RU2795567C1 - Method for laboratory diagnosis of male reproductive function based on evaluation of spermatozoa dna fragment dispersion - Google Patents
Method for laboratory diagnosis of male reproductive function based on evaluation of spermatozoa dna fragment dispersion Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795567C1 RU2795567C1 RU2022131789A RU2022131789A RU2795567C1 RU 2795567 C1 RU2795567 C1 RU 2795567C1 RU 2022131789 A RU2022131789 A RU 2022131789A RU 2022131789 A RU2022131789 A RU 2022131789A RU 2795567 C1 RU2795567 C1 RU 2795567C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ejaculate
- spermatozoa
- glass slide
- dfi
- dna fragmentation
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область, к которой относится изобретениеThe field to which the invention relates
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при диагностике нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, гинекологии, репродукции, дерматовенерологии, онкологии для выявления этиологии и патогенеза патозо-оспермии.The invention relates to medicine and can be used in the diagnosis of disorders of spermatogenesis and infertility in urology, andrology, gynecology, reproduction, dermatovenereology, oncology to identify the etiology and pathogenesis of pathoso-ospermia.
Уровень техникиState of the art
Сперматозоиды человека легко подвержены оксидативному стрессу из-за влияния системных факторов (старение, коморбидность - сахарный диабет, рак, варикоцеле) и образа жизни (ожирение, курение, лекарства, ксенобиотики, экология, частота эякуляции). В 25-30% случаев, диагностированных как мужское идиопатическое бесплодие обнаруживаются высокий процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК (Agarwal et ah, 2017), что приводит к бесплодию, выкидышам и замершей беременности.Human spermatozoa are easily susceptible to oxidative stress due to the influence of systemic factors (aging, comorbidity - diabetes mellitus, cancer, varicocele) and lifestyle (obesity, smoking, drugs, xenobiotics, ecology, ejaculation frequency). In 25-30% of cases diagnosed as male idiopathic infertility, a high percentage of spermatozoa with DNA fragmentation is found (Agarwal et ah, 2017), which leads to infertility, miscarriages and miscarriages.
Упаковка ДНК в головке сперматозоида является результатом сложного процесса, требующего значительного уплотнения и перераспределения хроматина на заключительных стадиях сперматогенеза. Нормальная ДНК зрелых сперматозоидов обладает высокой устойчивостью к физической или химической денатурации.DNA packaging in the sperm head is the result of a complex process that requires significant compaction and redistribution of chromatin during the final stages of spermatogenesis. The normal DNA of mature spermatozoa is highly resistant to physical or chemical denaturation.
Сегодня известны три механизма, которые могут объяснить повреждение ДНК сперматозоидов:Today, three mechanisms are known that can explain damage to sperm DNA:
- дефектная конденсация хроматина во время сперматогенеза [1];- defective chromatin condensation during spermatogenesis [1];
- апоптоз [2]- apoptosis [2]
- окислительный стресс (ОС) [3], которому легко подвержены сперматозоиды человека из-за влияния системных факторов (пожилой возраст, коморбидность - сахарный диабет, рак, варикоцеле и др.) и образа жизни (ожирение, курение, лекарства, ксенобиотики, экология, частота эякуляции и др.) [4-7].- oxidative stress (OS) [3], to which human spermatozoa are easily exposed due to the influence of systemic factors (old age, comorbidity - diabetes mellitus, cancer, varicocele, etc.) and lifestyle (obesity, smoking, drugs, xenobiotics, ecology) , frequency of ejaculation, etc.) [4-7].
Базовый анализ эяулята (спермограмма) остается основным тестом для оценки мужского бесплодия, но прогностическая значимость обычных параметров спермограммы (количества сперматозоидов, подвижности, морфологии), невелика поскольку им присущи высокая внутри- и межлабораторная вариабельность и низкая предсказательная ценность [8].Basic ejaculate analysis (spermogram) remains the main test for evaluating male infertility, but the predictive value of common spermogram parameters (sperm count, motility, morphology) is low because of their high intra- and interlaboratory variability and low predictive value [8].
Спермограмма не может оценить повреждение хроматина сперматозоидов, в то время как научные исследования и клиническая практика указывает на то, что целостность ДНК сперматозоидов влияет на их функциональные возможности, подчеркивая тем самым важность тестов на ФДНКС для оценки нарушений фертильности [9, 10].Spermogram cannot assess sperm chromatin damage, while scientific studies and clinical practice indicate that the integrity of sperm DNA affects their functionality, thus emphasizing the importance of FDNKS tests for assessing fertility disorders [9, 10].
В этой связи, наряду с базовым анализом эякулята Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендует проводить дополнительное исследование спермы с помощью тестов для выявления ОС и ФДНКС [11].In this regard, along with the basic analysis of the ejaculate, the World Health Organization (WHO) recommends additional semen examination using tests to detect OS and FDNKS [11].
С времен зарождения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и по настоящее время ФДНКС считали одной из основных причин мужского бесплодия по причине нарушения оплодотворения, имплантации, продукции эмбрионов плохого качества, увеличения частоты самопроизвольных абортов и снижения частоты наступления беременности при ВРТ [8, 12-17].Since the birth of assisted reproductive technologies (ART) and up to the present, FDNKS has been considered one of the main causes of male infertility due to impaired fertilization, implantation, production of poor quality embryos, an increase in the frequency of spontaneous abortions and a decrease in the frequency of pregnancy with ART [8, 12-17 ].
Известны способы диагностики мужской репродуктивной функции и их недостатки. Для оценки целостности хроматина сперматозоидов известна линейка методов и тестов с различной степенью диагностических и прогностических возможностей:Known methods for diagnosing male reproductive function and their shortcomings. To assess the integrity of sperm chromatin, a range of methods and tests with varying degrees of diagnostic and prognostic capabilities are known:
1) тесты для оценки повреждений ДНК - структурный анализ хроматина сперматозоидов (SCSA/ sperm chromatin structure assay); идентификация фрагментов поврежденных ДНК (одиночный или двойной разрыв), меченных dUTP с помощью терминальной дезоксинуклеоти-дилтрансферазы (TUNEL/nick-end labeling of dUTP using terminal deoxynucleotidyl transferase); оценка дисперсии хроматина (SCD/sperm chromatin dispersion test) или Гало-тест (halo assay); гель-электрофорез отдельных клеток (SCGE/ single-cell gel electrophoresis или Comet assay);1) tests for assessing DNA damage - structural analysis of sperm chromatin (SCSA / sperm chromatin structure assay); identification of damaged DNA fragments (single or double break) labeled with dUTP using terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL/nick-end labeling of dUTP using terminal deoxynucleotidyl transferase); evaluation of chromatin dispersion (SCD / sperm chromatin dispersion test) or halo test (halo assay); single-cell gel electrophoresis (SCGE/single-cell gel electrophoresis or Comet assay);
2) тесты для оценки качества конденсации хроматина - окрашивание анилиновым синим (aniline alue/AB); окрашивание хромомицином A3 (chromomycin А3/СМА3); окрашивание акридин-оранжевым (acridine orange staying/AO) [10, 18-19].2) tests to assess the quality of chromatin condensation - staining with aniline blue (aniline alue/AB); staining with chromomycin A3 (chromomycin A3/CMA3); acridine orange staying/AO staining [10, 18-19].
Все эти методы различаются по своей диагностической точности (чувствительности, специфичности) и клинической ценности из-за присущих каждому из них преимуществ и недостатков, связанных с различными технологиями выявления повреждений ДНК сперматозоидов [10,20] (Таб. 1)All these methods differ in their diagnostic accuracy (sensitivity, specificity) and clinical value due to their inherent advantages and disadvantages associated with different technologies for detecting sperm DNA damage [10,20] (Table 1)
Существует также ряд методов диагностики мужского бесплодия.There are also a number of methods for diagnosing male infertility.
Оценку и вычисление концентрации нейтрофильных гранулоцитов/пероксидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте осуществляют с помощью цитохимического окрашивания орто-толуидином (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработке эякулята человека. -издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.18.1.5-1.7; рис. 2.14; 3.11).Evaluation and calculation of the concentration of neutrophilic granulocytes / peroxidase-positive leukocytes in the ejaculate is carried out using cytochemical staining with ortho-toluidine (see WHO Guidelines for the study and processing of human ejaculate. -Publishing house "CAPITAL PRINT", Moscow, 2012, fifth edition, ISBN 978- 5-905106-09-05 (section 2.18.1.5-1.7; Fig. 2.14; 3.11).
Недостатки данного способа следующие:The disadvantages of this method are the following:
1. отсутствует коммерчески доступный набор для окрашивания, реактив: как правило предлагается 6 реагентов, которые сложно купить в виду того, что они являются прекурсорами,1. there is no commercially available kit for staining, reagent: as a rule, 6 reagents are offered, which are difficult to buy due to the fact that they are precursors,
2. сложно готовить к использованию, ввиду того, что современные лаборатории используют, как правило, исключительно готовые наборы реагентов и не имеет необходимого поверенного оборудования: весов, оборудования для титрования,2. it is difficult to prepare for use, due to the fact that modern laboratories use, as a rule, exclusively ready-made sets of reagents and do not have the necessary verified equipment: balances, titration equipment,
3. используемый орто-толуидин является особо опасным канцерогеном, что обуславливает риск для здоровья персоналу,3. used ortho-toluidine is a particularly dangerous carcinogen, which causes a risk to the health of personnel,
4. результаты считают в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, который отсутствует на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с необходимым регистрационным удостоверением,4. the results are considered in the improved Neubauer hemocytometer, which is not available on the Russian laboratory market of equipment and consumables with the necessary registration certificate,
5. формула подсчета адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра, что вызывает определенные трудности.5. The calculation formula is adapted to the Neubauer hemocytometer, which causes certain difficulties.
Известен способ оценки и вычисления концентрации нейтрофильных гранулоцитов (лейкоцитов)/пероксидазо-положительных клеток (ППК) в эякуляте. При его осуществлении используют полуколичественную оценку содержания лейкоцитов в эякуляте на тест-полоске с помощью иммунохроматографического метода, основанного на ферментативной активности лейкоцитарной эстеразы (без цитохимического окрашивания) (см. В.В. Долгов, С.А. Луговская, Н.Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. - 145 с., 199 ил., 5-94789-144-1. Стр. 70).A known method for assessing and calculating the concentration of neutrophilic granulocytes (leukocytes)/peroxidase-positive cells (PPC) in the ejaculate. In its implementation, a semi-quantitative assessment of the content of leukocytes in the ejaculate on a test strip is used using an immunochromatographic method based on the enzymatic activity of leukocyte esterase (without cytochemical staining) (see V.V. Dolgov, S.A. Lugovskaya, N.D. and etc. Laboratory diagnosis of male infertility. - M. - Tver: LLC Publishing House "Triada", 2006. - 145 p., 199 ill., 5-94789-144-1. P. 70).
