RU2789860C2 - Membrane for separating stem cells from biological samples, a method for obtaining the specified membrane and a method and device for separation, including the specified membrane - Google Patents
Membrane for separating stem cells from biological samples, a method for obtaining the specified membrane and a method and device for separation, including the specified membrane Download PDFInfo
- Publication number
- RU2789860C2 RU2789860C2 RU2021113722A RU2021113722A RU2789860C2 RU 2789860 C2 RU2789860 C2 RU 2789860C2 RU 2021113722 A RU2021113722 A RU 2021113722A RU 2021113722 A RU2021113722 A RU 2021113722A RU 2789860 C2 RU2789860 C2 RU 2789860C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane
- stem cells
- cells
- target
- carrier structure
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение представляет собой мембрану для отделения целевых стволовых клеток от биологических образцов, более конкретно от суспензии отдельных клеток, полученной из биологического образца, что позволяет получать стерильные целевые стволовые клетки в физиологическом буфере, характеризующиеся известным размером популяции (количество выделенных клеток) и жизнеспособностью (соотношение живых/мертвых клеток) клеток. Полученные таким образом целевые стволовые клетки могут быть использованы либо для терапии, сразу после отделения, или в дальнейшем - для разработки тканевых наполнителей или новых решений в области регенеративной медицины, связанной с различными тканями в стоматологии, ортопедии, пластической хирургии и т.д., либо для исследований, например, для изучения биологии стволовых клеток или тестирования новых терапевтических агентов и т. д. Мембрана выполнена в виде трехмерной структуры-носителя, изготовленной из по меньшей мере одного слоя биосовместимого полимера с заданным размером пор в качестве материала-носителя, имеющей ковалентно связанные целевые молекулы, предпочтительно целевые антитела, или на ее поверхности, и/или в порах, где указанные молекулы распознают характеристические антигены, связанные с поверхностью целевых стволовых клеток, и, таким образом, связывают целевые стволовые клетки с мембраной. Целевые молекулы могут быть связаны непосредственно с поверхностью и/или присутствовать в связанном виде в порах структуры-носителя или они могут быть связаны или интегрированы в трехмерную структуру мембраны с помощью определенных функционализированных наночастиц.The present invention is a membrane for separating target stem cells from biological samples, more specifically from a suspension of individual cells obtained from a biological sample, which allows the production of sterile target stem cells in physiological buffer, characterized by a known population size (number of isolated cells) and viability (ratio living/dead cells) cells. The target stem cells obtained in this way can be used either for therapy, immediately after separation, or later - for the development of tissue fillers or new solutions in the field of regenerative medicine associated with various tissues in dentistry, orthopedics, plastic surgery, etc., or for research, for example, to study the biology of stem cells or test new therapeutic agents, etc. The membrane is made in the form of a three-dimensional carrier structure made of at least one layer of a biocompatible polymer with a given pore size as a carrier material, having covalently bound target molecules, preferably target antibodies, or on its surface and/or in pores, where said molecules recognize characteristic antigens associated with the surface of the target stem cells and thus bind the target stem cells to the membrane. The target molecules may be bound directly to the surface and/or present bound in the pores of the carrier structure, or they may be bound or integrated into the three-dimensional structure of the membrane by certain functionalized nanoparticles.
Кроме того, настоящее изобретение включает способ получения мембраны, а также способ и устройство для отделения целевых стволовых клеток от биологического образца, которые включают указанную выше мембрану в качестве составной части. In addition, the present invention includes a method for producing a membrane, as well as a method and apparatus for separating target stem cells from a biological sample, which include the above membrane as an integral part.
Применение мембраны и способов по настоящему изобретению обеспечивает высокоспецифичное и эффективное активное отделение целевых стволовых клеток от смеси клеток в биологическом образце.The use of the membrane and methods of the present invention provides a highly specific and efficient active separation of target stem cells from a mixture of cells in a biological sample.
Уровень техники, технические проблемы и недостатки, решаемые настоящим изобретением. State of the Art, Technical Problems and Disadvantages Solved by the Present Invention.
Патент США № 794266 относится к выделению клеток путем связывания магнитных частиц с клетками. Решения из указанного выше патента несопоставимы с решениями, раскрытыми в настоящем изобретении, поскольку в указанном выше патенте используют технологию отделения клеток, основанную на магнитной силе притяжения в поле, в то время как настоящее изобретение вызывает отделение клеток, исключительно основываясь на реакции антитела с клеткой.US Pat. No. 794,266 relates to cell isolation by binding magnetic particles to cells. The solutions from the above patent are not comparable to the solutions disclosed in the present invention, since the above patent uses a cell separation technology based on magnetic force of attraction in the field, while the present invention causes cell separation solely based on the reaction of an antibody with a cell.
Патент США № 7592431 относится к выделению Treg-клеток (регуляторные Т-клетки) с помощью биосовместимых структур-носителей и активации маркеров клеточной поверхности. Релевантная литература не указывает на наличие каких-либо достаточно специфических маркеров в Treg-клетках; следовательно, способ согласно изобретению основан на другом подходе: дифференцировке стволовых клеток в Treg-клетки.US Pat. No. 7,592,431 relates to the isolation of T reg cells (regulatory T cells) using biocompatible carrier structures and activation of cell surface markers. The relevant literature does not indicate the presence of any sufficiently specific markers in T reg cells; therefore, the method according to the invention is based on a different approach: differentiation of stem cells into T reg cells.
Заявка на патент WO 2017075389 включает описание получения клеток с использованием соответствующих маркеров; авторы не указали тип исходной ткани; способ осуществляется вручную (требует больше времени, затраты и выходы несопоставимы), и применяемые антитела несопоставимы с антителами, упомянутыми в настоящем изобретении (например, CD90).Patent application WO 2017075389 includes a description of the production of cells using appropriate markers; the authors did not specify the type of original tissue; the method is manual (more time consuming, costs and yields are not comparable) and the antibodies used are not comparable to the antibodies mentioned in the present invention (eg CD90).
Патент США № 7390484 включает описание нового оптимизированного коллекторного контейнера для липоаспирации, включающего систему фильтрации, позволяющую обогащать суспензию клеток. Речь идет о «концентрировании» клеток и их нанесении на планшеты для культуры клеток для дальнейшей очистки и размножения клеток, полученных из образца.US Pat. No. 7,390,484 includes a description of a novel, optimized lipoaspiration collection container incorporating a filtration system to enrich the cell suspension. It is about “concentrating” the cells and applying them to cell culture plates for further purification and expansion of the cells obtained from the sample.
Заявка на патент США № 20130130371 описывает механическую очистку липоаспирата с применением сетчатых фильтров. Однако способ согласно настоящему изобретению определяет суспензию клеток как исходный материал, который можно получить несколькими способами, следовательно, способ согласно настоящему изобретению не ограничивается фильтрацией или очисткой с применением сетчатых фильтров. Более того, в указанной выше патентной заявке не упоминается какой-либо способ «отделения клеток на основе аффинности». В ней раскрывается предварительное получение липоаспирата для дальнейшего применения.US Patent Application No. 20130130371 describes the mechanical cleaning of lipoaspirate using mesh filters. However, the method of the present invention defines a cell suspension as a raw material that can be obtained in several ways, therefore, the method of the present invention is not limited to filtration or screening. Moreover, the above patent application does not mention any "affinity-based cell separation" method. It discloses the preliminary preparation of lipoaspirate for further use.
Заявка на патент США № 20130034524 описывает общеизвестный протокол выделения клеток с применением центрифугирования, ферментативного расщепления и т. д. Это не служит препятствием для настоящего изобретения, поскольку указанная выше заявка на патент относится к «обогащению или концентрированию клеток», а не к выделению или отделению клеток. Это также означает, что указанный выше патент не относится к способу отделения на основе аффинности; кроме того, выходы существенно ниже, чем выходы согласно настоящему изобретению, в особенности потому, что даже после центрифугирования все еще получают «смесь клеток».US Patent Application No. 20130034524 describes a well-known cell isolation protocol using centrifugation, enzymatic digestion, etc. This does not interfere with the present invention, since the above patent application refers to "enrichment or concentration of cells", and not to isolate or cell separation. This also means that the above patent is not related to the affinity based separation method; moreover, the yields are substantially lower than those according to the present invention, especially because even after centrifugation a "cell mixture" is still obtained.
Вышеупомянутые недостатки решений из уровня техники устраняются с помощью мембраны и способа отделения согласно настоящему изобретению.The aforementioned disadvantages of the prior art solutions are overcome by the membrane and separation method according to the present invention.
В контексте данной заявки термин «стволовые клетки» определяет клетки с высокой (теоретически бесконечной) способностью к самообновлению популяции (что означает, что они могут делиться таким образом, что образуется больше клеток такого же типа), которые могут дифференцироваться в по меньшей мере один другой тип клеток, таким образом, имея способность к репопуляции или регенерации (различных) тканей после трансплантации. На молекулярном уровне эти клетки экспрессируют так называемые маркеры стволовых клеток, такие как поверхностные антигены, характерные для стволовых клеток. В зависимости от биологического образца содержащиеся в нем стволовые клетки экспрессируют характеристические поверхностные антигены. Например, гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из периферической или пуповинной крови, экспрессируют среди прочего поверхностные антигены CD34, тогда как мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из жировой ткани, экспрессируют поверхностные антигены CD90.In the context of this application, the term "stem cells" defines cells with a high (theoretically infinite) capacity for self-renewal of the population (which means that they can divide in such a way that more cells of the same type are formed), which can differentiate into at least one other cell type, thus having the ability to repopulate or regenerate (various) tissues after transplantation. At the molecular level, these cells express so-called stem cell markers, such as surface antigens characteristic of stem cells. Depending on the biological sample, the stem cells it contains express characteristic surface antigens. For example, hematopoietic stem cells isolated from peripheral or cord blood express inter alia CD34 surface antigens, while mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue express CD90 surface antigens.
Термин «целевая стволовая клетка» означает стволовые клетки, экспрессирующие характеристические поверхностные антигены, которые связываются с выбранными целевыми молекулами.The term "target stem cell" means stem cells expressing characteristic surface antigens that bind to selected target molecules.
