RU2788203C1 - Correction of the ovulatory cycle in female rabbit recipients for transplantation of embryos modified by genetic engineering methods - Google Patents

Correction of the ovulatory cycle in female rabbit recipients for transplantation of embryos modified by genetic engineering methods Download PDF

Info

Publication number
RU2788203C1
RU2788203C1 RU2022114598A RU2022114598A RU2788203C1 RU 2788203 C1 RU2788203 C1 RU 2788203C1 RU 2022114598 A RU2022114598 A RU 2022114598A RU 2022114598 A RU2022114598 A RU 2022114598A RU 2788203 C1 RU2788203 C1 RU 2788203C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
correction
transplantation
recipients
embryos
progesterone
Prior art date
Application number
RU2022114598A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Владимир Михайлович Покровский
Евгений Александрович Патраханов
Алексей Васильевич Дейкин
Михаил Владимирович Покровский
Михаил Викторович Корокин
Анастасия Юрьевна Карагодина
Николай Егорович Казбан
Дарья Николаевна Сушкова
Диана Георгиевна Воронина
Индира Султановна Кочкарова
Оксана Борисовна Алтухова
Original Assignee
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ")
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") filed Critical Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ")
Application granted granted Critical
Publication of RU2788203C1 publication Critical patent/RU2788203C1/en

Links

Abstract

FIELD: pharmacology.
SUBSTANCE: invention relates to experimental pharmacology and can be used to prepare female rabbit recipients in order to create transgenic animals. Correction is carried out by intramuscular administration of progesterone-based suspension to female rabbits at a dose of 11.5 mg/kg, regardless of the phase of the estrous cycle, and 4 days after the introduction of progesterone suspension, intramuscular administration of prostaglandin F2α at a dose of 0.083 mg/kg is carried out, followed by surgical transplantation of genetically modified embryos 24-48 hours after ovulation.
EFFECT: proposed scheme of hormonal correction of the ovulatory cycle in female rabbit recipients for the transplantation of embryos modified by genetic engineering significantly increases the number of implanted embryos during their transplantation by surgical method.
1 cl, 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и генной инженерии и может быть использовано для подготовки самок реципиентов кролика с целью создания трансгенных животных. The invention relates to experimental pharmacology and genetic engineering and can be used to prepare female rabbit recipients in order to create transgenic animals.

В настоящее время, увеличивается темп работы лабораторий, занимающихся генным редактированием репродуктивного материала разных видов с целью воспроизведения более близкой к реальности модели заболевания в эксперименте или создания животных продуцентов лекарственных белков, которые могут стать биореакторами, многократно превышающими количественные характеристики производства и делающие процесс многократно выгоднее экономически. Кролик как биологический вид, становится все более привлекательным для исследователей из-за своих природных особенностей. В связи с чем становится все более актуальной разработка технологий воспроизведения репродуктивного материала, измененного методами генной инженерии. Currently, the pace of work of laboratories engaged in gene editing of reproductive material of various species is increasing in order to reproduce a disease model closer to reality in an experiment or to create animal producers of medicinal proteins that can become bioreactors that many times exceed the quantitative characteristics of production and make the process many times more economically profitable. . The rabbit as a biological species is becoming more and more attractive to researchers due to its natural features. In this connection, the development of technologies for reproducing reproductive material modified by genetic engineering is becoming increasingly important.

