RU2792679C1

RU2792679C1 - Bactericidal pharmaceutical composition for parenteral use in the form of lyophilizate with endolysin

Info

Publication number: RU2792679C1
Application number: RU2021128274A
Authority: RU
Inventors: Евгений Валерьевич Усачев; Дарья Владимировна Васина; Владимир Алексеевич Гущин; Артем Петрович Ткачук; Сергей Михайлович Юдин; Валентин Владимирович Макаров; Сергей Александрович Краевой; Наталия Петровна Антонова
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-03-23

Abstract

FIELD: medicine; biotechnology.

SUBSTANCE: proposed bactericidal pharmaceutical composition, including, wt.%: recombinant modified endolysin LysECD7-SMAP — 0.1–0.5%, poloxamer 188 — 0.01%, phosphate buffer solution pH=7.5 — 99.49–99.89%; and the use of said composition as an antimicrobial agent.

EFFECT: expansion of the arsenal of pharmaceutical compositions with a pronounced specific antibacterial activity against gram-negative bacteria when used systemically, including bacteria with multidrug resistance.

2 cl, 2 dwg, 4 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs

Изобретение относится к медицине, а именно лекарственным средствам, предназначенным для борьбы с инфекциями, вызываемыми грамотрицательными бактериями.SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely medicines intended for combating infections caused by Gram-negative bacteria.

Уровень техникиState of the art

Устойчивость бактерий к существующим антимикробным средствам является одной из основных проблем современности в области здравоохранения. Горизонтальный перенос генов позволяет бактериям быстро приобретать новые механизмы резистентности, что, наряду с неправильным использованием и злоупотреблением антибиотиками среди населения, а также в сельском хозяйстве и промышленности, приводит к появлению штаммов, частично или полностью невосприимчивых к антибиотикам. Всемирная организация здравоохранения обращает особое внимание на патогены группы ESKAPE, к которым относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и другие представители Enterobacteriaceae. Данные бактерии способны приобретать устойчивость сразу к нескольким антибактериальным средствам и чаще других вызывают опасные для жизни пациентов инфекции, в том числе и внутрибольничные. Перечисленные обстоятельства диктуют актуальность и востребованность разработки новейших средств, обладающих антибактериальными свойствами в отношении данных патогенных микроорганизмов.The resistance of bacteria to existing antimicrobial agents is one of the main problems of our time in the field of public health. Horizontal gene transfer allows bacteria to quickly acquire new mechanisms of resistance, which, along with the misuse and abuse of antibiotics among the population, as well as in agriculture and industry, leads to the emergence of strains that are partially or completely resistant to antibiotics. The World Health Organization pays special attention to the pathogens of the ESKAPE group, which include Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae and other representatives of Enterobacteriaceae. These bacteria are capable of acquiring resistance to several antibacterial agents at once and more often than others cause life-threatening infections in patients, including nosocomial infections. These circumstances dictate the relevance and demand for the development of new products with antibacterial properties in relation to these pathogenic microorganisms.

Из уровня техники из патента RU 2715694 С1 02.03.2020 фармацевтическая композиция для лечения глазных инфекций, вызванных метициллин-устойчивыми штаммами Staphylococcus aureus, включающая в качестве активного начала N-концевой СНАР-домен эндолизина бактериофага K Staphylococcus aureus, при следующем соотношении компонентов в лиофилизованной смеси, мас. % на сухой вес: N-концевой СНАР-домен эндолизина Бактериофага K Staphylococcus aureus 1,9 гипромеллоза 7,5 декспантенол 5,1 натрия хлорид 33,0 бензалкония хлорид 0,6 повидон 30,3 лимонная кислота моногидрат 0,8 двузамещенный натрия фосфат 10,8.From the prior art from patent RU 2715694 C1 02.03.2020 pharmaceutical composition for the treatment of eye infections caused by methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus, including the N-terminal CHAP domain of bacteriophage K Staphylococcus aureus endolysin as an active principle, with the following ratio of components in a lyophilized mixture , wt. % on dry weight: N-terminal CHAP domain of endolysin Bacteriophage K Staphylococcus aureus 1.9 hypromellose 7.5 dexpanthenol 5.1 sodium chloride 33.0 benzalkonium chloride 0.6 povidone 30.3 citric acid monohydrate 0.8 dibasic sodium phosphate 10.8.

