RU2785794C2 - Peptide compounds for induction of apoptosis in tumor cell - Google Patents
Peptide compounds for induction of apoptosis in tumor cell Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785794C2 RU2785794C2 RU2021113908A RU2021113908A RU2785794C2 RU 2785794 C2 RU2785794 C2 RU 2785794C2 RU 2021113908 A RU2021113908 A RU 2021113908A RU 2021113908 A RU2021113908 A RU 2021113908A RU 2785794 C2 RU2785794 C2 RU 2785794C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bax
- apoptosis
- tumor cell
- cathepsin
- cells
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 30
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 102100015379 CTSS Human genes 0.000 abstract description 61
- 108090000613 Cathepsin S Proteins 0.000 abstract description 61
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 102000024678 Bcl-2 family Human genes 0.000 abstract description 4
- 108091011726 Bcl-2 family Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000001771 impaired Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 58
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 31
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 31
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 28
- 102000009178 bcl-2-Associated X Protein Human genes 0.000 description 27
- 108010048571 bcl-2-Associated X Protein Proteins 0.000 description 27
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 101710032374 BCL2L1 Proteins 0.000 description 20
- 102100015655 BCL2L1 Human genes 0.000 description 20
- 102100002974 CDKN1A Human genes 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 18
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000000861 pro-apoptotic Effects 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N Intaxel Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 9
- 229960001592 Paclitaxel Drugs 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 229930003347 taxol Natural products 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 9
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 9
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 8
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 7
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 6
- 108060000885 BCL2 Proteins 0.000 description 5
- 102100013894 BCL2 Human genes 0.000 description 5
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 5
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 5
- 230000002132 lysosomal Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 210000003712 Lysosomes Anatomy 0.000 description 4
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 4
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 4
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102100011038 SLC20A2 Human genes 0.000 description 4
- 101710021264 SLC20A2 Proteins 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 4
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001868 lysosomic Effects 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 4
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 3
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 3
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 3
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 101800001074 Papain-like proteinase Proteins 0.000 description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- LQBVNQSMGBZMKD-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethylcyclohexen-1-yl]methyl]piperazin-1-yl]-N-[3-nitro-4-(oxan-4-ylmethylamino)phenyl]sulfonyl-2-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-yloxy)benzamide Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C=1CC(C)(C)CCC=1CN(CC1)CCN1C(C=C1OC=2C=C3C=CNC3=NC=2)=CC=C1C(=O)NS(=O)(=O)C(C=C1[N+]([O-])=O)=CC=C1NCC1CCOCC1 LQBVNQSMGBZMKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N Acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N Cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 102100013574 POU2F1 Human genes 0.000 description 2
- 101710006192 POU2F1 Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000004908 autophagic flux Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000453 cell autonomous Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000000973 chemotherapeutic Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 101700050775 oct-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 229960001183 venetoclax Drugs 0.000 description 2
- HKIPCXRNASWFRU-UHFFFAOYSA-N 1,3-difluoropropan-2-one Chemical class FCC(=O)CF HKIPCXRNASWFRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUCMRTZQCZRJDC-UHFFFAOYSA-N Acetyl fluoride Chemical compound CC(F)=O JUCMRTZQCZRJDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- 101700010813 BAX Proteins 0.000 description 1
- SUNMBRGCANLOEG-UHFFFAOYSA-N Bis(chloromethyl) ketone Chemical class ClCC(=O)CCl SUNMBRGCANLOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 1
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 102000003902 Cathepsin C Human genes 0.000 description 1
- 108090000267 Cathepsin C Proteins 0.000 description 1
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 description 1
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 description 1
- 102000015833 Cystatins Human genes 0.000 description 1
- 108050004038 Cystatins Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010050513 Metastatic renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001700 Mitochondrial Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000026947 Plant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102200007331 RETN C25A Human genes 0.000 description 1
- XWAONOGAGZNUSF-UHFFFAOYSA-N Siramesine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1N1C2=CC=CC=C2C(CCCCN2CCC3(CC2)C2=CC=CC=C2CO3)=C1 XWAONOGAGZNUSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009495 Siramesine Drugs 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000001946 anti-microtubular Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic Effects 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000002 effect on proteasome Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating Effects 0.000 description 1
- 108091006070 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 1
- 230000026938 proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention belongs
Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, и может быть использовано в качестве терапевтического средства для лечения заболеваний, связанных с нарушенной экспрессией катепсина S и/или белками семейства BCL-2.The invention relates to the pharmaceutical industry and can be used as a therapeutic agent for the treatment of diseases associated with impaired expression of cathepsin S and/or proteins of the BCL-2 family.
Уровень техникиState of the art
Три аспекта отличают опухоли человека различных типов и этиологии от нормальных клеток: способность к более быстрой пролиферации, уклонение от подавления клеточного роста и повышенная чувствительность к цитотоксической терапии [Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar 4; 144(5):646-74. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013. PMID: 21376230]. Кроме того, два очень важных процесса дают опухолевым клеткам преимущество в выживании. Во-первых, клетки проявляют химиотерапевтическую устойчивость к запрограммированному процессу гибели клеток, называемому апоптозом, и, во-вторых, такие клетки развивают уникальное свойство повышенной подвижности, что способствует их распространению во время метастазирования [Norouzi S, Gorgi Valokala M, Mosaffa F, Zirak MR, Zamani P, Behravan J. Crosstalk in cancer resistance and metastasis. Crit Rev Oncol Hematol. 2018 Dec;132:145-153. doi: 10.1016/j.critrevonc.2018.09.017. Epub 2018 Oct 4. PMID: 30447920; Steeg PS. Targeting metastasis. Nat Rev Cancer. 2016 Apr; 16(4):201-18. doi: 10.1038/nrc.2016.25. PMID: 27009393; PMCID: PMC7055530]. Центральное место в быстрой пролиферации раковых клеток занимает убиквитин-зависимый протеасомный путь и его потребность в таких ключевых клеточных процессах, как регуляция клеточного цикла, клеточная дифференцировка и апоптоз. Так, влияние на протеасомы с целью ингибирования быстрой пролиферации раковых клеток ранее уже рассматривалось в качестве терапевтической стратегии. Важное значение здесь имеет эффект блокирования протеасомной деградации убиквитинированных проапоптотических белков и, по-видимому, усиления апоптоза раковых клеток, предположительно за счет их накопления, как это видно на примере проапоптотического белка BAX [Li B, Dou QP. Bax degradation by the ubiquitin/proteasome-dependent pathway: involvement in tumor survival and progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Apr 11;97(8):3850-5. doi: 10.1073/pnas.070047997. PMID: 10725400; PMCID: PMC18105]. Несмотря на то, что точные механизмы протеолитического распада убиквитинированного белка BAX недостаточно исследованы, они могут представлять альтернативную стратегию терапевтического действия при раке.Three aspects distinguish human tumors of various types and etiologies from normal cells: the ability to proliferate more rapidly, evasion of cell growth suppression, and increased sensitivity to cytotoxic therapy [Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. cell. 2011 Mar 4; 144(5):646-74. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013. PMID: 21376230]. In addition, two very important processes give tumor cells a survival advantage. Firstly, cells exhibit chemotherapeutic resistance to a programmed cell death process called apoptosis, and secondly, such cells develop a unique property of increased motility, which contributes to their spread during metastasis [Norouzi S, Gorgi Valokala M, Mosaffa F, Zirak MR, Zamani P, Behravan J. Crosstalk in cancer resistance and metastasis. Crit Rev Oncol Hematol. 2018 Dec;132:145-153. doi: 10.1016/j.critrevonc.2018.09.017. Epub 2018 Oct 4. PMID: 30447920; Steeg PS. Targeting metastasis. Nat Rev Cancer. 2016 Apr; 16(4):201-18. doi: 10.1038/nrc.2016.25. PMID: 27009393; PMCID: PMC7055530]. Central to the rapid proliferation of cancer cells is the ubiquitin-dependent proteasome pathway and its requirement for key cellular processes such as cell cycle regulation, cell differentiation, and apoptosis. Thus, the effect on proteasomes to inhibit the rapid proliferation of cancer cells has previously been considered as a therapeutic strategy. Important here is the effect of blocking the proteasomal degradation of ubiquitinated proapoptotic proteins and, apparently, enhancing apoptosis of cancer cells, presumably due to their accumulation, as seen in the example of the proapoptotic protein BAX [Li B, Dou QP. Bax degradation by the ubiquitin/proteasome-dependent pathway: involvement in tumor survival and progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Apr 11;97(8):3850-5. doi: 10.1073/pnas.070047997. PMID: 10725400; PMCID:PMC18105]. Although the exact mechanisms of proteolytic degradation of the ubiquitinated BAX protein are not well understood, they may represent an alternative therapeutic strategy in cancer.
