RU2787384C1 - Bacillus subtilis subsp. inaquosorum with antagonistic action against pathogenic and opportunitical microorganisms - Google Patents
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum with antagonistic action against pathogenic and opportunitical microorganisms Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787384C1 RU2787384C1 RU2022114530A RU2022114530A RU2787384C1 RU 2787384 C1 RU2787384 C1 RU 2787384C1 RU 2022114530 A RU2022114530 A RU 2022114530A RU 2022114530 A RU2022114530 A RU 2022114530A RU 2787384 C1 RU2787384 C1 RU 2787384C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- subtilis
- microorganisms
- vkm
- inaquosorum
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 241000220915 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum Species 0.000 title claims description 12
- 235000000102 Bacillus subtilis subsp inaquosorum Nutrition 0.000 title claims description 8
- 230000000529 probiotic Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims abstract description 16
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 abstract description 68
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 abstract description 6
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 abstract description 4
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 21
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 20
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 5
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 4
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 229940030998 Streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 4
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229940032049 Enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 3
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenases Human genes 0.000 description 3
- 108091000084 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 241000018541 Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10 Species 0.000 description 2
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 2
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 2
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 229940115931 Listeria monocytogenes Drugs 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 229940055023 Pseudomonas aeruginosa Drugs 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 229940037645 Staphylococcus epidermidis Drugs 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1CO[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 2
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000401513 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940105657 CATALASE Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 EC 1.11.1.6 Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 EC 1.11.1.6 Proteins 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 210000003495 Flagella Anatomy 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 1
- 241000194024 Streptococcus salivarius Species 0.000 description 1
- 229920000147 Styrene maleic anhydride Polymers 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229960003487 Xylose Drugs 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal Effects 0.000 description 1
- 150000001479 arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 101700013200 gyrB1 Proteins 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 200000000011 liver disorder Diseases 0.000 description 1
- 101700049451 lppL Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 230000002644 neurohormonal Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 101700072042 parE Proteins 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000004537 potential cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
[0001] Настоящие изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к получению штамма Bacillus subtilis subsp. inaquosorum, подходящего для создания пробиотиков и метабиотиков за счет антагонистического действия в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.[0001] The present invention relates to the field of biotechnology and medicine, namely to obtain a strain of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum , suitable for the creation of probiotics and metabiotics due to the antagonistic action against pathogenic and opportunistic microorganisms.
Уровень техникиState of the art
[0002] Пробиотические микроорганизмы являются непатогенными и нетоксикогенными для человека микроорганизмами, которые способны восстанавливать нормальную микрофлору органов за счет усиления роста симбиотических бактерий и/илиподавления роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В составе пробиотиков и метабиотиков часто используют бактерии Bacillus subtilis (B. subtilis) и их метаболиты. B. subtilis представляют вид факультативно аэробной спорообразующейих почвенной бактерий, положительных по Граму. На сегодняшний день вид Bacillus subtilis - один из наиболее известных и тщательно изученных представителей рода бацилл (Bacillus). Вид B. subtilis в настоящее время включает четыре подвида: Subtilis, Inaquosorum, Spizizenii и Stercoris [1]. Большинство бактерий вида B. subtilis не относятся к патогенным для человека микроорганизмам. Отсутствие патогенности и токсичности у штаммов B. subtilis и их метаболитов позволяет считать их наиболее перспективными в качестве основы пробиотиков и метабиотиков нового поколения [2].[0002] Probiotic microorganisms are non-pathogenic and non-toxic for humans microorganisms that are able to restore the normal microflora of organs by enhancing the growth of symbiotic bacteria and/or inhibiting the growth of pathogenic and opportunistic microorganisms. The bacteria Bacillus subtilis (B. subtilis) and their metabolites are often used as part of probiotics and metabiotics. B. subtilis is a Gram-positive facultative aerobic spore-forming soil bacteria. To date, the species Bacillus subtilis is one of the most famous and carefully studied representatives of the genus Bacillus ( Bacillus ). The species B. subtilis currently includes four subspecies: Subtilis , Inaquosorum , Spizizenii , and Stercoris [1]. Most bacteria of the B. subtilis species are not pathogenic for humans. The absence of pathogenicity and toxicity in B. subtilis strains and their metabolites allows us to consider them the most promising as the basis of new generation probiotics and metabiotics [2].
[0003] Известно широкое применение метаболитов штаммов B. subtilis в качестве компонентов композиций для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, в частности для коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника [3-5]. В патентах приводятся композиции, в состав которых входят метаболиты пробиотического штамма бактерий B. subtilis ВКПМ № В-2335 (RU2589818; опубл.: 10.07.2016; МПК: A61K35/02; A61K35/74; A61K36/899; A61K47/48; A61K9/48). Данный штамм использовали при создании препарата «Биоспорин» в 1991г. [6]. Однако описанный штамм B. subtilis ВКПМ № В-2335 обладает недостаточно высокой эффективностью применения.[0003] It is known that metabolites of B. subtilis strains are widely used as components of compositions for the treatment of diseases of the gastrointestinal tract, in particular for the correction of dysbiotic disorders of the intestinal microbiocenosis [3-5]. Patents contain compositions containing metabolites of the probiotic bacterial strain B. subtilis VKPM No. B-2335 (RU2589818; publ.: 07/10/2016; IPC: A61K35/02; A61K35/74; A61K36/899; A61K47/48; A61K9 /48). This strain was used to create the drug "Biosporin" in 1991. [6]. However, the described strain of B. subtilis VKPM No. B-2335 has insufficiently high application efficiency.
[0004] В данном изобретении предлагается новый штамм, относящийся к подвиду B. subtilis subsp. inaquosorum.[0004] This invention proposes a new strain belonging to the subspecies of B. subtilis subsp. inaquosorum.