Недостатки данного способа заключаются в следующем:The disadvantages of this method are as follows:
1. Способ позволяет осуществить только приблизительное определение концентрации и только нейтрофильных гранулоцитов/перокисидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте,1. The method allows only an approximate determination of the concentration and only of neutrophilic granulocytes / peroxidase-positive leukocytes in the ejaculate,
2. Не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.2. Does not give an accurate idea of the presence or absence of an inflammatory process in a man.
3. Метод определения - неколичественный (полуколичественный «на тест-полоске»: > или <1х106/мл), что противоречит рекомендациям ВОЗ.3. The method of determination is non-quantitative (semi-quantitative "on a test strip": > or <1x10 6 / ml), which is contrary to WHO recommendations.
4. Лейкоцитарная эстераза появляется в биожидкости при разрушении лейкоцитов, что может привести к ложноположительной диагностике (пиоспермии).4. Leukocyte esterase appears in the biofluid when leukocytes are destroyed, which can lead to a false positive diagnosis (pyospermia).
Известен способ количественной оценки содержания круглых клеток (нейтрофильных и других лейкоцитов, макрофагов, клеток сперматогенеза) (концентрации) без цитохимического окрашивания ППК в эякуляте (см. Е.Е. Брагина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и генитальная хирургия. - 2014, №1, с. 20).There is a method for quantifying the content of round cells (neutrophilic and other leukocytes, macrophages, spermatogenesis cells) (concentration) without cytochemical staining of the PPC in the ejaculate (see E.E. Bragina. Protocol for spermiological research. - Andrology and genital surgery. - 2014, No. 1, p. 20).
Недостатки данного способа следующие.The disadvantages of this method are the following.
1. Производится определение концентрации только круглых клеток (всех подряд), а не только ППК в эякуляте.1. The concentration of only round cells (all in a row) is determined, and not only the AUC in the ejaculate.
2. Метод не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.2. The method does not give an accurate idea of the presence or absence of an inflammatory process in a man.
3. Метод не приемлем для мониторинга содержания лейкоцитов в сперме.3. The method is not suitable for monitoring the content of leukocytes in semen.
4. Идентификация лейкоцитов происходит путем субъективной оценки («на глаз») по косвенным идентификационным признакам, что не соответствует рекомендациям ВОЗ.4. Identification of leukocytes occurs by subjective assessment ("by eye") by indirect identification signs, which does not comply with WHO recommendations.
Известен способ определения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработка эякулята человека, издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.7, 2.8.1, 2.8.4, стр. 34-47).There is a known method for determining the concentration of spermatozoa in 1 milliliter (ml) of ejaculate (see WHO Guidelines for the study and processing of human ejaculate, CAPITAL PRINT publishing house, Moscow, 2012, fifth edition, ISBN 978-5-905106-09-05 (section 2.7 , 2.8.1, 2.8.4, pp. 34-47).
Недостатки данного способа следующие.The disadvantages of this method are the following.
1. Вычисление концентрации осуществляется только сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята.1. The calculation of the concentration is carried out only for spermatozoa in 1 milliliter (ml) of ejaculate.
2. Подсчет проводят в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, которого нет на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с регистрационным удостоверением.2. Counting is carried out in an improved Neubauer hemocytometer, which is not available on the Russian laboratory market for equipment and consumables with a registration certificate.
3. Фиксация и разведение образца спермы происходит рабочим раствором, состоящим из сложной прописи химических веществ - прекурсоров (п.2.7.5 руководства ВОЗ), которые не используются в современной клинико-диагностической лаборатории. Одним из таких прекурсоров является особо опасный канцероген - формалин.3. The semen sample is fixed and diluted with a working solution consisting of a complex prescription of chemicals - precursors (paragraph 2.7.5 of the WHO manual), which are not used in a modern clinical diagnostic laboratory. One of these precursors is a particularly dangerous carcinogen - formalin.
4. Оценка требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов основана на сложных математических расчетах и также адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра (Руководство ВОЗ, стр. 40-41 глава 2.8.1).4. The estimation of the required dilution for further calculation of sperm concentration is based on complex mathematical calculations and is also adapted to the Neubauer hemocytometer (WHO Manual, pp. 40-41 chapter 2.8.1).
5. Все формулы для подсчета адаптированы к гемоцитометру Нейбауэра.5. All calculation formulas are adapted to the Neubauer hemocytometer.
Известен способ измерения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята, (см. Е.Е. Брагина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и ге-нитальная хирургия. - 2014, №1, с. 18-19).There is a known method for measuring the concentration of spermatozoa in 1 milliliter (ml) of ejaculate (see E.E. Bragina. Protocol for spermiological research. - Andrology and genital surgery. - 2014, No. 1, p. 18-19).
Согласно данному способу производят подготовку препарата, фиксацию эякулята, приготовление счетной камеры, заполнение окошек гемоцитометра эякулятом, осаждение сперматозоида в камере, определение количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов, измерение количества сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята в препарате в камере Горяева и вынесение заключения.According to this method, preparation of the preparation, fixation of the ejaculate, preparation of the counting chamber, filling the windows of the hemocytometer with ejaculate, sedimentation of the spermatozoon in the chamber, determination of the number of large squares necessary for counting spermatozoa, measurement of the number of spermatozoa in 1 milliliter (ml) of ejaculate in the preparation in the Goryaev chamber and issuing a conclusion.
Недостатки данного способа следующие.The disadvantages of this method are the following.
1. Осуществляется только измерение концентрации сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята.1. Only the measurement of sperm concentration in 1 milliliter (ml) of ejaculate is carried out.
2. Фиксация и разведение образца спермы проводится несколькими рабочими растворами (50 г NaHCO3, 10 мл 36-40% раствора формальдегида (насыщенный раствор)). Один из них - прекурсор и является особо опасный канцерогеном формальдегидом. Фиксация физиологическим раствором долгая (до полной остановки подвижных клеток), что отражается на времени оборота теста в лаборатории/ТАТ (время оборота теста/turn around time) и вносит дополнительные погрешности.2. Fixation and dilution of the semen sample is carried out with several working solutions (50 g NaHCO 3 , 10 ml 36-40% formaldehyde solution (saturated solution)). One of them is a precursor and is a particularly dangerous carcinogen formaldehyde. Fixation with saline solution is long (until the motile cells completely stop), which affects the turn around time of the test in the laboratory / TAT (turn around time) and introduces additional errors.
3. Оценка качества требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов многоэтапна и усложнена: при приготовлении препарата (10 мкл, покровное стекло 22x22 мм), глубина препарата примерно 20 мкм. Используется специальный подсчет сперматозоидов в поле зрения для определения оптимального разведения. При диаметре поля зрения микроскопа (измерять объективом - микрометром) 500 мкм обнаружение 4 сперматозоидов в поле зрения примерно соответствует 1 млн/мл. Если диаметр поля зрения 250 мкм - 1 сперматозоид в поле зрения соответствует 1 млн/мл. В этом случае пользоваться табл.2 следует после умножения количества обнаруженных сперматозоидов на 4).3. Evaluation of the quality of the required dilution for further calculation of the concentration of spermatozoa is multi-stage and complicated: when preparing the preparation (10 µl, coverslip 22x22 mm), the depth of the preparation is approximately 20 µm. A special field-of-view sperm count is used to determine the optimal dilution. With a microscope field of view diameter (measured with a micrometer lens) of 500 μm, the detection of 4 spermatozoa in the field of view approximately corresponds to 1 million / ml. If the diameter of the field of view is 250 microns - 1 spermatozoon in the field of view corresponds to 1 million / ml. In this case, Table 2 should be used after multiplying the number of detected spermatozoa by 4).
4. Этап определения количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов также усложняет процесс исследования, что отражается на ТАТ.4. The step of determining the number of large squares required for sperm count also complicates the research process, which is reflected in the TAT.
Для идентификации микроорганизмов у бесплодных пар и у пациентов с подозрением на инфекции мужских добавочных половых желез (Male accessory gland infection/MAGI) клиническими рекомендациями (КР) Европейской ассоциации урологов/European Association of Urology (EAU, 2022) наряду с СПЖ и постмассажной порции мочи рекомендуется использовать эякулят [EAU Guidelines on Sexual and Reproductive Health A. Salonia (Chair), C. Bettocchi, J. Carvalho, G. Corona, Т.Н. Jones, J.I. Martinez-Salamanca, S. Minhas (Vice-chair), P. Verze; Guidelines Associates: L. Boeri, P. Capogrosso, A. Cocci, K. Dimitropoulos, G. Hatzichristodoulou, A. Kalkanli, V. Modgil, U. Milenkovic, G. Russo, T. Tharakan, © European Association of Urology 2021; EAU Guidelines on urological Infections. 2022. Accessed January 28, 2022. https://d56bochluxqnz.cloudfront.net/documentd/full-guideline/EAU-JN-Urological-Infections-2022.pdf].For the identification of microorganisms in infertile couples and in patients with suspected male accessory gland infection (MAGI) clinical guidelines (CR) of the European Association of Urology / European Association of Urology (EAU, 2022) along with the SLE and post-massage urine ejaculate is recommended [EAU Guidelines on Sexual and Reproductive Health A. Salonia (Chair), C. Bettocchi, J. Carvalho, G. Corona, T.N. Jones, JI Martinez-Salamanca, S. Minhas (Vice-chair), P. Verze; Guidelines Associates: L. Boeri, P. Capogrosso, A. Cocci, K. Dimitropoulos, G. Hatzichristodoulou, A. Kalkanli, V. Modgil, U. Milenkovic, G. Russo, T. Tharakan, © European Association of Urology 2021; EAU Guidelines on Urological Infections. 2022. Accessed January 28, 2022. https://d56bochluxqnz.cloudfront.net/documentd/full-guideline/EAU-JN-Urological-Infections-2022.pdf].