Известно применение простагландина F2α, который способствует овуляции у телок препубертатного возраста (C.E.P. Leonardi L.F.M., Pfeifer M.I.B., Rubin J., SinghR.J., Mapletoft G.A., Pessoa A.M., Bainy C.A.M. Silva. Prostaglandin F2α promotes ovulation in prepubertal heifers Theriogenology. 2012. V. 78, N 7. P. 1578–82. DOI:10.1016/j.theriogenology), которое заключалось в том, чтобы определить влияние экзогенного простагландина F (2α) (PGF) с или без лечения прогестероном на первую овуляцию у телок препубертатного возраста. Телкам вводили интравагинальную вставку, высвобождающую прогестерон (CIDR; Pfizer Animal Health, Монреаль, Квебек, Канада), и вызывали фолликулярную волну с помощью 50 мг прогестерона + 2 мг эстрадиолбензоата внутримышечно, а также вводили аналог PGF. Время удаления CIDR, на 5 день фолликулярной волны (в среднем 8,6 ± 0,5 дня после введения CIDR); и (3) телки контрольной группы не получали лечения (N = 14).Телок обследовали ежедневно с помощью трансректального ультразвукового исследования с начала эксперимента для подтверждения того, что овуляция произошла, или до 5 дней после инъекции PGF (группы PG и PPG) или до тех пор, пока доминантные фолликулы следующей фолликулярной волны не достигли 8 мм (контрольная группа).It is known to use prostaglandin F2α, which promotes ovulation in prepubertal heifers (C.E.P. Leonardi L.F.M., Pfeifer M.I.B., Rubin J., SinghR.J., Mapletoft G.A., Pessoa A.M., Bainy C.A.M. Silva. Prostaglandin F2α promotes ovulation in prepubertal heifers Theriogenology. 2012. V. 78, N 7. P. 1578-82. DOI:10.1016/j.theriogenology), which was to determine the effect of exogenous prostaglandin F (2α) (PGF) with or without progesterone treatment on first ovulation in prepubertal heifers age. Heifers were injected with an intravaginal progesterone releasing insert (CIDR; Pfizer Animal Health, Montreal, Quebec, Canada) and follicular wave induced with 50 mg progesterone + 2 mg estradiol benzoate intramuscularly, and a PGF analogue was administered. CIDR removal time, on day 5 of the follicular wave (mean 8.6 ± 0.5 days after CIDR injection); and (3) untreated control heifers (N = 14). Heifers were examined daily by transrectal ultrasound from the start of the experiment to confirm that ovulation had occurred or up to 5 days after PGF injection (PG and PPG groups) or until until the dominant follicles of the next follicular wave reached 8 mm (control group).

Данные способы гормональной коррекции овуляторного цикла невозможно применить на кроличьей модели в производстве, так как эстральный цикл крупного рогатого скота, в частности коров, существенно отличается от такового у кроликов. Так у крупного рогатого скота эстральный цикл длится от 18 до 24 дней, кролики (Oryctolagus cuniculus) обладают индуцированной овуляцией (Ramirez and Beyer, 1988) с нерегулярными и неопределенными циклами течки; поэтому на ферме (и в лаборатории) они могут размножаться в течение всего года при изобилии питательных кормов.( G. González-Mariscal; J.I. McNitt; S.D. Lukefahr (2007).Maternal care of rabbits in the lab and on the farm: Endocrine regulation of behavior and productivity. , 52(1), 0–91.doi:10.1016/j.yhbeh.2007.03.028)These methods of hormonal correction of the ovulatory cycle cannot be applied to a rabbit model in production, since the estrous cycle of cattle, in particular cows, differs significantly from that of rabbits. Thus in cattle the estrous cycle lasts from 18 to 24 days, rabbits (Oryctolagus cuniculus) have induced ovulation (Ramirez and Beyer, 1988) with irregular and indefinite estrus cycles; therefore, on the farm (and in the laboratory), they can breed throughout the year with an abundance of nutritious feed. ( G. González-Mariscal; J.I. McNitt; S.D. Lukefahr (2007). of behavior and productivity., 52(1), 0–91.doi:10.1016/j.yhbeh.2007.03.028)

Задачей изобретения является создание эффективного способа гормональной коррекции овуляторного цикла самок кроликов реципиентов для дальнейшего воспроизводства ими генномодифицированного потомства.The objective of the invention is to create an effective method for hormonal correction of the ovulatory cycle of female recipient rabbits for their further reproduction of genetically modified offspring.

Технический результат заключается в повышении количества и качества имплантируемых генномодифицированных эмбрионов, с определенными необходимыми признаками.The technical result consists in increasing the quantity and quality of implantable genetically modified embryos, with certain necessary features.

Задача решается с помощью предлагаемого способа, включающего внутримышечное введение самкам кроликов суспензию на основе прогестерона в дозе 11,5 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 4 дня после введения суспензии прогестерона, осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг/кг, с последующей хирургической трансплантацией генномодифицированных эмбрионов через 24-48 часов после наступления овуляции.The problem is solved using the proposed method, which includes intramuscular administration of a suspension based on progesterone at a dose of 11.5 mg/kg to female rabbits, regardless of the phase of the estrous cycle, and 4 days after the administration of the progesterone suspension, intramuscular administration of prostaglandin F2α at a dose of 0.083 mg/kg is carried out. kg, followed by surgical transplantation of genetically modified embryos 24-48 hours after ovulation.

Таким образом, поставленная задача решена. За счет предлагаемой гормональной коррекции овуляторного цикла самок кроликов с известным гормональным статусом повышается эффективность проведения успешной трансплантации репродуктивного материала, в результате чего повышается количество и качество имплантируемых генномодифицированных эмбрионов, что позволит самке кролика производить большее количество потомства, а это позволит увеличить темп генно-инженерного процесса в получении особей с определенными необходимыми признаками.Thus, the task is solved. Due to the proposed hormonal correction of the ovulatory cycle of female rabbits with a known hormonal status, the efficiency of successful transplantation of reproductive material increases, resulting in an increase in the number and quality of implanted genetically modified embryos, which will allow the female rabbit to produce more offspring, and this will increase the rate of the genetic engineering process in obtaining individuals with certain necessary features.