[0005] Известны несколько штаммов подвида B. subtilis subsp. inaquosorum: DV7-B-4, DSM 22148, KCTC 13429, BGSC 3A28, NRRL B-23052, CIP 110137, которые выделены из почвы [7]. В патенте KR101635987 (опубл.: 07.07.2016; МПК: A61K35/74; A61K36/48; A61P1/16) описан состав композиции для профилактики и лечения заболеваний печени, включающий ферментированный соевый продукт, полученный с использованием B. subtilis subsp. inaquosorum FA0718 (Accession No. KCCM 11280P) в качестве активного ингредиента [8]. Ферментированный соевый продукт, полученный с использованием B. subtilis subsp. inaquosorum ингибирует фиброз печени, обладая активностью, ингибирующей экспрессию альфа-SMA.[0005] Several strains of the B. subtilis subsp. subspecies are known. inaquosorum: DV7-B-4, DSM 22148, KCTC 13429, BGSC 3A28, NRRL B-23052, CIP 110137, which were isolated from the soil [7]. Patent KR101635987 (publ.: 07/07/2016; IPC: A61K35/74; A61K36/48; A61P1/16) describes the composition of the composition for the prevention and treatment of liver diseases, including a fermented soy product obtained using B. subtilis subsp. inaquosorum FA0718 (Accession No. KCCM 11280P) as an active ingredient [8]. A fermented soy product made using B. subtilis subsp. inaquosorum inhibits hepatic fibrosis by having an activity that inhibits the expression of alpha-SMA.
[0006] Известно применение штамма B. subtilis subsp. inaquosorum DE111 совместно со штаммом HU Biol-II при производстве пробиотического средства для человека. [9, 10].[0006] It is known to use a strain of B. subtilis subsp. inaquosorum DE111 together with the HU Biol-II strain in the production of a probiotic agent for humans. [9, 10].
[0007] В качестве ближайшего аналога заявляемого штамма рассмотрен штамм Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T [11], который обладает высоким генетическим сходством с заявленным штаммом. Однако в уровне техники не найдено примеров применения штамма KCTC 13429T для производства эффективных лекарственных средств, обладающих антагонистическим действием в отношении патогенных микроорганизмов.[0007] As the closest analogue of the claimed strain, the strain of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T [11], which has a high genetic similarity with the claimed strain. However, no examples of the use of the KCTC 13429T strain for the production of effective drugs with an antagonistic effect against pathogenic microorganisms have been found in the prior art.
[0008] В настоящее время существует необходимость в расширении арсенала штаммов B. subtilis, обладающих широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.[0008] Currently, there is a need to expand the arsenal of B. subtilis strains that have a broad antagonistic effect against pathogenic and opportunistic microorganisms.
Термины и сокращенияTerms and abbreviations
[0009] Культуральная жидкость - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток [12]. [0009] Culture fluid - a liquid medium obtained by culturing various pro- and eukaryotic cells in vitro and containing residual nutrients and metabolic products of these cells [12].
[0010] Культуральная суспензия - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая культивируемые клетки и/или споры. [0010] Culture suspension - liquid medium obtained by culturing various pro- and eukaryotic cellsin vitro and containing cultured cells and/or spores.
[0011] Метабиотики - вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина [13]. [0011] Metabiotics - substances that are structural components of probiotic microorganisms and / or their metabolites that are able to optimize physiological functions, metabolic, epigenetic, informational, regulatory, transport, immune, neurohormonal, and / or behavioral responses associated with the activity of symbiotic (indigenous ) microflora of the host organism [13].
[0012] Пермеат - фаза, прошедшая через мембрану в процессе мембранного разделения, основанного на преимущественной проницаемости одного или нескольких компонентов жидкой либо газовой смеси, а также коллоидной системы, через разделительную перегородку-мембрану. При этом задержанная фаза называется концентратом [14]. [0012] Permeate - a phase that has passed through the membrane in the process of membrane separation, based on the predominant permeability of one or more components of a liquid or gas mixture, as well as a colloidal system, through a separating membrane. In this case, the delayed phase is called a concentrate [14].
[0013] Пробиотики - функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника [15]. [0013] Probiotics - a functional food ingredient in the form of non-pathogenic and non-toxicogenic living microorganisms useful for humans, which, when systematically consumed in the form of preparations or as part of food products, has a beneficial effect on the human body as a result of normalizing the composition and / or increasing the biological activity of normal microflora intestines [15].
[0014] Тангенциальная ультрафильтрация - ультрафильтрация, в процессе которой фильтруемая жидкость движется параллельно мембране. [0014] Tangential ultrafiltration - ultrafiltration, during which the filtered liquid moves parallel to the membrane.
[0015] Ультрафильтрация - процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемый путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны. При этом размер выделяемых частиц (т.е. частицы какого размера не проходят через фильтр, а остаются в концентрате) составляет приблизительно 0,001-0,05 мкм (5-500 кДа). [0015] Ultrafiltration is a process of membrane separation, as well as fractionation and concentration of substances, carried out by filtering a liquid under the action of a pressure difference before and after the membrane. In this case, the size of the emitted particles (ie, particles of what size do not pass through the filter, but remain in the concentrate) is approximately 0.001-0.05 microns (5-500 kDa).
[0016] КОЕ - колониеобразующая единица. [0016] CFU - colony forming unit.
[0017] об/об/мин - объем подаваемый на объем рабочий в минуту. [0017] rpm - the volume supplied to the working volume per minute.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
[0018] Задачей настоящего изобретения является выделение нового штамма бактерий Bacillus subtilis для создания пробиотиков и метабиотиков.[0018] The objective of the present invention is to isolate a new strain of bacteria Bacillus subtilis to create probiotics and metabiotics.
[0019] Данная задача решается заявленным изобретением за счет достижения такого технического результата, как обнаружение нового штамма Bacillus subtilis subsp. inaquosorum ВКМ В-3536D с возможностью применения для создания пробиотиков и метабиотиков.[0019] This problem is solved by the claimed invention by achieving such a technical result as the discovery of a new strain of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum VKM B-3536D with the possibility of using for the creation of probiotics and metabiotics.
