RU2788860C1 - Method for differential diagnosis of cervical dysplasias - Google Patents
Method for differential diagnosis of cervical dysplasias Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788860C1 RU2788860C1 RU2021135760A RU2021135760A RU2788860C1 RU 2788860 C1 RU2788860 C1 RU 2788860C1 RU 2021135760 A RU2021135760 A RU 2021135760A RU 2021135760 A RU2021135760 A RU 2021135760A RU 2788860 C1 RU2788860 C1 RU 2788860C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mir
- cervical
- dysplasia
- pcr
- ratio
- Prior art date
Links
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 16
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 18
- 230000002380 cytological Effects 0.000 claims description 15
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 210000003679 Cervix Uteri Anatomy 0.000 description 2
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 2
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 229940014598 TAC Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 238000002573 colposcopy Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N (6aS,11bR)-7,11b-dihydro-6H-indeno[2,1-c]chromene-3,4,6a,9,10-pentol;2',4',5',7'-tetrabromo-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2.O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1OC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N 0.000 description 1
- 101710019027 CG-3 Proteins 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001869 Mir-126 Polymers 0.000 description 1
- 229920002576 Mir-375 Polymers 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 229940079862 Sodium Lauryl Sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N Triamcinolone acetonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001215 Vagina Anatomy 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000003905 Vulva Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004085 squamous epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины и может быть использовано для дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий.The invention relates to the field of biotechnology and diagnostic medicine and can be used for differential diagnosis of cervical dysplasia.
Рак шейки матки (РШМ) занимает одну из лидирующих позиций в структуре онкологической заболеваемости среди женщин [1]. Особенностью этого заболевания является хорошо изученная стадийность его развития. Она обеспечивает возможность своевременной диагностики и лечения так называемых предраковых изменений цервикального эпителия, или дисплазий. Cervical cancer (CC) occupies one of the leading positions in the structure of cancer incidence among women [1]. A feature of this disease is the well-studied staging of its development. It provides the possibility of timely diagnosis and treatment of the so-called precancerous changes in the cervical epithelium, or dysplasia.
Диагностика цервикальных дисплазий начинается с гинекологического обследования. Кольпоскопия - осмотр и ревизия состояния слизистой оболочки шейки матки, влагалища и вульвы при увеличении микроскопа в 7-30 раз и применении диагностических тестов (реакция эпителия на воздействие 3% уксусной кислоты, раствора Люголя и др.). С помощью кольпоскопии можно обнаружить изменения цервикального эпителия, но трудно определить их характер, особенно на начальных этапах развития РШМ. Решающее значение имеют результаты исследований состояния образца клеток цервикального эпителия врачом клинической диагностики - цитологом. Для проведения такого исследования врач - гинеколог должен получить материал, который проходит подготовку (фиксация, окрашивание клеток) либо с участием лаборанта (традиционная цитология), либо с помощью автоматизированных запатентованных технологий (жидкостная цитология), готовый препарат исследуется цитологом путем стандартной микроскопии. Качество цитологического исследования определяется квалификацией всех специалистов, участвующих в процессе, поэтому «человеческий фактор» существенно влияет на диагностическую ценность этого метода.Diagnosis of cervical dysplasia begins with a gynecological examination. Colposcopy - examination and revision of the state of the mucous membrane of the cervix, vagina and vulva with a microscope magnification of 7-30 times and the use of diagnostic tests (epithelial reaction to exposure to 3% acetic acid, Lugol's solution, etc.). With the help of colposcopy, changes in the cervical epithelium can be detected, but it is difficult to determine their nature, especially in the initial stages of cervical cancer. Of decisive importance are the results of studies of the state of the sample of cells of the cervical epithelium by a clinical diagnostics doctor - a cytologist. To conduct such a study, a gynecologist must receive material that is being prepared (fixation, staining of cells) either with the participation of a laboratory assistant (traditional cytology) or using automated patented technologies (liquid cytology), the finished preparation is examined by a cytologist using standard microscopy. The quality of a cytological examination is determined by the qualifications of all specialists involved in the process, therefore the "human factor" significantly affects the diagnostic value of this method.
К дополнительным методам, широко вошедшим в клиническую практику, относится детекция генетического материала вируса папилломы человека (ВПЧ) в материале цервикального мазка. При этом клиническое значение имеет не только факт инфицирования, но и серотип и онкогенный потенциал вируса, активность инфекционного процесса («вирусная нагрузка»), длительность персистенции вирусной инфекции.Additional methods widely used in clinical practice include the detection of the genetic material of the human papillomavirus (HPV) in the material of the cervical smear. At the same time, not only the fact of infection is of clinical importance, but also the serotype and oncogenic potential of the virus, the activity of the infectious process (“viral load”), and the duration of the persistence of the viral infection.
