RU2787592C1 - New promoter and application thereof - Google Patents
New promoter and application thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787592C1 RU2787592C1 RU2021137780A RU2021137780A RU2787592C1 RU 2787592 C1 RU2787592 C1 RU 2787592C1 RU 2021137780 A RU2021137780 A RU 2021137780A RU 2021137780 A RU2021137780 A RU 2021137780A RU 2787592 C1 RU2787592 C1 RU 2787592C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polynucleotide
- promoter
- present
- nucleotide
- sequence
- Prior art date
Links
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims abstract description 110
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 110
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-Lysine Natural products NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 37
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 20
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 20
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 18
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 10
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 24
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 18
- 239000002609 media Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 Amino Acids Drugs 0.000 description 9
- 229940021015 I.V. solution additive Amino Acids Drugs 0.000 description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 8
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 7
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 7
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- -1 diethylaminoethyl Chemical group 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N Linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N Palmitic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N Stearic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 2
- 229960004799 Tryptophan Drugs 0.000 description 2
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 2
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- PRKQVKDSMLBJBJ-UHFFFAOYSA-N Ammonium carbonate Chemical compound N.N.OC(O)=O PRKQVKDSMLBJBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O Ammonium nitrate Chemical compound [NH4+].[O-][N+]([O-])=O DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940019746 Antifibrinolytic amino acids Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229940088623 Biologically Active Substance Drugs 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229920002024 GDNA Polymers 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L Iron(II) sulfate Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M Lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940071257 Lithium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229940045184 Malt extract Drugs 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 229960002429 Proline Drugs 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960004441 Tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- SOGXBRHOWDEKQB-UHFFFAOYSA-N benzyl 2-chloroacetate Chemical compound ClCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 SOGXBRHOWDEKQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000005712 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N monochloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Область изобретенияField of invention
Настоящее изобретение относится к новому промотору и способу получения целевого вещества с использованием указанного промотора. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому полинуклеотиду, обладающему промоторной активностью, к вектору и клетке-хозяину, каждое из которых содержит указанный полинуклеотид, и к способу получения целевого вещества с использованием указанного микроорганизма.The present invention relates to a new promoter and a method for obtaining the target substance using the specified promoter. More specifically, the present invention relates to a new polynucleotide having promoter activity, to a vector and a host cell, each of which contains the specified polynucleotide, and to a method for obtaining the target substance using the specified microorganism.
Описание предшествующего уровня техникиDescription of the prior art
L-аминокислоты являются основными структурными единицами белков и находят применение как важные вещества для фармацевтического сырья, пищевых добавок, кормов для животных, питательных веществ, пестицидов, бактерицидных веществ и так далее. В числе L-аминокислот L-лизин является незаменимой аминокислотой, не проходящей биосинтез в живом организме, и известен как аминокислота, необходимая для стимуляции роста, метаболизма кальция, стимуляции секреции желудочного сока и резистентности к заболеваниям. L-лизин находит широкое применение в кормах, продуктах медицинского назначения, продуктах питания и так далее. L-триптофан также является одной из незаменимых аминокислот и находит применение в пищевых добавках, трансфузионных агентах, фармацевтическом сырье, веществах для оздоровительного питания и так далее.L-amino acids are the basic structural units of proteins and find applications as important substances for pharmaceutical raw materials, food additives, animal feed, nutrients, pesticides, bactericides and so on. Among L-amino acids, L-lysine is an essential amino acid that is not biosynthesized in a living body, and is known as an amino acid essential for growth promotion, calcium metabolism, stimulation of gastric acid secretion, and disease resistance. L-lysine finds wide application in feed, medical products, food and so on. L-tryptophan is also one of the essential amino acids and finds application in dietary supplements, transfusion agents, pharmaceutical raw materials, health food substances and so on.
Распространенные методы получения аминокислот включают главным образом ферментационные методы с использованием микроорганизмов, таких как Brevibacterium или Cory neb actehum (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986), в дополнение к Escherichia coli, микроорганизмам рода Bacillus, Streptomyces, Penicillium, Klebsiella, Erwinia, Pantoea и так далее (патенты США №№ 3,220,929 и 6,682,912), и также включают промышленные методы синтеза, такие как монохлорацетатный метод, метод Штреккера и так далее.Common methods for obtaining amino acids include mainly fermentation methods using microorganisms such as Brevibacterium or Coryneb actehum (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986), in addition to Escherichia coli, microorganisms of the genus Bacillus, Streptomyces, Penicillium, Klebsiella, Erwinia, Pantoea and so on (U.S. Patent Nos. 3,220,929 and 6,682,912), and also include industrial synthesis methods such as the monochloroacetate method, the Strecker method, and so on.
Кроме того, было проведено множество исследований для эффективного получения аминокислот, например, были предприняты попытки разработать микроорганизм, обеспечивающий высокую эффективность получения аминокислот, или ферментационную технологию. Конкретно, были разработаны специфические в отношении целевого вещества способы повышения экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез аминокислот, или удаления генов, не являющихся обязательными для биосинтеза аминокислот, у штамма рода Corynebacterium (патенты Кореи №№ 10-0924065 и 1208480). В дополнение к этим методам применяют метод удаления генов, не вовлеченных в получение аминокислот, и метод удаления генов, конкретные функции которых при получении аминокислот не известны. Тем не менее, все еще существует потребность в исследованиях метода, который позволил бы эффективно получать L-аминокислоты с высоким выходом.In addition, many studies have been carried out for the efficient production of amino acids, for example, attempts have been made to develop a microorganism that provides high efficiency in the production of amino acids, or a fermentation technology. Specifically, target-substance-specific methods have been developed to increase the expression of a gene encoding an enzyme involved in amino acid biosynthesis or to remove genes not essential for amino acid biosynthesis in a strain of the genus Corynebacterium (Korean Patent Nos. 10-0924065 and 1208480). In addition to these methods, a method is used to remove genes not involved in the production of amino acids, and a method to remove genes whose specific functions in the production of amino acids are not known. However, there is still a need to research a method that would allow efficient production of L-amino acids in high yield.
С учетом этого предшествующего уровня техники авторы настоящего изобретения разработали новый полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, позволяющий получать целевое вещество с высокой продуктивностью в микроорганизме рода Corynebacterium, и обнаружили, что при введении этого полинуклеотида в микроорганизм продуктивность в отношении целевого вещества может быть повышена, завершив посредством этого настоящее изобретение.In view of this prior art, the inventors of the present invention have developed a novel polynucleotide having promoter activity to produce a target substance with high productivity in a microorganism of the genus Corynebacterium, and have found that by introducing this polynucleotide into the microorganism, the productivity of the target substance can be increased, completing by this present invention.
Авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия для получения нового полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, и в результате обнаружили, что при усовершенствовании промотора целевого гена посредством замены оснований усовершенствованный промотор способен регулировать экспрессию гена, функционально связанного с ним, завершив посредством этого настоящее изобретение.The present inventors have made considerable efforts to obtain a novel polynucleotide having promoter activity, and as a result, found that by improving the promoter of the target gene by base substitution, the improved promoter is able to regulate the expression of the gene operably linked to it, thereby completing the present invention.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на С.One object of the present invention is to provide a polynucleotide having promoter activity, wherein the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with C.
Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить генную экспрессионную кассету, содержащую указанный полинуклеотид и целевой ген.Another object of the present invention is to provide a gene expression cassette containing said polynucleotide and a target gene.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить клетку-хозяина, содержащую указанный полинуклеотид или указанную генную экспрессионную кассету.Another object of the present invention is to provide a host cell containing said polynucleotide or said gene expression cassette.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ получения целевого вещества, включающий стадии культивирования указанной клетки-хозяина в среде и выделения целевого вещества из среды.Another object of the present invention is to provide a method for obtaining a target substance, comprising the steps of culturing said host cell in a medium and isolating the target substance from the medium.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить применение полинуклеотид а в качестве промотора, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид.Another object of the present invention is to provide the use of a polynucleotide a as a promoter, wherein the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been replaced with another nucleotide.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙDETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
Настоящее изобретение будет описано подробно, как изложено ниже. В то же время, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в данном изобретении, может также быть применено к другим описаниям и воплощениям. То есть объем настоящего изобретения включает все комбинации различных элементов, раскрытых в данном изобретении. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.The present invention will be described in detail as follows. At the same time, each of the descriptions and embodiments disclosed in this invention can also be applied to other descriptions and embodiments. That is, the scope of the present invention includes all combinations of the various elements disclosed in this invention. In addition, the scope of the present invention is not limited to the specific description below.
Кроме того, специалистам в данной области будет ясно, или они смогут убедиться, применяя не более чем рутинные эксперименты, что существует множество эквивалентов конкретных воплощений изобретения, описанных здесь. Кроме того, эти эквиваленты следует трактовать как включенные в настоящее изобретение.In addition, those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, that there are many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. In addition, these equivalents should be construed as included in the present invention.
Для решения указанных выше задач согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на С.To solve the above problems, according to one aspect of the present invention, a polynucleotide having promoter activity is provided, wherein the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with C.
При использовании здесь термин «нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 1», может относиться к части промоторной последовательности гена NCgl0859.As used herein, the term "nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1" may refer to a portion of the promoter sequence of the NCgl0859 gene.
В этой связи, термин «ген NCg10859» относится к гену, естественным образом присутствующему у микроорганизма рода Corynebacterium, или гену, кодирующему гипотетический белок, функция которого неизвестна.In this regard, the term "NCg10859 gene" refers to a gene naturally present in a microorganism of the genus Corynebacterium or a gene encoding a hypothetical protein whose function is unknown.
Последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 1, может представлять собой последовательность, имеющую происхождение из Corynebacterium (Corynebacterium sp.), и, конкретно, последовательность, имеющую происхождение из Corynebacterium glutamicum. Тем не менее, последовательность, обладающая активностью, эквивалентной активности указанного полинуклеотида или превышающей активность указанного полинуклеотида, может быть включена в промотор по настоящему изобретению без ограничения.The sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 may be a sequence originating from Corynebacterium (Corynebacterium sp.), and specifically, a sequence originating from Corynebacterium glutamicum. However, a sequence having an activity equivalent to that of the specified polynucleotide or greater than the activity of the specified polynucleotide may be included in the promoter of the present invention without limitation.
При использовании здесь термин «полинуклеотид», относящийся к нуклеотидному полимеру, где нуклеотидные мономеры ковалентно связаны в длинную цепь, относится к цепи ДНК, имеющей предопределенную длину или длину, превышающую предопределенную длину.As used herein, the term "polynucleotide", referring to a nucleotide polymer, where the nucleotide monomers are covalently linked into a long chain, refers to a DNA chain having a predetermined length or a length greater than a predetermined length.
При использовании здесь термин «промотор» относится к нетранслируемой нуклеотидной последовательности выше кодирующей области, содержащей сайт связывания для полимеразы и обладающей активностью инициации транскрипции целевого гена промотора с образованием мРНК (матричная РНК), то есть к домену ДНК, с которым связывается полимераза, инициируя транскрипцию гена. Промотор может быть расположен в 5'-домене домена инициации транскрипции с образованием мРНК.As used herein, the term "promoter" refers to an untranslated nucleotide sequence upstream of the coding region containing a binding site for a polymerase and having the activity of initiating transcription of the target promoter gene to form mRNA (messenger RNA), i.e., the DNA domain to which the polymerase binds to initiate transcription. gene. The promoter may be located in the 5' domain of the transcription initiation domain to form mRNA.
При использовании здесь термин «полинуклеотид, обладающий промоторной активностью», относится к области ДНК, которая содержит сайт связывания для РНК-полимеразы или энхансер, и так далее, для экспрессии гена, расположенного ниже ее и функционально связанного с ней, то есть целевого гена, и расположена вблизи сайта транскрипции целевого гена. Применительно к задачам настоящего изобретения, полинуклеотид может быть использован как промотор для общего применения, и, по сравнению с существующим промотором или эндогенным промотором в клетках, полинуклеотид может регулировать (например, повышать или снижать) экспрессию целевого гена, функционально связанного с ним, и образование и/или активность белка, кодируемого целевым геном, и он может регулировать (например, повышать или снижать) образование и/или активность целевого продукта (биологически активного вещества, например одного или более чем одного, выбранного из группы, состоящей из аминокислот, нуклеиновых кислот, витаминов, белков, жирных кислот, органических кислот и так далее), вовлеченного в образование указанного белка, без ограничения этим.As used herein, the term "polynucleotide having promoter activity" refers to a region of DNA that contains a binding site for an RNA polymerase or an enhancer, and so on, for the expression of a gene downstream and operably linked to it, that is, a target gene, and is located near the transcription site of the target gene. For the purposes of the present invention, a polynucleotide can be used as a promoter for general use, and, compared to an existing promoter or an endogenous promoter in cells, a polynucleotide can regulate (e.g., increase or decrease) the expression of a target gene operably linked to it and produce and/or the activity of the protein encoded by the target gene, and it can regulate (for example, increase or decrease) the formation and/or activity of the target product (biologically active substance, for example, one or more selected from the group consisting of amino acids, nucleic acids , vitamins, proteins, fatty acids, organic acids, and so on) involved in the formation of the specified protein, without limitation.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может содержать любую полинуклеотидную последовательность без ограничения, при условии, что она обладает промоторной активностью.The polynucleotide of the present invention may contain any polynucleotide sequence without limitation, provided that it has promoter activity.
В одном воплощении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может содержать полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где один или более чем один нуклеотид в нуклеотидной последовательности, представленной SEQ IDNO: 1, заменен на другой нуклеотид.In one embodiment, a polynucleotide having promoter activity of the present invention may comprise a polynucleotide having promoter activity, wherein one or more than one nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ IDNO: 1 has been replaced with another nucleotide.
Конкретно, полинуклеотид может состоять из полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, где один или более чем один нуклеотид в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен на другой нуклеотид. В настоящем описании полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может быть использован взаимозаменяемо с «вариантом промотора», и все описанные выше термины могут быть использованы в настоящем описании.Specifically, the polynucleotide may consist of a polynucleotide having promoter activity, where one or more than one nucleotide in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced by another nucleotide. As used herein, a polynucleotide having promoter activity may be used interchangeably with "promoter variant", and all of the terms described above may be used herein.
Например, полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может представлять собой полинуклеотид, где нуклеотид в определенном положении полинуклеотидной последовательности, обладающей существующей промоторной активностью, заменен и, таким образом, промоторная активность ослаблена или усилена.For example, a polynucleotide having promoter activity may be a polynucleotide where a nucleotide at a certain position in a polynucleotide sequence having existing promoter activity is changed, and thus the promoter activity is reduced or enhanced.
В одном воплощении вариант промотора может представлять собой промотор, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид.In one embodiment, the promoter variant may be a promoter where the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is changed to another nucleotide.
«Другой нуклеотид» не ограничен, при условии, что он представляет собой нуклеотид, отличный от нуклеотида до замены. Например, описание того, что «нуклеотид в положении 178 SEQ ID NO: 1 заменен на другой нуклеотид», означает, что нуклеотид заменен на аденин (А), цитозин (С) или гуанин (G), за исключением тимина (Т). Кроме того, в настоящем изобретении, если не указано иное, описание нуклеотида как «замененного» означает, что нуклеотид заменен на нуклеотид, отличный от нуклеотида до замены.The "other nucleotide" is not limited, as long as it is a nucleotide other than the nucleotide before the substitution. For example, the description that "the nucleotide at position 178 of SEQ ID NO: 1 is changed to another nucleotide" means that the nucleotide is changed to adenine (A), cytosine (C) or guanine (G) except for thymine (T). In addition, in the present invention, unless otherwise indicated, the description of a nucleotide as "replaced" means that the nucleotide is replaced with a nucleotide that is different from the nucleotide before the change.
В то же время, специалисты в данной области могут определить нуклеотид в положении, соответствующем положению 178 SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, в любой полинуклеотидной последовательности посредством выравнивания последовательностей, известного в данной области. Если в настоящем изобретении не описано иное, то при описании «нуклеотида в определенном положении определенной SEQ ID NO» очевидно, что этот нуклеотид также включает «нуклеотид в соответствующем положении» в любой полинуклеотидной последовательности. Таким образом, полинуклеотидная последовательность, где любой один или более чем один нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из нуклеотидов в положениях, соответствующих положению 178 полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид в любой полинуклеотидной последовательности, обладающей промоторной активностью, также включена в объем настоящего изобретения.At the same time, those skilled in the art can determine the nucleotide at position corresponding to position 178 of SEQ ID NO: 1 of the present invention in any polynucleotide sequence by sequence alignment known in the art. Unless otherwise described in the present invention, when describing "a nucleotide at a certain position of a certain SEQ ID NO", it is obvious that this nucleotide also includes "a nucleotide at the corresponding position" in any polynucleotide sequence. Thus, a polynucleotide sequence wherein any one or more nucleotides selected from the group consisting of nucleotides at positions corresponding to position 178 of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced by another nucleotide in any polynucleotide sequence having promoter activity also included in the scope of the present invention.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой полинуклеотид, где нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO: 1, то есть промоторная последовательность гена NCg10859, изменена. Конкретно, изменение может представлять собой замену нуклеотида в положении 178 указанной последовательности на другой нуклеотид. Конкретно, нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, может быть заменен на С.The polynucleotide of the present invention may be a polynucleotide wherein the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, the promoter sequence of the NCg10859 gene, is changed. Specifically, the change may be a replacement of the nucleotide at position 178 of the indicated sequence with another nucleotide. Specifically, the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be replaced with C.
Полинуклеотид может иметь измененную (повышенную или сниженную) промоторную активность по сравнению с полинуклеотидом без изменения. Таким образом, возможна регуляция (повышение или снижение) экспрессии целевого гена, функционально связанного с полинуклеотидом, и активности белка, кодируемого целевым геном, и, кроме того, возможна регуляция экспрессии гена, отличного от целевого гена.A polynucleotide may have an altered (increased or decreased) promoter activity compared to an unaltered polynucleotide. Thus, it is possible to regulate (increase or decrease) the expression of the target gene operably linked to the polynucleotide and the activity of the protein encoded by the target gene, and furthermore, the expression of a gene other than the target gene can be regulated.
Например, замена нуклеотида в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, на другой нуклеотид позволяет получить промотор, обладающий активностью, более ослабленной или усиленной, чем промоторная последовательность без замены (неизмененная).For example, substitution of the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 with a different nucleotide results in a promoter that is more attenuated or enhanced than the promoter sequence without the substitution (unchanged).
Кроме того, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, вовлеченный в увеличение образования или образованного количества целевого вещества, конкретно L-аминокислоты, и более конкретно L-лизина.In addition, the polynucleotide may be a polynucleotide involved in increasing the formation or produced amount of the target substance, specifically L-amino acids, and more specifically L-lysine.
Эффект увеличения образованного количества L-аминокислоты, более конкретно L-лизина, посредством изменения промотора гена NCg10859 был впервые изучен авторами настоящего изобретения.The effect of increasing the generated amount of L-amino acid, more specifically L-lysine, by changing the promoter of the NCg10859 gene was first studied by the authors of the present invention.
При использовании здесь «L-лизин», являющийся одной из основных α-аминокислот, представляет собой незаменимую аминокислоту, не синтезируемую in vivo. L-лизин может находить применение, но без ограничения, в различных продуктах, таких как корма, или кормовые добавки, или продукты питания, пищевые добавки, продукты медицинского назначения и так далее.As used herein, "L-lysine", which is one of the basic α-amino acids, is an essential amino acid not synthesized in vivo. L-lysine can find use in, but is not limited to, various products such as feed or feed additives or food, nutritional supplements, medical products, and so on.
В одном воплощении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может содержать полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Например, полинуклеотид может по существу состоять из или может состоять из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, без ограничения этим.In one embodiment, a polynucleotide having promoter activity of the present invention may comprise the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. For example, the polynucleotide may essentially consist of, or may consist of, the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, without being limited thereto.
Кроме того, без ограничения описанным выше воплощением, в полинуклеотидную последовательность могут быть включены различные изменения в диапазоне, не приводящем к существенному снижению промоторной активности. Например, нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть изменена посредством известного метода мутагенеза, например направленной эволюции, сайт-направленного мутагенеза и так далее.In addition, without being limited to the embodiment described above, various changes can be included in the polynucleotide sequence in a range that does not lead to a significant decrease in promoter activity. For example, the nucleotide sequence of the present invention can be changed by a known method of mutagenesis, such as directed evolution, site-directed mutagenesis, and so on.
В этой связи, термин «изменение» относится к генетически или негенетически стабильному фенотипическому изменению, и в настоящем изобретении он может быть использован взаимозаменяемо с «модификацией» или «мутацией».In this regard, the term "change" refers to a genetically or non-genetically stable phenotypic change, and in the present invention it can be used interchangeably with "modification" or "mutation".
Таким образом, в настоящем изобретении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может представлять собой полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или полинуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%, или более гомологичную или идентичную SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В числе указанных выше категорий, нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию или идентичность, может представлять собой последовательность, идентичную менее чем на 100%, за исключением последовательности, идентичной на 100%.Thus, in the present invention, a polynucleotide having promoter activity may be a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide sequence of at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98%, or 99% or more homologous or identical to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Among the above categories, a nucleotide sequence having homology or identity may be a sequence less than 100% identical except for 100% identical sequence.
Несмотря на то, что он описан в настоящем изобретении как «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную определенной SEQ ID NO», или «полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную определенной SEQ ID NO», очевидно, что в настоящем изобретении может также быть использован полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности, при условии, что он обладает активностью, идентичной или соответствующей активности полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности соответствующей SEQ ID NO.Although it is described in the present invention as "a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by a specific SEQ ID NO", or "a polynucleotide containing a nucleotide sequence represented by a specific SEQ ID NO", it is clear that in the present invention can also be used a polynucleotide having a nucleotide sequence with a deletion, modification, substitution or addition of part of the sequence, provided that it has an activity identical to or corresponding to that of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of the corresponding SEQ ID NO.
Например, очевидно, что полинуклеотид, где во внутренней области или в конце нуклеотидной последовательности соответствующей SEQ ID NO добавлена бессмысленная последовательность или где во внутренней области или в конце нуклеотидной последовательности соответствующей SEQ ID NO удалена часть последовательности, также включен в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает активностью, идентичной или соответствующей активности указанного полинуклеотида.For example, it is clear that a polynucleotide where a nonsense sequence is added in the interior or at the end of the nucleotide sequence of the corresponding SEQ ID NO or where a portion of the sequence is deleted in the interior or at the end of the nucleotide sequence of the corresponding SEQ ID NO is also included within the scope of the present invention, provided that that it has an activity identical to or corresponding to that of said polynucleotide.
Гомология или идентичность относятся к степени совпадения двух заданных нуклеотидных последовательностей и могут быть выражены в процентах.Homology or identity refers to the degree of match between two given nucleotide sequences and may be expressed as a percentage.
Во многих случаях термины «гомология» и «идентичность» могут быть использованы взаимозаменяемо.In many cases, the terms "homology" and "identity" can be used interchangeably.
Гомология или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов может быть определена с применением стандартных алгоритмов выравнивания и может быть использована с штрафом за разрыв, установленным в используемой программе по умолчанию. По существу гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться в условиях умеренной или высокой жесткости по всей длине или на протяжении по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% всей длины последовательностей. Также рассматриваются полинуклеотиды, содержащие вырожденные кодоны вместо кодонов гибридизующихся полинуклеотидов.Homology or sequence identity of conservative polynucleotides can be determined using standard alignment algorithms and can be used with the gap penalty set in the default program being used. Substantially homologous or identical sequences can hybridize under conditions of moderate or high stringency over the entire length, or over at least about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, or about 90% of the entire length of the sequences. Also contemplated are polynucleotides containing degenerate codons instead of the codons of hybridizing polynucleotides.
Гомология, сходство или идентичность любых двух полинуклеотидных последовательностей могут быть определены с применением известного компьютерного алгоритма, такого как программа «FASTA», с использованием параметров по умолчанию, например как в Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. Альтернативно, как в программе Needleman пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версии 5.0.0 или последующих версий), гомология, сходство или идентичность могут быть определены с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с применением BLAST или ClustalW базы данных Национального центра биотехнологической информации.Homology, similarity, or identity of any two polynucleotide sequences can be determined using a known computer algorithm, such as the FASTA program, using default parameters, such as those in Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. sci. USA 85:2444. Alternatively, as in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (version 5.0.0 or later), homology, similarity, or identity can be determined using the Needleman and Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) (including the GCG software package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 ( 1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and CARILLO et al (1988) SIAM J Applied Math 48:1073) For example, homology, similarity or identity can be determined using BLAST or ClustalW of the National Center for Biotechnology Information database.
Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидов могут быть определены путем сравнения информации о последовательностях с применением компьютерной программы GAP, например Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как раскрыто в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Кратко, программа GAP определяет значение, полученное делением числа сходно выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значения 1 для идентичных положений и 0 для неидентичных) и взвешенную матрицу сравнения по Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (альтернативно, матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS-версия NCBI NUC4.4); (2) штраф 3,0 за каждый разрыв и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа каждого разрыва (альтернативно, штраф за начало разрыва 10, штраф за продолжение разрыва 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевой разрыв. Соответственно, термин «гомология» или «идентичность», используемый в настоящем изобретении, отражает родство последовательностей.Homology, similarity, or identity of polynucleotides can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program, such as Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443 as disclosed in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Briefly, the GAP program determines the value obtained by dividing the number of similarly aligned characters (ie, nucleotides or amino acids) by the total number of characters in the shorter of the two sequences. The default parameters for the GAP program may include: (1) a binary comparison matrix (containing the values 1 for identical positions and 0 for non-identical ones) and a weighted comparison matrix according to Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, as disclosed in Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (alternatively, the EDNAFULL substitution matrix (EMBOSS version of NCBI NUC4.4); (2) a penalty of 3.0 for each break and an additional penalty of 0.10 for each character of each break (alternatively, a penalty for starting a break 10, gap extension penalty 0.5), and (3) no end gap penalty Accordingly, the term "homology" or "identity" as used in the present invention reflects sequence relatedness.
Кроме того, может быть включен, без ограничения, зонд, который может быть получен из известной генной последовательности, например полинуклеотидной последовательности, имеющей такую же активность и гибридиующейся с последовательностью, комплементарной всей описанной выше полинуклеотидной последовательности или ее части, в жестких условиях. «Жесткие условия» обозначают условия, позволяющие проводить специфичную гибридизацию полинуклеотидов. Эти условия конкретно раскрыты в литературе (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Например, жесткие условия могут включать условия, при которых гены, имеющие высокую гомологию или идентичность, гены, гомологичные или идентичные на 40% или более, конкретно на 70% или более, 80% или более, 85% или более или 90% или более, более конкретно на 95% или более, намного более конкретно на 97% или более и особенно конкретно на 99% или более, гибридизуются друг с другом, в то время как гены, имеющие более низкую гомологию или идентичность, чем указано выше, не гибридизуются друг с другом, или могут включать обычные условия промывки при Саузерн-гибридизации, то есть однократную промывку, конкретно двукратную или трехкратную, при концентрации соли и температуре, соответствующих 60°С, 1x SSC (физиологический раствор-цитрат натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфатом натрия), конкретно 60°С, 0,1х SSC и 0,1% SDS, и более конкретно 68°С, 0,1х SSC и 0,1% SDS.In addition, a probe can be included, without limitation, that can be derived from a known gene sequence, such as a polynucleotide sequence having the same activity and hybridizing to a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence described above, under stringent conditions. "Stringent conditions" refers to conditions that allow specific hybridization of polynucleotides. These conditions are specifically disclosed in the literature (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). For example, stringent conditions may include those under which genes having high homology or identity, genes that are 40% or more homologous or identical, specifically 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more , more specifically by 95% or more, much more specifically by 97% or more, and especially specifically by 99% or more, hybridize with each other, while genes having lower homology or identity than the above do not hybridize. with each other, or may include conventional washing conditions in Southern hybridization, that is, a single wash, specifically two or three times, at a salt concentration and temperature corresponding to 60 ° C, 1x SSC (saline sodium citrate) and 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), specifically 60°C, 0.1x SSC and 0.1% SDS, and more specifically 68°C, 0.1x SSC and 0.1% SDS.
Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, однако в зависимости от жесткости гибридизации могут быть возможны несовпадения нуклеотидов. Термин «комплементарный» использован для описания связи между нуклеотидами, гибридизуемыми друг с другом. Например, применительно к ДНК, аденин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, настоящее изобретение может также включать выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный полноразмерной последовательности, а также последовательность нуклеиновой кислоты, по существу сходную с ним.Hybridization requires two nucleic acids to have complementary sequences, however, depending on the stringency of the hybridization, nucleotide mismatches may occur. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotides that hybridize with each other. For example, in relation to DNA, adenine is complementary to thymine, and cytosine is complementary to guanine. Thus, the present invention may also include an isolated nucleic acid fragment that is complementary to the full-length sequence, as well as a nucleic acid sequence substantially similar to it.
Конкретно, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность, может быть определен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm 55°С в условиях, описанных выше. Кроме того, значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, без ограничения этим, и специалисты в данной области могут надлежащим образом его контролировать в зависимости от поставленной задачи.Specifically, a polynucleotide having homology or identity can be determined using hybridization conditions including a hybridization step at a T m value of 55°C under the conditions described above. In addition, the value of T m may be 60°C, 63°C or 65°C, without limitation, and experts in this field can properly control it depending on the task.
Жесткость, подходящая для гибридизации полинуклеотидов, зависит от длины и комплементарности полинуклеотидов, и эти показатели хорошо известны в данной области (см. Sambrook et al., указанную выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).The stringency suitable for polynucleotide hybridization depends on the length and complementarity of the polynucleotides, and these are well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может быть выделен или получен с применением стандартных молекулярно-биологических методик. Например, полинуклеотид может быть получен с применением стандартной технологии синтеза с использованием автоматического синтезатора ДНК, но получение не ограничено этим.A polynucleotide having promoter activity of the present invention can be isolated or obtained using standard molecular biology techniques. For example, a polynucleotide can be prepared using standard synthesis techniques using an automatic DNA synthesizer, but the preparation is not limited to this.
Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению может быть использован в качестве промотора.A polynucleotide having a promoter activity of the present invention can be used as a promoter.
Промотор может быть расположен в 5'-области сайта инициации транскрипции с образованием мРНК.The promoter can be located in the 5'-region of the site of initiation of transcription with the formation of mRNA.
Промотор может иметь повышенную или сниженную промоторную активность по сравнению с существующими промоторами. Иными словами, промотор может повышать или снижать экспрессию и/или активность белка, кодируемого целевым геном, а также экспрессию целевого гена в клетках-хозяевах. Применительно к задачам настоящего изобретения, целевой ген, экспрессия которого усилена или ослаблена, может быть изменен в соответствии с продуктом, который необходимо получить, и промотор может быть использован как промотор для общего применения для усиления или ослабления целевого гена.The promoter may have increased or decreased promoter activity compared to existing promoters. In other words, the promoter can increase or decrease the expression and/or activity of the protein encoded by the target gene, as well as the expression of the target gene in host cells. For the purposes of the present invention, a target gene whose expression is up-regulated or down-regulated can be changed according to the product to be obtained, and the promoter can be used as a promoter for general use to enhance or down-regulate the target gene.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена генная экспрессионная кассета, содержащая полинуклеотид и целевой ген.According to another aspect of the present invention, there is provided a gene expression cassette comprising a polynucleotide and a target gene.
Полинуклеотид по настоящему изобретению является таким, как описано выше.The polynucleotide of the present invention is as described above.
При использовании здесь термин «генная экспрессионная кассета» относится к стандартной кассете, содержащей промотор и целевой ген и способной экспрессировать целевой ген, расположенный ниже промотора и функционально связанный с ним. В область, расположенную внутри или вне генной экспрессионной кассеты, могут быть включены различные факторы, которые могут способствовать эффективной экспрессии целевого гена. Обычно генная экспрессионная кассета может помимо промотора, функционально связанного с целевым геном, содержать сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосом и сигнал терминации трансляции, но без ограничения ими.As used herein, the term "gene expression cassette" refers to a standard cassette containing a promoter and a target gene and capable of expressing a target gene located downstream of and operably linked to the promoter. In the region located inside or outside the gene expression cassette, various factors can be included that can contribute to the effective expression of the target gene. Typically, a gene expression cassette may, in addition to a promoter operably linked to a target gene, contain, but is not limited to, a transcription termination signal, a ribosome binding domain, and a translation termination signal.
Применительно к задачам настоящего изобретения, «целевой ген» относится к гену, экспрессию которого регулирует промоторная последовательность по настоящему изобретению. Белок, кодируемый целевым геном, может быть назван «целевым белком», а ген, кодирующий «целевой белок», может быть назван «целевым геном».For purposes of the present invention, a "target gene" refers to a gene whose expression is controlled by the promoter sequence of the present invention. A protein encoded by a target gene may be referred to as a "target protein", and a gene encoding a "target protein" may be referred to as a "target gene".
Кроме того, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может иметь различные модификации в кодирующей области в диапазоне, не приводящем к изменению полипептидной последовательности, в силу вырожденности кодонов или с учетом кодонов, предпочтительных для организма, который будет экспрессировать полинуклеотид. Описание полинуклеотидной последовательности является таким, как описано выше.In addition, the polynucleotide encoding the target protein may have various modifications in the coding region in a range that does not lead to a change in the polypeptide sequence, due to codon degeneracy or codon preference for the organism that will express the polynucleotide. Description of the polynucleotide sequence is as described above.
В частности, выражение «состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2» означает, что при использовании рестриктазы не исключены добавление, делеция и/или изменение нуклеотидов, которые могут произойти в процессе лигирования с целевым геном, когда соответствующий полинуклеотид используют в качестве промотора, лигируя его с целевым геном.In particular, the expression "consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2" means that when using a restriction enzyme, the addition, deletion and/or change of nucleotides is not excluded, which can occur during ligation with the target gene, when the corresponding polynucleotide is used as a promoter, ligating it to the target gene.
Кроме того, полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, может включать любую нуклеотидную последовательность без ограничения, при условии, что она представляет собой нуклеотидную последовательность, гибридизуемую с последовательностью, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, в жестких условиях, обладая промоторной активностью по настоящему изобретению.In addition, a polynucleotide having promoter activity, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, may include any nucleotide sequence without limitation, provided that it is a nucleotide sequence hybridizable with a sequence complementary to all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO : 2, under stringent conditions, having the promoter activity of the present invention.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид или генную экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид и целевой ген.According to another aspect of the present invention, a recombinant vector containing a polynucleotide or a gene expression cassette containing a polynucleotide and a target gene is provided.
Полинуклеотид, целевой ген и генная экспрессионная кассета по настоящему изобретению являются такими, как описано выше.The polynucleotide, target gene and gene expression cassette of the present invention are as described above.
При использовании здесь термин «вектор» относится к искусственной молекуле ДНК, имеющей генетический материал, способный экспрессировать целевой ген у подходящего хозяина, и конкретно относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность гена, кодирующего целевой белок, функционально связанную с ней.As used herein, the term "vector" refers to an artificial DNA molecule having genetic material capable of expressing a target gene in a suitable host, and specifically refers to a DNA construct containing the nucleotide sequence of a gene encoding a target protein operably linked to it.
При использовании здесь термин «функционально связанный» означает, что полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению функционально связан с последовательностью гена для инициации и опосредования транскрипции целевого гена. Функциональная связь может быть достигнута с применением рекомбинантной генетической методики, известной в данной области, а сайт-специфичное расщепление и лигирование ДНК может быть осуществлено с использованием рестриктазы и лигазы, известных в данной области, без ограничения этим.As used herein, the term "operably linked" means that a polynucleotide having promoter activity of the present invention is operably linked to a gene sequence to initiate and mediate transcription of a target gene. Functional linkage can be achieved using recombinant genetic techniques known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can be performed using a restriction enzyme and ligase known in the art, without being limited to this.
Конкретных ограничений относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, нет, при условии, что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине, и для трансформации клетки-хозяина может быть использован любой вектор, известный в данной области. Примеры часто используемого вектора могут включать естественные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги.There are no particular restrictions on the vector used in the present invention, provided that it can be expressed in a host cell, and any vector known in the art can be used to transform the host cell. Examples of a commonly used vector may include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages.
Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, ГХП, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, и так далее; и в качестве плазмидного вектора могут быть использованы векторы на основе pDZ, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET; однако векторы не ограничены перечисленными. Конкретно, могут быть использованы векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и так далее, однако векторы не ограничены перечисленными. Кроме того, введение полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено любым методом, известным в данной области, например посредством гомологичной рекомбинации.For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, HXP, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, and so on can be used as a phage vector or cosmid vector; and as a plasmid vector, vectors based on pDZ, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET can be used; however, the vectors are not limited to those listed. Specifically, pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, and so on, can be used, but the vectors are not limited to those listed. In addition, the introduction of the polynucleotide into the chromosome can be carried out by any method known in this field, for example, through homologous recombination.
Поскольку вектор по настоящему изобретению может быть введен в хромосому путем индуцирования гомологичной рекомбинации, возможно дополнительное включение селекционного маркера для подтверждения успешного введения гена в хромосому. Селекционный маркер предназначен для скрининга клеток, трансформированных вектором, то есть для определения того, введен ли полинуклеотид. Могут быть использованы маркеры, обеспечивающие селектируемые фенотипы, такие как резистентность к лекарственным средствам, ауксотрофия, резистентность к токсичным агентам или экспрессия поверхностных белков. В среде, обработанной селективным агентом, выжить или продемонстрировать отличный фенотип могут только клетки, экспрессирующие селекционный маркер, и таким образом можно отбирать трансформированные клетки.Since the vector of the present invention can be introduced into the chromosome by inducing homologous recombination, it is possible to additionally include a selection marker to confirm the successful introduction of the gene into the chromosome. The selection marker is for screening cells transformed with the vector, ie to determine if a polynucleotide has been introduced. Markers conferring selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to toxic agents, or expression of surface proteins can be used. In the medium treated with the selection agent, only cells expressing the selection marker can survive or show a different phenotype, and thus transformed cells can be selected.
При использовании здесь термин «трансформация» относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, для обеспечения возможности экспрессии белка, кодируемого полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Кроме того, при условии, что полинуклеотид, используемый для трансформации, может быть экспрессирован в клетке-хозяине, не имеет значения, расположен ли полинуклеотид, используемый для трансформации, в хромосоме клетки-хозяина или вне хромосомы, и изобретение включает оба эти случая. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой генную конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии, или в форме вектора, содержащего указанную экспрессионную кассету.As used herein, the term "transformation" refers to introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell to allow expression of the protein encoded by the polynucleotide in the host cell. In addition, as long as the polynucleotide used for transformation can be expressed in the host cell, it does not matter whether the polynucleotide used for transformation is located on the chromosome of the host cell or off the chromosome, and the invention includes both of these cases. In addition, the polynucleotide includes DNA and RNA encoding the target protein. The polynucleotide may be introduced in any form, as long as it can be introduced into and expressed in the host cell. For example, a polynucleotide can be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for self-expression, or in the form of a vector containing said expression cassette.
Метод трансформации включает любой метод введения гена, кодирующего целевой белок, в клетку и может быть осуществлен путем выбора подходящей стандартной методики, известной в данной области, в соответствии с клеткой-хозяином. Например, метод трансформации может включать электропорацию, преципитацию с фосфатом кальция (CaPO4), преципитацию с хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, методику с полиэтиленгликолем (PEG), методику с ВЕАЕ(диэтиламиноэтил)-декстраном, методику с катионными липосомами, методику с ацетатом лития и DMSO (диметилсульфоксид) и так далее, однако метод не ограничен этим.The transformation method includes any method of introducing a gene encoding a target protein into a cell and can be carried out by selecting an appropriate standard technique known in the art according to the host cell. For example, the transformation method may include electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, BEAE(diethylaminoethyl)-dextran method, cationic liposome method, with lithium acetate and DMSO (dimethyl sulfoxide) and so on, but the method is not limited to this.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая указанный полинуклеотид или указанную генную экспрессионную кассету.According to another aspect of the present invention, there is provided a host cell comprising said polynucleotide or said gene expression cassette.
Конкретно, клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, без ограничения им.Specifically, the host cell may be a microorganism of the genus Corynebacterium, without limitation.
Полинуклеотид и генная экспрессионная кассета являются такими, как описано выше.The polynucleotide and gene expression cassette are as described above.
При использовании здесь термин «микроорганизм» включает все из микроорганизма дикого типа и микроорганизма, генетически модифицированного естественным или искусственным образом, и представляет собой понятие, включающее микроорганизм, имеющий определенный механизм, ослабленный или усиленный вследствие введения чужеродного гена или усиления или ослабления активности эндогенного гена. В настоящем изобретении микроорганизм может включать любой микроорганизм без ограничения, при условии, что в него введен полинуклеотид по настоящему изобретению или он содержит полинуклеотид по настоящему изобретению.As used herein, the term "microorganism" includes all of a wild-type microorganism and a naturally or artificially genetically modified microorganism, and is a concept that includes a microorganism having a certain mechanism, weakened or enhanced due to the introduction of a foreign gene or the increase or decrease in the activity of an endogenous gene. In the present invention, the microorganism may include any microorganism, without limitation, as long as it contains the polynucleotide of the present invention or it contains the polynucleotide of the present invention.
В настоящем изобретении микроорганизм может содержать полинуклеотид, конкретно полинуклеотид и/или вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и более конкретно вектор, содержащий ген, кодирующий целевой белок, но без ограничения этим. Кроме того, полинуклеотид и вектор могут, без ограничения, быть введены в микроорганизм посредством трансформации.In the present invention, the microorganism may contain a polynucleotide, specifically a polynucleotide and/or a vector containing the specified polynucleotide, and more specifically a vector containing a gene encoding the target protein, but without limitation. In addition, the polynucleotide and the vector may, without limitation, be introduced into the microorganism through transformation.
Микроорганизм представляет собой клетку или микроорганизм, трансформированные вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению и ген, кодирующий целевой белок, для экспрессии целевого гена, и, применительно к задачам настоящего изобретения, клетка-хозяин или микроорганизм могут представлять собой любой микроорганизм, при условии, что он способен продуцировать целевой продукт, содержащий целевой белок.A microorganism is a cell or microorganism transformed with a vector containing a polynucleotide of the present invention and a gene encoding a target protein to express the target gene, and for purposes of the present invention, the host cell or microorganism may be any microorganism, provided that it is capable of producing the target product containing the target protein.
При использовании здесь термин «микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт», включает все из микроорганизма дикого типа и микроорганизма, генетически модифицированного естественным или искусственным образом, и относится к микроорганизму, имеющему определенный механизм, ослабленный или усиленный вследствие введения чужеродного гена или усиления или инактивации активности эндогенного гена. Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для получения целевого белка или продукта.As used herein, the term "microorganism producing a target protein or target product" includes all of a wild-type microorganism and a naturally or artificially genetically modified microorganism, and refers to a microorganism having a particular mechanism, attenuated or enhanced due to the introduction of a foreign gene or amplification or inactivation of endogenous gene activity. The microorganism may be a microorganism containing a genetic modification to obtain the target protein or product.
Применительно к задачам настоящего изобретения, микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную продуктивность в отношении целевого белка или целевого продукта за счет того, что он содержит полинуклеотид по настоящему изобретению. Конкретно, в настоящем изобретении микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт, или микроорганизм, имеющий продуктивность в отношении целевого белка или целевого продукта, может представлять собой микроорганизм, где усилены или ослаблены некоторые из генов пути биосинтеза целевого белка или целевого продукта, или усилены или ослаблены некоторые из генов пути деградации целевого белка или целевого продукта.With respect to the objectives of the present invention, the microorganism producing the target protein or target product may be a microorganism having increased productivity in relation to the target protein or target product due to the fact that it contains the polynucleotide of the present invention. Specifically, in the present invention, the microorganism producing the target protein or target product, or the microorganism having productivity in relation to the target protein or target product, may be a microorganism, where some of the genes of the biosynthetic pathway of the target protein or target product are enhanced or attenuated, or enhanced or weakened some of the genes of the degradation pathway of the target protein or target product.
Применительно к задачам настоящего изобретения, микроорганизм, содержащий полинуклеотид, может иметь повышенную продукцию L-аминокислоты, конкретно L-лизина.For purposes of the present invention, a microorganism containing a polynucleotide may have an increased production of an L-amino acid, specifically L-lysine.
В настоящем изобретении микроорганизм может включать любой микроорганизм без ограничения, при условии, что он представляет собой микроорганизм, в который введен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по настоящему изобретению, и, таким образом, в котором указанный полинуклеотид может действовать как промотор.In the present invention, the microorganism may include any microorganism without limitation, as long as it is a microorganism into which a polynucleotide having a promoter activity of the present invention has been introduced, and thus in which said polynucleotide can act as a promoter.
Конкретно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, более конкретно Corynebacterium glutamicum или Corynebacterium flavum, и наиболее конкретно Corynebacterium glutamicum, без ограничения этим.Specifically, the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium flavum, and most specifically Corynebacterium glutamicum, without limitation.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения целевого вещества, включающий стадии культивирования указанной клетки-хозяина в среде и выделения целевого вещества из среды.According to another aspect of the present invention, a method for obtaining a target substance is provided, comprising the steps of culturing said host cell in a medium and isolating the target substance from the medium.
Клетка-хозяин является такой, как описано выше.The host cell is as described above.
В настоящем изобретении целевое вещество может представлять собой аминокислоту. Конкретно, если не указано иное, аминокислота может представлять собой аминокислоту L-типа и может быть выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, треонина, серина, цистеина, глутамина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина и их комбинаций, без ограничения ими.In the present invention, the target substance may be an amino acid. Specifically, unless otherwise indicated, the amino acid may be an L-type amino acid and may be selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, threonine, serine, cysteine, glutamine, methionine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid. acid, lysine, arginine, histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, and combinations thereof, without limitation.
Более конкретно, аминокислота может представлять собой L-лизин, без ограничения этим.More specifically, the amino acid may be L-lysine, without limitation.
При использовании здесь термин «культивирование» относится к выращиванию микроорганизма в подходящих и искусственно контролируемых условиях окружающей среды. В настоящем изобретении способ получения целевого вещества с использованием микроорганизма, содержащего указанный полинуклеотид, может быть осуществлен с применением метода, широко известного в данной области. Конкретно, культивирование можно проводить методом периодической, подпитываемой или повторяющейся подпитываемой культуры, без ограничения этим. Среда, используемая для культивирования, должна подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Культуральные среды для микроорганизмов рода Corynebacterium раскрыты, например, в Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.As used herein, the term "cultivation" refers to the cultivation of a microorganism under suitable and artificially controlled environmental conditions. In the present invention, a method for producing a target substance using a microorganism containing said polynucleotide can be carried out using a method widely known in the art. Specifically, cultivation can be carried out by batch, fed-batch, or repetitive fed-batch culture, without being limited thereto. The medium used for cultivation should suitably meet the requirements for the particular strains. Culture media for microorganisms of the genus Corynebacterium are disclosed, for example, in the Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.
В качестве источника углерода, используемого в средах, могут быть включены: сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и так далее; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут быть использованы, без ограничения, по отдельности или в смеси.As the carbon source used in the media, sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose may be included; oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, and so on; fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid; alcohols such as glycerol and ethanol; and organic acids such as acetic acid. These substances can be used, without limitation, individually or in a mixture.
В качестве используемого источника азота могут быть включены пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука, мочевина или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут также быть использованы, без ограничения, по отдельности или в смеси.As the nitrogen source used, peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, liquid corn extract, soy flour, urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be included. Nitrogen sources may also be used, without limitation, alone or in a mixture.
В качестве используемого источника фосфора могут быть включены дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрийсодержащие соли. Кроме того, культуральная среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа, необходимую для роста. В завершение, помимо веществ, указанных выше, могут быть использованы вещества, необходимые для роста, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральной среде могут быть использованы подходящие предшественники. В процессе культивирования указанные выше вещества-источники можно адекватным образом добавлять в культуру периодическим или непрерывным образом.As the source of phosphorus used, potassium dihydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts may be included. In addition, the culture medium may contain a metal salt, such as magnesium sulfate or iron sulfate, necessary for growth. Finally, in addition to the substances mentioned above, substances necessary for growth, such as amino acids and vitamins, can be used. In addition, suitable precursors may be used in the culture medium. During cultivation, the above source substances can be adequately added to the culture in a batch or continuous manner.
Во время культивирования микроорганизма рН культуры можно подходящим образом корректировать с использованием основного соединения, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, или кислого соединения, такого как фосфорная кислота или серная кислота. Кроме того, пенообразование можно предотвращать с использованием пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Для поддержания аэробного состояния в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух).During cultivation of the microorganism, the pH of the culture can be appropriately adjusted using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia, or an acidic compound such as phosphoric acid or sulfuric acid. In addition, foaming can be prevented using a defoamer such as a polyglycol fatty acid ester. Oxygen or an oxygen-containing gas (eg, air) can be introduced into the culture to maintain an aerobic state.
Температура культуры (среды) может обычно составлять от 20 до 45° С, конкретно от 25 до 40°С. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества целевого вещества, но, конкретно, его можно осуществлять от 10 до 160 часов.The temperature of the culture (medium) can usually be from 20 to 45°C, in particular from 25 to 40°C. Cultivation can be continued until the desired amount of the target substance is obtained, but specifically, it can be carried out from 10 to 160 hours.
Применительно к выделению целевого вещества из культуры (среды), целевое вещество можно отделять и выделять обычным методом, известным в данной области. В методе разделения можно применять центрифугирование, фильтрование, хроматографию, кристаллизацию и так далее. Например, без ограничения, супернатант, полученный путем центрифугирования культуральной среды при низкой скорости и удаления биомассы, можно отделять посредством ионообменной хроматографии.With regard to the selection of the target substance from the culture (medium), the target substance can be separated and isolated by the usual method known in this field. The separation method can apply centrifugation, filtration, chromatography, crystallization and so on. For example, without limitation, the supernatant obtained by centrifuging the culture medium at low speed and removing the biomass can be separated by ion exchange chromatography.
Стадия выделения может дополнительно включать процесс очистки.The isolation step may further include a purification process.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение полинуклеотида в качестве промотора, где нуклеотид в положении 178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на другой нуклеотид.According to another aspect of the present invention, the use of a polynucleotide as a promoter is provided, wherein the nucleotide at position 178 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with another nucleotide.
Полинуклеотид является таким, как описано выше.The polynucleotide is as described above.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее, последующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для пояснения настоящего изобретения и, таким образом, не подразумевают ограничения объема настоящего изобретения. С другой стороны, технические подробности, не описанные в данном описании, могут быть в достаточной степени поняты и легко реализованы специалистами в данной области или областях, сходных с областью, к которой относится настоящее изобретение.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following Examples are merely preferred embodiments for illustrating the present invention and thus are not intended to limit the scope of the present invention. On the other hand, technical details not described in this specification can be sufficiently understood and easily implemented by those skilled in the art or fields similar to the field to which the present invention pertains.
Пример 1. Получение рекомбинантного вектора, содержащего новую промоторную последовательностьExample 1. Obtaining a recombinant vector containing a new promoter sequence
Сначала на основе базы данных GenBank Национальных институтов здравоохранения США (U.S. National Institutes of Health GenBank (NIH GenBank)) была получена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1), содержащая промоторную область NCg10859 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 дикого типа. Для изучения эффекта варианта промотора (PNCg10859(t178c), SEQ ID NO: 2), где нуклеотид, соответствующий положению 178 полинуклеотида SEQ ID NO: 1, был заменен с Т на С, на продукцию L-лизина, получали вектор для получения экспрессирующего его штамма с использованием плазмиды pDCM2 (публикация патента Кореи №10-2020-0136813) для введения и замены гена в хромосоме Corynebacterium.First, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) containing the NCg10859 promoter region of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wild-type was obtained from the U.S. National Institutes of Health GenBank (NIH GenBank) GenBank database. To study the effect of the promoter variant (PNCg10859(t178c), SEQ ID NO: 2), where the nucleotide corresponding to position 178 of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 was changed from T to C, on the production of L-lysine, a vector was obtained to obtain its expression strain using plasmid pDCM2 (Korean Patent Publication No. 10-2020-0136813) to introduce and replace a gene in the Corynebacterium chromosome.
Подробно, для проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) использовали гДНК (геномную ДНК) Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 дикого типа в качестве матрицы, пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4 и пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 5 и 6. Для проведения ПЦР с перекрывающимися фрагментами использовали смесь двух фрагментов, полученных, как описано выше, в качестве матриц и пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6, получая посредством этого фрагмент. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 минут; 30 циклов из 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд; и 72°С в течение 5 минут. Плазмиду pDCM2 обрабатывали Smal и полученный продукт ПЦР клонировали в нее методом слияния. При клонировании методом слияния использовали набор для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Полученный вектор был обозначен как pDCM2-PNCg10859(t178c). Информация о последовательностях праймеров, использованных для получения вектора, представлена в Таблице 1 ниже.In detail, the gDNA (genomic DNA) of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wild-type as a template, a pair of primers with the sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, and a pair of primers with the sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6, were used for PCR (polymerase chain reaction). For PCR with overlapping fragments, a mixture of two fragments obtained as described above was used as templates and a pair of primers with the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6, thereby obtaining a fragment. PCR was performed under the following conditions: denaturation at 94°C for 5 minutes; 30 cycles of 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute and 30 seconds; and 72°C for 5 minutes. Plasmid pDCM2 was treated with Smal and the resulting PCR product was cloned into it by the fusion method. Fusion cloning used the In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech). The resulting vector was designated pDCM2-PNCg10859(t178c). Information about the primer sequences used to obtain the vector is presented in Table 1 below.
Пример 2. Оценка продуктивности микроорганизма, содержащего новую промоторную последовательность, в отношении L-лизина 2-1. Получение штамма, экспрессирующего вариант PNCg10859Example 2 Evaluation of the productivity of a microorganism containing a new promoter sequence in relation to L-lysine 2-1. Obtaining a strain expressing the PNCg10859 variant
Вектор с замененным геном, полученный в Примере 1, вводили в Corynebacterium glutamicum CJ3P (US 9556463 В2) с получением штамма с введенным вариантом, продуцирующего L-лизин, «CJ3P_PNCg10859(tl78c)».The gene-swapped vector obtained in Example 1 was introduced into Corynebacterium glutamicum CJ3P (US 9556463 B2) to obtain an L-lysine producing variant introduced strain "CJ3P_PNCg10859(tl78c)".
Подробно, осуществляли трансформацию посредством электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 52:541-545) и затем осуществляли отбор штамма, в хромосому которого посредством гомологичной рекомбинации последовательностей был введен вектор, на агаровой питательной среде, содержавшей 25 мг/л канамицина. Первично отобранный штамм подвергали вторичному кроссинговеру для отбора штамма, в который был введен целевой вариант. Вариант (замену) у конечного трансформированного штамма анализировали посредством ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8 с последующим секвенированием. Информация о последовательностях праймеров, использованных для получения штамма, экспрессирующего вариант PNCg10859, представлена в Таблице 2 ниже.In detail, transformation was carried out by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 52:541-545) and then the selection of the strain, into the chromosome of which the vector was introduced by homologous recombination of sequences, was carried out on an agar nutrient medium containing 25 mg/l kanamycin . The primary selected strain was subjected to secondary crossover to select the strain into which the target variant was introduced. The variant (replacement) in the final transformed strain was analyzed by PCR using a pair of primers with SEQ ID NO: 7 and 8, followed by sequencing. Primer sequence information used to generate a strain expressing the PNCg10859 variant is shown in Table 2 below.
2-2. Сравнение продуктивности штамма, экспрессирующего вариант PNCg10859, в отношении L-лизина2-2. Comparison of the productivity of a strain expressing the PNCg10859 variant with respect to L-lysine
Продуктивность в отношении L-лизина анализировали по титрам штамма, полученного в Примере 2-1, и контрольного исходного штамма, при ферментации в колбах.Productivity in relation to L-lysine was analyzed by the titers of the strain obtained in Example 2-1, and the control of the original strain, when fermented in flasks.
Сначала каждый штамм вносили в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержавшую 25 мл посевной среды, и культивировали с покачиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. 1 мл раствора посевной культуры вносили в колбу с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержавшую 24 мл среды для продуцирования, и культивировали с покачиванием при 30°С в течение 72 часов при 200 об/мин. В связи с этим, состав посевной среды и среды для продуцирования был следующим.First, each strain was introduced into a 250 ml baffled flask containing 25 ml of seed medium and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm. 1 ml of the inoculum solution was introduced into a 250 ml baffled flask containing 24 ml of production medium, and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm. In this regard, the composition of the seed medium and production medium was as follows.
Посевная среда (рН 7,0)Seed medium (pH 7.0)
20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 0,1мг биотина, 1мг тиамина-HCl, 2 мг пантотената кальция и 2 мг никотинамида (на 1 л дистиллированной воды).20 g glucose, 10 g peptone, 5 g yeast extract, 1.5 g urea, 4 g KH 2 PO 4 , 8 g K 2 HPO 4 , 0.5 g MgSO 4 ⋅7H 2 O, 0.1 mg biotin, 1 mg thiamine-HCl, 2 mg calcium pantothenate and 2 mg nicotinamide (per 1 liter of distilled water).
Среда для продуцирования (рН 7,0)Production medium (pH 7.0)
100 г глюкозы, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г соевого белка, 5 г сухого кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г КН2РО4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида и 30 г СаСО3 (на 1 л дистиллированной воды).100 g glucose, 40 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.5 g soy protein, 5 g dry corn extract, 3 g urea, 1 g KH 2 PO 4 , 0.5 g MgSO 4 ⋅7H 2 O, 100 µg of biotin, 1000 µg of thiamine-HCl, 2000 µg of calcium pantothenate, 3000 µg of nicotinamide and 30 g of CaCO 3 (per 1 liter of distilled water).
По завершении культивирования продуктивность в отношении L-лизина измеряли с применением ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), и концентрация лизина в культуральной среде и степень повышения концентрации для каждого штамма показаны в Таблице 3 ниже.After completion of cultivation, the L-lysine productivity was measured using HPLC (high performance liquid chromatography), and the concentration of lysine in the culture medium and the degree of concentration increase for each strain are shown in Table 3 below.
Как показано в Таблице 3, было подтверждено, что штамм Corynebacterium glutamicum CJ3P PNCg10859(t178c), в который был введен вариант, продемонстрировал повышение концентрации L-лизина на 22,5% по сравнению со штаммом Corynebacterium glutamicum CJ3P, в который не был введен вариант.As shown in Table 3, it was confirmed that the strain of Corynebacterium glutamicum CJ3P PNCg10859(t178c) in which the variant was introduced showed an increase in the concentration of L-lysine by 22.5% compared with the Corynebacterium glutamicum CJ3P strain in which the variant was not introduced. .
Иными словами, было подтверждено, что рассматриваемый вариант существенно повышал продуктивность микроорганизма в отношении L-лизина.In other words, it was confirmed that the considered option significantly increased the productivity of the microorganism in relation to L-lysine.
На основании приведенного выше описания специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в различных конкретных формах без изменения его технической идеи или существенных признаков.Based on the above description, it will be clear to those skilled in the art that the present invention may be embodied in various specific forms without changing its technical idea or essential features.
В этой связи, следует понимать, что во всех аспектах описанные выше воплощения приведены для наглядности и не являются ограничивающими. Объем изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием, и поэтому подразумевают, что формула изобретения включает все изменения и модификации, не выходящие за рамки границ и пределов формулы изобретения или эквивалентов таких границ и пределов.In this regard, it should be understood that, in all aspects, the embodiments described above are for illustrative purposes and are not restrictive. The scope of the invention is defined by the appended claims and not by the preceding description, and therefore the claims are intended to include all changes and modifications not exceeding the bounds and limits of the claims or the equivalents of such bounds and limits.
Эффект изобретения Новый промотор по настоящему изобретению вводят в микроорганизм, продуцирующий аминокислоту, для повышения продуктивности микроорганизма в отношении этой аминокислоты. В частности, при получении аминокислоты с использованием нового промотора L-лизин, который до настоящего времени получали существующими методами синтеза, можно получать методом ферментации, и, таким образом, промотор может быть полезным образом использован для получения аминокислот.Effect of the Invention The novel promoter of the present invention is introduced into an amino acid-producing microorganism to increase the productivity of the microorganism for that amino acid. In particular, when producing an amino acid using a new promoter, L-lysine which has been obtained by the existing synthetic methods so far can be obtained by fermentation, and thus the promoter can be usefully used to produce amino acids.
<110> CJ CheilJedang Corporation<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Novel promoter and use thereof<120> Novel promoter and use thereof
<130> OPA21218<130>OPA21218
<150> KR 10-2021-0059092<150> KR 10-2021-0059092
<151> 2021-05-07<151> 2021-05-07
<160> 8<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1<210> 1
<211> 400<211> 400
<212> DNA<212> DNA
<213> Unknown<213> Unknown
<220><220>
<223> промотор<223> promoter
<400> 1<400> 1
acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60
caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120
aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagctct 180aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagctct 180
gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240
taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300
aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360
gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400
<210> 2<210> 2
<211> 400<211> 400
<212> DNA<212> DNA
<213> Unknown<213> Unknown
<220><220>
<223> вариант промотора<223> promoter variant
<400> 2<400> 2
acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60
caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120
aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagccct 180aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagccct 180
gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240
taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300
aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360
gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400
<210> 3<210> 3
<211> 37<211> 37
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> праймер 1F<223> primer 1F
<400> 3<400> 3
tgaattcgag ctcggtaccc ccaccgcctt cacaccg 37tgaattcgag ctcggtaccc ccaccgcctt cacaccg 37
<210> 4<210> 4
<211> 33<211> 33
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> праймер 2R<223> primer 2R
<400> 4<400> 4
gatcgaaaag aatcagggct tgtgacgatt atc 33gatcgaaaag aatcaggggct tgtgacgatt atc 33
<210> 5<210> 5
<211> 33<211> 33
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> праймер 3F<223> primer 3F
<400> 5<400> 5
gataatcgtc acaagccctg attcttttcg atc 33gataatcgtc acaagccctg attcttttcg atc 33
<210> 6<210> 6
<211> 38<211> 38
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> праймер 4R<223> primer 4R
<400> 6<400> 6
gtcgactcta gaggatcccc gcagtacata gatcgggg 38gtcgactcta gaggatcccc gcagtacata gatcgggg 38
<210> 7<210> 7
<211> 17<211> 17
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> праймер 5F<223> primer 5F
<400> 7<400> 7
ccggcttgag cagttcg 17ccggcttgag cagttcg 17
<210> 8<210> 8
<211> 17<211> 17
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> праймер 6R<223> primer 6R
<400> 8<400> 8
gcgacgaagg atcctgg 17gcgacgaagg atcctgg 17
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2021-0059092 | 2021-05-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787592C1 true RU2787592C1 (en) | 2023-01-11 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188236C2 (en) * | 1998-03-18 | 2002-08-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Method of l-glutamic acid producing |
| US9556463B2 (en) * | 2013-10-15 | 2017-01-31 | Cj Cheiljedang Corporation | Genes encoding biofilm formation inhibitory proteins and a method for producing L-lysine using a bacterial strain with the inactivated genes |
| WO2018043856A1 (en) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 씨제이제일제당 (주) | Novel promoter and use thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188236C2 (en) * | 1998-03-18 | 2002-08-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Method of l-glutamic acid producing |
| US9556463B2 (en) * | 2013-10-15 | 2017-01-31 | Cj Cheiljedang Corporation | Genes encoding biofilm formation inhibitory proteins and a method for producing L-lysine using a bacterial strain with the inactivated genes |
| WO2018043856A1 (en) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 씨제이제일제당 (주) | Novel promoter and use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PATEK M. et al., Promoters of Corynebacterium glutamicum, Journal of Biotechnology, 2003, Volume 104, Issues 1-3, pp.311-323. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6998466B2 (en) | Mutant polypeptide with weakened citrate synthase activity and L-amino acid production method using it | |
| CN111655860A (en) | Novel promoter and method for producing L-amino acid using same | |
| KR102277407B1 (en) | Novel glutamate synthase subunit alpha variant and a method for producing L-glutamic acid using the same | |
| RU2732338C1 (en) | Microorganism for producing l-amino acid with high activity of α-glucosidase and method of producing l-amino acid using thereof | |
| RU2747494C1 (en) | New o-succinyl homoserine transferase mutant and method for synthesis of o-succinyl homoserine using said mutant | |
| KR102273638B1 (en) | Novel Phosphoglycerate dehydrogenase variant and a method for producing XMP or GMP using the same | |
| RU2787592C1 (en) | New promoter and application thereof | |
| RU2787780C1 (en) | New promoter and application thereof | |
| JP2024503049A (en) | GlxR protein mutant or threonine production method using the same | |
| JP2023553135A (en) | Novel branched-chain amino acid aminotransferase mutant and method for producing isoleucine using the same | |
| CN113994002B (en) | Novel promoter and use thereof | |
| CN113994003B (en) | Novel promoter and use thereof | |
| RU2817768C2 (en) | Microorganism having enhanced ability to produce l-amino acid with branched chain, and method of producing l-amino acid with branched chain using same | |
| RU2792640C1 (en) | New variant of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and method for obtaining l-valine with its use | |
| RU2793368C1 (en) | New version of the transcription regulator and a method for obtaining l-valine with its use | |
| RU2794484C1 (en) | New option of dahp synthases and a method for obtaining l-lysine with its use | |
| RU2795162C1 (en) | New option of the transcription regulator whca of the whib family and a method for producing l-valine using it | |
| KR102339264B1 (en) | Novel promoter and use thereof | |
| RU2792638C1 (en) | New variant of branch-chain amino acid permease and method for producing l-valine with its use | |
| RU2793435C1 (en) | New variant of the membrane protein terc and a method for obtaining l-lysine using it | |
| RU2793405C1 (en) | New protein variant and method for obtaining l-valine with its use | |
| KR102339271B1 (en) | Novel promoter and use thereof | |
| RU2805078C1 (en) | MICROORGANISM CONTAINING LysE VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID USING IT | |
| RU2794279C1 (en) | New variant of 2-isopropylmalate synthase and a method for obtaining l-valine with its use | |
| RU2793436C1 (en) | New variant of sugar phosphate-isomerase/epimerase and a method for obtaining l-lysine with its use |