Нормативно-правовые акты (НПА) российских коллег рекомендуют для поиска возбудителей инфекций использовать уретральный соскоб (УС)/ уретральное отделяемое (УО) или эякулят [Приказ Минздрава России от 31.07.2020 N 803н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению"; "Клинические рекомендации "Мужское бесплодие" (утв. Минздравом России), разработчик: общероссийская общественная организация "Российское общество урологов", одобрено Научно-практическим Советом Минздрава РФ, 2021 г.; Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. - 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Деловой экспресс, 2016. - 768 с.; Приказ Минздрава России от 29.12. 2012, №1673 н «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при хроническом простатите (обследование в целях установления диагноза и лечения); Приказ Минздрава России №1675н от 29.12. 2012 «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при неспецифическом и другом уретрите»; Приказ Минздрава России от 9 ноября 2012 №696н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при острых простатите, орхите и эпидидимите»; Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 октября 2012 г. №556н "Об утверждении стандарта медицинской помощи при бесплодии с использованием вспомогательных репродуктивных технологий"].Regulatory legal acts (NLA) of Russian colleagues recommend using urethral scraping (US) / urethral discharge (UV) or ejaculate to search for infectious agents [Order of the Ministry of Health of Russia dated July 31, 2020 N 803n "On the procedure for using assisted reproductive technologies, contraindications and restrictions to their application"; "Clinical guidelines "Male infertility" (approved by the Ministry of Health of Russia), developer: All-Russian public organization "Russian Society of Urologists", approved by the Scientific and Practical Council of the Ministry of Health of the Russian Federation, 2021; Federal clinical guidelines. Dermatovenereology 2015: Skin diseases. Transmitted infections - 5th ed., revised and supplemented - M.: Delovoy Express, 2016. - 768 pp.; Order of the Ministry of Health of Russia dated December 29, 2012, No. 1673 n "On approval of the standard of primary health care for chronic prostatitis (examination for diagnosis and treatment); Order of the Ministry of Health of Russia No. 1675n dated December 29, 2012 "On approval of the standard for primary health care for nonspecific and other urethritis"; Order of the Ministry of Health of Russia dated November 9, 2012 No. 696n "On approval of the standard specialized medical care for acute prostatitis, orchitis and epididymitis"; Order of the Ministry of Health of the Russian Federation dated October 30, 2012 No. 556n "On approval of the standard of medical care for infertility using assisted reproductive technologies"].
В настоящее время на пути поиска этиологического фактора MAGI в сочетании с мужским бесплодием представляются сомнительными существующие лабораторные алгоритмы с участием УО/УС и секрета предстательной железы (СПЖ) ввиду низкой диагностический ценности заявленных локусов, а также по причине отсутствия возможности воспроизводства и стандартизации по количеству и качеству взятого биоматериала [Сапожкова Ж.Ю., Шабалова И.П., Касоян К.Т. Исследование осадка эякулята в диагностике инфекций, передаваемых половым путем: Учебное пособие. Москва, 2017; Сапожкова Ж.Ю., Милованова Г.Α., Пацап О.И. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Маркеры и методы. Часть II // Лабораторная и клиническая медицина. Фармация. 2021. Т. 1, No 2. С.65 - 79. DOI: 10.14489/1 стр.2021.02.рр. 065-079].At present, on the way to the search for the etiological factor of MAGI in combination with male infertility, the existing laboratory algorithms involving SV/US and prostate secretion (SPS) seem doubtful due to the low diagnostic value of the declared loci, as well as due to the lack of the possibility of reproduction and standardization in terms of the number and the quality of the taken biomaterial [Sapozhkova Zh.Yu., Shabalova I.P., Kasoyan K.T. The study of ejaculate sediment in the diagnosis of sexually transmitted infections: Textbook. Moscow, 2017; Sapozhkova Zh.Yu., Milovanova G.A., Patsap O.I. Laboratory diagnosis of male infertility. Markers and methods. Part II // Laboratory and Clinical Medicine. Pharmacy. 2021. V. 1,
Таким образом, известные способы являются низкоинформативными и малодостоверными. В этой связи стоит задача создания своевременной и правильной диагностики количественного состава биотопа осадка эякулята, которая наряду с известными дигностическими подходами позволит избежать назначение дополнительных дорогостоящих лабораторных и инструментальных методов и необоснованную антибиотикотерапию, что отражает концепцию управления здоровьем и долголетием на основе корректного планирования медицинской и экономической эффективности в организации здравоохранения.Thus, the known methods are low informative and unreliable. In this regard, the task is to create timely and correct diagnostics of the quantitative composition of the ejaculate sediment biotope, which, along with well-known diagnostic approaches, will allow avoiding the appointment of additional expensive laboratory and instrumental methods and unreasonable antibiotic therapy, which reflects the concept of health and longevity management based on correct planning of medical and economic efficiency. in a healthcare organization.
Известен способ диагностики нарушения мужской репродуктивной функции на основе микробиологического (МБА) (культурального) исследования цельного эякулята и на основе молекулярного (МАНК/ПЦР-РВ) исследования УО/УС и СПЖ (Приказ Минздрава России от 29.12. 2012, №1673 н «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при хроническом простатите (обследование в целях установления диагноза и лечения)), который является наиболее близким к заявляемому способу и прият в качестве ближайшего аналога (прототипа).A known method for diagnosing a violation of male reproductive function based on microbiological (MBA) (cultural) studies of whole ejaculate and on the basis of molecular (NAAT / PCR-RT) studies of UO / US and life expectancy (Order of the Ministry of Health of Russia dated 29.12. 2012, No. 1673 n “On approval of the standard of primary health care for chronic prostatitis (examination for diagnosis and treatment)), which is the closest to the claimed method and pleasant as the closest analogue (prototype).
К недостаткам известного способа относится:The disadvantages of the known method include:
- большинство этиологических агентов инфекционно-воспалительных процессов являются некультивируемыми или плохо культивируемыми в силу своих биологических свойств;- most of the etiological agents of infectious and inflammatory processes are uncultivated or poorly cultivated due to their biological properties;
- существующие лабораторные алгоритмы с участием УО/УС и СПЖ имеют низкую эффективность ввиду отсутствия диагностический ценности перечисленных локусов, так как инвазивный процесс получения этих видов биоматериала связан с дискомфортом и, зачастую, болевыми ощущениями у пациента, что в результате не позволяет отобрать полноценный биологический образец для исследования.- the existing laboratory algorithms involving VR/US and SLE have low efficiency due to the lack of diagnostic value of the listed loci, since the invasive process of obtaining these types of biomaterial is associated with discomfort and, often, pain in the patient, which, as a result, does not allow taking a full-fledged biological sample for research.
Определение количества облигатно-анаэробных условно-патогенных микроорганизмов (ОАУПМО) и их соотношение в биотопе, а также выделение устойчивых типов бактериальных сообществ, связанных с нарушением мужской фертильности, не предоставляется возможным с помощью МБА в виду ограничения диагностических возможностей метода. Как следствие, имеет место риск ложноотрицательных результатов, что определяет трудности этиотропной терапии, переход заболевания в хроническую форму и рецидивирующий характер течения.Determination of the number of obligate anaerobic opportunistic pathogens (OAUPMO) and their ratio in the biotope, as well as the identification of resistant types of bacterial communities associated with impaired male fertility, is not possible using MBA due to the limited diagnostic capabilities of the method. As a result, there is a risk of false-negative results, which determines the difficulties of etiotropic therapy, the transition of the disease to a chronic form and the recurrent nature of the course.
В настоящее время не определен идеальный метод измерения ФДНКС и его оптимальные пороговые значения, но четыре основных теста - TUNEL, SC-SA, SCGE / Comet assay и SCD/ halo assay/Гало-тест кажутся надежными для получения информации о качестве ДНК сперматозоидов, что важно для установления мужского фактора бесплодия [19, 21].At present, the ideal method for measuring FDNCS and its optimal thresholds has not been determined, but the four main tests - TUNEL, SC-SA, SCGE / Comet assay and SCD / halo assay / Halo test seem to be reliable for providing information on the quality of spermatozoa, which important for establishing male factor infertility [19, 21].
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Изобретение направлено на решение задачи повышения диагностической достоверности результатов диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии ДНК-фрагментов сперматозоидов.The invention is aimed at solving the problem of increasing the diagnostic reliability of the results of diagnosing male reproductive function based on the assessment of the dispersion of DNA fragments of spermatozoa.
Результат, достигаемый при использовании представленного способа, состоит в расширении спектра диагностики этиологических факторов инфекционной природы нарушения мужской репродуктивной функции, повышения информативности и достоверности диагностики.The result achieved by using the presented method is to expand the range of diagnosis of etiological factors of the infectious nature of the violation of male reproductive function, increase the information content and reliability of diagnosis.