Инфекция ВПЧ является лишь одним из этиологических факторов развития РШМ, но не диагностическим критерием заболевания, что накладывает принципиальные ограничения на диагностический потенциал этого метода.HPV infection is only one of the etiological factors in the development of cervical cancer, but not a diagnostic criterion for the disease, which imposes fundamental limitations on the diagnostic potential of this method.
Объективные ограничения перечисленных методов определяют необходимость разработки новых подходов. В частности, идентификация молекулярных маркеров злокачественной трансформации клеток цервикального эпителия и разработка надежных технологий анализа таких маркеров позволили бы создать новые, объективные и экономичные, методы ранней диагностики цервикальных дисплазий и РШМ.The objective limitations of these methods determine the need to develop new approaches. In particular, the identification of molecular markers of malignant transformation of cervical epithelial cells and the development of reliable technologies for the analysis of such markers would make it possible to create new, objective and economical methods for the early diagnosis of cervical dysplasia and cervical cancer.
МикроРНК (миРНК) - это короткие (20-24 нуклеотида) молекулы РНК, которые участвуют в процессе пост-транскрипционной регуляции работы генов. В клетках человека описано несколько тысяч различных микроРНК, функциональная активность которых обеспечивают контроль трансляции клеточного генома. Для клеток каждой ткани характерен определенный набор (профиль) молекул микроРНК, который формируется тремя-четырьмя сотнями «мажорных» молекул. Злокачественная трансформация сопровождается характерными изменениями этого профиля. Анализ таких изменений в клетках эпителия цервикального канала имеет диагностический потенциал, как показано сотнями научных публикаций [2-4], включая публикации авторов заявки [5-7]. Но для создания новой диагностической технологии необходимо определить молекулы микроРНК, экспрессионные изменения которых достоверно связаны с процессом неопластической трансформации, и разработать метод анализа таких изменений и способ клинической интерпретации результатов.MicroRNAs (miRNAs) are short (20-24 nucleotides) RNA molecules that are involved in the post-transcriptional regulation of genes. Several thousand different miRNAs have been described in human cells, the functional activity of which provides control of the translation of the cellular genome. The cells of each tissue are characterized by a certain set (profile) of microRNA molecules, which is formed by three to four hundred "major" molecules. Malignant transformation is accompanied by characteristic changes in this profile. The analysis of such changes in cervical epithelial cells has diagnostic potential, as shown by hundreds of scientific publications [2-4], including publications of the authors of the application [5-7]. However, to create a new diagnostic technology, it is necessary to identify microRNA molecules whose expression changes are reliably associated with the process of neoplastic transformation, and develop a method for analyzing such changes and a method for clinical interpretation of the results.
Известен способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий, основанный на исследовании материала цитологического мазка с выделением РНК, анализом двух молекул микроРНК (miR-126, miR-375) с помощью метода обратной транскрипции (ОТ), последующей полимеразной цепной реакции (ПЦР) ОТ-ПЦР и расчетом соотношения относительной концентрации этих молекул. Диагностическая чувствительность способа - 70%, специфичность - 72%. [6].A known method for the differential diagnosis of cervical dysplasia, based on the study of the material of a cytological smear with RNA isolation, analysis of two microRNA molecules (miR-126, miR-375) using the reverse transcription (RT) method, subsequent polymerase chain reaction (PCR) RT-PCR and calculation of the ratio of the relative concentration of these molecules. Diagnostic sensitivity of the method - 70%, specificity - 72%. [6].
Техническим результатом изобретения является повышение точности, чувствительности и специфичности способа.The technical result of the invention is to improve the accuracy, sensitivity and specificity of the method.
Указанный технический результат достигается в способе дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий, включающем исследование цитологического мазка путем выделения РНК, анализ двух молекул микроРНК методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), расчет соотношения относительных концентрации этих молекул, в котором методом ОТ - ПЦР исследуют две молекулы микроРНК: miR-451-5p и miR-200a-3p, вычисляют соотношение их относительных концентраций и при соотношении miR-451- 5p/miR-200a-3p < 1,7 диагностируют нормальный цервикальный эпителий или легкую степень цервикальной дисплазии, при miR-451-5p / miR-200a-3p >1,7 - тяжелую степень дисплазии или рак шейки матки.The specified technical result is achieved in a method for the differential diagnosis of cervical dysplasia, including the study of a cytological smear by RNA isolation, analysis of two microRNA molecules by reverse transcription (RT) and subsequent quantitative polymerase chain reaction (PCR), calculation of the ratio of the relative concentrations of these molecules, in which the RT method - PCR examines two miRNA molecules: miR-451-5p and miR-200a-3p, calculates the ratio of their relative concentrations, and when the ratio miR-451-5p/miR-200a-3p < 1.7, normal cervical epithelium or mild cervical epithelium is diagnosed dysplasia, with miR-451-5p / miR-200a-3p>1.7 - severe dysplasia or cervical cancer.
