RU2730947C1 - Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons - Google Patents

Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons Download PDF

Info

Publication number
RU2730947C1
RU2730947C1 RU2020101921A RU2020101921A RU2730947C1 RU 2730947 C1 RU2730947 C1 RU 2730947C1 RU 2020101921 A RU2020101921 A RU 2020101921A RU 2020101921 A RU2020101921 A RU 2020101921A RU 2730947 C1 RU2730947 C1 RU 2730947C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
slide
minutes
smear
spermatozoa
air
Prior art date
Application number
RU2020101921A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Игорь Владимирович Виноградов
Михаил Юрьевич Габлия
Евгений Алексеевич Яценко
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС"
Priority to RU2020101921A priority Critical patent/RU2730947C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2730947C1 publication Critical patent/RU2730947C1/en
Priority to PCT/RU2021/000016 priority patent/WO2021145794A2/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to reproductive technologies, and can be used to determine the number of spermatozoons with fragmented DNA sections (IFn,%). That is ensured by using a fresh ejaculate, the smear of which is prepared for examination by liquefying the liquefied ejaculate with a phosphate-salt buffer with pH 7.2 and centrifugation at 2,400 rpm for 10 minutes, wherein precipitation is re-suspended in phosphate-salt buffer with pH 7.2 and concentration is adjusted to 20×10cells/ml; then smear is fixed on pre-cleaned defatted glass, then dried in air, obtaining a slide; said slide is fixed with alcohol fixing solution 96 %, and then dried in air and immersed in hydrolysing solution (0.1N HCl), followed by washing; staining slide in 0.05 % buffer solution of toluidine blue, washing in distilled water and drying in air; image cytometry is used to analyze the obtained results and to calculate the number of spermatozoa with fragmented DNA sections according to the presented formula, wherein the final result is the arithmetic mean of the results of at least three measurements, and if the IFis more than 30 % of the spermatozoons, the fertility is considered to be reduced.EFFECT: method enables higher accuracy of determining the number of spermatozoons with fragmented DNA sections with simplification and shorter duration of the procedure.7 cl

Description

Предметом настоящего изобретения является быстрый и точный способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах, который может быть введен в рутинную практику любых аналитических и ветеринарных лабораторий и лабораторий, специализирующихся на вопросах репродуктивной функции человека.The subject of the present invention is a fast and accurate method for determining the integrity of chromatin / DNA in spermatozoa, which can be introduced into the routine practice of any analytical, veterinary and reproductive laboratory.

Целостность хроматина/ДНК спермы является важным, независимым параметром качества спермы, который связан с потенциалом мужской фертильности, жизненно важна для успешной беременности и передачи генетического материала потомству.Sperm chromatin / DNA integrity is an important, independent parameter of sperm quality that is linked to male fertility potential, vital for a successful pregnancy and the transfer of genetic material to offspring.

Фрагментация ДНК в сперматозоидах характеризуется двухцепочечными и одноцепочечными разрывами молекулы ДНК. Это связано с дефицитом содержания в хромосомах специальных транспортных белков-протаминов, защищающих ДНК от внешних повреждений. Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и на ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно на формирование бластоцисты в предимплантационный период эмбрионального развития (т.е. до нидации зародыша к стенке матки). DNA fragmentation in spermatozoa is characterized by double-stranded and single-stranded breaks in the DNA molecule. This is due to a deficiency in the content of special transport proteins, protamines, in chromosomes, which protect DNA from external damage. Fragmentation of sperm DNA affects not only fertility, but also the early stages of embryonic development of the fetus, especially the formation of a blastocyst in the pre-implantation period of embryonic development (i.e., before the embryo is brought to the uterine wall).

В настоящее время в практике используется несколько методов для оценки состояния хроматина/ДНК сперматозоида. Эти методы могут давать диагностическую и прогностическую информацию, дополняющую, но отличную от информации, получаемой из стандартных параметров спермы (концентрация, подвижность и морфология).Currently, in practice, several methods are used to assess the state of chromatin / DNA of a sperm. These methods can provide diagnostic and prognostic information that is complementary to, but different from, information obtained from standard sperm parameters (concentration, motility and morphology).

Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. The study of the structure of chromatin is carried out using DNA staining with flurochromes. Cell staining with fluorescent dyes, i.e. DNA by flurochrome, occurs due to the ability of flurochrome to selectively stain double-stranded nucleic acids in the sperm itself.

В настоящее время стандартным методом для исследования фрагментации ДНК в сперматозоидах является определение структуры хроматина по Эвенсону (SCSA: Sperm Chromatin Staicture Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994). Currently, the standard method for studying DNA fragmentation in spermatozoa is the determination of the chromatin structure according to Evenson (SCSA: Sperm Chromatin Staicture Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994).

В SCSA сперма подвергается воздействию кислотой и окрашивается метахроматическим ДНК-красителем акридиновым оранжевым (АО). ДНК, денатурирующая в кислоте (фрагментированная, то есть аномальная), флуоресцирует красным, в то время как неповрежденная двухцепочечная ДНК флуоресцирует зеленым. Соотношение красной и зеленой флуоресценции в образце спермы контролируют с помощью проточной цитомерии (ПЦМ). ПЦМ в SCSA - метод исследования в режиме поштучного анализа клеточных элементов по сигналам флуоресценции, а именно, с исследованием одиночных клеток в потоке. Основа метода заключается в использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; облучении клетки лазерным излучением; регистрации сигналов флуоресценции от каждой клетки.In SCSA, sperm is exposed to acid and stained with metachromatic DNA dye acridine orange (AO). DNA denatured in acid (fragmented, i.e. abnormal) fluoresces in red, while intact double-stranded DNA fluoresces in green. The ratio of red and green fluorescence in a semen sample is monitored by flow cytomery (PCM). PCM in SCSA is a method of research in the mode of single-piece analysis of cellular elements by fluorescence signals, namely, with the study of single cells in a stream. The method is based on the use of a hydrofocusing system, which ensures the passage of cells in a stream one by one; irradiation of cells with laser radiation; registration of fluorescence signals from each cell.

Предполагается, что клетки «ненормальные», когда количество красной флюоресценции превышает определенный порог. Доля этих клеток рассматривается как индекс фрагментации ДНК (IF). SCSA «предсказывает бесплодие», когда IF превышает 30%, обосновывая его клиническое применение и широкое использование в проводимых исследованиях.Cells are assumed to be "abnormal" when the amount of red fluorescence exceeds a certain threshold. The proportion of these cells is considered as the DNA fragmentation index (IF). SCSA “predicts infertility” when IF exceeds 30%, justifying its clinical use and widespread use in ongoing research.

Однако метод SCSA, хотя и является надежным и высоко воспроизводимым, является дорогим методом, трудным для выполнения и не очень подходящим для рутинных лабораторных исследований (De Jonge, 2002). По этой причине качество ДНК сперматозоидов до сих пор широко не определяется, несмотря на то, что подтверждено его клиническое значение при изучении бесплодия. However, SCSA, while reliable and highly reproducible, is expensive, difficult to perform, and not very suitable for routine laboratory testing (De Jonge, 2002). For this reason, the quality of sperm DNA is still not widely defined, despite the fact that its clinical significance in the study of infertility has been confirmed.

Наиболее близким аналогом является способ по патенту RU 2657609 C1 14.06.2018, заключающийся в том, что спермопробу эякулят размораживают, фиксируют мазок спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°С. Приготавливают краситель смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-ного акридин оранжевого. Образцы погружают в краситель на 5-7 мин, далее мазок подсушивают на воздухе в течение 1-2 мин, микроскопируют. Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба эякулят выбраковывается.The closest analogue is the method according to patent RU 2657609 C1 06/14/2018, which consists in thawing the ejaculate sperm sample, fixing the smear with an alcoholic solution of acetic acid for 1 hour in a refrigerator at a constant temperature of + 5 ° C. A dye is prepared by mixing 40 ml of citric acid solution, 2.5 ml of sodium hydrogen phosphate solution and 10 ml of 1% acridine orange. The samples are immersed in the dye for 5-7 minutes, then the smear is dried in air for 1-2 minutes, microscoped. A separate count of spermatozoa with fragmented DNA and normal spermatozoa is carried out, while spermatozoa with fragmented DNA are colored red, yellow or orange, normal ones - green. For the final result, the arithmetic mean of the results of at least three measurements is taken; when a fragmentation index of more than 30% of the sperm sample is detected, the ejaculate is discarded.

Недостатками известного способа является низкая точность, длительность и сложность определения индекса фрагментации, обусловленная использованием криоконсервированного эякулята, длительное фиксирование мазка и использование специального флюрохромного красителя.The disadvantages of this method are low accuracy, duration and complexity of determining the fragmentation index due to the use of cryopreserved ejaculate, long-term fixation of the smear and the use of a special flurochromic dye.

Технической проблемой заявленного способа является устранение указанных недостатков аналога.The technical problem of the claimed method is the elimination of these disadvantages of the analogue.

Технический результат заключается в упрощении способа при повышении точности и сокращении времени, затрачиваемого на определение целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах.The technical result consists in simplifying the method while increasing the accuracy and reducing the time spent on determining the integrity of chromatin / DNA in spermatozoa.

Заявленный технически результат достигается в заявленном способе для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах, при котором подготавливают мазок эякулята к исследованию, фиксируют мазок, приготовляют краситель, окрашивают IF слайд красителем, вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК

Figure 00000001
, %, при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, отличающемся тем, чтоThe claimed technical result is achieved in the claimed method for determining the integrity of chromatin / DNA in spermatozoa, in which a smear of ejaculate is prepared for examination, the smear is fixed, a dye is prepared, the IF slide is stained with a dye, the number of spermatozoa with fragmented DNA regions is calculated
Figure 00000001
,%, while the arithmetic mean of the results of at least three measurements is taken as the final result, differing in that

- используют свежий (нативный) эякулят;- use fresh (native) ejaculate;

- подготовляют мазок эякулята к исследованию путем промывания разжиженного эякулята фосфатно-солевым буфером с pH7,2 и центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 минут, при этом повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH7,2 и доводят концентрацию до 20×106 клеток/мл;- prepare a smear of ejaculate for examination by washing the liquefied ejaculate with phosphate-buffered saline with pH 7.2 and centrifugation at 2500 rpm for 10 minutes, while resuspending the sediment in phosphate-buffered saline with pH 7.2 and adjusting the concentration to 20 × 10 6 cells / ml;

- фиксируют мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, после чего сушат на воздухе в течение 30 минут, получая IF слайд;- the smear is fixed on a previously cleaned defatted glass slide, after which it is air-dried for 30 minutes to obtain an IF slide;

- указанный IF слайд фиксируют фиксирующим раствором спирта 96%, инкубируя в течение 30 минут при +4°С, а затем сушат на воздухе в течение 30 минут;- the specified IF slide is fixed with a fixing solution of alcohol 96%, incubating for 30 minutes at + 4 ° C, and then air-dried for 30 minutes;

- погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl), инкубируя при +4°С в течение 5 мин.; - immersed in a hydrolysis solution (0.1N HCl), incubating at + 4 ° C for 5 minutes;

- после этого IF слайд промывают 3 раза в дистиллированной воде в течение 2 мин.; - after this IF slide is washed 3 times in distilled water for 2 minutes;

- окрашивают IF слайд в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий в течение 5 минут при комнатной температуре;- stain the IF slide in 0.05% buffer solution of toluidine blue dye for 5 minutes at room temperature;

- слайд кратко промывают в дистиллированной воде, а затем сушат на воздухе;- the slide is briefly washed in distilled water and then dried in air;

- посредством цитометрии изображения производят анализ полученных результатов и вычисляют количество сперматозоидов, с фрагментированными участками ДНК. Приготовление красителя заключается в смешивании 0.5 мл красителя толуидиновый синий с 9,5 мл смеси буфера McIlvaine с pH3,5-глицерин 50%.- by means of image cytometry, the obtained results are analyzed and the number of spermatozoa with fragmented DNA fragments is calculated. The dye preparation consists in mixing 0.5 ml of toluidine blue dye with 9.5 ml of a mixture of McIlvaine buffer with pH 3.5-glycerol 50%.

В международных исследованиях обнаружено, что ядра сперматозоидов с красной флуоресценцией в тесте SCSA соответствуют тем, которые окрашены в темно-фиолетовый цвет тиазиновым красителем толуидиновый синий. Доля темно-фиолетовых клеток также коррелирует с долей сперматозоидов, содержащих разрывы нитей ДНК, измеренной прямым методом обнаружения фрагментации ДНК, то есть анализом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL).In international studies, it has been found that the nuclei of sperm with red fluorescence in the SCSA test correspond to those stained in dark purple color with the thiazine dye toluidine blue. The proportion of dark purple cells also correlates with the proportion of spermatozoa containing DNA strand breaks, as measured by direct DNA fragmentation detection, that is, dUTP terminal deoxynucleotidyl transferase assay (TUNEL).

Заявленный способ основан на метахроматических свойствах тиазинового красителя толуидиновый синий. Способ заключается в окрашивании клеток красителем толуидиновый синий, после обработки соляной кислотой.The claimed method is based on the metachromatic properties of the thiazine dye toluidine blue. The method consists in staining cells with toluidine blue dye, after treatment with hydrochloric acid.

Молекула красителя толуидиновый синий связывается с фосфатными группами аномальной ДНК. Чем больше аномалий хроматина/ДНК, тем доступно больше фосфатных групп и яркость окрашивания увеличивается.The toluidine blue dye molecule binds to the phosphate groups of abnormal DNA. The more chromatin / DNA abnormalities, the more phosphate groups are available and the brightness of the staining increases.

Поэтому спектр светло-голубой (сперма с нормальным хроматинома/ДНК), фиолетовый (сперма с некоторыми отклонениями хроматина/ДНК), темно-фиолетовы (сперма с аномальным хроматином/ДНК).Therefore, the spectrum is light blue (sperm with normal chromatin / DNA), purple (sperm with some chromatin / DNA abnormalities), dark purple (sperm with abnormal chromatin / DNA).

В заявленном способе применяется цитометрии изображения для обнаружения сперматозоидов с нарушением целостности хроматина/ДНК. В отличие от ПЦМ, цитометрия изображение (ЦИ) - это статическая визуализация клеток, визуальная интерпретации данных с использованием оптической микроскопии. Перед анализом, клетки обычно окрашивают для повышения контрастности, или для обнаружения специфических молекул путем маркировки их с флюорохромами.The claimed method employs image cytometry to detect sperm with chromatin / DNA integrity. Unlike PCM, image cytometry (CI) is a static imaging of cells, a visual interpretation of data using optical microscopy. Before analysis, cells are usually stained to enhance contrast, or to detect specific molecules by labeling them with fluorochromes.

IF слайды оценивают под световым микроскопом, головки сперматозоидов с хорошей целостностью хроматина/ДНК окрашиваются в светло-голубой, с нарушенной целостностью хроматина/ДНК (1 - цепочечные разрывы ДНК) окрашены в фиолетовый и темно-фиолетовый цвет. При IF более 30% сперматозоидов фертильность значительно снижается.IF slides are assessed under a light microscope, sperm heads with good chromatin / DNA integrity are stained in light blue, with chromatin / DNA integrity impaired (1 - DNA strand breaks) are colored in violet and dark violet. With an IF of more than 30% of sperm, fertility is significantly reduced.

Заявленный способ реализован следующим образом.The claimed method is implemented as follows.