Однако известная композиция не обладает антибактериальными свойствами по отношению к грамотрицательным бактериям и не может быть применена для лечения и профилактики инфекций, вызываемых ими. Также указанная композиция не предназначена для парентерального использования, в связи с чем не имеет системного действия.However, the known composition does not have antibacterial properties against gram-negative bacteria and cannot be used for the treatment and prevention of infections caused by them. Also, the specified composition is not intended for parenteral use, and therefore has no systemic effect.

Описание изобретенияDescription of the invention

Заявленная бактерицидная фармацевтическая композиция для парентерального применения в форме лиофилизата имеет следующий состав, мас. %:The claimed bactericidal pharmaceutical composition for parenteral use in the form of a lyophilizate has the following composition, wt. %:

• рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,1-0,5%,• recombinant modified endolysin LysECD7-SMAP - 0.1-0.5%,

• полоксамер 188 - 0,01%,• poloxamer 188 - 0.01%,

• фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 99,49-99,89%.• Phosphate buffer solution pH=7.5 - 99.49-99.89%.

Задачами настоящей фармацевтической композиции для парентерального применения в форме лиофилизата являются лечение и профилактика различных видов системных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, чувствительными к действию эндолизина LysECD7-SMAP.The objectives of the present pharmaceutical composition for parenteral use in the form of a lyophilizate are the treatment and prevention of various types of systemic infections caused by gram-negative bacteria sensitive to the action of LysECD7-SMAP endolysin.

В частности, LysECD7-SMAP активен в отношении возбудителей различных инфекций, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью, включая Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex и Enterobacter spp. Кроме того, возможно применение препаратов на его основе в отношении Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.In particular, LysECD7-SMAP is active against pathogens of various infections, including those with multidrug resistance, including Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex and Enterobacter spp. In addition, it is possible to use preparations based on it against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes.

Бактерицидное средство - эндолизин - разрушает клеточную стенку грамположительных и грамотрицательных бактерий, вызывая их гибель.The bactericidal agent - endolysin - destroys the cell wall of gram-positive and gram-negative bacteria, causing their death.

Технический результат заключается в использовании фармацевтической композиции, обладающей выраженной специфической фармакологической (антибактериальной) активностью в отношении грамотрицательных бактерий при системном применении, включая бактерии с множественной лекарственной устойчивостью.The technical result consists in the use of a pharmaceutical composition with a pronounced specific pharmacological (antibacterial) activity against gram-negative bacteria when used systemically, including bacteria with multidrug resistance.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Указанный технический результат реализуется за счет определенного состава фармацевтической композиции, а также определенных дозировок ингредиентов, входящих в состав композиции.The specified technical result is realized due to a certain composition of the pharmaceutical composition, as well as certain dosages of the ingredients that make up the composition.

Бактерицидная фармацевтическая композиция для парентерального применения в форме лиофилизата имеет следующий состав, мас. %: рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,1-0,5%, полоксамер 188 - 0,01%, фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 99,49-99,89%.The bactericidal pharmaceutical composition for parenteral use in the form of a lyophilizate has the following composition, wt. %: recombinant modified endolysin LysECD7-SMAP - 0.1-0.5%, poloxamer 188 - 0.01%, phosphate buffer solution pH=7.5 - 99.49-99.89%.

Пример 1Example 1

Действующим веществом в композиции является модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP, аминокислотная последовательность которого представлена в перечне аминокислотных последовательностей Seq ID №1.The active substance in the composition is a modified endolysin LysECD7-SMAP, the amino acid sequence of which is presented in the list of amino acid sequences Seq ID No. 1.

Эндолизин получают биотехнологическим путем посредством создания генетической конструкции для экспрессии в штамме Е. coli Bl21(DE3)pLysS. Исходная кодирующая последовательность LysECD7-SMAP была искусственно синтезирована в векторе pALTA-LysECD7-SMAP и интегрирована в экспрессионный вектор рЕТ-42b (+), в результате чего получали плазмиду pET42b-LysECD7-SMAP.Endolysin is produced biotechnologically by creating a genetic construct for expression in E. coli strain Bl21(DE3)pLysS. The original LysECD7-SMAP coding sequence was artificially synthesized in the pALTA-LysECD7-SMAP vector and integrated into the pET-42b (+) expression vector, resulting in the pET42b-LysECD7-SMAP plasmid.

Субстанцию белка получают по следующей технологии: культивирование клеток-продуцентов Е. coli в ферментере с индукцией экспрессии белка, получение растворимых фракций лизатов биомассы клеток продуцента, их трехстадийная хроматографическая очистка (катионообменная хроматография на носителе Capto SP Impres, с последующей двухэтапной гель-эксклюзионной хроматографией на носителях Superdex 75 и Sephadex G25) и концентрирование препарата до концентрации 20 мг/мл.The protein substance is obtained according to the following technology: cultivation of E. coli producer cells in a fermenter with induction of protein expression, obtaining soluble fractions of producer cell biomass lysates, their three-stage chromatographic purification (cation-exchange chromatography on a Capto SP Impres carrier, followed by two-stage gel exclusion chromatography on carriers Superdex 75 and Sephadex G25) and concentrating the drug to a concentration of 20 mg/ml.

Далее для формуляции лекарственного препарата полученную ФС модифицированного эндолизина LysECD7-SMAP разбавляют стерильным раствором PBS, рН 7,5 до конечных концентраций 1 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл, а затем смешивают с 10% раствором Полоксамера 188 до концентрации 0,01% и фильтруют с помощью одноразовых фильтрационных систем в асептических условиях. Растворы разливают в стерильные стеклянные флаконы и подвергают лиофильной сушке.Further, to formulate the drug, the obtained PS of the modified endolysin LysECD7-SMAP is diluted with a sterile solution of PBS, pH 7.5 to final concentrations of 1 mg/ml, 2.5 mg/ml and 5 mg/ml, and then mixed with a 10% solution of Poloxamer 188 to a concentration of 0.01% and filtered using disposable filtration systems under aseptic conditions. The solutions are poured into sterile glass vials and freeze-dried.

Пример 2Example 2

Оценка спектра действия и степени антибактериальной активности ГЛФ на основе LysECD7-SMAP проводилась в экспериментах in vitro в отношении широкого спектра различных представителей как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Каждый вид был представлен 4-5 штаммами или клиническими изолятами с различной степенью устойчивости к антибиотикам. В концентрации 100 мкг/мл эндолизин проявлял бактерицидную активность в отношении 47 штаммов из 59 исследуемых с активностью выше 33,33%).The evaluation of the spectrum of action and the degree of antibacterial activity of GLF based on LysECD7-SMAP was carried out in experiments in vitro against a wide range of different representatives of both gram-negative and gram-positive bacteria. Each species was represented by 4-5 strains or clinical isolates with varying degrees of antibiotic resistance. At a concentration of 100 µg/ml, endolysin exhibited bactericidal activity against 47 strains out of 59 studied with an activity above 33.33%.

При этом спектр активности и эффективность в отношении грамотрицательных штаммов был ожидаемо выше, чем по отношению к грамположительным бактериям. Особенно ярко выраженная активность была отмечена к представителям таких видов как Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex и Enterobacter spp, медианное значение антибактериальной активности к ним составляло более 50%, а для двух видов - 100% (фиг. 1).At the same time, the spectrum of activity and efficiency in relation to gram-negative strains was expectedly higher than in relation to gram-positive bacteria. Especially pronounced activity was noted against representatives of such species as Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex and Enterobacter spp, the median value of antibacterial activity to them was more than 50%, and for two species - 100 % (Fig. 1).

Также LysECD7-SMAP проявлял выраженную активность по отношению к грамположительным Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes. Таким образом, в спектр антибактериальной активности модифицированного эндолизина входят практически все представители социально значимой группы патогенных бактерий ESKAPE, а также другие важные возбудители инфекционных заболеваний различной этиологии.LysECD7-SMAP also showed a pronounced activity against Gram-positive Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Thus, the spectrum of antibacterial activity of the modified endolysin includes almost all representatives of the socially significant group of pathogenic bacteria ESKAPE, as well as other important pathogens of infectious diseases of various etiologies.

Пример 3Example 3

Самкам мышей линии BALB/c (24-26 г) внутрибрюшинно вводили взвесь клеток штамма K. pneumoniae М9 в дозе 1×10³ КОЕ/животное. Спустя 2 часа после заражения внутривенно вводили исследуемую ГЛФ с концентрацией эндолизина 1, 2,5 и 5 мг/мл, плацебо или антибиотики гентамицин и ампициллин в соответствии с планом эксперимента. Лечение проводили ежедневно, 5 дней, 2 раза в сутки. В течение 10 суток за животными проводили наблюдение, учитывали их гибель и ежедневно регистрировали массу тела животных (фиг. 2). На 1, 3 и 7 сутки проводили оценку обсемененности селезенки и легких, а на 1 и 3 сутки - высевы из крови методом бактериологического посева различных разведений крови или гомогенатов органов на плотную питательную среду с дальнейшим культивированием в течение 18 ч при температуре 37°С, проводя подсчет выросших бактериальных колоний.Female mice of the BALB/c line (24-26 g) were intraperitoneally injected with a suspension of cells of the K. pneumoniae M9 strain at a dose of 1×10 ³ CFU/animal. 2 hours after infection, the studied GLF was administered intravenously at endolysin concentrations of 1, 2.5 and 5 mg/ml, placebo or antibiotics gentamicin and ampicillin in accordance with the experimental plan. The treatment was carried out daily, 5 days, 2 times a day. Within 10 days, the animals were observed, their death was taken into account, and the body weight of the animals was recorded daily (Fig. 2). On the 1st, 3rd and 7th days, the contamination of the spleen and lungs was assessed, and on the 1st and 3rd days - seeding from the blood by bacteriological seeding of various dilutions of blood or organ homogenates on a solid nutrient medium with further cultivation for 18 hours at a temperature of 37°C, by counting the grown bacterial colonies.

С учетом оценки обсемененности паренхиматозных органов, а также высевов крови животных, двукратное внутривенное ежедневное введении ГЛФ в концентрации 2,5 мг/мл в течение 5 дней показало наибольшую эффективность при лечении бактериального клебсиеллезного сепсиса в изученной модели, при этом, в отдельных случаях, эффективность применения была сопоставима с применением гентамицина, к действию которого клетки модельного штамма чувствительны.Taking into account the assessment of contamination of parenchymal organs, as well as blood cultures of animals, twice intravenous daily administration of GLF at a concentration of 2.5 mg/ml for 5 days showed the greatest effectiveness in the treatment of bacterial Klebsiella sepsis in the studied model, while, in some cases, the effectiveness application was comparable to the use of gentamicin, to which the cells of the model strain are sensitive.

Пример 4Example 4

Самкам мышей линии BALB/c (24-26 г) интраназально вводили взвесь клеток штамма K. pneumoniae М9 в дозе 2×10⁶ КОЕ/животное. Спустя 2 часа после заражения внутривенно вводили исследуемую ГЛФ с концентрацией эндолизина 2,5 мг/мл или плацебо в соответствии с планом эксперимента. Лечение проводили ежедневно, 5 дней, 1 или 2 раза в сутки. В течение 10 суток за животными проводили наблюдение, учитывали их гибель и ежедневно регистрировали массу тела животных. На 1, 3 и 7 сутки проводили оценку обсемененности селезенки и легких, а на 1 и 3 сутки - высевы из крови методом бактериологического посева различных разведений крови или гомогенатов органов на плотную питательную среду с дальнейшим культивированием в течение 18 ч при температуре 37°С, проводя подсчет выросших бактериальных колоний.Female mice of the BALB/c line (24-26 g) were intranasally injected with a suspension of cells of the K. pneumoniae M9 strain at a dose of 2×10 ⁶ CFU/animal. 2 hours after infection, the studied GLF was administered intravenously at a concentration of endolysin 2.5 mg/ml or placebo in accordance with the experimental plan. The treatment was carried out daily, 5 days, 1 or 2 times a day. Within 10 days, the animals were observed, their death was taken into account, and the body weight of the animals was recorded daily. On the 1st, 3rd and 7th days, the contamination of the spleen and lungs was assessed, and on the 1st and 3rd days - seeding from the blood by bacteriological seeding of various dilutions of blood or organ homogenates on a solid nutrient medium with further cultivation for 18 hours at a temperature of 37°C, by counting the grown bacterial colonies.

В ходе проведенного исследования было показано, что при лечении клебсиеллезной пневмонии ГЛФ на основе модифицированного эндолизина LysECD7-SMAP в концентрациях 1, 2,5 и 5 мг/мл, выживаемость испытуемых мышей линии BALB/c значимо повышается при двукратном внутривенном ежедневном лечении. Кроме того, показано снижение обсемененности легких при введении препарата в дозе 2,5 мг/мл в течение 5 дней.In the course of the study, it was shown that in the treatment of Klebsiella pneumonia with GLF based on modified endolysin LysECD7-SMAP at concentrations of 1, 2.5 and 5 mg/ml, the survival rate of the tested mice of the BALB/c line significantly increases with twice daily intravenous treatment. In addition, a decrease in the contamination of the lungs with the introduction of the drug at a dose of 2.5 mg/ml for 5 days is shown.

Заявленная фармацевтическая композиция может быть получена специалистом на практике и при ее использовании обеспечивает реализацию заявленного назначения. Возможность осуществления на практике следует из того, что для каждого ингредиента, включенного в формулу изобретения на основании описания, известен материальный эквивалент, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения и критерию «полнота раскрытия» для изобретения.The claimed pharmaceutical composition can be obtained by a specialist in practice and, when used, ensures the implementation of the claimed purpose. The possibility of implementation in practice follows from the fact that for each ingredient included in the claims based on the description, a material equivalent is known, which allows us to conclude that the criterion "industrial applicability" for the invention and the criterion "complete disclosure" for the invention.

ПЕРЕЧЕНЬ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙAMINO ACID SEQUENCE LISTING

Seq ID №1Seq ID #1

MFKLSQRSKD RLVGVHPDLV KVVHRALELT PVDFGITEGV RSLETQKKYV AEGKSKTMKS 60 MFKLSQRSKD RLVGVHPDLV KVVHRALELT PVDFGITEGV RSLETQKKYV AEGKSKTMKS 60

RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD AFKQAGRELG VSVEWGGDWV SFKDGVHFQL 120 RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD AFKQAGRELG VSVEWGGDWV SFKDGVHFQL 120

PHSKYPDPKL ERKLRRLKRK IAHKVKKY 148PHSKYPDPKL ERKLRRLKRK IAHKVKKY 148

Claims

1. Bactericidal pharmaceutical composition for parenteral use in the form of a lyophilisate having the following composition, wt. %:

recombinant modified endolysin LysECD7-SMAP with amino acid sequence:

MFKLSQRSKD RLVGVHPDLV KVVHRALELT PVDFGITEGV RSLETQKKYV AEGKSKTMKS 60

RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD AFKQAGRELG VSVEWGGDWV SFKDGVHFQL 120

PHSKYPDPKL ERKLRRLKRK IAHKVKKY 148 - 0.1-0.5%,

poloxamer 188 - 0.01%,

phosphate buffer solution pH=7.5 - 99.49-99.89%.

2. The use of a bactericidal composition according to claim 1 as an antimicrobial agent against sensitive bacterial species Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex, Enterobacter spp, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes.