RU2787841C2 - Композиции и способы для ингибирования протеолитического пути аргинин/n-дегрона - Google Patents
Композиции и способы для ингибирования протеолитического пути аргинин/n-дегрона Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787841C2 RU2787841C2 RU2020111517A RU2020111517A RU2787841C2 RU 2787841 C2 RU2787841 C2 RU 2787841C2 RU 2020111517 A RU2020111517 A RU 2020111517A RU 2020111517 A RU2020111517 A RU 2020111517A RU 2787841 C2 RU2787841 C2 RU 2787841C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- modified base
- methyl nucleotide
- artificial sequence
- misc
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 33
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 title description 12
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 title description 3
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 54
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 230000000771 oncological Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims abstract description 6
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 245
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 claims description 135
- 206010073071 Hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 89
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 89
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 claims description 66
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 claims description 66
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 51
- 230000000861 pro-apoptotic Effects 0.000 claims description 49
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N ADRIAMYCIN Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 46
- 208000006990 Cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 46
- 229960004679 Doxorubicin Drugs 0.000 claims description 46
- 208000006359 Hepatoblastoma Diseases 0.000 claims description 46
- 230000000973 chemotherapeutic Effects 0.000 claims description 43
- 230000001085 cytostatic Effects 0.000 claims description 43
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 43
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 42
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 32
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N Staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 claims description 31
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 claims description 29
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 claims description 21
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims description 15
- 229920000972 Sense strand Polymers 0.000 claims description 11
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 175
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 174
- 229920001985 Small interfering RNA Polymers 0.000 description 105
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 105
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 97
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 85
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 82
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 82
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 66
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 56
- 102000036615 UBR-box proteins Human genes 0.000 description 54
- 108091006985 UBR-box proteins Proteins 0.000 description 54
- 101700027867 UBR5 Proteins 0.000 description 54
- 108060008759 UBR1 Proteins 0.000 description 51
- 101700072333 UBR2 Proteins 0.000 description 51
- 108060008760 UBR4 Proteins 0.000 description 50
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 49
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 47
- 102100008469 UBR2 Human genes 0.000 description 42
- 102000003441 UBR1 Human genes 0.000 description 40
- 102100005738 UBR5 Human genes 0.000 description 40
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 13
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 11
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 11
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 10
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 10
- 230000025458 RNA interference Effects 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 230000002987 rna-interference Effects 0.000 description 8
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 6
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 6
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 6
- 210000003979 Eosinophils Anatomy 0.000 description 5
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 description 5
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-Aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 4
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 3
- 239000002138 L01XE21 - Regorafenib Substances 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 3
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 3
- 102100005499 PTPRC Human genes 0.000 description 3
- 101700059076 PTPRC Proteins 0.000 description 3
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 3
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 3
- 229960004836 regorafenib Drugs 0.000 description 3
- FNHKPVJBJVTLMP-UHFFFAOYSA-N regorafenib Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=C(F)C(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 FNHKPVJBJVTLMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 102100008450 AFP Human genes 0.000 description 2
- 108009000409 Autophagy Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 2
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N DATI Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@]2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N Neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 210000001325 Yolk Sac Anatomy 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 2
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 2
- 230000006877 autophagy Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000000271 cardiovascular Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940121650 immune-checkpoint protein inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000002318 immunoblotting Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 2
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 2
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 2
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920002496 poly(ether sulfone) Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012132 radioimmunoprecipitation assay buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 2
- WCWUXEGQKLTGDX-LLVKDONJSA-N (2R)-1-[4-[(4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yl)oxy]-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl]oxypropan-2-ol Chemical compound C1=C2NC(C)=CC2=C(F)C(OC2=NC=NN3C=C(C(=C32)C)OC[C@H](O)C)=C1 WCWUXEGQKLTGDX-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHFDRBXTEDBWCZ-ZROIWOOFSA-N 3-[2,4-dimethyl-5-[(Z)-(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-1H-pyrrol-3-yl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC=CC=C3NC\2=O)=C1C NHFDRBXTEDBWCZ-ZROIWOOFSA-N 0.000 description 1
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 1
- 102100005005 ATE1 Human genes 0.000 description 1
- 101700005273 ATE1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine Transaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000003808 Amyloid Neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000008421 Amyloidosis, Hereditary, Transthyretin-Related Diseases 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 101700004551 BRAF Proteins 0.000 description 1
- 102100004328 BRAF Human genes 0.000 description 1
- 102000036638 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 108010042977 BRCA1 Protein Proteins 0.000 description 1
- 229920000195 Bacterial small RNA Polymers 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N Bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037177 Biodistribution Effects 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N Bisbenzimide Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100007290 CD274 Human genes 0.000 description 1
- 101710012053 CD274 Proteins 0.000 description 1
- 102100005310 CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 101700054183 CTLA4 Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 210000004292 Cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 108009000097 DNA Replication Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010018239 EC 2.3.2.8 Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000001723 Extracellular Space Anatomy 0.000 description 1
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 1
- 102100010966 GPT Human genes 0.000 description 1
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 210000001596 Intra-Abdominal Fat Anatomy 0.000 description 1
- 208000000541 Johanson Blizzard syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100013180 KDR Human genes 0.000 description 1
- 101710030888 KDR Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- MPVGZUGXCQEXTM-UHFFFAOYSA-N Linifanib Chemical compound CC1=CC=C(F)C(NC(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C=2C=3C(N)=NNC=3C=CC=2)=C1 MPVGZUGXCQEXTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950002216 Linifanib Drugs 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102100000541 MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 101700064507 MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 101000191605 MET Proteins 0.000 description 1
- SQFDQLBYJKFDDO-UHFFFAOYSA-K Merbromin Chemical compound [Na+].[Na+].C=12C=C(Br)C(=O)C=C2OC=2C([Hg]O)=C([O-])C(Br)=CC=2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O SQFDQLBYJKFDDO-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002782 Merbromin Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 1
- 108010019706 Nivolumab Proteins 0.000 description 1
- 108009000118 Nuclear Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 229950006354 Orantinib Drugs 0.000 description 1
- 208000007571 Ovarian Epithelial Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 229950005564 Patisiran Drugs 0.000 description 1
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010020147 Protein Corona Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102100013504 RPL17 Human genes 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102100013991 SDE2 Human genes 0.000 description 1
- 108060007336 SDE2 Proteins 0.000 description 1
- 108060007796 SPATA2 Proteins 0.000 description 1
- 241000316887 Saissetia oleae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003915 Spermatocytes Anatomy 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N Sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 229940033123 Tannic Acid Drugs 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N Tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 1
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 102100005739 UBR4 Human genes 0.000 description 1
- 102100009661 VTN Human genes 0.000 description 1
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 102000015735 beta Catenin Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 beta Catenin Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 230000001612 cachectic Effects 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000031084 chorio-allantoic fusion Effects 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase family Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase family Proteins 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000028170 human MET protein Human genes 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003509 long acting drug Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal Effects 0.000 description 1
- 230000003986 lysosome degradation Effects 0.000 description 1
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000587 neutral red assay Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 1
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 201000001539 ovarian carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 108010026276 pembrolizumab Proteins 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional Effects 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000770 pro-inflamatory Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 230000010516 protein arginylation Effects 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 229960002633 ramucirumab Drugs 0.000 description 1
- 108010026911 ramucirumab Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 101710044770 sll1951 Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000037327 stress response Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000730 tolerability Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LXZZYRPGZAFOLE-UHFFFAOYSA-L transplatin Chemical compound [H][N]([H])([H])[Pt](Cl)(Cl)[N]([H])([H])[H] LXZZYRPGZAFOLE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000989 vascularization Effects 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолевых заболеваний. В настоящем изобретении предложена молекула миРНК, снижающая уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, причем по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию, выбранную из 2’-O-метилнуклеотида, 3’-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций. Кроме того, предложены фармацевтические композиции и комбинации, содержащие миРНК. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения онкологических заболеваний. 10 н. и 20 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл., 1 пр.
Description
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, связанных с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате и, таким образом, включается в настоящее описание посредством ссылки. Файл, содержащий перечень последовательностей, называется SL_1541-14.txt. Текстовый файл, созданный 17 марта 2020, имеет размер примерно 66 килобайт и представляется в электронном виде.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолевых заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В последние годы появился ряд значительных достижений в лечении рака, которые предлагают многообещающие решения для ранее неизлечимых заболеваний. Однако, некоторые виды рака, такие как гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), остаются мало восприимчивыми к текущей терапии. Функциональная активность даже поврежденной печени и отсутствие явных патологических симптомов ГЦК осложняют ее раннюю диагностику (Bialecki E.S., Di Bisceglie A.M. Diagnosis of hepatocellular carcinoma // HPB. 2005. V.7, pp.26-34), что приводит к большому числу неоперабельных пациентов. Кроме того, у многих пациентов развивается резистентность к сорафенибу, еще недавно единственному препарату для терапии ГЦК. В последние годы для лечения ГЦК был одобрен регорафениб - множественный ингибитор киназ, а также два различных ингибитора контрольных точек (вторая линия лечения после появления резистентности к сорафенибу) (Personeni N., Pressiani T., Santoro A., Rimassa L. Regorafenib in hepatocellular carcinoma: latest evidence and clinical implications // Drugs Context. 2018. V.7, p.212533).
На сегодняшний день широко применяются следующие основные средства и способы терапии ГЦК:
1. Низкомолекулярные киназные ингибиторы, подавляющие как внутриклеточные киназы (серин/треонинкиназы c-CRAF, BRAF), так и расположенные на поверхности клеток рецепторные тирозинкиназы (Сорафениб, Сунитиниб, Орантиниб, Бриваниб, Линифаниб, Регорафениб).
2. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (антитела к PD-1, PD-L1, CTLA-4, например, Ниволумаб, Пембролизумаб).
3. Радиоэмболизация иттрием-90 (90Y).
4. Антитела, селективно ингибирующие VEGFR2 (например, Рамуцирумаб).
5. Трансплантация печени или резекция части печени.
Несмотря на некоторые успехи при применении перечисленных подходов, они обладают рядом значительных недостатков, включая резистентность к лечению, недостаточную эффективность и профиль безопасности. Кроме того, медиана выживаемости для неоперабельных пациентов с ГЦК, подвергающихся одному или нескольким из перечисленных выше видов терапии, все еще остается крайне низкой, составляя от 6 до 8 месяцев.
Таким образом, существующие известные средства и способы лечения гепатоцеллюлярной карциномы на сегодняшний день весьма ограничены и малоэффективны. В связи с этим существует необходимость разработки новых лекарственных препаратов и способов терапии.
Терапия с применением малых интерферирующих РНК (миРНК)
РНК-интерференция - это селективное посттранскрипционное подавление экспрессии генов, опосредованное малыми интерферирующими РНК (миРНК, siRNA) в клетках эукариот. Полагают, что этот процесс посттранскрипционного сайленсинга генов является эволюционно консервативным механизмом защиты клеток, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии позволяют синтезировать миРНК, направленные против любой РНК с любой нуклеотидной последовательностью. В настоящее время ряд конструкций миРНК продемонстрировал способность специфично подавлять экспрессию генов в моделях как in vitro, так и in vivo. Часть из этих миРНК проходит оценку в клинических исследованиях, а два препарата одобрены для применения в клинике в США и Евросоюзе. При этом, РНК-интерференцию считают многообещающим способом для лечения опухолей, например, путем выключения генов, характеризующихся повышенной экспрессией в трансформированных клетках, либо генов, принимающих участие в делении клетки. Кроме того, на сегодняшний день важным направлением исследований в области РНК-интерференции для клинического применения является разработка способов безопасной и эффективной доставки малых РНК (Haussecker D. Current issues of RNAi therapeutics delivery and development // Journal of Controlled Release. 2014. V.195, pp.49-54; Mansoori B. et al. RNA Interference and its role in cancer therapy // Adv. Pharm. Bull. 2014. V4(4), pp.313-321).
