RU2796104C1 - Application of peptide compound for apoptosis induction in a tumor cell - Google Patents
Application of peptide compound for apoptosis induction in a tumor cell Download PDFInfo
- Publication number
- RU2796104C1 RU2796104C1 RU2022124530A RU2022124530A RU2796104C1 RU 2796104 C1 RU2796104 C1 RU 2796104C1 RU 2022124530 A RU2022124530 A RU 2022124530A RU 2022124530 A RU2022124530 A RU 2022124530A RU 2796104 C1 RU2796104 C1 RU 2796104C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bax
- cathepsin
- pep1
- cells
- bcl
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, и может быть использовано в качестве терапевтического средства для лечения заболеваний, связанных с нарушенной экспрессией катепсина S и/или белками семейства BCL-2.The invention relates to the pharmaceutical industry and can be used as a therapeutic agent for the treatment of diseases associated with impaired expression of cathepsin S and/or proteins of the BCL-2 family.
Уровень техникиState of the art
Три аспекта отличают опухоли человека различных типов и этиологии от нормальных клеток: способность к более быстрой пролиферации, уклонение от подавления клеточного роста и повышенная чувствительность к цитотоксической терапии [Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar 4; 144(5): 646-74. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013. PMID: 21376230]. Кроме того, два очень важных процесса дают опухолевым клеткам преимущество в выживании. Во-первых, клетки проявляют химиотерапевтическую устойчивость к запрограммированному процессу гибели клеток, называемому апоптозом, и, во-вторых, такие клетки развивают уникальное свойство повышенной подвижности, что способствует их распространению во время метастазирования [Norouzi S, Gorgi Valokala М, Mosaffa F, Zirak MR, Zamani P, Behravan J. Crosstalk in cancer resistance and metastasis. Crit Rev Oncol Hematol. 2018 Dec; 132:145-153. doi: 10.1016/j.critrevonc.2018.09.017. Epub 2018 Oct 4. PMID: 30447920; Steeg PS. Targeting metastasis. Nat Rev Cancer. 2016 Apr; 16(4):201-18. doi: 10.1038/nrc.2016.25. PMID: 27009393; PMCID: РМС7055530]. Центральное место в быстрой пролиферации раковых клеток занимает убиквитин-зависимый протеасомный путь и его потребность в таких ключевых клеточных процессах, как регуляция клеточного цикла, клеточная дифференцировка и апоптоз. Так, влияние на протеасомы с целью ингибирования быстрой пролиферации раковых клеток ранее уже рассматривалось в качестве терапевтической стратегии. Важное значение здесь имеет эффект блокирования протеасомной деградации убиквитинированных проапоптотических белков и, по-видимому, усиления апоптоза раковых клеток, предположительно за счет их накопления, как это видно на примере проапоптотического белка ВАХ [Li В, Dou QP. Box degradation by the ubiquitin/proteasome-dependent pathway: involvement in tumor survival and progression. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Apr 11; 97(8):3850-5. doi: 10.1073/pnas.070047997. PMID: 10725400; PMCID: РМС18105]. Несмотря на то, что точные механизмы протеолитического распада убиквитинированного белка ВАХ недостаточно исследованы, они могут представлять альтернативную стратегию терапевтического действия при раке.Three aspects distinguish human tumors of various types and etiologies from normal cells: the ability to proliferate more rapidly, evasion of cell growth suppression, and increased sensitivity to cytotoxic therapy [Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. cell. 2011 Mar 4; 144(5): 646-74. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013. PMID: 21376230]. In addition, two very important processes give tumor cells a survival advantage. Firstly, cells exhibit chemotherapeutic resistance to a programmed cell death process called apoptosis, and secondly, such cells develop a unique property of increased motility, which contributes to their spread during metastasis [Norouzi S, Gorgi Valokala M, Mosaffa F, Zirak MR, Zamani P, Behravan J. Crosstalk in cancer resistance and metastasis. Crit Rev Oncol Hematol. Dec 2018; 132:145-153. doi: 10.1016/j.critrevonc.2018.09.017. Epub 2018 Oct 4. PMID: 30447920; Steeg PS. Targeting metastasis. Nat Rev Cancer. 2016 Apr; 16(4):201-18. doi: 10.1038/nrc.2016.25. PMID: 27009393; PMCID: PMC7055530]. Central to the rapid proliferation of cancer cells is the ubiquitin-dependent proteasome pathway and its requirement for key cellular processes such as cell cycle regulation, cell differentiation, and apoptosis. Thus, the effect on proteasomes to inhibit the rapid proliferation of cancer cells has previously been considered as a therapeutic strategy. Important here is the effect of blocking the proteasomal degradation of ubiquitinated proapoptotic proteins and, apparently, enhancing the apoptosis of cancer cells, presumably due to their accumulation, as seen in the example of the proapoptotic BAX protein [Li B, Dou QP. Box degradation by the ubiquitin/proteasome-dependent pathway: involvement in tumor survival and progression. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Apr 11; 97(8):3850-5. doi: 10.1073/pnas.070047997. PMID: 10725400; PMCID: PMC18105]. Although the exact mechanisms of proteolytic degradation of the ubiquitinated BAX protein are not well understood, they may represent an alternative therapeutic strategy in cancer.
Одной из групп внутриклеточных протеиназ, которые отвечают за регулирование гибели и метастазирования опухолевых клеток, являются лизосомальные цистеиновые катепсины, которые относятся к суперсемейству папаин-подобных протеиназ [Turk V, St oka V, Vasiljeva О, Renko M, Sun T, Turk В, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan; 1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208; Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11; 12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Soond SM, Kozhevnikova MV, Zamyatnin AA Jr. 'Patchiness' and basic cancer research: unravelling the proteases. Cell Cycle. 2019 Aug; 18(15): 1687-1701. doi: 10.1080/15384101.2019.1632639. Epub 2019 Jun 24. PMID: 31213124; PMCID: РМС6649598]. Хотя они обычно экспрессируются и находятся в лизосомах, в начале заболевания или из-за ряда сигналов, связанных с началом заболевания, некоторые из этих катепсинов секретируются во внеклеточный матрикс (extracellular matrix, ЕСМ) [Rozhin J, Sameni M, Ziegler G, Sloane BF. Pericellular pH affects distribution and secretion of cathepsin В in malignant cells. Cancer Res. 1994 Dec 15; 54(24):6517-25. PMID: 7987851; Kramer L, Turk D, Turk B. The Future of Cysteine Cathepsins in Disease Management. Trends Pharmacol Sci. 2017 Oct; 38(10):873-898. doi: 10.1016/j.tips.2017.06.003. Epub 2017 Jun 28. PMID: 28668224; Reiser J, Adair B, Reinheckel T. Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease. J Clin Invest. 2010 Oct; 120(10):3421-31. doi: 10.1172/JCI42918. Epub 2010 Oct 1. PMID: 20921628; PMCID: PMC2947230], где они могут беспрепятственно расщеплять компоненты ЕСМ и, таким образом, способствовать росту опухолевых клеток и их распространению. Одной из таких протеиназ является катепсин S, который может быть подходящим кандидатом для таргетной терапии [Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11; 12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Rudzinska M, ParodiA, Soond SM, Vinarov AZ, Korolev DO, Morozov AO, Daglioglu C, Tutar Y, Zamyatnin AA Jr. The Role of Cysteine Cathepsins in Cancer Progression and Drug Resistance. Int J Mol Sci. 2019 Jul 23; 20(14):3602. doi: 10.3390/ijms20143602. PMID: 31340550; PMCID: РМС6678516]. Хотя экспрессия катепсина S в тканях относительно ограничена, было отмечено, что он экспрессируется под действием ряда физиологических условий, связанных с гипоксией в месте опухоли или в условиях химиотерапевтического воздействия. Следовательно, он может проявлять свою активность в качестве индуцибельного фактора, который, в частности, способствует развитию опухоли и, возможно, устойчивости к химиотерапии (Soond, S.M.; Savvateeva, L.V.; Makarov, V.A.; Gorokhovets, N.V.; Townsend, P.A.; Zamyatnin, A.A., Jr. Cathepsin S Cleaves BAX as a Novel and Therapeutically Important Regulatory Mechanism for Apoptosis. Pharmaceutics 2021, 13, 339). Кроме того, было обнаружено, что экспрессия катепсина S вносит вклад в развитие сердечно-сосудистых заболеваний атеросклеротического генеза [Wu Н, Du Q, Dai Q, Ge J, Cheng X. Cysteine Protease Cathepsins in Atherosclerotic Cardiovascular Diseases. J Atheroscler Thromb. 2018 Feb 1; 25(2):111-123. doi: 10.5551/jat.RV17016. Epub 2017 Oct 5. PMID: 28978867; PMCID: РМС5827079], а также участвует в деградации белков во время опосредованной МНС-II презентации опухолевого антигена и дифференцировки опухолевых макрофагов М1-М2 [Yang M, Liu J, Shao J, Qin Y, Ji Q, Zhang X, Du J. Cathepsin S-mediated autophagic flux in tumor-associated macrophages accelerate tumor development by promoting M2 polarization. Mol Cancer. 2014 Mar 2; 13:43. doi: 10.1186/1476-4598-13-43. PMID: 24580730; PMCID: PMC4015740], что только подчеркивает разнообразную активность катепсина S при различных нормальных и патологических состояниях [Honey K, Rudensky AY. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat Rev Immunol. 2003 Jun; 3(6):472-82. doi: 10.1038/nri1110. PMID: 12776207].One of the groups of intracellular proteinases that are responsible for regulating the death and metastasis of tumor cells are lysosomal cysteine cathepsins, which belong to the superfamily of papain-like proteinases [Turk V, St oka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. Jan 2012; 1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208; Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11; 12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Soond SM, Kozhevnikova MV, Zamyatnin AA Jr. 'Patchiness' and basic cancer research: unraveling the proteases. cell cycle. 2019 Aug; 18(15): 1687-1701. doi: 10.1080/15384101.2019.1632639. Epub 2019 Jun 24. PMID: 31213124; PMCID: PMC6649598]. Although they are usually expressed and located in lysosomes, at the onset of the disease or due to a number of signals associated with the onset of the disease, some of these cathepsins are secreted into the extracellular matrix (extracellular matrix, ECM) [Rozhin J, Sameni M, Ziegler G, Sloane BF . Pericellular pH affects distribution and secretion of cathepsin B in malignant cells. Cancer Res. 1994 Dec 15; 54(24):6517-25. PMID: 7987851; Kramer L, Turk D, Turk B. The Future of Cysteine Cathepsins in Disease Management. Trends Pharmacol Sci. 2017 Oct; 38(10):873-898. doi: 10.1016/j.tips.2017.06.003. Epub 2017 Jun 28. PMID: 28668224; Reiser J, Adair B, Reinheckel T. Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease. J Clin Invest. 2010 Oct; 120(10):3421-31. doi: 10.1172/JCI42918. Epub 2010 Oct 1. PMID: 20921628; PMCID: PMC2947230], where they can easily cleave ECM components and thus promote tumor cell growth and spread. One such proteinase is cathepsin S, which may be a suitable candidate for targeted therapy [Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11; 12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Rudzinska M, ParodiA, Soond SM, Vinarov AZ, Korolev DO, Morozov AO, Daglioglu C, Tutar Y, Zamyatnin AA Jr. The Role of Cysteine Cathepsins in Cancer Progression and Drug Resistance. Int J Mol Sci. 2019 Jul 23; 20(14):3602. doi: 10.3390/ijms20143602. PMID: 31340550; PMCID: PMC6678516]. Although the expression of cathepsin S in tissues is relatively limited, it has been noted that it is expressed under the influence of a number of physiological conditions associated with hypoxia at the site of the tumor or under conditions of chemotherapeutic exposure. Therefore, it can show its activity as an inducible factor, which, in particular, promotes tumor development and, possibly, resistance to chemotherapy (Soond, S.M.; Savvateeva, L.V.; Makarov, V.A.; Gorokhovets, N.V.; Townsend, P.A.; Zamyatnin, A.A., Jr. Cathepsin S Cleaves BAX as a Novel and Therapeutically Important Regulatory Mechanism for Apoptosis Pharmaceutics 2021, 13, 339). In addition, it was found that the expression of cathepsin S contributes to the development of cardiovascular diseases of atherosclerotic origin [Wu H, Du Q, Dai Q, Ge J, Cheng X. Cysteine Protease Cathepsins in Atherosclerotic Cardiovascular Diseases. J Atheroscler Thromb. 2018
Из уровня техники известны цитотоксические средства, в частности, Таксол и его терапевтические аналоги [Wang LG, Liu ХМ, Kreis W, Budman DR. The effect of antimicrotubule agents on signal transduction pathways of apoptosis: a review. Cancer Chemother Pharmacol. 1999; 44(5):355-61. doi: 10.1007/s002800050989. PMID: 10501907; Weaver BA. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 2014 Sep 15; 25(18):2677-81. doi: 10.1091/mbc.E14-04-0916. PMID: 25213191; PMCID: PMC4161504; Martins I, Raza SQ, Voisin L, Dakhli H, Allouch A, Law F, Sabino D, De Jong D, Thoreau M, Mintet E, Dugue D, Piacentini M, Gougeon ML, Jaulin F, Bertrand P, Brenner C, Ojcius DM, Kroemer G, Modjtahedi N, Deutsch E, Perfettini JL. Anticancer chemotherapy and radiotherapy trigger both non-cell-autonomous and cell-autonomous death. Cell Death Dis. 2018 Jun 18; 9(7):716. doi: 10.1038/s41419-018-0747-y. PMID: 29915308; PMCID: PMC6006149], которые действуют путем ингибирования деполимеризации тубулина и таким образом вызывают остановку цикла ряда быстро пролиферирующих раковых клеток и последующую гибель клеток путем апоптоза. Однако некоторые клетки могут проявлять устойчивость к вызывающим гибель свойствам таких соединений, и эта устойчивость обычно связана с поздними стадиями рака, которые обладают повышенной способностью к метастазированию опухоли [Einzig AI, Gorowski Е, Sasloff J, Wiernik PH. Phase II trial of taxol in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Invest. 1991;9(2): 133-6. doi: 10.3109/07357909109044223. PMID: 1677827; Sangrajrang S, Fellous A. Taxol resistance. Chemotherapy. 2000 Sep-Oct; 46(5):327-34. doi: 10.1159/000007306. PMID: 10965098].The prior art known cytotoxic agents, in particular, Taxol and its therapeutic analogues [Wang LG, Liu XM, Kreis W, Budman DR. The effect of antimicrotubule agents on signal transduction pathways of apoptosis: a review. Cancer Chemother Pharmacol. 1999; 44(5):355-61. doi: 10.1007/s002800050989. PMID: 10501907; Weaver BA. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 2014
Для поиска потенциальных катепсин-специфических антагонистов, которые могут быть особенно перспективными для лечения рака, определяют различные пептидные последовательности, на основе которых возможна разработка терапевтических средств [Rudzinska М, Parodi A, Maslova VD, Efremov YM, Gorokhovets NV, Makarov VA, Popkov VA, Golovin AV, Zernii EY, Zamyatnin AA. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers (Basel). 2020 May 21; 12(5):1310. doi: 10.3390/cancers12051310. PMID: 32455715; PMCID: PMC7281206, Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11; 12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: РМС6630828]. В целом, с учетом последних достижений в определении сайтов расщепления субстрата с использованием скрининга пептидных библиотек, появилась более четкая картина механизмов регуляции ингибиторами специфичности и степени взаимодействия катепсин-субстрат. Так, недавно описаны синтетические пептиды (производные фторметилкетонов или хлорметилкетонов тетрапептидов структуры R1-pept-R2, где РЕРТ - одна из аминокислотных последовательностей: PLVE, VLPE; R1 - одна из защитных групп: ацетильная (Ас), бензилоксикарбонильная (Z) или отсутствует; R2 - производные фторметилкетона (FMK) или хлорметилкетона (CMK)), обладающие высокой аффинностью к каталитической триаде цистеиновых катепсинов и способностью специфически ингибировать протеолитическую активность цистеиновых катепсинов [Rudzinska, М.; Parodi, A.; Maslova, V.D.; Efremov, Y.M.; Gorokhovets, N.V.; Makarov, V.A.; Popkov, V.A.; Golovin, A.V.; Zernii, E.Y.; Zamyatnin, A.A. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers 2020, 12 (5), 1310].To search for potential cathepsin-specific antagonists that may be particularly promising for cancer treatment, various peptide sequences are determined, on the basis of which the development of therapeutic agents is possible [Rudzinska M, Parodi A, Maslova VD, Efremov YM, Gorokhovets NV, Makarov VA, Popkov VA , Golovin AV, Zernii EY, Zamyatnin AA. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers (Basel). 2020 May 21; 12(5):1310. doi: 10.3390/cancers12051310. PMID: 32455715; PMCID: PMC7281206, Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11; 12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828]. In general, taking into account recent advances in the determination of substrate cleavage sites using screening of peptide libraries, a clearer picture of the mechanisms of regulation of specificity and degree of cathepsin-substrate interaction by inhibitors has emerged. Thus, synthetic peptides have recently been described (derivatives of fluoromethyl ketones or chloromethyl ketones of tetrapeptides of the structure R1-pept-R2, where PEPT is one of the amino acid sequences: PLVE, VLPE; R1 is one of the protective groups: acetyl (Ac), benzyloxycarbonyl (Z) or absent; R2 - derivatives of fluoromethyl ketone (FMK) or chloromethyl ketone (CMK)), which have a high affinity for the catalytic triad of cysteine cathepsins and the ability to specifically inhibit the proteolytic activity of cysteine cathepsins [Rudzinska, M.; Parodi, A.; Maslova, V.D.; Efremov, Y.M.; Gorokhovets, N.V.; Makarov, V.A.; Popkov, V.A.; Golovin, A. V.; Zernii, E.Y.; Zamyatnin, A.A. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers 2020, 12(5), 1310].
Катепсины играют взаимоисключающую роль в развитии, так катепсин S опосредует дифференцировку ассоциированных с опухолью макрофагов M1-М2, в то время как катепсин С требуется для дифференцировки нейтрофилов, индуцированной опухолью N1-N2 [Yang М, Liu J, Shao J, Qin Y, Ji Q, Zhang X, Du J. Cathepsin S-mediated autophagic flux in tumor-associated macrophages accelerate tumor development by promoting M2 polarization. Mol Cancer. 2014 Mar 2; 13:43. doi: 10.1186/1476-4598-13-43. PMID: 24580730; PMCID: РМС4015740]. Следовательно, нацеливание на конкретные субстраты с целью блокирования их способности воздействовать на катепсины может представлять альтернативный подход.Cathepsins play a mutually exclusive role in development, as cathepsin S mediates differentiation of tumor-associated M1-M2 macrophages, while cathepsin C is required for tumor-induced N1-N2 differentiation of neutrophils [Yang M, Liu J, Shao J, Qin Y, Ji Q, Zhang X, Du J. Cathepsin S-mediated autophagic flux in tumor-associated macrophages accelerate tumor development by promoting M2 polarization. Mol Cancer. 2014
Наиболее близкими к заявляемому пептиду являются «ВН-3 миметики» [Merino D, Kelly GL, Lessene G, Wei AH, Roberts A W, Strasser A. ВН3-Mimetic Drugs: Blazing the Trail for New Cancer Medicines. Cancer Cell. 2018 Dec 10; 34(6):879-891. doi: 10.1016/j.ccell.2018.11.004. PMID: 30537511; Walensky LD. Targeting BAX to drug death directly. Nat Chem Biol. 2019 Jul; 15(7):657-665. doi: 10.1038/s41589-019-0306-6. Epub 2019 Jun 17. PMID: 31209350], где пептидные терапевтические антагонисты определяются из белковых областей взаимодействия между проапоптотическими и антиапоптотическими ВН3-домен-содержащими белками. Например, терапевтический агент АВТ-199 нарушает ингибирующую активность Вс1-2 с белком ВАХ для лечения лейкоза, тем самым позволяя ВАХ олигомеризоваться и индуцировать проницаемость митохондриальной внешней мембраны (МОМР) и гибель клеток через активацию внутреннего пути апоптоза [Souers AJ, Lever son JD, Boghaert ER, Adder SL, Catron ND, Chen J, Dayton BD, Ding H, Enschede SH, Fairbrother WJ, Huang DC, Hymowitz SG, Jin S, Khaw SL, Kovar PJ, Lam LT, Lee J, Maecker HL, Marsh KC, Mason KD, Mitten MJ, Nimmer PM, Oleksijew A, Park CH, Park CM, Phillips DC, Roberts AW, Sampath D, Seymour JF, Smith ML, Sullivan GM, Tahir SK, Tse C, Wendt MD, Xiao Y, Xue JC, Zhang H, Humerickhouse RA, Rosenberg SH, Elmore SW. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 2013 Feb; 19(2):202-8. doi: 10.1038/nm.3048. Epub 2013 Jan 6. PMID: 23291630].Closest to the claimed peptide are "BH-3 mimetics" [Merino D, Kelly GL, Lessene G, Wei AH, Roberts A W, Strasser A. BH3-Mimetic Drugs: Blazing the Trail for New Cancer Medicines. cancer cell. 2018
Однако ABT-199 как селективный ингибитор BCL-2 является доказанно эффективным только в отношении гематологических злокачественных опухолей, тогда как ингибирование определенных катепсинов, расщепляющих проапоптотические белки, например, ВАХ, могут индуцировать гибель злокачественных клеток различного типа и с наибольшим эффектом.However, ABT-199 as a selective inhibitor of BCL-2 is proven effective only against hematological malignant tumors, while inhibition of certain cathepsins that cleave proapoptotic proteins, such as BAX, can induce the death of malignant cells of various types and with the greatest effect.
В последнее время возник большой интерес к идентификации катепсинов, способных расщеплять и дезактивировать проапоптотические ВН3-белки, с целью выявления тех ферментов, на которые можно будет терапевтически воздействовать. Некоторые катепсины могут расщеплять цитоплазматические -ВАХ, -BID, -Bcl-xl и -Mcl-xl [Cao X, Deng X, May WS. Cleavage of Box to p18 Box accelerates stress-induced apoptosis, and a cathepsin-like protease may rapidly degrade p18 Box. Blood. 2003 Oct 1; 102(7):2605-14. doi: 10.1182/blood-2003-01-0211. Epub 2003 Jun 19. PMID: 12816867; Appelqvist H, Johansson AC, Linderoth E, Johansson U, Antonsson B, Steinfeld R, Kagedal K, Ollinger K. Lysosome-mediated apoptosis is associated with cathepsin D-specific processing of bid at Phe24, Trp48, and Phe183. Ann Clin Lab Sci. 2012 Summer; 42(3):231-42. PMID: 22964611; Cirman T, Oresic K, Mazovec GD, Turk V, ReedJC, Myers RM, Salvesen GS, Turk В. Selective disruption oflysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. J Biol Chem. 2004 Jan 30; 279(5):3578-87. doi: 10.1074/jbc.M308347200. Epub 2003 Oct 27. PMID: 14581476; Cirman T, Mazovec GD, Turk V, ReedJC, Myers RM, Salvesen GS, Turk B. Selective disruption oflysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. J Biol Chem. 2004 Jan 30; 279(5):3578-87. doi: 10.1074/jbc.M308347200. Epub 2003 Oct 27. PMID: 14581476]. Поэтому необходимо обеспечить стабилизацию проапоптотических ВН3-белков (таких как ВАХ) посредством ингибирования катепсина, позволяя этим ВН3-белкам вызывать апоптоз в отсутствие ингибирующего действия антиапоптотических ВН3-белков (таких как Bcl-xl). Как правило для этого может потребоваться разработка, по крайней мере, двух различных терапевтических средств, где первый агент должен быть нацелен на катепсин (что позволяет стабилизировать ВАХ), второй - на ВАХ (или Bcl-2/Bcl-xl), тем самым нарушая их ингибирующее взаимодействие и позволяя преобладать проапоптотической активности ВАХ. Хотя этот подход действительно имеет хороший потенциал для индивидуального нацеливания белок-связывающих партнеров, недостатки заключаются в том, что такой подход потребует значительного количества времени для определения эффективности отдельных терапевтических средств и того, насколько эффективным может быть каждый из них при совместном действии. Следовательно, необходимо изучить альтернативные стратегии для разработки схемы, в которой может быть осуществлено нацеливание не только на катепсин, но и его производные проапоптотические субстраты (путем отделения его от антиапоптотического регулятора), которые в совокупности являются важными посредниками в гибели раковых клеток через апоптоз.Recently, there has been great interest in the identification of cathepsins capable of cleaving and inactivating proapoptotic BH3 proteins in order to identify those enzymes that can be therapeutically affected. Some cathepsins can cleave cytoplasmic -BAX, -BID, -Bcl-xl and -Mcl-xl [Cao X, Deng X, May WS. Cleavage of Box to p18 Box accelerates stress-induced apoptosis, and a cathepsin-like protease may rapidly degrade p18 Box. Blood. 2003
Технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является поиск пептидной последовательности, способной индуцировать апоптоз в опухолевой клетке, а также ингибировать функциональную (протеолитическую) активность катепсина S, с перспективой использования в разработке противоопухолевых терапевтических средств.The technical problem to be solved by the invention is the search for a peptide sequence capable of inducing apoptosis in a tumor cell, as well as inhibiting the functional (proteolytic) activity of cathepsin S, with the prospect of using it in the development of antitumor therapeutic agents.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Техническим результатом изобретения является подавление активности катепсина S и индуцирование апоптоза за счет ингибирования взаимодействия ингибиторного белка Bcl-xl (или Bcl-2) с ВАХ, стабилизирования мономерного ВАХ, а также ингибирования катепсин S-опосредованный протеолиз полиубиквитинированного производного ВАХ (р120ВАХ).The technical result of the invention is the suppression of the activity of cathepsin S and the induction of apoptosis by inhibiting the interaction of the inhibitory protein Bcl-xl (or Bcl-2) with VAC, stabilizing the monomeric VAC, and also inhibiting cathepsin S-mediated proteolysis of the polyubiquitinated derivative of VAC (p120VAC).