Способ осуществляется следующим образом. The method is carried out as follows.

Для исследования были выбраны самки кролика породы ХИКОЛЬ массой 3000-3200 г. For the study, female rabbits of the HIKOL breed weighing 3000-3200 g were selected.

20 животным экспериментальной группы была осуществлена гормональная коррекция овуляторного цикла (n=20). Животные в контрольной группе были выбраны в эксперимент методом визуального определения эструса (n=20). У самок кролика экспериментальной группы предварительной выборки не проводилось.20 animals of the experimental group underwent hormonal correction of the ovulatory cycle (n=20). Animals in the control group were selected for the experiment by the method of visual determination of estrus (n=20). In the female rabbits of the experimental group, pre-sampling was not carried out.

Животные были распределены на 4 группы (N=10). Animals were divided into 4 groups (N=10).

После проведения 20 животным из экспериментальной группы гормональной коррекции овуляторного цикла: 10 из них были оплодотворены искусственным осеменением, а 10 проводилась трансплантация генномодифицированных эмбрионов.After 20 animals from the experimental group underwent hormonal correction of the ovulatory cycle: 10 of them were fertilized by artificial insemination, and 10 underwent transplantation of genetically modified embryos.

Остальные 20 животных были распределены по 10 животных в аналогичные группы без проведения гормональной коррекции овуляторного цикла.The remaining 20 animals were divided into 10 animals in similar groups without hormonal correction of the ovulatory cycle.

Для осуществления первого этапа гормональной коррекции овуляторного цикла у самок кроликов внутримышечно вводилась суспензия прогестерона в дозе 11,25/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Через 4 дня после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ) в дозе 0,083 мг/кг. Предполагаемое время наступления овуляции – 24-48 часов после введения второго препарата. To implement the first stage of hormonal correction of the ovulatory cycle in female rabbits, a suspension of progesterone was administered intramuscularly at a dose of 11.25/kg, regardless of the phase of the estrous cycle of females. 4 days after the administration of progesterone, intramuscular administration of prostaglandin F2α (CJSC Mosagrogen, RF) was carried out at a dose of 0.083 mg/kg. The estimated time of ovulation is 24-48 hours after the introduction of the second drug.

Пример конкретного выполнения.An example of a specific implementation.

Для исследования были выбраны самки кролика породы ХИКОЛЬ массой 3000-3200 г. For the study, female rabbits of the HIKOL breed weighing 3000-3200 g were selected.

Животные были разделены на 4 группы:Animals were divided into 4 groups:

1. Искусственное осеменение самок с предварительной гормональной коррекцией овуляторного цикла (ОГКЦ) (n=10).1. Artificial insemination of females with preliminary hormonal correction of the ovulatory cycle (OHCC) (n=10).

2. Трансплантация эмбрионов хирургическим способом после предварительной гормональной коррекцией овуляторного цикла (ТГКЦ) (n=10).2. Surgical transplantation of embryos after preliminary hormonal correction of the ovulatory cycle (THCC) (n=10).

3. Искусственное осеменение самок без предварительной гормональной коррекции овуляторного цикла (ОК) (n=10).3. Artificial insemination of females without prior hormonal correction of the ovulatory cycle (OC) (n=10).

4. Трансплантация генномодифицированных эмбрионов хирургическим путем без предварительной коррекции овуляторного цикла (ТК) (n=10).4. Surgical transplantation of genetically modified embryos without preliminary correction of the ovulatory cycle (TC) (n=10).

Для подготовки групп с предварительной гормональной коррекцией овуляторного цикла у самок кроликов внутримышечно вводился прогестерон (суспензия для инъекций, ЗАО «Мосагроген», РФ «Прогестомаг» рег. 32-3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 27.06.2018) в дозе 11,25 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Для удобства введения препарата прогестерон на масляной основе готовили раствора суспензии прогестерона по известному способу, описанному в патенте № 2761137 публ. 06.12.2021 «В предварительно подготовленную стерильную пластиковую или стеклянную объёмом не более 100 мл ёмкость с крышкой помещается 9,95 мл дистиллированной воды. Далее данная ёмкость нагревается на водяной бане до 40°С, после чего в неё помещается с помощью инсулинового шприца 0,05 мл полисорбата Твин-80 и перемешивается стеклянной палочкой до полного растворения. Полученный раствор охлаждают до температуры ниже 25°С для того, чтобы избежать разрушение гормона, оптимальная температура (20-23°С). После охлаждения, струйно, вводим в раствор 1 мл препарата прогестерона. Добиваются гомогенности среды с помощью размешивания стеклянной палочкой или быстрого взбалтывания закрытой ёмкости. Используется непосредственно после приготовления в объеме индивидуальном для каждой особи из расчёта 4,5мг/100г. Хранению и повторному использованию полученная суспензия не подлежит во избежание потери гомогенности и распада среды на фазы, потери специфических свойств гормоном, а также развитии патогенной флоры». Через 4 суток после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ «Магестрофан» рег. 32- 3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 11.06.15) в дозе 0,083 мг/кг. Предполагаемое время наступления овуляции – 24-48 часов после введения второго препарата. Запланированной датой родов считались 35 сутки с начала оплодотворения. Количество генномодифицированных эмбрионов, трансплантируемых самкам в исследуемых группах, составляло 15-18 штук.To prepare groups with preliminary hormonal correction of the ovulatory cycle, progesterone was administered intramuscularly in female rabbits (injection suspension, CJSC Mosagrogen, Russian Federation Progestomag reg. ) at a dose of 11.25 mg/kg, regardless of the phase of the estrous cycle of females. For ease of administration of the oil-based progesterone preparation, a progesterone suspension solution was prepared according to a well-known method described in patent No. 2761137 publ. 12/06/2021 “9.95 ml of distilled water is placed in a pre-prepared sterile plastic or glass container with a volume of not more than 100 ml with a lid. Next, this container is heated in a water bath to 40 ° C, after which 0.05 ml of Tween-80 polysorbate is placed into it using an insulin syringe and mixed with a glass rod until completely dissolved. The resulting solution is cooled to a temperature below 25°C in order to avoid the destruction of the hormone, the optimum temperature (20-23°C). After cooling, in a jet, we introduce 1 ml of the progesterone preparation into the solution. Achieve homogeneity of the medium by stirring with a glass rod or by rapidly shaking a closed container. It is used immediately after preparation in an individual volume for each individual at the rate of 4.5 mg / 100 g. The resulting suspension is not subject to storage and reuse in order to avoid loss of homogeneity and decomposition of the medium into phases, loss of specific properties of the hormone, as well as the development of pathogenic flora. 4 days after the administration of progesterone, intramuscular injection of prostaglandin F2α (CJSC "Mosagrogen", RF "Magestrofan" reg. 32-3-4.15-2649 No. PVR-3-4.15 / 03139 dated 11.06.15) was carried out at a dose of 0.083 mg / kg . The estimated time of ovulation is 24-48 hours after the introduction of the second drug. The planned date of delivery was considered to be 35 days from the start of fertilization. The number of genetically modified embryos transplanted to females in the study groups was 15-18.

После окрола был проведен подсчет потомства у самок кролика из разных исследуемых групп. Результаты эффективности предварительной гормональной коррекции овуляторного цикла представлены в Таблице 1.After birth, offspring were counted in female rabbits from different study groups. The results of the effectiveness of preliminary hormonal correction of the ovulatory cycle are presented in Table 1.

Индекс эффективности имплантации рассчитывался путем отношения количества потомства к количеству беременных самок в группе.The implantation efficiency index was calculated by the ratio of the number of offspring to the number of pregnant females in the group.

Таблица 1Table 1

Figure 00000001
Figure 00000001

В ходе исследования было установлено, что гормональная коррекция овуляторного цикла группы самок при искусственном осеменении увеличивает количество оплодотворенных особей на 30% (р<0,05) относительно контрольной группы. Количество животных которым проводили трансплантацию генномодифицированных эмбрионов после гормональной коррекции овуляторного цикла по факту регистрации окрола на 35 сутки составило на 20% (р<0,05) больше в сравнении с контрольной группой которой проводили трансплантацию без коррекции. Индекс эффективности имплантации при применении препаратов по указанной схеме был выше на 58% у группы ТГКЦ в сравнении с ТК и на 17% больше у группы ОГКЦ в сравнении с ОК. During the study, it was found that the hormonal correction of the ovulatory cycle of a group of females during artificial insemination increases the number of fertilized individuals by 30% (p<0.05) relative to the control group. The number of animals that underwent transplantation of genetically modified embryos after hormonal correction of the ovulatory cycle upon birth registration on the 35th day was 20% (p<0.05) more in comparison with the control group of which transplantation was performed without correction. The index of implantation efficiency when using drugs according to this scheme was 58% higher in the THCC group compared to TC and 17% higher in the OGCC group compared to OC.

Таким образом, предлагаемая схема гормональной коррекции овуляторного цикла у самок реципиентов кролика для трансплантации эмбрионов, измененных методами генной инженерии, достоверно повышает количество и качество имплантируемых эмбрионов при их трансплантации хирургическим методом.Thus, the proposed scheme of hormonal correction of the ovulatory cycle in female rabbit recipients for transplantation of genetically modified embryos significantly increases the number and quality of implanted embryos during their surgical transplantation.

Claims (1)

Способ коррекции овуляторного цикла у самок реципиентов кролика в эксперименте, характеризующийся тем, что осуществляют внутримышечное введение самкам кроликов суспензию на основе прогестерона в дозе 11,5 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 4 дня после введения суспензии прогестерона осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг/кг, с последующей хирургической трансплантацией генномодифицированных эмбрионов через 24-48 ч после наступления овуляции. A method for correcting the ovulatory cycle in female rabbit recipients in an experiment, characterized by intramuscular administration of a suspension based on progesterone at a dose of 11.5 mg/kg to female rabbits, regardless of the phase of the estrous cycle, and 4 days after the administration of the progesterone suspension, intramuscular administration is carried out prostaglandin F2α at a dose of 0.083 mg/kg, followed by surgical transplantation of genetically modified embryos 24-48 hours after ovulation.
RU2022114598A 2022-05-31 Correction of the ovulatory cycle in female rabbit recipients for transplantation of embryos modified by genetic engineering methods RU2788203C1 (en)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2788203C1 true RU2788203C1 (en) 2023-01-17

Family

ID=

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КОЗИКОВА Л.В. Трансплантация ранних эмбрионов кроликов - важный этап получения трансгенных особей, Современные научные исследования и инновации, 2017, vol. 2, cc. 49-52. HOFFMAN K.L., GONZALEZ-MARISCAL G., Progesterone receptor activation signals behavioral transitions across the reproductive cycle of the female rabbit, Horm Behav., 2006, vol. 50, N. 1, pp. 154-168. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6823013B2 (en) Single recombinant bovine FSH after follicle synchronization
Mollah et al. HCG-induced spawning of the catfish, Clarias macrocephalus (Gunther)
Linhart et al. Optimization of artificial propagation in European catfish, Silurus glanis L.
AU659475B2 (en) Topical application of steroid hormones and vaginocervical stimulation to induce maternal behaviour of animals
AU763326B2 (en) Genetic manipulation of spermatogonia
RU2493873C1 (en) Injection preparation for higher sperm production in farm breeders and cocks, and method for using it
RU2788203C1 (en) Correction of the ovulatory cycle in female rabbit recipients for transplantation of embryos modified by genetic engineering methods
DE2454674A1 (en) METHOD OF CULTIVATING CELLULAR BODIES, IN PARTICULAR IN THE REARING OF SUCKLETS
Vijayalakshmy et al. Embryo transfer technology in animals: An overview
JPH05503699A (en) How to increase female fertility
RU2617042C2 (en) Method of induction of superovulation in cows-donors embryones with prolongation of activity of hypophysical gonadotropins
Arain et al. Biotechnological therapies for animal reproduction in the livestock sector
Tkacheva et al. Intravital method for the obtaining genital products from the male African catfish
JP3241378B2 (en) Somatotropin to increase bovine fertility
RU2452502C1 (en) Method for prevention of early cattle embryonic mortality
JPS6284026A (en) Production of sexial product, manufacture of composition therefor and use
JP2007252344A (en) Method for securing good quality egg from sevenband grouper adult fish by considering timing of artificial insemination after maturation/induced ovulation using lhrha-extended release preparation
JP2007254434A (en) Maturation- and ovulation-inducing method for sevenband grouper by lhrha injection administration using cacao butter oily preparation
JP2019137643A (en) Sustained-release agent for superovulation treatment, superovulation treatment solution, superovulation treatment set, superovulation treatment method, fertilized egg production method, and use of proteoglycan as sustained-release agent
RU2761137C1 (en) Method for synchronizing the estrous cycle in female mice in experiment
RU2774927C1 (en) Method for growing replacement heifers
WO2024009796A1 (en) Swine egg collection method and fertilized swine egg production method
John Clark Generation of transgenic livestock by pronuclear injection
RU2808596C1 (en) Method of increasing fertility of cows from frontal insemination
Bekahegn Estrus Synchronization and Artificial Insemination Technologies in Abergelle Goat at Station and on-farm Conditions of Waghemira Zone, Ethiopia