Недавние разработки на основе РНК-терапии для лечения наследственных и метаболических заболеваний печени привели к созданию эффективных пролонгированных препаратов, которые превосходят низкомолекулярные соединения и антитела (Hu B., Weng Y., Xia X.H., Liang X.J., Huang Y. Clinical advances of siRNA therapeutics // J. Gene Med. 2019. V.21, p.e3097). Однако, РНК после внутривенной или подкожной инъекции быстро выводится почками, что приводит к низкой эффективности доставки в ткани и органы, поэтому существует потребность в разработке новых эффективных систем для адресной доставки миРНК в клетки.
Среди известных систем доставки миРНК следует выделить стабильные липидные наночастицы (ЛНЧ), обеспечивающие эффективную доставку в клетки печени in vivo, что было продемонстрировано при проведении клинических исследований (Tatiparti K., Sau S., Kashaw S.K., Iyer A.K. siRNA delivery strategies: a comprehensive review of recent developments // Nanomaterials (Basel). 2017. V.7, p.77; Zatsepin T.S., Kotelevtsev Y.V., Koteliansky V. Lipid nanoparticles for targeted siRNA delivery - going from bench to bedside // Int. J. Nanomedicine. 2016. V.11, pp.3077-3086; Cullis P.R., Hope M.J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies // Mol. Ther. 2017. V.25, pp.1467-1475). Во время циркуляции в кровотоке поверхность ЛНЧ покрывается белками, включая аполипопротеины, которые обеспечивают специфическую рецептор-опосредованную доставку ЛНЧ в гепатоциты (Chen D., Parayath N., Ganesh S., Wang W., Amiji M. The role of apolipoprotein- and vitronectin-enriched protein corona on lipid nanoparticles for in vivo targeted delivery and transfection of oligonucleotides in murine tumor models // Nanoscale. 2019. V.11, pp.18806-18824). Оптимизация композиций липидных наночастиц, содержащих миРНК, для адресной доставки в печень (Kulkarni J.A., Witzigmann D., Chen S., Cullis P.R., van der Meel R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics // Acc. Chem. Res. 2019. V.52, pp.2435-2444) позволила разработать лекарственное средство для транстиретин-опосредованной наследственной амилоидной полинейропатии, одобренное управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) в 2018 году (Adams D., Gonzalez-Duarte A., O'Riordan W.D., Yang C.C., Ueda M., Kristen A.V., Tournev I., Schmidt H.H., Coelho T., Berk J.L., et al. Patisiran, an RNAi therapeutic, for hereditary transthyretin amyloidosis // N. Engl. J. Med. 2018. V.379, pp.11-21). Эта технология также может применяться для подавления любых молекулярных путей в трансформированных клетках, в том числе в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.
Протеолитический путь Arg/N-дегрона
В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что протеолитический путь Arg/N-дегрона участвует в процессах связанных с развитием онкологических заболеваний (Brower C.S., Piatkov K.I., Varshavsky A. Neurodegeneration-associated protein fragments as short-lived substrates of the N-end rule pathway // Mol. Cell. 2013. V.50, pp.161-171; Shearer R.F., Iconomou M., Watts C.K., Saunders D.N. Functional roles of the E3 ubiquitin ligase UBR5 in cancer // Mol. Cancer Res. 2015. V.13, pp.1523-1532; Mao J., Liang Z., Zhang B., Yang H., Li X., Fu H., Zhang X., Yan Y., Xu W., Qian H. UBR2 enriched in p53 deficient mouse bone marrow mesenchymal stem cell-exosome promoted gastric cancer progression via Wnt/b-catenin pathway // Stem Cells. 2017. V.35, pp.2267-2279). Регулируя деградацию специфических белков, путь Arg/N-дегрона (ранее известный, как путь Arg/правила N-конца) влияет на большое количество биологических функций (Varshavsky A. N-degron and C-degron pathways of protein degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019. V.116, pp.358-366; Varshavsky A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis // Protein Sci. 2011. V.20, pp.1298-1345). Недавние исследования выявили основные анти-апоптотические функции пути Arg/N-дегрона - благодаря своей способности избирательно разрушать специфические про-апоптотические фрагменты белков, включая Asp-BRCA1, Arg-BIMEL, Cys-TRAF1 и CysRIPK1 (Piatkov K.I., Brower C.S., Varshavsky A. The N-end rule pathway counteracts cell death by destroying proapoptotic protein fragments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V.109, pp.E1839-E1847; Xu Z., Payoe R., Fahlman R.P. The C-terminal proteolytic fragment of the breast cancer susceptibility type 1 protein (BRCA1) is degraded by the N-end rule pathway // J. Biol. Chem. 2012. V.287, pp.7495-7502). Поскольку апоптоз имеет решающее значение для удаления ненужных или поврежденных клеток, то блокирование внутриклеточных апоптотических путей важно для выживания раковых клеток. И наоборот, стимулирование гибели клеток является основным подходом к лечению большинства видов рака. Анти-апоптотическое действие пути Arg/N-дегрона позволяет предположить, что его активация может подавлять апоптоз и, тем самым, оказывать влияние на прогрессирование опухолевого заболевания.
Действительно, недавние исследования показали, что внутриклеточный уровень UBR5 (EDD), одной из ключевых убиквитин лигаз этого пути, часто увеличен при карциномах печени, легких и яичников, что также подтверждает возможность уменьшения выживаемости раковых клеток при ингибировании UBR5 (O'Brien P.M., Davies M.J., Scurry J.P., Smith A.N., Barton C.A., Henderson M.J., Saunders D.N., Gloss B.S., Patterson K.I., Clancy J.L., et al. The E3 ubiquitin ligase EDD is an adverse prognostic factor for serous epithelial ovarian cancer and modulates cisplatin resistance in vitro // Br. J. Cancer. 2008. V.98, pp.1085-1093).
Было показано, что другая убиквитин лигаза пути Arg/N-дегрона, UBR2, активируется в опухолях в ответ на кахектические стимулы, включая про-воспалительные цитокины (Zhang G., Lin R.K., Kwon Y.T., Li Y.P. Signaling mechanism of tumor cell-induced up-regulation of E3 ubiquitin ligase UBR2 // FASEB J. 2013. V.27, pp.2893-2901).
Наконец, генетические исследования с удалением генов отдельных Ubr-убиквитиновых лигаз в модельных организмах указывают на то, что этот путь положительно влияет на рост сосудов и подвижность клеток (Kwon Y.T., Kashina A.S., Davydov I.V., Hu R.-G., An J.Y., Seo J.W., Du F., Varshavsky A. An essential role of N-terminal arginylation in cardiovascular development // Science. 2002. V.297, pp.96-99; Kashina A. Protein arginylation, a global biological regulator that targets actin cytoskeleton and the muscle // Anat. Rec. (Hoboken). 2014. V.297, pp.1630-1636; An J.Y., Seo J.W., Tasaki T., Lee M.J., Varshavsky A., Kwon Y.T. Impaired neurogenesis and cardiovascular development in mice lacking the E3 ubiquitin ligases UBR1 and UBR2 of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103, pp.6212-6217).
Эти и другие данные подтверждают, что путь Arg/N-дегрона играет важную роль в положительной регуляции пролиферации, подвижности и выживаемости раковых клеток. Следовательно, ингибирование этого пути может являться потенциально эффективным подходом для лечения рака.
Компоненты пути Arg/N-дегрона представляют собой специфические убиквитин лигазы Е3 (N-рекогнины), которые могут узнавать дестабилизирующие N-концевые аминокислоты, называемые N-дегронами (Varshavsky A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis // Protein Sci. 2011. V.20, pp.1298-1345; Sriram S.M., Kwon Y.T. The molecular principles of N-end rule recognition // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1164-1165; Tasaki T., Zakrzewska A., Dudgeon D.D., Jiang Y., Lazo J.S., Kwon Y.T. The substrate recognition domains of the N-end rule pathway // J. Biol. Chem. 2009. V.284, pp.1884-1895). У человека и мыши есть четыре известных белка пути N-дегрона, UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, которые являются функционально избыточными (Hwang C.S., Sukalo M., Batygin O., Addor M.C., Brunner H., Aytes A.P., Mayerle J., Song H.K., Varshavsky A., Zenker M. Ubiquitin ligases of the N-end rule pathway: assessment of mutations in UBR1 that cause the Johanson-Blizzard syndrome // PLoS One. 2011. V.6, p.e24925; Kwon Y.T., Xia Z., Davydov I.V., Lecker S.H., Varshavsky A. Construction and analysis of mouse strains lacking the ubiquitin ligase UBR1 (E3alpha) of the N-end rule pathway // Mol. Cell. Biol. 2001. V.21, pp.8007-8021; Sultana R., Theodoraki M.A., Caplan A.J. Specificity in the actions of the UBR1 ubiquitin ligase in the degradation of nuclear receptors // FEBS Open Bio. 2013. V.3, pp.394-397; Tasaki T., Mulder L.C.F., Iwamatsu A., Lee M.J., Davydov I.V., Varshavsky A., Muesing M., Kwon Y.T. A family of mammalian E3 ubiquitin ligases that contain the UBR box motif and recognize N-degrons // Mol. Cell. Biol. 2005. V.25, pp.7120-7136) и важны для раннего эмбрионального развития (Kwon Y.T. et al. Female lethality and apoptosis of spermatocytes in mice lacking the UBR2 ubiquitin ligase of the N-end rule pathway // Mol. Cell. Biol. 2003. V.23, pp.8255-8271; Saunders D.N. et al. Edd, the murine hyperplastic disc gene, is essential for yolk sac vascularization and chorioallantoic fusion // Mol. Cell. Biol. 2004. V.24, pp.7225-7234; Tasaki T. et al. UBR box N-recognin-4 (UBR4), an N-recognin of the N-end rule pathway, and its role in yolk sac vascular development and autophagy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V.110, pp.3800-3805). Эти белки структурно отличаются и принадлежат к разным семействам убиквитин лигаз, поэтому разработка универсального низкомолекулярного ингибитора для всех четырех белков чрезвычайно сложна, если вообще возможна (Choi W.S. et al. Structural basis for the recognition of N-end rule substrates by the UBR box of ubiquitin ligases // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1175-1181; Kitamura K. Inhibition of the Arg/N-end rule pathway-mediated proteolysis by dipeptide-mimetic molecules // Amino Acids. 2016. V.48, pp.235-243; Lee M.J. et al. Synthetic heterovalent inhibitors targeting recognition E3 components of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105, pp.100-105; Matta-Camacho E. et al. Structural basis of substrate recognition and specificity in the N-end rule pathway // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1182-1187; Sriram S. et al. Development and characterization of monomeric N-end rule inhibitors through in vitro model substrates // J. Med. Chem. 2013. V.56, pp.2540-2546).