Результат достигается за счет того, что в способе лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции, включающем сбор и обработку биологического материала, осуществление диагностики и на основе полученных данных формирование заключения о мужской репродуктивной функции, при этом в качестве биологического материала используют эякулят, обработку эякулята проводят следующим образом: аликвоту из 100 мкл свежего эякулята размещают на сухом одноразовом предметном стекле; помещают предметное стекло в термостат при 37°С на 25-30 минут до полного высушивания; достают предметное стекло с высохшей аликвотой и оставляют на 2 мин при комнатной температуре 22°С; помещают предметное стекло с высушенной аликвотой в герметичный пластиковый контейнер для хранения при температуре -22°С на срок 28 дней для последующего отсроченного исследования; через 28 дней хранения перед оценкой фрагментации ДНК сперматозоидов достают предметное стекло с замороженной высушенной на воздухе аликвотой, оставляют при температуре +22°С; добавляют в высушенную аликвоту эякулята 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора; перемешивают наконечником пипетки до образования однородной суспензии; полученную суспензию помещают в коническую микропробирку Эппендорфа объемом 0,5 мл; на предметное стекло наносят покрытие с положительно электрически заряженной поверхностью для обеспечения прикрепления клеточного материала к поверхности; суспензию эякулята смешивают с инертным агарозным микрогелем; охлаждают и подвергают воздействию денатурирующего агента и ли-зирующего раствора; наносят на предметное стекло; окрашивают и оценивают фрагментацию ДНК сперматозоидов путем подсчета на лабораторном счетчике 300 сперматозоидов на образец с помощью светопольной микроскопии под иммерсионным объективом x1000; фертильность эякулята оценивают с учетом фрагментации ДНК - сперматозоидов по формуле:The result is achieved due to the fact that in the method of laboratory diagnostics of male reproductive function, including the collection and processing of biological material, the implementation of diagnostics and, based on the data obtained, the formation of a conclusion about male reproductive function, while ejaculate is used as biological material, ejaculate processing is carried out as follows : an aliquot of 100 μl of fresh ejaculate is placed on a dry disposable slide; place the glass slide in a thermostat at 37°C for 25-30 minutes until completely dry; take out a glass slide with a dried aliquot and leave for 2 min at room temperature 22°C; place the slide with the dried aliquot in a sealed plastic container for storage at a temperature of -22°C for a period of 28 days for a subsequent delayed study; after 28 days of storage, before assessing sperm DNA fragmentation, a glass slide with a frozen air-dried aliquot is taken out, left at a temperature of +22°C; add to the dried aliquot of the ejaculate 50 μl of phosphate-buffered saline; mix with a pipette tip until a homogeneous suspension is formed; the resulting suspension is placed in a 0.5 ml Eppendorf conical microtube; a glass slide is coated with a positively electrically charged surface to allow attachment of cellular material to the surface; the ejaculate suspension is mixed with an inert agarose microgel; cooled and exposed to a denaturing agent and a lysing solution; applied to a glass slide; staining and evaluating sperm DNA fragmentation by counting 300 sperm per sample on a laboratory counter using bright field microscopy under an immersion lens x1000; ejaculate fertility is estimated taking into account DNA fragmentation - spermatozoa according to the formula:
гдеWhere
DFI - индекс фрагментации ДНК сперматозоидов,DFI - sperm DNA fragmentation index,
S - число сперматозоидов с малым ореолом вокруг сперматозоида,S is the number of spermatozoa with a small halo around the spermatozoon,
WH - число сперматозоидов без ореола,WH - number of spermatozoa without halo,
WHD - число разрушенных сперматозоидов без ореола,WHD - number of destroyed spermatozoa without halo,
N - число исследуемых сперматозоидов,N is the number of test spermatozoa,
при DFI<=15% выносят заключение о наличии нормальной репродуктивной функции, при DFI>15%, но <25% выносят заключение о сомнительной репродуктивной функции, а при DFI>25% - о наличии патологии.at DFI<=15% they make a conclusion about the presence of normal reproductive function, at DFI>15%, but <25% they make a conclusion about doubtful reproductive function, and at DFI>25% - about the presence of pathology.
Технический результат усиливается за счет того, что фрагментацию ДНК сперматозоидов классифицируют следующим образом: фрагменация отсутствует при отсутствии разрывов и/или повреждений ядерной ДНК сперматозоидов, при этом размер ореола больше или равен внутреннему диаметру ядра; имеет место частичная фрагментация ДНК, присутствуют разрывы и/или повреждения ядерной ДНК сперматозоидов, при этом размер ореола_меньше большого ореола и больше малого ореола сперматозоида; к сперматозоидам S с малым ореолом относят сперматозоиды, у которых фрагментация ДНК присутствует, при этом имеют место разрывы и/или повреждения ядерной ДНК сперматозоидов, размер ореола меньше 1/3 или такой же, как внутренний диаметр ядра; к сперматозоидам WH без ореола относят сперматозоиды с фрагментацией ДНК, разрывами и/или повреждениями ядерной ДНК сперматозоидов, без ореола; к спераматозоидам WHD относят те, у которых фрагментация ДНК присутствует, имеет место полная деградация ядерной ДНК сперматозоидов.The technical result is enhanced by the fact that fragmentation of sperm DNA is classified as follows: fragmentation is absent in the absence of breaks and/or damage to the nuclear DNA of spermatozoa, while the size of the halo is greater than or equal to the inner diameter of the nucleus; there is partial fragmentation of DNA, there are breaks and / or damage to the nuclear DNA of spermatozoa, while the size of the halo is less than the large halo and greater than the small halo of the spermatozoa; spermatozoa S with a small halo include spermatozoa in which DNA fragmentation is present, with breaks and / or damage to the nuclear DNA of spermatozoa, the size of the halo is less than 1/3 or the same as the inner diameter of the nucleus; WH spermatozoa without a halo include spermatozoa with DNA fragmentation, breaks and / or damage to the nuclear DNA of spermatozoa, without a halo; WHD spermatozoa include those in which DNA fragmentation is present, complete degradation of the nuclear DNA of spermatozoa takes place.
Перед проведением диагностики: образцы эякулята с повышенной вязкостью разжижалют фосфатно-солевым раствор Бромелайна и перемешивают без образования пены и пузырьков воздуха, определяют время выполнения теста для получения результата в интервале между 30-60 минутами после сбора спермы.Before diagnostics: high-viscosity ejaculate samples are liquefied with Bromelain phosphate-salt solution and mixed without foaming or air bubbles, the test time is determined to obtain a result between 30-60 minutes after semen collection.
Для окрашивания предметного стекла с нанесенной аликвотой эякулята используют набор для окрашивания эякулята, включающий раствор для фиксирования и предокрашивания, окрашивающий раствор «розовый», окрашивающий раствор «синий».To stain a slide with an aliquot of ejaculate applied, an ejaculate staining kit is used, including a solution for fixing and prestaining, a pink staining solution, a blue staining solution.
В составе Набора для окрашивания эякулята используют следующие реагенты:The following reagents are used in the Ejaculate Staining Kit:
Описание графических материаловDescription of graphic materials
Сущность изобретения и возможность достижения технического результата будут более понятны из последующего описания со ссылками на фигуры графических материалов, где показано:The essence of the invention and the possibility of achieving a technical result will be more clear from the following description with reference to the figures of graphic materials, which show:
фиг. 1 - Микроскопическая картина препарата, контрольная визуализация пяти оценочных категорий фрагментации ДНК сперматозоидов по Fernandez et al.fig. 1 - Microscopic picture of the preparation, control visualization of the five evaluation categories of sperm DNA fragmentation according to Fernandez et al.
На фигуре использованы следующие обозначения:The following symbols are used in the figure:
1 - микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с большим гало (Large/L) (сперматозоид, размер гало которого больше или такой же, как внутренний диаметр ядра),1 - microscopic picture of the preparation: spermatozoa with a large halo (Large / L) (spermatozoa whose halo size is larger or the same as the inner diameter of the nucleus),
2 - Микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с гало среднего размера (Medium/M) (сперматозоид с гало, размер которого меньше большого гало и больше малого гало сперматозоида), некоторые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов,2 - Microscopic picture of the preparation: spermatozoa with a medium-sized halo (Medium / M) (sperm with a halo smaller than the large halo and larger than the small halo of the spermatozoa), some breaks / damage to the nuclear DNA of the spermatozoa,
3 - Микроскопическая картина препарата: сперматозоид с малым гало (Small/S) (сперматозоид, размер ореола которого меньше 1/3 или такой же, как внутренний диаметр ядра), значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов,3 - Microscopic picture of the specimen: small halo spermatozoon (Small/S) (spermatozoon whose halo size is less than 1/3 or the same as the inner diameter of the nucleus), significant breaks/damages in the nuclear DNA of spermatozoa,
4 - Микроскопическая картина препарата: сперматозоид без гало (Without HALO /WH), значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов,4 - Microscopic picture of the preparation: spermatozoa without halo (Without HALO /WH), significant breaks/damages in the nuclear DNA of spermatozoa,
5 - Микроскопическая картина препарата: разрушенный сперматозоид без гало (Without HALO -Degraded/WHD) (сперматозоид без ореола и с ядром, которое неравномерно или слабо окрашено).5 - Microscopic picture of the preparation: a destroyed spermatozoon without a halo (Without HALO -Degraded / WHD) (a spermatozoon without a halo and with a nucleus that is uneven or weakly colored).
Осуществление способаImplementation of the method
За период июль-август 2022 г. на клинической базе организаци «Международная Школа Цитологии&Медицинская Школа Инноваций» (г. Москва) проведено одномоментное исследование, в котором диагностический метод применялся в одинаковых условиях ко всем обследуемым добровольцам мужского пола в количестве 492 человека.For the period July-August 2022, at the clinical base of the organization "International School of Cytology & Medical School of Innovations" (Moscow), a one-stage study was conducted in which the diagnostic method was applied under the same conditions to all the examined male volunteers in the amount of 492 people.
Средний возраст обследуемых мужчин 38, 28 лет (стандартное отклонение 8,64; медиана возраста 38 лет, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 59 лет).The average age of the examined men was 38.28 years (standard deviation 8.64; median age 38 years, minimum age 23 years, maximum age 59 years).
Критерии включения в исследование:Criteria for inclusion in the study:
- наличие у пациентов жалоб на неудачные попытки зачатия на протяжении 1-5 лет;- the presence of complaints in patients of unsuccessful attempts to conceive for 1-5 years;
- соблюдение полового воздержания в течение 3-5 суток;- observance of sexual abstinence within 3-5 days;
- отсутствие активных жалоб, характерных для MAGI (male accessory gland infections/инфекций мужских добавочных половых желез) и/или в анамнезе MAGI, а именно специфический или неспецифический уретрит, хронический или острый простатит, орхит, эпи-дидимит.- the absence of active complaints characteristic of MAGI (male accessory gland infections / infections of the male accessory gonads) and / or a history of MAGI, namely specific or nonspecific urethritis, chronic or acute prostatitis, orchitis, epididymitis.
Критерии исключения:Exclusion Criteria:
- азооспермия,- azoospermia,
- криптозооспермия,- cryptozoospermia,
- применение антибактериальных, противовирусных препаратов в последние 4 недели до обследования;- the use of antibacterial, antiviral drugs in the last 4 weeks before the examination;
- использование местных лекарственных препаратов в течение 3-х недель, предшествующих обследованию,- the use of local drugs during the 3 weeks preceding the examination,
- наличие у пациентов синдрома хронической тазовой боли,- the presence of patients with chronic pelvic pain syndrome,
- наличие симптомов нижних мочевых путей,- presence of lower urinary tract symptoms,
- наличие синдрома хронической мошоночной боли,- the presence of chronic scrotal pain syndrome,
- наличие эректильной дисфункции,- the presence of erectile dysfunction,
- отсутствие нарушений кариотипа, микроделеций AZF локуса Y-хромосомы, мутаций гена CFTR;- absence of karyotype disorders, microdeletions of the AZF locus of the Y chromosome, mutations of the CFTR gene;
- наличие у пациентов сексуальных партнеров - женщин с рецидивирующими нарушениями влагалищного биоценоза, с воспалительными заболеваниями органов малого таза.- the presence of sexual partners in patients - women with recurrent disorders of the vaginal biocenosis, with inflammatory diseases of the pelvic organs.
Выбывших из исследования пациентов не было.There were no patients who dropped out of the study.
Все добровольцы подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.All volunteers signed an informed consent to participate in the study.
За месяц до выполнения Гало-теста (гало или ореол вокруг сперматозоида, форма гало зависит от состояния сперматозоида), все обследуемые мужчины (n=492) получили результаты спермограммы, где были выявлены различные сценарии патоспермии, а также нормоспермия.A month before the Halo test (halo or halo around the spermatozoon, the shape of the halo depends on the state of the spermatozoon), all the examined men (n=492) received the results of the spermogram, where various scenarios of pathospermia were identified, as well as normospermia.
В рамках научных исследований и клинических разработок для установления причины бесплодия всем добровольцам было выполнено исследование эякулята на ФДНКС на предварительно подготовленных образцах препаратах спермы, собранных и доставленных в соответствии с рекомендациями ВОЗ 6-го издания (2021) [11].As part of research and clinical development, to determine the cause of infertility, all volunteers underwent a study of the ejaculate for FDNKS on pre-prepared samples of sperm preparations collected and delivered in accordance with the recommendations of the WHO 6th edition (2021) [11].
Каждый образец эякулята разделяли на две части: одну часть в аликвоте 100 мкл использовали непосредственно для приготовления препаратов с последующим хранением и дальнейшим исследованием на ФДНКС, а оставшуюся часть использовали для спермограммы [22].Each ejaculate sample was divided into two parts: one part in an aliquot of 100 μl was used directly for preparation of preparations with subsequent storage and further analysis for FDNKS, and the rest was used for spermogram [22].
Обработку эякулята проводили согласно следующим этапам [22]:The ejaculate was processed according to the following steps [22]:
1) аликвоту из 100 мкл свежего эякулята размещали на сухое одноразовое предметное1) an aliquot of 100 µl of fresh ejaculate was placed on a dry disposable slide
стекло;glass;
2) помещали стекло в термостат при 37°С на 25-30 минут до полного высушивания аликвоты;2) put the glass in a thermostat at 37°C for 25-30 minutes until the aliquot is completely dry;
3) доставали из термостата предметное стекло с высохшей аликвотой и оставляли на 2 мин при комнатной температуре 22°С;3) a glass slide with a dried aliquot was removed from the thermostat and left for 2 min at room temperature 22°C;
4) помещали стеклопрепарат в герметичный пластиковый контейнер для хранения при температуре -22°С на срок 28 дней для последующего отсроченного исследования;4) the glass preparation was placed in a sealed plastic container for storage at a temperature of -22°C for a period of 28 days for a subsequent delayed study;
5) через 28 дней хранения непосредственно перед оценкой ФДНКС доставали из пластикового контейнера замороженные высушенные на воздухе стеклопрепараты, оставляли их до комнатной температуры 22°С;5) after 28 days of storage, immediately before the evaluation of FDNKS, the frozen glass preparations dried in air were taken out of the plastic container and left to room temperature 22°C;
6) добавляли в высушенные аликвоты эякулята по 50 мкл восстанавливающей жидкости (фосфатно-солевого буферного раствора);6) added to the dried aliquots of ejaculate, 50 μl of recovery liquid (phosphate-buffered saline);
7) аккуратно перемешивали наконечником пипетки до образования однородной суспензии;7) mix gently with a pipette tip until a homogeneous suspension is formed;
8) полученную суспензию помещали в коническую микропробирку типа Эппендорф объемом 0,5 мл;8) the resulting suspension was placed in a 0.5 ml Eppendorf-type conical microtube;
9) использовали подготовленный образец эякулята для дальнейшего анализа с помощью В состав Набора входит:9) used the prepared ejaculate sample for further analysis using the Kit includes:
1) Пробирка типа Эппендроф с легкоплавкой агарозой (Реагент №1) - 10 шт,;1) Eppendrof-type test tube with low-melting agarose (Reagent No. 1) - 10 pcs.;
2) Фосфатно-солевой буферный раствор (Реагент №2) 50 мл;2) Phosphate-saline buffer solution (Reagent No. 2) 50 ml;
3) Денатурирующий раствор (Реагент №3) 100 мл;3) Denaturing solution (Reagent No. 3) 100 ml;
4) Лизирующий раствор (Реагент №4) 100 мл;4) Lysing solution (Reagent No. 4) 100 ml;
5) Дегидратирующий раствор 1 (Реагент №5) 50 мл;5) Dehydrating solution 1 (Reagent No. 5) 50 ml;
6) Дегидратирующий раствор 2 (Реагент №6) 50 мл;6) Dehydrating solution 2 (Reagent No. 6) 50 ml;
7) Дегидратирующий раствор 3 (Реагент 7) 50 мл;7) Dehydrating solution 3 (Reagent 7) 50 ml;
8) Раствор для фиксирования и предокрашивания (Реагент №8) 50 мл;8) Solution for fixing and prestaining (Reagent No. 8) 50 ml;
9) Окрашивающий раствор «розовый» (Реагент №9) 50 мл;9) Staining solution "pink" (Reagent No. 9) 50 ml;
10) Окрашивающий раствор «синий» (Реагент №10) 50 мл.10) Staining solution "blue" (Reagent No. 10) 50 ml.
Перед размещением на предметное стекло с предварительно нанесенным покрытием (с положительно заряженной поверхностью) для обеспечения наилучшего прикрепления клеточного материала к поверхности, образцы смешивали с инертным агарозным микрогелем, охлаждали и подвергали воздействию денатурирующего агента и лизирующего раствора. Затем предметные стекла окрашивали и оценивали ФДНКС путем подсчета на лабораторном счетчике 300 сперматозоидов на образец с помощью светопольной микроскопии под иммерсионным объективом х1000 [23, 24].Prior to being placed on a pre-coated (positively charged surface) glass slide to ensure the best adhesion of the cellular material to the surface, the samples were mixed with an inert agarose microgel, cooled and exposed to a denaturing agent and a lysing solution. The slides were then stained and the FDNCS was assessed by counting 300 spermatozoa per sample on a laboratory counter using bright-field microscopy under a x1000 immersion lens [23, 24].
Принцип действия Набора следующий: интактные (неповрежденные/нефрагментированные/цельные) молекулы ДНК расширяются после денатурации и экстракции ядерных белков с образованием нуклеол с большими специфическими ореолами (гало) расплетенных петель ДНК, которые выходят из центрального ядра. При фрагментации ДНК (повреждении целостности) дисперсия не развивается или минимальна и сопровождается образованием нуклеол без ореола рассеивания, либо ореол (гало) слабо выражены.The principle of operation of the Kit is as follows: intact (intact/unfragmented/whole) DNA molecules expand after denaturation and extraction of nuclear proteins to form nucleoli with large specific halos (halos) of untwisted DNA loops that emerge from the central nucleus. With DNA fragmentation (damage to integrity), dispersion does not develop or is minimal and is accompanied by the formation of nucleoli without a scattering halo, or the halo (halo) is weakly expressed.
Гало сперматозоидов в исследуемых препаратах классифицировали по 5 категориям (фиг. 1):Sperm halo in the studied preparations were classified into 5 categories (Fig. 1):
1. Фрагментация ДНК отсутствует - оптимальное качество эякулята - нет разрывов/повреждения ядерной днк сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с большим гало (large/l) (сперматозоид, размер гало которого больше или такой же, как внутренний диаметр ядра) (1).1. No DNA fragmentation - optimal quality of the ejaculate - no breaks/damages in the nuclear DNA of the spermatozoa microscopic picture of the preparation: spermatozoa with a large halo (large/l) (spermatozoa whose halo size is larger or the same as the internal diameter of the nucleus) (1).
2. Фрагментация ДНК присутствует, но без значимого влияния на эмбриогенез - некоторые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с гало среднего размера (medium/m) (сперматозоид с гало, размер которого меньше большого гало и больше малого гало сперматозоида) (2).2. DNA fragmentation is present, but without a significant effect on embryogenesis - some breaks/damages in the nuclear DNA of spermatozoa Microscopic picture of the preparation: spermatozoa with a medium-sized halo (medium/m) (2).
3. Фрагментация днк присутствует, субоптимальное качество эякулята - значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоид с малым гало (small/s) (сперматозоид, размер ореола которого меньше 1/3 или такой же, как внутренний диаметр ядра) (3).3. DNA fragmentation is present, suboptimal quality of the ejaculate - significant breaks / damage to the nuclear DNA of spermatozoa Microscopic picture of the preparation: spermatozoon with a small halo (small / s) (spermatozoon whose halo size is less than 1/3 or the same as the inner diameter of the nucleus) ( 3).
4. Фрагментация ДНК присутствует, неоптимальное качество эякулята - значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоид без гало (without halo /wh) (4).4. DNA fragmentation is present, suboptimal quality of the ejaculate - significant breaks/damages in the nuclear DNA of spermatozoa microscopic picture of the preparation: spermatozoon without halo (without halo / wh) (4).
5. Фрагментация ДНК присутствует, эякулят низкого качества- полная деградация ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: разрушенный сперматозоид без гало (without halo -degraded/whd) (сперматозоид без ореола и с ядром, которое неравномерно или слабо окрашено) (5).5. DNA fragmentation is present, poor quality ejaculate - complete degradation of sperm nuclear DNA Microscopic picture of the preparation: destroyed sperm without halo (without halo - degraded / whd) (sperm without halo and with a nucleus that is uneven or weakly colored) (5).
Производился подсчет процентного содержания сперматозоидов с фрагментированным ДНК согласно следующей формуле в соответствии с заявленной формулой изобретения:The percentage of spermatozoa with fragmented DNA was calculated according to the following formula in accordance with the claimed claims:
где:Where:
DFI (DNA Fragmentation Index) - индекс фрагментации ДНК сперматозоидов,DFI (DNA Fragmentation Index) - sperm DNA fragmentation index,
S - число сперматозоидов с малым гало,S is the number of spermatozoa with a small halo,
WH - число сперматозоидов без гало,WH - number of spermatozoa without halo,
WHD - число разрушенных сперматозоидов без гало,WHD - number of destroyed spermatozoa without halo,
N - число исследуемых сперматозоидов.N is the number of test spermatozoa.
Результаты анализа на отчете пациента записывали согласно следующим категориям:The results of the analysis on the patient report were recorded according to the following categories:
Число исследуемых сперматозоидов (N), % Number of test spermatozoa (N), %
Число сперматозоидов без фрагментации ДНК (L+M), % Number of spermatozoa without DNA fragmentation (L+M), %
Число сперматозоидов без фрагментации ДНК (L+M), % Number of spermatozoa without DNA fragmentation (L+M), %
Число сперматозоидов с фрагментацией ДНК (S+WH), % Number of spermatozoa with DNA fragmentation (S+WH), %
Число разрушенных/деградированных сперматозоидов (WHD), % Number of destroyed/degraded spermatozoa (WHD), %
Индекс фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI), % Sperm DNA Fragmentation Index (DFI), %
Далее проводили оценку результатов лабораторного анализа согласно следующим пороговым значениям в соответствии с формулой изобретения:Next, the laboratory analysis results were evaluated according to the following threshold values in accordance with the claims:
- норма: DFI<=15%,- norm: DFI<=15%,
- сомнительный результат: от DFI>15% до <25%,- doubtful result: from DFI>15% to <25%,
- патология: DFI>25%.- pathology: DFI>25%.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью стандартных компьютерных программ: GraphPad Prism 8.0.1 и Microsoft® Excel® для Microsoft 365 MSO (версия 2201 Сборка 16.0.14827.20158). Для оценки достоверности получаемых результатов, использовали коэффициент Пирсона (р) для параметрической статистики, коэффициент корреляции (г) и методы описательной статистики.Statistical processing of the results was performed using standard computer programs: GraphPad Prism 8.0.1 and Microsoft® Excel® for Microsoft 365 MSO (version 2201 Build 16.0.14827.20158). To assess the reliability of the results obtained, we used the Pearson coefficient (p) for parametric statistics, the correlation coefficient (r) and methods of descriptive statistics.
Результаты экспериментальных исследованийResults of experimental studies
У 54,1% (266/492=54,1%) мужчин, средний возраст которых составил 36,58 лет (стандартное отклонение 8,12; медиана возраста 34 года, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 59 лет) ФДНКС не была выявлена (DFI<=15%).54.1% (266/492=54.1%) of men with a mean age of 36.58 years (standard deviation 8.12; median age 34 years, minimum age 23 years, maximum age 59 years) did not have FDNCS. detected (DFI<=15%).
Согласно корреляционной матрице, у данной категории добровольцев была отмечена слабая прямая корреляция между низким уровнем ФДНКС и астенозооспермией (r=0,20; ρ 0,0001) и вискозипатией (r=0,13; p 0,0001), а также слабая обратная корреляция с олигоасте-нотератозооспермией (r=-0,12; ρ 0,0001). Отмечено также отсутствие пиоспермии у мужчин без ФДНКС (Таблица 2).According to the correlation matrix, this category of volunteers showed a weak direct correlation between a low level of FDNCS and asthenozoospermia (r=0.20; ρ 0.0001) and viscosipathia (r=0.13; p 0.0001), as well as a weak inverse correlation with oligoastenoteratozoospermia (r=-0.12; ρ 0.0001). The absence of pyospermia in men without FDNCS was also noted (Table 2).
В таблице 2 приведены результаты расчета следующих параметров:Table 2 shows the results of calculating the following parameters:
Параметр 1/ Parameter 1 - Нормозооспермия/normozoospermia,
Параметр 2/ Parameter 2 - Олигоастенотератозооспермия/oligoasthenoteratozoopermia,
Параметр 3/ Parameter 3 - Астенозооспермия/asthenozoospermia,
Параметр 4/ Parameter 4 - Олигостенозооспермия/ologoasthenozoospermia,
Параметр 5/ Parameter 5 - Дискинезия/dyskinesia,
Параметр 6/ Parameter 6 - Вискозипатия/viscosipathia,Parameter 6 / Parameter 6 - Viscosipathia / viscosipathia,
Параметр 7/ Parameter 7 - Лейкоспермия (Пиоспермия)/1еисозреггша,Parameter 7 / Parameter 7 - Leukospermia (Pyospermia) / 1 eusozreggsha,
Параметр 8/ Parameter 8 - Гемоспермия/hemospermia,Parameter 8 / Parameter 8 - Hemospermia / hemospermia,
Параметр 9/ Parameter 9 - Олигоспермия/oligospermia,Parameter 9 / Parameter 9 - Oligospermia / oligospermia,
Параметр 10/ Parameter 10 - Агглютинация/agglutination,Parameter 10 / Parameter 10 - Agglutination / agglutination,
Параметр 11/ Parameter 11 - Некрозооспермия/necrozoospermia,Parameter 11/ Parameter 11 - Necrozoospermia/necrozoospermia,
Параметр 12/ Parameter 12 - Индекс ФДНКС/DFI.Parameter 12/ Parameter 12 - FDNKS/DFI index.
У 21,3% (105/492=21,3%) мужчин, средний возраст которых составил 38,71 лет (стандартное отклонение 8,33; медиана возраста 39 лет, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 56 лет) выявлены сомнительные значения ФДНКС (DFI в диапазоне >15% до <25%).21.3% (105/492=21.3%) of men with a mean age of 38.71 years (standard deviation 8.33; median age 39 years, minimum age 23 years, maximum age 56 years) had doubtful values FDNKS (DFI in the range of >15% to <25%).
Согласно корреляционной матрице, у данной категории добровольцев была отмечена слабая прямая корреляция между сомнительным уровнем ФДНКС и олигоастенотератозоос-пермией (r=0,24; ρ 0,0001), олигоспермией (r=0,23; p 0,0001) и средним возрастом бесплодных мужчин 39 лет (r=0,17; ρ 0,0001); слабая обратная зависимость с астенозооспермией (r=-0,22; p 0,0001). (Табл. 3).According to the correlation matrix, in this category of volunteers, a weak direct correlation was noted between the questionable level of FDNCS and oligoasthenoteratozoos-permia (r=0.24; ρ 0.0001), oligospermia (r=0.23; p 0.0001) and mean age infertile men aged 39 (r=0.17; ρ 0.0001); weak inverse relationship with asthenozoospermia (r=-0.22; p 0.0001). (Table 3).
В таблице 3 приведены результаты расчета следующих параметров по результатам экспериментальных исследований:Table 3 shows the results of calculating the following parameters based on the results of experimental studies:
Параметр 1/ Parameter 1 - Нормозооспермия/normozoospermia,
Параметр 2/ Parameter 2 - Олигоастенотератозооспермия/oligoasthenoteratozoopermia,
Параметр 3/ Parameter 3 - Астенозооспермия/asthenozoospermia,
Параметр 4/ Parameter 4 - Олигостенозооспермия/ologoasthenozoospermia,
Параметр 5/ Parameter 5 - Дискинезия/dyskinesia,
Параметр 6/ Parameter 6 - Вискозипатия/viscosipathia,Parameter 6 / Parameter 6 - Viscosipathia / viscosipathia,
Параметр 7/ Parameter 7 - Лейкоспермия (Пиоспермия)/1еисо8репша,Parameter 7 / Parameter 7 - Leukospermia (Pyospermia) / leucospermia,
Параметр 8 /Parameter 8 - Гемоспермия/hemospermiaParameter 8 /Parameter 8 - Hemospermia/hemospermia
Параметр 9/ Parameter 9 - Олигоспермия/oligospermia,Parameter 9 / Parameter 9 - Oligospermia / oligospermia,
Параметр 10/ Parameter 10 - Агглютинация/agglutination,Parameter 10 / Parameter 10 - Agglutination / agglutination,
Параметр 11/ Parameter 11 - Некрозооспермия/necrozoospermia,Parameter 11/ Parameter 11 - Necrozoospermia/necrozoospermia,
Параметр 12/ Parameter 12 - Индекс ФДНКС/DFI.Parameter 12/ Parameter 12 - FDNKS/DFI index.
У 24,6% (121/492=24,6%) мужчин, средний возраст которых составил 41,55 лет (стандартное отклонение 9,06; медиана возраста 43 года, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 59 лет) была выявлена ФДНКС (DFI>25%).24.6% (121/492=24.6%) of men with a mean age of 41.55 years (standard deviation 9.06; median age 43 years, minimum age 23 years, maximum age 59 years) had FDNCS. (DFI>25%).
Согласно корреляционной матрице, у данной категории добровольцев была отмечена слабая прямая корреляция между уровнем ФДНКС и средним возрастом бесплодных мужчин 44 года (г=0,28; ρ 0,0001) (Табл.4).According to the correlation matrix, this category of volunteers showed a weak direct correlation between the level of FDNCS and the average age of infertile men 44 years (r=0.28; ρ 0.0001) (Table 4).
В таблице 3 приведены результаты расчета следующих параметров по результатам экспериментальных исследований:Table 3 shows the results of calculating the following parameters based on the results of experimental studies:
Параметр 1/ Parameter 1 - Нормозооспермия/normozoospermia,
Параметр 2/ Parameter 2 - Олигоастенотератозооспермия/oligoasthenoteratozoopermia,
Параметр 3/ Parameter 3 - Астенозооспермия/asthenozoospermia,
Параметр 4/ Parameter 4 - Олигостенозооспермия/ologoasthenozoospermia,
Параметр 5/ Parameter 5 - Дискинезия/dyskinesia,
Параметр 6/ Parameter 6 - Вискозипатия/viscosipathia,Parameter 6 / Parameter 6 - Viscosipathia / viscosipathia,
Параметр 7/ Parameter 7 - Лейкоспермия (Пиоспермия)Леисозреггта,Parameter 7 / Parameter 7 - Leukospermia (Pyospermia) Leisosereggta,
Параметр 8/ Parameter 8 - Гемоспермия/hemospermia,Parameter 8 / Parameter 8 - Hemospermia / hemospermia,
Параметр 9/ Parameter 9 - Олигоспермия/oligospermia,Parameter 9 / Parameter 9 - Oligospermia / oligospermia,
Параметр 10/ Parameter 10 - Агглютинация/agglutination,Parameter 10 / Parameter 10 - Agglutination / agglutination,
Параметр 11/ Parameter 11 - Некрозооспермия/necrozoospermia,Parameter 11/ Parameter 11 - Necrozoospermia/necrozoospermia,
Параметр 12/ Parameter 12 - Индекс ФДНКС/DFI.Parameter 12/ Parameter 12 - FDNKS/DFI index.
Согласно анализу всей обследуемой выборке бесплодных мужчин (n=492) установлена слабая прямая корреляция между возрастом мужчин и уровнем ФДНКС (r=0,1563, р=0,0005) (Табл. 5).According to the analysis of the entire surveyed sample of infertile men (n=492), a weak direct correlation was established between the age of men and the level of FDNCS (r=0.1563, p=0.0005) (Table 5).
Установлена слабая прямая корреляция между индексом ФДНКС и олиастенотератозо-оспермией (r=0,19; p<0,0001), пиоспермией (r=0,29; p<0,0001); некрозооспермией (r=0,16; p=0,0004) (Таб.6).A weak direct correlation was established between the FDNKS index and oliasthenoteratoso-ospermia (r=0.19; p<0.0001), pyospermia (r=0.29; p<0.0001); necrozoospermia (r=0.16; p=0.0004) (Table 6).
Заключение.Conclusion.
Отсутствие ФДНКС было установлено у 54,1% (266/492=54,1%) мужчин, средний возраст которых составил 36,58 лет (DFI<=15%); отмечена слабая прямая корреляция между нормальным уровнем ФДНКС и астенозооспермией (г=0,20; ρ 0,0001) и вискозипатией (r=0,13; p 0,0001); слабая обратная корреляция с олигоастенотератозооспермией (r=-0,12; ρ 0,0001); отмечено отсутствие пиоспермии.The absence of FDNCS was found in 54.1% (266/492=54.1%) of men, whose mean age was 36.58 years (DFI<=15%); a weak direct correlation was noted between the normal level of FDNCS and asthenozoospermia (r=0.20; ρ 0.0001) and viscosipathia (r=0.13; p 0.0001); weak inverse correlation with oligoasthenoteratozoospermia (r=-0.12; ρ 0.0001); the absence of pyospermia was noted.
Сомнительный результат по наличию ФДНКС установлен у 21,3% (105/492=21,3%) мужчин, средний возраст которых составил 38,71 лет (DFI в диапазоне >15% до <25%); отмечена слабая прямая корреляция между сомнительным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов (ФДНКС) и олигоастенотератозооспермией (r=0,24; ρ 0,0001), олигоспермией (r=0,23; ρ 0,0001) и средним возрастом 39 лет (r=0,17; p 0,0001); слабая обратная зависимость с астенозооспермией (r=-0,22; ρ 0,0001). ФДНКС была обнаружена у 24,6% (121/492=24,6%) мужчин, средний возраст которых составил 41,55 (DFI>25%); отмечена слабая прямая корреляция между высоким уровнем ФДНКС и средним возрастом 44 года (r=0,28; p 0,0001).A questionable result for the presence of FDNCS was found in 21.3% (105/492=21.3%) of men, whose mean age was 38.71 years (DFI in the range of >15% to <25%); there was a weak direct correlation between the questionable level of spermatozoa DNA fragmentation (FDNKS) and oligoasthenoteratozoospermia (r=0.24; ρ 0.0001), oligospermia (r=0.23; ρ 0.0001) and a mean age of 39 years (r=0 .17, p 0.0001); weak inverse relationship with asthenozoospermia (r=-0.22; ρ 0.0001). FDNCS was found in 24.6% (121/492=24.6%) of men, with a mean age of 41.55 (DFI>25%); there was a weak direct correlation between a high level of FDNC and a mean age of 44 years (r=0.28; p 0.0001).
Во всей обследуемой выборке бесплодных мужчин (n=492) установлена слабая прямая корреляция между уровнем ФДНКС и возрастом (r=0,1563, р=0,0005), олиастенотератозоос-пермией (r=0,19; p<0,0001), пиоспермией (r=0,29; p<0,0001) и некрозооспермией (r=0,16; p=0,0004).In the entire surveyed sample of infertile men (n=492), a weak direct correlation was established between the level of FDNCS and age (r=0.1563, p=0.0005), oliasthenoteratozoos-permia (r=0.19; p<0.0001) , pyospermia (r=0.29; p<0.0001) and necrozoospermia (r=0.16; p=0.0004).
Результаты настоящего исследования показали, что предлагаемый способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии днк-фрагментов сперматозоидов дополняет рутинную спермограмму, предоставляя конкретную информацию клиницисту о качестве генетического материала эякулята, что значительно повышает информативность проводимой диагностики и позволяет повысить эффективность лечения..The results of this study showed that the proposed method for laboratory diagnosis of male reproductive function based on the evaluation of the dispersion of DNA fragments of sperm complements the routine spermogram, providing specific information to the clinician about the quality of the genetic material of the ejaculate, which significantly increases the information content of the diagnosis and improves the effectiveness of treatment.
Валидированный протокол выполнения теста способствует стандартизации технологии выявления теста на дисперсию ДНК-фрагментов сперматозоидов в российских клинико-диагностических лабораториях и в специализированных эмбриологических лабораториях в целях скрининга нарушений мужской репродуктивной функции.The validated test protocol contributes to the standardization of the technology for detecting the test for the dispersion of DNA fragments of spermatozoa in Russian clinical diagnostic laboratories and in specialized embryological laboratories in order to screen for violations of male reproductive function.
Результаты быстрого и точного Гало-теста могут быть полезны клиницистам для разработки новых лечебно-диагностических стратегий и тактик у мужчин с нарушением фертильности как для естественного процесса репродукции, так и для ВРТ.The results of a fast and accurate Halo test can be useful for clinicians to develop new treatment and diagnostic strategies and tactics in men with impaired fertility, both for the natural process of reproduction and for ART.
Таким образом, рассмотренные клинические случаи использования диагностики по заявляемому способу наглядно показывают преимущества использования заявляемого способа диагностики, которые позволяет позволяют расширить диапазон распознаваемых до 90%.Thus, the considered clinical cases of the use of diagnostics by the claimed method clearly show the advantages of using the proposed diagnostic method, which allows you to expand the range of recognizable up to 90%.
Анализ практикующих врачей лабораторной медицины и урологов-андрологов РФ по работе с осадком эякулята представляется ценным профессиональным кейсом для пересмотра протоколов лабораторного обследования пациентов мужского пола в прегравидарной подготовке супружеской пары, в том числе рекомендуемым для обсуждения и пересмотра действующих КР и НПА РФ.The analysis of practicing laboratory medicine doctors and urologists-andrologists of the Russian Federation on working with ejaculate sediment seems to be a valuable professional case for revising the protocols for laboratory examination of male patients in preconception preparation of a married couple, including those recommended for discussion and revision of the existing CR and RLA of the Russian Federation.
Применение заявляемого способа диагностики позволяет избежать назначения дополнительных лабораторных методов, инструментальных диагностических процедур и необоснованной антибиотикотерапии, что отражает концепцию управления здоровьем и долголетием на основе корректного планирования медицинской и экономической эффективности в организации здравоохранения.The application of the proposed diagnostic method allows avoiding the appointment of additional laboratory methods, instrumental diagnostic procedures and unreasonable antibiotic therapy, which reflects the concept of health and longevity management based on the correct planning of medical and economic efficiency in a healthcare organization.
Таким образом, применение представленного способа позволяет исключить недостатки, присущие известным способам.Thus, the application of the presented method allows to eliminate the disadvantages inherent in known methods.
ЛИТЕРАТУРАLITERATURE
1. Aitken RJ., Bronson R., Smith ТВ., et al. The source and significance of DNA damage in human spermatozoa; a commentary on diagnostic strategies and straw man fallacies // Mol Hum Reprod 2013. Vol. 19, P. 475-85.1. Aitken RJ., Bronson R., Smith TV., et al. The source and significance of DNA damage in human spermatozoa; a commentary on diagnostic strategies and straw man fallacies // Mol Hum Reprod 2013. Vol. 19, P. 475-85.
2. Aitken RJ., De Iuliis GN. On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa // Mol Hum Reprod 2010. Vol. 16, N3.2. Aitken RJ., De Iuliis GN. On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa // Mol Hum Reprod 2010. Vol. 16, N3.
3. Agarwal Α., Said TM. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility // Hum Reprod Update 2003. Vol. 9, P. 331-45.3. Agarwal A., Said TM. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility // Hum Reprod Update 2003. Vol. 9, P. 331-45.
4. Aitken RJ. Impact of Oxidative Stress on Male and Female Germ Cells: Implications for Fertility // Reproduction 2020. Vol.159, N4. P.189-201. doi:10.1530/REP19-0452.4. Aitken R.J. Impact of Oxidative Stress on Male and Female Germ Cells: Implications for Fertility // Reproduction 2020. Vol.159, N4. P.189-201. doi:10.1530/REP19-0452.
5. Agarwal Α., Parekh N., Parmer Selvam MK., et al. Male Oxidative Stress Infertility (MOSI): Proposed Terminology and Clinical Practice Guidelines for Management of Idiopathic Male Infertility // World J. Mens Health 2019 Vol. 37, N3. P. 296-312. doi:10.5534/wjmh.190055.5. Agarwal A., Parekh N., Parmer Selvam M.K., et al. Male Oxidative Stress Infertility (MOSI): Proposed Terminology and Clinical Practice Guidelines for Management of Idiopathic Male Infertility // World J. Mens Health 2019 Vol. 37, N3. P. 296-312. doi:10.5534/wjmh.190055.
6. EstevesT SC. Interventions to prevent sperm DNA damage effects on reproduction // Advances in Experimental Medicine and Biology 2019. Vol.1166, P.119-148. doi: 10.1007/978-3-030-21664-1_8.6. EstevesT SC. Interventions to prevent sperm DNA damage effects on reproduction // Advances in Experimental Medicine and Biology 2019. Vol.1166, P.119-148. doi: 10.1007/978-3-030-21664-1_8.
7. McQueen DB., Zhang J., Robins JC. Sperm DNA fragmentation and recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis // Fertil Steril 2019. Vol. 112, P. 54-60.7. McQueen D.B., Zhang J., Robins JC. Sperm DNA fragmentation and recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis // Fertil Steril 2019. Vol. 112, P. 54-60.
8. Zheng WW., Song G., Wang QL., et al. Sperm DNA damage has a negative effect on early embryonic development following in vitro fertilization // Asian J Androl 2018. Vol.20. P.75-79. Доступно no: https://www.aiandrologv.eom/text.asp72018/20/l/75/209295. Ссылка активна на 28.08.2022.8. Zheng W. W., Song G., Wang Q. L., et al. Sperm DNA damage has a negative effect on early embryonic development following in vitro fertilization // Asian J Androl 2018. Vol.20. P.75-79. Available no: https://www.aiandrologv.eom/text.asp72018/20/l/75/209295. The link is active on 08/28/2022.
9. Hamilton TRDS, Assumpcao MEOD. Sperm DNA fragmentation: causes and identification // Zygote 2020. Vol.28, N 1. P.l-8. doi:10.1017/S0967199419000595.9. Hamilton TRDS, Assumpcao MEOD. Sperm DNA fragmentation: causes and identification // Zygote 2020. Vol.28,
10. Dutta S., Henkel R., Agarwal A. Comparative analysis of tests used to assess sperm chromatin integrity and DNA fragmentation. // Andrologia 2021. Vol.53, N 2. doi:10.1111/and.13718.10. Dutta S., Henkel R., Agarwal A. Comparative analysis of tests used to assess sperm chromatin integrity and DNA fragmentation. // Andrologia 2021. Vol.53,
11. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sixth Edition // World Health Organization 2021.11. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sixth Edition // World Health Organization 2021.
12. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M., et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology // Reprod Biomed Online 2003. Vol. 7, P. 477-484.12. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M., et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology // Reprod Biomed Online 2003. Vol. 7, P. 477-484.
13. Seli E., Gardner DK., Schoolcraft WB., et al. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization // Fertil Steril 2004. Vol.82, P. 378-383.13. Seli E., Gardner DK., Schoolcraft WB., et al. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization // Fertil Steril 2004. Vol. 82, P. 378-383.
14. Lin MH., Kuo-Kuang LR., Li SH., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates // Fertil Steril 2008. Vol. 90, P. 352-9.14. Lin MH., Kuo-Kuang LR., Li SH., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates // Fertil Steril 2008. Vol. 90, P. 352-9.
15. Lewis SE., Agbaje I., Alvarez J. Sperm DNA tests as useful adjuncts to semen analysis // Syst Biol Reprod Med 2008. Vol. 54, P. 111-25.15. Lewis SE., Agbaje I., Alvarez J. Sperm DNA tests as useful adjuncts to semen analysis // Syst Biol Reprod Med 2008. Vol. 54, P. 111-25.
16. Evenson DP. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA): 30 years of experience with the SCSA // Sperm Chromatin: Biological and Clinical Applications in Male Infertility and Assisted Reproduction 2011. P. 125-149. DOI 10.1007/978-1-4419-6857-9_9.16 Evenson DP. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA): 30 years of experience with the SCSA // Sperm Chromatin: Biological and Clinical Applications in Male Infertility and Assisted Reproduction 2011. P. 125-149. DOI 10.1007/978-1-4419-6857-9_9.
17. Robinson L., Gallos ID., Conner SJ., et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and metaanalysis // Hum Reprod 2012. Vol. 27, P. 2908-2917.17. Robinson L., Gallos ID., Conner SJ., et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and metaanalysis // Hum Reprod 2012. Vol. 27, P. 2908-2917.
18. Muratori M., De Geyter C. Chromatin condensation, fragmentation of DNA and differences in the epigenetic signature of infertile men // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2019. Vol. 33, N1. P. 117-26. DOI: 10.1016/j.beem.2018.10.004.18. Muratori M., De Geyter C. Chromatin condensation, fragmentation of DNA and differences in the epigenetic signature of infertile men // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2019. Vol. 33, N1. P. 117-26. DOI: 10.1016/j.beem.2018.10.004.
19. Esteves SC., Santi D., Simoni M. An update on clinical and surgical interventions to reduce sperm DNA fragmentation in infertile men // Andrology 2020. Vol. 8, N1. P. 53-81. https://doi.org/10.111 l/andr.12724.19. Esteves SC., Santi D., Simoni M. An update on clinical and surgical interventions to reduce sperm DNA fragmentation in infertile men // Andrology 2020. Vol. 8, N1. P. 53-81. https://doi.org/10.111l/andr.12724.
20. Javed Α., Talkad MS., Ramaiah MK. Evaluation of sperm DNA fragmentation using multiple methods: a comparison of their predictive power for male infertility // Clin Exp Reprod Med 2019. Vol. 46. P. 14-21.20. Javed A., Talkad MS., Ramaiah MK. Evaluation of sperm DNA fragmentation using multiple methods: a comparison of their predictive power for male infertility // Clin Exp Reprod Med 2019. Vol. 46. P. 14-21.
21. Sandro СЕ., Carmen LF., Mercedes GM., et al. Reliability of the sperm chromatin dispersion assay to evaluate sperm deoxyribonucleic acid damage in men with infertility // Fertility and Sterility 2022.Vol. 117. N1. P. 64-73. doi 10.1016/j.fertnstert.2021.08.04521. Sandro SE., Carmen LF., Mercedes GM., et al. Reliability of the sperm chromatin dispersion assay to evaluate sperm deoxyribonucleic acid damage in men with infertility // Fertility and Sterility 2022.Vol. 117. N1. P. 64-73. doi 10.1016/j.fertnstert.2021.08.045
22. McEvoy Α., Roberts P., Yap K. Development of a simplified method of human semen storage for the testing of sperm DNA fragmentation using the Halosperm G2 test kit // Fertil Steril 2014. Vol. 102. P. 981-988.22. McEvoy A., Roberts P., Yap K. Development of a simplified method of human semen storage for the testing of sperm DNA fragmentation using the Halosperm G2 test kit // Fertil Steril 2014. Vol. 102. P. 981-988.
23. Fernandez JL., Muriel L., Goyanes V., et al. Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test // Fertil Steril 2005. Vol. 84. P. 833-42.23. Fernandez JL., Muriel L., Goyanes V., et al. Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test // Fertil Steril 2005. Vol. 84. P. 833-42.
24. Fernandez JL., Cajigal D., Lopez-Fernandez C, et al. Assessing sperm DNA fragmentation with the sperm chromatin dispersion test // Methods Mol Biol 2011. Vol. 682. P. 291-301.24. Fernandez JL., Cajigal D., Lopez-Fernandez C, et al. Assessing sperm DNA fragmentation with the sperm chromatin dispersion test // Methods Mol Biol 2011. Vol. 682. P. 291-301.
Claims (27)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2795567C1 true RU2795567C1 (en) | 2023-05-05 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116908078A (en) * | 2023-09-14 | 2023-10-20 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | Method, device, storage medium and equipment for detecting sperm DFI |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2559575C2 (en) * | 2010-05-18 | 2015-08-10 | Юстус-Либиг-Универзитет Гиссен | Method for detecting sperm cell fertility and instant analysis of sperm cell fertility |
RU2620542C1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-05-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Method for determining the fertility of semmatazoids in patients with idiopatic infertility |
RU2673472C1 (en) * | 2017-11-30 | 2018-11-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" (ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д.О. Отта") | Method for assessing the quality of ejaculate by the content of spermatozoa with hydroxymethylated dna |
RU2730947C1 (en) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2559575C2 (en) * | 2010-05-18 | 2015-08-10 | Юстус-Либиг-Универзитет Гиссен | Method for detecting sperm cell fertility and instant analysis of sperm cell fertility |
RU2620542C1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-05-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Method for determining the fertility of semmatazoids in patients with idiopatic infertility |
RU2673472C1 (en) * | 2017-11-30 | 2018-11-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" (ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д.О. Отта") | Method for assessing the quality of ejaculate by the content of spermatozoa with hydroxymethylated dna |
RU2730947C1 (en) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Батуревич Л.В. и др. Значение индекса ДНК-фрагментации в диагностике мужской инфертильности. Лабораторная диагностика нарушений мужской фертильности. "Laboratory Diagnostics. Eastern Europe", 2022, volume 11, N1, с. 30-37. SATHANANTHAN A. et al. The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos. 1996 Feb; 11(2):345-56, реф., PubMed PMID: 8671223 [он-лайн] [29.12.2008]. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116908078A (en) * | 2023-09-14 | 2023-10-20 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | Method, device, storage medium and equipment for detecting sperm DFI |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Feijó et al. | Diagnostic accuracy of sperm chromatin dispersion test to evaluate sperm deoxyribonucleic acid damage in men with unexplained infertility | |
Giwercman et al. | Correlation between sperm motility and sperm chromatin structure assay parameters | |
Bungum et al. | Sperm chromatin structure assay (SCSA): a tool in diagnosis and treatment of infertility | |
Henkel et al. | TUNEL assay and SCSA determine different aspects of sperm DNA damage | |
Coughlan et al. | Sperm DNA fragmentation, recurrent implantation failure and recurrent miscarriage | |
Jedrzejczak et al. | Prediction of spontaneous conception based on semen parameters | |
Sikka et al. | Current updates on laboratory techniques for the diagnosis of male reproductive failure | |
US20230313295A1 (en) | Method of determining endometrial receptivity and application thereof | |
Haddock et al. | Sperm DNA fragmentation is a novel biomarker for early pregnancy loss | |
Tello-Mora et al. | Acrosome reaction and chromatin integrity as additional parameters of semen analysis to predict fertilization and blastocyst rates | |
Natali et al. | An assessment of new sperm tests for male infertility | |
Kızılay et al. | Sperm function tests in clinical practice | |
Schaff et al. | Novel centrifugal technology for measuring sperm concentration in the home | |
Wang et al. | Assessment of density gradient centrifugation (DGC) and sperm chromatin dispersion (SCD) measurements in couples with male factor infertility undergoing ICSI | |
Hwang et al. | Use of diagnostic testing to detect infertility | |
Nicopoullos et al. | Sperm DNA fragmentation in subfertile men: the effect on the outcome of intracytoplasmic sperm injection and correlation with sperm variables | |
Hassanen et al. | TUNEL assay: Establishing a sperm DNA fragmentation cut‐off value for Egyptian infertile men | |
Stahl et al. | Concordance among sperm deoxyribonucleic acid integrity assays and semen parameters | |
Craciunas et al. | The transcriptomic profile of endometrial receptivity in recurrent miscarriage | |
Rios et al. | Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation: predictors, fertility outcomes, and assays among infertile males | |
RU2795567C1 (en) | Method for laboratory diagnosis of male reproductive function based on evaluation of spermatozoa dna fragment dispersion | |
Pourmasumi et al. | Male factor testing in recurrent pregnancy loss cases: A narrative review | |
RU2697395C1 (en) | Method for prediction of idiopathic infertility of men | |
Zorn et al. | Seminal elastase‐inhibitor complex, a marker of genital tract inflammation, and negative IVF outcome measures: role for a silent inflammation? | |
RU2819094C1 (en) | Male reproductive function test method |