[0020] Заявленный технический результат достигается за счет того, что штамм Bacillus subtilis subsp. inaquosorum ВКМ В-3536D (далее B. subtilis ВКМ В-3536D) обладает антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также адаптацией штамма B. subtilis ВКМ В-3536D для культивирования в лабораторных и промышленных питательных средах. [0020] The claimed technical result is achieved due to the fact that the strain of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum VKM B-3536D (hereinafter B. subtilis VKM B-3536D) has an antagonistic effect against pathogenic and opportunistic microorganisms, as well as adaptation of the B. subtilis VKM B-3536D strain for cultivation in laboratory and industrial nutrient media.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
[0021] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.[0021] In the following detailed description of an implementation of the invention, numerous implementation details are provided to provide a clear understanding of the present invention. However, one skilled in the art will appreciate how the present invention can be used, both with and without these implementation details. In other cases, well-known methods, procedures, and components are not described in detail so as not to unduly obscure the features of the present invention.
[0022] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.[0022] In addition, from the foregoing it is clear that the invention is not limited to the above implementation. Numerous possible modifications, alterations, variations, and substitutions that retain the spirit and form of the present invention will be apparent to those skilled in the art.
[0023] Заявленный штамм B. subtilis депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук» под регистрационным номером ВКМ В-3536D.[0023] The claimed strain of B. subtilis is deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. G.K. Skryabin, a separate division of the Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences" under registration number VKM B-3536D.
[0024] Заявленный штамм выделен из природных источников Ленинградской области. При этом заявленный штамм получил название B. subtilis SA44. В настоящей заявке преимущественно используется название штамма в соответствии с номером, полученном при депонировании. Однако следует понимать, что названия «B. subtilis ВКМ В-3536D» и «B. subtilis SA44» обозначают один и тот же штамм.[0024] The claimed strain is isolated from natural sources in the Leningrad region. While the claimed strain was named B. subtilis SA44. In the present application, the name of the strain is predominantly used in accordance with the number obtained upon deposit. However, it should be understood that the names " B. subtilis VKM B-3536D" and " B. subtilis SA44" refer to the same strain.
[0025] Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D является диким штаммом с неизменными свойствами. Заявленный штамм представлен подвижными эндоспорообразующими грамположительными палочками. Они образуют круглые, выпуклые, складчатые колонии беловатого цвета, диаметром 2 - 3 мм. Размер клеток составляет 0.6-0.8μ х 1.8-2.8 μ. Клеточная стенка и реакция по Граму - Грам-положительная. Споры овальные, спорангий не раздут, диаметр спор равен диаметру клетки, расположены центрально и парацентрально. Образуют перитрихиальное жгутикование.[0025] B. subtilis strain VKM B-3536D is a wild strain with unchanged properties. The claimed strain is represented by mobile endospore-forming gram-positive rods. They form round, convex, folded whitish colonies, 2-3 mm in diameter. Cell size is 0.6-0.8μ x 1.8-2.8μ. Cell wall and Gram reaction - Gram-positive. The spores are oval, the sporangium is not swollen, the spore diameter is equal to the cell diameter, they are located centrally and paracentrally. They form a peritrichous flagella.
[0026] Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D может расти при 55°С на питательной среде с 7% NaCl и рН 5.7. Заявленный штамм обладает следующими биохимическими признаками: [0026] The B. subtilis strain VKM B-3536D can grow at 55°C on a nutrient medium with 7% NaCl and pH 5.7. The claimed strain has the following biochemical characteristics:
• оксидазо- и каталазо- положительный;• oxidase- and catalase-positive;
• аэроб, но способен расти в анаэробных условаиях;• aerobic, but able to grow under anaerobic conditions;
• реакция Вогкс-Проскауэра (V-P) - положительная;• Vogks-Proskauer reaction (V-P) - positive;
• утилизирует цитрат, продуцирует нитраты из нитритов;• utilizes citrate, produces nitrates from nitrites;
• образует кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннитола;• forms acid from glucose, arabinose, xylose, mannitol;
• гидролизует желатин, казеин и крахмал.• hydrolyzes gelatin, casein and starch.
[0027] В рамках заявленного изобретения штамм B. subtilis ВКМ В-3536D был адаптирован под культивирование в лабораторных и промышленных питательных средах. В одном варианте реализации штамм B. subtilis ВКМ В-3536D культивируют на твердой питательной среде. При этом может быть использован питательный агар, например, питательный агар BBL® или питательный агар DIFCO®. При этом культивирование штамма на твердой питательной среде проводят посевом с использованием метода штрихов. [0027] In the framework of the claimed invention, the B. subtilis VKM B-3536D strain was adapted for cultivation in laboratory and industrial nutrient media. In one embodiment, the B. subtilis VKM B-3536D strain is cultured on a solid nutrient medium. Nutrient agar, such as BBL® Nutrient Agar or DIFCO® Nutrient Agar, can be used. At the same time, the cultivation of the strain on a solid nutrient medium is carried out by seeding using the stroke method.
[0028] В другом варианте реализации штамм B. subtilis ВКМ В-3536D культивируют в жидкой питательной среде. При этом жидкая среда для культивирования штамма B. subtilis ВКМ В-3536D может иметь исходный рН 7,0±0,2. В состав жидкой питательной среды входят: пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза, сульфат магния, сульфат марганца, хлорид кальция, калиевые соли ортофорсфорной кислоты и вода. [0028] In another embodiment, the B. subtilis VKM B-3536D strain is cultured in a liquid nutrient medium. In this case, the liquid medium for cultivating the strain B. subtilis VKM B-3536D may have an initial pH of 7.0 ± 0.2. The composition of the liquid nutrient medium includes: peptone, yeast extract, glucose, magnesium sulfate, manganese sulfate, calcium chloride, potassium salts of orthophoric acid and water.
[0029] Существенным фактором для формирования спор, составляющих основу биомассы штамма B. subtilis ВКМ В-3536D в культуральной суспензии, является соотношение источника углерода (глюкоза) и аминного азота (пептон). В предпочтительном варианте реализации указанное соотношение составляет приблизительно 4:1. Пептон может быть получен из молока, мяса животных и/или из дрожжей.[0029] An essential factor for the formation of spores, which form the basis of the biomass of the strain B. subtilis VKM B-3536D in a cultural suspension, is the ratio of the carbon source (glucose) and amine nitrogen (peptone). In a preferred embodiment, this ratio is approximately 4:1. The peptone can be obtained from milk, animal meat and/or yeast.