Способ иллюстрируется фиг. 1,2, где:The method is illustrated in Fig. 1.2, where:
На фиг.1 - кривая ROC-анализа;Figure 1 - curve ROC analysis;
На фиг.2 - образец исследованного цитологического мазка заявляемым способом.Figure 2 - a sample of the studied cytological smear by the inventive method.
Как показали проведенные исследования, развитие дисплазии тяжелой степени эпителия цервикального канала сопровождается активацией экспрессии miR-145-5p и угнетением экспрессии miR-200a-3p.Studies have shown that the development of severe dysplasia of the cervical canal epithelium is accompanied by activation of miR-145-5p expression and inhibition of miR-200a-3p expression.
Чувствительность диагностического теста, основанного на индивидуальной оценке изменений экспрессии этих молекул, не является достаточной, в то время как расчет соотношения концентраций молекул с реципрокным (разнонаправленным) характером патологических изменений позволяет уверенно дифференцировать клинические значимые различия: «NILM+LSIL» vs. «HSIL+CC» (NILM - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy / цитограмма без особенностей; LSIL - Low Squamous Interepithelial Lesions / дисплазия легкой степени; HSIL - High Squamous Interepithelial Lesions / дисплазия тяжелой степени; CC - cervical cancer / рак шейки матки).The sensitivity of a diagnostic test based on an individual assessment of changes in the expression of these molecules is not sufficient, while the calculation of the ratio of the concentrations of molecules with a reciprocal (multidirectional) nature of pathological changes makes it possible to confidently differentiate clinically significant differences: "NILM + LSIL" vs. "HSIL + CC" (NILM - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy / cytogram without features; LSIL - Low Squamous Interepithelial Lesions / mild dysplasia; HSIL - High Squamous Interepithelial Lesions / severe dysplasia; CC - cervical cancer / cervical cancer) .
Для оценки показателей диагностической значимости параметра miR-451-5p/miR-200a-3p был использован биологический материал 24 женщин, проходивших диспансерное обследование. Соскоб цервикального эпителия был получен традиционным методом с целью последующего проведения цитологического исследования. В каждом случае было приготовлено три препарата (цитологических стекла); нанесенный на стекла материал был высушен, фиксирован, окрашен (гематоксилин-эозин). Оценка препаратов была проведена двумя опытными врачами - цитологами. В исследование были включены препараты, оценка которых не вызвала сомнений или расхождений мнений двух специалистов: дисплазия легкой степени / LSIL - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy (n=12); и дисплазия тяжелой степени / HSIL - High Squamous Intraepithelial Lesion (n=12). В последствии пациенткам второй группы было проведено хирургическое лечение (диатермоконизация) и гистологическое исследование операционного материала, в ходе которого цитологический диагноз был подтвержден.To assess the indicators of the diagnostic significance of the miR-451-5p/miR-200a-3p parameter, biological material from 24 women who underwent dispensary examinations was used. Scraping of the cervical epithelium was obtained by the traditional method for the purpose of subsequent cytological examination. In each case, three preparations (cytological glasses) were prepared; the material deposited on the glass was dried, fixed, stained (hematoxylin-eosin). The drugs were evaluated by two experienced cytologists. The study included drugs, the evaluation of which did not cause doubts or disagreements between two specialists: mild dysplasia / LSIL - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy (n=12); and severe dysplasia / HSIL - High Squamous Intraepithelial Lesion (n=12). Subsequently, the patients of the second group underwent surgical treatment (diathermoconization) and a histological examination of the surgical material, during which the cytological diagnosis was confirmed.
