer is selected from polysaccharide, polyvinylpyrrolidone, polyester and polyalkylene glycol. Preferably, the non-ionic polymer is a water-soluble cellulose selected from hydroxyethylcellulose, hydroxy-n-propylcellulose, hydroxy-n-butylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, and ethylhydroxyethylcellulose; starch; dextran; a polyester selected from compounds under the trademark Eudagrit; or a polyalkylene glycol such as polyethylene glycol or polypropylene glycol.
В еще одном частном варианте осуществления изобретения, неионный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, крахмала, декстрана 70, Eudagrit® NM; Eudagrit® NE, поливинилпирролидона (PVP) и полиэтиленгликоля (PEG). Полиэтиленгликоль предпочтительно представляет собой PEG-10000, PEG- 20000 или PEG-35000 в соответствии с его молекулярной массой.In yet another particular embodiment of the invention, the non-ionic polymer is selected from hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, starch, dextran 70, Eudagrit® NM; Eudagrit® NE, polyvinylpyrrolidone (PVP) and polyethylene glycol (PEG). The polyethylene glycol is preferably PEG-10000, PEG-20000 or PEG-35000 according to its molecular weight.
Является предпочтительным, когда неионный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и PEG 35 000. Является предпочтительным, когда неионный полимер выбран из фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и PEG 35 000. Еще более предпочтительно неионный полимер представляет собой PEG 35 000.It is preferred when the non-ionic polymer is selected from hydroxypropyl methylcellulose phthalate and PEG 35,000. It is preferred when the non-ionic polymer is selected from hydroxypropyl methylcellulose phthalate and PEG 35,000. Even more preferably, the non-ionic polymer is PEG 35,000.
Неионный полимер используется в качестве покрытия наночастиц альбумина, сообщая им повышенную стабильность и в целом обеспечивая увеличение количества моноклональных антител, которыми может быть наполнена наночастица. Было продемонстрировано, что наличие покрытия не оказывает значимого влияния на физические свойства наночастицы. В зависимости от характера покрытия возможно лишь незначительное увеличение или уменьшение размера и дзета-потенциала.A non-ionic polymer is used as a coating for albumin nanoparticles, giving them increased stability and generally providing an increase in the amount of monoclonal antibodies that can be loaded into the nanoparticle. It has been demonstrated that the presence of a coating does not significantly affect the physical properties of the nanoparticle. Depending on the nature of the coating, only a slight increase or decrease in size and zeta potential is possible.
В частном варианте осуществления изобретения, весовое отношение неионный полимер / альбумин составляет от 0,02 до 5 (в/в), более предпочтительно от 0,05 до 2 (в/в).In a particular embodiment of the invention, the weight ratio non-ionic polymer/albumin is from 0.02 to 5 (w/w), more preferably from 0.05 to 2 (w/w).
В еще одном частном варианте осуществления изобретения и в дополнительном варианте осуществления изобретения, наночастицы, используемые в настоящем изобретении, дополнительно содержат соединение для защиты матрицы альбумина в процессе сушки наночастиц или сушки суспензии, содержащей наночастицы, с использованием общепринятых способов, например посредством сушки распылением, далее - «защитное средство». Указанное защитное средство не входит в состав твердой матрицы наночастиц, выступая в качестве объемообразующего средства, способствующего эффективной сушке наночастиц с сохранением их структуры. В качестве защитного средства может использоваться практически любое соединение, отвечающее этим характеристикам. В конкретном варианте осуществления указанное защитное средство представляет собой сахарид.In yet another particular embodiment of the invention and in a further embodiment of the invention, the nanoparticles used in the present invention further comprise a compound to protect the albumin matrix during the drying of the nanoparticles or the drying of the suspension containing the nanoparticles using conventional methods, for example by spray drying, further - "protective agent". The specified protective agent is not included in the composition of the solid matrix of nanoparticles, acting as a bulk-forming agent that promotes efficient drying of nanoparticles while maintaining their structure. Almost any compound that meets these characteristics can be used as a protective agent. In a particular embodiment, said protectant is a saccharide.
Неограничивающие иллюстративные примеры защитных средств, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают лактозу, маннитол, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мальтодекстрин, глюкозу, сорбит и т.д., а также вещества с пребиотическими характеристиками, такие как, например, олигофруктоза, пектин, инулин, олигосахариды (например, галактоолигосахариды, олигосахариды грудного молока), лактулоза, пищевые волокна и т.д., и любые их комбинации. В конкретном варианте осуществления защитное средство выбрано из лактозы, маннитола, сахарозы, мальтозы, трегалозы, мальтодекстрина, глюкозы, сорбита и их комбинаций. Предпочтительно защитное средство представляет собой сахарозу. Если наночастицы, используемые в изобретении, включают защитное средство, весовое отношение матрицы альбумина и защитного средства может изменяться в широком диапазоне; тем не менее, в конкретном варианте осуществления весовое отношение защитное средство / альбумин составляет 1: 0,1-1,5, как правило, 1: 0,5-4, предпочтительно около 1:1.Non-limiting illustrative examples of protectants that can be used in the context of the present invention include lactose, mannitol, sucrose, maltose, trehalose, maltodextrin, glucose, sorbitol, etc., as well as substances with prebiotic characteristics, such as, for example, oligofructose. , pectin, inulin, oligosaccharides (eg, galactooligosaccharides, breast milk oligosaccharides), lactulose, dietary fiber, etc., and any combination thereof. In a particular embodiment, the protectant is selected from lactose, mannitol, sucrose, maltose, trehalose, maltodextrin, glucose, sorbitol, and combinations thereof. Preferably the protectant is sucrose. If the nanoparticles used in the invention include a protective agent, the weight ratio of the albumin matrix and the protective agent can vary over a wide range; however, in a particular embodiment, the weight ratio of protectant/albumin is 1:0.1-1.5, typically 1:0.5-4, preferably about 1:1.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, наночастицы, используемые в изобретении, содержат по меньшей мере одно визуализирующее средство, которое обеспечивает возможность направленной доставки лекарственного препарата с визуальным контролем за счет предварительной визуализации расположения частиц до, во время и после доставки лекарственного препарата. Для связывания с поверхностью наночастиц подходит большое количество визуализирующих средств, включая, помимо прочего, флуоресцентные визуализирующие средства (такие как индоцианин зеленый, цианин 5, цианин 7, цианин 9, флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок), визуализирующие средства, меченые радиоактивными изотопами (такие как средства, содержащие йод-124, 99mTc), и магнитно-резонансные визуализирующие средства (такие как гадолиниевые контрастные средства).In some embodiments of the present invention, the nanoparticles used in the invention comprise at least one imaging agent that enables image-guided targeted drug delivery by pre-visualizing the location of the particles before, during, and after drug delivery. A wide variety of imaging agents are suitable for binding to the surface of nanoparticles, including but not limited to fluorescent imaging agents (such as indocyanine green,
Наночастицы, используемые в изобретении, могут доставлять моноклональные антитела в контролируемом процессе. Такой контроль способен обеспечивать доставку моноклональных антител в течение длительного периода. Например, предполагается, что доставка может осуществляться в течение периода от 1 до 30 суток. Помимо выполнения с возможностью доставки лекарственного препарата контролируемым образом, наночастицы могут быть выполнены с возможностью использования различных вариантов обнаружения и визуализации частиц до, во время и после доставки лекарственного препарата.The nanoparticles used in the invention can deliver monoclonal antibodies in a controlled process. Such control is able to ensure the delivery of monoclonal antibodies over a long period. For example, it is contemplated that delivery may take place over a period of 1 to 30 days. In addition to being capable of delivering a drug in a controlled manner, the nanoparticles can be configured to use a variety of particle detection and imaging options before, during, and after drug delivery.
Наночастицы, используемые в настоящем изобретении, могут дополнительно содержать второе моноклональное антитело или лекарственный препарат для обеспечения комбинированной терапии.The nanoparticles used in the present invention may further contain a second monoclonal antibody or drug to provide combination therapy.
Указаннойый лекарственный препарат включает, например, другие белки, такие как кальцитонин, инсулин или циклоспорин А.Said drug product includes, for example, other proteins such as calcitonin, insulin or cyclosporine A.
Второе моноклональное антитело может быть любым из указанных выше, представляя собой, например, бевацизумаб (Авастин®), ранибизумаб (Луцентис®), трастузумаб (Герцептин®), цетуксимаб (Эрбитукс®) или ритуксимаб (Мабтера®).The second monoclonal antibody can be any of the above, being, for example, bevacizumab (Avastin®), ranibizumab (Lucentis®), trastuzumab (Herceptin®), cetuximab (Erbitux®) or rituximab (MabThera®).
Способ получения наночастиц.Method for obtaining nanoparticles.
Наночастицы, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены путем осаждения белков (альбумина и моноклональных антител) в водной среде перед очисткой и сушкой.The nanoparticles used in the present invention can be obtained by precipitating proteins (albumin and monoclonal antibodies) in an aqueous medium before purification and drying.
Этот способ содержит:This method contains:
a) получение водного раствора альбумина и моноклональных антител;a) obtaining an aqueous solution of albumin and monoclonal antibodies;
b) титрование водного раствора, полученного на этапе а), до рН от 4 до 5;b) titration of the aqueous solution obtained in step a) to a pH of 4 to 5;
c) добавление десольватирующего средства к водному раствору, полученному на этапе b).c) adding a desolvating agent to the aqueous solution obtained in step b).
Этот способ основан на технологии десольватации, в которой водный раствор альбумина и моноклональных антител медленно десольватируют путем медленного добавления, такого как добавление по каплям, десольватирующего средства (как правило, органического растворителя, такого как этанол, ацетон или ТГФ) при постоянных условиях перемешивания, температуры и рН.This method is based on a desolvation technology in which an aqueous solution of albumin and monoclonal antibodies is slowly desolvated by slowly adding, such as dropwise addition, a desolvating agent (typically an organic solvent such as ethanol, acetone or THF) under constant stirring conditions, temperature and pH.
В частном варианте осуществления изобретения, альбумин, используемый при получении водного раствора на этапе а), представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин, более предпочтительно человеческий сывороточный альбумин.In a particular embodiment of the invention, the albumin used in the preparation of the aqueous solution in step a) is human serum albumin or bovine serum albumin, more preferably human serum albumin.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, моноклональные антитела, используемые при получении водного раствора на этапе а), выбраны из бевацизумаба (Авастина®), ранибизумаба (Луцентиса®), трастузумаба (Герцептина®), цетуксимаба (Герцептина®) и ритуксимаба (Мабтеры®). Более предпочтительно моноклональные антитела представляют собой бевацизумаб или ранибизумаб, еще более предпочтительно бевацизумаб.In yet another preferred embodiment of the present invention, the monoclonal antibodies used in preparing the aqueous solution in step a) are selected from bevacizumab (Avastin®), ranibizumab (Lucentis®), trastuzumab (Herceptin®), cetuximab (Herceptin®) and rituximab ( Mabthers®). More preferably, the monoclonal antibodies are bevacizumab or ranibizumab, even more preferably bevacizumab.
Раствор альбумина и моноклональных антител можно получить общепринятыми способами, известными специалистам в данной области техники, например путем добавления альбумина и моноклональных антител в водный раствор.A solution of albumin and monoclonal antibodies can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art, for example by adding albumin and monoclonal antibodies to an aqueous solution.
Альбумин и моноклональные антитела предпочтительно смешивают при комнатной температуре, т.е. при температуре от 18°С до 25°С, предпочтительно от 20°С до 22°С.Albumin and monoclonal antibodies are preferably mixed at room temperature, ie. at a temperature of from 18°C to 25°C, preferably from 20°C to 22°C.
Количество альбумина, которое может быть добавлено в водный раствор, может изменяться в широком интервале значений, тем не менее, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество альбумина, добавляемое в указаннойый водный раствор, составляет от 0,1% до 10% (в/о), предпочтительно от 0,5% до 5% (в/о), еще более предпочтительно от 1% до 2% (в/о).The amount of albumin that can be added to the aqueous solution can vary over a wide range of values, however, in a specific embodiment of the present invention, the amount of albumin added to said aqueous solution is from 0.1% to 10% (w/v ), preferably 0.5% to 5% (w/v), even more preferably 1% to 2% (w/v).
Аналогичным образом количество моноклональных антител, которое может быть добавлено в водный раствор, может изменяться в широком интервале значений, тем не менее, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество моноклональных антител, добавляемое в указаннойый водный раствор, составляет от 0,005% до 1% (в/о), предпочтительно от 0,01% до 0,5% (в/о), еще более предпочтительно от 0,01% до 0,4% (в/о).Similarly, the amount of monoclonal antibodies that can be added to an aqueous solution can vary over a wide range of values, however, in a specific embodiment of the present invention, the amount of monoclonal antibodies added to said aqueous solution is from 0.005% to 1% (in /o), preferably from 0.01% to 0.5% (w/o), even more preferably from 0.01% to 0.4% (w/o).
В частном варианте осуществления изобретения, альбумин и моноклональные антитела добавляют в водный раствор таким образом, чтобы весовое отношение моноклональные антитела / альбумин составляло от 0,01 до 0,5, более предпочтительно от 0,01 до 0,2.In a particular embodiment of the invention, albumin and monoclonal antibodies are added to the aqueous solution so that the weight ratio of monoclonal antibodies/albumin is from 0.01 to 0.5, more preferably from 0.01 to 0.2.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, водный раствор альбумина и моноклональные антитела подвергают гомогенизации, например посредством перемешивания.In a preferred embodiment of the present invention, the aqueous solution of albumin and monoclonal antibodies are subjected to homogenization, for example by mixing.
Этап b) способа получения наночастиц включает снижение уровня рН водного раствора, содержащего альбумин и моноклональные антитела до слабокислого рН. Это обеспечивает возможность осаждения наночастиц на следующем этапе данного способа. Это может быть осуществлено путем добавления кислого компонента в водный раствор, полученный на этапе а), такого как 1М HCl.Step b) of the method for producing nanoparticles includes lowering the pH of an aqueous solution containing albumin and monoclonal antibodies to a slightly acidic pH. This allows the nanoparticles to be deposited in the next step of this method. This can be done by adding an acidic component to the aqueous solution obtained in step a), such as 1M HCl.
В частном варианте осуществления изобретения, водный раствор инкубируют в течение по меньшей мере 10 минут при комнатной температуре.In a particular embodiment of the invention, the aqueous solution is incubated for at least 10 minutes at room temperature.
На этапе с) способа получения наночастиц в водный раствор, полученный на этапе Ь), добавляют десольватирующее средство.In step c) of the method for producing nanoparticles, a desolvating agent is added to the aqueous solution obtained in step b).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, добавление десольватирующего средства в водный раствор, полученный на этапе b), осуществляют при перемешивании.In a preferred embodiment of the present invention, the addition of the desolvating agent to the aqueous solution obtained in step b) is carried out with stirring.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления осуществления настоящего изобретения указанное десольватирующее средство представляет собой органический растворитель, выбранный из этанола и тетрагидрофурана (ТГФ), более предпочтительно этанол.In yet another preferred embodiment of the present invention, said desolvating agent is an organic solvent selected from ethanol and tetrahydrofuran (THF), more preferably ethanol.
Десольватирующее средство медленно добавляют в водный раствор при перемешивании. Более предпочтительно десольватирующее средство добавляют по каплям в водный раствор альбумина и моноклональных антител при перемешивании полученной смеси.The desolvating agent is slowly added to the aqueous solution with stirring. More preferably, the desolvating agent is added dropwise to the aqueous solution of albumin and monoclonal antibodies while stirring the resulting mixture.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное добавление десольватирующего средства осуществляют в атмосфере инертного газа, такой как атмосфера азота.In a preferred embodiment of the present invention, said addition of the desolvating agent is carried out under an inert gas atmosphere, such as a nitrogen atmosphere.
После добавления десольватирующего средства в водный раствор альбумина и моноклональных антител при вышеуказанных условиях, т.е. при комнатной температуре и перемешивании, самопроизвольно образуются наночастицы изобретения. В частном варианте осуществления изобретения указанные наночастицы находятся в суспензии в среде, в которой они были получены.After adding a desolvating agent to an aqueous solution of albumin and monoclonal antibodies under the above conditions, i.e. at room temperature and stirring, spontaneously formed nanoparticles of the invention. In a particular embodiment of the invention, these nanoparticles are in suspension in the medium in which they were obtained.
Таким образом, способ изобретения обеспечивает возможность получения однородной дисперсии наночастиц с использованием простого процесса десольватации, обеспечивающего получение твердых наносфер со структурой матричного типа, в которых моноклональные антитела распределены во всему объему матрицы альбумина.Thus, the method of the invention makes it possible to obtain a homogeneous dispersion of nanoparticles using a simple desolvation process that provides solid nanospheres with a matrix type structure in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix.
Таким образом, наночастицы, полученные этим способом, можно рассматривать как самособирающиеся наночастицы, которые образуются самопроизвольно вследствие местных взаимодействий между моноклональными антителами и альбумином при добавлении десольватирующего средства.Thus, the nanoparticles obtained by this method can be considered as self-assembling nanoparticles that form spontaneously due to local interactions between monoclonal antibodies and albumin upon the addition of a desolvating agent.
Способ получения наночастиц может содержать дополнительный этап очистки, например с использованием способов фильтрации, центрифугирования и ультрацентрифугирования.The method for producing nanoparticles may contain an additional purification step, for example using filtration, centrifugation and ultracentrifugation methods.
Аналогичным образом указаннойый способ может включать дополнительный этап сушки полученных наночастиц для получения наночастиц изобретения в виде порошка. Эта форма выпуска указанных наночастиц обеспечивает их стабильность и, в частности, дополнительно полезна для их конечного применения в составе фармацевтических композиций.Similarly, said method may include an additional step of drying the obtained nanoparticles to obtain nanoparticles of the invention in the form of a powder. This form of release of these nanoparticles ensures their stability and, in particular, is additionally useful for their end use in pharmaceutical compositions.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, наночастицы, полученные на этапе с) или после очистки, подвергают сушке общепринятыми способами, например вакуумной сушке или предпочтительно сушке распылением или сублимационной сушке (лиофилизации) для высушивания наночастиц.In a preferred embodiment of the present invention, the nanoparticles obtained in step c) or after purification are subjected to drying by conventional methods, such as vacuum drying or preferably spray drying or freeze drying (lyophilization) to dry the nanoparticles.
В частном варианте осуществления изобретения, этот этап сушки, в частности при выполнении с использованием сушки распылением или лиофилизации, содержит добавление к сформированным наночастицам защитного средства. Это защитное средство защищает наночастицу в процессе сушки и представляет собой, например, сахарид.In a particular embodiment of the invention, this drying step, in particular when carried out using spray drying or lyophilization, comprises adding a protective agent to the formed nanoparticles. This protectant protects the nanoparticle during the drying process and is, for example, a saccharide.
Неограничивающие иллюстративные примеры сахаридов, которые могут быть использованы в качестве защитных средств в контексте настоящего изобретения, включают лактозу, маннитол, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мальтодекстрин, глюкозу, сорбит и т.д., а также полисахариды с пребиотическими характеристиками, такие как, например, олигофруктоза, пектин, инулин, олигосахариды (например, галактоолигосахариды, олигосахариды грудного молока), лактулоза, пищевые волокна и т.д., и их смеси. В конкретном варианте осуществления защитное средство выбрано из лактозы, маннитола, сахарозы, мальтозы, трегалозы, мальтодекстрина, глюкозы, сорбита и их комбинаций. Если наночастицы включают защитное средство, его добавляют в соответствующем количестве; при этом несмотря на то что весовое отношение матрицы наночастиц и защитного средства может изменяться в широком диапазоне, в конкретном варианте осуществления весовое отношение альбумин / защитное средство составляет 1:0,1-1,5, как правило, 1:0,5-4, предпочтительно около 1:1.Non-limiting illustrative examples of saccharides that can be used as protectants in the context of the present invention include lactose, mannitol, sucrose, maltose, trehalose, maltodextrin, glucose, sorbitol, etc., as well as polysaccharides with prebiotic characteristics, such as, for example, oligofructose, pectin, inulin, oligosaccharides (eg, galactooligosaccharides, breast milk oligosaccharides), lactulose, dietary fiber, etc., and mixtures thereof. In a particular embodiment, the protectant is selected from lactose, mannitol, sucrose, maltose, trehalose, maltodextrin, glucose, sorbitol, and combinations thereof. If the nanoparticles include a protective agent, it is added in an appropriate amount; however, despite the fact that the weight ratio of the matrix of nanoparticles and the protective agent can vary over a wide range, in a specific embodiment, the weight ratio of albumin / protective agent is 1:0.1-1.5, usually 1:0.5-4 , preferably about 1:1.
Для сушки наночастиц также может использоваться сушка распылением. Для этой цели суспензию, содержащую наночастицы и защитное средство, помещают в распылительную сушилку с контролируемыми условиями обработки (температура воздуха на входе, температура воздуха на выходе, давление воздуха, скорость подачи образца, всасывание и расход воздуха). Специалист в данной области техники может подобрать наиболее подходящие условия обработки в каждом конкретном случае.Spray drying can also be used to dry nanoparticles. For this purpose, a suspension containing nanoparticles and a protective agent is placed in a spray dryer with controlled processing conditions (inlet air temperature, outlet air temperature, air pressure, sample feed rate, suction and air flow). The person skilled in the art can select the most suitable processing conditions in each case.
Этот способ обеспечивает возможность получения наночастиц в виде сухого порошка, который сохраняет стабильность на протяжении длительных периодов времени при контролируемых условиях или условиях окружающей среды и может быть легко включен в различные конечные твердые и жидкие продукты.This method provides the possibility of obtaining nanoparticles in the form of a dry powder, which remains stable over long periods of time under controlled conditions or environmental conditions and can be easily incorporated into various final solid and liquid products.
Поскольку наночастицы получают перед добавлением защитного средства, оно не образует конъюгаты или комплексы с матрицей альбумина.Because the nanoparticles are prepared prior to the addition of the protectant, it does not form conjugates or complexes with the albumin matrix.
В еще одном частном варианте осуществления настоящего изобретения, когда наночастицы, используемые в изобретении, покрывают неионным полимером, указанные наночастицы с покрытием могут быть получены путем инкубации наночастиц альбумина с моноклональными антителами, полученных после этапов а) - с) описанного выше способа, с неионным полимером.In another particular embodiment of the present invention, when the nanoparticles used in the invention are coated with a non-ionic polymer, said coated nanoparticles can be obtained by incubating albumin nanoparticles with monoclonal antibodies obtained after steps a) to c) of the method described above with a non-ionic polymer .
В частном варианте осуществления изобретения, неионный полимер может представлять собой любой из вышеописанных. Является предпочтительным, когда указанный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, крахмала, декстрана 70, Eudagrit® NM, Eudagrit® NE, поливинилпирролидона и полиэтиленгликоля (PEG). Более предпочтительно неионный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и PEG 35000.In a particular embodiment of the invention, the non-ionic polymer may be any of the above. It is preferred that said polymer is selected from hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, starch, dextran 70, Eudagrit® NM, Eudagrit® NE, polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol (PEG). More preferably, the non-ionic polymer is selected from hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose phthalate and PEG 35000.
В частном варианте осуществления изобретения, весовое отношение неионный полимер / альбумин составляет от 0,02 до 5, более предпочтительно от 0,05 до 2.In a particular embodiment of the invention, the non-ionic polymer/albumin weight ratio is from 0.02 to 5, more preferably from 0.05 to 2.
В еще одном частном варианте осуществления изобретения, инкубации наночастиц в неионном полимере выполняют менее 1 часа, более предпочтительно менее 45 минут.In yet another particular embodiment of the invention, the incubation of the nanoparticles in the non-ionic polymer is less than 1 hour, more preferably less than 45 minutes.
Фармацевтическая композиция.Pharmaceutical composition.
Описанные выше наночастицы обладают способностью удерживать моноклональные антитела и защищать их в процессе обработки и хранения, а также до конечной доставки в заданную биологическую область. Таким образом, дезактивация моноклональных антител после включения в состав различных конечных продуктов (например, фармацевтических композиций или косметических композиций) полностью предотвращается или существенно снижается. Экспериментальные исследования показали, что моноклональные антитела сохраняют целостность в матрице альбумина.The nanoparticles described above have the ability to retain monoclonal antibodies and protect them during processing and storage, as well as before final delivery to a given biological area. Thus, the deactivation of monoclonal antibodies after incorporation into various end products (eg, pharmaceutical compositions or cosmetic compositions) is completely prevented or significantly reduced. Experimental studies have shown that monoclonal antibodies retain their integrity in the albumin matrix.
Кроме того, наночастицы изобретения обеспечивают возможность пролонгированного высвобождения моноклональных антител, которые также сохраняют всю полноту биологической активности и, таким образом, представляют собой систему доставки лекарственных препаратов, представляющих большой интерес для применения in vivo в соответствии с данными по биологической активности, полученными в животной модели неоваскуляризации роговицы. Проведенные эксперименты in vivo показали, что наночастицы альбумина с моноклональными антитела обеспечивают значительное снижение площади глаза с васкуляризацией роговицы по сравнению с введением тех же моноклональных антител в свободной форме.In addition, the nanoparticles of the invention allow sustained release of monoclonal antibodies that also retain their full biological activity and thus constitute a drug delivery system of great interest for in vivo use according to animal model biological activity data. corneal neovascularization. Experiments performed in vivo have shown that albumin nanoparticles with monoclonal antibodies provide a significant reduction in the area of the eye with corneal vascularization compared with the introduction of the same monoclonal antibodies in free form.
Кроме того, анализы биораспределения, выполненные с использованием наночастиц изобретения, указывают на то, что они способны концентрироваться в опухолевых тканях, что делает их очень многообещающими системами наночастиц для высвобождения моноклональных антител в пораженные раковые ткани.In addition, biodistribution analyzes performed using the nanoparticles of the invention indicate that they are able to concentrate in tumor tissues, making them very promising nanoparticle systems for releasing monoclonal antibodies into affected cancer tissues.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей множество наночастиц, как определено выше, в виде суспензии или сухого порошка и вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.Thus, in another aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition containing a plurality of nanoparticles as defined above, in the form of a suspension or dry powder, and an excipient, a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Характеристики наночастиц уже определены выше и включены в настоящий документ посредством ссылки.The characteristics of the nanoparticles have already been defined above and are incorporated herein by reference.
В частном варианте осуществления изобретения, наночастицы, содержащиеся в фармацевтической композиции изобретения, находятся в виде сухого порошка.In a particular embodiment of the invention, the nanoparticles contained in the pharmaceutical composition of the invention are in the form of a dry powder.
Несмотря на возможность использования любых способов введения фармацевтической композиции в контексте настоящего изобретения, предпочтительно фармацевтическая композиция вводится человеку или животному перорально, местно или парентерально, более предпочтительно путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрилегочного введения, внутриглазного введения, внутримышечного введения, внутрикожного или подкожного введения, перорального введения или ингаляции.While any route of administration of the pharmaceutical composition may be used in the context of the present invention, preferably the pharmaceutical composition is administered to a human or animal orally, topically or parenterally, more preferably by intravenous administration, intra-arterial administration, intra-pulmonary administration, intraocular administration, intramuscular administration, intradermal or subcutaneous administration, oral administration or inhalation.
Более предпочтительно фармацевтическая композиция содержит наполнитель или носитель, приемлемый для перорального, местного или парентерального введения.More preferably, the pharmaceutical composition contains an excipient or carrier suitable for oral, topical or parenteral administration.
В зависимости от конкретного способа введения фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде таблеток, драже, капсул, пакетов-саше, гранул, порошков, суспензий, эмульсий, безводных или гидратированных композиций для наружного применения и растворов.Depending on the particular route of administration, the pharmaceutical composition may be formulated as tablets, dragees, capsules, sachets, granules, powders, suspensions, emulsions, anhydrous or hydrated topical formulations and solutions.
Фармацевтически приемлемые носители или наполнители хорошо известны специалистам в данной области техники и общедоступны. Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель является химически инертным к активной композиции и каждому из ее компонентов и не связан с отрицательными побочными действиями или токсичностью при условиях применения.Pharmaceutically acceptable carriers or excipients are well known to those skilled in the art and are commonly available. Preferably, the pharmaceutically acceptable carrier or excipient is chemically inert to the active composition and each of its components and is not associated with adverse side effects or toxicity under the conditions of use.
В некоторых частных вариантах осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая композиция выполнена с возможностью использования в качестве системы доставки для транспортировки лекарственного препарата при пероральном, местном, парентеральном или внутривенном введении в систему кровообращения пациента.In some particular embodiments of the present invention, the pharmaceutical composition is configured to be used as a delivery system for transporting a drug for oral, topical, parenteral, or intravenous administration into a patient's circulatory system.
Композиции, подходящие для перорального введения, включают жидкие растворы, такие как эффективное количество наночастиц или содержащей их композиции, растворенных в разбавителях, таких как вода или физиологический раствор: капсулы, пакеты-саше, таблетки, пастилки, каждая из которых содержит предварительно заданное количество наночастиц, порошки, суспензии в соответствующей жидкости и эмульсии.Compositions suitable for oral administration include liquid solutions, such as an effective amount of nanoparticles or compositions containing them, dissolved in diluents such as water or saline: capsules, sachets, tablets, lozenges, each containing a predetermined amount of nanoparticles , powders, suspensions in appropriate liquids and emulsions.
Композиции для местного применения включают водные офтальмологические растворы или суспензии, офтальмологическую мазь, глазной имплантат или любую другую композицию, способную доставлять наночастицы на наружную поверхность глаза. Предпочтительно композиция для местного применения представляет собой офтальмологический раствор или суспензию, содержащую наночастицы для применения в качестве жидких капель. Любая из вышеуказанных композиций может включать подходящий растворитель, консерванты и другое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, широко применяемое в офтальмологических композициях.Compositions for topical application include aqueous ophthalmic solutions or suspensions, ophthalmic ointment, ophthalmic implant, or any other composition capable of delivering nanoparticles to the outer surface of the eye. Preferably, the topical composition is an ophthalmic solution or suspension containing nanoparticles for use as liquid drops. Any of the above compositions may include a suitable solvent, preservatives, and other pharmaceutically acceptable excipient commonly used in ophthalmic compositions.
Парентеральные композиции, как правило, содержат от 0,5% до 25% по массе наночастиц в растворе. Указанные композиции могут быть приготовлены в виде однодозовых или многодозовых герметичных контейнеров, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, требуя добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, только непосредственно перед применением.Parenteral compositions typically contain from 0.5% to 25% by weight of nanoparticles in solution. Said compositions may be prepared in single-dose or multi-dose sealed containers such as ampoules and vials and may be stored in a freeze-dried (lyophilized) state requiring the addition of a sterile liquid carrier such as water for injection just prior to use.
Заболевания, подлежащие лечению.Diseases to be treated.
Как указано выше, было продемонстрировано, что наночастицы альбумина и моноклональных антител являются очень многообещающей системой доставки лекарственных препаратов для лечения глазных заболеваний и рака.As stated above, albumin and monoclonal antibody nanoparticles have been shown to be a very promising drug delivery system for the treatment of eye diseases and cancer.
Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к наночастицам или определенной выше композиции для лечения глазных заболеваний.Thus, another aspect of the present invention relates to nanoparticles or compositions as defined above for the treatment of eye diseases.
В частном варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.In a particular embodiment of this aspect of the invention, the nanoparticle contains a hard core, said hard core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is not coated with a polymer. More specifically, said hard core is not coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of this aspect of the invention, the nanoparticle contains a hard core, said hard core, consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is not coated with a polymer. More specifically, said hard core is not coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро состоит из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of this aspect of the invention, the nanoparticle contains a solid core, said solid core consists of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is not coated with a polymer. More specifically, said hard core is not coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of this aspect of the invention, the nanoparticle contains a hard core, said hard core, consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is not coated with a polymer. More specifically, said hard core is not coated with a non-ionic polymer.
В другом аспекте настоящего изобретения, оно также относится к способу лечения заболевания глаз, указанный способ содержит введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше.In another aspect of the present invention, it also relates to a method for treating an eye disease, said method comprising administering to a patient in need of such treatment nanoparticles or a composition containing nanoparticles as described above.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше, для получения лекарственного препарата для лечения глазных заболеваний.In another aspect, the present invention also relates to the use of nanoparticles or compositions containing nanoparticles, as described above, for the preparation of a drug for the treatment of eye diseases.