Свежий эякулят разжижают при +37°С в течение 30 мин. Разжиженный эякулят промывают фосфатно-солевым буфером с pH7,2 и центрифугируют при 2400 об/мин в течение 10 минут. Повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH7,2 и доводят концентрацию до 20×106 клеток/мл. Делают тонкий мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, а затем сушат на воздухе в течение 30 минут. Высохший мазок фиксируют фиксирующим раствором (спирт 96%) инкубируя в течение 30 минут при +40°С, а затем сушат на воздухе в течение 30 минут. Предметное стекло погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl), инкубируя при +40°С в течение 5 мин. После этого предметное стекло промывают 3 раза в дистиллированной воде в течение 2 минут. Слайд окрашивают буферным 0,05% раствором красителя толуидиновы синий (смешать 0.5 мл красителя толуидиновый синий с 9,5 мл смеси буфера McIlvaine с pH3,5-глицерин 50%) в течение 5 минут при комнатной температуре.Fresh ejaculate is diluted at + 37 ° C for 30 minutes. The liquefied ejaculate is washed with phosphate-buffered saline with pH 7.2 and centrifuged at 2400 rpm for 10 minutes. Resuspend the pellet in pH 7.2 phosphate buffered saline and adjust the concentration to 20 x 10 6 cells / ml. Make a thin smear on a previously cleaned defatted glass slide and then air dry for 30 minutes. The dried smear is fixed with a fixing solution (alcohol 96%), incubating for 30 minutes at + 40 ° C, and then air-dried for 30 minutes. The slide is immersed in a hydrolyzing solution (0.1N HCl), incubating at + 40 ° C for 5 minutes. After that, the slide is washed 3 times in distilled water for 2 minutes. The slide is stained with a 0.05% buffer solution of toluidine blue dye (mix 0.5 ml of toluidine blue dye with 9.5 ml of a mixture of McIlvaine buffer with pH 3.5-glycerol 50%) for 5 minutes at room temperature.

Слайд кратко промывают в дистиллированной воде, а затем сушат на воздухе. Полученный слайд пригоден для длительного хранения в архиве.The slide is rinsed briefly in distilled water and then air dried. The resulting slide is suitable for long-term archiving.

При световой микроскопии подсчитывают в общей сложности 200-300 сперматозоидов в разных областях предметного стекла (ЦИ), используя иммерсионное масло и увеличение × 1000. Головки сперматозоидов с хорошей целостностью хроматина/ДНК бледно-голубые, головки с пониженной целостностью - фиолетовые, темно-фиолетовые, и классифицируются как аномальные клетки. Under light microscopy, a total of 200-300 spermatozoa are counted in different areas of the glass slide (CI) using immersion oil and × 1000 magnification. Sperm heads with good chromatin / DNA integrity are pale blue, heads with reduced integrity are purple, dark purple , and are classified as abnormal cells.

Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в фиолетовый, темно-фиолетовый цвета, нормальные - в бледно-голубой цвет. Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IF n , % вычисляют по формуле,

Figure 00000002
, где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в фиолетовый, темно-фиолетовый, шт; С- - количество сперматозоидов, окрашенных в бледно-голубой, шт.A separate count of spermatozoa with fragmented DNA and normal spermatozoa is carried out, while spermatozoa with fragmented DNA are stained in purple, dark purple, and normal in pale blue. The number of spermatozoa with fragmented DNA regions IF n,% is calculated by the formula,
Figure 00000002
, where C + is the number of spermatozoa, colored in purple, dark purple, pcs; С - - the number of spermatozoa, colored in pale blue, pcs.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений.The final result is taken as the arithmetic mean of the results of at least three measurements.

Claims (19)

1. Способ определения количества сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК (IFn, %), при котором подготавливают мазок эякулята к исследованию, фиксируют мазок, приготовляют краситель, окрашивают слайд красителем, вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК, отличающийся тем, что1. A method for determining the number of spermatozoa with fragmented DNA regions (IFn,%), in which a smear of ejaculate is prepared for examination, a smear is fixed, a dye is prepared, the slide is stained with a dye, the number of spermatozoa with fragmented DNA regions is calculated, characterized in that - используют свежий эякулят;- using fresh ejaculate; - подготовляют мазок эякулята к исследованию путем промывания разжиженного эякулята фосфатно-солевым буфером с pH 7,2 и центрифугирования при 2400 об/мин в течение 10 минут, при этом повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH 7,2 и доводят концентрацию до 20×106 клеток/мл;- prepare a smear of ejaculate for examination by washing the liquefied ejaculate with phosphate-buffered saline with a pH of 7.2 and centrifugation at 2400 rpm for 10 minutes, while the sediment is resuspended in phosphate-buffered saline with a pH of 7.2 and the concentration is adjusted to 20 x 10 6 cells / ml; - фиксируют мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, после чего сушат на воздухе, получая слайд;- the smear is fixed on a previously cleaned defatted glass slide, after which it is dried in air to obtain a slide; - указанный слайд фиксируют фиксирующим раствором спирта 96%, а затем осуществляют сушку на воздухе;- the specified slide is fixed with a fixing solution of alcohol 96%, and then air drying is carried out; - погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl);- immersed in a hydrolysis solution (0.1N HCl); - после этого промывают слайд; - after that the slide is washed; - окрашивают слайд в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий;- stain the slide in 0.05% buffer solution of toluidine blue dye; - слайд промывают в дистиллированной воде, а затем сушат на воздухе;- the slide is washed in distilled water and then dried in air; - посредством цитометрии изображения производят анализ полученных результатов и вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК по следующей формуле:- by means of image cytometry, the obtained results are analyzed and the number of spermatozoa with fragmented DNA fragments is calculated according to the following formula:
Figure 00000003
,
Figure 00000003
, где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в фиолетовый, темно-фиолетовый, шт; С - количество сперматозоидов, окрашенных в бледно-голубой, шт., where C + is the number of spermatozoa, colored purple, dark purple, pcs; C - the number of sperm, colored in pale blue, pcs., при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, и при IFn более 30% сперматозоидов фертильность считают сниженной.at the same time, the arithmetic mean of the results of at least three measurements is taken as the final result, and if IFn is more than 30% of spermatozoa, fertility is considered reduced. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зафиксированный мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле сушат на воздухе в течение 30 минут.2. The method according to claim 1, characterized in that the fixed smear on a previously cleaned defatted glass slide is dried in air for 30 minutes. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубацию указанного слайда, зафиксированного фиксирующим раствором спирта 96%, осуществляют в течение 30 минут при +4°С, а сушку на воздухе осуществляют в течение 30 минут.3. The method according to claim 1, characterized in that the incubation of said slide, fixed with a fixing solution of 96% alcohol, is carried out for 30 minutes at + 4 ° C, and air drying is carried out for 30 minutes. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубацию погружением в гидролизующий раствор (0,1N HCl) осуществляют при +4°С в течение 5 минут.4. The method according to claim 1, characterized in that the incubation by immersion in a hydrolyzing solution (0.1N HCl) is carried out at + 4 ° C for 5 minutes. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что слайд промывают 3 раза в дистиллированной воде в течение 2 минут.5. The method according to claim 1, characterized in that the slide is washed 3 times in distilled water for 2 minutes. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашивание слайда в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий осуществляют в течение 5 минут при комнатной температуре.6. The method according to claim 1, characterized in that the staining of the slide in a buffer 0.05% solution of the toluidine blue dye is carried out for 5 minutes at room temperature. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что приготовление красителя заключается в смешивании 0.5 мл красителя толуидиновый синий с 9,5 мл смеси буфера Макилвейна с pH 3,5 - глицерин 50%. 7. The method according to claim 1, characterized in that the preparation of the dye consists in mixing 0.5 ml of the toluidine blue dye with 9.5 ml of a mixture of McIlwaine buffer with a pH of 3.5 - 50% glycerin.
RU2020101921A 2020-01-17 2020-01-17 Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons RU2730947C1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020101921A RU2730947C1 (en) 2020-01-17 2020-01-17 Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons
PCT/RU2021/000016 WO2021145794A2 (en) 2020-01-17 2021-01-15 Method for determining chromatin/dna integrity in spermatozoa

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020101921A RU2730947C1 (en) 2020-01-17 2020-01-17 Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2730947C1 true RU2730947C1 (en) 2020-08-26

Family

ID=72238018

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020101921A RU2730947C1 (en) 2020-01-17 2020-01-17 Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2730947C1 (en)
WO (1) WO2021145794A2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2795567C1 (en) * 2022-12-06 2023-05-05 Жанна Юрьевна Сапожкова Method for laboratory diagnosis of male reproductive function based on evaluation of spermatozoa dna fragment dispersion

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013064159A1 (en) * 2011-10-30 2013-05-10 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Means and methods for assessing sperm nuclear dna structure
RU2657609C1 (en) * 2017-08-08 2018-06-14 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) Method for determining the dna fragmentation index of spermatozoa in producer animals

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013064159A1 (en) * 2011-10-30 2013-05-10 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Means and methods for assessing sperm nuclear dna structure
RU2657609C1 (en) * 2017-08-08 2018-06-14 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) Method for determining the dna fragmentation index of spermatozoa in producer animals

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVENSON D.P. Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA)// Method Mol Biol., 2013;927:147-64. *
ОВЧИННИКОВ Р.И. и др. Причины репродуктивных потерь у мужчин-фрагментация ДНК сперматозоидов// РМЖ, No 11 от 26.06.2015, с.634. *
ОВЧИННИКОВ Р.И. и др. Причины репродуктивных потерь у мужчин-фрагментация ДНК сперматозоидов// РМЖ, No 11 от 26.06.2015, с.634. EVENSON D.P. Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA)// Method Mol Biol., 2013;927:147-64. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2795567C1 (en) * 2022-12-06 2023-05-05 Жанна Юрьевна Сапожкова Method for laboratory diagnosis of male reproductive function based on evaluation of spermatozoa dna fragment dispersion
RU2815686C1 (en) * 2023-09-04 2024-03-20 Татьяна Александровна Сорокина Method for detecting single-stranded and double-stranded dna breaks in male germ cells
RU2815686C9 (en) * 2023-09-04 2024-04-16 Татьяна Александровна Баранова Method for detecting single-stranded and double-stranded dna breaks in male germ cells

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021145794A3 (en) 2021-09-10
WO2021145794A2 (en) 2021-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Selvam et al. A systematic review on sperm DNA fragmentation in male factor infertility: laboratory assessment
CN108398407B (en) Human sperm motility rate and DNA damage double-parameter detection and analysis kit
US4615878A (en) Metachromatic dye sorption means for differential determination of sub-populations of lymphocytes
US20080199430A1 (en) Methods and kits for qualifying sperm cells
WO2017156843A1 (en) Kit for evaluating sperm quality and method of use thereof
Farah et al. Use of fluorescent dyes for readily recognizing sperm damage
US10718694B2 (en) Counterstains for a biological sample
Sousa et al. Dual use of Diff-Quik-like stains for the simultaneous evaluation of human sperm morphology and chromatin status
Dolník et al. Flow cytometry in assessment of sperm integrity and functionality–a review
RU2730947C1 (en) Method for determining integrity of chromatin/dna in spermatozoons
JP5092149B2 (en) Test method for sperm function
RU2657609C1 (en) Method for determining the dna fragmentation index of spermatozoa in producer animals
CN114324274B (en) Specific nucleic acid fluorescent staining reaction liquid and application thereof in sperm DNA integrity detection
Andraszek et al. Preliminary research on evaluation of sperm morphometry and chromatin structure in the semen of silver fox (Vulpes vulpes)
CN112014367A (en) Application of AuNPs1-2 pH probe in male infertility and product
CN113049559A (en) Sperm DNA fragmentation fluorescence detection method, detection kit and application thereof
US20080182290A1 (en) Apparatus and methods for determining viability of cell-based products
JP5557218B2 (en) Test method for sperm function
Susianti et al. Yoavita. Auto identify discrepancies between urine test strip and sediment results using cross check function on fully automated urine analyzer
RU2814377C1 (en) Method for determining need for assisted reproductive technologies (art) with sperm donation in idiopathic male infertility with non-obstructive azoospermia
El-Shorbagy et al. Excessive ROS generation and oxidative stress induction trigger chromatin dispersion and apoptosis in sperms of parents with recurrent implantation failure
RU2804207C1 (en) Method for predicting male infertility based on sperm dna fragmentation analysis
CN115326519A (en) Sperm DNA fragment staining kit and application thereof
WO2023176787A1 (en) Method for detecting sperm
Sharma et al. Sperm 8 and Indications