Для регулирования пути N-дегрона малыми молекулами были предложены дипептиды, а также гетеровалентные лиганды, которые имитируют N-дегроны и конкурентно связываются с убиквитин лигазами, предотвращая взаимодействие с их естественными субстратами (Kitamura K. Inhibition of the Arg/N-end rule pathway-mediated proteolysis by dipeptide-mimetic molecules // Amino Acids. 2016. V.48, pp.235-243; Lee M.J. et al. Synthetic heterovalent inhibitors targeting recognition E3 components of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105, pp.100-105; Baker R.T., Varshavsky A. Inhibition of the N-end rule pathway in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88, pp.1090-1094). В частности, указанные низкомолекулярные ингибиторы могут непосредственно связывать N- и UBR-домены UBR-убиквитин-лигаз (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5).
Было также обнаружено, что другие соединения, такие как дубильная кислота и мербромин, могут специфически и эффективно подавлять активность белка ATE1 в клетке, который является критическим ферментом пути Arg/N-дегрона, действующим на этапе до E3 лигазы (Saha S. et al. Small molecule inhibitors of arginyltransferase regulate arginylation-dependent protein degradation, cell motility, and angiogenesis // Biochem. Pharmacol. 2012. V.83, pp.866-873).
миРНК также использовались для подавления индивидуальных белков пути Arg/N-дегрона in vitro, что позволило изучить роли индивидуальных белков в деградации конкретных мишеней (Rageul J. et al. Conditional degradation of SDE2 by the Arg/N-End rule pathway regulates stress response at replication forks // Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.3996-4010; Cipolla L. et al. UBR5 interacts with the replication fork and protects DNA replication from DNA polymerase h toxicity // Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.11268-11283; Kim S.T. et al. The N-recognin UBR4 of the N-end rule pathway is required for neurogenesis and homeostasis of cell surface proteins // PLoS ONE. 2018. V.13, p.e0202260). Однако, все эти исследования по временному или частичному ингибированию пути N-дегрона проводились только на перевиваемых клеточных линиях in vitro.
На основании вышеизложенного можно заключить, что протеолитический путь Arg/N-дегрона является новой мишенью для противоопухолевой терапии, поскольку может положительно регулировать многие процессы, сопровождающие развитие онкологических заболеваний, включая ангиогенез, пролиферацию клеток, их подвижность и выживание. Следовательно, ингибирование пути Arg/N-дегрона может стать высокоэффективным подходом для терапии ряда онкологических заболеваний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на новом подходе, использующем в качестве мишеней для терапии рака UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона, с применением клинически апробированной технологии РНК-интерференции, при этом ингибирование данного пути также может усиливать действие химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, например, при лечении гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Указанный подход принципиально отличается от уже существующих средств и способов терапии ГЦК, поскольку обладает иным механизмом действия (РНК-интерференция), обеспечивающим подавление экспрессии целевых белков UBR-убиквитин-лигаз, относящихся к протеолитическому пути Arg/N-дегрона, что, в свою очередь, приводит к индукции спонтанного апоптоза в трансформированной клетке.
Кроме того, предложенный подход также отличается от вариантов комбинаторного лечения, применяющих миРНК в сочетании с химиотерапией или ингибиторами иммунных контрольных точек, поскольку такие комбинации, во-первых, не нацелены на путь Arg/N-дегрона, а, во-вторых, не предназначены для терапии ГЦК.
Кроме того, из уровня техники не известны специфические ингибиторы пути Arg/N-дегрона, нацеленные сразу на все четыре UBR-убиквитин-лигазы (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5). Ранее описанные низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на UBR-убиквитин-лигазы, ингибируют не только N-дегроновые убиквитин-лигазы, но и любые другие убиквитин-лигазы, которые содержат UBR-домен. Следует отметить, что существует семь известных убиквитин-лигаз, содержащих UBR-домен, при этом три из них не являются частью пути Arg/N-дегрона. Кроме того, указанные низкомолекулярные ингибиторы обладают иным механизмом действия, требуют больших доз и не позволяют реализовать адресную доставку в печень.
Таким образом, с учетом существующей потребности в разработке новых препаратов, методов или оптимизации известных схем лечения ГЦК, настоящее изобретение направлено на расширение арсенала доступных терапевтических средств, а также усовершенствование способов их адресной доставки в орган-мишень, с устранением одного или более недостатков согласно предшествующему уровню техники.
Целью настоящего изобретения является создание новых средств, композиций и способов для ингибирования протеолитического пути аргинин/N-дегрона с применением технологий РНК-интерференции, для обеспечения индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли, расширения арсенала способов и средств для лечения онкологических заболеваний, а также для повышения эффективности действия химиотерапевтических цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, применяющихся для терапии указанных онкологических заболеваний.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибирование по меньшей мере трех UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5) с применением молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) обеспечивает эффективное повреждение или по меньшей мере частичное разрушение трансформированных клеток вследствие индуцированного апоптоза, а также увеличивает чувствительность указанных трансформированных клеток к действию химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических и таргетных агентов, что в свою очередь приводит к увеличению эффективности указанных агентов, а также позволяет применять их в более низких дозах, тем самым улучшая профиль безопасности лечения и уменьшая побочные эффекты.
Согласно одному варианту реализации изобретения предложена молекула миРНК, снижающая уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, длиной по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно предпочтительному варианту реализации, указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно одному варианту реализации изобретения указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона.
Согласно одному варианту реализации изобретения в предложенной молекуле миРНК по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию. В предпочтительном варианте реализации указанная химическая модификация выбрана из 2'-O-метилнуклеотида, 3'-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 14.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 40.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 56.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 70.
Согласно дополнительному варианту реализации изобретения, указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, более предпочтительно клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена липидная наночастица, содержащая одну или более молекул миРНК согласно изобретению.
В предпочтительном варианте реализации указанная липидная наночастица содержит одну или более молекул миРНК, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 56 и SEQ ID NO. 70.
В одном из вариантов реализации изобретения предложенная липидная наночастица имеет размер, составляющий от 60 до 140 нм. Согласно другому варианту реализации предложенная липидная наночастица характеризуется дзета-потенциалом, составляющим от -15 до +15 мВ.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в трансформированной клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы миРНК согласно изобретению, липидной наночастицы согласно изобретению, фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют посредством внутривенной инъекции. В другом варианте реализации указанное введение осуществляют в дозе, составляющей от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг.
В другом варианте реализации указанное введение осуществляют один раз в неделю.
В еще одном варианте реализации указанное введение осуществляют два раза в неделю.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего 4 недели.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 5 недель.
Согласно дополнительному варианту реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 12 недель.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанный способ включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, который может представлять собой химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Отбор миРНК в экспериментах in vitro и in vivo. (А) Оценка уровня мРНК в культуре клеток Hepa1-6 после трансфекции 1 нМ миРНК, специфичными к Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5. Уровень мРНК анализировали через 24 часа после трансфекции. (Б) Кривые зависимости уровня мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в культуре клеток Hepa1-6 от концентрации миРНК. Уровень мРНК анализировали через 24 часа после трансфекции (среднее значение ± SD). Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем. (*P <0,05, ** P< 0,005, *** P< 0,0005, **** P 0,0001). (В) Оценка уровня Ubr мРНК в печени через 3 дня после инъекции соответствующих миРНК в составе липидных наночастиц (ЛНЧ). (Г) Зависимость уровня мРНК в клетках печени от дозы миРНК через 3 дня после инъекции ЛНЧ. (Д) Восстановление уровня мРНК и белка Ubr убиквитин лигаз в печени через 3, 5, 7, 10 или 15 дней после однократных инъекций соответствующих миРНК в составе ЛНЧ. (Е) Оценка тканеспецифической активности миРНК через 3 дня при системном введении в составе ЛНЧ. Для всех экспериментов in vivo количество повторов n=3 и результаты представлены в виде среднего ± SEM. Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем (*P <0,05, ** P< 0,005, *** P< 0,0005, **** P< 0,0001).
Фиг. 2. Эффект подавления экспрессии Ubr-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона in vitro. (А) Анализ уровня белков UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 методом иммуноблоттинга в клеточных культурах Hepa 1-6 и AML-12 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК siUbrs. (Б) Количественная оценка уровня экспрессии UBR белков в клеточных культурах Hepa 1-6 и AML-12 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК. (В) Asp1119-BRCA1f (образующийся из fDHFR-UbR48-Asp1119-BRCA1f) и Val1119-BRCA1f экспрессировали в культуре клеток Hepa 1-6, трансфицированных миРНК. Образцы клеточных лизатов анализировали методом гель-электрофореза по Лэммли и визуализировали иммуноблоттингом антителами к FLAG. (Г) Анализ уровня пролиферации клеток при окрашивании красителем нейтральным красным в культуре Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 10 нМ миРНК. (Д) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 10 нМ миРНК. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Шкала 100 мкм. (Е) Тест на миграцию клеток проводили на культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по критерию Стьюдента (*P 0,01).
Фиг. 3. Фенотип, наблюдаемый in vitro при подавлении экспрессии Ubr убиквитин лигаз является результатом прямого специфичного действия миРНК. (А) Анализ миграции клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции двумя различными смесями миРНК, специфичных к Ubr убиквитин лигазам (10 нМ). (Б) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции двумя различными смесями миРНК (10 нМ). Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-позитивными клетками. Шкала -100 мкм. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*Р <0,05).
Фиг. 4. Подавление Ubr убиквитин лигаз приводит к активации апоптоза. Анализ уровня гибели клеток методом проточной цитометрии при окрашивании Аннексином V /7AAD культуры клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*Р <0,05).
Фиг. 5. Продолжительное подавление экспрессии Ubr-убиквитин лигаз в печени вызывает воспаление. В течение 4 недель дважды в неделю мыши получали инъекцию миРНК в липидных наночастицах. Комбинированная доза липидных частиц содержала по 0,3 мг/кг миРНК UBR1, UBR2 и UBR5 и 0,5 мг/кг миРНК UBR4, общая доза по всем миРНК 1,4 мг/кг. Контрольные мыши получали инъекцию липидных частиц LNP-siCtrl с контрольной миРНК к люциферазе в дозе 1,4 мг/кг. (А) Уровень мРНК и (Б) уровень белков UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в печени мышей после инъекции липидных частиц. Уровень UBR5 в печени не определялся. (В) Кривая массы тела животных, получавших инъекции ЛНЧ. Масса животных измерялась перед каждой инъекцией ЛНЧ и усреднялась по группе. Изменения массы животного выражались в процентах от исходной массы животного в начальный день эксперимента (0 день). (Г) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в клетках печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Масштаб 100 мкм. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P 0,02). (Д) Окрашивание гематоксилином и эозином тканей печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ. Масштаб 200 мкм (10x) и 100 мкм (20x). (Е) Анализ представленности популяций нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов в печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (Ж) % нейтрофилов, Ly6Chigh макрофагов или эозинофилов в печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ или носителя, гейтированные на CD45+ клетки. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=5 мышей на группу.
Фиг. 6. Характеристика селезенки при хроническом подавлении экспрессии Ubr-убиквитин лигаз. (А) Уровни мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в селезенке мышей, после инъекций смеси ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. (Б) Анализ представленности популяций нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов в селезенке мышей, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (В) % нейтрофилов, Ly6Chigh макрофагов и эозинофилов в селезенке мышей, получавших инъекции ЛНЧ, нормированных на CD45+ клетки Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=5 мышей на группу. Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем (*P <0,05, ***P< 0,0005, ****P< 0,0001).
Фиг. 7. Экспрессия уровня Ubr-убиквитин лигаз в печени мышей с ГЦК. Уровни мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в печени здоровых мышей и мышей с ГКК определяли после инъекций ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 в течение 5 недель. Инъекции проводили дважды в неделю, суммарная доза миРНК в смеси составляла 1,4 мг/кг. (***Р< 0,0005, ****Р< 0,0001).
Фиг. 8. Подавление экспрессии Ubr-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона в модели гепатоклеточной карциномы (ГЦК) увеличивает опухолевую нагрузку и воспаление. Схема эксперимента: временная шкала индукции опухоли (инъекция онкоген-кодирующих плазмид) и режим инъекций ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. Инъекции ЛНЧ-миРНК проводили в течение 4 недель (А) или в течение 5 недель (Б), один или два раза в неделю. Образцы ткани для анализа извлекали на 66 день после индукции опухоли. (В-Г) Анализ соотношения массы печени к массе тела животных с индуцированной гепатоклеточной карциномой и получавших инъекции ЛНЧ-миРНК в течение 4 недель (В) или 5 недель (Г). Соотношение масса печени/масса тела в каждой группе соотносили к контрольной группе мышей с ГЦК. (Д) Анализ представленности популяций нейтрофилов, и Ly6Chigh макрофагов в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (Е) % нейтрофилов and Ly6Chigh макрофагов в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ-миРНК, нормированных на CD45+ клетки. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=3-10 мышей на группу. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P <0,05).
Фиг. 9. Подавление экспрессии UBR-убиквитиновых лигаз пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз in vitro. (А) Анализ пролиферации клеток Hepa 1-6 cells после ко-трансфекции миРНК и добавления доксорубицина (левая панель) или только доксорубицина (правая панель). (Б-В) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК к UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и 48-часовой инкубации в присутствии доксорубицина. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Масштаб 100 мкм. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (****P <0,0001).
Фиг. 10. Нокдаун UBR-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз in vitro. (А) Анализ пролиферации клеток Hepa 1-6 cells после ко-трансфекции миРНК и добавления стауроспорина (левая панель) или только стауроспорина (правая панель). (Б) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и 24-часовой инкубации в присутствии 50 нМ стауроспорина. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. P-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (**Р <0,001, ****Р <0,0001).
Фиг. 11. Химиотерапия при ГЦК эффективнее в условиях подавления пути Arg/N-дегрона. (А) Схема эксперимента: хронология индукции опухоли (инъекция онкоген-кодирующих плазмид) и инъекций миРНК в составе ЛНЧ (черная шкала) и доксорубицина (серая шкала). Ткани для анализа извлекали на 68-й день после индукции опухоли. (Б) Окрашивание гематоксилином и эозином срезов тканей печени мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ и доксорубицина. Шкала 100 мкм. (В) Анализ методом проточной цитометрии нейтрофилов, макрофагов и дендритных клеток в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 и доксорубицина.
Фиг. 12. Химиотерапия гепатоклеточной карциномы проходит эффективнее в условиях подавления пути Arg/N-дегрона. (А) Анализ соотношения массы печени к массе тела животных с индуцированной гепатоклеточной карциномой и получавших в течение 4 недель инъекции ЛНЧ с дозой 1 мг/кг и дополнительно получавших или не получавших доксорубицин. n=10-18 мышей на группу. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. (Б) Кривая массы тела животных, получавших инъекции ЛНЧ. Масса животных измерялась перед каждой инъекцией ЛНЧ и усреднялась по группе. Изменения массы животного выражались в процентах от исходной массы животного в день первой инъекции. (В) Срезы печени прокрашивали антителами к маркеру пролиферации Ki67 n=4 мыши на группу. (Г) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в срезах печени. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками Шкала 100 мкм. n=2-3 мыши на группу. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P <0,05, ***P<0,001, ****P< 0,0001).
Фиг. 13. Распределение липидных частиц по размерам, полученное методом динамического светорассеяния. (А) ЛНЧ с миРНК UBR1; (Б) ЛНЧ с миРНК UBR2; (В) ЛНЧ с миРНК UBR4; (Г) ЛНЧ с миРНК UBR5; (Д) ЛНЧ с миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 (миРНК siUbr); (Е) ЛНЧ с контрольной миРНК, специфичной к мРНК люциферазы (миРНК Ctrl).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к использованию в качестве мишеней для терапии рака UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона, с применением клинически апробированной технологии РНК-интерференции, при этом ингибирование данного пути также может усиливать действие химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, при лечении опухолевых заболеваний.
Согласно одному варианту реализации изобретения предложены молекулы миРНК, снижающие уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанные молекулы миРНК содержат смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, длиной по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно предпочтительному варианту реализации, указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно одному варианту реализации изобретения указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона.
Согласно одному варианту реализации изобретения в предложенной молекуле миРНК по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию. В предпочтительном варианте реализации указанная химическая модификация выбрана из 2'-O-метилнуклеотида, 3'-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 14.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 40.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 56.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 70.
Согласно дополнительному варианту реализации изобретения, указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку. Более предпочтительно указанная опухолевая клетка представляет собой клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена липидная наночастица, содержащая одну или более молекул миРНК согласно изобретению.
В предпочтительном варианте реализации указанная липидная наночастица содержит одну или более молекул миРНК, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 56 и SEQ ID NO. 70.
В одном из вариантов реализации изобретения предложенная липидная наночастица имеет размер, составляющий от 60 до 140 нм.
Согласно еще одному варианту реализации предложенная липидная наночастица характеризуется дзета-потенциалом, составляющим от -15 до +15 мВ.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В еще одном предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В еще одном предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в трансформированной клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы миРНК согласно изобретению, липидной наночастицы согласно изобретению, фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют посредством внутривенной инъекции. В другом варианте реализации указанное введение осуществляют в дозе, составляющей от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг.
В другом варианте реализации указанное введение осуществляют один раз в неделю.
В еще одном варианте реализации указанное введение осуществляют два раза в неделю.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего 4 недели.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 5 недель.
Согласно дополнительному варианту реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 12 недель.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанный способ включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, который может представлять собой химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Указанные и другие варианты реализации изобретения подробно описаны в Примерах ниже.
ПРИМЕРЫ
Подавление экспрессии UBR-убиквитин лигаз in vitro
Для подавления экспрессии мышиных мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5, был проведен скрининг 10 лучших кандидатов миРНК для каждой UBR-убиквитин-лигазы в линии клеток Hepa 1-6 (фиг. 1A). Для предотвращения подавления побочных мишеней, миРНК были отобраны на основании нескольких известных критериев. В результате были выбраны две наиболее эффективные миРНК для каждой UBR-убиквитин-лигазы и использованы в дальнейших исследованиях (фиг. 1Б). Полученные низкие концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) позволяют использовать низкие концентрации миРНК, что дополнительно уменьшает вероятность побочных эффектов. Было показано, что 0,25 нМ каждой миРНК достаточно для достижения снижения уровня белка на 70-80% после 72 часов воздействия в клетках Hepa 1-6 и AML-12 (фиг. 2А и 2Б). Затем нами был использован репортер деградации Asp1119-BRCA1 для доказательства того, что наблюдаемое подавление UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона является достаточным для снижения функциональной активности пути. Эта репортерная система состоит из контрольной FLAG-меченной дигидрофолатредуктазы мыши (fDHFR-UbR48), связанной с FLAG-меченной изучаемой мишенью пути Arg/N-дегрона. Котрансляционное расщепление белка Ub деубиквитилазами дает как белок с исследуемым N-концевым остатком, так и фрагмент контрольного белка в эквимолярном соотношении. В нормальных условиях про-апоптотический фрагмент белка BRCA-1 (Asp-BRCA1) разрушается UBR-убиквитин-лигазами пути Arg/N-дегрона и, следовательно, должен накапливаться, если функциональная активность пути нарушена. Действительно, замедленная деградация про-апоптотического фрагмента BRCA1 наблюдалась, когда клетки Hepa 1-6 обрабатывали миРНК против Ubrs (фиг. 2В), что указывает на ингибирование функциональной активности пути Arg/N-дегрона в нашей системе.
Известно, что путь Arg/N-дегрона положительно регулирует пролиферацию и миграцию клеток. Далее авторы настоящего изобретения подтвердили, что подавление UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 снижало пролиферацию и миграцию клеток Hepa 1-6 через 72 ч после воздействия миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 (siUbrs) по сравнению с контролем миРНК (siCtrl) (фиг. 2Г-2Е; фиг. 3A). С другой стороны, путь Arg/N-дегрона ответственен за деградацию проапоптотических фрагментов. Следовательно, подавление UBR-убиквитин-лигаз должно приводить к увеличению спонтанного апоптоза в клетках, предварительно трансфицированных миРНК siUbr. Спонтанный апоптоз был повышен на 3-8% по сравнению с контрольной группой, что продемонстрировали результаты анализа методом TUNEL (фиг. 2E) и окрашивания аннексином V (фиг. 4). Авторы настоящего изобретения не обнаружили положительных 7-аминоактиномициновых D (7AAD) клеток, что указывает на то, что в клетках, обработанных миРНК-siUbr, была увеличена гибель только апоптотических клеток. Результаты in vitro также были проверены с использованием второго набора высокоэффективных миРНК siUbr (фиг. 3), подтверждая прямое влияние подавления UBR-убиквитин-лигаз на пролиферацию, миграцию и апоптоз клеток.
Подавление экспрессии UBR-убиквитин лигаз в здоровой печени мыши
Выбранные миРНК для подавления экспрессии UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 убиквитин лигаз были индивидуально упакованы в липидные наночастицы с использованием липидоида C12-200, и далее были проверены на активность подавления мишеней in vivo через 72 часа после однократной внутривенной инъекции в дозе 0,25 мг/кг (каждая миРНК) (фиг. 1В). Поскольку возможно упаковывать сразу несколько разных миРНК в одну ЛНЧ, то авторы настоящего изобретения получили ЛНЧ, содержащие как одну, так и все четыре миРНК для подавления убиквитин-лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Благодаря своим размерам (80-90 нм) и почти нейтральному заряду, ЛНЧ с миРНК легко проходят через эндотелиальные слои, которые отделяют гепатоциты от кровотока, и в дальнейшем интернализуются гепатоцитами посредством макропиноцитоза. Биологическое распределение таких ЛНЧ с миРНК на основе липидоида C12-200 после внутривенной инъекции мышам было оценено ранее и подтверждено, что подавление мишеней происходило только в клетках печени. Наиболее эффективные ЛНЧ-миРНК (si1-6, si2-9, si4-7 и si5-4; Таблица 1) были выбраны для проведения экспериментов по зависимости подавления мишени от дозы миРНК, восстановлению уровня экспрессии мишени от времени после единичной инъекции и биораспределению (фиг. 1Г-1Е), а также всех дальнейших экспериментов в этом исследовании. Однократное введение ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в дозах от 0,125 до 0,5 мг/кг приводило к сильному снижению уровня мРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 (80-85%) в печени здоровых животных через 72 ч после инъекции (фиг. 1Г). Ни одна из протестированных доз не привела к гибели животных, что свидетельствует о том, что эффективное подавление экспрессии UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 возможно при использовании количеств миРНК гораздо ниже максимально переносимой дозы. В селезенке, почке, легких и костном мозге не было выявлено значительного подавления мишени. Тем не менее, 50-60% нокдаун Ubrs наблюдался в висцеральной жировой ткани (фиг. 1Е), возможно, из-за доставки в периферические макрофаги. Подавление мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4, Ubr5 в печени здоровых животных более чем на 60% продолжалось, по меньшей мере 10 дней, что обеспечивает удобный режим инъекций раз в неделю при многократном применении. Хроническое применение ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 показало, что длительное подавление UBR-убиквитин-лигаз может быть достигнуто в печени здоровых мышей без индукции значительной гепатотоксичности (фиг. 3). Самки мышей линии C57BL/6 получали инъекцию ЛНЧ-миРНК (суммарно 1,4 мг/кг миРНК) в течение 4 недель. Хотя уровни АЛТ, АСТ и АЛП были увеличены у мышей, получавших ЛНЧ-миРНК (Таблица 2), не наблюдалось значительного изменения веса или различий в поведении мышей между группами (фиг. 5В), что указывает на хорошую переносимость ЛНЧ-миРНК. Было достигнуто подавление мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в печени на 75-90% по сравнению с контрольной группой, которой вводили фосфатно-солевой буфер; однако снижение уровней мРНК всех Ubrs также наблюдалось в группе с контрольной ЛНЧ-миРНК. При этом снижение уровня мРНК Ubr не наблюдалось при многократных инъекциях в меньшей или равной дозе контрольными ЛНЧ-миРНК siCtlr, с миРНК к люциферазе (фиг. 7). Также не наблюдалось никаких фенотипических различий между здоровыми животными и группой получавшей ЛНЧ-миРНК.