Указанную композицию можно вводить пациенту перорально, местно или путем внутриглазной инъекции. В предпочтительном варианте осуществления композицию вводят местно, например путем нанесения на слизистую оболочку глаза или интравитреальной инъекции.The specified composition can be administered to the patient orally, topically or by intraocular injection. In a preferred embodiment, the composition is administered topically, for example by ocular mucosal application or intravitreal injection.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения при введении наночастиц для лечения заболевания глаз указанные наночастицы вводят в составе местной или инъекционной фармацевтической композиции, такой как описана выше.Thus, in a preferred embodiment of the present invention, when nanoparticles are administered for the treatment of an eye disease, said nanoparticles are administered as part of a topical or injectable pharmaceutical composition such as described above.
В еще одном частном варианте осуществления изобретения, заболевание глаз, подлежащая лечению, выбрана из макулярной дегенерации, неоваскуляризации или ангиогенеза роговицы, неоваскуляризации или ангиогенеза радужки, неоваскуляризации или ангиогенеза сетчатки, диабетической пролиферативной ретинопатии, недиабетической пролиферативной ретинопатии, глаукомы, инфекционного конъюнктивита, аллергического конъюнктивита, язвенного кератита, неязвенного кератита, эписклерита, склерита, диабетической ретинопатии, увеита, эндофтальмита, инфекционных процессов и воспалительных процессов.In another particular embodiment of the invention, the eye disease to be treated is selected from macular degeneration, corneal neovascularization or angiogenesis, iris neovascularization or angiogenesis, retinal neovascularization or angiogenesis, diabetic proliferative retinopathy, non-diabetic proliferative retinopathy, glaucoma, infectious conjunctivitis, allergic conjunctivitis, ulcerative keratitis, non-ulcerative keratitis, episcleritis, scleritis, diabetic retinopathy, uveitis, endophthalmitis, infectious processes and inflammatory processes.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к наночастицам или определенной выше композиции для лечения рака.Another aspect of the present invention relates to nanoparticles or compositions as defined above for the treatment of cancer.
В частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.In a particular embodiment of this aspect of the present invention, the nanoparticle contains a hard core, said hard core containing a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of this aspect of the present invention, the nanoparticle contains a hard core, said hard core, consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро состоит из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of this aspect of the present invention, the nanoparticle contains a solid core, said solid core consists of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said solid core is coated with a non-ionic polymer.
В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.In another particular embodiment of this aspect of the present invention, the nanoparticle contains a hard core, said hard core, consisting of a non-crosslinked albumin matrix and monoclonal antibodies, in which monoclonal antibodies are distributed throughout the volume of the albumin matrix, said hard core is coated with a non-ionic polymer.
В другом аспекте настоящего изобретения, оно также относится к способу лечения рака, указанный способ содержит введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше.In another aspect of the present invention, it also relates to a method of treating cancer, said method comprising administering to a patient in need of such treatment nanoparticles or a composition containing nanoparticles as described above.
В еще одном аспекте настоящего изобретения, оно также относится к применению наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше, для получения лекарственного препарата для лечения рака.In another aspect of the present invention, it also relates to the use of nanoparticles or compositions containing nanoparticles, as described above, for the preparation of a drug for the treatment of cancer.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанную композицию вводят пациенту парентерально, например путем внутривенного, внутриартериального, внутримышечного или подкожного введения.In a preferred embodiment of the invention, said composition is administered to the patient parenterally, for example by intravenous, intra-arterial, intramuscular or subcutaneous injection.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения при введении наночастиц для лечения рака указанные наночастицы вводят в составе парентеральной композиции, такой как описана выше.Thus, in a preferred embodiment of the invention, when nanoparticles are administered for cancer treatment, said nanoparticles are administered as part of a parenteral composition such as described above.
В еще одном частном варианте осуществления изобретения, рак, подлежащий лечению, включает, помимо прочего, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Примеры рака, подлежащего лечению путем введения наночастиц, включают, например, рак молочной железы, рак легких, рак поджелудочной железы, множественную миелому, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, меланому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, почек и ЖКТ, рак мочевого пузыря или плоскоклеточный рак.In yet another particular embodiment of the invention, the cancer to be treated includes, but is not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. Examples of cancers to be treated by administering the nanoparticles include, for example, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, multiple myeloma, renal cell carcinoma, prostate cancer, melanoma, colon cancer, colorectal cancer, kidney cancer, cervical cancer. uterus, ovarian cancer, liver, kidney and gastrointestinal cancer, bladder cancer or squamous cell carcinoma.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы, используемые в настоящем изобретении, или содержащие их композиции могут быть введены со второй терапевтической композицией и/или вторым лекарственным препаратом для лечения глазных заболеваний или рака.In some embodiments of the invention, the nanoparticles used in the present invention, or compositions containing them, can be administered with a second therapeutic composition and/or a second drug for the treatment of eye diseases or cancer.
Частота приема композиции и второй композиции или второго лекарственного препарата может быть скорректирована на протяжении курса лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первый и второй лекарственный препараты вводят одновременно, последовательно или параллельно. При отдельном введении композицию наночастиц и вторую композицию можно вводить с различной частотой или интервалами.The frequency of administration of the composition and the second composition or the second drug may be adjusted during the course of treatment. In some embodiments of the invention, the first and second drugs are administered simultaneously, sequentially or in parallel. When administered separately, the nanoparticle composition and the second composition may be administered at different frequencies or intervals.
В качестве альтернативы наночастицы, используемые в настоящем изобретении, могут содержать второе моноклональное антитело или лекарственный препарат для обеспечения комбинированной терапии.Alternatively, the nanoparticles used in the present invention may contain a second monoclonal antibody or drug to provide combination therapy.
Указанный лекарственный препарат включает, например, другие белки, такие как кальцитонин, инсулин или циклоспорин А.Said drug includes, for example, other proteins such as calcitonin, insulin, or cyclosporin A.
Второе моноклональное антитело может быть любым из указанных выше, представляя собой, например, бевацизумаб (Авастин®), ранибизумаб (Луцентис®), трастузумаб (Герцептин®), цетуксимаб (Эрбитукс®) или ритуксимаб (Мабтера®).The second monoclonal antibody can be any of the above, being, for example, bevacizumab (Avastin®), ranibizumab (Lucentis®), trastuzumab (Herceptin®), cetuximab (Erbitux®) or rituximab (MabThera®).
Примеры.Examples.
В приведенных ниже примерах используются следующие сокращения.The following abbreviations are used in the examples below.
BEVA - бевацизумаб.BEVA - bevacizumab.
B-NP - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом.B-NP - albumin nanoparticles filled with bevacizumab.
HSA - человеческий сывороточный альбумин.HSA - human serum albumin.
РМ - механическая смесь.PM - mechanical mixture.
NP-Glu - наночастицы альбумина, сшитые с глутаральдегидом.NP-Glu - albumin nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde.
B-NP-GLU - наночастицы альбумина, сшитые с глутаральдегидом и наполненные бевацизумабом.B-NP-GLU - albumin nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde and filled with bevacizumab.
NP-PEG35 - наночастицы альбумина, покрытые полиэтиленгликолем 35000.NP-PEG35 - albumin nanoparticles coated with polyethylene glycol 35000.
B-NP-PEG35 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые полиэтиленгликолем 35000.B-NP-PEG35 - albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated with polyethylene glycol 35000.
B-NP-HPMC-P - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые фталатом гидроксипропилметилцеллюлозы.B-NP-HPMC-P - albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated with hydroxypropyl methylcellulose phthalate.
B-NP-S100 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые Eudagrit S-100.B-NP-S100 - albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated with Eudagrit S-100.
Материалы.Materials.
Человеческий сывороточный альбумин или HSA (фракция V, степень чистоты 96-99%), полиэтиленгликоль 35000 (PEG35) и 25% водный раствор глутаральдегида (GLU) были получены от компании Sigma (Мадрид, Испания).Human serum albumin or HSA (fraction V, 96-99% pure), polyethylene glycol 35000 (PEG35) and 25% aqueous glutaraldehyde (GLU) were obtained from Sigma (Madrid, Spain).
Бевацизумаб (Авастин®) был приобретен у компании Roche (Испания). Гидроксипропилметилцеллюлоза K100 LV (НРМС; ММ 164000) производства компании Ashland Chemical Hispania (Испания). Авастин® поставляется в виде концентрата для приготовления раствора для инфузий в одноразовых флаконах с номинальным содержанием 100 мг бевацизумаба во флаконе объемом 4 мл или 400 мг бевацизумаба во флаконе объемом 16 мл (концентрация 25 мг/мл). Фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС-Р) был приобретен у компании Acros Organic (Испания). Набор для анализа белка Micro ВСА был приобретен у компании Pierce (Thermo Fisher Scientific Inc., штат Иллинойс, США). Набор для иммуноферментного анализа Shikari Q-beva, используемый для определения бевацизумаба, был приобретен у компании Matriks Biotech (Турция). Ацетон был приобретен у компании Prolabo, VWR International Ltd (Англия), а хлорид олова дигидрат и чистый спирт были приобретены у компании Рапгеас Pharma (Испания). Изофлуран был приобретен у компании Braun, а средство для безболезненного умерщвления Т-69 Intervet - у компании Schering-Plough Animal Health. Элюат пертехнетата с технецием-99 т был получен из генератора Drytec® 99Mo-99mTc, приобретенного у компании General Electric.Bevacizumab (Avastin®) was purchased from Roche (Spain). Hydroxypropyl methylcellulose K100 LV (HPMC; MM 164000) manufactured by Ashland Chemical Hispania (Spain). Avastin® is supplied as a concentrate for solution for infusion in single-use vials with a nominal content of 100 mg of bevacizumab in a 4 ml vial or 400 mg of bevacizumab in a 16 ml vial (25 mg/ml concentration). Hydroxypropylmethylcellulose phthalate (HPMC-R) was purchased from Acros Organic (Spain). The Micro BCA protein assay kit was purchased from Pierce (Thermo Fisher Scientific Inc., Illinois, USA). The Shikari Q-beva enzyme immunoassay kit used to detect bevacizumab was purchased from Matriks Biotech (Turkey). Acetone was purchased from Prolabo, VWR International Ltd (England) and stannous chloride dihydrate and pure alcohol were purchased from Rapgeas Pharma (Spain). Isoflurane was purchased from Braun and T-69 Intervet Painless Killer from Schering-Plough Animal Health. The technetium-99 t pertechnetate eluate was obtained from a Drytec® 99Mo-99mTc generator purchased from General Electric.
Для физико-химических исследований использовали следующие приборы: спектрометр Thermo / Nicolet 360FT-IR (E.S.P.Thermo Fisher Scientific, США), дифрактометр Bruker Axs D8 Advance (Германия), для термогравиметрического анализа (ТГ) и дифференциальной сканирующей колориметрии (ДСК) использовали калориметр Mettler Toledo dsc822e с роботом для отбора проб Mettler Toledo TSO 801 RO и охладителем Julabo FT900, а для элементного анализа - элементный анализатор LECO CHN-900 (штат Мичиган, США).The following instruments were used for physicochemical studies: Thermo / Nicolet 360FT-IR spectrometer (E.S.P. Thermo Fisher Scientific, USA), Bruker Axs D8 Advance diffractometer (Germany), Mettler calorimeter was used for thermogravimetric analysis (TG) and differential scanning colorimetry (DSC). Toledo dsc822e with Mettler Toledo TSO 801 RO sampling robot and Julabo FT900 cooler, and for elemental analysis - LECO CHN-900 elemental analyzer (Michigan, USA).
Для исследований с использованием радиомечения и исследований биораспределения использовали следующие приборы: ОФЭКТ-КТ Symbia, Siemens Medical Systems (Германия), калибратор активности AtomLab 500, Biodex (США), гамма-счетчик LKB Pharmacia.For studies using radiolabeling and biodistribution studies, the following instruments were used: Symbia SPECT-CT, Siemens Medical Systems (Germany),
Физико-химическая характеристика наночастиц (размер, дзета-потенциал и морфология).Physicochemical characteristics of nanoparticles (size, zeta potential and morphology).
Размер и дзета-потенциал наночастиц определяли в приборе Zeta Plus (Brookhaven Inst. Corp., США). Диаметр наночастиц определяли после диспергирования в сверхчистой воде (1/10) и измеряли при 25°С способом динамического светорассеяния под углом 90°С. Дзета-потенциал определяли следующим образом: 200 мкл образца растворяли в 2 мл раствора 1 мМ KCl с рН, приведенным к 7,4.The size and zeta potential of nanoparticles were determined using a Zeta Plus instrument (Brookhaven Inst. Corp., USA). The diameter of the nanoparticles was determined after dispersion in ultrapure water (1/10) and measured at 25°C by dynamic light scattering at an angle of 90°C. The zeta potential was determined as follows: 200 μl of the sample was dissolved in 2 ml of a solution of 1 mm KCl with pH adjusted to 7.4.
Морфологические характеристики наночастиц исследовали с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) под цифровым сканирующим электронным микроскопом Zeiss DSM940 (Оберкохен, Германия). Для этой цели образцы диспергировали в воде и центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при 4°С для удаления криопротектора. Затем микросферы помещали на стеклянные пластинки, приклеенные двусторонней клейкой лентой к металлическим стержням, и высушивали. На них напыляли слой платины с палладием толщиной 4 нм с использованием устройства для ионного напыления Cressington 208HR с планетарным/наклонным столиком, оборудованного регулятором толщины МТМ-20. СЭМ выполняли с использованием прибора LEO 1530 (LEO Electron Microscopy Inc, Торнвуд, штат Нью-Йорк, США) при напряжении 1-3 кВ и силе тока накала около 0,5 мА.The morphological characteristics of the nanoparticles were studied using scanning electron microscopy (SEM) under a Zeiss DSM940 digital scanning electron microscope (Oberkochen, Germany). For this purpose, the samples were dispersed in water and centrifuged at 27,000 g for 20 minutes at 4°C to remove the cryoprotectant. Then the microspheres were placed on glass plates glued to metal rods with double-sided adhesive tape and dried. They were sputtered with a 4 nm thick platinum/palladium layer using a Cressington 208HR planetary/tilt stage ion sputterer equipped with an MTM-20 thickness control. SEM was performed using a LEO 1530 instrument (LEO Electron Microscopy Inc, Thornwood, NY, USA) at a voltage of 1-3 kV and a filament current of about 0.5 mA.
Выход.Exit.
Количество HSA, превращенное в наночастицы (выход) определяли путем подсчета HSA, образующего наночастицы, с использованием набора Micro ВСА. Коротко говоря, 10 мг наночастиц взвешивали и диспергировали в 10 мл сверхчистой воды и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 минут при 4°С (Rotor 3336, Biorage Heraeus, Ханау, Германия). Затем микросферы измельчали с 1 мл 0,02 Н NaOH, и 200 мкл этого раствора переносили в 96-луночный микропланшет с дальнейшим использованием для анализа белка Micro ВСА в спектрофотометре при 562 нм.The amount of HSA converted to nanoparticles (yield) was determined by counting HSA forming nanoparticles using a Micro BCA kit. Briefly, 10 mg of nanoparticles were weighed and dispersed in 10 ml of ultrapure water and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4° C. (Rotor 3336, Biorage Heraeus, Hanau, Germany). Then the microspheres were ground with 1 ml of 0.02 N NaOH, and 200 μl of this solution was transferred into a 96-well microplate with further use for analysis of Micro BCA protein in a spectrophotometer at 562 nm.
Избирательность набора определяли с использованием контролей, содержащих другие вспомогательные вещества и препараты (глутаральдегид, PEG 35 000, НРМС или бевацизумаб), для определения возможных искажений при определении альбумина. Анализ данных выполняли с использованием следующей формулы:The selectivity of the kit was determined using controls containing other excipients and preparations (glutaraldehyde, PEG 35,000, HPMC or bevacizumab) to determine possible distortions in the determination of albumin. Data analysis was performed using the following formula:
где Wлиоф - количество HSA, преобразованного в наночастицы,where Wliof is the amount of HSA converted into nanoparticles,
a Wисх - количество HSA, использованное для получения наночастиц.a Wix is the amount of HSA used to obtain nanoparticles.
Подсчет полезной нагрузки препарата в наночастицах.Calculation of drug payload in nanoparticles.
Количество антител, содержащихся в наночастицах альбумина, оценивали с использованием иммуноферментного анализа (Shikari Q-BEVA). Для этой цели 10 мг наночастиц взвешивали и диспергировали в 1 мл воды. Суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Ханау, Германия). Надосадочную жидкость удаляли. Затем наночастицы растворяли в 1 мл 0,02 Н NaOH. 200 мкл полученного раствора переносили в 96-луночный микропланшет, покрытый человеческим фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), и выполняли специфический ИФА для бевацизумаба (процедура испытаний Q-Beva, Shikari Q-Beva, Matriks Biotek).The amount of antibodies contained in the albumin nanoparticles was assessed using enzyme immunoassay (Shikari Q-BEVA). For this purpose, 10 mg of nanoparticles were weighed and dispersed in 1 ml of water. The suspension was centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Hanau, Germany). The supernatant was removed. Then the nanoparticles were dissolved in 1 ml of 0.02 N NaOH. 200 μl of the resulting solution was transferred to a 96-well microplate coated with human vascular endothelial growth factor (VEGF) and specific ELISA for bevacizumab was performed (test procedure Q-Beva, Shikari Q-Beva, Matriks Biotek).
Каждый образец анализировали в трех повторностях и выполняли расчеты с использованием стандартных кривых в диапазоне от 0,1 до 100 мкг/мл (r2>0,993). Пределы обнаружения и количественного определения составляли 0,1 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно (r2>0,993).Each sample was analyzed in triplicate and calculated using standard curves ranging from 0.1 to 100 μg/ml (r2>0.993). The limits of detection and quantification were 0.1 µg/mL and 100 µg/mL, respectively (r2>0.993).
Нагрузка бевацизумаба (DL) и эффективность включения (ЕЕ) рассчитывали по следующим формулам:Bevacizumab loading (DL) and incorporation efficiency (EE) were calculated using the following formulas:
где Wвкл - количество включенного бевацизумаба,where Won is the amount of included bevacizumab,
Wобщ - общее количество использованного препарата,Wtot - the total amount of the drug used,
a Wнч - масса наночастиц.a Wnch is the mass of nanoparticles.
ИК-Фурье-спектроскопия.IR-Fourier spectroscopy.
Молекулярную структуру наночастиц HSA исследовали с использованием ИК-Фурье-спектроскопии. Инфракрасные спектры образцов, диспергированных в 1% образца в дисках KBr, снимали на Фурье-ИК-спектрометре NICOLET (Thermo / Nicolet 360FT-IR E.S.P. Thermo Fisher Scientific, США). Образцы сканировали в диапазоне от 4000 до 400 см-1. Условия съемки были следующими: разрешение 8,0 и 40-кратное сканирование образцов. Данные анализировали с использованием программного обеспечения OMNIC (Thermo Fisher Scientific, США).The molecular structure of the HSA nanoparticles was studied using FT-IR spectroscopy. IR spectra of samples dispersed in 1% sample in KBr disks were recorded on a NICOLET Fourier IR spectrometer (Thermo / Nicolet 360FT-IR E.S.P. Thermo Fisher Scientific, USA). The samples were scanned in the range from 4000 to 400 cm-1. The shooting conditions were as follows: 8.0 resolution and 40x sample scan. Data were analyzed using OMNIC software (Thermo Fisher Scientific, USA).
Рентгенографические исследования.X-ray studies.
Рентгенографические исследования выполняли для изучения распределения кристаллографических плоскостей и изменчивости степени кристалличности полимерной матрицы в различных образцах наночастиц. Для этой цели образцы в виде порошка на металлической пластинке помещали в дифрактометр (Bruker Axs D8 Advance, Германия) и измеряли в диапазоне углов до 360° при комнатной температуре. Дифрактограммы анализировали с использованием программы Diffrac.Suite.X-ray studies were performed to study the distribution of crystallographic planes and the variability of the degree of crystallinity of the polymer matrix in different samples of nanoparticles. For this purpose, samples in the form of a powder on a metal plate were placed in a diffractometer (Bruker Axs D8 Advance, Germany) and measured in the range of angles up to 360° at room temperature. The diffraction patterns were analyzed using the Diffrac.Suite program.
Термический анализ.Thermal analysis.
Реакцию различных наночастиц на изменения температуры исследовали с использованием термического анализа (термогравиметрического анализа (ТГА) в сочетании с дифференциальным термическим анализом (ДТА)). Анализировали изменения поведения при термическом воздействии функциональных групп HSA во время образования наночастиц. Термические анализы проводили на анализаторе термогравиметрического и дифференциально-термического анализа TGA/sDTA 85 le Mettler Toledo. Термограммы получали путем нагрева около 5-10 мг образца в перфорированном алюминиевом тигле с частотой сканирования 10°С/мин от 25 до 250°С. Термические анализы выполняли в атмосфере неподвижного воздуха с использованием N2 (20 мл-мин-1) в качестве продувочного газа. Измерения выполняли в трех повторностях.The response of various nanoparticles to temperature changes was investigated using thermal analysis (thermogravimetric analysis (TGA) combined with differential thermal analysis (DTA)). Behavioral changes were analyzed upon thermal exposure of HSA functional groups during the formation of nanoparticles. Thermal analyzes were performed on a TGA/sDTA 85 le Mettler Toledo thermogravimetric and differential thermal analysis analyzer. Thermograms were obtained by heating about 5-10 mg of the sample in a perforated aluminum crucible with a scanning frequency of 10°C/min from 25 to 250°C. Thermal analyzes were performed under still air using N2 (20 mL-min-1) as purge gas. Measurements were performed in triplicate.
Элементный анализ.elemental analysis.
Элементный анализ (С, Н, О и N) наночастиц выполняли для подтверждения связи различных стабилизирующих добавок в наночастицах HSA на элементном анализаторе LECO CHN-900 (штат Мичиган, США). Коротко говоря, 1 мг каждого образца испытывали в трех повторностях с выражением результатов в процентах (% по массе) с СО ± 0,4. Этот способ демонстрирует изменения в составе кислорода, водорода или азота альбумина (HSA) при связывании с другими компонентами (глутаральдегидом, PEG35, НРМС-Р или бевацизумабом).Elemental analysis (C, H, O, and N) of nanoparticles was performed to confirm the relationship of various stabilizing additives in HSA nanoparticles on a LECO CHN-900 elemental analyzer (Michigan, USA). Briefly, 1 mg of each sample was tested in triplicate, expressed as a percentage (% by weight) with SD ± 0.4. This method demonstrates changes in the composition of oxygen, hydrogen or nitrogen of albumin (HSA) when bound to other components (glutaraldehyde, PEG35, HPMC-P or bevacizumab).
Исследование высвобождения in vitro.In vitro release study.
Исследования высвобождения in vitro наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, выполняли в PBS (рН 7,4). Пробирки Эппендорфа, содержащие 10 мг каждой композиции наночастиц, диспергировали в общем объеме 1 мл PBS, помещенном в пробирки Эппендорфа, и помещали во встряхивающую баню при 37°С при постоянном перемешивании с частотой 60 циклов/мин (Unitronic 320 OR, Selecta, Мадрид, Испания). Пробирки Эппендорфа отбирали с различными временными интервалами и центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Ханау, Германия). Надосадочные жидкости анализировали для определения содержания бевацизумаба с использованием специфического ИФА (Shikari Q-Beva, Matriks Biotek). Профили высвобождения выражали в совокупном высвобождении в процентах и наносили на график изменения по времени.In vitro release studies of bevacizumab-loaded albumin nanoparticles were performed in PBS (pH 7.4). Eppendorf tubes containing 10 mg of each nanoparticle composition were dispersed in a total volume of 1 ml of PBS placed in Eppendorf tubes and placed in a shaking bath at 37°C with constant stirring at a frequency of 60 cycles/min (Unitronic 320 OR, Selecta, Madrid, Spain). Eppendorf tubes were taken at various time intervals and centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Hanau, Germany). Supernatants were analyzed for bevacizumab content using a specific ELISA (Shikari Q-Beva, Matriks Biotek). Release profiles were expressed as cumulative release as a percentage and plotted over time.
Кроме того, на основе профилей высвобождения оценивали кинетику с использованием экспоненциальной модели на основе уравнения Корсмейера - Пеппаса (ур. 4):In addition, based on the release profiles, the kinetics were evaluated using an exponential model based on the Korsmeier-Peppas equation (equation 4):
где Q - процентная доля высвобождения препарата в момент времениwhere Q is the percentage of the release of the drug at the point in time
t,t,
K - константа, учитывающая структурные и геометрические характеристики исследуемого устройства, n - диффузионная экспонента, которая, как правило, используется в качестве показателя механизма транспортировки препарата в лекарственной форме.K is a constant that takes into account the structural and geometric characteristics of the device under study, n is the diffusion exponent, which is usually used as an indicator of the drug transport mechanism in the dosage form.
Значение n≤0,43 показывает, что высвобождение препарата происходит согласно фиковской диффузии, тогда как значение n≥0,85 указывает на то, что в высвобождении препарата преобладает механизм эрозии. Для значений 0,43<n<0,85 высвобождение обозначается как аномальное, подразумевая, что высвобождение препарата обусловлено сочетанием диффузии и эрозии [Gao Y., et al., In Vitro Release Kinetics of Antituberculosis Drugs from Nanoparticles Assessed Using a Modified Dissolution Apparatus. Biomed Research International 2013].A value of n≤0.43 indicates that the release of the drug occurs according to Fickian diffusion, while a value of n≥0.85 indicates that the release of the drug is dominated by the erosion mechanism. For values of 0.43<n<0.85, release is designated as abnormal, implying that drug release is due to a combination of diffusion and erosion [Gao Y., et al., In Vitro Release Kinetics of Antituberculosis Drugs from Nanoparticles Assessed Using a Modified Dissolution Apparatus . Biomed Research International 2013].
Пример 1. Получение наночастиц человеческого сывороточного альбумина, наполненных бевацизумабом. Влияние отношения бевацизумаб/HSA на физико-химические свойства полученных наночастиц.Example 1 Preparation of human serum albumin nanoparticles filled with bevacizumab. Effect of the bevacizumab/HSA ratio on the physicochemical properties of the obtained nanoparticles.
Наночастицы, наполненные бевацизумабом, получали с использованием процедуры осаждения белков в водной среде перед очисткой и сушкой.Bevacizumab-loaded nanoparticles were prepared using an aqueous protein precipitation procedure prior to purification and drying.
Для этой цели 100 мг HSA и переменное количество бевацизумаба (BEVA) (1-20 мг) растворяли в 5-10 мл воды для инъекций, а затем раствор титровали до рН 4,1-4,4 с использованием 1 М HCL. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Наночастицы получали путем непрерывного добавления 16 мл этанола, используемого в качестве десольватирующего средства при постоянном перемешивании (500 об/мин) при комнатной температуре. Полученные наночастицы очищали двумя различными способами - ультрацентрифугированием и ультрафильтрацией. В первом наночастицы очищали дважды путем центрифугирования при 21000 g в течение 20 минут при 4°С (Sigma 3K30, Остероде-ам-Харц, Германия) и повторного диспергирования микросфер в исходном объеме в воде. Во втором наночастицы очищали путем ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтрующий элемент с размером пор 50 кДа (Medica SPA, Италия). Затем наночастицы лиофилизировали в приборе Genesis 12EL (Virtis, штат Нью-Йорк, США) после повторного диспергирования или 5% водного раствора сахарозы. Эти композиции представляют собой наночастицы человеческого сывороточного альбумина, наполненные частицами бевацизумаба, без какой-либо дополнительной стабилизации, далее - композиции B-NP.For this purpose, 100 mg of HSA and a variable amount of bevacizumab (BEVA) (1-20 mg) were dissolved in 5-10 ml of water for injection, and then the solution was titrated to pH 4.1-4.4 using 1 M HCL. The mixture was incubated at room temperature for 10 minutes. Nanoparticles were obtained by continuous addition of 16 ml of ethanol used as a desolvatant with constant stirring (500 rpm) at room temperature. The obtained nanoparticles were purified by two different methods - ultracentrifugation and ultrafiltration. In the first, the nanoparticles were purified twice by centrifugation at 21,000 g for 20 minutes at 4°C (Sigma 3K30, Osterode am Harz, Germany) and redispersion of the microspheres in the original volume in water. In the second, the nanoparticles were purified by ultrafiltration through a polysulfone membrane filter element with a pore size of 50 kDa (Medica SPA, Italy). The nanoparticles were then lyophilized in a Genesis 12EL (Virtis, NY, USA) after redispersion or 5% sucrose aqueous solution. These compositions are human serum albumin nanoparticles filled with bevacizumab particles without any additional stabilization, hereinafter referred to as B-NP compositions.
Для включения моноклональных антител в наночастицы определяли два ключевых параметра- отношение бевацизумаб / альбумин и время инкубации для обеих композиций перед образованием наночастиц. В сводной таблице 1 приведены основные физико-химические свойства полученных наночастиц при изменении отношения моноклональные антитела / белок. При низком отношении бевацизумаб / альбумин (например, 0,01) наночастицы не сохраняли стабильность с течением времени. Для отношений выше 0,01 полученные наночастицы сохраняли стабильность при среднем размере, близком к 300 нм, и отрицательном поверхностном заряде около -15 мВ.To incorporate the monoclonal antibodies into the nanoparticles, two key parameters were determined, the bevacizumab/albumin ratio and the incubation time for both formulations before nanoparticle formation. Summary Table 1 shows the main physicochemical properties of the obtained nanoparticles when changing the ratio of monoclonal antibodies/protein. At a low bevacizumab/albumin ratio (eg 0.01), the nanoparticles were not stable over time. For ratios above 0.01, the resulting nanoparticles were stable with an average size close to 300 nm and a negative surface charge of about -15 mV.
Аналогичным образом расчетный выход технологического процесса составил около 80%. На фигуре 1 показано влияние отношения бевацизумаб / альбумин на содержание моноклональных антител.Similarly, the estimated yield of the process was about 80%. The figure 1 shows the effect of the ratio of bevacizumab/albumin on the content of monoclonal antibodies.
В соответствии с данными результатами количество бевацизумаба, содержащегося в наночастицах, возрастало с увеличением отношения BEVA/HSA. Все эти эксперименты проводили после 10 минут инкубации между моноклональными антителами и белком. Примечательно, что при увеличении этого параметра не наблюдались значимые различия в физико-химических свойствах наночастиц.Consistent with these results, the amount of bevacizumab contained in the nanoparticles increased with increasing BEVA/HSA ratio. All of these experiments were performed after 10 minutes of incubation between monoclonal antibodies and protein. It is noteworthy that no significant differences in the physicochemical properties of nanoparticles were observed with an increase in this parameter.
Таблица 1. Влияние отношения бевацизумаб / альбумин на физико-химические свойства полученных наночастиц. Время инкубации между бевацизумабом и альбумином - 10 минут. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).Table 1. Effect of the bevacizumab/albumin ratio on the physicochemical properties of the obtained nanoparticles. The incubation time between bevacizumab and albumin is 10 minutes. Data are expressed as mean ± SD (n=3).
Пример 2. Влияние сшивки наночастиц, наполненных бевацизумабом, с глутаральдегидом на их физико-химические свойства.Example 2. Effect of cross-linking of nanoparticles filled with bevacizumab with glutaraldehyde on their physicochemical properties.
В связи с тем фактом, что наночастицы человеческого сывороточного альбумина в отсутствие бевацизумаба не сохраняли стабильность и исчезали сразу же после образования, контрольные наночастицы, наполненные бевацизумабом, были получены путем сшивки с 12,5 мкг глутаральдегида в этаноле (300 мкл), далее - композиции B-NP-GLU. Для этой цели только что образовавшиеся наночастицы, наполненные бевацизумабом, инкубировали в течение 5 минут с глутаральдегидом перед очисткой и лиофилизацией.Due to the fact that human serum albumin nanoparticles in the absence of bevacizumab did not remain stable and disappeared immediately after formation, control nanoparticles filled with bevacizumab were obtained by cross-linking with 12.5 μg of glutaraldehyde in ethanol (300 μl), hereinafter - compositions B-NP-GLU. For this purpose, newly formed nanoparticles filled with bevacizumab were incubated for 5 minutes with glutaraldehyde before purification and lyophilization.
В сводной таблице 2 приведены основные физико-химические свойства необработанных наночастиц HSA (без дополнительных процедур стабилизации) и контрольных наночастиц, полученных путем сшивки с глутаральдегидом. Путем включения бевацизумаба в наночастицы альбумина получали стабильные наночастицы с высоким содержанием антител. Примечательно, что эффективность включения, рассчитанная как содержание активных моноклональных антител в наночастицах, была близкой к 90% при содержании бевацизумаба около 13%. При сшивке наночастиц, наполненных бевацизумабом, с глутаральдегидом, полученные наночастицы были незначительно меньше полученных без химического сшивающего агента. Тем не менее, обработка наночастиц глутаральдегидом инактивировала моноклональные антитела, и количественная оценка с использованием ИФА показала очень низкие уровни антител.Summary Table 2 shows the main physicochemical properties of untreated HSA nanoparticles (without additional stabilization procedures) and control nanoparticles obtained by crosslinking with glutaraldehyde. By incorporating bevacizumab into albumin nanoparticles, stable nanoparticles with a high antibody content were obtained. It is noteworthy that the incorporation efficiency, calculated as the content of active monoclonal antibodies in nanoparticles, was close to 90% at a bevacizumab content of about 13%. When cross-linking nanoparticles filled with bevacizumab with glutaraldehyde, the obtained nanoparticles were slightly smaller than those obtained without a chemical cross-linking agent. However, treatment of the nanoparticles with glutaraldehyde inactivated the monoclonal antibodies and ELISA quantitation showed very low antibody levels.
Пример 3. Характеристика наночастиц, наполненных бевацизумабом.Example 3. Characterization of nanoparticles filled with bevacizumab.
ПЭМ.TEM.
На фиг. 2 показана морфология наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP), которые имеют сферическую форму и неровную поверхность.In FIG. 2 shows the morphology of bevacizumab-filled (B-NP) nanoparticles that are spherical in shape and have an uneven surface.
ИК-Фурье-спектроскопия.IR-Fourier spectroscopy.
ИК-спектроскопия позволяет оценить проявление конформационньгх изменений во вторичной структуре белка. На фиг. 3 показаны ИК-Фурье-спектры наночастиц, наполненных бевацизумабом, в сравнении с отдельными спектрами моноклональных антител, белка и их механической смеси.IR spectroscopy makes it possible to evaluate the manifestation of conformational changes in the secondary structure of a protein. In FIG. 3 shows the FT-IR spectra of bevacizumab-filled nanoparticles compared to individual spectra of monoclonal antibodies, protein, and their mechanical mixture.
ИК-спектры белков демонстрируют большое количество амидных связей, которые отражают различные колебания пептидных групп. Такие сигналы: амидная полоса I в диапазоне от 1600 до 1700 см-1 (главным образом участок С=О) и амидная полоса II при 1550 см-1 (участок C-N, связанный с изгибными колебаниями N-H) - использовались в качестве подтверждения присутствия такой химической связи и ее непосредственного отношения ко вторичной структуре белка. Тем не менее, амидная полоса I более чувствительна к изменению вторичной структуры белка, чем амид II. Таким образом, изменения частоты и силы этих сигналов являются подтверждением взаимодействия с белком.The IR spectra of proteins show a large number of amide bonds, which reflect various vibrations of peptide groups. Such signals: amide band I in the range from 1600 to 1700 cm-1 (mainly the C=O region) and amide band II at 1550 cm-1 (C-N region associated with N-H bending vibrations) - were used as confirmation of the presence of such a chemical connection and its direct relation to the secondary structure of the protein. However, amide band I is more sensitive to changes in protein secondary structure than amide II. Thus, changes in the frequency and strength of these signals are confirmation of the interaction with the protein.
В данном случае и в связи с тем фактом, что наночастицы образованы двумя различными белками (альбумином и бевацизумабом), наблюдались небольшие изменения частоты сигнала, соответствующие пику амида I (1642 для HSA и 1645 см-1 для B-NP).In this case, and due to the fact that the nanoparticles are formed by two different proteins (albumin and bevacizumab), slight changes in signal frequency were observed corresponding to the amide I peak (1642 for HSA and 1645 cm-1 for B-NP).
В качестве контроля также исследовали наночастицы, сшитые с глутаральдегидом. В этом случае также было обнаружено незначительное смещение частот амида I (1642-1645 см-1) вследствие взаимодействия между глутаральдегидом и альбумином.As a control, nanoparticles crosslinked with glutaraldehyde were also studied. In this case, a slight frequency shift of amide I (1642-1645 cm-1) was also found due to the interaction between glutaraldehyde and albumin.
Рентгенографические исследования.X-ray studies.
На фиг. 4 показаны рентгеновские спектры человеческого сывороточного альбумина, бевацизумаба и наночастиц, наполненных бевацизумабом. Во всех случаях такие спектры показывают аморфную структуру.In FIG. 4 shows X-ray spectra of human serum albumin, bevacizumab, and bevacizumab-loaded nanoparticles. In all cases, such spectra show an amorphous structure.
Термический анализ.Thermal analysis.
Термические анализы были выполнены для определения реакции между функциональными группами HSA и бевацизумаба. На фиг. 5 показаны термограммы нативного альбумина (HSA) и бевацизумаба (BEVA) (А), наночастиц с бевацизумабом (B-NP) и механической смеси (P.M.) альбумина и бевацизумаба (В), нативного альбумина (HSA) и глутаральдегида (GLU) (С), наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (NP-GLU), и механической смеси (P.M.) альбумина и глутаральдегида (D).Thermal analyzes were performed to determine the reaction between the functional groups of HSA and bevacizumab. In FIG. Figure 5 shows thermograms of native albumin (HSA) and bevacizumab (BEVA) (A), nanoparticles with bevacizumab (B-NP) and mechanical mixture (P.M.) of albumin and bevacizumab (B), native albumin (HSA) and glutaraldehyde (GLU) (C ), nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde (NP-GLU), and a mechanical mixture (P.M.) of albumin and glutaraldehyde (D).
Термограммы показывают, что нативный альбумин обладает экзотермическим эффектом около 30°С, который соответствует обратимому переходу, и вторым тепловым эффектом, связанным с эндотермическим переходом стеклования.Thermograms show that native albumin has an exothermic effect around 30° C., which corresponds to a reversible transition, and a second thermal effect associated with an endothermic glass transition.
Отсутствие в наночастицах экзотермического сигнала, соответствующего альбумину, может быть обусловлено сочетанием альбумина с белком (BEVA) и сшивающим агентом (глутаральдегидом). Таким образом, бевацизумаб и альбумин образуют комплекс.The absence of an exothermic signal in nanoparticles corresponding to albumin may be due to the combination of albumin with protein (BEVA) and a crosslinking agent (glutaraldehyde). Thus, bevacizumab and albumin form a complex.
Элементный анализ.elemental analysis.
В таблице 3 приведены данные элементного анализа человеческого сывороточного альбумина, бевацизумаба, наночастиц альбумина, сшитых с глутаральдегидом, и наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом. Бевацизумаб демонстрирует значительно более низкое содержание углерода и азота по сравнению с человеческим сывороточным альбумином. Напротив, содержание кислорода в моноклональных антителах примерно в два раза выше, чем в альбумине. Аналогичным образом наночастицы, наполненные бевацизумабом (B-NP), демонстрировали более низкую долю азота и более высокое содержание кислорода по сравнению с нативным альбумином.Table 3 shows elemental analysis data for human serum albumin, bevacizumab, albumin nanoparticles crosslinked with glutaraldehyde, and albumin nanoparticles filled with bevacizumab. Bevacizumab exhibits significantly lower carbon and nitrogen content compared to human serum albumin. On the contrary, the oxygen content in monoclonal antibodies is about two times higher than in albumin. Similarly, bevacizumab-filled (B-NP) nanoparticles exhibited a lower nitrogen content and a higher oxygen content compared to native albumin.
Пример 4. Стабильность наночастиц, наполненных бевацизумабом.Example 4. Stability of nanoparticles filled with bevacizumab.
Стабильность наночастиц оценивали в сверхчистой воде. Образцы диспергировали в очищенной воде и хранили при комнатной температуре в течение 3 суток. Через различные интервалы времени оценивали стабильность путем измерения размера, коэффициента полидисперсности и дзета-потенциала наночастиц.The stability of nanoparticles was evaluated in ultrapure water. Samples were dispersed in purified water and stored at room temperature for 3 days. Stability was evaluated at various time intervals by measuring the size, polydispersity coefficient, and zeta potential of the nanoparticles.
После диспергирования в воде (при рН, приведенном к 7,4) наночастицы, наполненные бевацизумабом, сохраняли стабильность на протяжении по меньшей мере 24 часов (фиг. 6). Их поведение было аналогичным наблюдаемому для пустых наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (фиг. 6). Аналогичным образом эксперимент не влиял на коэффициент полидисперсности (КП) B-NP. Так, при t=0 КП составлял 0,19±0,01, а через 24 часа этот параметр составлял 0,16±0,03 (данные не показаны).After dispersion in water (at pH adjusted to 7.4), the bevacizumab-filled nanoparticles were stable for at least 24 hours (FIG. 6). Their behavior was similar to that observed for empty nanoparticles crosslinked with glutaraldehyde (Fig. 6). Similarly, the experiment did not affect the polydispersity coefficient (PC) of B-NP. So, at t=0, the CP was 0.19±0.01, and after 24 hours this parameter was 0.16±0.03 (data not shown).
Пример 5. Высвобождение in vitro бевацизумаба из наночастиц.Example 5 In vitro release of bevacizumab from nanoparticles.
На фиг. 7 показан профиль высвобождения in vitro бевацизумаба из наночастиц альбумина в PBS. Этот профиль характеризовался первоначальным взрывным эффектом с высвобождением около 23% включенных антител за первые 5 минут с последующим медленным контролируемым высвобождением на протяжении следующих 24 часов. В конце эксперимента было достигнуто высвобождение около 40% включенного бевацизумаба. Взрывное высвобождение может быть связано с антителами, адсорбированными на поверхности наночастиц.In FIG. 7 shows the in vitro release profile of bevacizumab from albumin nanoparticles in PBS. This profile was characterized by an initial burst of release of about 23% of incorporated antibodies in the first 5 minutes, followed by a slow controlled release over the next 24 hours. At the end of the experiment, a release of about 40% of the included bevacizumab was achieved. The explosive release may be associated with antibodies adsorbed on the surface of the nanoparticles.
Пример 6. Получение и характеристика наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, с покрытием.Example 6 Preparation and characterization of coated albumin nanoparticles filled with bevacizumab.
Включение бевацизумаба в наночастицы человеческого сывороточного альбумина, покрытые различными соединениями, было выполнено с использованием процедуры, состоящей из четырех этапов. В частности, были выбраны неионные НРМС-Р и PEG35 для оценки их способности к связыванию с наночастицами, наполненными бевацизумабом. Также использовали ионное покрытие Eudragit S-100.Incorporation of bevacizumab into human serum albumin nanoparticles coated with various compounds was performed using a four-step procedure. In particular, non-ionic HPMC-P and PEG35 were selected to evaluate their ability to bind to bevacizumab-filled nanoparticles. Eudragit S-100 ionic coating was also used.
Первый этап заключался в получении наночастиц в водной среде. После этого на наночастицы наносили покрытие путем простой инкубации в водной среде. Третий этап использовался для очистки полученных наночастиц, которые высушивали на заключительном этапе.The first stage was to obtain nanoparticles in an aqueous medium. Thereafter, the nanoparticles were coated by simple incubation in an aqueous medium. The third stage was used to purify the obtained nanoparticles, which were dried at the final stage.
Первый этап. 100 мг HSA и переменное количество бевацизумаба (1-20 мг) растворяли в 5-10 мл воды для инъекций, а затем раствор титровали до рН 4,1-4,4 с использованием 1 М HCl. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Наночастицы получали путем непрерывного добавления 16 мл этанола, используемого в качестве десольватирующего средства при постоянном перемешивании (500 об/мин) при комнатной температуре.First stage. 100 mg HSA and a variable amount of bevacizumab (1-20 mg) were dissolved in 5-10 ml water for injection, and then the solution was titrated to pH 4.1-4.4 using 1 M HCl. The mixture was incubated at room temperature for 10 minutes. Nanoparticles were obtained by continuous addition of 16 ml of ethanol used as a desolvatant with constant stirring (500 rpm) at room temperature.
Второй этап. Для нанесения покрытия на только что полученные наночастицы, наполненные бевацизумабом, добавляли одно из следующих соединений: PEG 35000, фталат гидроксиметалпропилцеллюлозы или Eudragit S-100.Second phase. To coat the newly obtained nanoparticles filled with bevacizumab, one of the following compounds was added: PEG 35000, hydroxymethylpropyl cellulose phthalate, or Eudragit S-100.
В качестве контроля наночастицы, наполненные бевацизумабом, стабилизировали путем сшивки с 12,5 мкг глутаральдегида в этаноле (300 мкл) в течение 5 минут, как описано выше.As a control, bevacizumab-loaded nanoparticles were stabilized by cross-linking with 12.5 μg of glutaraldehyde in ethanol (300 μl) for 5 minutes as described above.
Третий этап. Полученные наночастицы подвергали очистке. Использовали две различные процедуры - ультрацентрифугирование и ультрафильтрацию. В первом наночастицы очищали дважды путем центрифугирования при 21000 g в течение 20 минут при 4°С (Sigma 3K30, Остероде-ам-Харц, Германия) и повторного диспергирования микросфер в исходном объеме в воде. Во втором наночастицы очищали путем ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтрующий элемент с размером пор 50 кДа (Medica SPA, Италия).Third stage. The resulting nanoparticles were purified. Used two different procedures - ultracentrifugation and ultrafiltration. In the first, the nanoparticles were purified twice by centrifugation at 21,000 g for 20 minutes at 4°C (Sigma 3K30, Osterode am Harz, Germany) and redispersion of the microspheres in the original volume in water. In the second, the nanoparticles were purified by ultrafiltration through a polysulfone membrane filter element with a pore size of 50 kDa (Medica SPA, Italy).
Четвертый этап. На завершающем этапе наночастицы лиофилизировали в приборе Genesis 12EL (Virtis, штат Нью-Йорк, США). При использовании в качестве способа очистки ультрацентрифугирования микросферы после завершающего этапа центрифугирования диспергировали в 5% водном растворе сахарозы. При использовании ультрафильтрации микросферы также повторно диспергировали в 5% водном растворе сахарозы.Fourth stage. At the final stage, the nanoparticles were lyophilized in a Genesis 12EL device (Virtis, NY, USA). When used as a purification method by ultracentrifugation, the microspheres after the final centrifugation step were dispersed in a 5% aqueous sucrose solution. When using ultrafiltration, the microspheres were also redispersed in a 5% aqueous sucrose solution.
В сводной таблице 4 приведены основные физико-химические свойства этих наночастиц. В целом количество содержащегося бевацизумаба было во всех случаях аналогичным и близким к 14%. Тем не менее, при инкубации наночастиц, наполненных бевацизумабом, с различными вспомогательными веществами для нанесения покрытия получали наночастицы с измененными физико-химическими свойствами. Так, наночастицы, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35), демонстрировали средние размеры и отрицательный дзета-потенциал, аналогичный необработанным наночастицам, наполненным бевацизумабом (B-NP). Напротив, при инкубации В-NP с HPMC-P средний размер получаемых наночастиц значительно возрастал по сравнению с B-NP. При инкубации с ионным Eudragit® S-100 полученные наночастицы демонстрировали меньшие размеры и увеличенный отрицательный дзета-потенциал по сравнению с B-NP. С использованием СЭМ было установлено, что наночастицы альбумина имеют сферическую форму и гладкую поверхность.Table 4 summarizes the main physicochemical properties of these nanoparticles. In general, the amount of bevacizumab contained was similar in all cases and close to 14%. However, upon incubation of bevacizumab-filled nanoparticles with various coating auxiliaries, nanoparticles with altered physicochemical properties were obtained. Thus, bevacizumab-filled and PEG35-coated (B-NP-PEG35) nanoparticles exhibited medium sizes and a negative zeta potential similar to untreated bevacizumab-filled (B-NP) nanoparticles. On the contrary, when B-NP was incubated with HPMC-P, the average size of the resulting nanoparticles increased significantly compared to B-NP. When incubated with ionic Eudragit® S-100, the resulting nanoparticles showed smaller sizes and an increased negative zeta potential compared to B-NP. Using SEM, it was found that albumin nanoparticles have a spherical shape and a smooth surface.
Таблица 4. Физико-химические характеристики бевацизумаба, включенного в наночастицы альбумина с покрытием. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3). КП - коэффициент полидисперсности. Покровные вещества: S-100 (ионный Eudragit® SI00), НРМС-Р (фталат гидроксипропилметилцеллюлозы), PEG35 (полиэтиленгликоль 35000). Отношение СА / белок - отношение покровное вещество / альбумин. B-NP-GLU - наночастицы альбумина, сшитые с глутаральдегидом и наполненные бевацизумабом. B-NP - необработанные наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом.Table 4 Physicochemical characteristics of bevacizumab incorporated into coated albumin nanoparticles. Data are expressed as mean ± SD (n=3). KP - coefficient of polydispersity. Coating agents: S-100 (ionic Eudragit® SI00), HPMC-P (hydroxypropyl methylcellulose phthalate), PEG35 (polyethylene glycol 35000). SA/protein ratio - coating substance/albumin ratio. B-NP-GLU - albumin nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde and filled with bevacizumab. B-NP - raw albumin nanoparticles filled with bevacizumab.