Одной из групп внутриклеточных протеиназ, которые отвечают за регулирование гибели и метастазирования опухолевых клеток, являются лизосомальные цистеиновые катепсины, которые относятся к суперсемейству папаин-подобных протеиназ [Turk V, Stoka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208; Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11;12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Soond SM, Kozhevnikova MV, Zamyatnin AA Jr. 'Patchiness' and basic cancer research: unravelling the proteases. Cell Cycle. 2019 Aug;18(15):1687-1701. doi: 10.1080/15384101.2019.1632639. Epub 2019 Jun 24. PMID: 31213124; PMCID: PMC6649598]. Хотя они обычно экспрессируются и находятся в лизосомах, в начале заболевания или из-за ряда сигналов, связанных с началом заболевания, некоторые из этих катепсинов секретируются во внеклеточный матрикс (extracellular matrix, ECM) [Rozhin J, Sameni M, Ziegler G, Sloane BF. Pericellular pH affects distribution and secretion of cathepsin B in malignant cells. Cancer Res. 1994 Dec 15;54(24):6517-25. PMID: 7987851; Kramer L, Turk D, Turk B. The Future of Cysteine Cathepsins in Disease Management. Trends Pharmacol Sci. 2017 Oct;38(10):873-898. doi: 10.1016/j.tips.2017.06.003. Epub 2017 Jun 28. PMID: 28668224; Reiser J, Adair B, Reinheckel T. Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease. J Clin Invest. 2010 Oct;120(10):3421-31. doi: 10.1172/JCI42918. Epub 2010 Oct 1. PMID: 20921628; PMCID: PMC2947230], где они могут беспрепятственно расщеплять компоненты ECM и, таким образом, способствовать росту опухолевых клеток и их распространению. Одной из таких протеиназ является катепсин S, который может быть подходящим кандидатом для таргетной терапии [Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11;12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Rudzińska M, Parodi A, Soond SM, Vinarov AZ, Korolev DO, Morozov AO, Daglioglu C, Tutar Y, Zamyatnin AA Jr. The Role of Cysteine Cathepsins in Cancer Progression and Drug Resistance. Int J Mol Sci. 2019 Jul 23;20(14):3602. doi: 10.3390/ijms20143602. PMID: 31340550; PMCID: PMC6678516]. Хотя экспрессия катепсина S в тканях относительно ограничена, было отмечено, что он экспрессируется под действием ряда физиологических условий, связанных с гипоксией в месте опухоли или в условиях химиотерапевтического воздействия. Следовательно, он может проявлять свою активность в качестве индуцибельного фактора, который, в частности, способствует развитию опухоли и, возможно, устойчивости к химиотерапии (Soond, S.M.; Savvateeva, L.V.; Makarov, V.A.; Gorokhovets, N.V.; Townsend, P.A.; Zamyatnin, A.A., Jr. Cathepsin S Cleaves BAX as a Novel and Therapeutically Important Regulatory Mechanism for Apoptosis. Pharmaceutics 2021, 13, 339). Кроме того, было обнаружено, что экспрессия катепсина S вносит вклад в развитие сердечно-сосудистых заболеваний атеросклеротического генеза [Wu H, Du Q, Dai Q, Ge J, Cheng X. Cysteine Protease Cathepsins in Atherosclerotic Cardiovascular Diseases. J Atheroscler Thromb. 2018 Feb 1;25(2):111-123. doi: 10.5551/jat.RV17016. Epub 2017 Oct 5. PMID: 28978867; PMCID: PMC5827079], а также участвует в деградации белков во время опосредованной MHC-II презентации опухолевого антигена и дифференцировки опухолевых макрофагов M1-M2 [Yang M, Liu J, Shao J, Qin Y, Ji Q, Zhang X, Du J. Cathepsin S-mediated autophagic flux in tumor-associated macrophages accelerate tumor development by promoting M2 polarization. Mol Cancer. 2014 Mar 2;13:43. doi: 10.1186/1476-4598-13-43. PMID: 24580730; PMCID: PMC4015740], что только подчеркивает разнообразную активность катепсина S при различных нормальных и патологических состояниях [Honey K, Rudensky AY. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat Rev Immunol. 2003 Jun;3(6):472-82. doi: 10.1038/nri1110. PMID: 12776207].One of the groups of intracellular proteinases that are responsible for regulating the death and metastasis of tumor cells are lysosomal cysteine cathepsins, which belong to the superfamily of papain-like proteinases [Turk V, Stoka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B, Turk D Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208; Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11;12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Soond SM, Kozhevnikova MV, Zamyatnin AA Jr. 'Patchiness' and basic cancer research: unraveling the proteases. cell cycle. 2019 Aug;18(15):1687-1701. doi: 10.1080/15384101.2019.1632639. Epub 2019 Jun 24. PMID: 31213124; PMCID: PMC6649598]. Although they are usually expressed and located in lysosomes, at the onset of the disease or due to a number of signals associated with the onset of the disease, some of these cathepsins are secreted into the extracellular matrix (extracellular matrix, ECM) [Rozhin J, Sameni M, Ziegler G, Sloane BF . Pericellular pH affects distribution and secretion of cathepsin B in malignant cells. Cancer Res. 1994 Dec 15;54(24):6517-25. PMID: 7987851; Kramer L, Turk D, Turk B. The Future of Cysteine Cathepsins in Disease Management. Trends Pharmacol Sci. 2017 Oct;38(10):873-898. doi: 10.1016/j.tips.2017.06.003. Epub 2017 Jun 28. PMID: 28668224; Reiser J, Adair B, Reinheckel T. Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease. J Clin Invest. 2010 Oct;120(10):3421-31. doi: 10.1172/JCI42918. Epub 2010 Oct 1. PMID: 20921628; PMCID: PMC2947230], where they can freely cleave ECM components and thus promote tumor cell growth and spread. One such proteinase is cathepsin S, which may be a suitable candidate for targeted therapy [Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11;12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828; Rudzińska M, Parodi A, Soond SM, Vinarov AZ, Korolev DO, Morozov AO, Daglioglu C, Tutar Y, Zamyatnin AA Jr. The Role of Cysteine Cathepsins in Cancer Progression and Drug Resistance. Int J Mol Sci. 2019 Jul 23;20(14):3602. doi: 10.3390/ijms20143602. PMID: 31340550; PMCID: PMC6678516]. Although the expression of cathepsin S in tissues is relatively limited, it has been noted that it is expressed under the influence of a number of physiological conditions associated with hypoxia at the site of the tumor or under conditions of chemotherapeutic exposure. Therefore, it may exhibit its activity as an inducible factor, which, in particular, promotes tumor development and, possibly, resistance to chemotherapy (Soond, S.M.; Savvateeva, L.V.; Makarov, V.A.; Gorokhovets, N.V.; Townsend, P.A.; Zamyatnin, A.A., Jr. Cathepsin S Cleaves BAX as a Novel and Therapeutically Important Regulatory Mechanism for Apoptosis Pharmaceutics 2021, 13, 339). In addition, it was found that the expression of cathepsin S contributes to the development of cardiovascular diseases of atherosclerotic origin [Wu H, Du Q, Dai Q, Ge J, Cheng X. Cysteine Protease Cathepsins in Atherosclerotic Cardiovascular Diseases. J Atheroscler Thromb. 2018
Из уровня техники известны цитотоксические средства, в частности, Таксол и его терапевтические аналоги [Wang LG, Liu XM, Kreis W, Budman DR. The effect of antimicrotubule agents on signal transduction pathways of apoptosis: a review. Cancer Chemother Pharmacol. 1999;44(5):355-61. doi: 10.1007/s002800050989. PMID: 10501907; Weaver BA. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 2014 Sep 15;25(18):2677-81. doi: 10.1091/mbc.E14-04-0916. PMID: 25213191; PMCID: PMC4161504; Martins I, Raza SQ, Voisin L, Dakhli H, Allouch A, Law F, Sabino D, De Jong D, Thoreau M, Mintet E, Dugué D, Piacentini M, Gougeon ML, Jaulin F, Bertrand P, Brenner C, Ojcius DM, Kroemer G, Modjtahedi N, Deutsch E, Perfettini JL. Anticancer chemotherapy and radiotherapy trigger both non-cell-autonomous and cell-autonomous death. Cell Death Dis. 2018 Jun 18;9(7):716. doi: 10.1038/s41419-018-0747-y. PMID: 29915308; PMCID: PMC6006149], которые действуют путем ингибирования деполимеризации тубулина и таким образом вызывают остановку цикла ряда быстро пролиферирующих раковых клеток и последующую гибель клеток путем апоптоза. Однако некоторые клетки могут проявлять устойчивость к вызывающим гибель свойствам таких соединений, и эта устойчивость обычно связана с поздними стадиями рака, которые обладают повышенной способностью к метастазированию опухоли [Einzig AI, Gorowski E, Sasloff J, Wiernik PH. Phase II trial of taxol in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Invest. 1991; 9(2):133-6. doi: 10.3109/07357909109044223. PMID: 1677827; Sangrajrang S, Fellous A. Taxol resistance. Chemotherapy. 2000 Sep-Oct; 46(5):327-34. doi: 10.1159/000007306. PMID: 10965098].The prior art known cytotoxic agents, in particular, Taxol and its therapeutic analogues [Wang LG, Liu XM, Kreis W, Budman DR. The effect of antimicrotubule agents on signal transduction pathways of apoptosis: a review. Cancer Chemother Pharmacol. 1999;44(5):355-61. doi: 10.1007/s002800050989. PMID: 10501907; Weaver BA. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 2014