Таблица 1. Последовательности миРНК, протестированные и использованные в данном исследовании.
Последовательности смысловой цепи | Последовательности антисмысловой цепи | ||
si-Ctrl | si-LUC | cuuAcGcuGAGuAcuucGATsT | UCGAAGuACUcAGCGuAAGTsT |
si-Ubr1 | si-1-1 | caAAGuAGuGuucauAAAAdTsdT | UUUuAUGAAcACuACUUUGdTsdT |
si-1-2 | ccuucGGuGAuAAaAuAcAdTsdT | UGuAUUUuAUcACCGAAGGdTsdT | |
si-1-3 | gguuAuGGcucAccAGAAAdTsdT | UUUCUGGUGAGCcAuAACCdTsdT | |
si-1-4 | gacuuuAGAcAGAuAuuuudTsdT | AAAAuAUCUGUCuAAAGUCdTsdT | |
si-1-5 | gacAGGAAcAAuAaAuucAdTsdT | UGAAUUuAUUGUUCCUGUCdTsdT | |
si-1-6 | caGAcuAGGuGcuauuucAdTsdT | UGAAAuAGcACCuAGUCUGdTsdT | |
si-1-7 | gauuAAAcAGuAuaAuAcAdTsdT | UGuAUuAuACUGUUuAAUCdTsdT | |
si-1-8 | gcuuAGAGAAuGucAuAAAdTsdT | UUuAUGAcAUUCUCuAAGCdTsdT | |
si-1-9 | ggcccGGcuGuuAcuGAAAdTsdT | UUUcAGuAAcAGCCGGGCCdTsdT | |
si-1-10 | caGAAuAucGGGuuAuAAudTsdT | AUuAuAACCCGAuAUUCUGdTsdT | |
si-Ubr2 | si-2-1 | gauGGuGAAcAGccAAucAdTsdT | UGAUUGGCUGUUcACcAUCdTsdT |
si-2-2 | ccAAGAAAAAGuuaGcAuudTsdT | AAUGCuAACUUUUUCUUGGdTsdT | |
si-2-3 | auuGuuAAGcAAAaGuGAAdTsdT | UUcACUUUUGCUuAAcAAUdTsdT | |
si-2-4 | aaGuGAAGuGGcAuAuAAAdTsdT | UUuAuAUGCcACUUcACUUdTsdT | |
si-2-5 | aguGAAGuGGcAuauAAAudTsdT | AUUuAuAUGCcACUUcACUdTsdT | |
si-2-6 | aguGGcAuAuAAAuuuccAdTsdT | UGGAAAUUuAuAUGCcACUdTsdT | |
si-2-7 | gcuccuAccucuAaGuGAAdTsdT | UUcACUuAGAGGuAGGAGCdTsdT | |
si-2-8 | gauAGAAcAuccucuuAGAdTsdT | UCuAAGAGGAUGUUCuAUCdTsdT | |
si-2-9 | ggcGAGAGAuGuucGAcAAdTsdT | UUGUCGAAcAUCUCUCGCCdTsdT | |
si-2-10 | gacuAuGGGAAGAgAuucAdTsdT | UGAAUCUCUUCCcAuAGUCdTsdT | |
si-Ubr4 | si-4-1 | caAAGAAGAuGAcuAcGAAdTsdT | UUCGuAGUcAUCUUCUUUGdTsdT |
si-4-2 | gcAAGuGuAGuucaGuGAAdTsdT | UUcACUGAACuAcACUUGCdTsdT | |
si-4-3 | gaAccuAGGGuuuccGAAAdTsdT | UUUCGGAAACCCuAGGUUCdTsdT | |
si-4-4 | gcAuuuGGcuGuuaGccAudTsdT | AUGGCuAAcAGCcAAAUGCdTsdT | |
si-4-5 | cgAucAAccuGuAcuAcAAdTsdT | UUGuAGuAcAGGUUGAUCGdTsdT | |
si-4-6 | cacGGAGcAuuGuauuAcAdTsdT | UGuAAuAcAAUGCUCCGUGdTsdT | |
si-4-7 | ggAcAuGAccAcAgGuAcAdTsdT | UGuACCUGUGGUcAUGUCCdTsdT | |
si-4-8 | gccGGuAucAAGAacAAcAdTsdT | UGUUGUUCUUGAuACCGGCdTsdT | |
si-4-9 | ccAuGGAAAuGAGauuGAAdTsdT | UUcAAUCUcAUUUCcAUGGdTsdT | |
si-4-10 | gcuuGAGuGuGuAcAucuudTsdT | AAGAUGuAcAcACUcAAGCdTsdT | |
si-Ubr5 | si-5-1 | agcuGAAcAAGuAcAAuuudTsdT | AAAUUGuACUUGUUcAGCUdTsdT |
si-5-2 | ggAGcAGGcuAcuauuAAAdTsdT | UUuAAuAGuAGCCUGCUCCdTsdT | |
si-5-3 | ggcAcAAGuuGuucuAcAAdTsdT | UUGuAGAAcAACUUGUGCCdTsdT | |
si-5-4 | ugAuAAGGAuGGAacAAAAdTsdT | UUUUGUUCcAUCCUuAUcAdTsdT | |
si-5-5 | guAGcuAcuGAAAauAAcAdTsdT | UGUuAUUUUcAGuAGCuACdTsdT | |
si-5-6 | ccGAGAAGAcuGAaAuAcudTsdT | AGuAUUUcAGUCUUCUCGGdTsdT | |
si-5-7 | gcGcucAGAAAGAaAuAcAdTsdT | UGuAUUUCUUUCUGAGCGCdTsdT | |
si-5-8 | gaAucAGGGAGGAucGcAAdTsdT | UUGCGAUCCUCCCUGAUUCdTsdT | |
si-5-9 | ggcuucGuccAAAaAGAAAdTsdT | UUUCUUUUUGGACGAAGCCdTsdT | |
si-5-10 | caGccAAuuGGAAaAuGcAdTsdT | UGcAUUUUCcAAUUGGCUGdTsdT |
Прописные буквы: обозначают рибонуклеотиды;
Строчные буквы: обозначают 2'-O-метил-нуклеотиды;
s: обозначает тиофосфатную межнуклеозидную связь
Таблица 2. Влияние длительного подавления Ubr-убиквитин лигаз N-концевого правила в печени мыши на показатели химического состава сыворотки крови.
PBS | LNP-siCtrl | LNP-siUbrs | ANOVA P-критерий | |
ALP (Ед/л) | 102 ± 11 | 88 ± 10 | 212 ± 54 | 0.0001 |
AST (Ед/л) | 102 ± 34 | 106 ± 35 | 207 ± 59 | 0.0038 |
ALT (Ед/л) | 19 ± 4 | 23 ± 3 | 62 ± 21 | 0.0006 |
BUN (мг/дл) | 32 ± 5 | 31 ± 2 | 27 ± 4 | 0.1830 |
Альбумин (г/дл) | 2.9 ± 0.1 | 2.9 ± 0.1 | 2.6 ± 0.2 | 0.0007 |
Общий билирубин (мг/дл) | 0.16 ± 0.05 | 0.10 ± 0.00 | 0.20 ± 0.07 | 0.0302 |
Общий белок (г/дл) | 4.7 ± 0.1 | 5.0 ± 0.1 | 4.3 ± 0.3 | 0.0001 |
Глобулин (г/дл) | 1.7 ± 0.1 | 2.1 ± 0.1 | 1.7 ± 0.1 | <0.0001 |
Холестерин (мг/дл) | 75 ± 4 | 86 ± 10 | 32 ± 3 | <0.0001 |
ALP: щелочная фосфатаза; AST: Аспартатаминотрансфераза; ALT: Аланинаминотрансфераза; BUN: азот мочевины крови; LNP - липидные наночастицы
Введение контрольных ЛНЧ-миРНК немного снижала уровень белка UBR4, что могло быть результатом ускоренной лизосомальной деградации UBR4. Действительно, многократные инъекции ЛНЧ-миРНК могут привести к значительному накоплению липидов в клетках печени и увеличению аутофагии, что, в свою очередь, инициирует деградацию лизосом. Наконец, хроническое подавление UBR-убиквитин-лигаз привело к небольшому, но значительному увеличению апоптотических клеток и расширению межклеточного пространства в печени (фиг. 5Г и 5Д), что подтверждает уменьшение активности пути Arg/N-дегрона в этом органе. Еще одним значимым результатом является инфильтрация мононуклеарных клеток в печени мышей, получавших ЛНЧ, содержащие миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 (фиг. 5Д). С помощью проточной цитометрии были идентифицированы нейтрофилы, макрофаги Ly6Chigh и эозинофилы (фиг. 5Е и 5Ж), что указывает на наличие хронического воспаления в печени. Эти популяции клеток также были увеличены в селезенке тех же животных (фиг. 6Б и 6В), что, по-видимому, является следствием воспаления, присутствующего в печени, а не влияния пути Arg/N-дегрона в селезенке, поскольку в селезенке не наблюдалось подавления мРНК UBR-убиквитин-лигаз (фиг. 6A).
Подавление пути N-дегрона в спонтанной модели ГЦК
Чтобы оценить эффекты подавления пути Arg/N-дегрона на ГЦК, авторы настоящего изобретения использовали спонтанную модель ГЦК, разработанную Твардом и др. Вкратце, плазмиды, кодирующие белок MET человека, белок DN90-бета-катенин человека и транспозазу Sleeping Beauty доставлялись в гепатоциты методом гидродинамической инъекции, далее онкогены интегрировались в геном клеток с помощью транспозазы. Через 5 недель после инъекции плазмид, было показано наличие альфа-фетопротеина (биомаркер ГЦК) в сыворотке крови мышей, а к концу 10-й недели печень значительно увеличивается до массового отношения печени к телу от 15% до 40 % против 4-5% у контрольных животных. Ранее авторы настоящего изобретения продемонстрировали эффективную доставку ЛНЧ-миРНК в клетки опухоли, которые развиваются у мышей после инъекции плазмиды. Поскольку ранее сообщалось, что UBR5 и UBR2 оверэкспрессированы при некоторых типах рака, то авторы настоящего изобретения оценили уровень экспрессии мРНК у всех четырех UBR-убиквитин лигаз и обнаружили, что ни одна из них не была повышена в нашей специфической модели ГЦК (фиг. 7). Влияние подавления пути Arg/N-дегрона на опухолевую нагрузку оценивали путем инъекции ЛНЧ-миРНК мышам с опухолями в течение 4 или 5 недель, один или два раза в неделю (фиг. 7, 8А и 8Б). ЛНЧ-миРНК содержали Ubr или контрольную миРНК, доза составляла 1,4 мг/кг. Во всех испытанных схемах подавление целевых UBR-убиквитин-лигаз с высокой дозой ЛНЧ-миРНК приводило к увеличению отношения печени к массе тела и развитию ГЦК (фиг. 8В и 8Г). Увеличенные популяции нейтрофилов и клеток Ly6Chigh также наблюдались в селезенках животных с ГЦК, получавших ЛНЧ-миРНК siUbr два раза в неделю (фиг. 8Д и 8Е), демонстрируя рост воспаления у этих животных - хорошо известного фактора развития и прогрессирования ГЦК. Как следствие, авторы настоящего изобретения повторно проанализировали режим инъекций ЛНЧ-миРНК и выбрали более низкую дозу и частоту инъекций для последующих экспериментов, чтобы уменьшить наблюдаемое воспаление.
Подавление пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз
Чтобы замедлить развитие ГЦК в результате подавления пути Arg/N-дегрона за счет уменьшения пролиферации и увеличения апоптоза в раковых клетках, и одновременно избегая при этом воспаления, была принята следующая стратегия: комбинаторное применение препаратов, индуцирующих апоптоз, в сочетании с уменьшенной дозой миРНК против убиквитин лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Этот подход был сначала опробован in vitro на клеточной линии гепатоцитов для оценки эффекта влияния подавления убиквитин лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в присутствии стауроспорина или доксорубицина на пролиферацию и апоптоз. Клетки Hepa 1-6 трансфецировали миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и через 72 часа добавляли доксорубицин (фиг. 9) или стауроспорин (фиг. 10) с последующим ожиданием в течение 48 или 24 часов, соответственно. Пролиферация клеток ингибировалась при более низких дозах миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, когда доксорубицин дополнительно добавлялся к клеткам (фиг. 9А). Действительно, при 0,156 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, когда пролиферация клеток ингибируется на 15-25%, добавление доксорубицина в дозах, не влияющих на пролиферацию (фиг. 9А, правый график), усиливает этот фенотип еще на 15-20%. Что касается апоптоза, обработка клеток только миРНК к UBR-убиквитин-лигазам приводит к увеличению на 4-5% апоптотических клеток по сравнению с контролем. Тем не менее, когда миРНК используются в сочетании с апоптоз-индуцирующими препаратами, апоптоз увеличивается на 11,5-13,5% по сравнению с контролем (фиг. 9Б и 9В). Следовательно, комбинаторный подход уменьшает пролиферацию и увеличивает апоптоз при более низких дозах миРНК и низкомолекулярных соединений, индуцирующих апоптоз, которые в противном случае были бы неэффективны по одиночке. Это демонстрирует, что оба подхода действуют синергически, позволяя уничтожить раковые клетки при меньших концентрациях действующих веществ.
Наконец, комбинаторный подход был протестирован на модели мыши с спонтанной ГЦК. Мышам с ГЦК альтернативно вводили ЛНЧ-миРНК в количестве 1 мг/кг и/или доксорубицин (2 мг/кг или 4 мг/кг) каждые 3-4 дня в общей сложности в течение 4 недель, начиная на 37 день после инъекции плазмид, индуцирующих ГЦК (фиг. 11A). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что длительное подавление пути Arg/N-дегрона в сочетании с применением химиотерапевтического агента приводило к ингибированию прогрессирования ГЦК. Относительный вес печени был снижен в среднем на 30% по сравнению с контролем (фиг. 12А), а опухолевая нагрузка была значительно ниже, чем нагрузка, наблюдаемая с одним доксорубицином и контрольной ЛНЧ-миРНК с доксорубицином. Морфология печени ГЦК, обработанной ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 и доксорубицином, напоминала нормальную ткань печени, в отличие от всех других групп, что указывает на снижение пролиферации и меньшее повреждение ткани (фиг. 11Б). Уменьшенная доза ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5, используемая в этом случае, позволила избежать увеличения воспалительных иммунных клеток (фиг. 11В). Кроме того, доксорубицин не оказывает непосредственного влияния на воспаление и не влияет на жизнеспособность иммунных клеток, о чем свидетельствует одинаковая или увеличенная популяция нейтрофилов, макрофагов или дендритных клеток в селезенке мышей, получавших LNP и доксорубицин (фиг. 11Б). Чтобы продемонстрировать влияние комбинаторного лечения на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток, окрашивали фиксированные срезы печени по белку Ki67, маркера клеточной пролиферации (фиг. 12Б).
У животных, получавших ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5, Ki67-положительные клетки уменьшались в среднем на 6% по сравнению с контролем, и добавление доксорубицина увеличивает разницу до 9% (р = 0,0001, тест Манна-Уитни). Наконец, обработка доксорубицином привела к значительному увеличению TUNEL-положительного окрашивания в печени мышей с ГЦК, получавших ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 (фиг. 12Г). Вместе эти данные свидетельствуют о том, что комбинированные эффекты подавления пути Arg/N-дегрона с использованием химиотерапии на прогрессирование гепатоцеллюлярной карциномы опосредованы не модуляцией воспалительного ответа, а прямым подавлением пролиферации и увеличением апоптоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии клеток и трансфекция
Линии гепатоцитов мышей Hepa 1-6 и AML-12 (ATCC, Manassas, VA) выращивали в среде DMEM, с добавлением 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Gibco, Waltham, MA) и 2 мМ L-глютамином (Gibco) без антибиотиков. Работа с клетками проводилась при конфлюентности 80%. Плазмиды трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Waltham, MA), а миРНК - Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), в соответствии с инструкциями производителя.
Разработка и селекция миРНК, упаковка в состав ЛНЧ
Авторы настоящего изобретения разработали и выбрали химически модифицированные миРНК, на основании последовательности мРНК мышиных Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 (10 миРНК на ген) (номера NCBI GenBank: NM_009461.2, GenBank: NM_001177374.1, GenBank: NM_001160319.1 и GenBank: NM_00. 3). миРНК были отобраны таким образом, чтобы избежать неспецифической активности, на основании нескольких известных критериев. Последовательности 19-звенных кандидатов были сопоставлены с базой данных мРНК (RefSeq) и оценены по их способности связываться вне целевой мишени. В частности, миРНК были ранжированы на основе количества/положений несоответствий в разных частях и несоответствий в положении сайта расщепления. Полученные последовательности дополнительно проверяли, чтобы исключить наличие известных мотивов микроРНК и мотивов иммуностимулирующих последовательностей. Введение 2'-O-метил (2'-OMe) пиримидиновых нуклеотидов в миРНК дополнительно снижает иммунный ответ и возможность неспецифичного действия, а вместе с использованием 3'-межнуклеотидных тиофосфатов повышает стабильность против нуклеаз. Эффективность миРНК к мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5, изучали путем трансфекции клеток Hepa 1-6 с последующим анализом методом обратной транскрипции с последующим ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) через 24 часа. Для дальнейших исследований была выбрана миРНК с наименьшей IC50 и наибольшей эффективностью понижения мРНК мишени (Таблица 1). Контрольная миРНК к мРНК люциферазы светлячка (siCtrl). миРНК были упакованы в липидные наночастицы (ЛНЧ), как описано ранее. Вкратце, ЛНЧ были получены путем смешивания растворов миРНК в кислом водном буфере и липидов в этаноле (3:1, по объему) с использованием микрофлюидного устройства NanoAssemblr (Precision NanoSystems), как описано ранее. миРНК (0,4 мг/мл для отдельной миРНК или 0,1 мг/мл каждая для смеси из четырех) разводили в 10-мМ цитратном буфере (рН 3,0), а смесь липидов (С12 -20045: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC, 850365; Avanti Polar Lipids): холестерин (S8667; Sigma-Aldrich): PEG-липид (880150; Avanti Polar Lipids)) получали в мольном соотношении 50:10:38,5:1,5 в этаноле (всего 8,83 мг/мл).
Растворы миРНК и липидов смешивали со скоростью 10 мл/мин в соответствии с протоколом производителя. Конечное массовое соотношение миРНК:С12-200 после смешивания составляло 1:5. Суспензию ЛНЧ-миРНК разбавляли стандартным фосфатно-солевым буфером, далее проводили диализ 500 объемами стандартного фосфатно-солевого буфера при pH 7,4 в диализных кассетах с мембраной, отделяющей соединения с молекулярной массой 20000 Да (MW) (66012; Thermo Fisher Scientific) 18 часов и фильтровали через шприцевой фильтр из полиэфирсульфона (PES) (поры 0,2 мм) (3915; Corning). Измерения размера частиц и зета-потенциала проводили с использованием Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical) в соответствии с протоколом производителя (фиг. 13; Таблица 3). Измерения зета-потенциала проводили в условиях нейтрального рН. Указанные значения являются средней величиной для 10-25 повторов. Эффективность включения миРНК в ЛНЧ определяли с использованием реагента Quant-iT RiboGreen (R11491; Thermo Fisher Scientific), как описано ранее.
Таблица 3. Параметры липидных наночастиц (LNP), использованных для доставки миРНК, в данном исследовании.
LNP-siRNA | Размер частиц, нм | Индекс полидисперсности, PdI | Зета-потенциал |
LNP si-Ubr1 | 84,5 ± 1,1 | 0,093 | 3,2 ± 1,7 |
LNP si-Ubr2 | 85,9 ± 0,6 | 0,100 | 3,7 ± 1,7 |
LNP si-Ubr4 | 85,4 ± 0,7 | 0,094 | 3,4 ± 1,4 |
LNP si-Ubr5 | 92,1 ± 2,0 | 0,100 | 3,2 ± 1,2 |
LNP si-Ubrs | 94,8 ± 3,7 | 0,130 | 2,9 ± 1,5 |
LNP si-Ctrl | 80,0 ± 0,8 | 0,062 | 3,9 ± 1,5 |
Синтез кДНК и ПЦР-РВ
Для выделения общей РНК ткани печени лизировали с использованием TRIzol (Invitrogen) с использованием прибора MP FastPrep-24 и набора реагентов Lysing Matrix D (MP Biomedicals) с последующим осаждением изопропанолом в соответствии с инструкциями производителя. кДНК получали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems). Уровни мРНК оценивали с помощью наборов для проведения ПЦР-РВ с использованием SYBR Green (Thermo Fisher Scientific) в термоциклере QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Количества мРНК были нормализованы с использованием мРНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (mGAPDH) мыши. Список праймеров приведен в таблице 4.
Таблица 4. Последовательности праймеров, использованных в данном исследовании.