[0030] В одном варианте реализации питательная среда может дополнительно включать факторы роста и/или специальные добавки. В предпочтительном варианте реализации питательная среда не включает дополнительных компонентов.[0030] In one embodiment, the implementation of the nutrient medium may further include growth factors and/or special additives. In a preferred embodiment, the implementation of the nutrient medium does not include additional components.
[0031] При глубинном культивировании в жидкой питательной среде штамм B. subtilis ВКМ В-3536D вносят в жидкую питательную среду в количестве приблизительно 0,5% объема жидкой питательной среды. Полученную смесь инкубируют при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации. Инкубацию проводят до достижения рН 8,5-8,9 культуральной жидкости и/или до достижения созревания более 90%. В предпочтительном варианте реализации культивирование проводят в ферментере. При этом коэффициент заполнения ферментера может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Указанный коэффициент заполнения, с одной стороны, позволяет избежать нежелательного пенообразования, и с другой стороны, позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения биомассы штамма. Это особенно актуально при использовании штамма для получения пробиотиков и/или метабиотиков в промышленных количествах. В результате культивирования получают культуральную суспензию, биомасса которой преимущественно представлена спорами штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Далее культуральная суспензия штамма B. subtilis ВКМ В-3536D может быть использована для создания пребиотиков и/или метабиотиков, или может храниться для последующего культивирования штамма.[0031] In submerged culture in a liquid nutrient medium, the B. subtilis strain VKM B-3536D is introduced into the liquid nutrient medium in an amount of approximately 0.5% of the volume of the liquid nutrient medium. The resulting mixture is incubated at a temperature of 36-38°C with constant stirring and aeration. Incubation is carried out until a pH of 8.5-8.9 of the culture fluid is reached and/or until a maturation of more than 90% is reached. In a preferred embodiment, the cultivation is carried out in a fermenter. The fill factor of the fermenter can be from about 60% to about 70%. The specified fill factor, on the one hand, avoids unwanted foaming, and on the other hand, allows the most efficient use of equipment for obtaining strain biomass. This is especially true when using the strain to produce probiotics and/or metabiotics in industrial quantities. As a result of cultivation, a cultural suspension is obtained, the biomass of which is mainly represented by spores of the strain B. subtilis VKM B-3536D. Further, the culture suspension of the strain B. subtilis VKM B-3536D can be used to create prebiotics and/or metabiotics, or can be stored for subsequent cultivation of the strain.
[0032] Способ хранения штамма B. subtilis ВКМ В-3536D в одном варианте реализации включает периодический пересев штамма B. subtilis ВКМ В-3536D с последующим хранением при 4-6°С. В другом варианте реализации штамм B. subtilis ВКМ В-3536D хранят в лиофилизированном состоянии.[0032] A method for storing a B. subtilis VKM B-3536D strain in one embodiment comprises periodically reseeding the B. subtilis VKM B-3536D strain, followed by storage at 4-6°C. In another embodiment, the B. subtilis VKM B-3536D strain is stored in a lyophilized state.
[0033] Способ выделения метаболитов штамма B. subtilis ВКМ В-3536D включает следующие этапы. Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D культивируют в жидкой питательной среде, как указано выше. Затем культуральную суспензию подвергают центрифугированию на проточной центрифуге. При этом происходит отделение основного количества биомассы B. subtilis ВКМ В-3536D от культуральной жидкости, включающей метаболиты штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Полученную культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации. В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию.[0033] The method for isolating metabolites of B. subtilis strain VKM B-3536D includes the following steps. The B. subtilis VKM B-3536D strain is cultivated in a liquid nutrient medium as described above. The culture suspension is then subjected to centrifugation in a flow centrifuge. When this occurs, the separation of the main amount of the biomass of B. subtilis VKM B-3536D from the culture fluid, including metabolites of the strain B. subtilis VKM B-3536D. The resulting culture liquid is subjected to ultrafiltration. In a preferred embodiment, tangential ultrafiltration is used.
[0034] Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D может применяться для получения пробиотиков и/или метабиотиков, действие которых основано на подавлении широкого ряда патогенных и/или условно патогенных микроорганизмов. Указанный ряд включает, но не ограничивается этим: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcuss alivarius, Streptococcus mitis.[0034] B. subtilis strain VKM B-3536D can be used to produce probiotics and/or metabiotics, the action of which is based on the suppression of a wide range of pathogenic and/or opportunistic microorganisms. This range includes, but is not limited to: Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes , Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Staphylococcus epidermidis , Streptococcus agalactiae , Enterococcus faecium , Enterococcus faecalis , Streptococcuss alivarius , Streptococcus mitis .
Описание реализации изобретенияDescription of the implementation of the invention
[0035][0035] Пример 1. Генетический анализ Example 1 Genetic Analysis B. subtilis B. subtilis ВКМ В-3536D. VKM B-3536D.
[0036] Для идентификации заявленного штамма было проведено выделение ДНК из культуры клеток ВКМ В-3536D [16]. Затем на приборе GeneAmp PCR System 2700 (“Applied Biosystems”, США) методом ПЦР амплифицировали фрагмент гена gyrB с использованием универсальных праймеров Up1F и UP2R. Определение нуклеотидной последовательности продукта ПЦР проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с праймером Up1S и последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Нуклеотидную последовательность фрагмент гена gyrB заявленного штамма B. subtilis ВКМ В-3536D сравнивали с нуклеотидными последовательностями аналогичных фрагментов гена gyrB штаммов B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T, B. subtilis subsp. spizizenii TU-B-10T, B. subtilis DSM 10T. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена gyrB выполняли в программе BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Определение филогенетического положения штаммов и процента сходства проводили с использованием программы TaxonDC 1.3.1 [17]. Филогенетический анализ показал высокое сходство заявленного штамма B. subtilis ВКМ В-3536D с типовым штаммом B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T - 99.34% (Таблица 1).[0036] To identify the claimed strain, DNA was isolated from a cell culture of VKM B-3536D [16]. Then, using the GeneAmp PCR System 2700 instrument (Applied Biosystems, USA), the gene fragmentgyrB using universal primers Up1F and UP2R. The nucleotide sequence of the PCR product was determined using the ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 with primer Up1S and subsequent analysis of the reaction products on an automatic sequencer Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Nucleotide sequence of a gene fragmentgyrB the declared strainB. subtilis VKM B-3536D was compared with the nucleotide sequences of similar gene fragmentsgyrB strainsB. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T,B. subtilis subsp. spizizenii TU-B-10T,B. subtilis DSM 10T. Phylogenetic analysis nucleotide sequences of gene fragmentsgyrB performed in the BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). The phylogenetic position of the strains and the percentage of similarity were determined using the TaxonDC 1.3.1 program [17]. Phylogenetic analysis showed a high similarity of the claimed strainB. subtilisVKM B-3536D with a typical strainB. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T - 99.34% (Table 1).
[0037][0037]
B. subtilis subsp. inaquosorum
KCTC 13429 T CP029465.1:4794-5714
B. subtilis subsp. inaquosorum
KCTC 13429 T
TU-B-10 T CP002905.1:5204-6124 B. subtilis subsp. spizizenii
TU-B-10 T
DSM 10 T CP060710.1:5241-6161 B. subtilis
DSM 10T
ВКМ В-3536DVKM V-3536D
[0038][0038] Пример 2. Получение биомассы штамма Example 2. Obtaining the biomass of the strain B. subtilisB. subtilis ВКМ В-3536D. VKM B-3536D.
[0039] Процесс глубинного культивирования вели в ферментере Р1000 фирмы Bioengineering (Швейцария) объемом 1000 дм3 с коэффициентом заполнения 0,6. В процессе культивирования поддерживали температуру 37±1°С. Скорость перемешивания составляля 250 об/мин. Начальная скорость аэрации составляла 0,2 об/об/мин, через 16 часов роста скорость изменяли до значения 0,5 об/об/мин. Процесс глубинного культивирования велит в течение 32 часов.[0039] The process of deep cultivation was carried out in a P1000 fermenter from Bioengineering (Switzerland) with a volume of 1000 dm 3 with a filling factor of 0.6. During cultivation, the temperature was maintained at 37±1°C. The stirring speed was 250 rpm. The initial aeration rate was 0.2 rpm, after 16 hours of growth the rate was changed to 0.5 rpm. The process of deep cultivation orders within 32 hours.
[0040][0040] Пример 3. Исследование штамма Example 3. Study of the strain B. subtilisB. subtilis ВКМ В-3536D на антагонистическую активность. VKM B-3536D for antagonistic activity.
[0041] Антагонистическую активность штамма B. subtilis ВКМ В-3536D исследовали методом перпендикулярных штрихов. Для этого на поверхность агаризованной среды Луриа-Бертани в чашке Петри штрихом рассевали штамм B. subtilis ВКМ В-3536D, взятый из культуральной суспензии, полученной в Примере 2. Посев делали по диаметру чашки Петри, которую затем помещали на сутки в термостат при температуре 37°С. После завершения роста штамма B. subtilis ВКМ В-3536D и диффузии продуцируемого вещества в агаризованную среду, перпендикулярно к выросшему штриху, подсевали штрихами тест-культуры, начиная от краев чашки. Чашки помещали в термостат на 48 часов. Наличие антагонистической активности фиксировали, измеряя зоны задержки роста тест-культур.[0041] The antagonistic activity of the B. subtilis VKM B-3536D strain was examined by the perpendicular streak method. To do this, the B. subtilis VKM B-3536D strain, taken from the culture suspension obtained in Example 2, was streaked onto the surface of the Luria-Bertani agar medium in a Petri dish. ° C. After the completion of the growth of the strain B. subtilis VKM B-3536D and the diffusion of the produced substance into the agar medium, perpendicular to the grown streak, the test cultures were inoculated with streaks, starting from the edges of the dish. The cups were placed in a thermostat for 48 hours. The presence of antagonistic activity was recorded by measuring the growth retardation zones of test cultures.
[0042][0042]
ВКМ В-3536D B. subtilis
VKM B-3536D
[0043] В результате исследования было установлена выраженная способность культуральной жидкости, содержащей штамм B. subtilis ВКМ В-3536, к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Это говорит о том, что заявленный штамм B. subtilis ВКМ В-3536D может быть использован в производстве пробиотиков.[0043] As a result of the study, a pronounced ability of the culture fluid containing the B. subtilis VKM B-3536 strain to suppress the growth of pathogenic and opportunistic microorganisms was established. This suggests that the claimed strain of B. subtilis VKM B-3536D can be used in the production of probiotics.
[0044][0044] Пример 4. Выделение метаболитов Example 4 Isolation of Metabolites B. subtilis B. subtilis ВКМ В-3536D из культуральной суспензии.VKM B-3536D from a culture suspension.
[0045] Культуральную суспензию B. subtilis ВКМ В-3536D, полученную как описано в Примере 1, подвергали центрифугированию на проточной суперцентрифуге Sharpless AS-26. Полученную культуральную жидкость подвергали ультрафильтрации на установке тангенциальной ультрафильтрации в две стадии. На первой стадии использовали фильтрующую мембрану АР-3-100. При этом получали концентрат 1с порогом отсечения 100 кДа, включающий высокомолекулярную фракцию метаболитов. Количество концентрата №1 составляло 1,5-2% от исходного объема культуральной жидкости. Пермеат, полученный после первой стадии фильтрации, вновь подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием фильтрующей мембраны АР-3-5. В результате получали концентрат №2 с порогом отсечения 5 кДа. Полученный концентрат №2 составлял около 10% от исходного объема культуральной жидкости. Полученный концентрат №2 включал в себя метаболиты B. subtilis ВКМ В-3536D.[0045] The culture suspension of B. subtilis VKM B-3536D obtained as described in Example 1 was subjected to centrifugation on a Sharpless AS-26 flow-through supercentrifuge. The resulting culture liquid was subjected to ultrafiltration on a tangential ultrafiltration unit in two stages. At the first stage, an AR-3-100 filtering membrane was used. In this case, concentrate 1 was obtained with a cut-off threshold of 100 kDa, which included a high molecular weight fraction of metabolites. The amount of concentrate No. 1 was 1.5-2% of the initial volume of the culture fluid. The permeate obtained after the first stage of filtration was again subjected to tangential ultrafiltration using an AP-3-5 filter membrane. The result was concentrate No. 2 with a cut-off threshold of 5 kDa. The resulting concentrate No. 2 was about 10% of the initial volume of the culture fluid. The resulting concentrate No. 2 included metabolites of B. subtilis VKM B-3536D.
[0046][0046] Пример 5. Исследование воздействия метаболитов Example 5 Metabolite Exposure Study B. subtilisB. subtilis ВКМ В-3536D на индикаторные культур. VKM B-3536D for indicator crops.
[0047] Изучение способности метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536D подавлять рост индикаторных культур проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами. Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 107 КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл концентратов №1 и №2, полученных в Примере 3. Затем чашки Петри оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили путем измерения зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения концентратов, включающих метаболиты B. subtilis ВКМ В-3536D. Появление зон, свободных от индикаторных культур, вокруг области нанесения концентратов указывает на антагонистическое действие метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536 в отношении указанных в Таблице 3 индикаторных культур. Величина зон, свободных от индикаторных культур, указывает на эффективность антагонистического действия метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536.[0047] A study of the ability of metabolites of B. subtilis VKM B-3536D to suppress the growth of indicator cultures was performed using an adapted standard disk method for determining the sensitivity of microorganisms to antibiotics. The indicator cultures used in this example are pathogenic and opportunistic microorganisms for humans. To implement the method, indicator cultures were placed on the surface of Luria-Bertani agar nutrient medium in a Petri dish in the amount of 10 7 CFU. After solidification, Petri dishes were dried for 15 minutes at 37°C. Then, 10 μl of concentrates No. 1 and No. 2 obtained in Example 3 were applied to the surface of the nutrient medium with indicator cultures in the form of drops with a diameter of 5 ± 1 mm. Then the Petri dishes were left at room temperature until the drops were completely absorbed and then incubated at 37°C within 24-48 hours. Detection of the results was carried out by measuring the zone of growth inhibition of indicator cultures around the area of application of concentrates, including metabolites of B. subtilis VKM B-3536D. The appearance of zones free from indicator cultures around the area of applying concentrates indicates the antagonistic effect of B. subtilis VKM B-3536 metabolites in relation to the indicator cultures indicated in Table 3. The size of zones free from indicator cultures indicates the effectiveness of the antagonistic action of B. subtilis VKM B-3536 metabolites.
[0048][0048]
* - бактериостатическое действие* - bacteriostatic action
«-» - задержка роста не наблюдалась"-" - growth retardation was not observed
[0049] В результате исследования было установлена выраженная способность метаболитов штамма B. subtilis ВКМ В-3536 к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Причем способностью к подавлению роста обладали как концентрат №1, включающий высокомолекулярные метаболиты весом более 100кДа, так и концентрат №2, включающий метаболиты весом 5-100кДа. Оба концентрата обладали способность задерживать рост 11 из 15 исследованных индикаторных культур. Это дает возможность использовать штамм B. subtilis ВКМ В-3536D для производства метабиотиков.[0049] As a result of the study, a pronounced ability of metabolites of the strain B. subtilis VKM B-3536 to suppress the growth of pathogenic and opportunistic microorganisms was established. Moreover, both concentrate No. 1, including high-molecular metabolites weighing more than 100 kDa, and concentrate No. 2, including metabolites weighing 5-100 kDa, had the ability to suppress growth. Both concentrates were able to retard the growth of 11 out of 15 indicator crops tested. This makes it possible to use the strain B. subtilis VKM B-3536D for the production of metabiotics.
[0050][0050] Пример 6. Исследование цитотоксичности штамма Example 6. Study of the cytotoxicity of the strain B. subtilisB. subtilis ВКМ В-3536D в отношении клеток млекопитающих. VKM B-3536D against mammalian cells.
[0051] Потенциальную цитотоксичность штамма B. subtilis ВКМ В-3536D оценивали согласно рекомендациям Европейского Агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) для характеризации микроорганизмов используемых в качестве кормовых добавок или штаммов-продуцентов (EFSA FEEDAP Panel) [18]. Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D выращивали в сердечно-мозговом бульоне при 30°С в течение 6 ч. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.[0051] The potential cytotoxicity of the B. subtilis strain VKM B-3536D was evaluated according to the recommendations of the European Food Safety Authority (EFSA) for the characterization of microorganisms used as feed additives or producer strains (EFSA FEEDAP Panel) [18]. The B. subtilis VKM B-3536D strain was grown in heart-brain broth at 30°C for 6 hours. The cells were separated from the culture fluid by centrifugation.
[0052] Анализ цитотоксичности на клетках Vero (клеточная линия почечного эпителия зеленой мартышки) проводили по методу Roberts et al., 2021 с модификациями [19]. Клетки Vero инкубировали с культуральной жидкостью. Степень поврежденности клеток Vero оценивали по выделению клетками фермента лактат-дегидрогеназы. Цитотоксичность выражали в процентах от токсичности детергента Triton-X100, вызывающего выход из клеток лактат-дегидрогеназы за счет перфорации клеточных мембран. В качестве контрольных штаммов использовали цитотоксичный и нецитотоксичный штаммы рода Bacillus. В Таблице 4 представлены средние значения 3 (штамм ВКМ В-3536D) или 2 (контрольные штаммы) экспериментов. Каждый эксперимент проводился в двух повторах.[0052] Cytotoxicity analysis on Vero cells (green monkey renal epithelium cell line) was performed according to the method of Roberts et al., 2021 with modifications [19]. Vero cells were incubated with culture fluid. The degree of damage to Vero cells was assessed by the secretion of the enzyme lactate dehydrogenase by the cells. Cytotoxicity was expressed as a percentage of the toxicity of the Triton-X100 detergent, which causes the release of lactate dehydrogenase from cells due to perforation of cell membranes. Cytotoxic and non-cytotoxic strains of the genus Bacillus were used as control strains. Table 4 shows the average values of 3 (strain VKM B-3536D) or 2 (control strains) experiments. Each experiment was carried out in duplicate.
[0053][0053]
* % цитотоксичности вычисляли, принимая за 100% количество лактат-дегидрогеназы, выделяемой клетками, обработанными Triton-X100.*% cytotoxicity was calculated assuming 100% the amount of lactate dehydrogenase secreted by cells treated with Triton-X100.
** Интерпретация результатов: 0-20% - не токсичный, 20-100% - токсичный.** Interpretation of results: 0-20% - non-toxic, 20-100% - toxic.
[0054] Из представленных результатов видно, что цитотоксичность культуральной жидкости штамма B. subtilis ВКМ В-3536D не превышает границы в 20%. Таким образом, штамм B. subtilis ВКМ В-3536D не является токсичным в отношении клеток Vero, и может считаться безопасным для клеток млекопитающих. Это дает возможность использовать штамм B. subtilis ВКМ В-3536D для производства метабиотиков. [0054] From the presented results, it can be seen that the cytotoxicity of the culture liquid of the strain B. subtilis VKM B-3536D does not exceed the limit of 20%. Thus, the B. subtilis VKM B-3536D strain is not toxic to Vero cells and can be considered safe for mammalian cells. This makes it possible to use the strain B. subtilis VKM B-3536D for the production of metabiotics.
[0055] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.[0055] The present application materials provide a preferred disclosure of the implementation of the claimed technical solution, which should not be used as limiting other, private embodiments of its implementation that do not go beyond the scope of the requested legal protection and are obvious to specialists in the relevant field of technology.
Источники информации Sources of information
1. Dunlap C. A. et al. Promotion of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum, Bacillus subtilis subsp. spizizenii and Bacillus subtilis subsp. stercoris to species status Epub 2019 Nov 12. 1. Dunlap C. A. et al. Promotion of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum, Bacillus subtilis subsp. spizizenii and Bacillus subtilis subsp. stercoris to species status Epub 2019 Nov 12.
2. Плотникова Е.Ю. Эффекты активных метаболитов Bacillus subtilis в пробиотическом продукте нового поколения РМЖ Медицинское обозрение №3, 2018.2. Plotnikova E.Yu. Effects of active metabolites of Bacillus subtilis in a probiotic product of a new generation of breast cancer Medical Review No. 3, 2018.
3. Синица А. В. Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта "бактистатин". Патент РФ №2287335 (20.11.2006).3. Sinitsa AV Drug for the treatment of diseases of the gastrointestinal tract "bactistatin". Patent of the Russian Federation No. 2287335 (20.11.2006).
4. Синица А. В. Метабиотическая композиция для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека. Патент РФ № 2589818, 10.07.2016.4. Sinitsa A. V. Metabiotic composition to ensure colonization resistance of human intestinal microbiocenosis. RF patent No. 2589818, 07/10/2016.
5. Синица А. В. Синбиотическая композиция для коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Патент РФ №2592988 (27.07.2016).5. Sinitsa A. V. Synbiotic composition for the correction of dysbiotic disorders of the microbiocenosis of the gastrointestinal tract. Patent of the Russian Federation No. 2592988 (27.07.2016).
6. Смирнов А.В. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека. Авт. Свид. №1722502, 30.03.1992.6. Smirnov A.V. Biosporin preparation for the prevention and treatment of human gastrointestinal diseases. Auth. Certificate No. 1722502, 03/30/1992.
7. Bacillus inaquosorum DV7-B-4 is a facultative anaerobe, mesophilic, rod-shaped bacterium that was isolated from arid soil (https://bacdive.dsmz.de/strain/1289).7. Bacillus inaquosorum DV7-B-4 is a facultative anaerobe, mesophilic, rod-shaped bacterium that was isolated from arid soil (https://bacdive.dsmz.de/strain/1289).
8. IL L. S. et al. compositions for preventing, improving, or treating liver disorders comprising substances of fermented soy bean using bacillus subtilis subsp. inaquosorum as an active ingredient Патент Южной Кореи № KR101635987 (B1), 2016-07-07.8. IL L. S. et al. compositions for preventing, improving, or treating liver disorders containing substances of fermented soy bean using bacillus subtilis subsp. inaquosorum as an active ingredient South Korean Patent No. KR101635987 (B1), 2016-07-07.
9. Chinyere A. Knight et al. The first report of antifungal lipopeptide production by a Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain. Microbiological Research Volume 216, November 2018, Pages 40-46 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30269855/).9. Chinyere A. Knight et al. The first report of antifungal lipopeptide production by a Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain. Microbiological Research Volume 216, November 2018, Pages 40-46 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30269855/).
10. The Bacillus subtilis strain named DE 111. https://www.fda.gov/media/132389/download10. The Bacillus subtilis strain named DE 111. https://www.fda.gov/media/132389/download
11. Hana Yi. Genomic insights into the taxonomic status of the three subspecies of Bacillus subtilis November 2013 Systematic and Applied Microbiology 37(2).11. Hana Yi Genomic insights into the taxonomic status of the three subspecies of Bacillus subtilis November 2013 Systematic and Applied Microbiology 37(2).
12. Словарь биотехнологических терминов / авт.-сост. В. З. Тарантул и др. - Москва: ИНИЦ Роспатента, 2005.12. Dictionary of biotechnological terms / ed. V. Z. Tarantul and others - Moscow: INITs Rospatent, 2005.
13. Шендеров Б. А., Ткаченко Е. И., Лазебник Л. Б., Ардатская М. Д., Синица А. В., Захарченко М. М. Метабиотики - новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018;151(3): 83-92.13. Shenderov B. A., Tkachenko E. I., Lazebnik L. B., Ardatskaya M. D., Sinitsa A. V., Zakharchenko M. M. Metabiotics - a new technology for the prevention and treatment of diseases associated with microecological disorders in the human body. Experimental and clinical gastroenterology. 2018;151(3): 83-92.
14. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. Под ред. И. Л. Кнунянца. 1988/14. Chemical encyclopedia. Moscow: Soviet Encyclopedia. Ed. I. L. Knunyants. 1988/
15. ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения (с Изменением N 1) / ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. № 52349-2005.15. GOST R 52349-2005 Food products. Functional food products. Terms and definitions (with Amendment No. 1) / GOST R dated May 31, 2005 No. 52349-2005.
16. Ausubel F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York (1994).16 Ausubel F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York (1994).
17. Tarlachkov S.V., Starodumova I.P. TaxonDC: calculating the similarity value of the 16S rRNA gene sequences of prokaryotes or ITS regions of fungi // Journal of Bioinformatics and Genomics, 2017, 3(5).17. Tarlachkov SV . , Starodumova IP TaxonDC: calculating the similarity value of the 16S rRNA gene sequences of prokaryotes or ITS regions of fungi // Journal of Bioinformatics and Genomics, 2017, 3(5).
18. EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed), Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B, Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Kärenlampi S, Aguilera J, Anguita M, Brozzi R, Galobart J, 2018. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA Journal, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.18. EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed), Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B, Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Kärenlampi S, Aguilera J, Anguita M , Brozzi R, Galobart J, 2018. Guidance on the characterization of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA Journal, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.
19. Roberts PH, Davis KC, Garstka W, Bhunia AK, 2001. Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains. Journal of Microbiological Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.19. Roberts PH, Davis KC, Garstka W, Bhunia AK, 2001. Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains. Journal of Microbiological Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.
Claims (2)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787384C1 true RU2787384C1 (en) | 2023-01-09 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2675934C2 (en) * | 2017-04-10 | 2018-12-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Фермлаб" | Combined probiotic preparation based on spore-forming bacteria of bacillus genus (options) for use in animal breeding, method for production thereof (variants) and bacillus subtilis (natto) strain used as additive for preparation |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2675934C2 (en) * | 2017-04-10 | 2018-12-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Фермлаб" | Combined probiotic preparation based on spore-forming bacteria of bacillus genus (options) for use in animal breeding, method for production thereof (variants) and bacillus subtilis (natto) strain used as additive for preparation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHINYERE A. KNIGHT et al. The first report of antifungal lipopeptide production by a Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain., Microbiological Research Volume 216, November 2018, Pages 40-46 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30269855/). * |
| HANA YI. Genomic insights into the taxonomic status of the three subspecies of Bacillus subtilis November 2013 Systematic and Applied Microbiology 37(2). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Touré et al. | Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria monocytogenes | |
| Marroki et al. | Characterization of Lactobacillus from Algerian goat's milk based on phenotypic, 16S rDNA sequencing and their technological properties | |
| CN113151064B (en) | Pediococcus pentosaceus and application thereof | |
| US8741622B2 (en) | Stress tolerant Bifidobacteria | |
| KR102310337B1 (en) | Lactococcus lactis q1 strain having complex digestive productivity and antibacterial activity and uses thereof | |
| Lestari et al. | The antibacterial activities of bacteriocin Pediococcus acidilactici of breast milk isolate to against methicillin-resistant Staphylococcus aureus | |
| Jovanović et al. | Characterization of some potentially probiotic Lactobacillus strains of human origin | |
| Negm El-Dein et al. | Probiotic properties and bile salt hydrolase activity of some isolated lactic acid bacteria | |
| JP2013201936A (en) | Method for controlling amine formation in lactic fermentation | |
| Sardar et al. | Exploring the microbiota of solar saltern of Mulund, Mumbai, India | |
| Abo-Amer | Inhibition of foodborne pathogens by a bacteriocin-like substance produced by a novel strain of Lactobacillus acidophilus isolated from camel milk | |
| RU2787384C1 (en) | Bacillus subtilis subsp. inaquosorum with antagonistic action against pathogenic and opportunitical microorganisms | |
| KR20150101789A (en) | Bacillus subtilis BK418 strain having complex enzyme productivity and antifungal activity and uses thereof | |
| RU2532227C1 (en) | Strain enterococcus mundtii producing peptide substance with antilisterial ativity | |
| KR20150004884A (en) | Ampicillin resistant texturizing lactic acid bacteria strains | |
| CN113061550B (en) | Lactobacillus new strain Z6 and application thereof in food | |
| EP2548945A2 (en) | Lactic acid bacterium with increased acid tolerance | |
| HM et al. | Exploring antimicrobial activity of Lactobacillus spp.(probiotics) isolated from raw cow’s milk against Staphylococcus aureus causing bovine mastitis | |
| KR100825500B1 (en) | Novel lactobacillus reuteri isolated from pig for the development of oral delivery system and use thereof | |
| Firdausy et al. | Antimicrobial Activity Of Metabolites Produced By Novel Coagulase-Negative Staphylococci (Cns) Isolated From Fermented Dairy Products In Malang, Indonesia | |
| KR101748560B1 (en) | Pediococcus acidilactici lrcc5307 strain having ability of choloesterol assimilation and method for manufacturing cultured butter using the same | |
| RU2571852C2 (en) | BACTERIA Enterococcus faecium STRAIN HAVING ANTAGONIST ACTIVITY IN RELATION TO BACTERIA OF Listeria GENUS AND Enterococcus faecalis SPECIES | |
| Demirok et al. | Some lactobacillus, leuconostoc and acetobacter strains in traditional turkish yoghurt, cheese, kefir samples as a probiotic candidate | |
| Boubakeur et al. | Probiotic properties and exopolysaccharides production of Stretptococcus thermophilus CNRZ 447 and Enterococcus durans NCBI 53345 | |
| Pham et al. | Cholesterol-lowering potential and exopolysaccharide biosynthesis of Lactobacillus spp. isolated from human milk |