Морфологическое исследование (фиг. 8) наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых PEG35 (B-NP-PEG35), показывает, что они имеют сферическую форму с неровной поверхностью и однородным распределением.Morphological examination (Fig. 8) of the nanoparticles filled with bevacizumab and coated with PEG35 (B-NP-PEG35) shows that they have a spherical shape with an uneven surface and a uniform distribution.
Пример 7. Высвобождение in vitro бевацизумаба из наночастиц с покрытием.Example 7 In Vitro Release of Bevacizumab from Coated Nanoparticles.
На фиг. 9 показан профиль высвобождения in vitro бевацизумаба из наночастиц альбумина, покрытых двумя неионными полимерами (PEG35 и НРМС-Р) и ионным Eudragit® SI00 в PBS при рН 7,4. Для наночастиц, покрытых PEG35 (B-NP-PEG35), профиль был аналогичен наблюдаемому для необработанных наночастиц (B-NP) с тем отличием, что в конце эксперимента количество высвобожденного бевацизумаба было выше, чем для B-NP. В любом случае эти пегилированные наночастицы обладали двухфазным профилем высвобождения, характеризующимся первоначальным взрывным эффектом в течение первых 5 минут - около 22%, за которым следовал более устойчивый и медленный этап высвобождения, продолжающийся по меньшей мере 24 ч. Взрывное высвобождение составляло около 22% и может быть связано с антителами, адсорбированными на поверхности наночастиц. Двухфазный процесс без учета первых 5 минут взрывного высвобождения был приведен с использованием уравнения Корсмейера - Пеппаса к профилю диффузии (n=0,54; R2=0,994). На этапе диффузии высвобождение бевацизумаба достигало плато на уровне 48% после первых двух часов.In FIG. 9 shows the in vitro release profile of bevacizumab from albumin nanoparticles coated with two non-ionic polymers (PEG35 and HPMC-P) and ionic Eudragit® SI00 in PBS at pH 7.4. For PEG35 coated nanoparticles (B-NP-PEG35), the profile was similar to that observed for untreated nanoparticles (B-NP) with the difference that at the end of the experiment the amount of bevacizumab released was higher than for B-NP. In any event, these PEGylated nanoparticles exhibited a biphasic release profile characterized by an initial burst during the first 5 minutes of about 22% followed by a more sustained and slower release step lasting at least 24 hours. The burst release was about 22% and may be associated with antibodies adsorbed on the surface of the nanoparticles. The biphasic process, ignoring the first 5 minutes of explosive release, was adjusted using the Korsmeier-Peppas equation to a diffusion profile (n=0.54; R2=0.994). During the diffusion phase, bevacizumab release plateaued at 48% after the first two hours.
Для наночастиц, покрытых НРМС-Р (B-NP-HPMC-P), количество бевацизумаба, высвобождающегося в течение первых 60 минут, составляло около 40%. После этого наблюдалась постоянная скорость высвобождения оставшихся антител. Тем не менее, в данном случае скорость высвобождения бевацизумаба была выше, чем для B-NP или B-NP-PEG35. Так что через 8 ч. инкубации из наночастиц, покрытых НРМС-Р, высвобождалось около 100% содержащегося в них бевацизумаба.For nanoparticles coated with HPMC-P (B-NP-HPMC-P), the amount of bevacizumab released during the first 60 minutes was about 40%. Thereafter, a constant rate of release of the remaining antibodies was observed. However, in this case, the release rate of bevacizumab was higher than for B-NP or B-NP-PEG35. So, after 8 hours of incubation, HPMC-R coated nanoparticles released about 100% of the bevacizumab contained in them.
В отличие от наночастиц с покрытием из неионных полимеров, наночастицы, покрытые Eudragit® S-100 (B-NP-S-100), продемонстрировали профиль немедленного высвобождения.Unlike non-ionic polymer coated nanoparticles, Eudragit® S-100 (B-NP-S-100) coated nanoparticles showed an immediate release profile.
Пример 8. Целостность бевацизумаба после включения в наночастицы альбумина.Example 8 Integrity of bevacizumab after incorporation into albumin nanoparticles.
Для подтверждения результатов, полученных с использованием набора ИФА при количественном определении содержания бевацизумаба в наночастицах альбумина, анализировали целостность антител (бевацизумаба), включенных в различные наночастицы, с использованием системы автоматизированного электрофореза на микрофлюидном чипе Experion™ (Bio Rad, США). Образцы оценивали в невосстанавливающих условиях и в восстанавливающих условиях с использованием 2-меркаптоэтанола. Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Experion System.To confirm the results obtained using the ELISA kit for quantitative determination of the content of bevacizumab in albumin nanoparticles, the integrity of antibodies (bevacizumab) included in various nanoparticles was analyzed using an automated electrophoresis system on a microfluidic chip Experion™ (Bio Rad, USA). Samples were evaluated under non-reducing conditions and under reducing conditions using 2-mercaptoethanol. The obtained data were processed using the Experion System software.
Наночастицы взвешивали и измельчали с 1 мл 0,005 Н NaOH. Концентрация различных растворов составляла около 400 нг белка/мкл (линейный динамический диапазон испытания - 5-2000 нг/мкл). В качестве контролей использовали образцы свободного белка (альбумина и бевацизумаба). Все эти образцы оценивали в полученном виде или после обработки β-меркаптоэтанолом и нагрева. Затем образцы обрабатывали в соответствии с протоколом набора для анализа Experion System Pro260 (Bio-Rad Lab., США). После загрузки образцов и контролей в чип их анализировали с использованием системы автоматизированного электрофореза Experion™ (Bio Rad, США).Nanoparticles were weighed and ground with 1 ml of 0.005 N NaOH. The concentration of various solutions was about 400 ng protein/µl (linear dynamic range of the test - 5-2000 ng/µl). Free protein samples (albumin and bevacizumab) were used as controls. All of these samples were evaluated as received or after treatment with β-mercaptoethanol and heating. The samples were then processed according to the protocol of the Experion System Pro260 assay kit (Bio-Rad Lab., USA). After loading the samples and controls into the chip, they were analyzed using the Experion™ automated electrophoresis system (Bio Rad, USA).
Результаты получали в виде денситометрических полос на смоделированном гель-электрофоретическом изображении. Каждая полоса соответствует отдельному образцу. Программное обеспечение Experion определяет различные пики размеров и выражает их в килодальтонах (кДа) на контрольной полосе системы.Results were obtained as densitometric bands on a simulated gel electrophoretic image. Each band corresponds to a separate sample. The Experion software identifies the various size peaks and expresses them in kilodaltons (kDa) on the system control band.
Результаты анализа показаны на фиг. 10. В дорожке 5 полоса бевацизумаба наиболее выражена в районе 150 кДа. Аналогичная полоса наблюдалась для дорожек 2 (B-NP) и 3 (B-NP-PEG35). Аналогичным образом в дорожках 1-3 также четко отображаются полосы, соответствующие альбумину (дорожка 4).The analysis results are shown in FIG. 10. In
Пример 9. Исследование биораспределения наночастиц, введенных через глаза крысам Вистар.Example 9 Study of biodistribution of nanoparticles administered through the eyes to Wistar rats.
Исследование биораспределения радиомеченых наночастиц у крыс Вистар для визуализации ОФЭКТ-КТ in vivo.Biodistribution study of radiolabeled nanoparticles in Wistar rats for in vivo SPECT-CT visualization.
Для радиомечения наночастиц использовали 99mTc путем восстановления 99mTc-пертехната хлоридом олова способом, описанным в других источниках. Если вкратце, 20 мкл раствора хлорида олова дигидрата в воде для инъекций с конечной концентрацией олова 0,02 мг/мл добавляли к 9 мг лиофилизированных наночастиц с последующим добавлением 60 мкл элюата 99mTcO4 к предварительно восстановленному олову. 4 мкл радиомеченой суспензии наночастиц (5 МБк) смешивали с 0,6 мг композиции немеченых наночастиц, полученную смесь осторожно вводили в правый глаз крысам Вистар, анестезированным изофлураном.Nanoparticles were radiolabeled with 99mTc by reduction of 99mTc-pertechnate with tin chloride in a manner described elsewhere. Briefly, 20 μl of a solution of stannous chloride dihydrate in water for injection with a final tin concentration of 0.02 mg/ml was added to 9 mg of lyophilized nanoparticles, followed by the addition of 60 μl of the 99mTcO4 eluate to the pre-reduced tin. 4 µl of a radiolabeled suspension of nanoparticles (5 MBq) was mixed with 0.6 mg of the composition of unlabeled nanoparticles, the resulting mixture was carefully injected into the right eye of Wistar rats anesthetized with isoflurane.
Офтальмологическое введение крысам Вистар для визуализации ОФЭКТ-КТ in vivo.Ophthalmic administration to Wistar rats for in vivo SPECT-CT imaging.
Животных анестезировали в течение одного часа во избежание активного удаления суспензии из глаза, затем пробуждали и снимали изображения ОФЭКТ-КТ в шести различных временных точках от 5 ч. до 17 ч. 30 мин. с момента введения наночастиц.Animals were anesthetized for one hour to avoid active removal of the suspension from the eye, then awakened and SPECT-CT images were taken at six different time points from 05:00 to 17:30. since the introduction of nanoparticles.
При визуализирующих исследованиях животных анестезировали перед каждым исследованием изофлураном и помещали в положение лежа на животе в систему ОФЭКТ-КТ Symbia Т2 Truepoint (Siemens). Изображения получали с использованием матрицы 128×128, 7 изображений/с; КТ использовали с параметрами 110 мАс и 130 кВ, 130 изображений толщиной 3 мм. Слияние изображений выполняли с использованием программного обеспечения Syngo MI Applications TrueD. Изображения обрабатывали и количественно оценивали с использованием встроенного программного комплекса. Количественные значения получали путем автоматического построения изоконтура в трех плоскостях для выбранных зон с получением исследуемых объемных областей (VOI), для которых определяли средние значения количеств.For imaging studies, animals were anesthetized prior to each study with isoflurane and placed in the prone position on a Symbia T2 Truepoint SPECT-CT system (Siemens). Images were obtained using a matrix of 128×128, 7 images/s; CT was used at 110 mAs and 130 kV, 130
На фиг. 11 и 12 показано биораспределение B-NP и B-NP-PEG35 после введения в глаза в виде глазных капель. Радиоактивность, связанная с наночастицами, сохранялась в глазу на протяжении по меньшей мере 4 ч. в случае B-NP и 8 ч. в случае B-NP-PEG35, хотя она медленно исчезала из места введения, перемещаясь в желудочно-кишечный тракт. Перемещение радиомеченых наночастиц через глотку животного наблюдается на крайнем верхнем слева изображении на фиг. 11. Интенсивность изображений ОФЭКТ на фиг. 11 была приведена к максимальной интенсивности каждого отдельного изображения для повышения точности оценки положения радиоактивности в организме животного.In FIG. 11 and 12 show the biodistribution of B-NP and B-NP-PEG35 after administration to the eye as eye drops. The radioactivity associated with the nanoparticles persisted in the eye for at least 4 hours for B-NP and 8 hours for B-NP-PEG35, although it slowly disappeared from the injection site, moving into the gastrointestinal tract. The movement of radiolabeled nanoparticles through the pharynx of the animal is observed in the upper leftmost image in FIG. 11. Intensity of SPECT images in FIG. 11 was adjusted to the maximum intensity of each individual image in order to improve the accuracy of estimating the position of radioactivity in the animal body.
Полуколичественная оценка радиоактивности с течением времени с поправкой на затухание показана в графическом виде на фиг. 12 для B-NP. Результаты для B-NP-PEG35 были очень схожими, но выведение указанных частиц происходило дольше, поскольку они больше времени остаются в глазу.A semi-quantitative assessment of radioactivity over time, corrected for attenuation, is shown graphically in FIG. 12 for B-NP. The results for B-NP-PEG35 were very similar, but the elimination of these particles took longer because they remain in the eye longer.
Пример 10. Биораспределение наночастиц после внутривенного введения самцам крыс ВистарExample 10. Biodistribution of nanoparticles after intravenous administration to male Wistar rats
Для визуализирующих экспериментов по биораспределению in vivo крысам Вистар вводили меченые 99mTc наночастицы HSA, наполненные бевацизумабом (B-NP), и наночастицы HSA, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35). Вводили внутривенно однократную дозу 5 мг бевацизумаба / кг веса тела и снимали изображения раз в два часа на протяжении до десяти часов с момента введения.For in vivo biodistribution imaging experiments, Wistar rats were injected with 99mTc labeled HSA nanoparticles loaded with bevacizumab (B-NP) and HSA nanoparticles filled with bevacizumab and coated with PEG35 (B-NP-PEG35). A single dose of 5 mg bevacizumab/kg body weight was administered intravenously and images were taken every two hours for up to ten hours from the time of administration.
Через 1 час после внутривенного введения радиоактивность, связанная с инъекцией B-NP и B-NP-PEG35, наблюдалась в печени и почках, как показано на фиг. 13. Кроме того, следует отметить, что B-NP-PEG35 в меньшей степени поглощается печенью. B-NP и В- NP-PEG35 не накапливаются ни в каких органах.1 hour after intravenous administration, radioactivity associated with injection of B-NP and B-NP-PEG35 was observed in the liver and kidneys, as shown in FIG. 13. In addition, it should be noted that B-NP-PEG35 is less absorbed by the liver. B-NP and B-NP-PEG35 do not accumulate in any organs.
Пример 11. Влияние наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, на неоваскуляризации) роговицы.Example 11 Effect of bevacizumab-filled albumin nanoparticles on corneal neovascularization.
Самцы крыс Вистар весом приблизительно 200 г были получены из компании Harlan для анализа эффективности наночастиц, наполненных бевацизумабом, в крысиной модели неоваскуляризации роговицы. Исследования были одобрены этическим комитетом организации в области исследований на животных (протокол за номером 172-14) в соответствии с европейским законодательством по экспериментам на животных.Male Wistar rats weighing approximately 200 g were obtained from Harlan to analyze the efficacy of bevacizumab-loaded nanoparticles in a rat model of corneal neovascularization. The studies were approved by the ethics committee of the organization in the field of animal research (protocol number 172-14) in accordance with European legislation on animal experiments.
Животных поддерживали в состоянии седации после внутрибрюшинного введения 100 мкл раствора 5 мг/кг ксилазина (Xilagesic, Calier Laboratory) и 200 мкл раствора 40 мг/кг кетамина (IMALGENE, Merial). Затем в каждый глаз крыс вводили одну каплю мидриатических глазных капель (Coliricusi Tropicamida, 10 мг/мл, Alcon). Через 5 минут роговицы крыс прижигали, прикладывая ляписный карандаш (Argepenal, Braun) к поверхности глаз на 5 секунд. И наконец, глаза промывали стерильным раствором NaCl 0,9% по объему.Animals were maintained sedated after intraperitoneal administration of 100 μl of a 5 mg/kg xylazine solution (Xilagesic, Calier Laboratory) and 200 μl of a 40 mg/kg ketamine solution (IMALGENE, Merial). Then, one drop of mydriatic eye drops (Coliricusi Tropicamida, 10 mg/ml, Alcon) was injected into each eye of the rats. After 5 minutes, the corneas of the rats were cauterized by applying a lapis pencil (Argepenal, Braun) to the surface of the eyes for 5 seconds. Finally, the eyes were washed with sterile 0.9% by volume NaCl solution.
Через двенадцать часов животных анестезировали изофлураном (Isovet, Испания) и разделяли на отдельные группы. В глаза животных вводили следующие лекарственные препараты в виде глазных капель: (i) 10 мкл водного раствора 4 мг/мл бевацизумаба (Авастина®) раз в 12 часов в течение 7 суток, (ii) 10 мкл водного раствора 4 мг/мл афлиберцепта (Эйлеа®) раз в 12 часов в течение 7 суток, (iii) 10 мкл водного раствора 0,1% дексаметазонфосфата (Coliriculi dexametasona®) раз в 12 часов в течение 7 суток, (iv) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (B-NP; 10 мкл суспензии, содержащей 40 мкг бевацизумаба) раз в сутки в течение одной недели, (v) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35; 10 мкл суспензии, содержащей 40 мкг бевацизумаба) раз в сутки в течение 1 недели. В качестве контролей одной группе животных вводили физиологический раствор (PBS), а другой группе животных вводили человеческий сывороточный альбумин, растворенный в PBS (HSA), в количестве, аналогичном вводимому с B-NP-PEG35.Twelve hours later, the animals were anesthetized with isoflurane (Isovet, Spain) and divided into separate groups. The following drugs were administered to the eyes of the animals in the form of eye drops: (i) 10 µl of an aqueous solution of 4 mg/ml of bevacizumab (Avastin®) every 12 hours for 7 days, (ii) 10 µl of an aqueous solution of 4 mg/ml of aflibercept ( Eilea®) every 12 hours for 7 days, (iii) 10 µl of an aqueous solution of 0.1% dexamethasone phosphate (Coliriculi dexametasona®) every 12 hours for 7 days, (iv) albumin nanoparticles filled with bevacizumab (B-NP ; 10 µl suspension containing 40 µg bevacizumab) once a day for one week, (v) albumin nanoparticles filled with bevacizumab and coated with PEG35 (B-NP-PEG35; 10 µl suspension containing 40 µg bevacizumab) once a day for 1 week. As controls, one group of animals was injected with saline (PBS), and the other group of animals was injected with human serum albumin dissolved in PBS (HSA), in an amount similar to that administered with B-NP-PEG35.
На фиг. 14 приведено схематическое представление плана-графика, на котором показано прижигание роговицы в 14 ч. (0-е сутки) и первое лечение через 24 ч. (1-е сутки).In FIG. 14 is a schematic representation of the schedule showing corneal cauterization at 2 pm (day 0) and the
Для расчетов получали цифровые изображения роговиц, которые анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ (общедоступное ПО, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Изображения анализировали в двоичном режиме с переводом в черно-белый формат. По этим изображениям определяли общую площадь роговицы, а также поверхность роговицы, пораженной ожогом нитратом серебра (очаг поражения), и рассчитывали площадь с наблюдаемым образованием новых сосудов (неоваскуляризацией роговицы) путем подсчета пикселей. По этим параметрам определяли площадь инвазии (IA) и CNV (неоваскуляризации роговицы, нормализованной по площади очага поражения):For calculations, digital images of the corneas were obtained and analyzed using ImageJ software (public domain, http://rsb.info.nih.gov/ij/). The images were analyzed in binary mode with conversion to black and white. From these images, the total area of the cornea as well as the surface of the cornea affected by the silver nitrate burn (lesion) was determined, and the area with observed neovascularization (corneal neovascularization) was calculated by counting the pixels. These parameters were used to determine the area of invasion (IA) and CNV (neovascularization of the cornea, normalized by the area of the lesion):
В сводной таблице 5 приведена эффективность различных лекарственных композиций бевацизумаба в виде результата сокращения площади поверхности глаза, пораженной неоваскуляризацией, вызванной очагом поражения (фиг. 15). Во всех случаях очаг поражения в глазах животных был аналогичным, статистически значимые различия по площади очага поражения между четырьмя группами не выявлены (р>0,05; фиг. 16).Summary Table 5 summarizes the efficacy of various bevacizumab formulations as a result of the reduction in ocular surface area affected by lesion-induced neovascularization (FIG. 15). In all cases, the lesion in the eyes of the animals was similar, no statistically significant differences in the area of the lesion were found between the four groups (p>0.05; Fig. 16).
Группа животных, получавших лечение раствором бевацизумаба (BEVA), показала более низкую площадь поражения глаза неоваскуляризацией по сравнению с животными, получавшими PBS (отрицательный контроль). С другой стороны, у животных, получавших лечение наночастицами, наполненными бевацизумабом (B-NP), площадь поражения глаза неоваскуляризацией роговицы была в 2,7 раза ниже, чем у животных, получавших лечение Авастином® (BEVA) (фиг. 17 и 18). При лечении животных пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом, площадь поражения неоваскуляризацией была приблизительно в 1,4 раза ниже, чем у животных, получавших лечение Авастином®. Важно отметить, что животные, получавшие лечение наночастицами, получали на 50% меньше бевацизумаба по сравнению с животными, получавшими лечение Авастином®. Еще одно важное наблюдение заключалось в том, что при выбранных условиях эксперимента ни дексаметазон, ни Эйлеа® не продемонстрировали положительного влияния на неоваскуляризацию (таблица 9, фиг. 15).The group of animals treated with bevacizumab solution (BEVA) showed a lower area of neovascularization of the eye compared to animals treated with PBS (negative control). On the other hand, in animals treated with bevacizumab (B-NP) nanoparticles, the area affected by corneal neovascularization was 2.7 times lower than in animals treated with Avastin® (BEVA) (Figs. 17 and 18) . When animals were treated with PEGylated nanoparticles filled with bevacizumab, the area affected by neovascularization was approximately 1.4 times lower than in animals treated with Avastin®. Importantly, nanoparticle-treated animals received 50% less bevacizumab compared to Avastin®-treated animals. Another important observation was that under the chosen experimental conditions, neither dexamethasone nor Eylea® showed a positive effect on neovascularization (Table 9, Fig. 15).
Таблица 5. Влияние композиций бевацизумаба на неоваскуляризацию роговицы, вызванную ожогом ляписным карандашом. BEVA - раствор бевацизумаба (Авастин® 4 мг/мл, две дозы в сутки в течение 7 суток); B-NP - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (4 мг/мл, одна доза в сутки в течение 7 суток); B-NP-PEG35 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (4 мг/мл, одна доза в сутки в течение 7 суток); HSA - человеческий сывороточный альбумин; дексаметазон- 0,1% раствор два раза в сутки в течение 7 суток; Эйлеа - раствор афлиберцепта (Эйлеа® 4 мг/мл, две дозы в сутки в течение 7 суток); контроль - PBS. IA - площадь инвазии. CNV - площадь неоваскуляризации роговицы, нормализованная по площади очага поражения. Данные выражены в виде среднего значения ± СО, n=9.Table 5. Effect of bevacizumab compositions on corneal neovascularization caused by pencil burn. BEVA - bevacizumab solution (
b р < 0,05 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)b p < 0.05 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from control (-)
с р <0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)p <0.01 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from control (-)
d р < 0,005 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)d p < 0.005 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from control (-)
е р < 0,001 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)e p < 0.001 - results of analysis of variance using Tukey's test significantly differ from control (-)
Гистология.Histology.
Для гистологического исследования глаз с неоваскуляризацией роговицы в конце лечения удаляли по два глаза из каждой группы. Поверхность глаза промывали физиологическим раствором и отделяли передний полюс от заднего. Роговицы укладывали на ровную поверхность, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 24 ч., а затем каждый образец несколько раз промывали PBS. Роговицы сохраняли в 70% метаноле для последующих срезов и анализа.For histological examination of eyes with corneal neovascularization at the end of treatment, two eyes were removed from each group. The surface of the eye was washed with saline and the anterior pole was separated from the posterior one. The corneas were laid on a flat surface, fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then each sample was washed several times with PBS. The corneas were stored in 70% methanol for subsequent sections and analysis.
Для анализа роговиц их включали в парафин и выполняли срезы толщиной 4 мкм от центра роговицы и зоны неоваскуляризации. Затем их окрашивали гематоксилином-эозином и анализировали с использованием оптической микроскопии. При оценке срезов оценивали интенсивность неоваскуляризации, интенсивность воспаления, фиброз, отек и среднюю толщину роговицы. Исследование выполнял исследователь с маскированием по группам лечения. Изображения снимали под микроскопом Nikon Eclipse Ci, оснащенным цифровой камерой Nikon DS-Ri 1. Изображения анализировали с использованием калиброванной системы анализа цифровых изображений Nikon NIS-elements.For analysis of the corneas, they were embedded in paraffin and sections were made 4 μm thick from the center of the cornea and the zone of neovascularization. They were then stained with hematoxylin-eosin and analyzed using optical microscopy. When evaluating sections, the intensity of neovascularization, the intensity of inflammation, fibrosis, edema, and the average thickness of the cornea were assessed. The study was performed by an investigator with treatment masking. Images were taken under a Nikon Eclipse Ci microscope equipped with a Nikon DS-
Для оценки интенсивности неоваскуляризации использовали следующую шкалу: 0 - отсутствие неоваскуляризации; 1 - минимальная или близкая к отсутствующей васкуляризация; 2 - легкая васкуляризация; 3 - ограниченная или очаговая васкуляризация в субэпителиальной и престромальной областях (умеренная неоваскуляризация); 4 - очень частая или интенсивная; 5 - диффузная и интенсивная васкуляризация. Интенсивность воспаления оценивали аналогичным образом: 0 - отсутствие воспаления; 1 - минимальное или близкое к отсутствующему воспаление; 2 - очаговое воспаление, низкое количество воспалительных клеток смешанного типа, таких как лимфоциты, нейтрофильные лейкоциты и эозинофильные лейкоциты; 3 - умеренное воспаление; 4 - очень частое или интенсивное; 5 - интенсивное, диффузное воспаление, воспалительные клетки смешанного типа. Для оценки активности фибробластов использовали следующую шкалу: 0 - отсутствие активности фибробластов; 1 - минимальная или близкая к отсутствующей активность фибробластов; 2 - очаговая активность фибробластов; 3 - умеренная активность фибробластов; 4 - очень частая; 5 - диффузная и интенсивная активность фибробластов. И наконец, для классификации отека использовали следующую шкалу: 0 - отсутствие отека; 1 - минимальный или близкий к отсутствующему отек; 2 - легкий отек; 3 - умеренный отек; 4 - очень частый или интенсивный; 5 - диффузный и интенсивный отек.To assess the intensity of neovascularization, the following scale was used: 0 - no neovascularization; 1 - minimal or close to absent vascularization; 2 - easy vascularization; 3 - limited or focal vascularization in the subepithelial and prestromal areas (moderate neovascularization); 4 - very frequent or intense; 5 - diffuse and intense vascularization. The intensity of inflammation was assessed in a similar way: 0 - no inflammation; 1 - minimal or close to absent inflammation; 2 - focal inflammation, low number of mixed inflammatory cells, such as lymphocytes, neutrophilic leukocytes and eosinophilic leukocytes; 3 - moderate inflammation; 4 - very frequent or intense; 5 - intense, diffuse inflammation, inflammatory cells of mixed type. To assess the activity of fibroblasts, the following scale was used: 0 - no activity of fibroblasts; 1 - minimal or close to absent fibroblast activity; 2 - focal activity of fibroblasts; 3 - moderate activity of fibroblasts; 4 - very frequent; 5 - diffuse and intense activity of fibroblasts. Finally, the following scale was used to classify edema: 0, no edema; 1 - minimal or close to absent edema; 2 - mild edema; 3 - moderate swelling; 4 - very frequent or intense; 5 - diffuse and intense edema.
На фиг. 19 показаны гистологические исследования глаз животных, включенных в исследование. Очаги поражения роговиц, для лечения которых применяли B-NP (фиг. 19В) и B-NP-PEG35 (фиг. 19С), находятся в фазе восстановления и не вызывают временное нарушение зрения, как на начальном этапе. Таким образом, повреждение является обратимым. Напротив, очаги поражения роговиц, для лечения которых применяли физиологический раствор, очень серьезно нарушают зрение и представляются необратимыми (фиг. 19F).In FIG. 19 shows histological examinations of the eyes of the animals included in the study. Corneal lesions treated with B-NP (FIG. 19B) and B-NP-PEG35 (FIG. 19C) are in the recovery phase and do not cause temporary visual impairment as they did initially. Thus, the damage is reversible. In contrast, corneal lesions treated with saline very seriously impair vision and appear to be irreversible (FIG. 19F).
В сводной таблице 6 приведены гистопатологические оценки в различных группах. Роговицы, для лечения которых применяли физиологический раствор, показали толщину в 1,4 раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли бевацизумаб, и в 2,7 раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли B-NP. С другой стороны, роговицы, для лечения которых применяли Авастин® (BEVA), показали толщину в два раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли B-NP, и в 1,3 раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли B-NP-PEG35. Аналогичным образом роговицы, для лечения которых применяли B-NP, продемонстрировали улучшение симптомов с низкой степенью фиброза, низкой васкуляризацией и отсутствием отеков.Summary Table 6 shows the histopathological scores in the different groups. Corneas treated with saline showed a thickness 1.4 times that of corneas treated with bevacizumab and 2.7 times the thickness of corneas treated with B-NP. On the other hand, corneas treated with Avastin® (BEVA) were twice as thick as B-NP treated corneas and 1.3 times thicker than B-NP treated corneas. -PEG35. Similarly, corneas treated with B-NP showed improved symptoms with low fibrosis, low vascularity, and no edema.
Таблица 6. Гистопатологические оценки образцов из глаз животных. Контроль - животные, получавшие лечение физиологическим раствором; BEVA - животные, получавшие лечение Авастином®; B-NP - животные, получавшие лечение наночастицами, наполненными бевацизумабом; B-NP-PEG35 - животные, получавшие лечение пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом.Table 6. Histopathological evaluations of animal eye specimens. Control - animals treated with saline; BEVA - animals treated with Avastin®; B-NP - animals treated with nanoparticles filled with bevacizumab; B-NP-PEG35 - Animals treated with PEGylated nanoparticles filled with bevacizumab.
Пример 12. Биораспределение наночастиц после внутривенного введения опухоленесущим безтимусным мышам.Example 12. Biodistribution of nanoparticles after intravenous administration to tumor-bearing athymic mice.
Для опытов по визуализации опухоли на мышах клетки гепатокарциномы человека (HepG2) культивировали при стандартных условиях, собирали через одну неделю после посева и суспендировали в PBS. Опухоли индуцировали у безтимусных мышей путем подкожного введения 5×105 клеток HepG2 в двух различных местах - в правую конечность и верхнюю часть спины. Рост опухоли контролировали в течение 12-15 суток, пока она не становилась четко видна, затем животных использовали для опытов с визуализацией ОФЭКТ-КТ in vivo после внутривенного введения 99mTc-меченых наночастиц HSA, покрытых PEG35 (NP-PEG35). Через 1 и 4 часа после в/в введения животных умерщвляли и иссекали обе опухоли и часть мышечной ткани контралатеральной ноги (без опухоли). Образцы использовали для подсчета на гамма-счетчике, калиброванном по 99mTc, вносили поправку на массу образца и затухание и рассчитывали отношение опухоль / нормальная ткань с использованием мышечной ткани контралатеральной ноги в качестве основы.For tumor imaging experiments in mice, human hepatocarcinoma (HepG2) cells were cultured under standard conditions, harvested one week after seeding, and suspended in PBS. Tumors were induced in athymic mice by subcutaneous injection of 5x105 HepG2 cells at two different sites, the right limb and upper back. Tumor growth was monitored for 12-15 days until it was clearly visible, then the animals were used for in vivo SPECT-CT imaging experiments after intravenous injection of 99mTc-labeled HSA nanoparticles coated with PEG35 (NP-PEG35). Animals were sacrificed 1 and 4 hours after i.v. administration, and both tumors and part of the muscle tissue of the contralateral leg (without tumor) were excised. The samples were counted on a gamma counter calibrated at 99mTc, corrected for sample weight and attenuation, and the tumor/normal tissue ratio was calculated using the muscle tissue of the contralateral leg as a basis.
У опухоленесущих мышей радиоактивность, связанная с внутривенно введенными NP-PEG35, сконцентрирована в опухолях (по сравнению с нормальной тканью), как видно на фиг. 20. Такое явление представляется зависимым от времени, поскольку через 4 ч. с момента введения наночастиц количество в опухолях снизилось, хотя и оставалось высоким (отношение опухоль / нормальная ткань >6).In tumor bearing mice, the radioactivity associated with intravenously administered NP-PEG35 is concentrated in the tumors (compared to normal tissue) as seen in FIG. 20. This phenomenon seems to be time-dependent, since 4 hours after the administration of the nanoparticles, the amount in the tumors decreased, although it remained high (tumor/normal tissue ratio >6).
Пример 13. Влияние наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, на мышиной модели колоректального рака.Example 13 Effect of bevacizumab-loaded albumin nanoparticles on a mouse model of colorectal cancer.
Исследования были одобрены этическим комитетом организации в области исследований на животных (протокол за номером 107-16) в соответствии с европейским законодательством по экспериментам на животных. Для опытов у компании Harlan Sprague Dawley, Inc. были приобретены сорок два самца безтимусных мышей весом около 20 граммов и возрастом 3 недели. Мышей содержали в контролируемых условиях в соответствии с правилами организации. Корм и воду давали без ограничений.The studies were approved by the ethics committee of the organization in the field of animal research (protocol number 107-16) in accordance with European legislation on animal experiments. For experiments at Harlan Sprague Dawley, Inc. Forty-two male athymic mice weighing about 20 grams and 3 weeks old were purchased. Mice were kept under controlled conditions in accordance with the rules of the organization. Food and water were provided without restrictions.
Клетки рака толстой кишки человека (НТ-29) культивировали при стандартных условиях, собирали через неделю после посева и суспендировали в PBS. Для индукции опухоли мышей анестезировали изофлураном путем ингаляции и подкожно вводили 100 мкл суспензии, содержащей 2-3×106 опухолевых клеток НТ-29 (клеточная линия рака толстой кишки человека, чувствительная к бевацизумабу), в правый бок каждого животного. Рост опухоли контролировали в течение 12-15 суток, пока она не становилась четко видна (диаметр 0,4-0,6 см), после чего начинали лечение.Human colon cancer cells (HT-29) were cultured under standard conditions, harvested one week after seeding, and suspended in PBS. For tumor induction, mice were anesthetized with isoflurane by inhalation, and 100 µl of a suspension containing 2-3×106 HT-29 tumor cells (bevacizumab sensitive human colon cancer cell line) was injected subcutaneously into the right flank of each animal. Tumor growth was monitored for 12-15 days until it became clearly visible (diameter 0.4-0.6 cm), after which treatment was started.
Мышей рандомизировали в шесть групп по семь особей в каждой: (i) водный раствор бевацизумаба (Авастина), (ii) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (B-NP), (iii) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35,000 (B-NP-PEG35), (iv) физиологический раствор (PBS), (v) пустые наночастицы, покрытые PEG 35000 (NP-PEG35) в количестве, аналогичном вводимому с B-NP-PEG35, (vi) водный раствор HSA, содержащий количество альбумина, аналогичное вводимому в группе, получавшей B-NP. Во всех случаях два раза в неделю внутривенно вводили 150-200 мкл препаратов, содержащих 5 мг бевацизумаба / кг веса. Контрольная группа в тех же временных точках получала внутривенное введение 0,9% физиологического раствора.Mice were randomized into six groups of seven each: (i) bevacizumab aqueous solution (Avastin), (ii) bevacizumab-loaded albumin nanoparticles (B-NP), (iii) bevacizumab-filled albumin nanoparticles coated with PEG35,000 (B -NP-PEG35), (iv) saline (PBS), (v) blank nanoparticles coated with PEG 35000 (NP-PEG35) in an amount similar to that administered with B-NP-PEG35, (vi) an aqueous HSA solution containing an amount albumin, similar to that administered in the group treated with B-NP. In all cases, 150-200 μl of preparations containing 5 mg of bevacizumab/kg of body weight were administered intravenously twice a week. The control group received intravenous administration of 0.9% saline at the same time points.
На 0-е сутки (до первого введения), 15-е сутки, 22-е сутки и 26-е сутки с момента первого введения отбирали образцы крови. Для измерения концентрации бевацизумаба в сыворотке использовали специфический иммуноферментный анализ (Shikari Q-Beva).On the 0th day (before the first injection), the 15th day, the 22nd day and the 26th day from the moment of the first injection, blood samples were taken. A specific enzyme immunoassay (Shikari Q-Beva) was used to measure the serum concentration of bevacizumab.
Объем и вес опухолей регистрировали 1-2 раза в неделю. Для опухолей (V) штангенциркулем измеряли два размера: ширину (W) и длину (L) - и выполняли расчет объема по следующей формуле (ур. 5):The volume and weight of tumors were recorded 1-2 times a week. For tumors (V), two dimensions were measured with a caliper: width (W) and length (L) - and the volume was calculated using the following formula (Eq. 5):
На фиг. 21 показана зависимость объема опухоли от времени. В каждой группе развились опухоли одинакового размера, статистически значимые различия между объемом опухолей между шестью группами в начале опыта не выявлены (р>0,05).In FIG. 21 shows the tumor volume as a function of time. Tumors of the same size developed in each group, no statistically significant differences between the volume of tumors between the six groups at the beginning of the experiment were found (p>0.05).
На 12-е сутки группа, получавшая B-NP-PEG35, показала значимое снижение объема опухоли (р<0,05) по сравнению с остальными группами. К 14-м суткам группы, получавшие BEVA и B-NP-PEG35, показали значимое снижение объема опухоли (р<0,05) по сравнению с остальными группами. На 22-е сутки группы, не получавшие лечения, показали повышенный объем опухоли по сравнению с особями, получавшими лечение наночастицами, наполненными бевацизумабом (B-NP), бевацизумабом (BEVA) и пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом (B-NP-PEG35). Следует отметить, что к концу опыта у половины животных в группе, не получавшей бевацизумаб, развились язвы в местах опухолей.On day 12, the group treated with B-NP-PEG35 showed a significant reduction in tumor volume (p<0.05) compared to the other groups. By day 14, the groups treated with BEVA and B-NP-PEG35 showed a significant reduction in tumor volume (p<0.05) compared to the rest of the groups. On
На фиг. 22 показаны уровни бевацизумаба в сыворотке. Образцы отбирали в следующие сутки: 0-е (перед введением), 15-е, 22-е и 26-е с момента первого введения. Следует отметить повышение уровней бевацизумаба в сыворотке на 22-е сутки, которые соответствуют следующим суткам после еженедельного введения. На фиг. 22 видно, что уровни бевацизумаба в сыворотке мышей, получавших несвязанный препарат, до шести раз превышают уровни у получавших наночастицы (B-NP и B-NP-PEG35).In FIG. 22 shows serum levels of bevacizumab. Samples were taken on the following days: 0 (before injection), 15, 22, and 26 after the first injection. Of note is an increase in serum levels of bevacizumab on
Польза введения бевацизумаба, включенного в наночастицы, заключается в более низких уровнях бевацизумаба в сыворотке. После внутривенного введения несвязанного бевацизумаба возникает высокая концентрация в крови, что может привести к побочным действиям. Эта концентрация постепенно снижается до достижения плато. Тем не менее, после введения новой дозы концентрация бевацизумаба в крови повышается (см. фиг. 22), таким образом увеличивая вероятность побочных действий.The benefit of administering bevacizumab incorporated into nanoparticles is lower serum levels of bevacizumab. After intravenous administration of unbound bevacizumab, high concentrations in the blood occur, which can lead to side effects. This concentration gradually decreases until a plateau is reached. However, after the introduction of a new dose, the concentration of bevacizumab in the blood increases (see Fig. 22), thus increasing the likelihood of side effects.
С другой стороны, после внутривенного введения наночастиц бевацизумаба уровни препарата в сыворотке постепенно повышаются до достижения плато. Эта концентрация в шесть раз ниже достигаемой при введении несвязанного бевацизумаба и остается постоянной. Кроме того, каждый раз при введении новой дозы пиковая концентрация бевацизумаба в крови намного ниже. Это снижает вероятность побочных действий.On the other hand, after intravenous administration of bevacizumab nanoparticles, serum levels of the drug gradually increase until a plateau is reached. This concentration is six times lower than achieved with the introduction of unbound bevacizumab and remains constant. In addition, each time a new dose is administered, the peak blood concentration of bevacizumab is much lower. This reduces the chance of side effects.
Кроме того, полиэтиленгликоль образует стерический барьер на поверхности наночастиц, предотвращая опсонизацию, которая представляет собой основной механизм потери введенной дозы в течение нескольких часов после в/в введения.In addition, polyethylene glycol forms a steric barrier on the surface of the nanoparticles, preventing opsonization, which is the main mechanism for losing the administered dose within a few hours after IV administration.
ПЭТ-визуализация.PET imaging.
В конце опыта из групп, получавших лечение бевацизумабом, пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом, и физиологическим раствором, отбирали по три мыши для визуализации 18F-ФДГ-ПЭТ. Для этого мышей не кормили на ночь, но давали пить воду без ограничений. Через сутки мышей анестезировали изофлураном 2% в 100% газообразном O2 и фиксировали в неподвижном состоянии для процедуры 18F-ФДГ-ПЭТ. За сорок минут до сканирования в хвостовую вену вводили 18F-ФДГ (10 МБк ± 2 в 80-100 мкл). ПЭТ-визуализацию выполняли на специальном томографе для мелких животных Philips Mosaic (Кливленд, штат Огайо) с разрешением 2 мм, осевым полем зрения (FOV) 11,9 см и поперечным FOV 12,8 см. Анестезированных мышей помещали в горизонтальном положении на стол ПЭТ-сканера для получения статического изображения (синограммы) в течение 15 минут. Изображения реконструировали с использованием трехмерного алгоритма RAMLA (истинная трехмерная реконструкция) с двумя итерациями и параметром релаксациии 0,024 в матрицу 128×128 с размером вокселя 1 мм и с учетом поправок на время нечувствительности, затухание, случайные совпадения и рассеяние. Для оценки поглощения 18F-ФДГ опухолью все исследования экспортировали и анализировал с использованием программного обеспечения PMOD (PMOD Technologies Ltd., Адлисвиль, Швейцария). Области исследования (regions of interest, ROI) строили на фронтальных изображениях ПЭТ для мелких животных толщиной 1 мм на последовательных срезах, включая опухоль в целом. И наконец, для каждой опухоли рассчитывали максимальное стандартизированное значение поглощения (SUV) по формуле:At the end of the experiment, three mice were selected for 18F-FDG-PET imaging from the groups treated with bevacizumab, pegylated nanoparticles filled with bevacizumab, and saline. For this, mice were not fed at night, but were allowed to drink water without restrictions. One day later, mice were anesthetized with 2% isoflurane in 100% O2 gas and immobilized for the 18F-FDG-PET procedure. Forty minutes before the scan, 18F-FDG (10 MBq ± 2 in 80-100 µl) was injected into the tail vein. PET imaging was performed on a dedicated small animal scanner Philips Mosaic (Cleveland, Ohio) with a resolution of 2 mm, an axial field of view (FOV) of 11.9 cm, and a transverse FOV of 12.8 cm. Anesthetized mice were placed in a horizontal position on the PET table -scanner to obtain a static image (sinogram) within 15 minutes. The images were reconstructed using a 3D RAMLA (true 3D reconstruction) algorithm with two iterations and a relaxation parameter of 0.024 into a 128×128 matrix with a 1 mm voxel size and corrected for dead time, attenuation, random coincidences and scattering. To evaluate tumor uptake of 18F-FDG, all studies were exported and analyzed using PMOD software (PMOD Technologies Ltd., Adliswil, Switzerland). Regions of interest (ROI) were built on frontal PET images for small animals with a thickness of 1 mm on consecutive sections, including the tumor as a whole. Finally, the Maximum Standardized Uptake Value (SUV) was calculated for each tumor using the formula:
В сводной таблице 7 приведены результаты ПЭТ-визуализации в различных группах. В отношении SUVmax (максимальное поглощение опухолью) самое низкое значение соответствовало группе, получавшей лечение B-NP-PEG35, тогда как самое высокое соответствовало группе, получавшей физиологический раствор.Summary Table 7 shows the results of PET imaging in different groups. With respect to SUVmax (maximum tumor uptake), the lowest value was in the B-NP-PEG35 treated group, while the highest was in the saline treated group.
В отношении объема самые низкие значения принадлежали группам, получавшим лечение B-NP-PEG35 и HSA. Тем не менее, особи, отобранные из группы HSA, не были представительными, поскольку они были единственными, у которых отсутствовали язвы. Самое высокое значение снова было зарегистрировано в группе, которая не получала лечения (физиологический раствор). Группа B-NP-PEG35 показала объем в три раза меньше, чем в группе физиологического раствора, и в 1,5 раза меньше, чем в группе BEVA.In terms of volume, the lowest values belonged to the groups treated with B-NP-PEG35 and HSA. However, the individuals selected from the HSA group were not representative as they were the only ones that did not have ulcers. The highest value was again recorded in the group that received no treatment (saline). The B-NP-PEG35 group showed three times less volume than the saline group and 1.5 times less than the BEVA group.
И наконец, для TLG (общий гликолиз очага) было зафиксировано наименьшее значение для группы, получавшей лечение B-NP-PEG35, которое было в 1,5 раза меньше, чем в группе лечения BEVA, и до 3,5 раз меньше, чем в группе, получавшей физиологический раствор.Finally, for TLG (total focal glycolysis), the lowest value was recorded for the B-NP-PEG35 treated group, which was 1.5 times less than in the BEVA group and up to 3.5 times less than in the BEVA group. group receiving saline.
Пример 14. Получение наночастиц человеческого сывороточного альбумина, наполненных ранибизумабом.Example 14 Preparation of human serum albumin nanoparticles filled with ranibizumab.
Наночастицы HSA, наполненные ранибизумабом, получали с использованием той же процедуры, которая описана в примере 1 для наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом.Ranibizumab-loaded HSA nanoparticles were prepared using the same procedure as described in Example 1 for bevacizumab-loaded albumin nanoparticles.
Для наночастиц, наполненных ранибизумабом, оптимальное отношение антитела / альбумин составляло 0,15. Наночастицы с ранибизумабом показали размер частиц около 210 нм при КП ниже 0,3 и дзета-потенциале - 15 мВ.For nanoparticles filled with ranibizumab, the optimal antibody/albumin ratio was 0.15. The nanoparticles with ranibizumab showed a particle size of about 210 nm with an EC below 0.3 and a zeta potential of 15 mV.
Claims (34)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17382383 | 2017-06-21 | ||
EP17382383.2 | 2017-06-21 | ||
PCT/EP2018/066639 WO2018234489A1 (en) | 2017-06-21 | 2018-06-21 | Albumin nanoparticles for the treatment of cancer and ocular diseases |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020101917A RU2020101917A (en) | 2021-07-21 |
RU2020101917A3 RU2020101917A3 (en) | 2021-09-30 |
RU2797114C2 true RU2797114C2 (en) | 2023-05-31 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013042125A2 (en) * | 2011-09-21 | 2013-03-28 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Nano delivery systems |
WO2014153087A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | President And Fellows Of Harvard College | Nanoparticle-based compositions |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013042125A2 (en) * | 2011-09-21 | 2013-03-28 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Nano delivery systems |
WO2014153087A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | President And Fellows Of Harvard College | Nanoparticle-based compositions |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
VARSHOCHIAN R et al. The protective effect of albumin on bevacizumab activity and stability in PLGA nanoparticles intended for retinal and choroidal neovascularization treatments. Eur J Pharm Sci, 2013, 50(3-4):341-5. * |
WANG G et al. Preparation of BMP-2 Containing Bovine Serum Albumin (BSA) Nanoparticles Stabilized by Polymer Coating. Pharm Res., 2008, 25(12):2896-909. LI CH et al. Direct comparison of two albumin-based paclitaxel-loaded nanoparticle formulations: is the crosslinked version more advantageous? Int J Pharm, 2014, 468(1-2):15-25. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7217247B2 (en) | polymer protein microparticles | |
US20060260777A1 (en) | Surface-modified microparticles and methods of forming and using the same | |
CN104602713A (en) | Methods and compositions for preparing a silk microsphere | |
CN105960232B (en) | The nanometer of hydrophilic active compounds is encapsulated | |
KR20110056042A (en) | Nano particles for tumor-targeting and processes for the preparation thereof | |
CN108366968A (en) | Manufacture the composition and method of protein microbeads | |
Esim et al. | Albumin-based nanoparticles as promising drug delivery systems for cancer treatment | |
Aljabali et al. | Protein-based nanomaterials: a new tool for targeted drug delivery | |
CN115243722A (en) | Systems and pharmaceutical compositions for therapy by direct injection of target cell populations | |
CN111032022B (en) | Albumin nanoparticles for the treatment of cancer and ocular diseases | |
Jiang et al. | Hyaluronic acid-based nanoparticles to deliver drugs to the ocular posterior segment | |
Ghaemi et al. | Targeted Nano-Delivery of Flutamide with polymeric and lipid nanoparticles | |
RU2797114C2 (en) | Nanoparticle and pharmaceutical composition for treatment of eye diseases or cancer | |
CN114099469A (en) | Composite nano-drug carrier and preparation method and application thereof | |
CN111467473A (en) | Polypeptide HM-3 nano-particles and preparation method thereof | |
Chashoo et al. | Nanoparticle based drug delivery system: milestone for cancer therapy | |
CN118512417A (en) | Targeting type traditional Chinese medicine in-situ tumor vaccine and preparation method and application thereof |