Технический результат достигается при применении специфического пептидного соединения, содержащего последовательность FFSFGGAL, выбранную из проапоптотических ВН3-домен-содержащих белков, характеризующегося способностью индуцировать апоптоз в опухолевой клетке.The technical result is achieved by using a specific peptide compound containing the FFSFGGAL sequence selected from proapoptotic BH3-domain-containing proteins, characterized by the ability to induce apoptosis in a tumor cell.
Изобретение также включает фармацевтическую композицию для индукции апоптоза в опухолевой клетке, содержащую указанное пептидное соединение и фармацевтически приемлемый носитель.The invention also includes a pharmaceutical composition for inducing apoptosis in a tumor cell, containing said peptide compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
Данное соединение может воздействовать не только на катепсин S, но и на его последующий проапоптотический/антиапоптотический белковый комплекс-мишень, т.е. является единым терапевтическим агентом, обладающим двойной специфичностью. Главное преимущество такого агента состоит в том, что он обладает способностью специфически воздействовать на более чем один белковый промежуточный продукт как часть главного регуляторного белкового комплекса, специфичного для пути передачи сигналов, имеющего ключевое значение для развития и прогрессирования рака.This compound can act not only on cathepsin S, but also on its subsequent pro-apoptotic/anti-apoptotic target protein complex, i.e. is a single therapeutic agent with dual specificity. The main advantage of such an agent is that it has the ability to specifically target more than one protein intermediate as part of a major regulatory protein complex specific for a signaling pathway that is key to cancer development and progression.
Частный вариант пептида, являющийся производным от Pit2 и имеющий последовательность FFSFGGAL (далее CS-PEP1), а также пептидное производное последовательности ВН3-домен-содержащего белка подходят для любого терапевтического применения, которое включает действие катепсина S (или других катепсинов), проапоптотические белки, содержащие ВН3-домен, или антиапоптотические белки, содержащие ВН3-домен, ответственные за регуляцию апоптоза (Фиг. 1).A particular peptide variant derived from Pit2 and having the sequence FFSFGGAL (hereinafter CS-PEP1), as well as a peptide derivative of the BH3 domain-containing protein sequence, are suitable for any therapeutic application that includes the action of cathepsin S (or other cathepsins), pro-apoptotic proteins, containing the BH3 domain, or anti-apoptotic proteins containing the BH3 domain, responsible for the regulation of apoptosis (Fig. 1).
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Изобретение поясняется иллюстрациями, гдеThe invention is illustrated by illustrations, where
на Фиг. 1 представлена схема ингибирующего действия заявляемого пептида (желтый круг). LMP - проницаемость лизосомальной мембраны; МОМР - проницаемость наружной мембраны митохондрий;in FIG. 1 shows a diagram of the inhibitory action of the proposed peptide (yellow circle). LMP - lysosomal membrane permeability; MOMP - permeability of the outer membrane of mitochondria;
на Фиг. 2 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что катепсин S опосредует расщепление ВАХ in vitro и в клетках млекопитающих;in FIG. 2 presents experimental data demonstrating that cathepsin S mediates BAX cleavage in vitro and in mammalian cells;
на Фиг. 3 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-РЕР1 ингибирует опосредованное катепсином S расщепление ВАХ in vitro;in FIG. 3 shows experimental data demonstrating that CS-PEP1 inhibits cathepsin S-mediated BAX cleavage in vitro;
на Фиг. 4 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-РЕР1 ингибирует расщепление Bcl-xl, но дестабилизирует его in vitro и в клетках млекопитающих;in FIG. 4 shows experimental data demonstrating that CS-PEP1 inhibits Bcl-xl cleavage but destabilizes it in vitro and in mammalian cells;
на Фиг. 5 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-РЕР1 стабилизирует белок ВАХ при экспрессии катепсина S;in FIG. 5 shows experimental data demonstrating that CS-PEP1 stabilizes the BAX protein when cathepsin S is expressed;
на Фиг. 6 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-РЕР1 стабилизирует уровень эндогенного белка ВАХ в т.ч. в присутствии экспрессии катепсина S;in FIG. Figure 6 presents experimental data demonstrating that CS-PEP1 stabilizes the level of endogenous BAX protein, incl. in the presence of cathepsin S expression;
на Фиг. 7 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что обработка клеток CS-PEP1 ингибирует опосредованное катепсином S расщепление полиубиквитинированного производного р120ВАХ ВАХ;in FIG. 7 shows experimental data demonstrating that treatment of cells with CS-PEP1 inhibits cathepsin S-mediated cleavage of the polyubiquitinated p120BAX BAX derivative;
на Фиг. 8 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-РЕР1 вызывает апоптоз и активацию каспазы-3.in FIG. 8 shows experimental data demonstrating that CS-PEP1 induces apoptosis and caspase-3 activation.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Ниже представлено более детальное описание реализации заявляемого изобретения, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.Below is a more detailed description of the implementation of the claimed invention, which does not limit the scope of the claims of the claimed invention, but demonstrates the possibility of carrying out the invention with the achievement of the claimed technical result.
Исходно было определено, что проапоптотический белок ВАХ и антиапоптотический белок Bcl-xl являются субстратами для катепсина S. Катепсины также могут регулироваться белками-ингибиторами (цистатинами) человека, которые предотвращают чрезмерную активацию нежелательной протеолитической активности катепсинов [Turk V, Stoka V, Vasiljeva О, Renko М, Sun Т, Turk В, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan; 1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208].Initially, it was determined that the proapoptotic BAX protein and the antiapoptotic Bcl-xl protein are substrates for cathepsin S. Cathepsins can also be regulated by human inhibitor proteins (cystatins), which prevent excessive activation of the undesirable proteolytic activity of cathepsins [Turk V, Stoka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. Jan 2012; 1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011
Была идентифицирована пептидная область, которая берет свое начало от ингибитора протеиназы, имеющего сходство с антиапоптотическим белком Bcl-xl. Для этой цели был использован растительный белок-ингибитор папаин-подобных протеиназ с последовательностью Pit2 [Misas Villamil JC, Mueller AN, Demir F, Meyer U, Breuer M, Dauben H, Win J, Huesgen PF, Doehlemann G. A fungal substrate mimicking molecule suppresses plant immunity via an inter-kingdom conserved motif. Nat Commun. 2019 Apr 5; 10(1): 1576. doi: 10.1038/s41467-019-09472-8. PMID: 30952847; PMCID: РМС6450895]. С использованием платформы BLAST при поиске по базе данных NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome'). был идентифицирован пептид из аминокислотной последовательности ингибитора Pit2, который также присутствует в α-5 спиральной петле Bcl-xl, и имеет последовательность FFSFGGAL (обозначен CS-PEP1);. Эта петля α-5 антиапоптотического белка Bcl-xl взаимодействует с ВН3 доменом проапоптотического ВАХ и это взаимодействие является ключевым этапом, ответственным за Bcl-xl-опосредованное ингибирование белка ВАХ во время активации апоптоза [Renault ТТ, Dejean LM, Мапоп S. A brewing understanding of the regulation of Bax function by Bcl-xL and Bcl-2. Mech Ageing Dev. 2017 Jan; 161 (Pt B):201-210. doi: 10.1016/j.mad.2016.04.007. Epub 2016 Apr 23. PMID: 27112371].A peptide region has been identified that originates from a proteinase inhibitor that shares similarities with the anti-apoptotic protein Bcl-xl. For this purpose, a plant protein inhibitor of papain-like proteinases with the Pit2 sequence was used [Misas Villamil JC, Mueller AN, Demir F, Meyer U, Breuer M, Dauben H, Win J, Huesgen PF, Doehlemann G. A fungal substrate mimicking molecule suppresses plant immunity via an inter-kingdom conserved motif. NatCommun. 2019
Пептид был синтезирован компанией Peptech Inc (Санкт-Петербург, Российская Федерация) методом твердофазного пептидного синтеза, при котором пептид получают путем соединения различных аминокислот друг с другом с последующей химической модификацией для введения функциональных групп. Способы химического синтеза пептида широко известны и хорошо описаны с помощью известных в данной области техники методов [US 6015881; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, сс. 4005-4008; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, сс. 4009-4012; Peptides, Chemistry and Biology, под ред. Kamber и др., изд-во ESCOM, Leiden, 1992, сс. 525-526; Riniker и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, сс. 9307-9320; Lloyd-Williams и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, сс. 11065-11133, и Andersson и др., Biopolymers 55, 2000, сс. 227-250]. Чистоту продукта определяли, используя MALDI-TOF, после чего пептид лиофилизировали для коммерческого использования.The peptide was synthesized by Peptech Inc (St. Petersburg, Russian Federation) by solid-phase peptide synthesis, in which the peptide is obtained by combining various amino acids with each other, followed by chemical modification to introduce functional groups. Methods for the chemical synthesis of a peptide are widely known and well described using methods known in the art [US 6015881; Mergler et al., Tetrahedron Letters 29, 1988, pp. 4005-4008; Mergler et al., Tetrahedron Letters 29, 1988, pp. 4009-4012; Peptides, Chemistry and Biology, ed. Kamber et al., ESCOM, Leiden, 1992, pp. 525-526; Riniker et al., Tetrahedron Letters 49, 1993, pp. 9307-9320; Lloyd-Williams et al., Tetrahedron Letters 49, 1993, pp. 11065-11133, and Andersson et al.,
Для работы с указанным пептидом был приготовлен 10 мМ стоковый раствор пептида в диметилсульфоксиде (ДМСО, со степенью чистоты, пригодной для работы с клеточными культурами (Sigma)), который хранили при 4°С. Последующие разведения выполняли в ДМСО и непосредственно использовали для обработки клеточных линий, выращенных на специальных культуральных средах in vitro, или для добавления к катепсину S в экспериментах по расщеплению белков ВАХ/Bcl-xl in vitro при значениях рН 5 или 7.To work with this peptide, a 10 mM stock solution of the peptide in dimethyl sulfoxide (DMSO, cell culture grade (Sigma)) was prepared and stored at 4°C. Subsequent dilutions were made in DMSO and used directly to treat cell lines grown on special in vitro culture media or to add to cathepsin S in in vitro BAX/Bcl-xl protein digestion experiments at
Свойства пептида оценивали in vitro биохимическими методами и на опухолевых линиях клеток.The properties of the peptide were evaluated in vitro by biochemical methods and on tumor cell lines.
Помимо ВАХ среди проаптотических ВН3-домен-содержащих белков могут быть использованы Bak, Mtd/Bok, Bcl-xs [Kelekar A, Thompson СВ. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis. Trends Cell Biol. 1998 Aug; 8(8):324-30. doi: 10.1016/s0962-8924(98)01321-x. PMID: 9704409]. Кроме того, представленная пептидная последовательность может иметь некоторые аминокислотные замены, не приводящие к существенным изменениям физико-химических свойств и проверенных с использованием молекулярного докинга (например, серин/треонин, аланин/валин/лейцин, изолейцин, серин/треонин, лизин/аргинин, аспарагин/глутамин и др.).In addition to VAC among proaptotic BH3-domain-containing proteins, Bak, Mtd/Bok, Bcl-xs [Kelekar A, Thompson SW. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis. Trends Cell Biol. 1998 Aug; 8(8):324-30. doi: 10.1016/s0962-8924(98)01321-x. PMID: 9704409]. In addition, the presented peptide sequence may have some amino acid substitutions that do not lead to significant changes in physicochemical properties and are verified using molecular docking (for example, serine/threonine, alanine/valine/leucine, isoleucine, serine/threonine, lysine/arginine, asparagine/glutamine, etc.).
Изобретение также включает фармацевтические композиции, в которых использован пептид CS-PEP1, имеющий последовательность FFSFGGAL, или пептиды, имеющие аминокислотные замены в последовательностях CS-PEP1, существенно не влияющие на свойства пептидов. Фармацевтические композиции могут быть применены в отношении заболеваний и нарушений, связанных с нарушенной экспрессией катепсина S и/или белками семейства BCL-2.The invention also includes pharmaceutical compositions using a CS-PEP1 peptide having the FFSFGGAL sequence, or peptides having amino acid substitutions in the CS-PEP1 sequences that do not significantly affect the properties of the peptides. Pharmaceutical compositions can be used in relation to diseases and disorders associated with impaired expression of cathepsin S and/or proteins of the BCL-2 family.
Фармацевтическая композиция включает пептид CS-PEP1, или его модификации с заменами аминокислот и любой известный из уровня техники фармацевтически приемлемый носитель в виде инертного нетоксичного материала, который не реагирует с активным ингредиентом, а также обеспечивает доставку и проникновение активного ингредиента в целевую ткань. Носитель подбирают по физико-химическим параметрам (растворимость, реакционная способность по отношению к пептидам, способ и условия введения состава).The pharmaceutical composition includes the CS-PEP1 peptide, or its modifications with amino acid substitutions, and any pharmaceutically acceptable carrier known from the prior art in the form of an inert non-toxic material that does not react with the active ingredient, and also ensures the delivery and penetration of the active ingredient into the target tissue. The carrier is selected according to physicochemical parameters (solubility, reactivity with respect to peptides, method and conditions for introducing the composition).
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, демонстрирующими возможность достижения требуемого технического результата.The present invention is illustrated by specific examples of implementation, demonstrating the possibility of achieving the desired technical result.
Пример 1. Определение способности катепсина S расщеплять ВАХ in vitro и в клетках (Фиг. 2А)Example 1. Determination of the ability of cathepsin S to cleave BAX in vitro and in cells (Fig. 2A)
В настоящее время механизмы регуляции катепсина S (CS) при расщеплении ВАХ неизвестны. Чтобы выявить эту взаимосвязь, рекомбинантный (полученный из E.coli) биологически активный CS был коинкубирован с очищенным белком ВАХ (Abeam) и наблюдали дозозависимое расщепление ВАХ (Фиг. 2А). Равные количества экспрессируемого бактериями белка ВАХ р21 подвергали действию активного CS при рН7, и анализировали реакцию расщепления ВАХ путем вестерн-блоттинга с использованием антител против ВАХ (Abeam). Фильтры были затем исследованы для обнаружения CS (нижние панели, SCB). Клетки 769Р и HEK293 котрансфицировали рВАХ-НА и плазмидами экспрессии pCS-FLAG (в возрастающих дозах, μg) в течение 24 часов, предварительно стимулированных носителем (левые панели) или 2 мкМ сирамезином (правые панели) в течение 1 часа; далее в клеточных экстрактах анализировали уровни экспрессии р21 ВАХ, CS и актина. В этом случае также наблюдали дозозависимое расщепление ВАХ (Фиг. 2В и С). Уровни белка р21 ВАХ анализировали в условиях стимуляции циклогексимидом (Фиг. 2D) после того, как клетки в течение 24 часов трансфицировали только рВАХ-НА (0,25 мкг) или pCS-FLAG (0,75 мкг). Уровни экспрессии р21 ВАХ были количественно определены, стандартизованы для уровней экспрессии актина в клетках, стимулированных при Т=0 ч до Т=6 ч. Синяя и красная кривые показывают уровни р21 ВАХ или р21 ВАХ при коэкспрессии с CS (соответственно), а линии тренда показаны черным. Таким образом дестабилизирующие эффекты экспрессии CS-flag на ВАХ-НА были также подтверждены на клетках млекопитающих, где период полужизни белка ВАХ-НА был значительно снижен по сравнению с экспрессией только ВАХ (Фиг 2. D, график).At present, the mechanisms of regulation of cathepsin S (CS) during BAX cleavage are unknown. To reveal this relationship, recombinant (derived from E. coli) biologically active CS was co-incubated with purified BAX protein (Abeam) and a dose-dependent cleavage of BAX was observed (Fig. 2A). Equal amounts of bacterially expressed BAX p21 protein were exposed to active CS at
Как видно из Фиг. 2, экспрессия CS приводит к разрушению белка ВАХ in vitro и в клетках млекопитающих.As can be seen from FIG. 2, CS expression results in the degradation of the BAX protein in vitro and in mammalian cells.
