RU2791172C1 - Primer kit, reagent and commercial kit for methylation of specific gene regions associated with human colorectal cancer and use of the commercial kit - Google Patents
Primer kit, reagent and commercial kit for methylation of specific gene regions associated with human colorectal cancer and use of the commercial kit Download PDFInfo
- Publication number
- RU2791172C1 RU2791172C1 RU2022111047A RU2022111047A RU2791172C1 RU 2791172 C1 RU2791172 C1 RU 2791172C1 RU 2022111047 A RU2022111047 A RU 2022111047A RU 2022111047 A RU2022111047 A RU 2022111047A RU 2791172 C1 RU2791172 C1 RU 2791172C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primer
- probe
- referred
- positive
- methylation
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, более конкретно, к набору праймеров, реагенту, коммерческому набору для выявления метилирования конкретных областей генов, связанных с колоректальным раком у человека, в кале, крови или ткани с применением специфической ПЦР, а также к применению коммерческого набора, которые подходят для осуществления выявления в геноме человека с целью выявления, происходит ли метилирование в конкретных областях генов, связанных с колоректальным раком и предраковой аденомой. The present invention relates to the field of biotechnology and, more specifically, to a primer kit, a reagent, a commercial kit for detecting methylation of specific regions of genes associated with human colorectal cancer in feces, blood or tissue using specific PCR, as well as the use of a commercial kit , which are suitable for performing detection in the human genome to determine whether methylation occurs in specific regions of genes associated with colorectal cancer and precancerous adenoma.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Колоректальный рак, также известный как распространенная аденома, является известной злокачественной опухолью пищеварительной системы. Текущие результаты исследований позволяют предположить, что частота возникновения колоректального рака связана не только с генетическими факторами, которые свидетельствуют об очевидной тенденции семейного наследования, но также связана с влиянием различных факторов внешней среды. Эпителиальные клетки колоректальной слизистой оболочки сначала претерпевают генетические и эпигенетические изменения под сочетанным действием ряда факторов, приобретая способность к злокачественной пролиферации, инвазии, инфильтрации и метастазированию, затем формируют локальные опухолевидные образования и, наконец, формируют метастазы в лимфатических узлах и других тканях и органах. В последние годы было показано, что в стране автора настоящего изобретения с повышением уровня жизни людей, изменениями в рационе питания и привычках, увеличением продолжительности жизни и тенденцией к старению населения заболеваемость колоректальным раком и смертность от него имеют линейную тенденцию к росту, а возраст начала заболевания имеет прогрессирующую тенденцию. Согласно "2015 China Cancer Statistics", опубликованной в "CA: A Cancer Journal for Clinicians", колоректальный рак занимает пятое место по заболеваемости раком у мужчин и четвертое у женщин, а также колоректальный рак занимает пятое место по смертности от рака как у мужчин, так и у женщин. Хотя современные хирургические способы и способы адъювантного лечения постоянно совершенствуются, послеоперационная выживаемость пациентов с колоректальным раком значительно улучшилась, все же уровень общей выживаемости пациентов в пределах пятилетнего периода времени все еще не является оптимальным, что в основном обусловлено тем, что уровень выживаемости тесно связан со стадией развития опухоли у пациентов с колоректальным раком, - выживаемость пациентов с ранней стадией колоректального рака после операции в пределах 5-летнего периода времени превышает 90%, однако у большинства пациентов появление симптомов или обнаружение заболевания происходит, когда опухоль уже развилась до средней или поздней стадии. Поскольку 93% случаев колоректального рака возникают на фоне аденом, большинство из них не имеют характерных симптомов на ранней стадии, а для перехода от аденом к раку требуется от 3 до 17 лет, что обеспечивает временную основу для раннего скрининга. Следовательно, для улучшения уровня общей выживаемости пациентов важными аспектами являются скрининг населения с высоким риском развития колоректального рака, раннее выявление и диагностика пациентов с колоректальным раком и раннее лечение пациентов с колоректальным раком.Colorectal cancer, also known as advanced adenoma, is a well-known malignant tumor of the digestive system. Current research suggests that the incidence of colorectal cancer is not only related to genetic factors, which indicate an obvious familial trend, but also related to the influence of various environmental factors. Epithelial cells of the colorectal mucosa first undergo genetic and epigenetic changes under the combined action of a number of factors, acquiring the ability for malignant proliferation, invasion, infiltration, and metastasis, then form local tumor-like formations, and, finally, form metastases in the lymph nodes and other tissues and organs. In recent years, it has been shown that in the country of the present inventor, with the improvement of people's living standards, changes in diet and habits, the increase in life expectancy, and the aging trend of the population, the incidence of colorectal cancer and mortality from it have a linear upward trend, and the age of onset of the disease has a progressive trend. According to "2015 China Cancer Statistics" published in "CA: A Cancer Journal for Clinicians", colorectal cancer ranks fifth in cancer incidence in men and fourth in women, and colorectal cancer ranks fifth in cancer mortality in both men, so do women. Although modern surgical and adjuvant treatment methods are constantly being improved, the postoperative survival of patients with colorectal cancer has improved significantly, yet the overall survival rate of patients within a five-year period of time is still not optimal, which is mainly due to the fact that the survival rate is closely related to the stage of tumor development in patients with colorectal cancer - the survival rate of patients with early stage colorectal cancer after surgery within a 5-year period of time exceeds 90%, however, in most patients, the onset of symptoms or detection of the disease occurs when the tumor has already developed to an intermediate or advanced stage. Since 93% of colorectal cancers occur in the presence of adenomas, most of them have no characteristic symptoms at an early stage, and it takes from 3 to 17 years to go from adenomas to cancer, which provides a temporary basis for early screening. Therefore, screening of populations at high risk of developing colorectal cancer, early detection and diagnosis of patients with colorectal cancer, and early treatment of patients with colorectal cancer are important aspects to improve overall patient survival.
Существующие способы скрининга колоректального рака и распространенной аденомы в основном делятся на две категории: анализ кала и структурное исследование толстой кишки. Анализ кала включает анализ кала на скрытую кровь (FOBT) и анализ ДНК в образцах стула (sDNA). Структурное исследование толстой кишки включает гибкую сигмоидоскопию (FSIG), колоноскопию (CS), двойную контрастную бариевую клизму (DCBE) и колоноскопию с помощью компьютерной томографии (CTC). FOBT представляет собой простой и быстрый способ скрининга колоректального рака и типов распространенной аденомы и используется для выявления следов гемоглобина в образцах кала. FOBT прост, недорог и неинвазивен, и его можно применять для крупномасштабных скрининговых исследований. Однако на результаты FOBT могут оказывать влияние многие факторы. Положительные результаты могут быть выявлены только при разрывах и кровотечениях опухоли, в то время как кровотечение полипов или раковой ткани зачастую бывает прерывистым и его следы могут не содержаться ни в одном образце кала. Следовательно, FOBT характеризуется низкой специфичностью и может привести к получению ошибочного медицинского заключения об отсутствии заболевания. FSIG представляет собой способ прямого исследования дистального отдела толстой кишки с применением эндоскопических методик. Операция относительно проста, требования к подготовке кишечника относительно низкие, и не требуется седация во время операции, а очаги поражения можно подвергать биопсии и лечению, что делает FSIG относительно недорогим, простым и безопасным способом скрининга. Тем не менее, участок обследования при FSIG ограничен дистальным отделом толстой кишки (ограниченным селезеночным изгибом), и если колоноскопию проводить после обнаружения с помощью FSIG опухолей в дистальных отделах ободочной и прямой кишки, можно пропустить 72,0% опухолей в проксимальных отделах ободочной и прямой кишки. Колоноскопия (CS) в настоящее время является золотым стандартом диагностики и лечения колоректального рака и типов распространенной аденомы и позволяет провести полное обследование всей толстой кишки, биопсию и удаление обнаруженных полипов. Хотя CS обладает преимуществами, состоящими в хорошем лечебном эффекте и высокой точности, она также обладает определенными недостатками: (1) CS является инвазивным способом исследования с более высоким риском возникновения осложнений, которые могут привести к перфорации толстой кишки (0,3%) или даже смерти (1/5000); (2) является времязатратной, требует надлежащей подготовки кишечника и седации перед исследованием; (3) является дорой, стоимость будет выше, если потребуется биопсия и удаление полипов; (4) при колоноскопии частота ошибочного медицинского заключения об отсутствии колоректального рака и распространенной аденомы составляет 5%. CTC представляет собой неинвазивную процедуру, при которой томографическое исследование проводят при толщине среза сканирования 1-2 мм, для выявления очагов поражения кишечника на 2-мерных и 3-мерных изображениях. CTC обладает преимуществами, состоящими в скорости, точности и низкой сложности, а обеспечиваемая ею эффективность скрининга больших полипов, колоректального рака и распространенной аденомы близка к эффективности CS. Тем не менее, в качестве стандартного способа скрининга CTC обладает очевидными слабыми местами: для получения удовлетворительного изображения при CTC все же необходимо выпустить 2-4 рад рентгеновских лучей в брюшную полость пациента во время обследования, что увеличивает риск развития рака; обычно введение в просвет кишки воздуха или углекислого газа для расширения кишечного тракта вызывает у пациента некоторый дискомфорт при обследовании; кроме того, высокая стоимость обследования накладывает тяжелое экономическое бремя как на отдельных лиц, так и на общество.Existing screening methods for colorectal cancer and advanced adenoma mainly fall into two categories: fecal analysis and structural examination of the colon. Fecal analysis includes fecal occult blood test (FOBT) and DNA analysis in stool samples (sDNA). Structural examination of the colon includes flexible sigmoidoscopy (FSIG), colonoscopy (CS), double contrast barium enema (DCBE), and computed tomography-assisted colonoscopy (CTC). FOBT is a simple and fast way to screen for colorectal cancer and types of advanced adenoma and is used to detect traces of hemoglobin in stool samples. FOBT is simple, inexpensive, and non-invasive, and can be used for large-scale screening studies. However, FOBT results can be influenced by many factors. Positive results can only be detected when the tumor ruptures and bleeds, while the bleeding of polyps or cancerous tissue is often intermittent and its traces may not be contained in any stool sample. Therefore, FOBT is characterized by low specificity and can lead to an erroneous medical conclusion about the absence of the disease. FSIG is a method for direct examination of the distal colon using endoscopic techniques. The operation is relatively simple, bowel preparation requirements are relatively low, and no sedation is required during surgery, and lesions can be biopsied and treated, making FSIG a relatively inexpensive, simple, and safe screening method. However, the site of examination for FSIG is limited to the distal colon (limited by the splenic flexure), and if colonoscopy is performed after FSIG detects tumors in the distal colon and rectum, 72.0% of tumors in the proximal colon and rectum can be missed. intestines. Colonoscopy (CS) is currently the gold standard for the diagnosis and treatment of colorectal cancer and types of advanced adenoma, and allows for a complete examination of the entire colon, biopsy and removal of detected polyps. Although CS has the advantages of good treatment effect and high accuracy, it also has certain disadvantages: (1) CS is an invasive examination with a higher risk of complications that can lead to colonic perforation (0.3%) or even death (1/5000); (2) is time consuming, requiring proper bowel preparation and sedation prior to the study; (3) is expensive, the cost will be higher if a biopsy and removal of polyps is required; (4) Colonoscopy has a 5% misdiagnosis of colorectal cancer and advanced adenoma. CTC is a non-invasive procedure in which tomography is performed at a scan slice thickness of 1-2 mm to identify intestinal lesions on 2D and 3D images. CTC has the advantages of speed, accuracy, and low complexity, and its screening performance for large polyps, colorectal cancer, and advanced adenomas is close to that of CS. However, as a standard screening method, CTC has obvious weaknesses: in order to obtain a satisfactory image in CTC, it is still necessary to release 2-4 rads of X-rays into the patient's abdomen during the examination, which increases the risk of cancer; usually the introduction of air or carbon dioxide into the intestinal lumen to expand the intestinal tract causes the patient some discomfort during the examination; in addition, the high cost of screening imposes a heavy economic burden on both individuals and society.
Генетическое тестирование отслоившихся клеток в образцах стула (sDNA) в настоящее время является наиболее передовой технологией для скрининга колоректального рака и распространенной аденомы. Это неинвазивный способ скрининга. По сравнению с нормальной слизистой оболочкой толстой кишки скорость метаболизма в клетках колоректального рака и распространенной аденомы была значительно увеличена, и соответственно увеличилось количество отслоившихся клеток. Посредством количественного анализа ДНК в отслоившихся клетках в кале можно эффективно осуществлять скрининг некоторых типов колоректального рака и распространенной аденомы. Такой способ обычно включает два типа тестов: первый тип представляет собой выявление отслоившихся клеток в кале с помощью цитологических исследований, то есть стандартное патологоанатомическое исследование отслоившихся эпителиальных клеток кишечника в кале с целью обнаружения опухолевых клеток с целью осуществления четкой диагностики опухолей кишечника. Второй тип представляет собой выявление ДНК отслоившихся клеток в кале, поскольку исследования показали, что мутировавшие гены в отслоившихся опухолевых клетках в кале пациента в значительной степени совпадают с мутировавшими генами в самой опухолевой ткани. Если ген данного типа может быть выявлен в опухолевых отслоившихся клетках из кала, также можно подтвердить диагноз кишечных опухолей. Такой способ обладает высокой специфичностью, и положительный результат, по сути, может подтвердить наличие очагов поражения. Для подвергаемой скринингу популяции нет необходимости менять пищевые привычки или ограничивать употребление лекарственных средств.Genetic testing of sloughed cells in stool samples (sDNA) is currently the most advanced technology for screening for colorectal cancer and advanced adenoma. This is a non-invasive screening method. Compared with the normal colonic mucosa, the metabolic rate of colorectal cancer cells and advanced adenoma was significantly increased, and the number of shed cells increased accordingly. Quantitative analysis of DNA in exfoliated cells in feces can effectively screen for some types of colorectal cancer and advanced adenoma. This method usually includes two types of tests: the first type is the detection of exfoliated cells in feces using cytological studies, that is, the standard pathoanatomical examination of exfoliated intestinal epithelial cells in feces in order to detect tumor cells in order to make a clear diagnosis of intestinal tumors. The second type is DNA detection of shed cells in the stool, because studies have shown that the mutated genes in the shed tumor cells in the patient's stool largely match the mutated genes in the tumor tissue itself. If a gene of this type can be detected in tumor exfoliated cells from feces, the diagnosis of intestinal tumors can also be confirmed. This method has high specificity, and a positive result, in fact, can confirm the presence of lesions. For the population being screened, there is no need to change dietary habits or restrict drug use.
Ген PRDM12 (белок 12, содержащий домен гомологии PRDI-BF1 и RIZ) расположен в хромосоме 9 человека, 9q34.12 (chr9: 130664594-130682997, hg38), и принадлежит к семейству регуляторов транскрипции, содержащих белковые домены PR и SET (семейство доменов PR/SET). Белок, кодируемый PRDM12, содержит N-концевые домены гомологии (PR) PRDI-BF1 и RIZ, один домен SET и три ДНК-связывающих домена с цинковыми пальцами C2H2 на С-конце. Отечественные и зарубежные исследования показали, что PRDM12 является важным регулятором транскрипции, контролирующим дифференцировку и образование нейронов, и ассоциирован с частотой возникновения солидных опухолей и гемобластозов. В настоящее время стране авторов настоящего изобретения и в других странах нет публикаций результатов исследований связи между степенью метилирования конкретных областей гена PRDM12 и онкогенезом, а также нет публикаций результатов исследований коммерческого набора для количественного выявления, предназначенного для количественного выявления степени метилирования PRDM12.The PRDM12 gene (protein 12 containing the PRDI-BF1 and RIZ homology domain) is located on
Ген FOXE1 (Forkhead Box E1) расположен в хромосоме 9 человека, 9q22.33 (chr9: 97853254-97856715, hg38), является членом семейства факторов транскрипции forkhead (семейства Forkhead) и содержит домен forkhead, который характерен для всех генов данного семейства (домен Forkhead). Данный домен состоит из более чем 100 аминокислот, которые могут распознавать конкретные последовательности геномной ДНК и связываться с ними. Предыдущие исследования показали, что FOXE1 является важным транскрипционным фактором и транскрипционным фактором семейства forkhead, специфичным для щитовидной железы, который необходим для морфогенеза и дифференцировки щитовидной железы, а также участвует в индуцируемой гормонами щитовидной железы регуляции транскрипции. FOXE1 напрямую связан с частотой возникновения рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы и плоскоклеточной карциномы кожи. Также сообщалось о гиперметилировании гена FOXE1 при плоскоклеточной карциноме кожи и раке молочной железы. Хотя роль FOXE1 при колоректальном раке до сих пор до конца не изучена, последние исследования показали, что аномально высокое метилирование гена FOXE1 обуславливает низкую экспрессию гена, что связано с метастазированием колоректального рака и прогнозом у пациента, и его используют в качестве потенциального биомаркера для выявления колоректального рака (биомаркер). Хотя в вышеуказанных исследованиях есть сообщения о выявлении метилирования в конкретных областях гена FOXE1, в стране авторов настоящего изобретения и в других странах нет публикаций о коммерческих наборах для количественного выявления метилирования в конкретных областях гена FOXE1.The FOXE1 gene (Forkhead Box E1) is located on
Ген B3GAT2 (бета-1,3-глюкуронилтрансферазы 2) расположен в хромосоме 6 человека, 6q13 (chr6: 70856679-70957189, hg38), является членом семейства глюкуронилтрансфераз и кодирует трансмембранный белок. Основная функция гена B3GAT2 заключается в катализе переноса бета-1,3-связанной глюкуроновой кислоты на концевую галактозильную группу остатков Gal-Beta-1-4 GLcNAc или Gal-Beta-1-3 GLcNAc, содержащихся в различных гликопротеинах или гликолипидах. Предыдущие исследования показали, что B3GAT2 участвует в синтезе эпитопов углеводной цепи HNK-1, что связано с распознаванием, адгезией и миграцией клеток в нервной системе и оказывает регулирующее влияние на рост и развитие нервной системы, регенерацию нейронов и синаптическую пластичность. В настоящее время в стране авторов настоящего изобретения и в других странах нет публикаций результатов исследований взаимосвязи между геном B3GAT2 и онкогенезом. Лишь в одном исследовании было обнаружено, что метилирование конкретной области гена B3GAT2 связано с частотой возникновением пищевода Барретта, что применяют в качестве биомаркера для диагностики данного заболевания. Хотя пищевод Барретта может привести к развитию рака пищевода, риск перерождения в рак очень низок. В настоящее время в стране авторов настоящего изобретения и в других странах нет публикаций о коммерческом наборе для количественного выявления степени метилирования конкретных областей гена B3GAT2.The B3GAT2 (beta-1,3-glucuronyl transferase 2) gene is located on human chromosome 6, 6q13 (chr6: 70856679-70957189, hg38), is a member of the glucuronyl transferase family and encodes a transmembrane protein. The main function of the B3GAT2 gene is to catalyze the transfer of beta-1,3-linked glucuronic acid to the terminal galactosyl group of Gal-Beta-1-4 GLcNAc or Gal-Beta-1-3 GLcNAc residues contained in various glycoproteins or glycolipids. Previous studies have shown that B3GAT2 is involved in the synthesis of HNK-1 carbohydrate chain epitopes, which is associated with cell recognition, adhesion, and migration in the nervous system and has a regulatory effect on nervous system growth and development, neuronal regeneration, and synaptic plasticity. Currently, in the country of the authors of the present invention and in other countries, there are no publications of the results of studies on the relationship between the B3GAT2 gene and oncogenesis. Only one study has found that methylation of a specific region of the B3GAT2 gene is associated with the incidence of Barrett's esophagus, which is used as a biomarker for the diagnosis of this disease. Although Barrett's esophagus can lead to esophageal cancer, the risk of developing into cancer is very low. Currently, in the country of the authors of the present invention and in other countries, there are no publications on a commercial kit for the quantitative detection of the degree of methylation of specific regions of the B3GAT2 gene.
Ген виментина расположен на хромосоме 10, 10P13 (chr10: 17229548-17229607), и принадлежит к семейству генов волокнистых белков, представляющих собой промежуточные филаменты типа III. Ген виментина является членом семейства волокнистых белков, представляющих собой промежуточные филаменты, и во многих отношениях характеризуется сложными паттернами генной экспрессии, и в основном экспрессируется в эмбриональных тканях и зрелых клетках, происходящих из мезенхимальной ткани. Все больше и больше исследований свидетельствуют о том, что экспрессия виментина не является специфическим биомаркером для клеток мезенхимального происхождения и опухолевых клеток мезенхимальной дифференцировки. Было обнаружено, что кератин и виментин совместно экспрессируются при раке молочной железы, гепатоцеллюлярной карциноме, раке предстательной железы, раке эндометрия, раке желудка, раке пищевода, раке толстой кишки, раке легкого и других злокачественных опухолях эпителиального происхождения и тесно связаны с сильной инвазивностью и хорошей способностью раковых клеток к перемещению. Другое исследование подтвердило, что подавление виментина, которое ассоциировано с образованием опухолей и предраковых очагов поражения (таких как аденомы), может быть тесно связано с метилированием его промотора. Это свидетельствует о том, что метилирование ДНК может обеспечивать подавление экспрессии виментина на уровне транскрипции гена, что оказывает стимулирующее действие на миграцию опухолевых клеток. Chen и соавторы показали, что уровни метилирования виментина в тканях колоректального рака на ранней стадии и распространенной аденомы без метастазов и при колоректальном раке на поздней стадии и распространенной аденоме эквивалентны. Другие исследования показали, что метилирование конкретных областей гена виментина не ассоциировано с размером опухоли и стадией по системе Дьюка. Все это иллюстрирует важность выявления метилирования в конкретных областях гена виментина для ранней диагностики колоректального рака и распространенной аденомы.The vimentin gene is located on chromosome 10, 10P13 (chr10: 17229548-17229607), and belongs to the fibrous protein gene family, which are type III intermediate filaments. The vimentin gene is a member of the family of fibrous intermediate filament proteins and has in many respects complex gene expression patterns and is predominantly expressed in embryonic tissues and mature cells derived from mesenchymal tissue. More and more studies indicate that vimentin expression is not a specific biomarker for cells of mesenchymal origin and tumor cells of mesenchymal differentiation. Keratin and vimentin have been found to be co-expressed in breast cancer, hepatocellular carcinoma, prostate cancer, endometrial cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, lung cancer, and other malignant tumors of epithelial origin, and are closely associated with strong invasiveness and good the ability of cancer cells to move. Another study confirmed that the suppression of vimentin, which is associated with the formation of tumors and precancerous lesions (such as adenomas), may be closely related to the methylation of its promoter. This indicates that DNA methylation can suppress vimentin expression at the level of gene transcription, which has a stimulating effect on tumor cell migration. Chen et al showed that the levels of vimentin methylation in tissues of early-stage colorectal cancer and advanced adenoma without metastases and advanced colorectal cancer and advanced adenoma are equivalent. Other studies have shown that methylation of specific regions of the vimentin gene is not associated with tumor size and Duke stage. All this illustrates the importance of detecting methylation in specific regions of the vimentin gene for the early diagnosis of colorectal cancer and advanced adenoma.
Ген SFRP2 расположен на хромосоме 4q31.3 (chr4: 153789388-153789447), и кодируемый белок SFRP2 содержит характерную богатую цистеином область. Многие исследования показали, что гиперметилирование гена SFRP2 может привести к его сайленсингу в ряде опухолей. Ген SFRP2 содержит два интрона и три экзона. Вокруг первого экзона гена SFRP2 имеется высокая плотность островков CpG. Такой островок CpG тесно связан с гиперметилированием ДНК в опухолевых клетках. В последние годы многие исследования показали, что гиперметилирование гена SFRP2 связано с частотой возникновения колоректального рака. Многочисленные исследования продемонстрировали, что степень метилирования SFRP2 является наиболее чувствительным маркером для диагностики колоректального рака. Следовательно, в качестве одной из основ для скрининга колоректального рака можно применять выявление метилирования в конкретных областях гена SFRP2 из отслоившихся клеток в кале.The SFRP2 gene is located on chromosome 4q31.3 (chr4: 153789388-153789447), and the encoded SFRP2 protein contains a characteristic cysteine-rich region. Many studies have shown that hypermethylation of the SFRP2 gene can lead to its silencing in a number of tumors. The SFRP2 gene contains two introns and three exons. There is a high density of CpG islands around the first exon of the SFRP2 gene. Such a CpG island is closely associated with DNA hypermethylation in tumor cells. In recent years, many studies have shown that hypermethylation of the SFRP2 gene is associated with the incidence of colorectal cancer. Numerous studies have demonstrated that the degree of SFRP2 methylation is the most sensitive marker for the diagnosis of colorectal cancer. Therefore, detection of methylation in specific regions of the SFRP2 gene from exfoliated cells in the stool can be used as one of the basis for screening for colorectal cancer.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
В свете вышеописанной проблемы в существующей технологии первой целью настоящего изобретения является создание набора праймеров для выявления метилирования конкретных областей генов, связанных с колоректальным раком у человека. Набор праймеров содержит набор праймеров для участков метилирования любого гена, выбранного из группы, состоящей из PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 или любой комбинации таких генов.In light of the above problem in existing technology, a first object of the present invention is to provide a primer set for detecting methylation of specific gene regions associated with human colorectal cancer. The primer set contains a primer set for the methylation sites of any gene selected from the group consisting of PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2, or any combination of such genes.
Необязательно, набор праймеров для выявления для гена PRDM12 предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, a set of primers for detection for the PRDM12 gene provides a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'-GTTAGATTAGAAGTATAAAATGTG-3'(SEQ ID NO: 1), называемый праймером 1;forward primer: 5'-GTTAGATTAGAAGTATAAAATGTG-3'(SEQ ID NO: 1), referred to as
обратный праймер: 5'-ATCCCATTCCTCTCCTCC-3' (SEQ ID NO: 2), называемый праймером 2; иreverse primer: 5'-ATCCCATTCCCTCCTCC-3' (SEQ ID NO: 2), referred to as primer 2; And
зонд для выявления: 5'-AGCGCGGTGGAGATTTG-3' (SEQ ID NO: 3), называемый зондом 1.detection probe: 5'-AGCGCGGTGGAGATTTG-3' (SEQ ID NO: 3), referred to as
Необязательно, набор праймеров для выявления для гена FOXE1 предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, a set of primers for detection for the FOXE1 gene provides a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'- CGAGTttAAGtttTTGGtAGAGG -3' (SEQ ID NO: 4), называемый праймером 3;forward primer: 5'-CGAGTttAAGtttTTGGtAGAGG -3' (SEQ ID NO: 4), referred to as
обратный праймер: 5'- CCGATCGACTaAaaCCCGa -3' (SEQ ID NO: 5), называемый праймером 4; иreverse primer: 5'-CCGATCGACTaAaaCCCGa -3' (SEQ ID NO: 5), referred to as primer 4; And
зонд для выявления: 5'- tCGAGTTCGGGCGtTGAGG -3' (SEQ ID NO: 6), называемый зондом 2.detection probe: 5'-tCGAGTTCGGGCGtTGAGG -3' (SEQ ID NO: 6), referred to as probe 2.
Необязательно, набор праймеров для выявления для гена B3GAT2 предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, a set of primers for detection for the B3GAT2 gene provides a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'- TtCGtCGGGTtTGGCG -3' (SEQ ID NO: 7), называемый праймером 5;forward primer: 5'-TtCGtCGGGTtTGGCG -3' (SEQ ID NO: 7), referred to as
обратный праймер: 5'- CAaaAaaTCGTaCAaCCCCG -3' (SEQ ID NO: 8), называемый праймером 6; иreverse primer: 5'-CAaaAaaTCGTaCAaCCCCG-3' (SEQ ID NO: 8), referred to as primer 6; And
зонд для выявления: 5'- tCGCGAGtAAGtTCGGGAG -3' (SEQ ID NO: 9), называемый зондом 3.detection probe: 5'-tCGCGAGtAAGtTCGGGAG-3' (SEQ ID NO: 9), referred to as
Необязательно, набор праймеров для выявления для гена виментина предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, the vimentin gene detection primer set includes a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'- GtCGtAGttTtTACGttTCGT -3' (SEQ ID NO: 10), называемый праймером 7;forward primer: 5'-GtCGtAGttTtTACGttTCGT -3' (SEQ ID NO: 10), referred to as
обратный праймер: 5'- aaCGCACGaCAaAaaAaCG -3' (SEQ ID NO: 11), называемый праймером 8; иreverse primer: 5'-aaCGCACGaCAaAaaAaCG-3' (SEQ ID NO: 11), referred to as primer 8; And
зонд для выявления: 5'- ttCGGGCGGCGTGTATG -3' (SEQ ID NO: 12), называемый зондом 4.detection probe: 5'-ttCGGGCGGCGTGTATG-3' (SEQ ID NO: 12), referred to as probe 4.
Необязательно, набор праймеров для выявления для гена SFRP2-1 предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, the primer set for detection for the SFRP2-1 gene provides a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'- CGGAtTGGGGtAAAAtAAGttC -3' (SEQ ID NO: 13), называемый праймером 9;forward primer: 5'-CGGAtTGGGGtAAAAtAAGttC-3' (SEQ ID NO: 13), referred to as
обратный праймер: 5'- CTaaCGaaAACGCGCCTA -3' (SEQ ID NO: 14), называемый праймером 10; иreverse primer: 5'-CTaaCGaaAACGCGCCTA -3' (SEQ ID NO: 14), referred to as primer 10; And
зонд для выявления: 5'- TAGGCGCGTTttCGttAGTAttTGG -3' (SEQ ID NO: 15), называемый зондом 5.detection probe: 5'-TAGGCGCGTTttCGttAGTAttTGG -3' (SEQ ID NO: 15), referred to as
Необязательно, набор праймеров для выявления для гена SFRP2-2 предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, the primer set for detection for the SFRP2-2 gene provides for a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'- AATGtAGtCGGCGCG -3' (SEQ ID NO: 16), называемый праймером 11;forward primer: 5'-AATGtAGtCGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 16), referred to as
обратный праймер: 5'- CCTTaTTaaaAaTTCAAaaAaCCCG -3' (SEQ ID NO: 17), называемый праймером 12; иreverse primer: 5'-CCTTaTTaaaAaTTCAAaaAaCCCG -3' (SEQ ID NO: 17), referred to as primer 12; And
зонд для выявления: 5'- AGttAtTTtCGGGCGTGCGGt -3' (SEQ ID NO: 18), называемый зондом 6.detection probe: 5'-AGttAtTTtCGGGCGTGCGGt -3' (SEQ ID NO: 18), referred to as probe 6.
Необязательно, набор праймеров дополнительно содержит набор праймеров для гена внутреннего стандарта ACTB. Набор праймеров для гена внутреннего стандарта ACTB предусматривает набор из специфических праймеров и зонда, имеющих следующие последовательности:Optionally, the primer set further comprises a primer set for the ACTB internal standard gene. The primer set for the ACTB internal standard gene provides a set of specific primers and a probe having the following sequences:
прямой праймер: 5'- GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAG -3' (SEQ ID NO: 19), называемый праймером 13;forward primer: 5'-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAG-3' (SEQ ID NO: 19), referred to as
обратный праймер: 5'- CAATAAAACCTACTCCTCCCTT -3' (SEQ ID NO: 20), называемый праймером 14; иreverse primer: 5'-CAATAAAACCTACTCCTCCCTT -3' (SEQ ID NO: 20), referred to as primer 14; And
зонд для выявления: 5'- TGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGT -3' (SEQ ID NO: 21), называемый зондом 7.detection probe: 5'-TGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGT -3' (SEQ ID NO: 21), referred to as
Необязательно, флуоресцентная репортерная группа на 5'-конце зонда для выявления предусматривает: ALEX-350, FAM, VIC, TET, CAL Fluor Gold 540, JOE, HEX, CAL Flour Orange 560, TAMRA, Cal Fluor Red 590, ROX, CAL Fluor 20 Red 610, TEXAS RED, CAL Flour Red 635, Quasar 670, Cy3, Cy5, Cy5.5 или Quasar 705. Группа для гашения на 3'-конце зонда для выявления предусматривает: TAMRA, BHQ1, BHQ2 и MGB.Optionally, a fluorescent reporter group at the 5' end of the detection probe provides: ALEX-350, FAM, VIC, TET, CAL Fluor Gold 540, JOE, HEX, CAL Flour Orange 560, TAMRA, Cal Fluor Red 590, ROX, CAL Fluor 20 Red 610, TEXAS RED, CAL Flour Red 635, Quasar 670, Cy3, Cy5, Cy5.5, or Quasar 705. The quench group at the 3' end of the detection probe includes: TAMRA, BHQ1, BHQ2, and MGB.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение реагента для выявления метилирования конкретных областей генов, связанных с колоректальным раком у человека. Реагент содержит шесть систем для ПЦР, а именно: смесь-A для ПЦР для CRC, смесь-B для ПЦР для CRC, смесь-C для ПЦР для CRC, смесь-D для ПЦР для CRC, смесь-E для ПЦР для CRC и смесь-F для ПЦР для CRC соответственно. Каждая система для ПЦР предусматривает набор из специфических праймеров и зонда для метилирования конкретных областей соответствующего гена, как описано выше, и набор из специфических праймеров и зонда для описанного выше гена внутреннего стандарта. Система для ПЦР А содержит прямой праймер (праймер 1) для гена PRDM12, обратный праймер (праймер 2) для гена PRDM12 и зонд для выявления (зонд 1) для гена PRDM12. Система для ПЦР B содержит прямой праймер (праймер 3) для гена FOXE1, обратный праймер (праймер 4) для гена FOXE1 и зонд для выявления (зонд 2) для гена FOXE1. Система для ПЦР C содержит прямой праймер (праймер 5) для гена B3GAT2, обратный праймер (праймер 6) для гена B3GAT2 и зонд для выявления (зонд 3) для гена B3GAT2. Система для ПЦР D содержит прямой праймер (праймер 7) для гена виментина, обратный праймер (праймер 8) для гена виментина и зонд для выявления (зонд 4) для гена виментина. Система для ПЦР E содержит прямой праймер (праймер 9) для гена SFRP2-1, обратный праймер (праймер 10) для гена SFRP2-1 и зонд для выявления (зонд 5) для гена SFRP2-1. Система для ПЦР F содержит прямой праймер (праймер 11) для гена SFRP2-2, обратный праймер (праймер 12) для гена SFRP2-2 и зонд для выявления (зонд 6) для гена SFRP2-2.Another object of the present invention is to provide a reagent for detecting methylation of specific gene regions associated with human colorectal cancer. The reagent contains six PCR systems, namely CRC PCR Mix-A, CRC PCR Mix-B, CRC PCR Mix-C, CRC PCR Mix-D, CRC PCR Mix-E, and mix-F for PCR for CRC, respectively. Each PCR system provides a set of specific primers and probe for methylation of specific regions of the corresponding gene, as described above, and a set of specific primers and probe for the internal standard gene described above. The PCR system A contains a forward primer (primer 1) for the PRDM12 gene, a reverse primer (primer 2) for the PRDM12 gene, and a detection probe (probe 1) for the PRDM12 gene. The PCR system B contains a forward primer (primer 3) for the FOXE1 gene, a reverse primer (primer 4) for the FOXE1 gene, and a detection probe (probe 2) for the FOXE1 gene. PCR system C contains a forward primer (primer 5) for the B3GAT2 gene, a reverse primer (primer 6) for the B3GAT2 gene, and a detection probe (probe 3) for the B3GAT2 gene. The PCR system D contains a forward primer (primer 7) for the vimentin gene, a reverse primer (primer 8) for the vimentin gene, and a detection probe (probe 4) for the vimentin gene. The E PCR system contains a forward primer (primer 9) for the SFRP2-1 gene, a reverse primer (primer 10) for the SFRP2-1 gene, and a detection probe (probe 5) for the SFRP2-1 gene. The F PCR system contains a forward primer (primer 11) for the SFRP2-2 gene, a reverse primer (primer 12) for the SFRP2-2 gene, and a detection probe (probe 6) for the SFRP2-2 gene.
Необязательно, каждая из шести систем для ПЦР, а именно смесь-A для ПЦР для CRC, смесь-B для ПЦР для CRC, смесь-C для ПЦР для CRC, смесь-D для ПЦР для CRC, смесь-E для ПЦР для CRC и смесь-F для ПЦР для CRC, дополнительно содержит универсальные ингредиенты, в том числе буфер для ПЦР, dNTP и MgCl2.Optionally, each of the six PCR systems, namely CRC PCR Mix-A, CRC PCR Mix-B, CRC PCR Mix-C, CRC PCR Mix-D, CRC PCR Mix-E and PCR Mix-F for CRC, additionally contains versatile ingredients including PCR buffer, dNTP and MgCl 2 .
Необязательно, ген внутреннего стандарта представляет собой конститутивный ген человека, то есть ген ACTB. Праймеры и зонд гена внутреннего стандарта применяют для контроля качества каждого образца и его амплификации в каждой реакционной системе, что позволяет избежать ложноотрицательного результата или частично заглушенного результата.Optionally, the internal standard gene is a human constitutive gene, ie the ACTB gene. Primers and an internal standard gene probe are used to control the quality of each sample and its amplification in each reaction system, thus avoiding a false negative result or a partially muted result.
Необязательно, в шести ПЦР-системах, а именно смеси-A для ПЦР для CRC, смеси-B для ПЦР для CRC, смеси-C для ПЦР для CRC, смеси-D для ПЦР для CRC, смеси-E для ПЦР для CRC и смеси-F для ПЦР для CRC, каждая реакционная система имеет конечный объем от 20 мкл до 40 мкл; концентрации праймеров в каждой реакционной системе являются следующими: прямой праймер имеет концентрацию от 0,3 мкМ до 0,8 мкМ, обратный праймер имеет концентрацию от 0,3 мкМ до 0,8 мкМ, и зонд имеет концентрацию от 0,1 мкМ до 0,3 мкМ; и конечные концентрации универсальных ингредиентов каждой из шести систем для ПЦР являются следующими: конечные концентрации dATP, dTTP, dCTP и dGTP в dNTP составляют от 0,1 мМ до 0,3 мМ, а конечная концентрация MgCl2 составляет от 1 мМ до 2 мМ.Optionally, in six PCR systems, namely CRC PCR Mix-A, CRC PCR Mix-B, CRC PCR Mix-C, CRC PCR Mix-D, CRC PCR Mix-E, and mix-F for PCR for CRC, each reaction system has a final volume of 20 µl to 40 µl; The primer concentrations in each reaction system are as follows: the forward primer has a concentration of 0.3 µM to 0.8 µM, the reverse primer has a concentration of 0.3 µM to 0.8 µM, and the probe has a concentration of 0.1 µM to 0 .3 μM; and the final concentrations of the universal ingredients of each of the six PCR systems are as follows: the final concentrations of dATP, dTTP, dCTP and dGTP in dNTP are 0.1 mM to 0.3 mM, and the final concentration of MgCl 2 is 1 mM to 2 mM.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание коммерческого набора для выявления метилирования конкретных областей генов, связанных с колоректальным раком у человека. Коммерческий набор содержит любую из шести систем для ПЦР или любую их комбинацию; от 0,5 до 2 единиц taq-полимеразы для ПЦР с горячим стартом, положительный контроль, отрицательный контроль и холостой контроль. Положительный контроль представляет собой смесь гена внутреннего стандарта ACTB и фрагментов метилированной плазмидной ДНК PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 или представляет собой положительный контроль в виде метилированной цельногеномной ДНК человека. Отрицательный контроль представляет собой смесь гена внутреннего стандарта ACTB и фрагментов неметилированной плазмидной ДНК PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 или представляет собой отрицательный контроль в виде неметилированной цельногеномной ДНК человека. Холостой контроль представляет собой буфер на основе Tris-EDTA или воду без нуклеаз c рН, составляющим 8,5 ± 0,1.Another object of the present invention is to provide a commercial kit for detecting methylation of specific gene regions associated with human colorectal cancer. The commercial kit contains any of the six PCR systems or any combination of them; 0.5 to 2 units of taq polymerase for hot start PCR, positive control, negative control and blank control. The positive control is a mixture of the ACTB internal standard gene and methylated plasmid DNA fragments PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2, or is a positive control in the form of methylated whole human genomic DNA. The negative control is a mixture of the ACTB internal standard gene and unmethylated plasmid DNA fragments PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 or is a negative control in the form of unmethylated whole human genomic DNA. The blank control is Tris-EDTA buffer or nuclease-free water with a pH of 8.5 ± 0.1.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа применения коммерческого набора для выявления метилирования конкретных областей генов, связанных с колоректальным раком у человека. ДНК выделяют непосредственно из кала, крови или тканей человека и конвертируют ДНК путем обработки бисульфитом, полученную конвертированную ДНК применяют в качестве матрицы, которую амплифицируют с помощью ПЦР, а накопление сигналов с зонда для выявления применяют для осуществления выявления в режиме реального времени метилирования конкретных областей генов, связанных с колоректальным раком у человека, т. е. генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2. При этом в качестве гена внутреннего стандарта применяли ген ACTB. Способ предусматривает следующие конкретные экспериментальные стадии ПЦР:Yet another object of the present invention is to provide a method for using a commercial kit to detect methylation of specific regions of genes associated with human colorectal cancer. DNA is isolated directly from human feces, blood or tissues, and the DNA is converted by treatment with bisulfite, the resulting converted DNA is used as a template, which is amplified by PCR, and the signal accumulation from the detection probe is used to perform real-time detection of methylation of specific regions of genes associated with human colorectal cancer, i.e. PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 genes. In this case, the ACTB gene was used as an internal standard gene. The method includes the following specific experimental PCR steps:
стадия 1: сбор образцов кала, крови или тканей у определенного количества пациентов с колоректальным раком и пациентов с распространенной аденомой;stage 1: collection of stool, blood or tissue samples from a certain number of patients with colorectal cancer and patients with advanced adenoma;
стадия 2: выделение геномной ДНК человека из образцов кала, крови или тканей подлежащих тестированию пациентов;stage 2: isolation of human genomic DNA from samples of feces, blood or tissues of patients to be tested;
стадия 3: конвертирование полученной выделенной геномной ДНК человека с помощью бисульфита и применение полученной конвертированной ДНК в качестве матрицы для ПЦР;step 3: converting the resulting isolated human genomic DNA with bisulfite and using the resulting converted DNA as a template for PCR;
стадия 4: объединение 29,7 мкл × (n+1) смеси для ПЦР и 0,3 мкл × (n+1) смешанного раствора taq-полимеразы для ПЦР с горячим стартом из коммерческого набора для выявления, равномерное перемешивание в течение 20 с и немедленное центрифугирование в течение 10 с; где n представляет собой количество подлежащих тестированию образцов;Step 4: Combine 29.7 µl × (n+1) PCR mix and 0.3 µl × (n+1) taq polymerase hot start PCR mixed solution from a commercial detection kit, mixing uniformly for 20 s and immediate centrifugation for 10 s; where n is the number of samples to be tested;
стадия 5: распределение полученного центрифугированного раствора в пробирки для ПЦР, таким образом, чтобы каждая пробирка для ПЦР содержала 30 мкл полученного центрифугированного раствора, затем добавление 10 мкл конвертированной ДНК-матрицы, в отношении которой выполняют выявление, где общий объем составляет 40 мкл;step 5: distributing the obtained spin solution into PCR tubes so that each PCR tube contains 30 µl of the obtained spin solution, then adding 10 µl of the converted DNA template to be detected, where the total volume is 40 µl;
стадия 6: проведение реакции амплификации, где процедура реакции является следующей:step 6: carrying out the amplification reaction, where the reaction procedure is as follows:
стадия 7: определение результатов ПЦР, при котором во время выявления в образце исходный уровень определяют путем получения сигналов флуоресценции циклов 3-15; порог устанавливают путем проведения линии порога, превышающей наиболее высокую точку кривой амплификации нормального отрицательного контроля, для которой значение Ct не поддается выявлению; решение о том, является результат для образца положительным или отрицательным принимают на основе зарегистрированных значений Ct, то есть на основе номера цикла, при осуществлении которого флуоресцентный сигнал в каждой реакционной пробирке достигает установленного порога.step 7: determination of the results of PCR, in which during detection in the sample, the initial level is determined by obtaining fluorescence signals of cycles 3-15; the threshold is set by drawing a threshold line above the highest point of the normal negative control amplification curve for which the Ct value is not detectable; the decision as to whether the result for the sample is positive or negative is made on the basis of the recorded Ct values, that is, on the basis of the cycle number at which the fluorescent signal in each reaction tube reaches the set threshold.
При использовании вышеуказанных технических решений преимущества настоящего изобретения резюмируются следующим образом.Using the above technical solutions, the advantages of the present invention are summarized as follows.
1. Настоящее изобретение позволяет идентифицировать метилирование конкретных областей новых генов в качестве онкомаркера для колоректального рака человека, который можно применять в качестве средства раннего скрининга и вспомогательного средства для выявления больных.1. The present invention makes it possible to identify methylation of specific regions of novel genes as a tumor marker for human colorectal cancer, which can be used as an early screening tool and an aid in patient detection.
2. В коммерческом наборе по настоящему изобретению выбраны подходящие области целевых генов и сконструированы высокоспецифичные праймеры и зонд.2. In the commercial kit of the present invention, suitable target gene regions are selected and highly specific primers and probes are designed.
3. Коммерческий набор по настоящему изобретению может предусматривать непосредственное применение кала для выделения ДНК, такой способ отбора образцов является неинвазивным и обеспечивает значительное уменьшение болевых ощущений у пациента.3. The commercial kit of the present invention may involve direct application of stool for DNA extraction, this sampling method is non-invasive and provides a significant reduction in patient pain.
4. В настоящем изобретении впервые раскрыт коммерческий набор для выявления метилирования генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2, связанных с колоректальным раком и распространенной аденомой, и применение данного коммерческого набора. Коммерческий набор для выявления включает прямые праймеры, обратные праймеры и соответствующие флуоресцентные зонды для специфичной в отношении метилирования амплификации генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2. Уровни метилирования генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 приводят к низкой экспрессии генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 у пациентов с колоректальным раком и пациентов с распространенной аденомой, так что клетки колоректального рака и клетки распространенной аденомы обладают более сильной инвазивной способностью. Следовательно, статус метилирования генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 можно применять в качестве молекулярных биомаркеров для оценки злокачественности и прогноза колоректального рака и распространенной аденомы. Диагностические коммерческие наборы, основанные на выявлении уровней метилирования генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2, связанных с колоректальным раком и распространенной аденомой, позволяют легко и быстро выявлять колоректальный рак и распространенную аденому на молекулярном уровне с тем, чтобы судить о злокачественности и прогнозе колоректального рака и распространенной аденомы. Диагностический коммерческий набор по настоящему изобретению обладает высокой эффективностью выявления, высокой специфичностью и преимуществами, состоящими в точности, надежности, гибкости, быстроте и низкой стоимости, что обеспечивает благоприятный эффект в отношении раннего выявления и своевременного лечения колоректального рака и распространенной аденомы.4. The present invention discloses for the first time a commercial kit for detecting methylation of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 genes associated with colorectal cancer and advanced adenoma and the use of this commercial kit. The commercial detection kit includes forward primers, reverse primers and appropriate fluorescent probes for methylation-specific amplification of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 genes. Methylation levels of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1, and SFRP2-2 genes result in low expression of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1, and SFRP2-2 genes in patients with colorectal cancer and patients with advanced adenoma, such that colorectal cancer cells and advanced adenoma cells have a stronger invasive ability. Therefore, the methylation status of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1, and SFRP2-2 genes can be used as molecular biomarkers to assess the malignancy and prognosis of colorectal cancer and advanced adenoma. Diagnostic commercial kits based on the detection of methylation levels of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 genes associated with colorectal cancer and advanced adenoma make it possible to easily and quickly detect colorectal cancer and advanced adenoma at the molecular level in order to to judge the malignancy and prognosis of colorectal cancer and advanced adenoma. The diagnostic commercial kit of the present invention has high detection efficiency, high specificity, and advantages of accuracy, reliability, flexibility, speed and low cost, which is beneficial in early detection and timely treatment of colorectal cancer and advanced adenoma.
5. В отличие от общепринятой для скрининга колоректального рака и распространенной аденомы колоноскопии, а также стандартного анализа кала на скрытую кровь, в коммерческом наборе, представленном в настоящем изобретении, для скрининга колоректального рака и распространенной аденомы применяется способ специфичной к метилированию ПЦР с выявлением в ДНК отслоившихся клеток в кале. Коммерческий набор, представленный в настоящем изобретении, обладает следующими преимуществами:5. In contrast to the conventional colonoscopy for screening colorectal cancer and advanced adenoma, as well as the standard fecal occult blood test, the commercial kit presented in the present invention uses a methylation-specific PCR method with DNA detection to screen for colorectal cancer and advanced adenoma exfoliated cells in feces. The commercial kit presented in the present invention has the following advantages:
1) является полностью неинвазивным: необходимо всего 2-5 г образца кала, что вполне приемлемо для населения, у которого отсутствуют симптомы;1) is completely non-invasive: only 2-5 g of a stool sample is needed, which is quite acceptable for an asymptomatic population;
2) высокая точность: коммерческий набор позволяет выявлять колоректальный рак и распространенную аденому в абсолютном большинстве случаев, а также в большинстве случаев предраковую аденому в доклинических исследованиях, позволяет выявлять колоректальный рак на ранней стадии в 96,3% случаев и предраковые аденомы (≥1 см) в 85,8% случаев, при этом специфичность составляет 100%;2) high accuracy: the commercial kit allows to detect colorectal cancer and widespread adenoma in the vast majority of cases, as well as in most cases precancerous adenoma in preclinical studies, allows to detect colorectal cancer at an early stage in 96.3% of cases and precancerous adenomas (≥1 cm ) in 85.8% of cases, while the specificity is 100%;
3) позволяет осуществлять одновременное выявление опухолей в левой и правой частях толстой кишки, что уменьшает слепую зону выявления и позволяет избежать ошибочного медицинского заключения об их отсутствии;3) allows for the simultaneous detection of tumors in the left and right parts of the colon, which reduces the blind zone of detection and avoids an erroneous medical conclusion about their absence;
4) позволяет обнаружить не только колоректальный рак и распространенную аденому, но и предраковую аденому, что дает возможность предотвратить колоректальный рак и распространенную аденому путем удаления предраковой аденомы; и4) allows you to detect not only colorectal cancer and widespread adenoma, but also precancerous adenoma, which makes it possible to prevent colorectal cancer and widespread adenoma by removing precancerous adenoma; And
5) простота в эксплуатации: после получения коммерческого тестового набора пользователь может осуществить сбор образцов дома, а затем отправить собранные образцы экспресс-почтой для тестирования специалистам.5) Easy to operate: after receiving the commercial test kit, the user can collect samples at home, and then send the collected samples by express mail for testing to specialists.
6. В данном способе применяют метод флуоресцентной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР в режиме реального времени), который разработан на основе стандартной технологии полимеразной цепной реакции. В процессе осуществления амплификации в стандартной полимеразной цепной реакции для количественного определения применяют флуоресцентные красители или выявление посредством электрофореза, тогда как применение способа с использованием зонда по настоящему изобретению обеспечивает более высокую точность, более высокую чувствительность и более высокую производительность данной технологии, и при этом отпадает необходимость в таких операциях, как электрофорез или гибридизация после ПЦР, обеспечивая таким образом уменьшение уровня загрязнения и количества ошибок при реализации.6. This method uses a real-time fluorescence PCR (real-time PCR) method, which is developed based on the standard polymerase chain reaction technology. The standard PCR amplification process uses fluorescent dyes or electrophoretic detection for quantitation, while the probe method of the present invention provides higher accuracy, higher sensitivity, and higher throughput of this technology without the need for in operations such as electrophoresis or hybridization after PCR, thus reducing contamination and implementation errors.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
Прилагаемые графические материалы, описанные в данном документе, используются для обеспечения дополнительного понимания настоящего изобретения и составляют часть настоящего изобретения. Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения и их описания используются для пояснения настоящего изобретения и не представляют собой ограничение настоящего изобретения. На графических материалах:The accompanying drawings described herein are used to provide further understanding of the present invention and form part of the present invention. Illustrative embodiments of the present invention and their descriptions are used to explain the present invention and do not constitute a limitation of the present invention. On graphics:
на фиг. 1 показаны результаты выявления метилирования гена PRDM12;in fig. 1 shows the results of detection of methylation of the PRDM12 gene;
на фиг. 2 показаны результаты выявления метилирования гена FOXE1;in fig. 2 shows the results of detecting methylation of the FOXE1 gene;
на фиг. 3 показаны результаты выявления метилирования гена B3GAT2;in fig. 3 shows the results of detection of methylation of the B3GAT2 gene;
на фиг. 4 показаны результаты выявления метилирования гена виментина;in fig. 4 shows the results of vimentin gene methylation detection;
на фиг. 5 показаны результаты выявления метилирования гена SFRP2-1; иin fig. 5 shows the results of detection of methylation of the SFRP2-1 gene; And
на фиг. 6 показаны результаты выявления метилирования гена SFRP2-2.in fig. 6 shows the results of detection of methylation of the SFRP2-2 gene.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS
Для решения технической задачи, прояснения и понимания технических решений и полезных эффектов настоящего изобретения настоящее изобретения будет дополнительно подробно описано ниже со ссылкой на прилагаемые графические материалы и варианты осуществления. Следует понимать, что конкретные варианты осуществления, описанные в данном документе, используются лишь для пояснения настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения.In order to solve the technical problem, clarify and understand the technical solutions and beneficial effects of the present invention, the present invention will be further described in detail below with reference to the accompanying drawings and embodiments. It should be understood that the specific embodiments described herein are used only to explain the present invention and not to limit the present invention.
Что касается фиг. 1-6, на них показаны результаты выявления метилирования соответствующих генов (канал FAM).With regard to FIG. 1-6, they show the results of detection of methylation of the corresponding genes (FAM channel).
Ниже настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на варианты осуществления.Below, the present invention is described in more detail with reference to embodiments.
1. Сбор образцов у объектов исследования1. Collection of samples from subjects of study
В данном исследовании образцы были получены хирургическим путем от 31 пациента с колоректальным раком в Шанхайской больнице Чанхай, которые были выбраны в качестве объектов исследования. Во всех случаях диагноз был поставлен на основании полученных от пациентов клинических данных, результатов визуализации, колоноскопии и т. д. и подтвержден посредством диагностики с использованием морфологического анализа материала, полученного в результате хирургического вмешательства. Полученные хирургическим путем ткани колоректального рака и ткани, расположенные рядом с ними (нормальная ткань слизистой оболочки ободочной и прямой кишки на расстоянии ≥5 см от раковой ткани), подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте и хранили в холодильнике при температуре -80 градусов. Собирали соответствующее количество раковой ткани и ткани, расположенной рядом с ней, и из них выделяли геномную ДНК.In this study, specimens were surgically obtained from 31 colorectal cancer patients at Shanghai Changhai Hospital, who were selected as study subjects. In all cases, the diagnosis was made on the basis of clinical data obtained from patients, the results of imaging, colonoscopy, etc. and confirmed through diagnostics using morphological analysis of the material obtained as a result of surgical intervention. Surgically obtained colorectal cancer tissues and tissues adjacent to them (normal tissue of the colonic and rectal mucosa at a distance of ≥5 cm from the cancerous tissue) were flash-frozen in liquid nitrogen and stored in a refrigerator at a temperature of -80 degrees. An appropriate amount of cancer tissue and tissue adjacent to it was collected, and genomic DNA was isolated from them.
В данном исследовании в качестве объектов исследования был выбран 31 пациент с колоректальным раком из Шанхайской больницы Чанхай и образцы кала соответствующих пациентов. В рассматриваемых случаях диагноз был поставлен на основании клинических данных, результатов визуализации, колоноскопии и морфологического анализа материала, полученного в результате хирургического вмешательства, у пациентов. Собранные образцы кала хранили в пробирке для сбора, содержащей раствор для сохранения ДНК в кале, и помещали в холодильник при температуре -20 градусов. Для выделения геномной ДНК собирали соответствующее количество каждого образца кала.In this study, 31 colorectal cancer patients from Shanghai Changhai Hospital and stool samples from the respective patients were selected as study subjects. In the cases under consideration, the diagnosis was made on the basis of clinical data, imaging, colonoscopy and morphological analysis of the material obtained as a result of surgical intervention in patients. Collected fecal samples were stored in a collection tube containing a solution to preserve DNA in feces and placed in a refrigerator at -20 degrees. An appropriate amount of each fecal sample was collected for genomic DNA isolation.
2. Выделение геномной ДНК2. Isolation of genomic DNA
Образцы тканей выделяли из раковых тканей и тканей, расположенных рядом с ними, с применением набора QIAamp DNA Mini Kit Tissue, коммерческого набора для выделения цельногеномной ДНК (Qiagen, Германия). Образцы кала получали с применением набора QIAamp DNA feces Mini Kit, коммерческого набора для выделения геномной ДНК из кала. Для последующего выявления метилирования конкретных областей генов с помощью ПЦР определяли концентрацию и качество геномной ДНК на микроспектрофотометре NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Конкретные стадии выделения проводили в соответствии с инструкциями по эксплуатации коммерческого набора для выделения.Tissue samples were isolated from and adjacent cancer tissues using the QIAamp DNA Mini Kit Tissue, a commercial whole genome DNA isolation kit (Qiagen, Germany). Fecal samples were obtained using the QIAamp DNA feces Mini Kit, a commercial kit for the isolation of genomic DNA from feces. For the subsequent detection of methylation of specific regions of genes using PCR, the concentration and quality of genomic DNA were determined on a NanoDrop2000 microspectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA). Specific isolation steps were performed according to the instructions for use of the commercial isolation kit.
3. Выбор контрольных групп3. Selection of control groups
Положительный контроль представлял собой смесь гена внутреннего стандарта ACTB и фрагментов метилированной плазмидной ДНК PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 или представлял собой положительный контроль в виде метилированной цельногеномной ДНК человека. Отрицательный контроль представлял собой смесь гена внутреннего стандарта ACTB и фрагментов неметилированной плазмидной ДНК PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2, или представлял собой отрицательный контроль в виде неметилированной цельногеномной ДНК человека, или представлял собой отрицательный контроль в виде неметилированной цельногеномной ДНК человека. Холостой контроль представлял собой буфер на основе Tris-EDTA или воду без нуклеаз.The positive control was a mixture of the ACTB internal standard gene and methylated plasmid DNA fragments PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 or was a positive control in the form of methylated whole human genomic DNA. The negative control was a mixture of the ACTB internal standard gene and fragments of unmethylated plasmid DNA PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2, or was a negative control in the form of unmethylated whole genome human DNA, or was a negative control in the form of unmethylated whole human genome DNA. The blank control was Tris-EDTA buffer or nuclease-free water.
4. Бисульфитная конверсия ДНК4. Bisulfite conversion of DNA
Геномную ДНК, полученную из кала, крови или тканей, обрабатывали с помощью коммерческого набора для бисульфитной конверсии ДНК ZYMO EZ DNA Methylation Gold Kit (ZYMO Company, США) согласно инструкциям, при этом обработка по сути включала три стадии - сульфонирование, гидролиз и дезаминирование, обеспечивающие конверсию неметилированного цитозина (C) в урацил (U), тогда как метилированный цитозин (5mC) не подвергался конверсии. Геномную ДНК тестируемого образца после конвертирования с помощью бисульфита применяли в качестве матрицы для выявления метилирования посредством ПЦР. Положительный контроль и отрицательный контроль представляли собой генетически сконструированные плазмиды.Genomic DNA obtained from feces, blood or tissues was processed using a commercial kit for bisulfite DNA conversion ZYMO EZ DNA Methylation Gold Kit (ZYMO Company, USA) according to the instructions, while the processing essentially included three stages - sulfonation, hydrolysis and deamination, providing the conversion of unmethylated cytosine (C) to uracil (U), while methylated cytosine (5mC) was not converted. The genomic DNA of the test sample after conversion with bisulfite was used as a template for detection of methylation by PCR. Positive control and negative control were genetically engineered plasmids.
5. Разработка и синтез праймеров и зондов5. Design and synthesis of primers and probes
Для разработки специфических праймеров и зондов к конкретным сайтам метилирования генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1, SFRP2-2 в геноме человека и гена внутреннего стандарта ACTB (см. последовательность всего генома человека, опубликованную в базе данных NCBI) применяли программное обеспечение Premier 3.0 и BeaconDesigner. Праймеры и зонды были синтезированы компанией Sangon Bioengineering Co., Ltd. (Шанхай).To design specific primers and probes for specific methylation sites of the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1, SFRP2-2 genes in the human genome and the ACTB internal standard gene (see the sequence of the entire human genome published in the NCBI database), software was used. providing Premier 3.0 and BeaconDesigner. Primers and probes were synthesized by Sangon Bioengineering Co., Ltd. (Shanghai).
В рамках настоящего изобретения одновременно были разработаны и проверены несколько наборов комбинаций последовательностей праймеров и зондов для последовательностей метилированных нуклеиновых кислот фрагментов целевых генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2, связанных с колоректальным раком и распространенной аденомой. После повторных экспериментов по оптимизации были оптимизированы представленные далее последовательности (таблица 1) наборов праймеров и зондов для выявления метилирования фрагментов генов PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2. Последовательности наборов специфических праймеров и зондов представлены в таблице 1.Within the framework of the present invention, several sets of primer and probe sequence combinations for methylated nucleic acid sequences of target gene fragments PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 associated with colorectal cancer and advanced adenoma were simultaneously developed and tested. After repeated optimization experiments, the following sequences (Table 1) of primer and probe sets were optimized to detect methylation of PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1, and SFRP2-2 gene fragments. The sequences of specific primer and probe sets are shown in Table 1.
6. Компоненты системы для ПЦР-реакции6. Components of the PCR reaction system
Система для ПЦР-реакции содержит вышеупомянутые специфические праймеры, которые можно разделить на 6 реакционных систем (A/B/C/D/E/F), среди которых:The PCR reaction system contains the above specific primers, which can be divided into 6 reaction systems (A/B/C/D/E/F), among which:
система для ПЦР А содержит прямой праймер (праймер 1) для гена PRDM12, обратный праймер (праймер 2) для гена PRDM12 и зонд для выявления (зонд 1) для гена PRDM12. система для ПЦР B содержит прямой праймер (праймер 3) для гена FOXE1, обратный праймер (праймер 4) для гена FOXE1 и зонд для выявления (зонд 2) для гена FOXE1. система для ПЦР C содержит прямой праймер (праймер 5) для гена B3GAT2, обратный праймер (праймер 6) для гена B3GAT2 и зонд для выявления (зонд 3) для гена B3GAT2. система для ПЦР D содержит прямой праймер (праймер 7) для гена виментина, обратный праймер (праймер 8) для гена виментина и зонд для выявления (зонд 4) для гена виментина. система для ПЦР E содержит прямой праймер (праймер 9) для гена SFRP2-1, обратный праймер (праймер 10) для гена SFRP2-1 и зонд для выявления (зонд 5) для гена SFRP2-1. система для ПЦР F содержит прямой праймер (праймер 11) для гена SFRP2-2, обратный праймер (праймер 12) для гена SFRP2-2 и зонд для выявления (зонд 6) для гена SFRP2-2. Система для ПЦР-реакции дополнительно содержит прямой праймер (праймер 13) для гена внутреннего стандарта ACTB, обратный праймер (праймер 14) для гена внутреннего стандарта ACTB, зонд для выявления (зонд 7) для ACTB, буфер для ПЦР, dNTP, taq-полимеразу для ПЦР с горячим стартом и MgCl2.the PCR A system contains a forward primer (primer 1) for the PRDM12 gene, a reverse primer (primer 2) for the PRDM12 gene, and a detection probe (probe 1) for the PRDM12 gene. the PCR system B contains a forward primer (primer 3) for the FOXE1 gene, a reverse primer (primer 4) for the FOXE1 gene, and a detection probe (probe 2) for the FOXE1 gene. the C PCR system contains a forward primer (primer 5) for the B3GAT2 gene, a reverse primer (primer 6) for the B3GAT2 gene, and a detection probe (probe 3) for the B3GAT2 gene. the PCR system D contains a forward primer (primer 7) for the vimentin gene, a reverse primer (primer 8) for the vimentin gene, and a detection probe (probe 4) for the vimentin gene. the E PCR system contains a forward primer (primer 9) for the SFRP2-1 gene, a reverse primer (primer 10) for the SFRP2-1 gene, and a detection probe (probe 5) for the SFRP2-1 gene. the F PCR system contains a forward primer (primer 11) for the SFRP2-2 gene, a reverse primer (primer 12) for the SFRP2-2 gene, and a detection probe (probe 6) for the SFRP2-2 gene. The PCR reaction system additionally contains a forward primer (primer 13) for the ACTB internal standard gene, a reverse primer (primer 14) for the ACTB internal standard gene, a detection probe (probe 7) for ACTB, a PCR buffer, dNTP, taq polymerase for hot start PCR and MgCl 2 .
Конвертированную ДНК вносили в каждую систему для ПЦР-реакции, и конечная концентрация каждого компонента показана в таблице 2.Converted DNA was added to each PCR reaction system and the final concentration of each component is shown in Table 2.
7. Применение коммерческого набора, которое включало следующие стадии.7. Application of a commercial kit, which included the following steps.
(1) Получали подлежащие тестированию образцы, при этом для настоящего изобретения были применимы все образцы - кала, крови или тканей. Из образцов кала, крови или тканей выделяли геномную ДНК и конвертировали с помощью бисульфита, а конвертированную ДНК применяли в качестве матрицы для ПЦР-реакций.(1) Received to be tested samples, while for the present invention were applicable to all samples - feces, blood or tissue. Genomic DNA was isolated from stool, blood, or tissue samples and converted with bisulfite, and the converted DNA was used as a template for PCR reactions.
(2) Из коммерческого набора извлекали реагент для ПЦР-реакции, уравновешивали до комнатной температуры, 29,7 мкл × (n+1), раствор для ПЦР-реакции и смесь ферментов 0,3 мкл × (n+1) равномерно перемешивали в течение 20 с и немедленно центрифугировали; где n представляет собой количество протестированных образцов; выполняли немедленное центрифугирование.(2) PCR reaction reagent was removed from the commercial kit, equilibrated to room temperature, 29.7 μl × (n+1), PCR reaction solution and enzyme mixture 0.3 μl × (n+1) were evenly mixed in for 20 s and immediately centrifuged; where n is the number of samples tested; performed immediate centrifugation.
(3) Полученный в результате центрифугирования раствор распределяли по пробиркам для ПЦР, по 30 мкл полученного в результате центрифугирования раствора на пробирку.(3) The centrifuged solution was dispensed into PCR tubes, 30 µl of the centrifuged solution per tube.
(4) С помощью микропипетки 10 мкл раствора матричной ДНК (подлежащей тестированию конвертированной ДНК или конвертированного отрицательного/положительного/холостого контроля) вносили в каждую пробирку для ПЦР до получения 40 мкл конечного объема каждой реакционной смеси. Пробирку немедленно закрывали крышкой, содержимое пробирки перемешивали до однородного состояния, подвергали кратковременному центрифугированию и переносили пробирку для ПЦР в амплификатор для флуоресцентной количественной ПЦР в режиме реального времени.(4) Using a micropipette, 10 µl of the template DNA solution (to be tested converted DNA or converted negative/positive/blank control) was added to each PCR tube to obtain 40 µl of the final volume of each reaction mixture. The tube was immediately capped, the contents of the tube were mixed until homogeneous, subjected to short-term centrifugation, and the PCR tube was transferred to the real-time fluorescence quantitative PCR cycler.
(5) В приборе для флуоресцентной количественной ПЦР в режиме реального времени программу амплификации устанавливали на непрерывное осуществление амплификации посредством ПЦР и получение и анализ флуоресцентного сигнала в режиме реального времени в процессе амплификации. Настройки программы реакции показаны в таблице 3.(5) In the real-time fluorescence quantitative PCR instrument, the amplification program was set to continuously carry out PCR amplification and obtain and analyze a real-time fluorescent signal during amplification. The reaction program settings are shown in Table 3.
(6) Определение результатов ПЦР(6) Determination of PCR results
Во время выявления в образце исходный уровень определяли путем получения сигналов флуоресценции циклов 3-15; порог устанавливали путем проведения линии порога, превышающей наиболее высокую точку кривой амплификации нормального отрицательного контроля, для которой значение Ct не поддавалось выявлению; присвоение образцу положительного или отрицательного результата осуществляли на основе зарегистрированных значений Ct, то есть на основе номера цикла, при осуществлении которого флуоресцентный сигнал в каждой реакционной пробирке достигал установленного порога.During detection in the sample, the baseline was determined by obtaining fluorescence signals of cycles 3-15; the threshold was set by drawing a threshold line above the highest point of the amplification curve of the normal negative control, for which the Ct value was not detectable; the assignment of a positive or negative result to the sample was carried out on the basis of the recorded Ct values, that is, on the basis of the number of the cycle, during which the fluorescent signal in each reaction tube reached the set threshold.
Выводы. (1) Для 31 положительного образа были получены кривые амплификации в соответствующих лунках выявления канала FAM, и результаты выявления являлись положительными, что согласовалось с результатами диагностики с использованием морфологического анализа. В 10 отрицательных образцах только канал ROX контроля для гена внутреннего стандарта имел кривую амплификации, а все результаты выявления целевого гена в канале FAM были отрицательными, что согласовалось с результатами диагностики с использованием морфологического анализа. Это свидетельствовало о том, что результаты выявления, полученные с помощью коммерческого набора, представленного в настоящем изобретении, характеризовались чрезвычайно высокой специфичностью и надежностью. Значения Ct показаны в подробном описании результатов выявления для каждого образца из настоящей заявки в таблице 3.Conclusions. (1) For 31 positive samples, amplification curves were obtained in the corresponding wells of the FAM channel detection, and the detection results were positive, which was consistent with the results of diagnosis using morphological analysis. In 10 negative samples, only the control ROX channel for the internal standard gene had an amplification curve, and all results of detection of the target gene in the FAM channel were negative, which was consistent with the results of diagnosis using morphological analysis. This indicated that the detection results obtained using the commercial kit presented in the present invention were characterized by extremely high specificity and reliability. The Ct values are shown in the detailed description of the detection results for each sample from the present application in Table 3.
По результатам флуоресцентной количественной ПЦР в образцах видно, что гены PRDM12, FOXE1, B3GAT2, виментина, SFRP2-1 и SFRP2-2 характеризовались высоким уровнем амплификации в образцах колоректального рака и распространенной аденомы, в то время как уровень амплификации в нормальных образцах был чрезвычайно низким. Следовательно, было доказано, что коммерческий набор по настоящему изобретению позволяет быстро и точно выявлять мутантные гены и нормальные гены в отслоившихся клетках в кале пациента с колоректальным раком и пациента с распространенной аденомой. Можно видеть, что коммерческий набор по настоящему изобретению позволяет не только быстро и эффективно получить результаты, но и интерпретация результатов является очень ясной и интуитивно понятной, а сами результаты являются надежными и специфичными.The fluorescence qPCR results in the samples showed that the PRDM12, FOXE1, B3GAT2, vimentin, SFRP2-1 and SFRP2-2 genes were characterized by a high level of amplification in colorectal cancer and advanced adenoma samples, while the amplification level in normal samples was extremely low . Therefore, it has been proven that the commercial kit of the present invention allows rapid and accurate detection of mutant genes and normal genes in sloughed cells in the feces of a patient with colorectal cancer and a patient with advanced adenoma. It can be seen that the commercial kit of the present invention not only allows results to be obtained quickly and efficiently, but the interpretation of the results is very clear and intuitive, and the results themselves are reliable and specific.
12PRDM
12
12PRDM
12
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
2B3GAT
2
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
инViment
in
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
2-1SFRP
2-1
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
2-1SFRP
2-1
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
2-2SFRP
2-2
2-2SFRP
2-2
ний стандарт)ACTB (internal
standard)
2-2SFRP
2-2
В вышеприведенном описании проиллюстрированы и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, и, как указано ранее, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено формой, раскрытой в данном документе, или не должно истолковываться как исключающее другие варианты осуществления, но может применяться в ряде других комбинаций, модификаций и условий. Можно понять, что настоящее изобретение можно подвергнуть модификации в пределах объема описанных в данном документе идей настоящего изобретения на основе вышеизложенного раскрытия и опыта или сведений в соответствующих областях техники. Тем не менее, модификации и изменения, производимые специалистами в данной области техники, не должны выходить за пределы сути и объема настоящего изобретения, и все они должны охватываться объемом охраны прилагаемой формулы настоящего изобретения.The foregoing description has illustrated and described the preferred embodiments of the present invention, and as previously indicated, it should be understood that the present invention is not limited to the form disclosed herein or should not be construed as excluding other embodiments, but may be used in a number of other combinations. , modifications and conditions. It can be understood that the present invention may be subject to modifications within the scope of the teachings of the present invention described herein based on the foregoing disclosure and experience or knowledge in the relevant arts. However, modifications and changes made by those skilled in the art should not depart from the spirit and scope of the present invention, and all of them should be covered by the scope of protection of the appended claims of the present invention.
Claims (131)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910982813.8 | 2019-10-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2791172C1 true RU2791172C1 (en) | 2023-03-03 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011126768A2 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-13 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for detecting colorectal cancer and adenoma |
| WO2012167145A2 (en) * | 2011-06-01 | 2012-12-06 | University Of Southern California | Genome-scale analysis of aberrant dna methylation in colorectal cancer |
| CN109486955A (en) * | 2018-12-29 | 2019-03-19 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | It is a kind of for excrement Detection progress phase adenoma, the kit of colorectal cancer related gene methylation sites |
| CN109811056A (en) * | 2019-02-28 | 2019-05-28 | 苏州唯善生物科技有限公司 | For colorectal cancer and its primed probe group and kit of precancerous lesion early diagnosis, detection or screening |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011126768A2 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-13 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for detecting colorectal cancer and adenoma |
| WO2012167145A2 (en) * | 2011-06-01 | 2012-12-06 | University Of Southern California | Genome-scale analysis of aberrant dna methylation in colorectal cancer |
| CN109486955A (en) * | 2018-12-29 | 2019-03-19 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | It is a kind of for excrement Detection progress phase adenoma, the kit of colorectal cancer related gene methylation sites |
| CN109811056A (en) * | 2019-02-28 | 2019-05-28 | 苏州唯善生物科技有限公司 | For colorectal cancer and its primed probe group and kit of precancerous lesion early diagnosis, detection or screening |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Д. В. РЕБРИКОВ и др. ПЦР в реальном времени, 6-е издание, БИНОМ, лаборатория знаний, Москва, 2015, стр. 85, 86. Основы полимеразной цепной реакции, методическое пособие, Москва, 2 января 2019, стр. 9, https://www.dna-technology.ru/sites/default/files/pcr_a5_083-4.pdf. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108977543B (en) | Colorectal cancer early diagnosis reagent based on joint detection of SDC2 and SFRP2 gene methylation level | |
| CN113755603B (en) | Marker, primer probe and kit for early screening and diagnosis of endometrial cancer | |
| WO2017114150A1 (en) | Molecular detection/diagnosis reagent for tumor | |
| US11767565B2 (en) | Use of detection reagent for detecting methylation of genes associated with colorectal cancer, and kit | |
| CN110229908B (en) | Primer, probe and kit for early detection of lung cancer gene methylation | |
| EP4047101A1 (en) | Primer set for methylation of a specific region of a human colorectal cancer-related gene, test, test kit and application thereof | |
| CN110331142B (en) | Multi-gene combined detection reagent | |
| CN110317871B (en) | Gene marker combination and application thereof | |
| CN112501298B (en) | Composition and kit for methylation noninvasive early detection of ovarian cancer | |
| US20240035096A1 (en) | Composition, kit, and application for detection of colorectal cancer | |
| CN110964823A (en) | DNA methylation kit for colorectal cancer detection and detection method | |
| US20230076141A1 (en) | Markers, primers, probes and kit for early screening and diagnosis of endometrial cancer | |
| RU2791172C1 (en) | Primer kit, reagent and commercial kit for methylation of specific gene regions associated with human colorectal cancer and use of the commercial kit | |
| CN108796078B (en) | Primer and probe set for diagnosing, detecting or screening digestive tract cancer | |
| CN116121387A (en) | Combined marker for colorectal cancer detection and application thereof | |
| CN116144782A (en) | Combined marker for lung cancer detection and application thereof | |
| CN114480655A (en) | DNA methylation marker combination and application thereof, ovarian cancer early detection primer probe and kit | |
| US11866790B2 (en) | Combination of DNA methylation markers and use thereof, primers, probes and kit for early detection of ovarian cancer | |
| CN114150065B (en) | Marker for colorectal cancer or precancerous lesion and application thereof | |
| WO2024001602A1 (en) | Composition for detecting gastric cancer, kit, and use thereof | |
| WO2024002165A1 (en) | Dna methylation biomarker for diagnosis of gastric cancer, kit, and use | |
| CN116656810A (en) | Biomarkers, nucleic acid products and kits for pancreatic cancer | |
| CN117004713A (en) | Biomarkers and kits for diagnosing or aiding in diagnosing gastric cancer | |
| CN110846418A (en) | Primer group, probe group, kit and application for methylation detection of colorectal cancer Septin9 gene | |
| CN114959024A (en) | Biological target for DNA methylation detection of fecal exfoliated cells, primer probe composition, application and kit and use method thereof |