Один из трех цитологических препаратов был использован для выделения РНК в соответствии с описанным ниже протоколом путем последовательного лизиса биологического материала, адсорбции нуклеиновых кислот на поверхности СПМЧ в присутствии изопропанола, последовательной отмывки этанолом, ацетоном. В заключении СПМЧ высушивали и проводили элюцию нуклеиновых кислот с поверхности частиц в 30 мкл буфера для элюции. Анализ относительной концентрации двух молекул микроРНК (miR-451a-5p и miR-200a-3p) провели путем последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР согласно ниже описанному протоколу. В каждом случае ПЦР проводили в двух технических повторах, результаты которых усредняли. Подсчет значения параметра miR- 451а-5р /200а-3р для каждого образца (пациентки) провели по формуле 2(CtmiR45ia-ctmiR200a) *jqq Принимая пороговым значением параметра miR451/200 = 1.7, для каждого включенного в исследование образца был определен диагноз: дисплазия легкой степени (LSIL) или отсутствие патологических изменений (п=12), и дисплазия тяжелой степени (HSIL) с высоким риском развития рака шейки матки (п=12). В двух из 24 случаев диагнозы, поставленные традиционными методами, не совпали с результатами оценки параметра miR451/200. На основе полученных данных был проведен расчет основных параметров диагностической значимости метода: чувствительность 92%; специфичность 92% (табл.1).One of the three cytological preparations was used for RNA isolation according to the protocol described below by successive lysis of biological material, adsorption of nucleic acids on the surface of SPMP in the presence of isopropanol, successive washing with ethanol and acetone. Finally, the SPMP was dried and the nucleic acids were eluted from the surface of the particles in 30 µl of elution buffer. Analysis of the relative concentration of two miRNA molecules (miR-451a-5p and miR-200a-3p) was performed by sequential reverse transcription and PCR reactions according to the protocol described below. In each case, PCR was performed in two technical repetitions, the results of which were averaged. The miR-451а-5р/200а-3р parameter value was calculated for each sample (patients) according to the formula mild (LSIL) or no pathological changes (n=12), and severe dysplasia (HSIL) with a high risk of developing cervical cancer (n=12). In two out of 24 cases, the diagnoses made by traditional methods did not coincide with the results of the assessment of the miR451/200 parameter. On the basis of the data obtained, the calculation of the main parameters of the diagnostic significance of the method was carried out: sensitivity 92%; specificity 92% (Table 1).
При этом площадь под кривой (фиг.1) после проведения ROC (receiver operation curve) анализа составила 0.96.The area under the curve (figure 1) after the ROC (receiver operation curve) analysis was 0.96.
Способ осуществляют, например, следующим образом.The method is carried out, for example, as follows.
1. Выделяют РНК из цитологического препарата (стекла с фиксированным и окрашенным материалом цервикального эпителия).1. RNA is isolated from a cytological preparation (glasses with fixed and stained cervical epithelium material).
Клеточный материал аккуратно растворяют на стекле лизис-буфером (600 мкл), содержащим гуанидинтиоцианат (5М), цитрата натрия (1М), лаурилсаркозинат натрия (10%-ный) и переносят в чистую пробирку, добавляют 10 мкл суперпарамагнитных наночастиц (СПМЧ) размером 4-10 мкм, покрытых диоксидом кремния, на поверхности которых сорбируется РНК. Смесь инкубируют на шейкере при 65°С в течение 15 минут. Добавляют изопропанол (600 мкл), инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут, затем концентрируют СПМЧ с помощью магнитного штатива и удаляют супернатант. Частицы с адсорбированной РНК промывают дважды 70%-ным этанолом (500 мкл), ацетоном (300 мкл) и высушивают. Для элюирования РНК частицы инкубируют в буфере для элюции Трис-НС (110 mМ), рН 8,9 (300 мкл) в течение 5 минут на шейкере при 65°С. После диссоциации РНК от частиц, СПМП концентрируют с помощью магнитного штатива, а раствор РНК переносят в чистую пробирку.Cellular material is carefully dissolved on glass with lysis buffer (600 µl) containing guanidine thiocyanate (5 M), sodium citrate (1 M), sodium lauryl sarcosinate (10%) and transferred to a clean test tube, 10 µl of superparamagnetic nanoparticles (SPMP) size 4 are added. -10 µm, coated with silicon dioxide, on the surface of which RNA is sorbed. The mixture is incubated on a shaker at 65°C for 15 minutes. Isopropanol (600 µl) is added, incubated at room temperature for 5 minutes, then the SPMP is concentrated using a magnetic rack and the supernatant is removed. Particles with adsorbed RNA are washed twice with 70% ethanol (500 μl), acetone (300 μl) and dried. To elute the RNA, the particles are incubated in Tris-HC elution buffer (110 mM), pH 8.9 (300 μl) for 5 minutes on a shaker at 65°C. After the dissociation of the RNA from the particles, the SPMP is concentrated using a magnetic stand and the RNA solution is transferred to a clean tube.
2. На втором этапе производят количественную оценку 2 молекул микроРНК: miR-145-5p и miR-200a-3p.2. At the second stage, 2 miRNA molecules are quantified: miR-145-5p and miR-200a-3p.
Реакцию обратной транскрипции (ОТ) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят на CFX96 Touch™ (Bio-Rad, США).Reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) were carried out on CFX96 Touch™ (Bio-Rad, USA).