Пример 2. Оценка ингибирующей активности CS-PEP1 в отношении опосредованного катепсином S расщепления ВАХ in vitro (Фиг. 3А)Example 2 Evaluation of the inhibitory activity of CS-PEP1 on cathepsin S-mediated BAX cleavage in vitro (FIG. 3A)
Для того, чтобы оценить ингибирующую активность CS-PEP1 в отношении CS-опосредованного расщепления ВАХ, совместно инкубировали иммунопреципитированный белок ВАХ-НА, полученный из клеток млекопитающих (Фиг. 3А) или бактериально экспрессированный ВАХ (Фиг. 3В) с активным CS и уменьшающимися дозами ингибитора CS-PEP1. Равные количества иммунопреципитированного белка ВАХ-НА р21, полученного из 0,25 мкг экспрессии ВАХ-НА в клетках HEK293, подвергали действию активного CS с уменьшающимся количеством CS-PEP1 при рН 7, а продукты расщепления р21 ВАХ (или CS) детектировали с помощью вестерн-блоттинга с антителами против ВАХ (Abeam) или CS (SCB, верхняя и средняя панель). Уровни субстрата р21 ВАХ были определены количественно, стандартизованы относительно ВАХ (дорожка 2) и отображены на нижней панели (Фиг. 3В). Реакции расщепления ВАХ при рН 7 инкубировали в присутствии уменьшающихся доз CS-PEP1, и реакции анализировали по продуктам расщепления р21 ВАХ (верхняя панель) и уровню CS (средняя панель) с использованием анти-ВАХ (Abcam) или антитела против CS (SCB). Уровни субстрата р21 ВАХ были определены количественно, стандартизованы относительно ВАХ (дорожка 2) и отображены на нижней панели. Количественные данные представлены как ±SEM, и их значимость (где р<0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001). Реакция расщепления р21 ВАХ может быть значительно замедлена в присутствии 10 мкМ-100 нМ CS-PEP1 или 10 мкМ-1 мМ CS-РЕР1 для р21 ВАХ и ВАХ соответственно in vitroIn order to assess the inhibitory activity of CS-PEP1 on CS-mediated BAX cleavage, mammalian-derived immunoprecipitated BAX-HA protein (Fig. 3A) or bacterially expressed BAX (Fig. 3B) was co-incubated with active CS and decreasing doses. inhibitor of CS-PEP1. Equal amounts of immunoprecipitated p21 BAX-HA protein derived from 0.25 μg of BAX-HA expression in HEK293 cells were exposed to active CS with decreasing amounts of CS-PEP1 at
Как видно из Фиг. 3, CS-PEP1 ингибирует опосредованное катепсином S расщепление ВАХ.As can be seen from FIG. 3, CS-PEP1 inhibits cathepsin S-mediated BAX cleavage.
Пример 3. Определение способности CS-PEP1 расщеплять и дестабилизировать Bcl-xl in vitro и в клетках млекопитающих (Фиг. 4А)Example 3 Determination of the ability of CS-PEP1 to cleave and destabilize Bcl-xl in vitro and in mammalian cells (Fig. 4A)
Анализы CS-опосредованного расщепления Bcl-xl in vitro проводили при рН 7 и 5 (верхняя панель) с использованием GST-Bcl-xl в качестве субстрата в присутствии 10 мкМ CS-PEP1 (или носителя). Уровни субстрата определяли количественно, как показано на нижней панели (белые столбцы с рН 7 и черные столбцы с рН 5), а продукты расщепления определяли с помощью окрашивания кумасси синим (Фиг. 4В). Клетки HEK293 стимулировали уменьшающимися дозами CS-PEP1 в присутствии носителя или 5 мкг/мл Рас в течение 24 часов и анализировали на р21 ВАХ (Abeam), Caspase-3 (Abeam), Bcl-xl (Abcam), CS (Invitrogen) и актина (Abcam) экспрессии. Количественные данные представлены как ±SEM, и их значимость (где р<0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001).In vitro CS-mediated Bcl-xl cleavage assays were performed at
Как видно из Фиг. 4, CS-PEP1 проявляет ингибирующую активность в отношении CS-опосредованного расщепления Bcl-xl in vitro при рН 7 (Фиг. 4А, дорожка 8) значительно лучше, чем при рН 5 (Фиг. 4А, дорожка 7). Уровни эндогенного белка Bcl-xl также оставались дестабилизированными в клетках HEK293 при совместной обработке клеток паклитакселом и 50 мкМ-10 нМ, что позволяет предположить, что CS-PEP1 может препятствовать стабилизации Bcl-xl в присутствии обычных химиотерапевтических препаратов, которые демонстрируют низкую эффективность в уничтожении клеток рака почки.As can be seen from FIG. 4, CS-PEP1 exhibits inhibitory activity against CS-mediated Bcl-xl cleavage in vitro at pH 7 (FIG. 4A, lane 8) significantly better than at pH 5 (FIG. 4A, lane 7). Endogenous Bcl-xl protein levels also remained destabilized in HEK293 cells when cells were co-treated with paclitaxel and 50 μM-10 nM, suggesting that CS-PEP1 may interfere with the stabilization of Bcl-xl in the presence of conventional chemotherapeutic drugs that show poor killing efficacy. kidney cancer cells.
Пример 4. Определение способности CS-PEP1 стабилизировать белок ВАХ при экспрессии катепсина S (Фиг. 5А)Example 4. Determination of the ability of CS-PEP1 to stabilize the BAX protein during the expression of cathepsin S (Fig. 5A)
Клетки 769Р совместно стимулировали носителем или 5 мкг/мл Рас, 10 мкМ zVAD-fmk и 10 мкМ CS-PEP1 в течение 24 часов. Растворимые WCL анализировали на экспрессию эндогенного р21 ВАХ (Abeam), CS (Abeam) и актина (Abeam). Уровни белка р21 ВАХ были определены количественно, стандартизованы для экспрессии актина и представлены черными полосами как кратные изменения по сравнению с стимуляциями одним носителем (Фиг. 5 В). Уровни эндогенного р21 ВАХ, CS и актина определяли в лизатах клеток HEK293 с помощью вестерн-блоттинга после 24 часов совместной стимуляции Рас (5 мкг/мл) и CS-PEP1 (10 мкМ) (Фиг. 5С). Клетки HEK293, котрансфицированные рВАХ-НА и pCS-FLAG или рВАХ-НА и pCS-C25A-FLAG, стимулировали носителем или 10 мкМ CS-PEP1 в течение 24 часов и циклогексимидом в течение следующих 6 часов. В указанные моменты времени клетки лизировали и клеточные лизаты (WCL) анализировали на р21 ВАХ, CS и экспрессию актина с использованием вестерн-блоттинга (Фиг. 5D). Уровни экспрессии для р21 ВАХ были количественно определены, стандартизированы для актина и выражены по отношению к уровням, наблюдаемым при Т=0 час. Коэкспрессия ВАХ и CS в присутствии стимуляции CS-PEP1 (синий) и р21 ВАХ с коэкспрессией CS-C25A (красный) показаны как линии тренда (черные кривые). Количественные данные представлены как ±SEM, и их значимость (где р<0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001).769P cells were costimulated with vehicle or 5 μg/ml Ras, 10 μM zVAD-fmk and 10 μM CS-PEP1 for 24 hours. Soluble WCL was analyzed for the expression of endogenous p21 BAX (Abeam), CS (Abeam) and actin (Abeam). p21 BAX protein levels were quantified, standardized for actin expression, and represented by black bars as fold changes compared to vehicle alone stimulations (FIG. 5B). Endogenous p21 BAX, CS and actin levels were determined in lysates of HEK293 cells by Western blotting after 24 hours of co-stimulation with Pac (5 μg/ml) and CS-PEP1 (10 μM) (Fig. 5C). HEK293 cells co-transfected with pBAX-HA and pCS-FLAG or pBAX-HA and pCS-C25A-FLAG were stimulated with vehicle or 10 μM CS-PEP1 for 24 hours and cycloheximide for a further 6 hours. At the indicated time points, cells were lysed and cell lysates (WCL) were analyzed for p21 BAX, CS and actin expression using Western blotting (FIG. 5D). The expression levels for p21 BAX were quantified, standardized for actin and expressed relative to the levels observed at T=0 hour. BAX and CS co-expression in the presence of CS-PEP1 stimulation (blue) and p21 BAX with CS-C25A co-expression (red) are shown as trend lines (black curves). Quantitative data are presented as ±SEM and their significance (where p<0.05) is determined using a two-tailed Student's t test (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001).
Наблюдался эффект CS-PEP1 в стабилизации уровней экспрессированного ВАХ при совместной экспрессии ВАХ-НА с CS (Фиг. 5А) или эндогенным белком ВАХ в присутствии индуцированного паклитакселом эндогенного CS (Фиг. 5В). Это было подтверждено наблюдением аналогичных уровней стабильности для ВАХ-НА, коэкспрессируемого с CS-C25A-Flag, и ВАХ-НА, коэкспрессированного с CS-Flag и обработанного CS-PEP1 (Фиг. 5С) в течение шестичасового курса, и где соответствующие периоды полураспада белков ВАХ были почти идентичными (Фиг. 5D).An effect of CS-PEP1 in stabilizing the levels of expressed BAX was observed when BAX-HA was co-expressed with CS (FIG. 5A) or endogenous BAX protein in the presence of paclitaxel-induced endogenous CS (FIG. 5B). This was confirmed by observing similar levels of stability for BAX-HA co-expressed with CS-C25A-Flag and BAX-HA co-expressed with CS-Flag and treated with CS-PEP1 (Fig. 5C) over a six-hour course, and where the corresponding half-lives VAC proteins were nearly identical (Figure 5D).
Пример 5. Стабилизация CS-PEP1 уровня эндогенного белка ВАХ в клеткахExample 5. Stabilization of CS-PEP1 level of endogenous BAX protein in cells
CS-PEP1 стабилизирует уровень эндогенного белка ВАХ (в том числе в присутствии экспрессии катепсина S) в клетках 769Р и HEK293 (Фиг. 6). Клетки 769Р и HEK293 трансфицировали 1 мкг пустой экспрессионной плазмиды pcDNA3.1+, pCS-FLAG или PCS-C25A-FLAG в течение 24 часов, а затем обрабатывали 10 мкМ CS-PEP1 еще в течение 24 часов. Клетки собирали, готовили лизаты и анализировали на предмет эндогенной экспрессии ВАХ (анти-ВАХ), катепсина S (с использованием анти-CS антител) и β-актина (анти-β-актин).CS-PEP1 stabilizes the level of endogenous BAX protein (including in the presence of cathepsin S expression) in 769P and HEK293 cells (Fig. 6). 769P and HEK293 cells were transfected with 1 μg empty expression plasmid pcDNA3.1+, pCS-FLAG or PCS-C25A-FLAG for 24 hours and then treated with 10 μM CS-PEP1 for an additional 24 hours. Cells were collected, lysates were prepared and analyzed for endogenous expression of BAX (anti-BAX), cathepsin S (using anti-CS antibodies) and β-actin (anti-β-actin).
В контрольных экспериментах экспрессия CS дестабилизировала эндогенные уровни ВАХ (первый блот, предпоследняя полоса), а доминантно-ингибирующая экспрессия CS-C25A отменила этот эффект (первый блот, полоса 8). При использовании клеток HEK293 эндогенные уровни ВАХ заметно повышались при обработке CS-PEP1 (второй блот, полоса 6). При экспрессии CS уровни ВАХ кажутся повышенными (с учетом того, что уровни β-актина ниже базальных по сравнению с контрольными условиями (см. полосы 3 и 4, второй блот). В HEK293 обработка PVLE не оказала заметного влияния на уровень эндогенного белка ВАХ ни с экспрессией CS, ни с доминантно-ингибирующей экспрессией С25А (третий блот). В совокупности такие результаты свидетельствуют о том, что CS-PEP1 стабилизирует уровень ВАХ как при обработке клеток только ингибиторами, так и при экспрессии CS в клетках 769Р. Аналогичная картина наблюдалась в клетках HEK293.In control experiments, CS expression destabilized endogenous BAC levels (first blot, penultimate lane), while dominant inhibitory expression of CS-C25A abolished this effect (first blot, lane 8). When using HEK293 cells, endogenous BAC levels were markedly increased by CS-PEP1 treatment (second blot, lane 6). When CS is expressed, BAX levels appear to be elevated (given that β-actin levels are lower than basal compared to control conditions (see
6. Определение способности CS-PEP1 ингибировть опосредованное катепсином S расщепление полиубиквитинированного производного р120 ВАХ ВАХ (Фиг. 7)6. Determination of the ability of CS-PEP1 to inhibit cathepsin S-mediated cleavage of the polyubiquitinated p120 BAX BAX derivative (Fig. 7)
Клетки HEK293, коэкспрессирующие CS-Flag или pCS-C25A-Flag с ВАХ и НА-убиквитином, в течение 6 часов дополнительно обрабатывали в течение 24 часов 10 мкМ CS-PEP1 и очищали лизаты целых клеток, иммунопреципитированные с использованием антител против НА. Иммунные комплексы анализировали на наличие белка ВАХ с помощью вестерн-блоттинга при длительном (верхняя панель) и кратковременном воздействии (нижняя панель). Красной стрелкой выделено полиубиквитинированное производное ВАХ, р120 ВАХ.HEK293 cells co-expressing CS-Flag or pCS-C25A-Flag with BAX and HA-ubiquitin were further treated for 24 hours with 10 μM CS-PEP1 for 6 hours and whole cell lysates immunoprecipitated with anti-HA antibodies were purified. Immune complexes were analyzed for the presence of the BAX protein by Western blotting with long-term (upper panel) and short-term exposure (lower panel). The red arrow indicates the polyubiquitinated VAC derivative, p120 VAC.
Как видно из Фиг. 7, обработка клеток CS-PEP1 также приводит к накоплению полиубиквитинированного производного ВАХ с массой 120 кДа (Пример 6), особенно в присутствии неактивного мутанта CS-C25A-Flag, что подразумевает, что CS может принимать участие в протеолитическом расщеплении убиквитинированного ВАХ и, следовательно, может играть важную роль в протеасомной деградации уровней белка ВАХ.As can be seen from FIG. 7, treatment of cells with CS-PEP1 also results in accumulation of the 120 kDa polyubiquitinated BAX derivative (Example 6), especially in the presence of the inactive CS-C25A-Flag mutant, implying that CS may be involved in the proteolytic cleavage of ubiquitinated BAX and therefore , may play an important role in the proteasomal degradation of BAX protein levels.
Пример 7. Определение способности CS-PEP1 вызывать апоптоз и активацию каспазы-3Example 7 Determination of the Ability of CS-PEP1 to Induce Apoptosis and Caspase-3 Activation
Клетки HEK293 (Фиг. 8А) или 769Р (Фиг. 8С), соответственно, совместно стимулировали CS-PEP1 (10 мкМ), пероксидом водорода (HP, 5 мкМ) или паклитакселом (Рас, 5 мкг/мл) в течение 24 часов; апоптотические клетки окрашивали с помощью TUNEL и определяли их количество. Растворимые лизаты цельных клеток (WCL), полученные из клеток, обработанных таким же образом, как на панелях А и С, анализировали на экспрессию каспазы-3 (Casp-3) и актина (Фиг. 8С). Уровни экспрессии каспазы-3 были количественно определены и стандартизированы для экспрессии актина по отношению к клеткам, стимулированным одним носителем (Фиг. 8D, график). Количественные данные представлены как ±SEM, и их значимость (где р<0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (*р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001).HEK293 (Fig. 8A) or 769P (Fig. 8C) cells, respectively, were co-stimulated with CS-PEP1 (10 μM), hydrogen peroxide (HP, 5 μM), or paclitaxel (Pac, 5 μg/ml) for 24 hours; apoptotic cells were stained with TUNEL and their number was determined. Soluble whole cell lysates (WCL) obtained from cells treated in the same manner as in panels A and C were analyzed for caspase-3 (Casp-3) and actin expression (FIG. 8C). Caspase-3 expression levels were quantified and standardized for actin expression relative to cells stimulated with vehicle alone (FIG. 8D, graph). Quantitative data are presented as ±SEM and their significance (where p<0.05) is determined using a two-tailed Student's t test (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001).
Обработка 10 мкМ CS-PEP1 клеток HEK293 или 769Р индуцировала их апоптоз примерно на 6-58% и 1-43%, соответственно (Фиг. 8A). CS-PEP1 может также взаимоусилить индуцирующие апоптоз эффекты обработки 769 клеток перекисью водорода или паклитакселом с 11% до 93% и от 55% до 64%, соответственно (Фиг. 8С). Обнаружение промежуточного соединения каспазы-3 с массой 18 кДа наблюдалось в качестве контроля - индикатора активации апоптоза (Фиг. 8В, D). Таким образом CS-PEP1 вызывает апоптоз и активацию каспазы-3.Treatment with 10 μM CS-PEP1 of HEK293 or 769P cells induced their apoptosis by approximately 6-58% and 1-43%, respectively (Fig. 8A). CS-PEP1 can also mutually enhance the apoptosis-inducing effects of hydrogen peroxide or paclitaxel treatment of 769 cells from 11% to 93% and 55% to 64%, respectively (Fig. 8C). Detection of an intermediate caspase-3 with a mass of 18 kDa was observed as a control indicator of apoptosis activation (Fig. 8B, D). Thus, CS-PEP1 induces apoptosis and caspase-3 activation.
Таким образом по результатам проведенных исследований выявлено, что пептид FFSFGGAL обладает рядом ценных терапевтических свойств, поскольку может усиливать ВАХ-опосредованный апоптоз за счет следующих способностей:Thus, according to the results of the studies, it was revealed that the FFSFGGAL peptide has a number of valuable therapeutic properties, since it can enhance BAC-mediated apoptosis due to the following abilities:
1. Подавлять активность катепсина S (так же, как ингибитор протеиназы Pit2 ингибирует растительные папаин-подобные протеиназы).1. Inhibit cathepsin S activity (in the same way that a Pit2 proteinase inhibitor inhibits plant papain-like proteinases).
2. Ингибировать взаимодействие ингибиторного белка Bcl-xl/BAX (благодаря тому, что он является производным от гидрофобного кармана Bcl-xl, который связывает ВН3-домен ВАХ).2. Inhibit the interaction of the Bcl-xl/BAX inhibitory protein (due to the fact that it is derived from the Bcl-xl hydrophobic pocket that binds the BH3 domain of the BAX).
3. Подавлять белковые взаимодействия В АХ/В АХ и образование олигомеров (благодаря тому, что они являются производными от гидрофобного кармана Bcl-xl, который связывает ВАХ), тем самым стабилизируя мономерный ВАХ (и который все еще может вызывать апоптоз Box, Bak and beyond - mitochondrial performance in apoptosis. FEBS J. 2018 Feb; 285(3):416-431. doi: 10.1111/febs.14186. Epub 2017 Sep 4. PMID: 28755482]).3. Suppress BAX/BAX protein interactions and oligomer formation (due to being derived from the Bcl-xl hydrophobic pocket that binds BAX), thereby stabilizing the monomeric BAX (and which can still induce apoptosis Box, Bak and beyond - mitochondrial performance in apoptosis. FEBS J. Feb 2018; 285(3):416-431. doi: 10.1111/febs.14186. Epub 2017
4. Ингибировать катепсин S-опосредованный протеолиз полиубиквитинированного производного ВАХ (р120 ВАХ).4. Inhibit cathepsin S-mediated proteolysis of the polyubiquitinated BAX derivative (p120 BAX).
Claims (2)
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021113908A Division RU2785794C2 (en) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | Peptide compounds for induction of apoptosis in tumor cell |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2796104C1 true RU2796104C1 (en) | 2023-05-17 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7521548B2 (en) * | 2001-02-07 | 2009-04-21 | Burnham Institute For Medical Research | Apoptosis modulator Bcl-B and methods for making and using same |
RU2367468C2 (en) * | 2003-11-19 | 2009-09-20 | Мерк Патент Гмбх | Bcl-2 PROTEINS, FRAGMENTS THEREOF, AND APPLICATION THEREOF IN PATIENTS WITH MALIGNANT TUMOUR |
US20110318380A1 (en) * | 2008-10-01 | 2011-12-29 | Dako Denmark A/S | MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring |
WO2020241800A1 (en) * | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 花王株式会社 | Norovirus-binding peptide |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7521548B2 (en) * | 2001-02-07 | 2009-04-21 | Burnham Institute For Medical Research | Apoptosis modulator Bcl-B and methods for making and using same |
RU2367468C2 (en) * | 2003-11-19 | 2009-09-20 | Мерк Патент Гмбх | Bcl-2 PROTEINS, FRAGMENTS THEREOF, AND APPLICATION THEREOF IN PATIENTS WITH MALIGNANT TUMOUR |
US20110318380A1 (en) * | 2008-10-01 | 2011-12-29 | Dako Denmark A/S | MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring |
WO2020241800A1 (en) * | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 花王株式会社 | Norovirus-binding peptide |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
UniParc - UPI0005B663D6, база данных UniParc, www.uniprot.org/uniparc/UPI0005B663D6?sort=score; UniProtKB/Swiss-Prot A0A0D1EAR7 2019-07-31. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kisselev et al. | The caspase-like sites of proteasomes, their substrate specificity, new inhibitors and substrates, and allosteric interactions with the trypsin-like sites | |
Denmeade et al. | The SERCA pump as a therapeutic target: making a “smart bomb” for prostate cancer | |
Storr et al. | The calpain system and cancer | |
Mandic et al. | Calpain-mediated Bid cleavage and calpain-independent Bak modulation: two separate pathways in cisplatin-induced apoptosis | |
DK2643010T3 (en) | BIOLOGICAL ACTIVE COMPLEX AND ITS PREPARATION | |
Lee et al. | Effect of conjugated linoleic acid, μ-calpain inhibitor, on pathogenesis of Alzheimer's disease | |
Bovenschen et al. | NK cell protease granzyme M targets α-tubulin and disorganizes the microtubule network | |
Xie et al. | Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways | |
WO2006001956A2 (en) | Compositions for inhibiting cell growth and inducing apoptosis in cancer cells and methods of use thereof | |
Nguyen et al. | A selective inhibitor of ubiquitin-specific protease 4 suppresses colorectal cancer progression by regulating β-catenin signaling. | |
Moh'd A et al. | The amyloid precursor protein/protease nexin 2 Kunitz inhibitor domain is a highly specific substrate of mesotrypsin | |
JP2010233569A (en) | Method and composition for adjusting apoptosis | |
Sharoar et al. | Amyloid β binds procaspase-9 to inhibit assembly of Apaf-1 apoptosome and intrinsic apoptosis pathway | |
Kang et al. | LRP1-dependent pepsin clearance induced by 2′-hydroxycinnamaldehyde attenuates breast cancer cell invasion | |
US20010012854A1 (en) | Multicatalytic protease inhibitors for use as anti-tumor agents | |
Wenta et al. | The HtrA3 protease promotes drug‐induced death of lung cancer cells by cleavage of the X‐linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) | |
RU2796104C1 (en) | Application of peptide compound for apoptosis induction in a tumor cell | |
RU2785794C2 (en) | Peptide compounds for induction of apoptosis in tumor cell | |
Hetfeld et al. | The COP9 signalosome-mediated deneddylation is stimulated by caspases during apoptosis | |
Reisbeck et al. | The iron chelator and OXPHOS inhibitor VLX600 induces mitophagy and an autophagy-dependent type of cell death in glioblastoma cells | |
Krishnan et al. | Guanine nucleotide binding protein like-1 (GNL1) promotes cancer cell proliferation and survival through AKT/p21 CIP1 signaling cascade | |
WO2022245249A1 (en) | Peptide compounds for inducing apoptosis in a cancer cell | |
Rao et al. | Ubiquitin receptor RPN13 mediates the inhibitory interaction of diphenyldihaloketones CLEFMA and EF24 with the 26S proteasome | |
Park et al. | A P-glycoprotein-and MRP1-independent doxorubicin-resistant variant of the MCF-7 breast cancer cell line with defects in caspase-6,-7,-8,-9 and-10 activation pathways | |
McCloskey et al. | The therapeutic potential of the proteasome in leukaemia |