Термин «целевая молекула» относится к молекуле, которая распознает характеристический антиген на поверхности целевой стволовой клетки и может связываться на этом характеристическом антигене. В процессе целевая молекула не должна влиять на саму целевую стволовую клетку, например, ее дифференцировку, или вынуждать ее делиться, и при применении не должна влиять на секрецию каких-либо веществ, которые могут вызвать краткосрочное (острое) или долгосрочное (хроническое) негативное воздействие на пациента или влияние на характеристики (генотип, эпигенетику или фенотип) целевых стволовых клеток. Предпочтительно, целевая молекула представляет собой целое антитело или часть антитела, которое распознает характеристический антиген на поверхности целевой стволовой клетки (например, область Fc, область Fab, аптамер) и обеспечивает специфическое связывание с характеристическим антигеном. Предпочтительно это антитела, распознающие следующие антигены: CD90, CD146, CD44, CD73, CD105, CD34, STRO-1, STRO-3 и т. д. The term "target molecule" refers to a molecule that recognizes a characteristic antigen on the surface of a target stem cell and can bind to that characteristic antigen. In the process, the target molecule must not affect the target stem cell itself, such as its differentiation, or cause it to divide, and, when applied, must not affect the secretion of any substances that can cause short-term (acute) or long-term (chronic) negative effects on the patient or influence on the characteristics (genotype, epigenetics or phenotype) of the target stem cells. Preferably, the target molecule is a whole antibody or part of an antibody that recognizes the characteristic antigen on the surface of the target stem cell (eg, F c region, F ab region, aptamer) and provides specific binding to the characteristic antigen. Preferably, these are antibodies that recognize the following antigens: CD90, CD146, CD44, CD73, CD105, CD34, STRO-1, STRO-3, etc.
Биологический образец для отделения целевых стволовых клеток может представлять собой любые органы, ткани и жидкости человека и животных, которые включают такие клетки и взяты от живых или мертвых доноров. Он прежде всего представляет собой, но не ограничивается перечисленным: подкожную жировую ткань, полученную липоаспирацией или хирургическим удалением; костный мозг, полученный пункцией; немобилизованную периферическую кровь и периферическую кровь после мобилизации костного мозга, полученную венепункцией или аферезом; эндометрий, полученный при биопсии матки; менструальную кровь; пуповинную ткань, желе Уортона и пуповинную кровь, полученные после/во время родов; амниотическую жидкость, полученную амниоцентезом или во время родов путем кесарева сечения; амниотическую оболочку, полученную после родов; пульпу зуба, полученную из зубов.The biological sample for separation of target stem cells can be any human or animal organs, tissues and fluids that include such cells and are taken from living or dead donors. It primarily represents, but is not limited to: subcutaneous adipose tissue obtained by lipoaspiration or surgical removal; bone marrow obtained by puncture; non-mobilized peripheral blood and peripheral blood after bone marrow mobilization obtained by venipuncture or apheresis; endometrium obtained by biopsy of the uterus; menstrual blood; cord tissue, Wharton's jelly and cord blood obtained after / during childbirth; amniotic fluid obtained by amniocentesis or during childbirth by caesarean section; amniotic membrane obtained after childbirth; dental pulp obtained from teeth.
Термин «функционализированная наночастица» относится к наночастице, имеющей поверхностные функциональные группы (например, NH2, OH, COOH, SH и т. д.) на своей поверхности, обеспечивающие связывание с трехмерной структурой-носителем мембраны и/или связывание целевых молекул на поверхности функционализированной наночастицы.The term “functionalized nanoparticle” refers to a nanoparticle having surface functional groups (e.g., NH 2 , OH, COOH, SH, etc.) on its surface, providing binding to the three-dimensional membrane carrier structure and/or binding of target molecules on the surface functionalized nanoparticle.
Термин «биофункционализированная наночастица» относится к функционализированной наночастице, имеющей уже связанные целевые молекулы или их части на своей поверхности, которые распознают характеристический антиген на поверхности целевой стволовой клетки и могут связываться с этим характеристическим антигеном.The term "biofunctionalized nanoparticle" refers to a functionalized nanoparticle having already bound target molecules or portions thereof on its surface that recognize a characteristic antigen on the surface of the target stem cell and can bind to this characteristic antigen.
Функционализированные наночастицы могут быть неорганическими, органическими, гибридными, композитными, магнитными или их комбинациями и состоят из металлов и/или их сплавов, и/или оксидов металлов, и/или полимеров, или любой комбинации указанных выше основных материалов с поверхностными функциональными группами (например, NH2, OH, COOH, SH и т. д.). В одном варианте осуществления функционализированные наночастицы представляют собой гибридные неоргано-органические наночастицы. Предпочтительно функционализированные наночастицы представляют собой, например, наночастицы из металлических сплавов (например, NiCu, представляющий собой никель/медь), заключенные в слой диоксида кремния (SiO2), имеющие поверхностные функциональные группы на поверхности. Функционализированные наночастицы также могут представлять собой оксиды металлов (например, Fe2O3 или Fe3O4), аналогично заключенные в слой диоксида кремния и имеющие поверхностные функциональные группы на поверхности. Предпочтительно толщина слоя диоксида кремния составляет от пары нанометров до нескольких десятков нанометров. В другом варианте осуществления функционализированные наночастицы представляют собой наночастицы на основе диоксида кремния (химически SiO2), полученные из различных предшественников на основе силоксана (например, (3-аминопропил)триэтоксисилан - APTES, винилтриэтоксисилан - VTES, (3-меркаптопропил)триэтоксисилан - MPTES), которые также могут обеспечивать присутствие желаемых функциональных групп на их поверхности уже в ходе синтеза этих наночастиц, т.е. in situ. В еще одном варианте осуществления функционализированные наночастицы представляют собой наночастицы на основе полисахаридов (например, хитозана, карбоксиметилцеллюлозы, альгината и т. д.). Их основная структура уже включает желаемые предпочтительные функциональные группы (например, NH2, OH, COOH и т.д.), обеспечивая функцию аналогичную другим примерам раскрытых функционализированных наночастиц. Другой вариант осуществления относится к синтезу наночастиц на основе других синтетических полимеров (например, дендримеров, производных метакрилатов, полиэтиленимина и т.д.), также содержащих желаемые функциональные группы (например, NH2, OH, COOH, SH и т.д.) в их основной структуре, таким образом, также удовлетворяющие начальному определению функционализированных наночастиц. Синтез наночастиц может быть осуществлен с использованием золь-гель метода, эмульсионных методов или любого другого способа синтеза, позволяющего получать наночастицы, которые удовлетворяют определению функционализированной наночастицы, состоящей из вышеупомянутых и других основных материалов.Functionalized nanoparticles may be inorganic, organic, hybrid, composite, magnetic, or combinations thereof and consist of metals and/or their alloys and/or metal oxides and/or polymers, or any combination of the above basic materials with surface functional groups (for example , NH2, OH, COOH, SH, etc.). In one embodiment, the functionalized nanoparticles are hybrid inorganic-organic nanoparticles. Preferably, the functionalized nanoparticles are, for example, metal alloy nanoparticles (for example, NiCu, which is nickel/copper) embedded in a layer of silicon dioxide (SiO2) having surface functional groups on the surface. Functionalized nanoparticles can also be metal oxides (for example, Fe2O3 or Fe3O4), similarly enclosed in a layer of silicon dioxide and having surface functional groups on the surface. Preferably, the thickness of the silica layer is from a couple of nanometers to several tens of nanometers. In another embodiment, the functionalized nanoparticles are silica-based nanoparticles (chemically SiO2) obtained from various siloxane-based precursors (e.g. (3-aminopropyl)triethoxysilane - APTES, vinyltriethoxysilane - VTES, (3-mercaptopropyl)triethoxysilane - MPTES), which can also provide the presence of desired functional groups on their surface already during synthesis these nanoparticles, i.e. in situ. In yet another embodiment, the functionalized nanoparticles are nanoparticles based on polysaccharides (eg, chitosan, carboxymethyl cellulose, alginate, etc.). Their basic structure already includes the desired preferred functional groups (e.g. NH2, OH, COOH, etc.) providing a function similar to other examples of the disclosed functionalized nanoparticles. Another embodiment relates to the synthesis of nanoparticles based on other synthetic polymers (e.g., dendrimers, methacrylate derivatives, polyethyleneimine, etc.) also containing the desired functional groups (e.g., NH2, OH, COOH, SH, etc.) in their basic structure, thus also satisfying the initial definition of functionalized nanoparticles. The synthesis of nanoparticles can be carried out using the sol-gel method, emulsion methods, or any other synthesis method that allows to obtain nanoparticles that satisfy the definition of a functionalized nanoparticle consisting of the above and other basic materials.
Исходная суспензия отдельных клеток представляет собой суспензию отдельных клеток и небольших клеточных кластеров, полученную из биологического образца в физиологическом буфере, т.е. буфере, позволяющем сохранять клетки в физиологических условиях. Такие буферы представляют собой, например, физиологический раствор, культуральную среду, 1xPBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и другие подобные растворы. Таким образом, исходная суспензия клеток включает целевые стволовые клетки, а также другие нецелевые клетки, т.е. остальную часть клеток тканей, нецелевые стволовые клетки, продукты клеточного распада и другие компоненты (например, плазму крови, межклеточную жидкость, внеклеточный матрикс), которые могут присутствовать в биологическом образце.The original single cell suspension is a suspension of single cells and small cell clusters obtained from a biological sample in a physiological buffer, i.e. buffer that allows cells to be stored under physiological conditions. Such buffers are, for example, saline, culture medium, 1xPBS (phosphate buffered saline) and the like. Thus, the initial cell suspension includes target stem cells as well as other non-target cells, i.e. the rest of tissue cells, non-target stem cells, cellular decay products, and other components (eg, blood plasma, extracellular fluid, extracellular matrix) that may be present in the biological sample.
Термин «активация мембраны» означает связывание целевых молекул, которые распознают и связывают характеристические антигены на поверхности целевых стволовых клеток, на/в трехмерной структуре-носителе мембраны. Активация мембраны может осуществляться путем включения целевых молекул с помощью любого химического, физико-химического или физического способа. Это включает, не ограничиваясь перечисленным, включение функционализированных наночастиц в структуру-носитель мембраны и последующее связывание целевых молекул с указанными наночастицами, интеграцию биофункционализированных наночастиц в структуру-носитель мембраны или прямое связывание целевых молекул со структурой-носителем мембраны.The term “membrane activation” means the binding of target molecules that recognize and bind characteristic antigens on the surface of target stem cells to/in a three-dimensional membrane carrier structure. Activation of the membrane can be carried out by incorporating target molecules using any chemical, physico-chemical or physical method. This includes, but is not limited to, incorporating the functionalized nanoparticles into a membrane carrier structure and then binding the target molecules to said nanoparticles, integrating the biofunctionalized nanoparticles into the membrane carrier structure, or directly binding the target molecules to the membrane carrier structure.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Изобретение описано ниже, представлено с вариантами осуществления, и раскрыто на фигуре.The invention is described below, presented with embodiments, and disclosed in the figure.
На фиг. 1 показана сменная кассета, составляющая часть устройства для отделения стволовых клеток от биологических образцов, которая включает мембрану согласно изобретению.In FIG. 1 shows a replaceable cassette, which is part of a device for separating stem cells from biological samples, which includes a membrane according to the invention.
Мембрана согласно изобретению состоит из трехмерной структуры-носителя с включенными целевыми молекулами на поверхности и/или в порах указанной структуры-носителя. Указанная структура-носитель изготовлена из по меньшей мере одного слоя биосовместимого полимера, имеющего структурированную или неструктурированную геометрию, с порами диаметром от 50 до 500 мкм, имеющего на своей поверхности и/или в порах ковалентно связанные целевые молекулы, которые распознают и связывают характеристические антигены на поверхности целевых стволовых клеток. Таким образом, целевые стволовые клетки захватываются на мембране, тогда как нецелевые клетки проходят через мембрану или могут быть смыты с поверхности мембраны.The membrane according to the invention consists of a three-dimensional carrier structure with included target molecules on the surface and/or in the pores of said carrier structure. The specified carrier structure is made of at least one layer of a biocompatible polymer having a structured or unstructured geometry, with pores with a diameter of 50 to 500 microns, having on its surface and / or in the pores covalently bound target molecules that recognize and bind characteristic antigens on surface of target stem cells. Thus, target stem cells are trapped on the membrane, while non-target cells pass through the membrane or can be washed away from the membrane surface.
Структурированная геометрия отдельного слоя структуры-носителя означает, что в каждом отдельном слое форма, размер и распределение пор являются одинаковыми по всему слою. Слой как таковой можно охарактеризовать в ходе способа получения, который можно регулировать. Неструктурированная геометрия означает, что в каждом отдельном слое форма, размер и распределение пор являются произвольными и на них нельзя повлиять в ходе получения. Геометрия отдельного слоя структуры-носителя зависит от используемого способа получения мембраны. Например, при использовании 3D-печати геометрия отдельного слоя структуры-носителя будет структурированной, тогда как при использовании электроспиннинга геометрия отдельного слоя будет по большей части неструктурированной или произвольной, что является характерной особенностью этого способа.The structured geometry of the individual layer of the carrier structure means that in each individual layer the shape, size and distribution of the pores are the same throughout the entire layer. The layer as such can be characterized in the course of the production process, which can be controlled. The unstructured geometry means that in each individual layer the shape, size and distribution of the pores are arbitrary and cannot be influenced during production. The geometry of an individual layer of the carrier structure depends on the method used to obtain the membrane. For example, when using 3D printing, the geometry of an individual layer of the support structure will be structured, while using electrospinning, the geometry of an individual layer will be mostly unstructured or arbitrary, which is a characteristic feature of this method.
Подходящий биосовместимый полимер может быть гидрофобным или гидрофильным. Предпочтительно он является гидрофобным; не должен связывать целевые стволовые клетки; должен быть инертным по отношению к целевым стволовым клеткам (что означает, что он не должен влиять на их основные характеристики, такие как статус и потенциал дифференцировки, статус и потенциал пролиферации, экспрессия поверхностных антигенов); во время применения не должен усиливать секрецию и/или возникновение каких-либо веществ, которые могут иметь краткосрочное или долгосрочное негативное воздействие на пациента, получающего лечение такими клетками; должен позволять осуществлять стерилизацию без изменения характеристик полимера; предпочтительно не должен связывать тромбоциты или эритроциты; должен обладать определенными физико-химическими и механическими характеристиками, важными для получения мембраны, такими как подходящая вязкость, значение pKa, пригодность для печати, поверхностное натяжение и т.д. Подходящие биосовместимые полимеры включают, но не ограничиваются перечисленным, различные тканые и нетканые натуральные материалы, например, производные полисахаридов, представляющие собой альгинат (ALG), карбоксиметилцеллюлозу (CMC), вискозу (VIS), шелк, коллаген, нанофибриллированную целлюлозу (NFC) и т.д. и их комбинации, полусинтетические материалы, такие как хитозан (CHI) и его производные, целлюлоза и другие производные, а также их комбинации; и синтетические материалы, например, поликапролактон (PCL), полиэтилентерефталат (PET), полибутилентерефталат (PBT), полипропилен (PP), полигидроксиэтилметакрилат (PHEMA), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (PHPMA), поливиниловый спирт (PVA), полиэтиленоксид (PEOX), различные дендримеры, например, полиамидоамин (PAMAM), полиэтиленимин (PEI) и т.д. и их комбинации.A suitable biocompatible polymer may be hydrophobic or hydrophilic. Preferably it is hydrophobic; must not bind target stem cells; must be inert to the target stem cells (meaning that it must not affect their main characteristics such as differentiation status and potential, proliferation status and potential, expression of surface antigens); during application should not increase the secretion and / or the emergence of any substances that may have a short-term or long-term negative effect on the patient receiving treatment with such cells; should allow sterilization without changing the characteristics of the polymer; preferably should not bind platelets or erythrocytes; must have certain physico-chemical and mechanical characteristics that are important for obtaining a membrane, such as suitable viscosity, pKa value, printability, surface tension, etc. Suitable biocompatible polymers include, but are not limited to, various woven and nonwoven natural materials such as polysaccharide derivatives such as alginate (ALG), carboxymethyl cellulose (CMC), viscose (VIS), silk, collagen, nanofibrillated cellulose (NFC), etc. .d. and combinations thereof, semi-synthetic materials such as chitosan (CHI) and its derivatives, cellulose and other derivatives, and combinations thereof; and synthetic materials such as polycaprolactone (PCL), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polypropylene (PP), polyhydroxyethyl methacrylate (PHEMA), poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) (PHPMA), polyvinyl alcohol (PVA) ), polyethylene oxide (PEOX), various dendrimers such as polyamidoamine (PAMAM), polyethyleneimine (PEI), etc. and their combinations.
Предпочтительно биосовместимые полимеры выбраны из PCL, CMC, CHI, ALG, PET, PEOX и PHEMA/PHPMA. Это не исключает другие биосовместимые полимеры или их комбинации.Preferably the biocompatible polymers are selected from PCL, CMC, CHI, ALG, PET, PEOX and PHEMA/PHPMA. This does not exclude other biocompatible polymers or combinations thereof.
Выбор биосовместимого полимера для получения как таковой структуры-носителя может гарантировать, что структура-носитель будет иметь функциональные группы на поверхности и/или в порах (например, NH2, OH, COOH, SH и т.д.).The choice of a biocompatible polymer to obtain as such a carrier structure can ensure that the carrier structure will have functional groups on the surface and/or in the pores (eg, NH 2 , OH, COOH, SH, etc.).
Если структура-носитель составлена из нескольких слоев, имеющих структурированную и/или неструктурированную геометрию, отдельные слои могут быть изготовлены из одинаковых или разных биосовместимых полимеров, и геометрия отдельных слоев, то есть форма, размер и распределение пор в отдельном слое, могут быть одинаковыми или разными.If the carrier structure is composed of several layers having structured and/or unstructured geometries, the individual layers may be made from the same or different biocompatible polymers and the geometry of the individual layers, i.e. the shape, size and distribution of pores in the individual layer, may be the same or different.
Геометрию отдельного слоя определяют таким образом, чтобы пока целевые стволовые клетки связываются с поверхностью и/или в порах мембраны, через мембрану проходило как можно больше нецелевых клеток. Предпочтительно диаметр пор находится в диапазоне от 100 до 200 мкм.The individual layer geometry is determined such that while the target stem cells bind to the surface and/or in the pores of the membrane, as many non-target cells as possible pass through the membrane. Preferably, the pore diameter is in the range of 100 to 200 µm.
Необязательно, функционализированные наночастицы могут быть ковалентно (или другим образом с применением любого химического, физико-химического или физического способа) связанными «in situ» на/в структуре-носителе, состоящей из биосовместимого полимера, то есть на поверхности или/и в порах указанной структуры-носителя. Функционализированные наночастицы могут быть интегрированы в/на структуру-носитель просто «механически», то есть без применения особых связей или взаимодействий со структурой-носителем (или просто захватываются на/в нее). С функционализированными наночастицами целевые молекулы ковалентно связаны через поверхностные функциональные группы, то есть через активные центры функционализированных наночастиц. Optionally, the functionalized nanoparticles can be covalently (or otherwise using any chemical, physico-chemical or physical method) linked "in situ" on/in a carrier structure consisting of a biocompatible polymer, i.e. on the surface and/or in the pores of said carrier structure. Functionalized nanoparticles can be integrated into/onto the carrier structure simply "mechanically", ie without the use of special bonds or interactions with the carrier structure (or simply captured onto/into it). Target molecules are covalently bound to functionalized nanoparticles through surface functional groups, i.e. through active sites of functionalized nanoparticles.
В ходе осуществления способа получения мембраны, то есть «in situ», биофункционализированные наночастицы, то есть функционализированные наночастицы со связанными целевыми молекулами, могут быть уже интегрированы в структуру-носитель. During the implementation of the method for obtaining the membrane, i.e. "in situ", biofunctionalized nanoparticles, i.e. functionalized nanoparticles with associated target molecules, can already be integrated into the carrier structure.
В соответствии с изобретением для получения мембран могут использоваться различные биоинженерные способы, такие как 3D-печать (например, экструзия, лазер и т. д. и их комбинации), литье, электроспиннинг, плетение из обработанных или необработанных бесконечных волокон и другие методики, а также их комбинации. Также могут быть использованы другие методики, например смешение полимеров, при этом выбранная морфология обеспечивается путем селективного удаления желаемых полимерных компонентов (одного или нескольких) за счет использования их различных точек плавления. Среди других возможных методик получения мембран есть также спекание шариков (частиц круглой формы) различных размеров (например, шариков полистирола или микросфер диоксида кремния) с последующим покрытием их полимером; когда спеченная часть удаляется, остается мембранная структура желаемой пористости (на одном или нескольких уровнях), полностью состоящая из полимера. Однако другие методики или их комбинации, обеспечивающие указанные выше характеристики мембраны, также могут быть использованы для получения мембран.In accordance with the invention, various bioengineering methods can be used to obtain membranes, such as 3D printing (for example, extrusion, laser, etc., and combinations thereof), casting, electrospinning, weaving from processed or unprocessed endless fibers, and other techniques, and also their combinations. Other techniques may also be used, such as blending of polymers, wherein the chosen morphology is achieved by selectively removing the desired polymer components (one or more) by using their different melting points. Among other possible methods for obtaining membranes, there is also the sintering of balls (round particles) of various sizes (for example, polystyrene balls or silicon dioxide microspheres) and then coating them with a polymer; when the sintered part is removed, what remains is a membrane structure of the desired porosity (at one or more levels), consisting entirely of polymer. However, other techniques, or combinations thereof, that provide the above characteristics of the membrane, can also be used to obtain membranes.