Для поиска потенциальных катепсин-специфических антагонистов, которые могут быть особенно перспективными для лечения рака, определяют различные пептидные последовательности, на основе которых возможна разработка терапевтических средств [Rudzińska M, Parodi A, Maslova VD, Efremov YM, Gorokhovets NV, Makarov VA, Popkov VA, Golovin AV, Zernii EY, Zamyatnin AA. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers (Basel). 2020 May 21; 12(5):1310. doi: 10.3390/cancers12051310. PMID: 32455715; PMCID: PMC7281206, Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019 Jun 11;12(2):87. doi: 10.3390/ph12020087. PMID: 31212661; PMCID: PMC6630828]. В целом, с учетом последних достижений в определении сайтов расщепления субстрата с использованием скрининга пептидных библиотек, появилась более четкая картина механизмов регуляции ингибиторами специфичности и степени взаимодействия катепсин-субстрат. Так, недавно описаны синтетические пептиды (производные фторметилкетонов или хлорметилкетонов тетрапептидов структуры R1-pept-R2, где PEPT - одна из аминокислотных последовательностей: PLVE, VLPE; R1 - одна из защитных групп: ацетильная (Ac), бензилоксикарбонильная (Z) или отсутствует; R2 - производные фторметилкетона (FMK) или хлорметилкетона (CMK)), обладающие высокой аффинностью к каталитической триаде цистеиновых катепсинов и способностью специфически ингибировать протеолитическую активность цистеиновых катепсинов [Rudzińska, M.; Parodi, A.; Maslova, V.D.; Efremov, Y.M.; Gorokhovets, N.V.; Makarov, V.A.; Popkov, V.A.; Golovin, A.V.; Zernii, E.Y.; Zamyatnin , A.A. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers 2020, 12 (5), 1310].To search for potential cathepsin-specific antagonists that may be particularly promising for cancer treatment, various peptide sequences are determined, on the basis of which the development of therapeutic agents is possible [Rudzińska M, Parodi A, Maslova VD, Efremov YM, Gorokhovets NV, Makarov VA, Popkov VA , Golovin AV, Zernii EY, Zamyatnin AA. Cysteine Cathepsins Inhibition Affects Their Expression and Human Renal Cancer Cell Phenotype. Cancers (Basel). 2020 May 21; 12(5):1310. doi: 10.3390/cancers12051310. PMID: 32455715; PMCID: PMC7281206, Soond SM, Kozhevnikova MV, Townsend PA, Zamyatnin AA Jr. Cysteine Cathepsin Protease Inhibition: An update on its Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Potential in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 2019
Катепсины играют взаимоисключающую роль в развитии, так катепсин S опосредует дифференцировку ассоциированных с опухолью макрофагов M1-M2, в то время как катепсин C требуется для дифференцировки нейтрофилов, индуцированной опухолью N1-N2 [Yang M, Liu J, Shao J, Qin Y, Ji Q, Zhang X, Du J. Cathepsin S-mediated autophagic flux in tumor-associated macrophages accelerate tumor development by promoting M2 polarization. Mol Cancer. 2014 Mar 2;13:43. doi: 10.1186/1476-4598-13-43. PMID: 24580730; PMCID: PMC4015740]. Следовательно, нацеливание на конкретные субстраты с целью блокирования их способности воздействовать на катепсины может представлять альтернативный подход.Cathepsins play a mutually exclusive role in development, as cathepsin S mediates tumor-associated M1-M2 macrophage differentiation, while cathepsin C is required for tumor-induced N1-N2 differentiation of neutrophils [Yang M, Liu J, Shao J, Qin Y, Ji Q, Zhang X, Du J. Cathepsin S-mediated autophagic flux in tumor-associated macrophages accelerate tumor development by promoting M2 polarization. Mol Cancer. 2014
Наиболее близкими к заявляемым пептидам являются «BH-3 миметики» [Merino D, Kelly GL, Lessene G, Wei AH, Roberts AW, Strasser A. BH3-Mimetic Drugs: Blazing the Trail for New Cancer Medicines. Cancer Cell. 2018 Dec 10;34(6):879-891. doi: 10.1016/j.ccell.2018.11.004. PMID: 30537511; Walensky LD. Targeting BAX to drug death directly. Nat Chem Biol. 2019 Jul; 15(7):657-665. doi: 10.1038/s41589-019-0306-6. Epub 2019 Jun 17. PMID: 31209350], где пептидные терапевтические антагонисты определяются из белковых областей взаимодействия между проапоптотическими и антиапоптотическими BH3-домен-содержащими белками. Например, терапевтический агент ABT-199 нарушает ингибирующую активность Bcl-2 с белком BAX для лечения лейкоза, тем самым позволяя BAX олигомеризоваться и индуцировать проницаемость митохондриальной внешней мембраны (MOMP) и гибель клеток через активацию внутреннего пути апоптоза [Souers AJ, Leverson JD, Boghaert ER, Ackler SL, Catron ND, Chen J, Dayton BD, Ding H, Enschede SH, Fairbrother WJ, Huang DC, Hymowitz SG, Jin S, Khaw SL, Kovar PJ, Lam LT, Lee J, Maecker HL, Marsh KC, Mason KD, Mitten MJ, Nimmer PM, Oleksijew A, Park CH, Park CM, Phillips DC, Roberts AW, Sampath D, Seymour JF, Smith ML, Sullivan GM, Tahir SK, Tse C, Wendt MD, Xiao Y, Xue JC, Zhang H, Humerickhouse RA, Rosenberg SH, Elmore SW. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 2013 Feb; 19(2):202-8. doi: 10.1038/nm.3048. Epub 2013 Jan 6. PMID: 23291630].Closest to the claimed peptides are "BH-3 mimetics" [Merino D, Kelly GL, Lessene G, Wei AH, Roberts AW, Strasser A. BH3-Mimetic Drugs: Blazing the Trail for New Cancer Medicines. cancer cell. 2018
Однако ABT-199 как селективный ингибитор BCL-2 является доказанно эффективным только в отношении гематологических злокачественных опухолей, тогда как ингибирование определенных катепсинов, расщепляющих проапоптотические белки, например, BAX, могут индуцировать гибель злокачественных клеток различного типа и с наибольшим эффектом.However, ABT-199, as a selective inhibitor of BCL-2, is proven effective only against hematological malignancies, while inhibition of certain cathepsins that cleave proapoptotic proteins, such as BAX, can induce the death of malignant cells of various types and with the greatest effect.
В последнее время возник большой интерес к идентификации катепсинов, способных расщеплять и дезактивировать проапоптотические BH3-белки, с целью выявления тех ферментов, на которые можно будет терапевтически воздействовать. Некоторые катепсины могут расщеплять цитоплазматические -BAX, -BID, -Bcl-xl и -Mcl-xl [Cao X, Deng X, May WS. Cleavage of Bax to p18 Bax accelerates stress-induced apoptosis, and a cathepsin-like protease may rapidly degrade p18 Bax. Blood. 2003 Oct 1;102(7):2605-14. doi: 10.1182/blood-2003-01-0211. Epub 2003 Jun 19. PMID: 12816867; Appelqvist H, Johansson AC, Linderoth E, Johansson U, Antonsson B, Steinfeld R, Kågedal K, Ollinger K. Lysosome-mediated apoptosis is associated with cathepsin D-specific processing of bid at Phe24, Trp48, and Phe183. Ann Clin Lab Sci. 2012 Summer;42(3):231-42. PMID: 22964611; Cirman T, Oresić K, Mazovec GD, Turk V, Reed JC, Myers RM, Salvesen GS, Turk B. Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. J Biol Chem. 2004 Jan 30;279(5):3578-87. doi: 10.1074/jbc.M308347200. Epub 2003 Oct 27. PMID: 14581476; Cirman T, Oresić K, Mazovec GD, Turk V, Reed JC, Myers RM, Salvesen GS, Turk B. Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. J Biol Chem. 2004 Jan 30; 279(5):3578-87. doi: 10.1074/jbc.M308347200. Epub 2003 Oct 27. PMID: 14581476]. Поэтому необходимо обеспечить стабилизацию проапоптотических BH3-белков (таких как BAX) посредством ингибирования катепсина, позволяя этим BH3-белкам вызывать апоптоз в отсутствие ингибирующего действия антиапоптотических BH3-белков (таких как Bcl-xl). Как правило для этого может потребоваться разработка, по крайней мере, двух различных терапевтических средств, где первый агент должен быть нацелен на катепсин (что позволяет стабилизировать BAX), второй - на BAX (или Bcl-2 / Bcl-xl), тем самым нарушая их ингибирующее взаимодействие и позволяя преобладать проапоптотической активности BAX. Хотя этот подход действительно имеет хороший потенциал для индивидуального нацеливания белок-связывающих партнеров, недостатки заключаются в том, что такой подход потребует значительного количества времени для определения эффективности отдельных терапевтических средств и того, насколько эффективным может быть каждый из них при совместном действии. Следовательно, необходимо изучить альтернативные стратегии для разработки схемы, в которой может быть осуществлено нацеливание не только на катепсин, но и его производные проапоптотические субстраты (путем отделения его от антиапоптотического регулятора), которые в совокупности являются важными посредниками в гибели раковых клеток через апоптоз.Recently, there has been great interest in identifying cathepsins capable of cleaving and inactivating proapoptotic BH3 proteins in order to identify those enzymes that can be therapeutically affected. Some cathepsins can cleave cytoplasmic -BAX, -BID, -Bcl-xl and -Mcl-xl [Cao X, Deng X, May WS. Cleavage of Bax to p18 Bax accelerates stress-induced apoptosis, and a cathepsin-like protease may rapidly degrade p18 Bax. Blood. 2003
Технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является создание новых пептидных последовательностей, способных индуцировать апоптоз в опухолевой клетке, а также ингибировать функциональную (протеолитическую) активность катепсина S, с перспективой использования в разработке противоопухолевых терапевтических средств.The technical problem to be solved by the invention is the creation of new peptide sequences capable of inducing apoptosis in a tumor cell, as well as inhibiting the functional (proteolytic) activity of cathepsin S, with the prospect of using it in the development of antitumor therapeutic agents.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Техническим результатом изобретения является создание специфических пептидов (пептидных соединений), способных подавлять активность катепсина S и индуцировать апоптоз за счет ингибирования взаимодействия ингибиторного белка Bcl-xl (или Bcl-2) с BAX, стабилизирования мономерного BAX, а также ингибирования катепсин S-опосредованный протеолиз полиубиквитинированного производного BAX (p120BAX).The technical result of the invention is the creation of specific peptides (peptide compounds) capable of inhibiting the activity of cathepsin S and inducing apoptosis by inhibiting the interaction of inhibitory protein Bcl-xl (or Bcl-2) with BAX, stabilizing monomeric BAX, and inhibiting cathepsin S-mediated proteolysis polyubiquitinated derivative of BAX (p120BAX).
Технический результат достигается за счет синтеза специфического пептидного соединения, содержащего последовательность, выбранную из проапоптотических BH3-домен-содержащих белков, характеризующегося способностью индуцировать апоптоз в опухолевой клетке.The technical result is achieved through the synthesis of a specific peptide compound containing a sequence selected from proapoptotic BH3-domain-containing proteins, characterized by the ability to induce apoptosis in a tumor cell.
В одном из частных вариантов реализации изобретения пептидное соединение содержит аминокислотную последовательность FFSFGGAL или аминокислотную последовательность, имеющую гомологичность по меньшей мере 50% с данной последовательностью. В другом частном варианте реализации изобретения пептидное соединение содержит аминокислотную последовательность WFGFTGSL или аминокислотную последовательность, имеющую гомологичность с ней по меньшей мере 50%, например, аминокислотную последовательность KLNRRWWFGFTGSL.In one particular embodiment of the invention, the peptide compound contains the amino acid sequence FFSFGGAL or an amino acid sequence having at least 50% homology with this sequence. In another particular embodiment of the invention, the peptide compound contains the amino acid sequence WFGFTGSL or an amino acid sequence having at least 50% homology with it, for example, the amino acid sequence KLNRRWWFGFTGSL.
Изобретение также включает фармацевтическую композицию для индукции апоптоза в опухолевой клетке, содержащую указанное пептидное соединение и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, изобретение относится к применению указанного пептидного соединения для индукции апоптоза в опухолевой клетке и приготовлению лекарственного средства, вызывающего индукцию апоптоза в опухолевой клетке.The invention also includes a pharmaceutical composition for inducing apoptosis in a tumor cell, containing said peptide compound and a pharmaceutically acceptable carrier. In addition, the invention relates to the use of said peptide compound for the induction of apoptosis in a tumor cell and the preparation of a drug that causes the induction of apoptosis in a tumor cell.
Заявляемые соединения могут воздействовать не только на катепсин S, но и на его последующий проапоптотический / антиапоптотический белковый комплекс-мишень, т.е. являются едиными терапевтическими агентами, обладающими двойной специфичностью. Главное преимущество такого агента (агентов) состоит в том, что он обладает способностью специфически воздействовать на более чем один белковый промежуточный продукт как часть главного регуляторного белкового комплекса, специфичного для пути передачи сигналов, имеющего ключевое значение для развития и прогрессирования рака.The claimed compounds can act not only on cathepsin S, but also on its subsequent pro-apoptotic / anti-apoptotic target protein complex, i.e. are single therapeutic agents with dual specificity. The main advantage of such agent(s) is that it has the ability to specifically target more than one protein intermediate as part of a major regulatory protein complex specific for a signaling pathway that is key to cancer development and progression.
Частные варианты пептидов, являющихся производными от Pit2 и имеющих последовательности FFSFGGAL (далее CS-PEP1), WFGFTGSL (CS-PEP3); KLNRRWWFGFTGSL (CS-PEP4), а также пептидные производные последовательностей BH3-домен-содержащих белков подходят для любого терапевтического применения, которое включает действие катепсина S (или других катепсинов), проапоптотические белки, содержащие BH3-домен, или антиапоптотические белки, содержащие BH3-домен, ответственные за регуляцию апоптоза (Фиг. 1).Private variants of peptides derived from Pit2 and having the sequences FFSFGGAL (hereinafter CS-PEP1), WFGFTGSL (CS-PEP3); KLNRRWWFGFTGSL (CS-PEP4), as well as peptide derivatives of sequences of BH3-domain-containing proteins, are suitable for any therapeutic application that involves the action of cathepsin S (or other cathepsins), pro-apoptotic proteins containing the BH3-domain, or anti-apoptotic proteins containing BH3- domain responsible for the regulation of apoptosis (Fig. 1).
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Изобретение поясняется иллюстрациями, где на Фиг. 1 представлена схема ингибирующего действия заявляемых пептидов (желтый круг). LMP- проницаемость лизосомальной мембраны; MOMP - проницаемость наружной мембраны митохондрий.The invention is illustrated by illustrations, where in Fig. 1 shows a diagram of the inhibitory action of the claimed peptides (yellow circle). LMP - lysosomal membrane permeability; MOMP is the permeability of the outer mitochondrial membrane.
На Фиг.2 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что катепсин S опосредует расщепление BAX in vitro и в клетках млекопитающих.Figure 2 presents experimental data demonstrating that cathepsin S mediates the cleavage of BAX in vitro and in mammalian cells.
На Фиг.3 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-PEP1 ингибирует опосредованное катепсином S расщепление BAX in vitro.Figure 3 presents experimental data demonstrating that CS-PEP1 inhibits cathepsin S-mediated BAX cleavage in vitro.
На Фиг.4 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-PEP1 ингибирует расщепление Bcl-xl, но дестабилизирует его in vitro и в клетках млекопитающих.Figure 4 presents experimental data demonstrating that CS-PEP1 inhibits Bcl-xl cleavage but destabilizes it in vitro and in mammalian cells.
На Фиг.5 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-PEP1 стабилизирует белок BAX при экспрессии катепсина S.Figure 5 presents experimental data demonstrating that CS-PEP1 stabilizes the BAX protein when cathepsin S is expressed.
На Фиг.6 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-PEP1, 3 и 4 стабилизируют уровни эндогенного белка BAX, тогда как CS-PEP1 и 3 - дополнительно стабилизируют уровень эндогенного белка BAX в присутствии экспрессии катепсина.Figure 6 presents experimental data demonstrating that CS-PEP1, 3 and 4 stabilize endogenous BAX protein levels, while CS-PEP1 and 3 further stabilize endogenous BAX protein levels in the presence of cathepsin expression.
На Фиг.7 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что обработка клеток CS-PEP1 ингибирует опосредованное катепсином S расщепление полиубиквитинированного производного p120BAX BAX.Figure 7 presents experimental data demonstrating that treatment of cells with CS-PEP1 inhibits cathepsin S-mediated cleavage of the polyubiquitinated p120BAX BAX derivative.
На Фиг. 8 представлены экспериментальные данные, демонстрирующие, что CS-PEP1 вызывает апоптоз и активацию каспазы-3.On FIG. 8 shows experimental data demonstrating that CS-PEP1 induces apoptosis and caspase-3 activation.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Ниже представлено более детальное описание реализации заявляемого изобретения, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.Below is a more detailed description of the implementation of the claimed invention, which does not limit the scope of the claims of the claimed invention, but demonstrates the possibility of carrying out the invention with the achievement of the claimed technical result.
Изобретение иллюстрируется с использованием пептидных соединений CS-PEP1, 3, 4, имеющих последовательности FFSFGGAL, WFGFTGSL, KLNRRWWFGFTGSL соответственно.The invention is illustrated using the CS-PEP1, 3, 4 peptide compounds having the sequences FFSFGGAL, WFGFTGSL, KLNRRWWFGFTGSL, respectively.
Исходно было определено, что проапоптотический белок BAX и антиапоптотический белок Bcl-xl являются субстратами для катепсина S. Катепсины также могут регулироваться белками-ингибиторами (цистатинами) человека, которые предотвращают чрезмерную активацию нежелательной протеолитической активности катепсинов [Turk V, Stoka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208].Initially, the pro-apoptotic BAX protein and the anti-apoptotic Bcl-xl protein were found to be substrates for cathepsin S. Cathepsins can also be regulated by human inhibitor proteins (cystatins) that prevent excessive activation of the unwanted proteolytic activity of cathepsins [Turk V, Stoka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B, Turk D. Cysteine cathepsins: from structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002. Epub 2011 Oct 12. PMID: 22024571; PMCID: PMC7105208].
Была идентифицирована пептидная область, которая берет свое начало от ингибитора протеиназы, имеющего сходство с антиапоптотическим белком Bcl-xl. Для этой цели был использован растительный белок-ингибитор папаин-подобных протеиназ с последовательностью Pit2 [Misas Villamil JC, Mueller AN, Demir F, Meyer U, Ökmen B, Schulze Hüynck J, Breuer M, Dauben H, Win J, Huesgen PF, Doehlemann G. A fungal substrate mimicking molecule suppresses plant immunity via an inter-kingdom conserved motif. Nat Commun. 2019 Apr 5;10(1):1576. doi: 10.1038/s41467-019-09472-8. PMID: 30952847; PMCID: PMC6450895]. С использованием платформы BLAST при поиске по базе данных NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome), параметры поиска: expected threshold=10, Matrix BLOSUM45, Gap Costs Existence 15; Extensions:2), был идентифицирован ряд пептидов из аминокислотной последовательности ингибитора Pit2, которые также присутствуют практически со 100% идентичностью в α-5 спиральной петле Bcl-xl (и имеют последовательности FFSFGGAL (обозначен CS-PEP1); WFGFTGSL (обозначен CS-PEP3); KLNRRWWFGFTGSL (обозначен CS-PEP4)). Эта петля α-5 антиапоптотического белка Bcl-xl взаимодействует с BH3 доменом проапоптотического BAX и это взаимодействие является ключевым этапом, ответственным за Bcl-xl-опосредованное ингибирование белка BAX во время активации апоптоза [Renault TT, Dejean LM, Manon S. A brewing understanding of the regulation of Bax function by Bcl-xL and Bcl-2. Mech Ageing Dev. 2017 Jan; 161(Pt B):201-210. doi: 10.1016/j.mad.2016.04.007. Epub 2016 Apr 23. PMID: 27112371].A peptide region has been identified that originates from a proteinase inhibitor that shares similarities with the anti-apoptotic protein Bcl-xl. For this purpose, a plant protein inhibitor of papain-like proteinases with the Pit2 sequence was used [Misas Villamil JC, Mueller AN, Demir F, Meyer U, Ökmen B, Schulze Hüynck J, Breuer M, Dauben H, Win J, Huesgen PF, Doehlemann G. A fungal substrate mimicking molecule suppresses plant immunity via an inter-kingdom conserved motif. NatCommun. 2019
Пептиды были синтезированы компанией Peptech Inc (Санкт-Петербург, Российская Федерация) методом твердофазного пептидного синтеза, при котором пептиды получают путем соединения различных аминокислот друг с другом с последующей химической модификацией для введения функциональных групп. Способы химического синтеза пептидов широко известны и хорошо описаны с помощью известных в данной области техники методов [US 6015881; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, cc.4005-4008; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, cc.4009-4012; Peptides, Chemistry and Biology, под ред. Kamber и др., изд-во ESCOM, Leiden, 1992, cc.525-526; Riniker и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc.9307-9320; Lloyd-Williams и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc.11065-11133, и Andersson и др., Biopolymers 55, 2000, cc.227-250]. Чистоту продукта определяли, используя MALDI-TOF, после чего пептиды лиофилизировали для коммерческого использования.The peptides were synthesized by Peptech Inc (St. Petersburg, Russian Federation) by solid-phase peptide synthesis, in which peptides are obtained by combining various amino acids with each other, followed by chemical modification to introduce functional groups. Methods for the chemical synthesis of peptides are widely known and well described using methods known in the art [US 6015881; Mergler et al., Tetrahedron Letters 29, 1988, pp. 4005-4008; Mergler et al., Tetrahedron Letters 29, 1988, pp. 4009-4012; Peptides, Chemistry and Biology, ed. Kamber et al., ESCOM, Leiden, 1992, pp. 525-526; Riniker et al., Tetrahedron Letters 49, 1993, pp. 9307-9320; Lloyd-Williams et al., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc. 11065-11133, and Andersson et al.,
Для работы с любым из указанных пептидов был приготовлен 10 мМ стоковый раствор пептида в диметилсульфоксиде (ДМСО, со степенью чистоты, пригодной для работы с клеточными культурами (Sigma)), который хранили при 4°С. Последующие разведения выполняли в ДМСО и непосредственно использовали для обработки клеточных линий, выращенных на специальных культуральных средах in vitro, или для добавления к катепсину S в экспериментах по расщеплению белков BAX / Bcl-xl in vitro при значениях pH 5 или 7.To work with any of these peptides, a 10 mM stock solution of the peptide in dimethyl sulfoxide (DMSO, cell culture grade (Sigma)) was prepared and stored at 4°C. Subsequent dilutions were made in DMSO and used directly to treat cell lines grown on special in vitro culture media or to add to cathepsin S in in vitro BAX/Bcl-xl protein digestion experiments at
Свойства заявляемых пептидов оценивали in vitro биохимическими методами и на опухолевых линиях клеток.The properties of the claimed peptides were evaluated in vitro by biochemical methods and on tumor cell lines.
Помимо BAX среди проаптотических BH3-домен-содержащих белков могут быть использованы Bak, Mtd/Bok, Bcl-xS [Kelekar A, Thompson CB. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis. Trends Cell Biol. 1998 Aug; 8(8):324-30. doi: 10.1016/s0962-8924(98)01321-x. PMID: 9704409]. Кроме того, представленные пептидные последовательности могут иметь некоторые аминокислотные замены, не приводящие к существенным изменениям физико-химических свойств и проверенных с использованием молекулярного докинга (например, серин/треонин, аланин/валин/лейцин, изолейцин, серин/треонин, лизин/аргинин, аспарагин/глутамин и др.).In addition to BAX, Bak, Mtd/Bok, Bcl-x S [Kelekar A, Thompson CB. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis. Trends Cell Biol. 1998 Aug; 8(8):324-30. doi: 10.1016/s0962-8924(98)01321-x. PMID: 9704409]. In addition, the presented peptide sequences may have some amino acid substitutions that do not lead to significant changes in physicochemical properties and are verified using molecular docking (for example, serine/threonine, alanine/valine/leucine, isoleucine, serine/threonine, lysine/arginine, asparagine/glutamine, etc.).
Изобретение также включает фармацевтические композиции, в которых использованы пептиды CS-PEP1, 3, 4, имеющие последовательности FFSFGGAL, WFGFTGSL, KLNRRWWFGFTGSL или пептиды, имеющие аминокислотные последовательности с гомологичностью по меньшей мере 50% CS-PEP1, 3, 4, или пептиды, имеющие аминокислотные замены в последовательностях CS-PEP1, 3, 4, существенно не влияющие на свойства пептидов. Фармацевтические композиции могут быть применены в отношении заболеваний и нарушений, связанных с нарушенной экспрессией катепсина S и/или белками семейства BCL-2.The invention also includes pharmaceutical compositions using CS-PEP1, 3, 4 peptides having the sequences FFSFGGAL, WFGFTGSL, KLNRRWWFGFTGSL or peptides having amino acid sequences with at least 50% homology to CS-PEP1, 3, 4, or peptides having amino acid substitutions in the CS-PEP1, 3, 4 sequences that do not significantly affect the properties of the peptides. Pharmaceutical compositions can be used in relation to diseases and disorders associated with impaired expression of cathepsin S and/or proteins of the BCL-2 family.
Фармацевтическая композиция включает пептид CS-PEP1 (или 3, или 4), или их модификации с 50% гомологичностью или заменами аминокислот и любой известный из уровня техники фармацевтически приемлемый носитель в виде инертного нетоксичного материала, который не реагирует с активным ингредиентом, а также обеспечивает доставку и проникновение активного ингредиента в целевую ткань. Носитель подбирают по физико-химическим параметрам (растворимость, реакционная способность по отношению к пептидам, способ и условия введения состава).The pharmaceutical composition includes a CS-PEP1 peptide (or 3 or 4), or modifications thereof with 50% homology or amino acid substitutions, and any pharmaceutically acceptable carrier known from the prior art in the form of an inert non-toxic material that does not react with the active ingredient, and also provides delivery and penetration of the active ingredient into the target tissue. The carrier is selected according to physicochemical parameters (solubility, reactivity with respect to peptides, method and conditions for introducing the composition).
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, демонстрирующими возможность достижения требуемого технического результата.The present invention is illustrated by specific examples of implementation, demonstrating the possibility of achieving the desired technical result.
Пример 1. Определение способности катепсина S расщеплять BAX in vitro и в клетках (Фиг. 2А)Example 1 Determination of the ability of cathepsin S to cleave BAX in vitro and in cells (Fig. 2A)
В настоящее время механизмы регуляции катепсина S (CS) при расщеплении BAX неизвестны. Чтобы выявить эту взаимосвязь, рекомбинантный (полученный из E.coli) биологически активный CS был коинкубирован с очищенным белком BAX (Abcam) и наблюдали дозозависимое расщепление BAX (Фиг. 2А). Равные количества экспрессируемого бактериями белка ВАХ p21 подвергали действию активного CS при pH7, и анализировали реакцию расщепления ВАХ путем вестерн-блоттинга с использованием антител против ВАХ (Abcam). Фильтры были затем исследованы для обнаружения CS (нижние панели, SCB). Клетки 769P и HEK293 котрансфицировали pBAX-HA и плазмидами экспрессии pCS-FLAG (в возрастающих дозах, μg) в течение 24 часов, предварительно стимулированных носителем (левые панели) или 2 мкМ сирамезином (правые панели) в течение 1 часа; далее в клеточных экстрактах анализировали уровни экспрессии p21 BAX, CS и актина. В этом случае также наблюдали дозозависимое расщепление BAX (Фиг. 2 B и C). Уровни белка p21 BAX анализировали в условиях стимуляции циклогексимидом (Фиг. 2 D) после того, как клетки в течение 24 часов трансфицировали только pBAX-HA (0,25 мкг) или pCS-FLAG (0,75 мкг). Уровни экспрессии p21 BAX были количественно определены, стандартизованы для уровней экспрессии актина в клетках, стимулированных при Т = 0 ч до Т = 6 ч. Синяя и красная кривые показывают уровни p21 BAX или p21 BAX при коэкспрессии с CS (соответственно), а линии тренда показаны черным. Таким образом дестабилизирующие эффекты экспрессии CS-flag на BAX-HA были также подтверждены на клетках млекопитающих, где период полужизни белка BAX-HA был значительно снижен по сравнению с экспрессией только BAX (Фиг 2. D, график).At present, the mechanisms of regulation of cathepsin S (CS) during BAX cleavage are unknown. To reveal this relationship, recombinant (E. coli-derived) biologically active CS was co-incubated with purified BAX protein (Abcam) and a dose-dependent cleavage of BAX was observed (FIG. 2A). Equal amounts of bacterially expressed BAX p21 protein were exposed to active CS at pH7, and the BAX cleavage reaction was analyzed by Western blotting using anti-BAX antibodies (Abcam). The filters were then examined for CS detection (lower panels, SCB). 769P and HEK293 cells were co-transfected with pBAX-HA and pCS-FLAG expression plasmids (at increasing doses, μg) for 24 hours, pre-stimulated with vehicle (left panels) or 2 μM siramesine (right panels) for 1 hour; further, the expression levels of p21 BAX, CS, and actin were analyzed in cell extracts. In this case, a dose-dependent cleavage of BAX was also observed (FIG. 2 B and C). p21 BAX protein levels were analyzed under cycloheximide stimulation conditions (FIG. 2D) after cells were transfected for 24 hours with pBAX-HA (0.25 μg) or pCS-FLAG (0.75 μg) alone. p21 BAX expression levels were quantified, standardized for actin expression levels in cells stimulated at T = 0 h to T = 6 h. Blue and red curves show p21 BAX or p21 BAX levels when co-expressed with CS (respectively) shown in black. Thus, the destabilizing effects of CS-flag expression on BAX-HA were also confirmed in mammalian cells, where the half-life of the BAX-HA protein was significantly reduced compared to expression of BAX alone (Fig. 2.D, graph).
Как видно из Фиг. 2, экспрессия CS приводит к разрушению белка BAX in vitro и в клетках млекопитающих.As can be seen from FIG. 2, CS expression results in the degradation of the BAX protein in vitro and in mammalian cells.
Пример 2. Оценка ингибирующей активности CS-PEP1 в отношении опосредованного катепсином S расщепления BAX in vitro (Фиг. 3 A)Example 2 Evaluation of the inhibitory activity of CS-PEP1 on cathepsin S-mediated BAX cleavage in vitro (FIG. 3A)
Для того чтобы оценить ингибирующую активность CS-PEP1 в отношении CS-опосредованного расщепления BAX, совместно инкубировали иммунопреципитированный белок BAX-HA, полученный из клеток млекопитающих (Фиг. 3А) или бактериально экспрессированный BAX (Фиг. 3 B) с активным CS и уменьшающимися дозами ингибитора CS-PEP1. Равные количества иммунопреципитированного белка BAX-HA p21, полученного из 0,25 мкг экспрессии BAX-HA в клетках HEK293, подвергали действию активного CS с уменьшающимся количеством CS-PEP1 при pH 7, а продукты расщепления p21 BAX (или CS) детектировали с помощью вестерн-блоттинга с антителами против BAX (Abcam) или CS (SCB, верхняя и средняя панель). Уровни субстрата p21 BAX были определены количественно, стандартизованы относительно BAX (дорожка 2) и отображены на нижней панели (Фиг. 3 B). Реакции расщепления BAX при pH 7 инкубировали в присутствии уменьшающихся доз CS-PEP1, и реакции анализировали по продуктам расщепления p21 BAX (верхняя панель) и уровню CS (средняя панель) с использованием анти-BAX (Abcam) или антитела против CS (SCB). Уровни субстрата p21 BAX были определены количественно, стандартизованы относительно BAX (дорожка 2) и отображены на нижней панели. Количественные данные представлены как ± SEM, и их значимость (где p <0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001). Реакция расщепления p21 BAX может быть значительно замедлена в присутствии 10 мкМ-100 нМ CS-PEP1 или 10 мкМ-1 мМ CS-PEP1 для p21 BAX и BAX соответственно in vitroIn order to assess the inhibitory activity of CS-PEP1 against CS-mediated BAX cleavage, mammalian-derived immunoprecipitated BAX-HA protein (Fig. 3A) or bacterially expressed BAX (Fig. 3B) was co-incubated with active CS and decreasing doses inhibitor of CS-PEP1. Equal amounts of immunoprecipitated p21 BAX-HA protein derived from 0.25 μg BAX-HA expression in HEK293 cells were exposed to active CS with decreasing amounts of CS-PEP1 at
Как видно из Фиг. 3, CS-PEP1 ингибирует опосредованное катепсином S расщепление BAX.As can be seen from FIG. 3, CS-PEP1 inhibits cathepsin S-mediated BAX cleavage.
Пример 3. Определение способности CS-PEP1 расщеплять и дестабилизировать Bcl-xl in vitro и в клетках млекопитающих (Фиг. 4 A)Example 3 Determination of the ability of CS-PEP1 to cleave and destabilize Bcl-xl in vitro and in mammalian cells (Fig. 4A)
Анализы CS-опосредованного расщепления Bcl-xl in vitro проводили при pH 7 и 5 (верхняя панель) с использованием GST-Bcl-xl в качестве субстрата в присутствии 10 мкМ CS-PEP1 (или носителя). Уровни субстрата определяли количественно, как показано на нижней панели (белые столбцы с pH 7 и черные столбцы с pH 5), а продукты расщепления определяли с помощью окрашивания кумасси синим (Фиг. 4 B). Клетки HEK293 стимулировали уменьшающимися дозами CS-PEP1 в присутствии носителя или 5 мкг / мл Pac в течение 24 часов и анализировали на p21 BAX (Abcam), Caspase-3 (Abcam), Bcl-xl (Abcam), CS (Invitrogen) и актина (Abcam) экспрессии. Количественные данные представлены как + SEM, и их значимость (где p <0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001).In vitro CS-mediated Bcl-xl cleavage assays were performed at
Как видно из Фиг. 4, CS-PEP1 проявляет ингибирующую активность в отношении CS-опосредованного расщепления Bcl-xl in vitro при pH 7 (Фиг. 4А, дорожка 8) значительно лучше, чем при pH 5 (Фиг. 4А, дорожка 7). Уровни эндогенного белка Bcl-xl также оставались дестабилизированными в клетках HEK293 при совместной обработке клеток паклитакселом и 50 мкМ-10 нМ, что позволяет предположить, что CS-PEP1 может препятствовать стабилизации Bcl-xl в присутствии обычных химиотерапевтических препаратов, которые демонстрируют низкую эффективность в уничтожении клеток рака почки.As can be seen from FIG. 4, CS-PEP1 exhibits inhibitory activity against CS-mediated Bcl-xl cleavage in vitro at pH 7 (FIG. 4A, lane 8) significantly better than at pH 5 (FIG. 4A, lane 7). Endogenous Bcl-xl protein levels also remained destabilized in HEK293 cells when cells were co-treated with paclitaxel and 50 μM-10 nM, suggesting that CS-PEP1 may interfere with the stabilization of Bcl-xl in the presence of conventional chemotherapeutic drugs that show poor killing efficacy. kidney cancer cells.
Пример 4. Определение способности CS-PEP1 стабилизировать белок BAX при экспрессии катепсина S (Фиг. 5 A)Example 4 Determination of the ability of CS-PEP1 to stabilize the BAX protein when cathepsin S is expressed (Fig. 5A)
Клетки 769P совместно стимулировали носителем или 5 мкг / мл Pac, 10 мкМ zVAD-fmk и 10 мкМ CS-PEP1 в течение 24 часов. Растворимые WCL анализировали на экспрессию эндогенного p21 BAX (Abcam), CS (Abcam) и актина (Abcam). Уровни белка p21 BAX были определены количественно, стандартизованы для экспрессии актина и представлены черными полосами как кратные изменения по сравнению с стимуляциями одним носителем (Фиг. 5 B). Уровни эндогенного p21 BAX, CS и актина определяли в лизатах клеток HEK293 с помощью вестерн-блоттинга после 24 часов совместной стимуляции Pac (5 мкг / мл) и CS-PEP1 (10 мкМ) (Фиг. 5 C). Клетки HEK293, котрансфицированные pBAX-HA и pCS-FLAG или pBAX-HA и pCS-C25A-FLAG, стимулировали носителем или 10 мкМ CS-PEP1 в течение 24 часов и циклогексимидом в течение следующих 6 часов. В указанные моменты времени клетки лизировали и клеточные лизаты (WCL) анализировали на p21 BAX, CS и экспрессию актина с использованием вестерн-блоттинга (Фиг. 5 D). Уровни экспрессии для p21 BAX были количественно определены, стандартизированы для актина и выражены по отношению к уровням, наблюдаемым при T = 0 час. Коэкспрессия BAX и CS в присутствии стимуляции CS-PEP1 (синий) и p21 BAX с коэкспрессией CS-C25A (красный) показаны как линии тренда (черные кривые). Количественные данные представлены как ± SEM, и их значимость (где p <0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001).769P cells were co-stimulated with vehicle or 5 μg/ml Pac, 10 μM zVAD-fmk, and 10 μM CS-PEP1 for 24 hours. Soluble WCLs were analyzed for expression of endogenous p21 BAX (Abcam), CS (Abcam) and actin (Abcam). p21 BAX protein levels were quantified, standardized for actin expression, and represented by black bars as fold changes compared to vehicle alone stimulations (FIG. 5B). Endogenous p21 BAX, CS, and actin levels were determined in HEK293 cell lysates by Western blotting after 24 hours of co-stimulation with Pac (5 μg/mL) and CS-PEP1 (10 μM) (Fig. 5C). HEK293 cells co-transfected with pBAX-HA and pCS-FLAG or pBAX-HA and pCS-C25A-FLAG were stimulated with vehicle or 10 μM CS-PEP1 for 24 hours and cycloheximide for a further 6 hours. At the indicated time points, cells were lysed and cell lysates (WCL) were analyzed for p21 BAX, CS and actin expression using Western blotting (FIG. 5D). Expression levels for p21 BAX were quantified, standardized for actin, and expressed relative to levels observed at T=0 h. BAX and CS co-expression in the presence of CS-PEP1 stimulation (blue) and p21 BAX with CS-C25A co-expression (red) are shown as trend lines (black curves). Quantitative data are presented as ± SEM and their significance (where p<0.05) is determined using a two-tailed Student's t-test (*p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001).
Наблюдался эффект CS-PEP1 в стабилизации уровней экспрессированного BAX при совместной экспрессии BAX-HA с CS (Фиг. 5А) или эндогенным белком BAX в присутствии индуцированного паклитакселом эндогенного CS (Фиг. 5В). Это было подтверждено наблюдением аналогичных уровней стабильности для BAX-HA, коэкспрессируемого с CS-C25A-Flag, и BAX-HA, коэкспрессированного с CS-Flag и обработанного CS-PEP1 (Фиг. 5С) в течение шестичасового курса, и где соответствующие периоды полураспада белков BAX были почти идентичными (Фиг. 5D).The effect of CS-PEP1 in stabilizing the levels of expressed BAX was observed when BAX-HA was coexpressed with CS (FIG. 5A) or endogenous BAX protein in the presence of paclitaxel-induced endogenous CS (FIG. 5B). This was confirmed by observing similar levels of stability for BAX-HA co-expressed with CS-C25A-Flag and BAX-HA co-expressed with CS-Flag and treated with CS-PEP1 (Fig. 5C) over a six-hour course, and where the corresponding half-lives BAX proteins were nearly identical (Figure 5D).
Аналогичным образом изучили способность CS-PEP3 и CS-PEP4 стабилизировать уровень эндогенного белка BAX в клетках, трансфицированных пустой экспрессионной плазмиды, а также плазмидами для экспрессии CS и каталитически неактивного (мутантного) CS-C25A.Similarly, the ability of CS-PEP3 and CS-PEP4 to stabilize the level of endogenous BAX protein in cells transfected with an empty expression plasmid, as well as plasmids for the expression of CS and catalytically inactive (mutant) CS-C25A, was studied.
Пример 5. CS-PEP1, 3 и 4 стабилизируют уровни эндогенного белка BAX, тогда как CS-PEP1 и 3 - дополнительно стабилизируют уровень эндогенного белка BAX в присутствии экспрессии катепсина в клетках 769P и HEK293 (Фиг. 6). Клетки 769P и HEK293 трансфицировали 1 мкг пустой экспрессионной плазмиды pcDNA3.1+, pCS-FLAG или PCS-C25A-FLAG в течение 24 часов, а затем обрабатывали 10 мкМ CS-PEPs -1, -3 или -4 еще в течение 24 часов. Клетки собирали, готовили лизаты и анализировали на предмет эндогенной экспрессии BAX (анти-BAX), катепсина S (с использованием анти-CS антител) и β-актина (анти- β -актин).Example 5 CS-PEP1, 3 and 4 stabilize endogenous BAX protein levels, while CS-PEP1 and 3 further stabilize endogenous BAX protein levels in the presence of cathepsin expression in 769P and HEK293 cells (FIG. 6). 769P and HEK293 cells were transfected with 1 μg of empty expression plasmid pcDNA3.1+, pCS-FLAG or PCS-C25A-FLAG for 24 hours and then treated with 10 μM CS-PEPs -1, -3 or -4 for an additional 24 hours . Cells were harvested, lysates prepared and analyzed for endogenous expression of BAX (anti-BAX), cathepsin S (using anti-CS antibodies) and β-actin (anti-β-actin).
Как видно из Фиг. 6, обработка CS-PEP3 интактных клеток 769P (левый блот, полоса 3) стабилизировала уровень белка BAX по сравнению с клетками 769P, обработанной только носителем (левый блот, полоса 10; при стандартизации по уровню β-актина). Обработка CS-PEP4 клеток 769P стабилизировала уровень эндогенного белка BAX при трансфекции клеток пустым вектором и стимуляции в одиночку (левый блот, полоса 1), а также при наличии сверхэкспрессии CS (левый блот, полоса 2) по сравнению с клетками, стимулированной только носителем (левый блот, полоса 10). В контрольных экспериментах экспрессия CS дестабилизировала эндогенные уровни BAX (левый блот, полоса 9), а доминантно-ингибирующая экспрессия CS-C25A отменила этот эффект (левый блот, полоса 8). При использовании клеток HEK293 эндогенные уровни BAX заметно повышались при обработке CS-PEP1 (средний блот, полоса 6) и CS-PEP3 (средний блот, полоса 10), и менее эффективно - при обработке CS-PEP4 (правый блот, полоса 9). При экспрессии CS уровни BAX кажутся повышенными (с учетом того, что уровни β-актина ниже базальных по сравнению с контрольными условиями (см. полосы 3 и 4, средний блот). В HEK293 обработка PVLE не оказала заметного влияния на уровень эндогенного белка BAX ни с экспрессией CS (правый блот, полоса 7), ни с доминантно-ингибирующей экспрессией C25A (правый блот, полоса 8). В совокупности такие результаты свидетельствуют о том, что CS-PEP -1, -3 и -4 стабилизируют уровень BAX (когда клетки обрабатываются только ингибиторами), тогда как только CS-PEP -1 и -4 стабилизируют уровень BAX в присутствии экспрессии CS в клетках 769P. В клетках HEK293 CS-PEP -1, -3, -4 стабилизируют эндогенные уровни экспрессии BAX, причем при экспрессии CS CS-PEP-1 и -3 стабилизируют эндогенные уровни BAX.As can be seen from FIG. 6, CS-PEP3 treatment of intact 769P cells (left blot, lane 3) stabilized BAX protein levels compared to vehicle-only treated 769P cells (left blot,
Пример 6. Определение способности CS-PEP1 ингибировть опосредованное катепсином S расщепление полиубиквитинированного производного p120BAX BAX (Фиг. 7)Example 6 Determination of the ability of CS-PEP1 to inhibit cathepsin S-mediated cleavage of a polyubiquitinated p120BAX BAX derivative (Fig. 7)
Клетки HEK293, коэкспрессирующие CS-Flag или pCS-C25A-Flag с BAX и HA-убиквитином, в течение 6 часов дополнительно обрабатывали в течение 24 часов 10 мкМ CS-PEP1 и очищали лизаты целых клеток, иммунопреципитированные с использованием антител против HA. Иммунные комплексы анализировали на наличие белка BAX с помощью вестерн-блоттинга при длительном (верхняя панель) и кратковременном воздействии (нижняя панель). Красной стрелкой выделено полиубиквитинированное производное BAX, p120BAX.HEK293 cells co-expressing CS-Flag or pCS-C25A-Flag with BAX and HA-ubiquitin were further treated for 24 hours with 10 μM CS-PEP1 and purified whole cell lysates immunoprecipitated with anti-HA antibodies. Immune complexes were analyzed for the presence of the BAX protein by Western blotting with long-term (upper panel) and short-term exposure (lower panel). The red arrow indicates the polyubiquitinated derivative of BAX, p120BAX.
Как видно из Фиг. 7, обработка клеток CS-PEP1 также приводит к накоплению полиубиквитинированного производного BAX с массой 120 кДа (Пример 6), особенно в присутствии неактивного мутанта CS-C25A-Flag, что подразумевает, что CS может принимать участие в протеолитическом расщеплении убиквитинированного BAX и, следовательно, может играть важную роль в протеасомной деградации уровней белка BAX.As can be seen from FIG. 7, treatment of cells with CS-PEP1 also results in accumulation of the 120 kDa polyubiquitinated BAX derivative (Example 6), especially in the presence of the inactive CS-C25A-Flag mutant, implying that CS may be involved in the proteolytic cleavage of ubiquitinated BAX and therefore , may play an important role in the proteasomal degradation of BAX protein levels.
Пример 7. Определение способности CS-PEP1 вызывать апоптоз и активацию каспазы-3Example 7 Determination of the Ability of CS-PEP1 to Induce Apoptosis and Caspase-3 Activation
Клетки HEK293 (Фиг. 8A) или 769P (Фиг. 8C), соответственно, совместно стимулировали CS-PEP1 (10 мкМ), пероксидом водорода (HP, 5 мкМ) или паклитакселом (Pac, 5 мкг / мл) в течение 24 часов; апоптотические клетки окрашивали с помощью TUNEL и определяли их количество. Растворимые лизаты цельных клеток (WCL), полученные из клеток, обработанных таким же образом, как на панелях A и C, анализировали на экспрессию каспазы-3 (Casp-3) и актина (Фиг. 8C). Уровни экспрессии каспазы-3 были количественно определены и стандартизированы для экспрессии актина по отношению к клеткам, стимулированным одним носителем (Фиг. 8D, график). Количественные данные представлены как ± SEM, и их значимость (где p <0,05) определяется с использованием двустороннего критерия t Стьюдента (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001).HEK293 (Fig. 8A) or 769P (Fig. 8C) cells, respectively, were co-stimulated with CS-PEP1 (10 μM), hydrogen peroxide (HP, 5 μM), or paclitaxel (Pac, 5 μg/mL) for 24 hours; apoptotic cells were stained with TUNEL and their number was determined. Soluble whole cell lysates (WCL) obtained from cells treated in the same manner as in panels A and C were analyzed for caspase-3 (Casp-3) and actin expression (FIG. 8C). Caspase-3 expression levels were quantified and standardized for actin expression relative to cells stimulated with vehicle alone (FIG. 8D, graph). Quantitative data are presented as ± SEM and their significance (where p<0.05) is determined using a two-tailed Student's t-test (*p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001).
Обработка 10 мкМ CS-PEP1 клеток HEK293 или 769P индуцировала их апоптоз примерно на 6-58% и 1-43%, соответственно (Фиг. 8А). CS-PEP1 может также взаимоусилить индуцирующие апоптоз эффекты обработки 769 клеток перекисью водорода или паклитакселом с 11% до 93% и от 55% до 64%, соответственно (Фиг. 8С). Обнаружение промежуточного соединения каспазы-3 с массой 18 кДа наблюдалось в качестве контроля - индикатора активации апоптоза (Фиг. 8B, D). Таким образом CS-PEP1 вызывает апоптоз и активацию каспазы-3.Treatment with 10 μM CS-PEP1 of HEK293 or 769P cells induced their apoptosis by approximately 6-58% and 1-43%, respectively (Fig. 8A). CS-PEP1 can also mutually enhance the apoptosis-inducing effects of hydrogen peroxide or paclitaxel treatment of 769 cells from 11% to 93% and 55% to 64%, respectively (Fig. 8C). Detection of an intermediate caspase-3 with a mass of 18 kDa was observed as a control indicator of apoptosis activation (Fig. 8B, D). Thus, CS-PEP1 induces apoptosis and caspase-3 activation.
Таким образом заявляемые пептиды обладают рядом ценных терапевтических свойств, поскольку они могут усиливать BAX-опосредованный апоптоз за счет следующих способностей:Thus, the claimed peptides have a number of valuable therapeutic properties, since they can enhance BAX-mediated apoptosis due to the following abilities:
1. Подавлять активность катепсина S (так же, как ингибитор протеиназы Pit2 ингибирует растительные папаин-подобные протеиназы).1. Inhibit cathepsin S activity (in the same way that a Pit2 proteinase inhibitor inhibits plant papain-like proteinases).
2. Ингибировать взаимодействие ингибиторного белка Bcl-xl/BAX (благодаря тому, что они являются производными от гидрофобного кармана Bcl-xl, который связывает BH3-домен BAX).2. Inhibit Bcl-xl/BAX inhibitory protein interaction (because they are derived from the Bcl-xl hydrophobic pocket that binds the BH3 domain of BAX).
3. Подавлять белковые взаимодействия BAX/BAX и образование олигомеров (благодаря тому, что они являются производными от гидрофобного кармана Bcl-xl, который связывает BAX), тем самым стабилизируя мономерный BAX (и который все еще может вызывать апоптоз [
4. Ингибировать катепсин S-опосредованный протеолиз полиубиквитинированного производного BAX (p120BAX).4. Inhibit cathepsin S-mediated proteolysis of the polyubiquitinated BAX derivative (p120BAX).
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2022/000157 WO2022245249A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-05-13 | Peptide compounds for inducing apoptosis in a cancer cell |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2022124530A Division RU2796104C1 (en) | 2022-09-16 | Application of peptide compound for apoptosis induction in a tumor cell |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021113908A RU2021113908A (en) | 2022-11-17 |
| RU2785794C2 true RU2785794C2 (en) | 2022-12-13 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7521548B2 (en) * | 2001-02-07 | 2009-04-21 | Burnham Institute For Medical Research | Apoptosis modulator Bcl-B and methods for making and using same |
| RU2367468C2 (en) * | 2003-11-19 | 2009-09-20 | Мерк Патент Гмбх | Bcl-2 PROTEINS, FRAGMENTS THEREOF, AND APPLICATION THEREOF IN PATIENTS WITH MALIGNANT TUMOUR |
| US20110318380A1 (en) * | 2008-10-01 | 2011-12-29 | Dako Denmark A/S | MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring |
| WO2020241800A1 (en) * | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 花王株式会社 | Norovirus-binding peptide |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7521548B2 (en) * | 2001-02-07 | 2009-04-21 | Burnham Institute For Medical Research | Apoptosis modulator Bcl-B and methods for making and using same |
| RU2367468C2 (en) * | 2003-11-19 | 2009-09-20 | Мерк Патент Гмбх | Bcl-2 PROTEINS, FRAGMENTS THEREOF, AND APPLICATION THEREOF IN PATIENTS WITH MALIGNANT TUMOUR |
| US20110318380A1 (en) * | 2008-10-01 | 2011-12-29 | Dako Denmark A/S | MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring |
| WO2020241800A1 (en) * | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 花王株式会社 | Norovirus-binding peptide |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| UniParc - UPI0005B663D6, база данных UniParc, www.uniprot.org/uniparc/UPI0005B663D6?sort=score; UniProtKB/Swiss-Prot A0A0D1EAR7 2019-07-31. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Curcio et al. | Calpains and neuronal damage in the ischemic brain: The swiss knife in synaptic injury | |
| Storr et al. | The calpain system and cancer | |
| Edison et al. | Degradation of Bcl-2 by XIAP and ARTS promotes apoptosis | |
| Mandic et al. | Calpain-mediated Bid cleavage and calpain-independent Bak modulation: two separate pathways in cisplatin-induced apoptosis | |
| Kandala et al. | Neddylation and deneddylation in cardiac biology | |
| Bovenschen et al. | NK cell protease granzyme M targets α-tubulin and disorganizes the microtubule network | |
| WO2006001956A2 (en) | Compositions for inhibiting cell growth and inducing apoptosis in cancer cells and methods of use thereof | |
| Eron et al. | Dual site phosphorylation of caspase-7 by PAK2 blocks apoptotic activity by two distinct mechanisms | |
| Moh'd A et al. | The amyloid precursor protein/protease nexin 2 Kunitz inhibitor domain is a highly specific substrate of mesotrypsin | |
| JP2010233569A (en) | Method and composition for adjusting apoptosis | |
| Gewies et al. | UBP41 is a proapoptotic ubiquitin-specific protease | |
| Wenta et al. | The HtrA3 protease promotes drug‐induced death of lung cancer cells by cleavage of the X‐linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) | |
| US20010012854A1 (en) | Multicatalytic protease inhibitors for use as anti-tumor agents | |
| RU2785794C2 (en) | Peptide compounds for induction of apoptosis in tumor cell | |
| RU2796104C1 (en) | Application of peptide compound for apoptosis induction in a tumor cell | |
| Hetfeld et al. | The COP9 signalosome-mediated deneddylation is stimulated by caspases during apoptosis | |
| Selvakumar et al. | N-myristoyltransferase 2 expression in human colon cancer: cross-talk between the calpain and caspase system | |
| Paas et al. | Phosphorylation of the complement component, C9, by an ecto-protein kinase of human leukemic cells | |
| WO2022245249A1 (en) | Peptide compounds for inducing apoptosis in a cancer cell | |
| KR20070011892A (en) | A novel agent comprising msx1 or gene encoding the same as an active ingredient for inducing apoptosis in cancer cells | |
| Osei-Amponsa et al. | hRpn13 shapes the proteome and transcriptome through epigenetic factors HDAC8, PADI4, and transcription factor NF-κB p50 | |
| Choi | Proteasome-mediated degradation of BRCA1 protein in MCF-7 human breast cancer cells | |
| Rao et al. | Ubiquitin receptor RPN13 mediates the inhibitory interaction of diphenyldihaloketones CLEFMA and EF24 with the 26S proteasome | |
| Vetterkind et al. | Ectopic expression of Par-4 leads to induction of apoptosis in CNS tumor cell lines | |
| McCloskey et al. | The therapeutic potential of the proteasome in leukaemia |