Реакцию ОТ проводят в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержит фермент обратную транскриптазу (100 у.е.) и соответствующий буфер (любого производителя), праймер для обратной транскрипции (50 nМ) и образец ранее выделенной РНК (4 мкл). Последовательность праймера для обратной транскрипции miR-451а-5р: 5'-АAC GGT ТТС GAC GAA ТАС TGC TAG AGT TGC TAG CAG AGC CCT TAA AAC ТСA -3'; для miR-200a-3p: 5'-AGA CAG TGC GAC GAA TAC TGC TAG AGT TGC TAG CAG AGC CCT TAA АСА TCG-3'. Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют 45 минут при 25°С, с последующим нагревом при 85°С в течение 5 мин для инактивации обратной транскриптазы.The RT reaction is carried out in a volume of 20 μl. The reaction mixture contains the reverse transcriptase enzyme (100 c.u.) and the appropriate buffer (any manufacturer), a primer for reverse transcription (50 nM) and a sample of previously isolated RNA (4 μl). The sequence of the primer for reverse transcription miR-451a-5p: 5'-AAC GGT TTC GAC GAA TAC TGC TAG AGT TGC TAG CAG AGC CCT TAA AAC TCA -3'; for miR-200a-3p: 5'-AGA CAG TGC GAC GAA TAC TGC TAG AGT TGC TAG CAG AGC CCT TAA ACA TCG-3'. The reaction mixture is thoroughly mixed and incubated for 45 minutes at 25°C, followed by heating at 85°C for 5 minutes to inactivate reverse transcriptase.
Количественную ПЦР проводят в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержит 2х мастер микс для ПЦР (любого производителя), праймеры для ПЦР (300 пМ), FAM-меченный зонд (200 пМ) и реакционную смесь после ОТ (4 мкл). Последовательности олигонуклеотидов для ПЦР анализа miR- 451а-5Ь: ПЦР-прямой праймер 5'- САА CGG ТТТ CGA CGA АТА С-3’, ПЦР- обратный праймер 5'- GGAAACCGTTACCATTACTG-3зонд 5'- FAM AGA GTT GCT AGC AGA GCC СТТ АА BQH1-3’. Последовательности олигонуклеотидов для ПЦР анализа miR-200a-3p: ПЦР-прямой праймер 5'-AGA CAG TGC GAC GAA ТАС-3’; ПЦР-обратный праймер 5'-CGC ACT GTC TGG TAA CG-3’; зонд 5'- FAM- AGA GTT GCT AGC AGA GCC СТТ AA- BQH1-3’. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 10 мин, 40 циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 60 сек. Детекцию сигнала амплификации проводят по каналу FAM. Реакцию ОТ-ПЦР для каждого образца повторяют независимо дважды и усредняют, вычисляют соотношение относительных концентраций двух молекул микроРНК по формуле:Quantitative PCR is carried out in a volume of 20 μl. The reaction mixture contains 2x PCR master mix (any manufacturer), PCR primers (300 pM), FAM-labeled probe (200 pM), and post-RT reaction mixture (4 µl). Oligonucleotide sequences for PCR analysis of miR-451a-5b: PCR forward primer 5'- CAA CGG TTT CGA CGA ATA C-3', PCR reverse primer 5'- GGAAACCGTTACCATTACTG-3 probe 5'- FAM AGA GTT GCT AGC AGA GCC CTT AA BQH1-3'. Oligonucleotide sequences for PCR analysis of miR-200a-3p: PCR forward primer 5'-AGA CAG TGC GAC GAA TAC-3'; PCR reverse primer 5'-CGC ACT GTC TGG TAA CG-3'; probe 5'- FAM- AGA GTT GCT AGC AGA GCC CTT AA- BQH1-3'. PCR reaction protocol: preheating at 95°C - 10 min, 40 cycles: denaturation at 95°C - 10 sec, primer annealing and elongation: 60°C - 60 sec. Amplification signal detection is carried out via the FAM channel. The RT-PCR reaction for each sample is repeated independently twice and averaged, the ratio of relative concentrations of two microRNA molecules is calculated using the formula:
miR-451-5p / miR-200a-3p = 2(ctmiR451a-ctmiR200a> *100, где: ctmiR-451 -5р - концентрация miR-451 -5р; ctmiR-200a-3p - концентрация miR-200a-3p.miR-451-5p / miR-200a-3p = 2( ctmiR451a - ctmiR200a > *100, where: ctmiR-451 -5p - concentration of miR-451 -5p; ctmiR-200a-3p - concentration of miR-200a-3p.
Полученное значение отношения «miR-45 l-5p/miR-200a-3p» сравнивают с пороговым значением 1.7. Если полученное значение меньше порогового, то профиль экспрессии и соотношения экспрессионной активности маркерных молекул микроРНК (miR-451а-5р и miR-200a-3p) соответствуют параметрам нормального цервикального эпителия или легкой степени дисплазии. Если полученное значение больше порогового или равно ему, результат расценивается как соответствующий состоянию тяжелой дисплазии цервикального эпителия или РШМ.The obtained value of the ratio "miR-45 l-5p/miR-200a-3p" is compared with a threshold value of 1.7. If the obtained value is less than the threshold value, then the expression profile and the ratio of expression activity of microRNA marker molecules (miR-451a-5p and miR-200a-3p) correspond to the parameters of normal cervical epithelium or mild dysplasia. If the obtained value is greater than or equal to the threshold value, the result is regarded as corresponding to the condition of severe cervical epithelium dysplasia or cervical cancer.
Способ подтверждается следующим клиническим примером.The method is confirmed by the following clinical example.
У пациентки Б. в рамках диспансерного обследования был взят мазок цервикального эпителия с целью проведения цитологического исследования. Жалоб на момент обращения к врачу не было, осмотр шейки матки в зеркалах патологии не выявил. Заключение цитологического исследования материала цервикальных мазков: клетки плоского эпителия с атипией неясного генеза (Atypical Squamous Cell of Undetermined Significance / ASCUS). Результат пересмотра препаратов в альтернативной лаборатории: дисплазия легкой степени тяжести (Light Squamous Intraepithelial Lesion / LSIL). Так, полученные результаты цитологического исследования оказались недостаточно информативны для определения тактики ведения пациентки.As part of a dispensary examination, a smear of the cervical epithelium was taken from patient B. in order to conduct a cytological examination. There were no complaints at the time of going to the doctor, examination of the cervix in the mirrors did not reveal any pathology. The conclusion of the cytological examination of the cervical smear material: squamous epithelial cells with atypia of unknown origin (Atypical Squamous Cell of Undetermined Significance / ASCUS). The result of the review of drugs in an alternative laboratory: dysplasia of mild severity (Light Squamous Intraepithelial Lesion / LSIL). Thus, the obtained results of cytological examination were not informative enough to determine the tactics of managing the patient.
Материал цитологического препарата был использован для выделения РНК в соответствии с ранее описанным протоколом путем последовательного лизиса биологического материала, адсорбции нуклеиновых кислот на поверхности СПМЧ в присутствии изопропанола, последовательной отмывки этанолом, ацетоном. В заключении СПМЧ высушивали и проводили элюцию нуклеиновых кислот с поверхности частиц в 30 мкл буфера для элюции. Анализ относительной концентрации двух молекул микроРНК (miR-451а-5р и miR-200a-3p) провели путем последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР согласно ранее описанному протоколу. В ходе анализа каждой молекулы была проведена реакция обратной транскрипции, затем была ПЦР в двух технических повторах, результаты которых усредняли. Подсчет значения параметра miR451/200 по формуле 2(CtmiR451a-CtmiR200a)*100=2.8, что выше порогового значения 1.7 На основе проведенного исследования состояние цервикального эпителия было оценено как дисплазия тяжелой степени (High Squamous Intraepithelial Lesion / HSIL). Таким образом, диагноз был подтвержден в результате повторного исследования, проведенного через 3 месяца, пациентке рекомендовано оперативное лечение.The material of the cytological preparation was used for RNA isolation in accordance with the previously described protocol by sequential lysis of biological material, adsorption of nucleic acids on the surface of SPMP in the presence of isopropanol, successive washing with ethanol, acetone. Finally, the SPMP was dried and the nucleic acids were eluted from the surface of the particles in 30 µl of elution buffer. Analysis of the relative concentration of two miRNA molecules (miR-451a-5p and miR-200a-3p) was performed by sequential reverse transcription and PCR reactions according to the previously described protocol. During the analysis of each molecule, a reverse transcription reaction was carried out, then there was a PCR in two technical repetitions, the results of which were averaged. Calculation of the miR451/200 parameter value according to formula 2 (CtmiR451a-CtmiR200a) *100=2.8, which is higher than the threshold value of 1.7 Based on the study, the state of the cervical epithelium was assessed as severe dysplasia (High Squamous Intraepithelial Lesion / HSIL). Thus, the diagnosis was confirmed as a result of a re-examination conducted after 3 months, the patient was recommended surgical treatment.
На Фиг. 2. представлен репрезентативный фрагмент цитологического препарата пациентки Б. (фото, разрешение Х40) и в табл. 2 - пример расчета параметра miR-451a-5p / miR-200c-3p (табл.2)On FIG. 2. shows a representative fragment of the cytological preparation of patient B. (photo, X40 resolution) and in table. 2 - an example of calculating the miR-451a-5p / miR-200c-3p parameter (Table 2)
Заявляемый способ позволяет повысить диагностическую значимость: обладает высокой чувствительностью - 92%, специфичностью - 92%, диагностической точностью - 91.67%.The inventive method allows to increase the diagnostic significance: it has a high sensitivity - 92%, specificity - 92%, diagnostic accuracy - 91.67%.
Источники информации:Sources of information:
1. А.Д. Каприн, В.В. Старинский Г. В. П. Злокачественные Новообразования В России 2018 (Заболеваемость И Смертность )//Федеральная Служба Государственной Статистики.1. A.D. Kaprin, V.V. Starinsky G. V. P. Malignant Neoplasms in Russia 2018 (Morbidity and Mortality) // Federal State Statistics Service.
2. Kawai S., Fujii Т., Kukimoto I., Yamada H., Yamamoto N., Kuroda M., Otani S., Ichikawa R., Nishio E., Torii Y., Iwata A. Identification of miRNAs in cervical mucus as a novel diagnostic marker for cervical neoplasia//Scientific Reports. Cep. 8. - 2018.- N1.- C. 7070.2. Kawai S., Fujii T., Kukimoto I., Yamada H., Yamamoto N., Kuroda M., Otani S., Ichikawa R., Nishio E., Torii Y., Iwata A. Identification of miRNAs in cervical mucus as a novel diagnostic marker for cervical neoplasia//Scientific Reports. cep. 8. - 2018.- N1.- C. 7070.
3. Gao C., Zhou C., Zhuang J., Liu L., Liu C., Li H., Liu G., Wei J., Sun C. MicroRNA expression in cervical cancer: Novel diagnostic and prognostic biomarkers//Joumal of Cellular Biochemistry. Cep. 119. -2018.-N8,- C. 7080-7090.3. Gao C., Zhou C., Zhuang J., Liu L., Liu C., Li H., Liu G., Wei J., Sun C. MicroRNA expression in cervical cancer: Novel diagnostic and prognostic biomarkers// Joumal of Cellular Biochemistry. cep. 119.-2018.-N8,- C. 7080-7090.
4. Pardini B., De Maria D., Francavilla A., Di Gaetano C., Ronco G., Naccarati A. MicroRNAs as markers of progression in cervical cancer: a systematic review//BMC Cancer. Cep. 18. - 2018.- N1.- C. 696.4. Pardini B., De Maria D., Francavilla A., Di Gaetano C., Ronco G., Naccarati A. MicroRNAs as markers of progression in cervical cancer: a systematic review//BMC Cancer. cep. 18. - 2018.- N1.- C. 696.
5. Князева M.C., Присяжная T.C., Забегина Л.М., Смирнова О.А., Михетько А.А., Берлев И.В., Малек А.В. Прогностическое значение анализа микроРНК в клетках цервикального эпителия при дисплазии легкой степени//Опухоли женской репродуктивной системы. Сер. 4. - 2020.- N16.- С. 59-68.5. Knyazeva M.C., Prisyazhnaya T.C., Zabegina L.M., Smirnova O.A., Mikhetko A.A., Berlev I.V., Malek A.V. Prognostic value of microRNA analysis in cervical epithelial cells in mild dysplasia//Tumours of the female reproductive system. Ser. 4. - 2020.- N16.- S. 59-68.
6. Архангельская П.А., Самсонов Р.Б., Штам Т.А., Князева М.С., Иванов М.К., Колесников Н.Н., Титов С.Е., Бахидзе Е.В., Берлев И.В., Михетько А.А., Воробьев С.Л.,6. Arkhangelskaya P.A., Samsonov R.B., Shtam T.A., Knyazeva M.S., Ivanov M.K., Kolesnikov N.N., Titov S.E., Bakhidze E.V., Berlev I.V., Mikhetko A.A., Vorobyov S.L.,
7. Малек А.В. Оценка экспрессии 4 микроРНК в цитологических препаратах в качестве дополнительного метода диагностики рака шеики матки/Юпухоли женской репродуктивной системы. Сер. 3. - 2017.- N13.- С. 63-72.7. Malek A.V. Evaluation of the expression of 4 microRNAs in cytological preparations as an additional method for diagnosing cancer of the cervix of the uterus/Tumours of the female reproductive system. Ser. 3. - 2017.- N13.- S. 63-72.
8 Ivanov М.К., Titov S.E., Dzyubenko V.V., Glushkov S.A., Krasilnikov S.E., Mansurova A.S., Malek A.V., Berlev I.V., Prisyazhnaya T.S., Kuleshova S.V., Hodkevich A.A., Lancuhaj Y.A., Dimitriadi T.A., Agletdinov E.F. Detection of Cervical Lesions and Cancer in Air-Dried Cytologic Smears by Combined Analysis of mRNA and miRNA Expression Levels//The Journal of Molecular Diagnostics. Cep. 23. - 2021.- N5,- C. 541-554.8 Ivanov M.K., Titov S.E., Dzyubenko V.V., Glushkov S.A., Krasilnikov S.E., Mansurova A.S., Malek A.V., Berlev I.V., Prisyazhnaya T.S., Kuleshova S.V., Hodkevich A.A., Lancuhaj Y.A., Dimitriadi T.A., Agletdinov E.F. Detection of Cervical Lesions and Cancer in Air-Dried Cytologic Smears by Combined Analysis of mRNA and miRNA Expression Levels//The Journal of Molecular Diagnostics. cep. 23. - 2021.- N5,- C. 541-554.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788860C1 true RU2788860C1 (en) | 2023-01-25 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818148C1 (en) * | 2023-09-01 | 2024-04-24 | Виктория Валерьевна Пименова | Method for assessing degree of malignancy of intraepithelial involvement of squamous epithelium of uterus |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2538618C2 (en) * | 2012-12-26 | 2015-01-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Петрозаводский государственный университет" | Differential diagnostic technique for cervical dysplasia and cervical cancer |
| RU2019114331A (en) * | 2019-05-07 | 2020-11-09 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" | METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF CERVICAL NEOPLASIES AND CERVICAL CANCER IN SITU |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2538618C2 (en) * | 2012-12-26 | 2015-01-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Петрозаводский государственный университет" | Differential diagnostic technique for cervical dysplasia and cervical cancer |
| RU2019114331A (en) * | 2019-05-07 | 2020-11-09 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" | METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF CERVICAL NEOPLASIES AND CERVICAL CANCER IN SITU |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КНЯЗЕВА М.С. и др. Прогностическое значение анализа микроРНК в клетках цервикального эпителия при дисплазии легкой степени. Опухоли женской репродуктивной системы 2020; 16(4): 66-75. CAMACHO L. et al. Impact of Data Normalization and Hemolysis in the Quantification of Serum MicroRNAs. Poster No: 5. MiRNA Biomarkers for Toxicology. SOT. Contemporary Concepts in Toxicology. New Orleans, Louisiana. March 12, 2016; p.7. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818148C1 (en) * | 2023-09-01 | 2024-04-24 | Виктория Валерьевна Пименова | Method for assessing degree of malignancy of intraepithelial involvement of squamous epithelium of uterus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhu et al. | MiR-21-5p, miR-34a, and human telomerase RNA component as surrogate markers for cervical cancer progression | |
| Rohan et al. | PCR‐detected genital papillomavirus infection: Prevalence and association with risk factors for cervical cancer | |
| Williams et al. | Molecular detection methods in HPV-related cancers | |
| CN110387421A (en) | DNA methylation qPCR kit and application method for lung cancer detection | |
| CN111549135A (en) | DNA methylation qPCR kit for cervical cancer detection, and use method and application thereof | |
| de Bie et al. | The indicating FTA elute cartridge: a solid sample carrier to detect high-risk HPV and high-grade cervical lesions | |
| KR102542502B1 (en) | Methylation classifier for detection of HPV-induced invasive cancers, non-HPV-induced gynecological and anal reproductive cancers and their high-grade precursor lesions | |
| Kerkar et al. | Human papillomavirus infection in asymptomatic population | |
| Frega et al. | Assessment of HPV-mRNA test to predict recurrent disease in patients previously treated for CIN 2/3 | |
| CN108330215A (en) | A kind of primer and probe compositions detecting high-risk 16 types of HPV using RPA technologies | |
| CN111808962A (en) | Kit for cervical cancer detection and use method | |
| US20060275784A1 (en) | Detection of Human Papilloma Virus in Papanicolaou (Pap) Smears | |
| CN112575123B (en) | Primer combination, probe combination and human papillomavirus nucleic acid detection kit | |
| RU2788860C1 (en) | Method for differential diagnosis of cervical dysplasias | |
| CA3181473A1 (en) | Tumor detection reagent and kit | |
| CN111793690A (en) | DNA methylation qPCR kit for cervical cancer detection and use method thereof | |
| Kim et al. | HPV E6/E7, hTERT, and Ki67 mRNA RT-qPCR assay for detecting high-grade cervical lesion with microscope slides | |
| CN108085419B (en) | probe and primer composition | |
| CA2348413C (en) | Detection of human papilloma virus in papanicolaou (pap) smears | |
| Han et al. | A molecular beacon-based method for screening cervical cancer | |
| WO2017114005A1 (en) | Terc gene and/or myc gene detection probe, preparation method therefor, and reagent kit | |
| CN110760615B (en) | II type herpes simplex virus detection kit and detection method | |
| CN110387436A (en) | Human papilloma virus primer and molecular beacon combination, kit and detection method based on constant-temperature amplification | |
| Chang et al. | Microsatellite alterations in exfoliated cervical epithelia deoxyribonucleic acid as a marker for high-grade dysplasia | |
| RU2532344C2 (en) | Diagnostic technique for hyperproliferative conditions and method for assessing risk of cervical cancer accompanying cervical intraepithelial neoplasia and papilloma virus carrier state by determinig mrna of functional human gene complex |