Предпочтительно технологию 3D-печати используют для получения мембраны со структурированной или «расчетно» неструктурированной геометрией. Для этой цели лучше всего использовать 3D-принтер на основе экструзии, который экструдирует полимер или гидрогели путем нагрева/плавления и механической экструзии. Возможны комбинации всех методик. 3D-принтер может одновременно обеспечивать точное (до пиколитров) пипетирование раствора/суспензии выбранных активных молекул в заранее определенные места на структуре мембраны, что представляет собой еще один способ обеспечения желаемой активации мембраны. Кроме того, внутренняя структура отдельных экструдированных нитей может быть выполнена в виде туннелей или нитей с двумя/более слоями (например, печать ядра/оболочки), что позволяет дополнительно контролировать химические, физико-химические и механические характеристики мембраны, а также контролировать характеристики мембраны в ее активном или неактивном состоянии.Preferably, 3D printing technology is used to produce a membrane with a structured or "calculated" unstructured geometry. For this purpose, it is best to use an extrusion-based 3D printer that extrudes polymer or hydrogels by heating/melting and mechanical extrusion. Combinations of all methods are possible. A 3D printer can simultaneously provide accurate (to picolitre) pipetting of a solution/suspension of selected active molecules to predetermined locations on the membrane structure, which is another way to ensure the desired activation of the membrane. In addition, the internal structure of the individual extruded filaments can be made in the form of tunnels or filaments with two/more layers (for example, core/shell printing), which allows additional control of the chemical, physico-chemical and mechanical characteristics of the membrane, as well as control of the characteristics of the membrane in its active or inactive state.
Второй предпочтительный способ представляет собой электроспиннинг, служащий для получения мембран с неструктурированной или частично структурированной геометрией (получаемые макроматериалы всегда могут быть схожими, при необходимости). При использовании этого способа, могут быть получены тонкие слои, состоящие из множества подслоев, которые могут быть собраны в мембрану произвольной толщины. В то же время электроспиннинг можно применять для изменения характеристик поверхности напечатанной трехмерной мембраны (например, увеличения ее удельной площади поверхности), микро- и нано-характеристик мембраны (например, локального добавления функциональных групп с электроспряденными волокнами и т.д.) или даже для активации мембраны (например, если композиция для электроспиннинга включает биофункционализированные наночастицы или иным образом интегрированные целевые молекулы).The second preferred method is electrospinning, serving to obtain membranes with unstructured or partially structured geometry (the resulting macromaterials can always be similar, if necessary). Using this method, thin layers can be obtained, consisting of a plurality of sublayers, which can be assembled into a membrane of arbitrary thickness. At the same time, electrospinning can be applied to change the surface characteristics of a printed 3D membrane (for example, increasing its specific surface area), micro- and nano-characteristics of the membrane (for example, local addition of functional groups with electrospun fibers, etc.) or even for membrane activation (eg, if the electrospinning composition includes biofunctionalized nanoparticles or otherwise integrated target molecules).
Третий предпочтительный способ получения мембран представляет собой получение тканых материалов, имеющих структурированную микрогеометрию, а также структурированную или неструктурированную микро- и наногеометрию. Они изготовлены из бесконечных волокон или предварительно отобранных полимеров. Последние могут быть дополнительно обработаны способом на основе электроспиннинга, что обеспечивает дополнительные характеристики мембраны.A third preferred method for producing membranes is to obtain woven materials having a structured microgeometry, as well as a structured or unstructured micro- and nanogeometry. They are made from endless fibers or pre-selected polymers. The latter can be further processed by an electrospinning method, which provides additional membrane characteristics.
Вышеупомянутые способы позволяют получить структуру-носитель мембраны из биосовместимого полимера, с которой впоследствии связываются целевые молекулы. Вышеупомянутые способы также позволяют получить структуру-носитель мембраны из биосовместимого полимера с уже интегрированными функционализированными наночастицами, с которыми впоследствии связываются целевые молекулы. Указанные выше способы позволяют получить структуру-носитель мембраны из биосовместимого полимера с уже интегрированными биофункционализированными наночастицами, как более подробно описано ниже. The above methods make it possible to obtain a membrane carrier structure from a biocompatible polymer, to which target molecules subsequently bind. The above methods also make it possible to obtain a membrane carrier structure from a biocompatible polymer with already integrated functionalized nanoparticles, to which target molecules subsequently bind. The above methods make it possible to obtain a membrane carrier structure from a biocompatible polymer with already integrated biofunctionalized nanoparticles, as described in more detail below.
Активация мембраны или биофункционализация могут выполняться непосредственно на трехмерной структуре-носителе. В этом случае поверхность структуры-носителя химически обрабатывают с использованием известных методов, например, так называемого карбодиимидного метода (CDI) с использованием реагента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), который приводит к образованию амидных связей в «более мягких условиях», получая, таким образом, активные центры на поверхности и в порах структуры-носителя мембраны, т.е. ковалентно связанные поверхностные функциональные группы, с которыми целевые молекулы (например, антитела, их части, аптамеры) ковалентно связываются без влияния или с минимальным влиянием на их активность. EDC представляет собой водорастворимый карбодиимид, дополнительно способствующий ковалентному связыванию активных молекул на мембране. Membrane activation or biofunctionalization can be performed directly on the three-dimensional support structure. In this case, the surface of the carrier structure is chemically treated using known methods, for example, the so-called carbodiimide method (CDI) using the reagent 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), which leads to the formation of amide bonds in " milder conditions”, thus obtaining active centers on the surface and in the pores of the membrane carrier structure, i.e. covalently linked surface functional groups to which target molecules (eg, antibodies, parts thereof, aptamers) are covalently bound with little or no effect on their activity. EDC is a water-soluble carbodiimide that further facilitates the covalent binding of active molecules to the membrane.
Общая методика такой активации включает реакцию в водной среде, в которую, помимо реагента EDC, добавляют целевые молекулы, которые требуется связать (например, антитела), мембранную структуру и буфер. Приблизительно через 30 минут получают мембрану с все еще активными антителами, связанными со структурой-носителем, т.е. мембрану, способную осуществлять аффинное связывание целевых стволовых клеток, которые экспрессируют антигены, распознающие антитела (или целевые молекулы), связанные в/на мембране, в ходе описанного выше способа. A general technique for such activation involves an aqueous reaction in which, in addition to the EDC reagent, the target molecules to be bound (eg, antibodies), a membrane structure, and a buffer are added. Approximately 30 minutes later, a membrane is obtained with still active antibodies bound to the carrier structure, ie. a membrane capable of affinity binding to target stem cells that express antigens that recognize antibodies (or target molecules) bound to/on the membrane in the manner described above.
Активацию мембраны можно осуществлять с применением функционализированных наночастиц, которые могут быть либо связаны (например, ковалентно), либо не связаны (т.е. просто «захвачены») на/в структуре-носителе мембраны, что означает «in situ» в биосовместимом полимере, при этом поверхностные функциональные группы служат точками привязки или активными центрами для связывания целевых молекул, которые распознают и связывают характеристические антигены, связанные с поверхностью целевых стволовых клеток, на поверхности функционализированных наночастиц.Membrane activation can be carried out using functionalized nanoparticles, which can either be bound (e.g., covalently) or unbound (i.e., simply “trapped”) on/in the membrane carrier structure, which means “in situ” in a biocompatible polymer , while surface functional groups serve as anchor points or active sites for binding target molecules that recognize and bind characteristic antigens associated with the surface of target stem cells on the surface of functionalized nanoparticles.
Если активацию мембраны выполняют с применением функционализированных наночастиц, функционализированные наночастицы (с соответствующими функциональными группами или активными центрами для связывания на структуре-носителе мембраны и для связывания целевых молекул, которые распознают и связывают характеристические антигены, связанные на поверхности стволовых клеток) получают предварительно с применением известных способов, например, CDI или способа сшивания с амином. Способ CDI в основном применяют для активации карбоксильных и фосфатных функциональных групп, другой упомянутый способ в основном применяют для активации функциональных аминогрупп. Указанные способы можно использовать одновременно.If membrane activation is performed using functionalized nanoparticles, functionalized nanoparticles (with the appropriate functional groups or active sites for binding on the membrane carrier structure and for binding target molecules that recognize and bind characteristic antigens bound on the surface of stem cells) are prepared previously using known methods such as CDI or amine crosslinking. The CDI method is mainly used to activate carboxyl and phosphate functional groups, the other mentioned method is mainly used to activate amino functional groups. These methods can be used simultaneously.
Активацию мембраны можно осуществлять с применением функционализированных наночастиц, когда структура-носитель мембраны с интегрированными функционализированными наночастицами уже получена в соответствии с одним из описанных выше способов. В этом случае предварительно полученные функционализированные наночастицы, которые получают в соответствии с одним из описанных выше способов, сначала интегрируют в структуру-носитель мембраны в ходе получения структуры-носителя в соответствии с одним из описанных выше способов. Таким образом, функционализированные наночастицы либо интегрируются «in situ», либо химически связываются со структурой-носителем на ее поверхности или в порах. Функционализированные наночастицы, интегрированные в структуру-носитель, имеют на своей поверхности упомянутые выше функциональные группы (например, NH2, OH, COOH, SH и т.д.), которые в последствии служат для осуществления тех же способов химического связывания целевых молекул (например, способа CDI) с указанными функциональными группами и, следовательно, со структурой-носителем. Вслед за этим следует активация мембраны, т. е. связывание целевых молекул, которые распознают и связывают характеристические антигены, связанные с поверхностью стволовых клеток, на поверхности функционализированных наночастиц, например, следуя описанному выше способу активации мембраны.Membrane activation can be carried out using functionalized nanoparticles when the membrane carrier structure with integrated functionalized nanoparticles has already been obtained in accordance with one of the methods described above. In this case, the prefabricated functionalized nanoparticles, which are obtained in accordance with one of the methods described above, are first integrated into the carrier structure of the membrane during the preparation of the carrier structure in accordance with one of the methods described above. Thus, functionalized nanoparticles either integrate "in situ" or chemically bond with the carrier structure on its surface or in pores. Functionalized nanoparticles integrated into the carrier structure have on their surface the functional groups mentioned above (for example, NH 2 , OH, COOH, SH, etc.), which subsequently serve to implement the same methods of chemical binding of target molecules (for example , CDI method) with the indicated functional groups and, therefore, with the carrier structure. This is followed by membrane activation, i.e. binding of target molecules that recognize and bind characteristic antigens associated with the surface of stem cells, on the surface of the functionalized nanoparticles, for example, following the membrane activation method described above.
Чтобы увеличить количество активных центров на поверхности и/или в порах структуры-носителя с интегрированными функционализированными наночастицами для связывания целевых молекул, поверхность структуры-носителя можно необязательно обработать механически (например, путем шлифовки, обрезки, удаления верхнего слоя структуры-носителя до толщины приблизительно мкм) или другим способом (например, травлением). Это позволяет экспонировать большее количество функционализированных наночастиц на поверхности или в порах структуры-носителя, что увеличивает эффективность связывания целевых молекул на структуре-носителе, что означает, что получают большее количество целевых молекул на единицу поверхности/объема мембраны.In order to increase the number of active sites on the surface and/or in the pores of the carrier structure with integrated functionalized nanoparticles for binding target molecules, the surface of the carrier structure can optionally be mechanically processed (for example, by grinding, trimming, removing the top layer of the carrier structure to a thickness of approximately μm ) or in another way (for example, etching). This allows more functionalized nanoparticles to be exposed on the surface or in the pores of the carrier structure, which increases the binding efficiency of target molecules on the carrier structure, which means that more target molecules are obtained per membrane surface/volume unit.
Необязательно, необходимые активные центры на поверхности и/или в порах структуры-носителя мембраны для связывания целевых молекул, особенно в случае тканых или электроспряденных мембран, можно получать с использованием кислородной плазмы, обеспечивающей гидрофильность поверхности и присутствие групп OH-, COOH- на поверхности и/или в порах структуры-носителя; или с использованием азотной плазмы (или аммонийной плазмы), обеспечивающей гидрофильность поверхности и присутствие функциональных групп NH2 на поверхности и/или в порах структуры-носителя; или с использованием фторидной плазмы (или HF), оптимизирующей гидрофобность структуры-носителя. Поверхности, обработанные плазмой, позволяют осуществлять применение указанных выше способов активации, а также дальнейших стадий биофункционализации. При необходимости дополнительной обработки структуры-носителя мембраны отдельные способы плазменной обработки можно повторять или комбинировать.Optionally, the necessary active sites on the surface and/or in the pores of the membrane carrier structure for binding target molecules, especially in the case of woven or electrospun membranes, can be obtained using oxygen plasma, providing surface hydrophilicity and the presence of OH-, COOH- groups on the surface and /or in the pores of the carrier structure; or using nitrogen plasma (or ammonium plasma) providing hydrophilicity of the surface and the presence of NH 2 functional groups on the surface and/or in the pores of the carrier structure; or using fluoride plasma (or HF) optimizing the hydrophobicity of the carrier structure. Plasma-treated surfaces allow the use of the above activation methods as well as further biofunctionalization steps. If additional processing of the membrane carrier structure is required, the individual plasma treatment methods can be repeated or combined.
Активацию мембраны с применением функционализированных наночастиц также можно осуществлять перед получением мембраны, а именно в случае, когда мембрану получают с помощью 3D-печати, при этом предварительно полученные биофункционализированные наночастицы, уже имеющие целевые молекулы, связанные с их поверхностными функциональными группами, добавляют в расплав выбранного биосовместимого полимера «in situ», после чего получают мембрану в соответствии с одним из описанных выше способов. Таким образом, биофункционализированные наночастицы с уже связанными целевыми молекулами интегрируют в трехмерную структуру мембраны в ходе способа ее получения.Activation of the membrane using functionalized nanoparticles can also be carried out before obtaining the membrane, namely in the case when the membrane is obtained using 3D printing, while previously obtained biofunctionalized nanoparticles already having target molecules associated with their surface functional groups are added to the melt of the selected biocompatible polymer "in situ", after which the membrane is obtained in accordance with one of the methods described above. Thus, the biofunctionalized nanoparticles with the target molecules already bound are integrated into the three-dimensional structure of the membrane during the preparation process.
В предпочтительном варианте осуществления мембрана выполнена в виде трехмерной структуры-носителя, состоящей из нескольких слоев со структурированной геометрией и размерами пор в диапазоне от 100 до 200 мкм. Отдельные слои структуры-носителя состоят из одного и того же биосовместимого полимера, и активацию мембраны осуществляют с помощью функционализированных наночастиц. In a preferred embodiment, the membrane is made in the form of a three-dimensional carrier structure, consisting of several layers with a structured geometry and pore sizes in the range from 100 to 200 microns. The individual layers of the carrier structure are composed of the same biocompatible polymer, and the membrane is activated using functionalized nanoparticles.
Предпочтительно мембрану согласно изобретению получают методом 3D-печати (биопечати). Выбранный биосовместимый полимер расплавляют, и в расплав добавляют «in situ» предварительно полученные функционализированные наночастицы с поверхностными функциональными группами; после этого трехмерную структуру мембраны со структурированной геометрией получают посредством 3D-печати, при этом функционализированные наночастицы интегрируют в трехмерную структуру-носитель мембраны. Полученную таким образом трехмерную структуру-носитель мембраны затем активируют с помощью функционализированных наночастиц с соответствующими целевыми молекулами, то есть выбранные целевые молекулы связываются с функциональными группами на наночастицах, которые находятся на структуре-носителе мембраны (таким образом, получают биофункционализированные наночастицы в мембране). Таким образом получают мембрану согласно изобретению.Preferably, the membrane according to the invention is produced by 3D printing (bioprinting). The selected biocompatible polymer is melted, and preformed functionalized nanoparticles with surface functional groups are added "in situ" to the melt; thereafter, a 3D membrane structure with structured geometry is produced by 3D printing, wherein the functionalized nanoparticles are integrated into the 3D carrier structure of the membrane. The three-dimensional membrane carrier structure thus obtained is then activated with the functionalized nanoparticles with the appropriate target molecules, i.e. the selected target molecules bind to functional groups on the nanoparticles that are on the membrane carrier structure (thus biofunctionalized nanoparticles in the membrane are obtained). In this way a membrane according to the invention is obtained.
Мембрану согласно изобретению применяют в способе отделения/выделения целевых стволовых клеток из биологического образца, при этом получают стерильные целевые стволовые клетки в физиологическом буфере с известным размером и жизнеспособностью клеточной популяции.The membrane according to the invention is used in a method for separation/isolation of target stem cells from a biological sample, whereby sterile target stem cells are obtained in physiological buffer with a known cell population size and viability.
Перед введением в мембрану биологический образец предварительно получают соответствующим образом, т.е. получают исходную суспензию отдельных клеток, при этом обеспечивают подходящий размер отдельных клеток в суспензии и подходящую плотность суспензии.Prior to introduction into the membrane, the biological sample is preliminarily prepared in an appropriate manner, i.e. an initial single cell suspension is obtained, while providing a suitable size of individual cells in suspension and a suitable density of the suspension.
Получение исходной суспензии отдельных клеток включает известные процессы разрушения биологического образца и механической фильтрации. Процессы разрушения биологических образцов включают, но не ограничиваются перечисленным, механическую обработку (например, мацерацию, разрезание, соскабливание, центрифугирование), химическую обработку (например, обработку буфером для лизиса эритроцитов, добавление антикоагулянтов), ферментативную обработку (например, применение коллагеназы, гиалуронидазы, трипсина или их комбинаций) и/или их комбинацию.Obtaining the initial suspension of individual cells involves the known processes of destruction of the biological sample and mechanical filtration. Processes for the degradation of biological samples include, but are not limited to, mechanical processing (eg, maceration, cutting, scraping, centrifugation), chemical processing (eg, processing with erythrocyte lysis buffer, addition of anticoagulants), enzymatic processing (eg, application of collagenase, hyaluronidase, trypsin or combinations thereof) and/or combinations thereof.
Необязательно, стадию удаления эритроцитов, например, с помощью буфера для лизиса эритроцитов, центрифугирования в градиенте плотности, меченых магнитных шариков, способа, называемого «плавучим» отделением, или других известных методик, можно добавить к получению исходной суспензии отдельных клеток, в частности, когда суспензию получают из крови и/или биологических образцов с высоким содержанием крови.Optionally, a step of removing erythrocytes, e.g. using erythrocyte lysis buffer, density gradient centrifugation, labeled magnetic beads, a method called "floating" separation, or other known techniques, can be added to the preparation of the initial single cell suspension, in particular when the suspension is obtained from blood and/or biological samples with a high content of blood.
Следующей стадией в способе является механическая фильтрация как предварительный способ отделения частиц (клеток) от выбранного биологического образца, основанный не только на размере пор фильтра (частицы меньшего размера, чем поры фильтра, проходят через фильтр), но также и на химическом составе материала фильтра. Например, одни вещества прилипают к материалу, из которого изготовлен выбранный фильтр, больше других. Механическая фильтрация включает сетчатые фильтры различной пористости (например, от 10 до 100 мкм), которые применяют в виде отдельных звеньев или в каскаде последовательных фильтров с уменьшающимся размером пор. Химический состав фильтров может включать (но не ограничиваясь перечисленным) нейлон, ацетат целлюлозы, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, полиэтилентерефталат, полипропилен, поликапролактон, при условии, что материал сетчатого фильтра не связывает целевые стволовые клетки.The next step in the method is mechanical filtration as a preliminary method of separating particles (cells) from the selected biological sample, based not only on the pore size of the filter (particles smaller than the pores of the filter pass through the filter), but also on the chemical composition of the filter material. For example, some substances adhere to the material from which the selected filter is made more than others. Mechanical filtration includes mesh filters of various porosities (for example, from 10 to 100 microns), which are used as separate links or in a cascade of successive filters with decreasing pore size. The chemical composition of the filters may include (but not limited to) nylon, cellulose acetate, polylactic acid, polyglycolic acid, polyethylene terephthalate, polypropylene, polycaprolactone, provided that the mesh filter material does not bind the target stem cells.
Если используют каскадные фильтры, то отдельные фильтры в каскаде могут быть изготовлены из разных материалов. Фильтры для этой цели могут включать коммерчески доступные фильтры (например, Corning® Cell Strainer) и/или разработанные внутри предприятия фильтры, изготовленные на 3D-принтере, или фильтры, полученные с помощью других методик, и их комбинации.If cascade filters are used, the individual filters in the cascade can be made from different materials. Filters for this purpose may include commercially available filters (eg, Corning® Cell Strainer) and/or in-house developed 3D printed filters or filters produced by other techniques and combinations thereof.
Путем такого предварительного получения биологического образца получают исходную суспензию отдельных клеток, при этом размер отдельных клеток и/или любых возможных более мелких кластеров клеток в суспензии не превышает размер пор отдельной мембраны по меньшей мере в двух измерениях, и плотность исходной суспензии клеток поддерживают на уровне ниже 2×108 клеток/мл, предпочтительно от 1×106 до 1×107 клеток/мл.By such preliminary preparation of a biological sample, an initial suspension of individual cells is obtained, while the size of individual cells and/or any possible smaller clusters of cells in the suspension does not exceed the pore size of an individual membrane in at least two dimensions, and the density of the initial cell suspension is maintained at a level below 2x10 8 cells/ml, preferably 1x10 6 to 1x10 7 cells/ml.
Подходящую плотность исходной суспензии отдельных клеток получают путем добавления физиологического буфера (для осуществления разбавления) или увеличения количества клеток в суспензии (путем концентрирования), если это необходимо. Подачу исходной суспензии клеток к мембране регулируют автоматически. Устройство для подсчета клеток (в режиме биоимпеданса) определяет количество клеток, достигающих мембраны, и поддерживает плотность исходной суспензии клеток на уровне ниже 2×108 клеток/мл путем автоматической подачи или удаления физиологического буфера.An appropriate density of the initial single cell suspension is obtained by adding a physiological buffer (for dilution) or by increasing the number of cells in the suspension (by concentration), if necessary. The supply of the initial cell suspension to the membrane is controlled automatically. The cell counting device (in bioimpedance mode) determines the number of cells reaching the membrane and maintains the density of the initial cell suspension below 2×10 8 cells/ml by automatically supplying or withdrawing physiological buffer.
Размер клеток и/или любых более мелких кластеров клеток в суспензии не должен превышать размер пор мембраны. Предпочтительный размер отдельных клеток и/или любых более мелких кластеров клеток в суспензии по меньшей мере в двух измерениях не должен превышать 70 мкм.The size of the cells and/or any smaller cell clusters in the suspension should not exceed the pore size of the membrane. The preferred size of individual cells and/or any smaller clusters of cells in suspension in at least two dimensions should not exceed 70 microns.
Отделение целевых стволовых клеток от исходного материала, то есть биологического образца, осуществляют на основании прохождения свободного потока исходной суспензии отдельных клеток через по меньшей мере одну мембрану. В ходе этого процесса целевые стволовые клетки захватываются на поверхности мембраны и в порах мембраны за счет специфического распознавания и связывания между характеристическими антигенами на поверхности целевых стволовых клеток и целевыми молекулами, то есть антителами или фрагментами антител к указанным характеристическим антигенам, связанными с мембраной. Проход других нецелевых клеток через мембрану не затруднен (или затруднен лишь незначительно, например, из-за увеличения количества связанных целевых стволовых клеток, что приводит к снижению эффективной пористости мембраны).The separation of the target stem cells from the source material, ie the biological sample, is carried out on the basis of the passage of the free flow of the initial suspension of individual cells through at least one membrane. During this process, the target stem cells are captured on the membrane surface and in the pores of the membrane by specific recognition and binding between the characteristic antigens on the surface of the target stem cells and the target molecules, i.e. antibodies or antibody fragments to the specified characteristic antigens associated with the membrane. The passage of other non-target cells through the membrane is not hindered (or only slightly hindered, for example, due to an increase in the number of bound target stem cells, which leads to a decrease in the effective porosity of the membrane).
Одну мембрану можно применять для отделения целевых стволовых клеток. Однако клетки можно также отделить, используя несколько мембран в каскаде, при этом каждая последующая мембрана в каскаде имеет такие же или меньшие размеры пор.One membrane can be used to separate target stem cells. However, cells can also be separated using multiple membranes in a cascade, with each successive membrane in the cascade having the same or smaller pore sizes.
Способ отделения дополнительно позволяет многократно фильтровать суспензию клеток через мембрану/мембраны, тем самым повышая эффективность. The separation method further allows the cell suspension to be repeatedly filtered through the membrane/membranes, thereby increasing efficiency.
В зависимости от конечного назначения применения целевые стволовые клетки могут быть удалены с мембраны одним из описанных ниже способов или мембрана может быть использована вместе с целевыми стволовыми клетками. В последнем случае мембрану, например, можно использовать в качестве тканевого наполнителя для имплантации пациенту, переживающему серьезную травму. После помещения в естественную среду связанные с мембраной стволовые клетки дифференцируются в желаемые окружающие ткани и эффективно способствуют регенерации одной или более окружающих тканей. Мембрану со связанными целевыми стволовыми клетками также можно применять в качестве субстрата для роста для размножения этих клеток для их применения желаемым образом (например, в терапии и т.д.). Другой способ применения мембраны с захваченными целевыми стволовыми клетками представляет собой дифференцировку клеток в подходящую ткань с помощью внешних стимулов (например, путем добавления выбранных факторов роста в среду для роста или других стимулов). Однако выбор ткани ограничен типом захваченных целевых стволовых клеток. Таким образом, например, может быть получен костный сегмент для имплантации пациенту. Это всего лишь несколько примеров, но есть еще много других возможностей применения непосредственно мембраны с захваченными целевыми стволовыми клетками.Depending on the end use, the target stem cells can be removed from the membrane by one of the methods described below, or the membrane can be used in conjunction with the target stem cells. In the latter case, the membrane, for example, can be used as a tissue filler for implantation in a patient undergoing a serious injury. Once placed in the natural environment, the membrane bound stem cells differentiate into the desired surrounding tissues and effectively contribute to the regeneration of one or more surrounding tissues. The membrane with bound target stem cells can also be used as a growth substrate to expand these cells for their use in the desired manner (eg, in therapy, etc.). Another method of using a membrane with captured target stem cells is to differentiate cells into suitable tissue with external stimuli (eg, by adding selected growth factors to the growth medium or other stimuli). However, the choice of tissue is limited by the type of target stem cells captured. Thus, for example, a bone segment can be obtained for implantation in a patient. These are just a few examples, but there are many other possibilities for using the membrane directly with captured target stem cells.
Способы удаления целевых стволовых клеток с мембраны включают, но не ограничиваются перечисленным: физико-механические способы (например, изменение давления; увеличение/уменьшение давления), физико-химические способы (например, изменение ионной силы путем добавления соли, буферов, ополаскивание сверхчистой водой и т. д.), биохимические способы (например, применение ферментов, таких как пептидазы, которые расщепляют связь между мембраной и антителами), химические способы (например, восстановление дисульфидных связей до тиоловых групп) и способы на основе аффинности (например, путем добавления соединений с большей аффинностью к выбранной активной функционализированной поверхности (например, антител), чем клетки (которые являются относительно «большими» частицами), и другие способы и их комбинации. Эти способы удаления целевых стволовых клеток с мембраны могут применяться: по отдельности, как комбинация вышеупомянутых способов, как каскадные системы одинаковых или разных способов с любым количеством дальнейших повторений. Предпочтительные способы отделения сводят к минимуму напряжение и уменьшают воздействие на отделенные целевые стволовые клетки, которые необходимо удалить с мембраны, как например, способ, в котором используют подходящие интервалы разницы давления. Выбранные способы удаления различаются в зависимости от свойств выбранной мембраны, функционализированных (или биофункционализированных) наночастиц, целевых молекул и целевых стволовых клеток. Следовательно, в различных выбранных способах/процессах выделения целевых стволовых клеток из биологических образцов могут применяться различные способы удаления или их комбинации. Methods for removing target stem cells from the membrane include, but are not limited to: physico-mechanical methods (e.g., changing pressure; increasing/decreasing pressure), physico-chemical methods (e.g., changing ionic strength by adding salt, buffers, rinsing with ultrapure water, and etc.), biochemical methods (for example, using enzymes such as peptidases that cleave the bond between the membrane and antibodies), chemical methods (for example, reducing disulfide bonds to thiol groups), and affinity-based methods (for example, by adding compounds with greater affinity for a selected active functionalized surface (e.g., antibodies) than cells (which are relatively "large" particles), and other methods and combinations thereof.These methods for removing target stem cells from the membrane can be used: individually, as a combination of the above ways, as cascade systems of the same or different ways with any the number of further repetitions. Preferred separation methods minimize stress and reduce the impact on the separated target stem cells to be removed from the membrane, such as a method that uses suitable pressure difference intervals. The removal methods chosen differ depending on the properties of the chosen membrane, functionalized (or biofunctionalized) nanoparticles, target molecules, and target stem cells. Therefore, various methods/processes for isolating target stem cells from biological samples may employ various removal methods or combinations thereof.
Устройство для отделения целевых стволовых клеток от биологического образца, то есть от суспензии отдельных клеток, состоит из корпуса, в котором установлены электронные и механические компоненты с соответствующей регулировкой, и сменной кассеты. В электронную часть входят все электронные компоненты, необходимые для работы устройства, такие как система бесперебойного питания ИБП, датчики для измерения скорости потока и температуры, чтобы обеспечить и контролировать потоки и оптимальную температуру 37°C, пригодную для работы с биоматериалами (указанная температура может быть скорректирована, если необходимо), устройство для подсчета клеток, аналого-цифровые преобразователи, электрические преобразователи и т.д. В механическую часть устройства входят все механические компоненты, необходимые для работы устройства, такие как системы клапанов, насосы и/или компрессор, открывающие и закрывающие направляющие устройства для вставки сменной кассеты, фурнитура для прикрепления сменной кассеты к корпусу и соединение жидкостной системы для сменной кассеты на основе быстроразъемных зажимов для легкой замены кассеты. Регулирующая часть обеспечивает правильное регулирование устройства, тем самым обеспечивая оптимальные условия работы устройства, например, подходящее регулирование температуры, правильное регулирование потока для обеспечения желаемых концентраций исходной суспензии клеток. A device for separating target stem cells from a biological sample, that is, from a suspension of individual cells, consists of a housing in which electronic and mechanical components are installed with appropriate adjustment, and a replaceable cassette. The electronic part includes all the electronic components necessary for the operation of the device, such as a UPS uninterruptible power supply system, flow and temperature sensors to ensure and control flows and an optimum temperature of 37°C suitable for working with biomaterials (the indicated temperature can be adjusted if necessary), cell counting device, A/D converters, electrical converters, etc. The mechanical part of the device includes all the mechanical components necessary for the operation of the device, such as valve systems, pumps and/or a compressor, opening and closing guides for inserting a replacement cassette, fittings for attaching a replacement cassette to the body, and a fluid system connection for a replacement cassette on Based on quick release clamps for easy cassette replacement. The control part provides for the correct regulation of the device, thereby ensuring the optimal operating conditions of the device, for example, suitable temperature control, correct flow control to provide the desired concentrations of the initial cell suspension.
Необязательно, в устройство может быть включена очищающая кассета для обеспечения самоочищения, особенно в том случае, когда незаменяемые части контактируют с биологическим материалом. Очистка устройства осуществляется автоматически согласно соответствующему протоколу.Optionally, a cleaning cassette may be included in the device to provide self-cleaning, especially when non-replaceable parts come into contact with biological material. Cleaning of the device is carried out automatically according to the appropriate protocol.
Сменная кассета, представленная на фиг. 1, включает контейнер FC для исходной суспензии отдельных клеток, полученной из биологического образца, камеру смешивания MIX для обеспечения плотности исходной суспензии на уровне ниже 2×108 клеток/мл путем добавления, при необходимости, физиологического буфера из контейнера PBS, по меньшей мере одну мембрану AM согласно изобретению, контейнер для отходов W и коллектор SC для сбора суспензии целевых стволовых клеток. Регулирующие клапаны VVR, подключенные к одной насосно-компрессорной установке в устройстве, обеспечивают надлежащую подачу жидкостей или суспензий. Сменную кассету можно вставлять в устройство как сверху, так и спереди.The replaceable cassette shown in Fig. 1 includes an FC container for an initial single cell suspension obtained from a biological sample, a MIX mixing chamber to ensure the density of the initial suspension at a level below 2×10 8 cells / ml by adding, if necessary, physiological buffer from the PBS container, at least one an AM membrane according to the invention, a waste container W and a collector SC for collecting the target stem cell suspension. VVR control valves connected to a single pump/compressor unit in the unit ensure that liquids or slurries are properly supplied. The replacement cassette can be inserted into the device either from the top or from the front.
Необработанный исходный материал, то есть исходная суспензия отдельных клеток, можно вводить в сменную кассету, расположенную в контейнере FC, с помощью инъекционной иглы или любого другого метода асептического переноса и хранения. Подходящую плотность исходной суспензии отдельных клеток обеспечивают в камере смешивания MIX путем подачи, при необходимости, физиологического буфера из контейнера PBS. The raw starting material, i.e. the original single cell suspension, can be injected into the exchange cassette located in the FC container using an injection needle or any other method of aseptic transfer and storage. A suitable density of the initial single cell suspension is provided in the MIX mixing chamber by supplying, if necessary, physiological buffer from the PBS container.
Затем суспензию отдельных клеток доставляют к мембране AM, и отделение целевых стволовых клеток от исходной суспензии происходит на основании прохождения свободного потока исходной суспензии отдельных клеток через по меньшей мере одну мембрану AM. Целевые стволовые клетки связываются с мембраной AM, в то время как все нецелевые клетки проходят через мембрану AM или удаляются с поверхности мембраны путем промывки в виде остаточной суспензии в контейнер для отходов W. Целевые стволовые клетки удаляются с мембраны AM с помощью физиологического буфера под давлением, подаваемого из контейнера PBS, через контур обратной связи. Полученную в результате стерильную суспензию целевых стволовых клеток в физиологическом буфере собирают в коллекторе SC. Эта суспензия целевых стволовых клеток может быть сразу применена к пациенту или впоследствии использована для различных целей.The single cell suspension is then delivered to the AM membrane, and separation of the target stem cells from the original suspension occurs based on the free flow of the original single cell suspension through the at least one AM membrane. Target stem cells bind to the AM membrane while all non-target cells pass through the AM membrane or are removed from the membrane surface by flushing as residual suspension into waste container W. Target stem cells are removed from the AM membrane using a physiological buffer under pressure, supplied from the PBS container, through the feedback loop. The resulting sterile suspension of target stem cells in physiological buffer is collected in an SC manifold. This suspension of targeted stem cells can be applied directly to the patient or subsequently used for various purposes.
Доставка исходной суспензии отдельных клеток к мембране AM регулируется автоматически. Устройство для подсчета клеток определяет количество клеток, достигающих мембраны, и поддерживает плотность исходной суспензии отдельных клеток на уровне ниже 2×108 клеток/мл путем автоматической подачи физиологического буфера из контейнера PBS.The delivery of the initial suspension of individual cells to the AM membrane is controlled automatically. The cell counting device determines the number of cells reaching the membrane and maintains the density of the original individual cell suspension below 2×108 cells/ml by automatic feeding of physiological buffer from the PBS container.
В предпочтительном варианте осуществления устройство для подсчета клеток основано на биоимпедансе, то есть на двух электродах из любого материала (серебро и т. д.), которые обнаруживают изменения электрического сопротивления. Устройство для подсчета клеток установлено в двух следующих различных положениях: на участке до того, как исходная суспензия отдельных клеток достигла мембраны AM, и до того, как стерильная суспензия целевых стволовых клеток в физиологическом буфере достигла коллекторного контейнера SC. Важной частью подсчета клеток является характеристика их соотношения живые/мертвые с помощью методики биоимпеданса для измерения проводимости мембраны AM (мертвые клетки имеют измененную проводимость из-за выделяемого цитозоля) или окрашивания для оценки жизнеспособности, при котором небольшой образец клеток из коллекторного контейнера SC отбирают онлайн и проверяют на наличие живых клеток.In a preferred embodiment, the cell counting device is based on bioimpedance, ie two electrodes of any material (silver, etc.) that detect changes in electrical resistance. The cell counting device was placed in the following two different positions: at the site before the initial single cell suspension reached the AM membrane and before the sterile suspension of target stem cells in physiological buffer reached the SC collection container. An important part of cell counting is the characterization of their live/dead ratio using a bioimpedance technique to measure AM membrane conductivity (dead cells have altered conductivity due to released cytosol) or viability staining, in which a small sample of cells from an SC collection container is taken online and checked for the presence of living cells.
Все датчики в устройстве подключены к главному компьютеру, оснащенному сенсорным экраном и пользовательским интерфейсом (UI). Устройство может быть подключено к Интернету через главный компьютер и порт LAN. Устройство можно установить в больнице, частной поликлинике или различных исследовательских институтах.All sensors in the device are connected to a host computer equipped with a touch screen and user interface (UI). The device can be connected to the Internet through a host computer and a LAN port. The device can be installed in a hospital, private clinic or various research institutes.
Конечным продуктом процесса отделения, которое достигается с помощью способа и устройства согласно изобретению, являются стерильные целевые стволовые клетки в физиологическом буфере (как определено в этой заявке) с известным размером клеточной популяции (количеством выделенных клеток) и известной жизнеспособностью клеток (соотношение живых/мертвых клеток).The end product of the separation process, which is achieved with the method and device according to the invention, are sterile target stem cells in physiological buffer (as defined in this application) with a known cell population size (number of isolated cells) and known cell viability (ratio of live/dead cells ).
Конечный продукт предназначен для применения в медицинских и/или исследовательских целях. В частности (но не исключая других возможных применений) возможно следующее применение: прямая трансплантация аутологичных и аллогенных клеток пациентам, подопытным или больным животным; культивирование, размножение и дифференцировка клеток в культурах in vitro; прямая криоконсервация клеток без культивирования для последующего применения; дальнейшее отделения (суб-)популяций клеток с помощью других маркеров.The end product is intended for medical and/or research applications. In particular (but not excluding other possible applications), the following applications are possible: direct transplantation of autologous and allogeneic cells in patients, experimental or diseased animals; cultivation, reproduction and differentiation of cells in cultures in vitro; direct cryopreservation of cells without cultivation for subsequent use; further separation of (sub-)populations of cells using other markers.
Варианты осуществления изобретенияEmbodiments of the invention
Получение мембраныGetting the membrane
Мембрану получают согласно технологии 3D-печати. Для начала получают трехмерную структуру-носитель мембраны, которая состоит из десяти слоев поликапролактона с 100 мкм порами с интегрированными функционализированными наночастицами NiCu, заключенными в слой диоксида кремния, с функциональными группами NH2 на поверхности. Перед активацией (т. е. связыванием целевых молекул) эту структуру-носитель мембраны подвергают шлифовке. В результате больше наночастиц с функциональными группами становятся доступными. Отдельно получают раствор антител к CD90 и EDC, таким образом получают активированные антитела, которые будут связываться со структурой-носителем мембраны. Структуру-носитель погружают в раствор активированного антитела. Примерно через тридцать минут антитела связываются со структурой-носителем мембраны, то есть с функциональными группами NH2. После этого мембрану 3 раза промывают деионизированной водой. Теперь мембрана активирована и готова к отделению целевых стволовых клеток, в данном конкретном случае стволовых клеток с экспрессируемыми антигенами CD90. The membrane is obtained according to 3D printing technology. To begin with, a three-dimensional membrane carrier structure is obtained, which consists of ten layers of polycaprolactone with 100 μm pores with integrated functionalized NiCu nanoparticles, enclosed in a layer of silicon dioxide, with NH 2 functional groups on the surface. Before activation (i.e., binding of target molecules), this membrane carrier structure is subjected to polishing. As a result, more nanoparticles with functional groups become available. Separately, a solution of anti-CD90 and EDC antibodies is prepared, thus obtaining activated antibodies which will bind to the membrane carrier structure. The carrier structure is immersed in the activated antibody solution. Approximately thirty minutes later, the antibodies bind to the membrane carrier structure, ie the NH 2 functional groups. The membrane is then washed 3 times with deionized water. The membrane is now activated and ready to separate the target stem cells, in this particular case, stem cells expressing CD90 antigens.
Способ отделения целевых стволовых клеток от биологического образцаMethod for separating target stem cells from a biological sample
Пример 1Example 1
Препарат гемопоэтических стволовых клеток CD34+ из костного мозга здорового донора для трансплантации пациенту с лейкемией после химиотерапииCD34 + hematopoietic stem cell preparation from the bone marrow of a healthy donor for transplantation into a patient with leukemia after chemotherapy
Биологический образец для получения клеток представляет собой периферическую кровь, собранную с помощью афереза после мобилизации костного мозга. Исходную суспензию отдельных клеток получают как «лейкоцитную пленку», представляющую собой фракцию образца крови, полученную центрифугированием в градиенте плотности для удаления эритроцитов и сыворотки крови путем дополнительной промывки в 1xPBS. The biological sample for cell production is peripheral blood collected by apheresis after bone marrow mobilization. The initial single cell suspension is obtained as a "buffy coat", which is a fraction of a blood sample obtained by density gradient centrifugation to remove erythrocytes and blood serum by additional washing in 1xPBS.
Конечную суспензию отдельных клеток получают в буфере 1xPBS для инъекции. С помощью инъекционной иглы исходную суспензию наносят на кассету с механическим фильтром 70 мкм для удаления любых крупных кластеров клеток и мембраной со связанными целевыми молекулами, которые распознают и связывают поверхностный антиген CD34, который экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках.The final single cell suspension is prepared in 1xPBS injection buffer. Using an injection needle, the stock suspension is applied to a cassette with a 70 µm mechanical filter to remove any large cell clusters and a membrane with bound target molecules that recognize and bind the CD34 surface antigen that is expressed on hematopoietic stem cells.
Регулятор потока на мембране обеспечивает оптимальную дозировку физиологической жидкости или буфера для предотвращения засорения системы. После того, как все нецелевые клетки собраны в контейнере для отходов, эффективность контура обратной связи гарантирует, что тот же раствор повторно фильтруется для захвата клеток, которые остались несвязанными с мембраной.A flow regulator on the membrane ensures optimal dosage of physiological fluid or buffer to prevent clogging of the system. Once all non-target cells have been collected in the waste container, the efficiency of the feedback loop ensures that the same solution is re-filtered to capture cells that remain unbound to the membrane.
Следующая стадия включает смывку нецелевых или несвязанных клеток с мембраны. Это осуществляют в отдельном контуре обратной связи (не присоединенном к контейнеру для отходов) с помощью физиологического раствора или буфера под давлением (например, 1 бар или более). Целевые клетки промывают и собирают в отдельном контейнере в нижней части устройства. Промытые и отобранные клетки подходят для прямого применения.The next step involves washing off non-target or unbound cells from the membrane. This is done in a separate feedback loop (not connected to the waste container) with physiological saline or a pressurized buffer (
Конечный продукт представляет собой стерильную суспензию гемопоэтических стволовых клеток CD34+, подходящую для применения у пациентов. The final product is a sterile suspension of CD34 + hematopoietic stem cells suitable for use in patients.
Пример 2Example 2
Препарат CD90+ (мезенхимальные стволовые клетки) для аутотрансплантацииCD90 + (mesenchymal stem cells) preparation for autotransplantation
Тумесцентный липоаспират подкожного жира применяют в качестве биологического образца для получения клеток. Исходную суспензию отдельных клеток получают в виде стромальной сосудистой фракции (SVF) в соответствии с известными способами в следующем порядке: промывание липоаспирата в 1xPBS (удаление эритроцитов и сыворотки крови), ферментативное расщепление с использованием коллагеназы Ia (разрушение межклеточных связей), градиентное центрифугирование и встряхивание (окончательное разделение клеток SVF и адипоцитов) и удаление адипоцитов пипетированием. Конечную суспензию отдельных клеток получают в буфере 1xPBS для инъекции. Tumescent subcutaneous fat lipoaspirate is used as a biological sample to obtain cells. The initial suspension of single cells is obtained as a stromal vascular fraction (SVF) according to known methods in the following order: washing of lipoaspirate in 1xPBS (removal of erythrocytes and blood serum), enzymatic cleavage using collagenase Ia (destruction of intercellular bonds), gradient centrifugation and shaking (final separation of SVF cells and adipocytes) and removal of adipocytes by pipetting. The final single cell suspension is prepared in 1xPBS injection buffer.
С помощью инъекционной иглы исходную суспензию наносят на кассету с механическим фильтром 70 мкм для удаления крупных кластеров клеток и мембраной со связанными целевыми молекулами, которые распознают и связывают поверхностный антиген CD90, который экспрессируется на мезенхимальных стволовых клетках из подкожного жира.Using an injection needle, the initial suspension is applied to a cassette with a 70 µm mechanical filter to remove large cell clusters and a membrane with associated target molecules that recognize and bind the CD90 surface antigen, which is expressed on mesenchymal stem cells from subcutaneous fat.
Регулятор потока на мембране обеспечивает оптимальную дозировку физиологической жидкости или буфера для предотвращения засорения системы. После того, как все нецелевые клетки собраны в контейнере для отходов, эффективность контура обратной связи гарантирует, что тот же раствор повторно фильтруется для захвата клеток, которые остались несвязанными с мембраной.A flow regulator on the membrane ensures optimal dosage of physiological fluid or buffer to prevent clogging of the system. Once all non-target cells have been collected in the waste container, the efficiency of the feedback loop ensures that the same solution is re-filtered to capture cells that remain unbound to the membrane.
Следующая стадия включает смывку нецелевых или несвязанных клеток с мембраны. Это осуществляют в отдельном контуре обратной связи (не присоединенном к контейнеру для отходов) с помощью физиологического раствора или буфера под давлением (например, 1 бар или более). Целевые клетки промывают и собирают в отдельный контейнер в нижней части устройства. Промытые и отобранные клетки подходят для прямого применения.The next step involves washing off non-target or unbound cells from the membrane. This is done in a separate feedback loop (not connected to the waste container) with physiological saline or a pressurized buffer (
Конечный продукт представляет собой стерильную суспензию мезенхимальных стволовых клеток CD90+, подходящую для применения пациентами для лечения различных клинических состояний (в области ортопедии, кардиологии, пластической и реконструктивной хирургии, стоматологии, урологии, онкологии). The final product is a sterile suspension of CD90 + mesenchymal stem cells suitable for use by patients in the treatment of various clinical conditions (orthopedics, cardiology, plastic and reconstructive surgery, dentistry, urology, oncology).
Пример применения суспензии отдельных клеток в ортопедии: полученную суспензию мезенхимальных стволовых клеток CD90+ наносят непосредственно в суставную щель (внутрисуставная инъекция) сустава с поверхностным повреждением хряща.An example of the use of single cell suspension in orthopedics: the resulting CD90 + mesenchymal stem cell suspension is applied directly to the joint space (intra-articular injection) of a joint with superficial cartilage damage.
Пример применения суспензии отдельных клеток в стоматологии: после удаления зуба происходит обширная резорбция кости в челюсти. Часто это является препятствием для поиска подходящего с эстетической точки зрения протеза для пораженной челюсти и замены зуба. Оптимальное решение для восстановления недостающей части челюсти представляет собой применение мезенхимальных стволовых клеток. Чтобы обеспечить пространство для роста кости, существующая пустота должна быть защищена от зарастания надкостницы. Обычно используют титановую сетку; однако сетка из биосовместимого материала, напечатанная на 3D-принтере, еще лучше. Стволовые клетки теперь можно наносить на это предварительно подготовленное пространство. Благодаря активности факторов роста, полученных из тромбоцитов, стволовые клетки начинают дифференцироваться в остеобласты (молодые костные клетки) и, наконец, в остеоциты (взрослые костные клетки). Через несколько месяцев костный дефект перекрывается здоровой нативной тканью. An example of the use of a suspension of individual cells in dentistry: after tooth extraction, extensive bone resorption occurs in the jaw. Often this is an obstacle to finding an aesthetically suitable prosthesis for the affected jaw and replacing the tooth. The optimal solution for restoring the missing part of the jaw is the use of mesenchymal stem cells. To provide space for bone growth, the existing void must be protected from periosteal overgrowth. Typically, a titanium mesh is used; however, a 3D printed biocompatible mesh is even better. Stem cells can now be applied to this pre-prepared space. Thanks to the activity of growth factors derived from platelets, stem cells begin to differentiate into osteoblasts (young bone cells) and finally into osteocytes (adult bone cells). A few months later, the bone defect is covered with healthy native tissue.
Claims (51)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021113722A RU2021113722A (en) | 2023-01-20 |
| RU2789860C2 true RU2789860C2 (en) | 2023-02-14 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1947170A1 (en) * | 2005-10-21 | 2008-07-23 | Kaneka Corporation | Stem cell separating material and method of separation |
| RU2600871C2 (en) * | 2012-12-14 | 2016-10-27 | Чун ЧЖЭН | Device for centrifugal filtration and cells separation system with such device for centrifugal filtration |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1947170A1 (en) * | 2005-10-21 | 2008-07-23 | Kaneka Corporation | Stem cell separating material and method of separation |
| RU2600871C2 (en) * | 2012-12-14 | 2016-10-27 | Чун ЧЖЭН | Device for centrifugal filtration and cells separation system with such device for centrifugal filtration |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICODEMOU ANDREAS et al., Mesenchymal stromal/stem cell separation methods: concise review, Cell and Tissue Banking, 2017, vol. 18, pp.443-460, doi:10.1007/S10561-017-9658-X. HADDEN WILLIAM J.et al., Stem cell migration and mechanotransduction on linear stiffness gradient hydrogels, PNAS, 15.05.2017, 114 (22), pp. 5647-5652, doi:10.1073/pnas.1618239114. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5827971B2 (en) | Filter cleaning apparatus and method with ultrasonic, backwash and filter motion during biological sample filtration | |
| Shahriari et al. | Hierarchically ordered porous and high-volume polycaprolactone microchannel scaffolds enhanced axon growth in transected spinal cords | |
| JP5515133B2 (en) | Bone regeneration composition manufacturing equipment | |
| CA2899713A1 (en) | Cell repopulated collagen matrix for soft tissue repair and regeneration | |
| JP2008504867A (en) | Methods of using regenerative cells for the treatment of musculoskeletal diseases | |
| CN113677700A (en) | Cell structure and method for producing cell structure | |
| AU2012315743B2 (en) | Bioscaffolds for formation of motor endplates and other specialized tissue structures | |
| JP4847129B2 (en) | Wound healing promoter | |
| AU2018453854B2 (en) | Membrane for separation of stem cells from biological samples, production process of said membrane, and process and device for separation, comprising said membrane | |
| KR101588070B1 (en) | The specific binding molecules-biodegradable nanofibers complex and method for preparing the same | |
| RU2789860C2 (en) | Membrane for separating stem cells from biological samples, a method for obtaining the specified membrane and a method and device for separation, including the specified membrane | |
| KR101909328B1 (en) | Tissue regeneration construct, and method for producing tissue regeneration construct | |
| CN114848895A (en) | 3D printing titanium alloy porous support loaded double-factor shell-core microsphere slow release system | |
| EP3222711B1 (en) | Production of artificial tissues comprising magnetic particles | |
| WO2021065665A1 (en) | Method for producing three-dimensional cell structure | |
| WO2022070787A1 (en) | Method for producing tissue construct and method for treating diseases by using tissue construct | |
| Hernáez Estrada | The Use of Mesenchymal Stromal Cells and Tissue-Engineered Blood Vessels for Seamless Implant Integration | |
| JP2023175345A (en) | Cell container and method for use thereof | |
| Tsaroucha | Development of regenerative extracellular vesicles for bone tissue engineering |