Название | Последовательность, |
mGAPDH dir | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG |
mGAPDH rev | TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
mUbr1up | CCCAGCAGTTCCTGTCTTGT |
mUbr1lo | ATCAGGAGGCACTTTCAGGC |
mUbr2up | AGAGTTTTCAGTCGCAGACCT |
mUbr2lo | TGATCGGGTCCATTCCCTGC |
mUbr4up | GCAGGGAGGGGTACAAGTTC |
mUbr4lo | GGCCTCTAGCCAACCTGAC |
mUbr5up | AGAACCATTACCACCACGGC |
mUbr5lo | CCACCTCAACCTCTTCCACG |
Функциональный анализ пути Arg/N-дегрона
Клетки Hepa 1-6 высевали при достижении 40% конфлюентности в 24-луночные планшеты и трансфицировали плазмидами, кодирующими FLAG-меченные нативную (fDHFR-UbR48-Asp1119-BRCA1f) или стабильную (fDHFR-UbR48-Val1119-BRCA1f) версии проапоптотического фрагмента BRCA1 с использованием Lipofectamine 2000, с или без 2,5 нМ миРНК. Через 72 часа клетки лизировали с помощью 1% SDS, 5 мМ DTT, содержащего полную смесь ингибиторов протеаз (Roche), с последующим нагреванием при 95°C в течение 10 минут. Образцы разбавляли в стандартном буфере для образцов додецилсульфата лития (LDS), нагревали при 95°C в течение 10 минут и анализировали методом денатурирующего гель-электрофореза по Лэммли (5-12%). После переноса белков на мембрану, ее инкубировали с антителом анти-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO) и визуализировали с использованием реагентов SuperSignal West Femto (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя на Fusion Solo S Imager (Vilber Lourmat, ). Франция).
Анализ пролиферации, миграции и апоптоза клеток in vitro
Клетки Hepa 1-6 высевали с плотностью, необходимой для достижения конфлюентности 80% через 72 ч или 96 ч, далее трансфицировали миРНК против люциферазы (контроль) или убиквитин лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в течение 72 ч и обрабатывали или не обрабатывали доксорубицином (Millipore-Sigma) в течение 48 часов или стауроспорин (Millipore-Sigma) в течение 24 часов. Для оценки пролиферации в клетках Hepa 1-6 использовали анализ с использованием нейтрального красного (метод, адаптированный из работы Фауц и др.). После обработки среду заменяли раствором 50 мг/мл нейтрального красного (Millipore-Sigma) в DMEM с добавлением 10% FBS в течение 3 ч при 37°С, 5% CO2. Затем клетки один раз промывали PBS, и краситель экстрагировали из клеток, добавляя элюирующий буфер (50% EtOH, 1% уксусная кислота). После 5 мин инкубации буфер для элюции переносили на новый планшет и считывали оптическую плотность при 540 нм. Для оценки миграции в монослое клеток делали царапину с помощью наконечника автоматической пипетки на 200 мкл. Фотографии были сделаны после внесения первоначальной царапины и спустя 24 часа миграция была оценена путем расчета расстояния между краями царапины. Апоптоз измеряли с использованием набора для определения гибели клеток In situ на основе TMR red (Roche). Обработанные клетки фиксировали 4% параформальдегидом, удаляли мембрану раствором 0,25% Тритон Х-100/0,25% Твин-20 в течение 7 минут на льду и анализировали в соответствии с протоколом производителя. Клетки контрастировали с использованием красителя Hoechst 33342 (Thermo Scientific) и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием системы визуализации EVOS FL (Thermo Fisher Scientific).
Исследования на животных
Все процедуры проводились в соответствии с руководством Национального института здравоохранения и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных и Управлением по исследованиям лабораторных животных в Массачусетском технологическом институте (Массачусетс, США) и Институте развития Биология (Москва, Россия), где проводилось настоящее исследование. Мыши линии C57BL/6 или FVB/N в возрасте 6-8 недель были приобретены в компании Charles River или выращены на месте. Мышей содержали при 22°С и световом цикле 12 часов света/12 часов темноты и кормили стандартным кормом для грызунов. Липидные наночастицы и доксорубицин разбавляли в стерильном физиологическом растворе и вводили через хвостовую вену. Гепатоцеллюлярная карцинома была индуцирована у мышей FVB/N, как описано ранее, с использованием плазмид, кодирующих транспозазу Sleeping Beauty и белки человека DN90-b-катенин и MET. Уровни альфа-фетопротеина в сыворотке крови определяли методом вестерн-блоттинга на 35-й день (анти-фетопротеин [AFP]; R&D Systems Minneapolis, MN). Животных умерщвляли на 66-68 дни после индукции опухоли, если не указано иное. После сбора сыворотки для анализа и отбора образцов печени для гистологии и иммуногистохимии, остальная часть печени была заморожена в жидком азоте и размолота для проведения анализа мРНК и белка.
Гистологический и иммуногистохимический анализ
Образцы печени фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином с использованием стандартных процедур. Срезы толщиной 5 мм окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) или иммуногистохимически. Окрашивание H&E проводили с использованием красителя ThermoShandon Gemini (Eosin и Hematoxylin от Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Система Envision (Dako) была использована для непрямой пероксидазной реакции с использованием 3,3'-диаминобензидина (DAB) для обнаружения Ki67 (BioCare Medical, Pacheco, CA). Окрашивание TUNEL проводили на срезах печени, обработанных протеиназой K, с использованием набора для определения гибели клеток In situ TMR red. Срезы контрастировали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием системы визуализации EVOS FL.
Приготовление лизатов клеток и тканей. Анализ методом вестерн-блоттинга
Клетки лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA), а образцы печени мыши обрабатывали в буфере для лизиса (20 мМ HEPES, 10% глицерина, 0,1 мМ ЭДТА, 75 мМ KCl, pH 7,9), содержащем полный набор ингибиторов протеаз (Roche), используя прибор MP FastPrep-24 и набор реагентов Lysing Matrix D (MP Biomedicals). Экстракты центрифугировали при 12000 g в течение 10 минут при 4°С. Концентрации общего белка в супернатантах определяли с использованием бицинхониновой кислоты (набор реагентов BCA, Pierce) с последующим добавлением концентрированного буфера для образца LDS (Pierce) до конечной концентрации 1Х буфера, нагревания при 95°C в течение 10 минут. Далее образцы анализировали методом денатурирующего гель-электрофореза по Лэммли (5-12%), с общим количеством белка 50-100 мг в дорожку. Разделенные белки анализировали вестерн-блоттингом с использованием следующих антител: анти-UBR1 (Abcam, Cambridge, MA, US), анти-UBR2 (Abcam), анти-UBR4 (Abcam), анти-EDD (Санта-Круз, Даллас, Техас), анти-б-актин (сигма). Вестерн-блоты визуализировали с использованием реагента SuperSignal West Femto в соответствии с инструкциями производителя.
Биохимический анализ крови
Сыворотку собирали пункцией сердца с последующим центрифугированием при 1700 g в течение 20 минут. Биохимический анализ был выполнен в IDEXX Laboratories (США).
Анализ клеток методом проточной цитометрии
Образцы селезенки разрушали вручную, используя тупой конец поршня шприца, тогда как печень инкубировали в коллагеназе типа IV (0,5 мг/мл) в сбалансированном солевом растворе Хэнка с кальцием (Pierce) в течение 30 минут до разрушения и градиентного разделения с использованием Optiprep (Cosmo Bio, Carlsbad, CA). Клетки при плотности 1*107 клеток/мл ресуспендировали в DMEM с 2% FBS и инкубировали 15 минут при комнатной температуре с разбавленными моноклональными антителами, а затем промывали и ресуспендировали в PBS с 2% FBS для последующего анализа. Были использованы следующие моноклональные антитела BioLegend: изотиоцианат флуоресцеина (FITC)-anti-CD11b (M1/70), фикоэритрин (PE)-anti-F4/80 (BM8), PerCPCy5.5-анти- CD11c (N418), PeCy7-анти-B220 (RA3-6B2), BV421-анти-Ly6G (1A8), BV510-анти-CD45 (30-F11), аллофикоцианин (APC)-анти-IA/IE (M5/114.15.2), APCFire-анти-Ly6C (HK1.4). Окрашивание аннексином V/7AAD проводили в соответствии с инструкциями производителя (BioLegend). Данные были получены с использованием прибора BD LSRFortessa, а анализ данных проточной цитометрии был выполнен с использованием программного обеспечения FlowJo (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).
Статистический анализ
Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) использовали для статистического анализа. Двусторонние непарные тесты Манна-Уитни с 95% доверительными границами или односторонние или двусторонние ANOVA использовались для статистического анализа, если не указано иное. Значение р<0,05 считали значимым.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Представленные примеры предназначены для того, чтобы помочь проиллюстрировать изобретение и не предназначены, и не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения. Более того, для специалистов в данной области техники из полного содержания настоящего документа, включая включенные в него примеры и ссылки на научные и патентные документы, станут очевидными различные модификации изобретения и многие другие варианты его реализации, в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе. Примеры содержат важную дополнительную информацию, примеры и руководство, которые могут быть адаптированы к практическому применению данного изобретения в различных вариантах его реализации и их эквивалентах.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Автономная некоммерческая образовательная организация высшего
образования «Сколковский институт науки и технологий»
Зэ Кох Инститьют фо Интегратив Кэнсэ Рисерч эт Массачусеттс
Инститьют оф Текнолоджи
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПУТИ
АРГИНИН/N-ДЕГРОНА
<130> P-1541-14RU
<160> Количество последовательностей SEQ ID NOS: 92
<210> 1
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 1
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 2
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> SEQ ID NO 3
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 3
caaaguagug uucauaaaat t 21
<210> SEQ ID NO 4
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 4
uuuuaugaac acuacuuugt t 21
<210> SEQ ID NO 5
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 5
ccuucgguga uaaaauacat t 21
<210> SEQ ID NO 6
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 6
uguauuuuau caccgaaggt t 21
<210> SEQ ID NO 7
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 7
gguuauggcu caccagaaat t 21
<210> SEQ ID NO 8
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 8
uuucugguga gccauaacct t 21
<210> SEQ ID NO 9
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 9
gacuuuagac agauauuuut t 21
<210> SEQ ID NO 10
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 10
aaaauaucug ucuaaaguct t 21
<210> SEQ ID NO 11
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 11
gacaggaaca auaaauucat t 21
<210> SEQ ID NO 12
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 12
ugaauuuauu guuccuguct t 21
<210> SEQ ID NO 13
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 13
cagacuaggu gcuauuucat t 21
<210> SEQ ID NO 14
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 14
ugaaauagca ccuagucugt t 21
<210> SEQ ID NO 15
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 15
gauuaaacag uauaauacat t 21
<210> SEQ ID NO 16
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 16
uguauuauac uguuuaauct t 21
<210> SEQ ID NO 17
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 17
gcuuagagaa ugucauaaat t 21
<210> SEQ ID NO 18
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 18
uuuaugacauucucuaagct t 21
<210> SEQ ID NO 19
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 19
ggcccggcug uuacugaaat t 21
<210> SEQ ID NO 20
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 20
uuucaguaac agccgggcct t 21
<210> SEQ ID NO 21
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 21
cagaauaucg gguuauaaut t 21
<210> SEQ ID NO 22
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 22
auuauaaccc gauauucugt t 21
<210> SEQ ID NO 23
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 23
gauggugaac agccaaucat t 21
<210> SEQ ID NO 24
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 24
ugauuggcug uucaccauct t 21
<210> SEQ ID NO 25
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 25
ccaagaaaaa guuagcauut t 21
<210> SEQ ID NO 26
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 26
aaugcuaacu uuuucuuggt t 21
<210> SEQ ID NO 27
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 27
auuguuaagc aaaagugaat t 21
<210> SEQ ID NO 28
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 28
uucacuuuug cuuaacaaut t 21
<210> SEQ ID NO 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 29
aagugaaguggcauauaaat t 21
<210> SEQ ID NO 30
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 30
uuuauaugcc acuucacuut t 21
<210> SEQ ID NO 31
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 31
agugaagugg cauauaaaut t 21
<210> SEQ ID NO 32
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 32
auuuauaugc cacuucacut t 21
<210> SEQ ID NO 33
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 33
aguggcauau aaauuuccat t 21
<210> SEQ ID NO 34
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 34
uggaaauuua uaugccacut t 21
<210> SEQ ID NO 35
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 35
gcuccuaccu cuaagugaat t 21
<210> SEQ ID NO 36
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 36
uucacuuaga gguaggagct t 21
<210> SEQ ID NO 37
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 37
gauagaacau ccucuuagat t 21
<210> SEQ ID NO 38
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (2)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 38
ucuaagagga uguucuauct t 21
<210> SEQ ID NO 39
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 39
ggcgagagau guucgacaat t 21
<210> SEQ ID NO 40
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 40
uugucgaaca ucucucgcct t 21
<210> SEQ ID NO 41
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 41
gacuauggga agagauucat t 21
<210> SEQ ID NO 42
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 42
ugaaucucuu cccauaguct t 21
<210> SEQ ID NO 43
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 43
caaagaagau gacuacgaat t 21
<210> SEQ ID NO 44
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 44
uucguaguca ucuucuuugt t 21
<210> SEQ ID NO 45
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 45
gcaaguguag uucagugaat t 21
<210> SEQ ID NO 46
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 46
uucacugaac uacacuugct t 21
<210> SEQ ID NO 47
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 47
gaaccuaggg uuuccgaaat t 21
<210> SEQ ID NO 48
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 48
uuucggaaac ccuagguuct t 21
<210> SEQ ID NO 49
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 49
gcauuuggcu guuagccaut t 21
<210> SEQ ID NO 50
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 50
auggcuaaca gccaaaugct t 21
<210> SEQ ID NO 51
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 51
cgaucaaccu guacuacaat t 21
<210> SEQ ID NO 52
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 52
uuguaguaca gguugaucgt t 21
<210> SEQ ID NO 53
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 53
cacggagcau uguauuacat t 21
<210> SEQ ID NO 54
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 54
uguaauacaa ugcuccgugt t 21
<210> SEQ ID NO 55
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 55
ggacaugacc acagguacat t 21
<210> SEQ ID NO 56
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 56
uguaccugug gucaugucct t 21
<210> SEQ ID NO 57
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 57
gccgguauca agaacaacat t 21
<210> SEQ ID NO 58
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 58
uguuguucuu gauaccggct t 21
<210> SEQ ID NO 59
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 59
ccauggaaau gagauugaat t 21
<210> SEQ ID NO 60
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 60
uucaaucuca uuuccauggt t 21
<210> SEQ ID NO 61
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 61
gcuugagugu guacaucuut t 21
<210> SEQ ID NO 62
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 62
aagauguaca cacucaagct t 21
<210> SEQ ID NO 63
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(12)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 63
agcugaacaa guacaauuut t 21
<210> SEQ ID NO 64
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)…(7)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 64
aaauuguacu uguucagcut t 21
<210> SEQ ID NO 65
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 65
ggagcaggcu acuauuaaat t 21
<210> SEQ ID NO 66
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 66
uuuaauagua gccugcucct t 21
<210> SEQ ID NO 67
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 67
ggcacaaguu guucuacaat t 21
<210> SEQ ID NO 68
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 68
uuguagaaca acuugugcct t 21
<210> SEQ ID NO 69
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 69
ugauaaggau ggaacaaaat t 21
<210> SEQ ID NO 70
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 70
uuuuguucca uccuuaucat t 21
<210> SEQ ID NO 71
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 71
guagcuacug aaaauaacat t 21
<210> SEQ ID NO 72
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(4)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)…(13)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 72
uguuauuuuc aguagcuact t 21
<210> SEQ ID NO 73
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(11)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(19)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 73
ccgagaagac ugaaauacut t 21
<210> SEQ ID NO 74
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(8)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 74
aguauuucag ucuucucggt t 21
<210> SEQ ID NO 75
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 75
gcgcucagaa agaaauacat t 21
<210> SEQ ID NO 76
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 76
uguauuucuu ucugagcgct t 21
<210> SEQ ID NO 77
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(15)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)…(17)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 77
gaaucaggga ggaucgcaat t 21
<210> SEQ ID NO 78
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 78
uugcgauccu cccugauuct t 21
<210> SEQ ID NO 79
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(6)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 79
ggcuucgucc aaaaagaaat t 21
<210> SEQ ID NO 80
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 80
uuucuuuuug gacgaagcct t 21
<210> SEQ ID NO 81
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (1)…(2)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)…(5)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)…(9)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)…(14)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)…(16)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)…(18)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 81
cagccaauug gaaaaugcat t 21
<210> SEQ ID NO 82
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)…(3)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)…(10)
<223> 2'-O-метил нуклеотид
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)…(21)
<223> Фосфоротиоатная связь
<400> 82
ugcauuuucc aauuggcugt t 21
<210> SEQ ID NO 83
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 83
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> SEQ ID NO 84
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 84
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> SEQ ID NO 85
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 85
cccagcagtt cctgtcttgt 20
<210> SEQ ID NO 86
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 86
atcaggaggc actttcaggc 20
<210> SEQ ID NO 87
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 87
Agagttttca gtcgcagacc t 21
<210> SEQ ID NO 88
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 88
tgatcgggtc cattccctgc 20
<210> SEQ ID NO 89
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 89
gcagggaggg gtacaagttc 20
<210> SEQ ID NO 90
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 90
ggcctctagc caacctgac 19
<210> SEQ ID NO 91
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 91
agaaccatta ccaccacggc 20
<210> SEQ ID NO 92
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 92
ccacctcaac ctcttccacg 20
<---
Claims (30)
1. Молекула миРНК, снижающая уровень мРНК убиквитин лигазы в клетке, при этом указанная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, причем по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию, выбранную из 2’-O-метилнуклеотида, 3’-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.
2. Молекула миРНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная молекула содержит последовательность SEQ ID NO: 14.
3. Молекула миРНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная молекула содержит последовательность SEQ ID NO: 40.
4. Молекула миРНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная молекула содержит последовательность SEQ ID NO: 56.
5. Молекула миРНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная молекула содержит последовательность SEQ ID NO: 70.
6. Фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК по любому из пп. 1-5 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
7. Фармацевтическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что указанное онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
8. Комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК по любому из пп. 1-5 и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент.
9. Комбинация по п. 8, отличающаяся тем, что указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
10. Применение молекулы миРНК по любому из пп. 1-5 для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что указанное онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
12. Применение молекулы миРНК по любому из пп. 1-5 для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что указанное онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
14. Применение фармацевтической композиции по п. 6 или 7 для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
15. Применение по п. 14, отличающееся тем, что указанное онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
16. Применение комбинации по любому из пп. 8-9 для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
17. Применение по п. 16, отличающееся тем, что указанное онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
18. Способ снижения уровней мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК по любому из пп. 1-5, фармацевтической композицией по любому из пп. 6-7 или комбинацией по любому из пп. 8-9 в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
20. Способ лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы миРНК по любому из пп. 1-5, фармацевтической композиции по любому из пп. 6-7.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют посредством внутривенной инъекции.
22. Способ по пп. 20-21, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют в дозе, составляющей от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг.
23. Способ по пп. 20-21, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют в режиме, выбранном из одного раза в неделю или двух раз в неделю на протяжении периода, составляющего не более 5 недель.
24. Способ по пп. 20-23, отличающийся тем, что указанное онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
25. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанный способ включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент.
27. Способ по пп. 25-26, отличающийся тем, что указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
28. Способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК по любому из пп. 1-5 или фармацевтической композицией по любому из пп. 6-7 в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная опухолевая клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина.
30. Способ по пп. 28-29, отличающийся тем, что указанная опухолевая клетка представляет собой клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020111517A RU2787841C2 (ru) | 2020-03-19 | Композиции и способы для ингибирования протеолитического пути аргинин/n-дегрона |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020111517A RU2787841C2 (ru) | 2020-03-19 | Композиции и способы для ингибирования протеолитического пути аргинин/n-дегрона |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020111517A RU2020111517A (ru) | 2021-09-21 |
RU2020111517A3 RU2020111517A3 (ru) | 2021-12-29 |
RU2787841C2 true RU2787841C2 (ru) | 2023-01-12 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014152932A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Mirna for treating cancer and for use with adoptive immunotherapies |
EP2794881B1 (en) * | 2011-12-22 | 2018-06-27 | InteRNA Technologies B.V. | Mirna for treating head and neck cancer |
RU2686313C2 (ru) * | 2015-02-25 | 2019-04-25 | Байонир Корпорейшн | Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая микроРНК в качестве активного ингредиента |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2794881B1 (en) * | 2011-12-22 | 2018-06-27 | InteRNA Technologies B.V. | Mirna for treating head and neck cancer |
WO2014152932A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Mirna for treating cancer and for use with adoptive immunotherapies |
RU2686313C2 (ru) * | 2015-02-25 | 2019-04-25 | Байонир Корпорейшн | Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая микроРНК в качестве активного ингредиента |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Rageul J. et al. Conditional degradation of SDE2 by the Arg/N-End rule pathway regulates stress response at replication forks, Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.3996-4010. Kim S.T. et al. The N-recognin UBR4 of the N-end rule pathway is required for neurogenesis and homeostasis of cell surface proteins, PLoS ONE. 2018. V.13, p.e0202260. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6946399B2 (ja) | C/EBPα低分子活性化RNA | |
JP6931733B2 (ja) | C/EBPアルファsaRNA組成物および使用方法 | |
US11965163B2 (en) | HNF4a saRNA compositions and methods of use | |
US9597369B2 (en) | Inhibitors of atypical protein kinase C and their use in treating hedgehog pathway-dependent cancers | |
Leboeuf et al. | Downregulation of the Arg/N-degron pathway sensitizes cancer cells to chemotherapy in vivo | |
JP2018517660A (ja) | 周皮細胞長鎖非コーディングrna | |
Zhou et al. | FBXW2 inhibits prostate cancer proliferation and metastasis via promoting EGFR ubiquitylation and degradation | |
WO2019016310A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS | |
RU2787841C2 (ru) | Композиции и способы для ингибирования протеолитического пути аргинин/n-дегрона | |
He et al. | Msl1 promotes liver regeneration by driving phase separation of stat3 and histone h4 and enhancing their acetylation | |
RU2800071C1 (ru) | Комбинированная терапия гепатоцеллюлярной карциномы на основе сорафениба | |
CA2895483A1 (en) | Tissue regeneration promoting agent | |
JP7082804B2 (ja) | Rageアプタマーを含む癌を治療するための医薬組成物 | |
US10213449B2 (en) | Compositions and methods for treating medulloblastoma | |
Liu et al. | Targeting lncRNA16 by GalNAc-siRNA conjugates facilitates chemotherapeutic sensibilization via the HBB/NDUFAF5/ROS pathway | |
Bordan et al. | PDZ-Binding Kinase, a Novel Regulator of Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension |