RU2787350C1 - Method for producing morpholine oligomers - Google Patents
Method for producing morpholine oligomers Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787350C1 RU2787350C1 RU2021139902A RU2021139902A RU2787350C1 RU 2787350 C1 RU2787350 C1 RU 2787350C1 RU 2021139902 A RU2021139902 A RU 2021139902A RU 2021139902 A RU2021139902 A RU 2021139902A RU 2787350 C1 RU2787350 C1 RU 2787350C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- morpholine
- oligomer
- synthesis
- morpholine oligomer
- amine
- Prior art date
Links
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 119
- 229940113083 morpholine Drugs 0.000 title claims abstract description 116
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 22
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 20
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 76
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 claims description 70
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- -1 N-allylmorpholine nucleoside Chemical class 0.000 claims description 27
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 14
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 11
- 230000001681 protective Effects 0.000 claims description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- MCKANBCWFDYIJO-UHFFFAOYSA-M amino(chloro)phosphinate Chemical compound NP([O-])(Cl)=O MCKANBCWFDYIJO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 claims description 7
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 4
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 claims description 4
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 claims description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 3
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- KJJPLEZQSCZCKE-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)CO KJJPLEZQSCZCKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005828 desilylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005866 tritylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 3
- 230000001268 conjugating Effects 0.000 claims 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 54
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 14
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L na2so4 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 12
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 12
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 150000002829 nitrogen Chemical group 0.000 description 7
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N Oxalyl chloride Chemical compound ClC(=O)C(Cl)=O CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M Lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M Sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N Palmitic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M Potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N Triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 3
- LVSJLTMNAQBTPE-UHFFFAOYSA-N disodium tetraborate Chemical compound [Na+].[Na+].O1B(O)O[B-]2(O)OB(O)O[B-]1(O)O2 LVSJLTMNAQBTPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 3
- 239000001184 potassium carbonate Substances 0.000 description 3
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 3
- 125000005039 triarylmethyl group Chemical group 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-Methylimidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethyl alcohol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WADSJYLPJPTMLN-UHFFFAOYSA-N 3-(cycloundecen-1-yl)-1,2-diazacycloundec-2-ene Chemical compound C1CCCCCCCCC=C1C1=NNCCCCCCCC1 WADSJYLPJPTMLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 2
- MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N Cyanoacetic acid Chemical compound OC(=O)CC#N MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 2
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 2
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N Gentisic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BNXBRFDWSPXODM-BPGGGUHBSA-N N-[1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]benzamide Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NC(=O)C=2C=CC=CC=2)C=C1 BNXBRFDWSPXODM-BPGGGUHBSA-N 0.000 description 2
- LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidite Chemical compound NP([O-])[O-] LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N Sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N Thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N cdcl3 Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ARBOVOVUTSQWSS-UHFFFAOYSA-N hexadecanoyl chloride Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(Cl)=O ARBOVOVUTSQWSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008079 hexane Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical group NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- MLGWTHRHHANFCC-UHFFFAOYSA-N prop-2-en-1-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC=C MLGWTHRHHANFCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N sulfonic acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEPTXBCIDSFGBF-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;fluoride;trihydrate Chemical compound O.O.O.[F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VEPTXBCIDSFGBF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinone Chemical compound CN1CCN(C)C1=O CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVSASNKOFCZVES-UHFFFAOYSA-N 1,3-dimethyl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound CN1C(=O)CC(=O)N(C)C1=O VVSASNKOFCZVES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIRYYUMNQFXZQD-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[[chloro(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-4-tritylmorpholin-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O1C(COP(Cl)(=O)N(C)C)CN(C(C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1N1C=C(C)C(=O)NC1=O DIRYYUMNQFXZQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDTBBCYZMFEIHU-UHFFFAOYSA-N 1-tritylpiperidine Chemical group C1CCCCN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZDTBBCYZMFEIHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Substances C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYMQBDRZXKIYFZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethyl-4H-imidazol-5-one Chemical compound CN1CC(=O)N=C1C CYMQBDRZXKIYFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- HLPXUVWTMGENBN-UHFFFAOYSA-N 3-methylidenemorpholine Chemical compound C=C1COCCN1 HLPXUVWTMGENBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEIRHBKKYVWAOM-UHFFFAOYSA-N 4-[hydroxy(diphenyl)methyl]phenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C(O)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QEIRHBKKYVWAOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGUBQKZSNQWWEV-UHFFFAOYSA-M 4-oxo-4-phenylmethoxybutanoate Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 UGUBQKZSNQWWEV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SUSANAYXICMXBL-UHFFFAOYSA-N 4-prop-2-enylmorpholine Chemical class C=CCN1CCOCC1 SUSANAYXICMXBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 5-Methyluridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M AC1L4ZKD Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N Chloranil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N Isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 1
- FXZWPZMCZNJILD-UHFFFAOYSA-N N-[(6-bromopyridin-3-yl)methyl]ethanamine;hydrochloride Chemical compound Cl.CCNCC1=CC=C(Br)N=C1 FXZWPZMCZNJILD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXTYJSXVUGJSGM-HTVVRFAVSA-N N-[9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-oxo-3H-purin-2-yl]-2-methylpropanamide Chemical compound C1=2NC(NC(=O)C(C)C)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OXTYJSXVUGJSGM-HTVVRFAVSA-N 0.000 description 1
- NZDWTKFDAUOODA-CNEMSGBDSA-N N-[9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 NZDWTKFDAUOODA-CNEMSGBDSA-N 0.000 description 1
- HRNHOEBQNIMEGD-UHFFFAOYSA-N N-[9-[6-[[chloro(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-4-tritylmorpholin-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound O1C(COP(Cl)(=O)N(C)C)CN(C(C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1N(C1=NC=N2)C=NC1=C2NC(=O)C1=CC=CC=C1 HRNHOEBQNIMEGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPWWDZRSNFSLRQ-UHFFFAOYSA-N N-dichlorophosphanyl-N-methylmethanamine Chemical compound CN(C)P(Cl)Cl XPWWDZRSNFSLRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIVIDPPYRINTTH-UHFFFAOYSA-N N-ethylpropan-2-amine Chemical compound CCNC(C)C RIVIDPPYRINTTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000002356 Skeleton Anatomy 0.000 description 1
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N Tert-Butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004319 Trichloroacetic Acid Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N Trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N Triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N Triphenylmethyl chloride Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(Cl)C1=CC=CC=C1 JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHCDYWFWJOXDIY-UHFFFAOYSA-N [PH4]Cl Chemical class [PH4]Cl CHCDYWFWJOXDIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N aminoazanium;chloride Chemical compound Cl.NN BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- WGXQAZYFZVZEGQ-UHFFFAOYSA-N borax Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].O1B(O)O[B-]2(O)OB(O)O[B-]1(O)O2 WGXQAZYFZVZEGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M carbamate Chemical group NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007275 deallylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid;morpholine Chemical group NP(N)(O)=O.C1COCCN1 RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- KTXPGRSAPGCSGO-UHFFFAOYSA-Z dodecaazanium;tetraborate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-] KTXPGRSAPGCSGO-UHFFFAOYSA-Z 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 150000002242 furanose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001340 slower Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- JHBKBRLRYPYBLP-UHFFFAOYSA-N tert-butyl N-(1,3-dihydroxypropan-2-yl)carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC(CO)CO JHBKBRLRYPYBLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-chloro-diphenylsilane Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Si](Cl)(C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к новым способам получения и очистки регулярных морфолиновых олигомеров, применяемых в генетических исследованиях и терапии.The invention relates to new methods for the preparation and purification of regular morpholine oligomers used in genetic research and therapy.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Гетерофазный синтез регулярных олигомеров уже несколько десятилетий является основным подходом к синтезу коротких пептидов, нуклеиновых кислот и их миметиков. Одной из разновидностей миметиков нуклеиновых кислот, зарекомендовавшей себя как агент для нокдауна генов, являются морфолиновые олигонуклеотиды (олигомеры): миметики с морфолин-фосфородиамидатным скелетом. Синтез морфолиновых олигомеров проводится на модифицированном полистирольном носителе путем циклической манипуляции защитными группами и пошагового наращивания цепи олигомера с деактивацией непрореагировавших реакционных центров (кэпированием). В начале цикла концевые защитные группы удаляются, затем присоединяется новое звено, содержащее новую концевую защиту, после чего кэпирование предотвращает образование неполных цепей в следующих циклах. Используемые в синтезе мономеры представляют собой модифицированные звенья, содержащие помимо вводимого фрагмента цепи: лабильную концевую защитную группу, ортогональные ей защитные группы на активных элементах нескелетных участков и активную группу для присоединения к цепи. Реакции удаления лабильной защиты и присоединения должны быть высокоэффективными, поскольку при множественных циклах выход продукта реакции падает в геометрической прогрессии. После завершения синтеза олигомер отделяется от полимерного носителя, и производится пост-синтетическая обработка, например удаление нескелетных защитных групп, предотвращающих побочные реакции и ветвление цепей. Очистка от примесей, образующихся в процессе синтеза, обычно проводится методами ВЭЖХ, поскольку разница в физических свойствах молекул олигомера невелика, и разделение требует высокой разрешающей способности метода.The heterophasic synthesis of regular oligomers has been the main approach to the synthesis of short peptides, nucleic acids, and their mimetics for several decades. One of the varieties of nucleic acid mimetics that has proven itself as an agent for gene knockdown are morpholine oligonucleotides (oligomers): mimetics with a morpholine-phosphorodiamidate skeleton. Synthesis of morpholine oligomers is carried out on a modified polystyrene support by cyclic manipulation of protective groups and stepwise growth of the oligomer chain with deactivation of unreacted reaction centers (capping). At the start of the cycle, the end protecting groups are removed, then a new unit containing the new end protection is attached, after which capping prevents the formation of incomplete chains in subsequent cycles. The monomers used in the synthesis are modified units containing, in addition to the introduced chain fragment, a labile terminal protective group, protective groups orthogonal to it on the active elements of non-skeletal regions, and an active group for attachment to the chain. The labile protection removal and addition reactions must be highly efficient, since the yield of the reaction product drops exponentially with multiple cycles. After completion of the synthesis, the oligomer is separated from the polymer carrier, and post-synthetic processing is carried out, for example, the removal of non-skeletal protective groups that prevent side reactions and chain branching. Purification of impurities formed during the synthesis is usually carried out by HPLC methods, since the difference in the physical properties of the oligomer molecules is small, and separation requires a high resolution of the method.
Существующие способы синтеза морфолиновых мономеров из рибонуклеозидов основаны на использовании реакции восстановительного аминирования с тетраборатом аммония. Существует два основных подхода. Их основным различием является селективное силилирование 5'-гидроксильной группы рибонуклеозидов, облегчающее течение дальнейших реакций. Стандартный метод предполагает использование несилилированных рибонуклеозидов и очистку тозилатов морфолин-нуклеозидов осаждением [патент US 5,185,444, опубл. 09.02.1993]. Силильный метод более трудоемок и предполагает использование хроматографической очистки до и после восстановительного аминирования, однако при этом выход продукта реакции выше [Pattanayak S. et al, 2012, DOI: 10.1080/15257770.2012.724491]. Это позволило предположить, что гидрофобные группы положительно влияют на эффективность реакции и использовать манипуляцию защитными группами иначе.The existing methods for the synthesis of morpholine monomers from ribonucleosides are based on the use of reductive amination with ammonium tetraborate. There are two main approaches. Their main difference is the selective silylation of the 5'-hydroxyl group of ribonucleosides, which facilitates the course of further reactions. The standard method involves the use of non-silylated ribonucleosides and the purification of morpholine nucleoside tosylates by precipitation [US patent 5,185,444, publ. February 9, 1993]. The silyl method is more laborious and involves the use of chromatographic purification before and after reductive amination, however, the yield of the reaction product is higher [Pattanayak S. et al, 2012, DOI: 10.1080/15257770.2012.724491]. This allowed us to assume that hydrophobic groups positively affect the reaction efficiency and to use the manipulation of protective groups in a different way.
Восстановительное аминирование с образованием третичного морфолина проводилось с образованием бензильного производного, однако удаление бензильной защиты происходит в тех же условиях, что и разрыв связи между морфолиновым и нуклеиновым основанием [Bell N.B., 2010, DOI: 10.1002/chem.200902237]. Это позволило предположить, что возможно введение других защитных групп в процессе восстановительного аминирования.Reductive amination with the formation of tertiary morpholine was carried out with the formation of a benzyl derivative, however, the removal of the benzyl protection occurs under the same conditions as the breaking of the bond between the morpholine and nucleic base [Bell N.B., 2010, DOI: 10.1002/chem.200902237]. This suggested that it is possible to introduce other protective groups during reductive amination.
Известны эфирный и фосфорамидитный подходы к синтезу морфолиновых олигомеров. Первый предполагает использование избытков хлорфосфорамидатов для обеспечения высокого выхода на каждом этапе синтеза [патент US 5185444 А, опубл. 09.02.1993]. Недостатком этого способа является высокий расход реагентов и долгое время синтеза фармакологически активных (20-25 звеньев) олигомеров. Фосфорамидитный синтез морфолиновых олигомеров основан на синтезе триэфиров фосфора (III) при активации фосфорамидитов тетразолами, с их стабилизацией борорганическими соединениями и последующим окислительным аминированием после завершения синтеза олигомера [заявка на патент WO 2018057430 A1, опубл. 29.03.2018]. Этот подход более оперативный и гибкий, но генерирует огромное количество примесей из-за высокой чувствительности к воде.Ether and phosphoramidite approaches to the synthesis of morpholine oligomers are known. The first involves the use of excess chlorophosphoramidates to ensure a high yield at each stage of the synthesis [patent US 5185444 A, publ. February 9, 1993]. The disadvantage of this method is the high consumption of reagents and the long synthesis of pharmacologically active (20-25 units) oligomers. Phosphoramidite synthesis of morpholine oligomers is based on the synthesis of triesters of phosphorus (III) during the activation of phosphoramidites with tetrazoles, with their stabilization with organoboron compounds and subsequent oxidative amination after completion of the synthesis of the oligomer [patent application WO 2018057430 A1, publ. 03/29/2018]. This approach is faster and more flexible, but generates a huge amount of impurities due to the high sensitivity to water.
Недостатки первого метода могут быть компенсированы применением различных активаторов: веществ (обычно, третичных аминов), создающих с субстратами активные интермедиаты, вступающие в реакции быстрее [Pattanayak S. et al, 2012, DOI: 10.1016/j.tetlet.2012.09.126]. Такой подход представляет собой объединение принципов предыдущих способов с подбором новых условий для повышения эффективности реакций наращивания цепи олигомера.The disadvantages of the first method can be compensated for by using various activators: substances (usually tertiary amines) that create active intermediates with substrates that react faster [Pattanayak S. et al, 2012, DOI: 10.1016/j.tetlet.2012.09.126]. This approach is a combination of the principles of the previous methods with the selection of new conditions to improve the efficiency of oligomer chain extension reactions.
Принципиальным недостатком очистки морфолиновых олигомеров с помощью ВЭЖХ является трудность масштабирования процесса для получения терапевтически значимого количества продукта. Квадратичный рост площади давления в делительной колонне приводит к тому, что разделение десятикратно большего количества вещества требует стократно более мощного насоса для нагнетания давления, что делает установку не только дорогостоящей, но и опасной. Другим недостатком является трудность отделения укороченных молекул от целевого продукта, что усугубляется отсутствием заряда на скелете морфолиновых олигомеров, делающим разницу в физических свойствах продукта и примеси еще меньше.A fundamental disadvantage of HPLC purification of morpholine oligomers is the difficulty of scaling up the process to obtain a therapeutically significant amount of the product. The quadratic increase in the pressure area in the separation column means that separating ten times more material requires a hundred times more powerful pressure pump, which makes the installation not only expensive, but also dangerous. Another disadvantage is the difficulty of separating shortened molecules from the target product, which is aggravated by the absence of a charge on the skeleton of morpholine oligomers, which makes the difference in the physical properties of the product and impurity even smaller.
Однако существует принципиальная разница в химических свойствах продукта и примеси: наличие лабильной концевой защитной группы и активного центра с ней. Наиболее близким к заявленному техническому решению является протокол ретритилирования, который состоит из удаления концевой тритильной защитной группы из регулярного олигомера и ее замены на более лабильную группу для оптимизации процесса очистки вещества от примесей [патент US 8299206 В2, опубл. 30.10.2012]. Способ синтеза морфолинового олигомера по US 8299206 B2 включает в себя (а) взаимодействие морфолиновой субъединицы на твердофазной основе, имеющей незащищенный кольцевой азот, с морфолиновым мономером, имеющим триарилметил-защищенный кольцевой азот и активированную фосфорамидатную группу на 5'-экзоциклическом углероде, с образованием фосфородиамидатной связи между 5'-экзоциклическим углеродом и незащищенным кольцевым азотом;However, there is a fundamental difference in the chemical properties of the product and the impurity: the presence of a labile terminal protective group and an active center with it. Closest to the claimed technical solution is the retritylation protocol, which consists of removing the terminal trityl protective group from the regular oligomer and replacing it with a more labile group to optimize the purification process of the substance from impurities [patent US 8299206 B2, publ. October 30, 2012]. The method for synthesizing a morpholine oligomer according to US 8,299,206 B2 comprises (a) reacting a solid-phase-based morpholine subunit having an unprotected ring nitrogen with a morpholine monomer having a triarylmethyl-protected ring nitrogen and an activated phosphoramidate group on the 5'-exocyclic carbon to form a phosphorodiamidate bonds between the 5'-exocyclic carbon and unprotected ring nitrogen;
(b) снятие защиты с защищенного кольцевого азота с образованием незащищенного кольцевого азота; и(b) deprotecting the protected ring nitrogen to form an unprotected ring nitrogen; and
(c) повторение стадий (а) и (b) один или несколько раз с дополнительными мономерами морфолиновой субъединицы с защищенным кольцевым азотом;(c) repeating steps (a) and (b) one or more times with additional ring nitrogen protected morpholine subunit monomers;
где упомянутое снятие защиты включает воздействие на триарилметил-защищенный кольцевой азот раствора реагента, содержащего соль гетероциклического амина в трифторэтанолсодержащем растворителе, при этом соль является солью гетероциклического амина, имеющего рКа в диапазоне 1-4 в его протонированной форме, и кислоты, выбранной из сульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и соляной кислоты. Обычно синтез дополнительно включает отщепление морфолинового олигомера от твердой фазы и снятие защиты с оснований в соответствии со стандартными процедурами.wherein said deprotection comprises exposing the triarylmethyl-protected ring nitrogen to a solution of a reagent containing a salt of a heterocyclic amine in a trifluoroethanol-containing solvent, wherein the salt is a salt of a heterocyclic amine having a pKa in the range of 1-4 in its protonated form, and an acid selected from sulfonic acid , trifluoroacetic acid and hydrochloric acid. Typically, the synthesis further comprises cleavage of the morpholine oligomer from the solid phase and deprotection of the bases according to standard procedures.
Недостатком данного технического решения является то, что очистка конечного продукта, полученного таким способом, до фармакологически приемлемого уровня возможна лишь с помощью ВЭЖХ, что не решает проблему масштаба применения. Причина, препятствующая получению в известном способе требуемого технического результата, заключается в том, что данный способ позволяет проводить очистку только небольшого количества вещества. Из существующего уровня техники также известен подход модификации тритильных групп для получения особых спектральных свойств продуктов [Shchepinov M.S., Korshun V.A. Recent applications of bifunctional trityl groups // Chem. Soc. Rev., 2003. V.32. PP. 170-180. DOI: 10.1039/b0089001]. Недостатком данного технического решения является малое влияние введенных в данном исследовании модификаций на фазовую и хроматографическую подвижность.The disadvantage of this technical solution is that the purification of the final product obtained in this way to a pharmacologically acceptable level is only possible using HPLC, which does not solve the problem of the scale of application. The reason that prevents obtaining the desired technical result in the known method is that this method allows purification of only a small amount of a substance. From the existing level of technology, the approach of modifying trityl groups is also known to obtain special spectral properties of products [Shchepinov M.S., Korshun V.A. Recent applications of bifunctional trityl groups // Chem. soc. Rev., 2003. V.32. PP. 170-180. DOI: 10.1039/b0089001]. The disadvantage of this technical solution is the small effect of the modifications introduced in this study on the phase and chromatographic mobility.
Из патента РФ 2606627 известен способ синтеза морфолинового олигомера, причем способ включает: (а) взаимодействие морфолиновых звеньев с носителем в твердой фазе, имеющей незащищенный кольцевой атом азота, с мономером морфолинового звена с защищенным основанием, имеющим кольцевой атом азота, защищенный триарилметилом, и активированную фосфорамидатную группу на 5'-экзоциклическом углероде, при этом образуется фосфородиамидатный мостик между 5'-экзоциклическим углеродом и незащищенным кольцевым атомом азота; (b) снятие защиты с защищенного кольцевого атома азота для образования незащищенного кольцевого атома азота; и (с) повторение стадий (а) и (b) один или несколько раз со следующими мономерами морфолинового звена с защищенным основанием; где, по меньшей мере, один из мономеров морфолинового звена с защищенным основанием представляет собой дважды защищенное гуаниновое морфолиновое соединение, имеющее структуру I:From RF patent 2606627, a method for the synthesis of a morpholine oligomer is known, the method including: (a) the interaction of morpholine units with a carrier in a solid phase having an unprotected ring nitrogen atom, with a base-protected morpholine unit monomer having a ring nitrogen atom protected by triarylmethyl and activated a phosphoramidate group on the 5'-exocyclic carbon, thereby forming a phosphorodiamidate bridge between the 5'-exocyclic carbon and the unprotected ring nitrogen atom; (b) deprotecting the protected ring nitrogen atom to form an unprotected ring nitrogen atom; and (c) repeating steps (a) and (b) one or more times with the following protected base morpholine monomers; where at least one of the monomers of the protected base morpholine unit is a doubly protected guanine morpholine compound having structure I:
в которой R1 выбран из группы, состоящей из низшего алкила, ди(низший алкил)амино и фенила; R2 выбран из группы, состоящей из низшего алкила, моноциклического арилметила и моноциклического(арилокси)метила; R3 выбран из группы, состоящей из триарилметила (тритила) и водорода; и Y представляет собой хлорфосфорамидатную группу. Недостатком такого подхода является низкая скорость реакции и высокий расход субстратов, которые, ввиду использования в смеси с третичными аминами, не поддаются регенерации и повторному использованию из-за образования пирофосфатов. Также в патенте РФ 2606627 раскрыто снятие защиты, которое включает воздействие на кольцевой атом азота, защищенный триарилметилом, раствора реагента, содержащего гетероциклическую аминную соль, в растворителе, содержащем трифторэтанол, при этом соль является солью гетероциклического амина с рКа в интервале 1-4 в протонированной форме, с кислотой, выбранной из сульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и хлористоводородной кислоты.in which R1 is selected from the group consisting of lower alkyl, di(lower alkyl)amino and phenyl; R2 is selected from the group consisting of lower alkyl, monocyclic arylmethyl and monocyclic (aryloxy)methyl; R3 is selected from the group consisting of triarylmethyl (trityl) and hydrogen; and Y is a chlorophosphoramidate group. The disadvantage of this approach is the low reaction rate and high consumption of substrates, which, due to the use in a mixture with tertiary amines, cannot be regenerated and reused due to the formation of pyrophosphates. Also in RF patent 2606627, deprotection is disclosed, which includes exposing the ring nitrogen atom protected by triarylmethyl to a solution of a reagent containing a heterocyclic amine salt in a solvent containing trifluoroethanol, wherein the salt is a salt of a heterocyclic amine with a pKa in the range of 1-4 in the protonated form, with an acid selected from sulfonic acid, trifluoroacetic acid and hydrochloric acid.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является решение как минимум одной из вышеуказанных в уровне техники проблем.The technical problem to be solved by the present invention is to solve at least one of the above problems in the prior art.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Технической решением является использование описанного признаками в пунктах формулы изобретения.The technical solution is to use the features described in the claims.
Одной из возможных технических задач, на решение которой может быть направлено настоящее изобретение, являлось создание способа получения морфолинового олигомера, который был бы пригоден для масштабирования до размеров промышленного производства. При этом чистота получаемых морфолиновых олигомеров должна быть не ниже 95%.One of the possible technical problems to which the present invention can be directed was to provide a method for obtaining morpholine oligomer, which would be suitable for scaling up to the size of industrial production. In this case, the purity of the obtained morpholine oligomers must be at least 95%.
Задача может быть решена тем, что в способе получения морфолинового олигомера синтезируют морфолиновый олигомер из морфолиновых мономеров и затем проводят очистку упомянутого олигомера, при этом синтез морфолинового олигомера из морфолиновых мономеров проводят с деактивацией непрореагировавших реакционных центров (кэпированием), а для очистки полученный олигомер липофилизируют посредством присоединения моноалкилокситритильного производного к концевой тритильной группе, затем проводят фазовое разделение липофильного морфолинового олигомера и примесей, после чего упомянутое моноалкилокситритильное производное удаляют. Заявленный способ может масштабироваться и позволяет получить морфолиновые олигомеры с чистотой 95,3%, которая подходит для дальнейшего использования в медицинских целях.The problem can be solved by the fact that in the method for obtaining a morpholine oligomer, a morpholine oligomer is synthesized from morpholine monomers and then the said oligomer is purified, while the synthesis of the morpholine oligomer from morpholine monomers is carried out with the deactivation of unreacted reaction centers (capping), and for purification, the resulting oligomer is lipophilized by addition of a monoalkyloxytrityl derivative to a terminal trityl group, then phase separation of the lipophilic morpholine oligomer and impurities is carried out, after which said monoalkyloxytrityl derivative is removed. The claimed method can be scaled and allows to obtain morpholine oligomers with a purity of 95.3%, which is suitable for further use in medical purposes.
Заявленный способ включает стадию синтеза морфолинового олигомера из морфолиновых мономеров и стадию очистки полученного олигомера от примесей. Морфолиновые мономеры, используемые при осуществлении заявленного способа, могут быть приобретены готовыми или получены с помощью известных из уровня техники способов. Способы синтеза морфолиновых мономеров широко описаны в уровне техники (патент US 5185444 А, опубл. 09.02.1993; заявка на патент WO 2018057430 А1, опубл. 29.03.2018) и могут быть использованы для получения морфолиновых мономеров для осуществления способа по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для синтеза морфолиновых мономеров рибонуклеозид конвертируют в N-аллилморфолин нуклеозид реакцией восстановительного аминирования и превращают в хлорфосфорамидат путем манипуляции защитными группами: силилирования, деаллилирования, тритилирования, десилилирования и хлорфосфораминирования.The claimed method includes the stage of synthesis of morpholine oligomer from morpholine monomers and the stage of purification of the obtained oligomer from impurities. Morpholine monomers used in the implementation of the claimed method can be purchased ready-made or obtained using methods known from the prior art. Methods for the synthesis of morpholine monomers are widely described in the prior art (patent US 5185444 A, publ. 02/09/1993; patent application WO 2018057430 A1, publ. 03/29/2018) and can be used to obtain morpholine monomers for implementing the method of the present invention. In one embodiment of the present invention, for the synthesis of morpholine monomers, the ribonucleoside is converted to N-allylmorpholine nucleoside by a reductive amination reaction and converted to chlorophosphoramidate by manipulation of protecting groups: silylation, deallylation, tritylation, desilylation, and chlorophosphoramination.
Синтез морфолинового олигомера может быть осуществлен с помощью одного из описанных в уровне техники способов синтеза морфолинового олигомера из морфолиновых мономеров, использующего стадию деактивации непрореагировавших реакционных центров (кэпирования). Один из таких способов описан, например, в патенте US 8299206 В2, опубл. 30.10.2012. Способы синтеза олигомера с кэпированием позволяют сохранить реакционноспособный центр на олигомере для дальнейшей липофилизации, при этом такой центр отсутствует у молекул-примесей, образующихся в результате многостадийного синтеза регулярного олигомера. В одном из вариантов осуществления способа по настоящему изобретению, для синтеза морфолиновых олигомеров иммобилизованную на модифицированной полистирольной смоле тритильную группу удаляют в кислой среде с образованием протонированного амина. После чего упомянутый амин нейтрализуют и смешивают с раствором хлорфосфорамидатового мономера морфолина и активатора, содержащего третичный амин. Смесь равномерно нагревают, например, в термостате и перемешивают, например, с помощью вибрационного привода, по завершении реакции остатки смеси смывают и носитель обрабатывают кэпирующим раствором на основе уксусного ангидрида. Цикл повторяют до получения целевой последовательности морфолинового олигонуклеотида.Synthesis of morpholine oligomer can be carried out using one of the methods described in the prior art for the synthesis of morpholine oligomer from morpholine monomers, using the stage of deactivation of unreacted reaction centers (capping). One such method is described, for example, in US patent 8299206 B2, publ. 10/30/2012. Methods for the synthesis of an oligomer with capping make it possible to preserve the reactive center on the oligomer for further lipophilization, while such a center is absent in the impurity molecules formed as a result of the multistage synthesis of a regular oligomer. In one embodiment of the method of the present invention, for the synthesis of morpholine oligomers, the trityl group immobilized on the modified polystyrene resin is removed in an acidic medium to form a protonated amine. After that, said amine is neutralized and mixed with a solution of morpholine chlorophosphoramidate monomer and an activator containing a tertiary amine. The mixture is evenly heated, for example, in a thermostat and stirred, for example, using a vibration drive, after completion of the reaction, the remains of the mixture are washed off and the carrier is treated with a capping solution based on acetic anhydride. The cycle is repeated until the target sequence of the morpholine oligonucleotide is obtained.
При осуществлении настоящего способа на стадии очистки полученного морфолинового олигомера липофильность синтезированного олигомера повышают путем присоединения липофилизирующего агента к концевой тритильной группе упомянутого олигомера. В качестве липофилизирующего агента может быть использовано любое моноалкилокситритильное производное, благодаря стабильности его связи с морфолиновой аминогруппой и высокой эффективности и относительно мягкими условиями удаления тритильной группы после процедуры очистки. При этом к остальным молекулам, являющимся примесями, загрязняющими препарат целевого олигомера, присоединения липофилизирующего агента не происходит. Поэтому при дальнейшем разделении молекул более липофильный целевой олигомер отделяют от менее липофильных примесей с большей эффективностью.When implementing the present method, at the stage of purification of the obtained morpholine oligomer, the lipophilicity of the synthesized oligomer is increased by adding a lipophilizing agent to the terminal trityl group of the said oligomer. Any monoalkyloxytrityl derivative can be used as a lipophilizing agent due to the stability of its bond with the morpholine amino group and high efficiency and relatively mild conditions for removing the trityl group after the purification procedure. At the same time, the lipophilizing agent does not attach to the remaining molecules, which are impurities that contaminate the preparation of the target oligomer. Therefore, upon further separation of the molecules, the more lipophilic target oligomer is separated from the less lipophilic impurities with greater efficiency.
Разделение молекул может быть осуществлено любым известным из уровня техники способом фазового разделения веществ. Один из таких способов описан, например, в патенте US 8785695 B2 (опубл. 22.07.2014). В этом изобретении предлагается способ очистки соединений, содержащих аминогруппы, от полярной фазы, где соединение, содержащее аминогруппы, превращается в результате реакции с альдегидом или кетоном в соответствующий имин, который нерастворим или мало растворим в полярной фазе, затем имин переводится в неполярную фазу и отделяется от полярной фазы, затем соединение, содержащее аминогруппы, выделяют из имина.The separation of molecules can be carried out by any method of phase separation of substances known from the prior art. One of these methods is described, for example, in US patent 8785695 B2 (publ. 22.07.2014). This invention proposes a method for purifying compounds containing amino groups from the polar phase, where the compound containing amino groups is converted by reaction with an aldehyde or ketone into the corresponding imine, which is insoluble or slightly soluble in the polar phase, then the imine is transferred to the non-polar phase and separated from the polar phase, then the compound containing amino groups is isolated from the imine.
В одном из вариантов осуществления настоящего способа для очистки морфолинового олигомера после завершения последнего цикла синтеза морфолинового олигомера концевую тритильную группу удаляют в кислой среде с образованием протонированного амина, упомянутый амин нейтрализуют и смешивают с моноалкилокситритильным производным с образованием липофилизированного морфолинового олигомера, после чего производят отделение олигомера от носителя, полученную смесь растворяют в органическом растворителе, несмешиваемом с водой, липофилизированный морфолиновый олигомер отмывают от примесей, после чего высушивают и упаривают до масла; упомянутое масло подвергают кислотной обработке для отделения липофильной группы и осаждают из эфира. Использование фазового разделения для очистки синтезированного морфолинового олигомера позволяет проводить синтез и последующую очистку большого количества вещества, что позволяет получать промышленное количество морфолинового олигомера с сохранением чистоты, необходимой для медицинского использования.In one of the embodiments of the present method for purification of the morpholine oligomer after the completion of the last cycle of synthesis of the morpholine oligomer, the terminal trityl group is removed in an acid medium with the formation of a protonated amine, said amine is neutralized and mixed with a monoalkyloxytrityl derivative to form a lipophilized morpholine oligomer, after which the oligomer is separated from carrier, the resulting mixture is dissolved in an organic solvent immiscible with water, lipophilized morpholine oligomer is washed from impurities, then dried and evaporated to an oil; said oil is subjected to an acid treatment to separate the lipophilic group and precipitated from the ether. The use of phase separation to purify the synthesized morpholine oligomer allows the synthesis and subsequent purification of a large amount of the substance, which makes it possible to obtain an industrial amount of the morpholine oligomer while maintaining the purity required for medical use.
В одном из вариантов осуществления изобретения для получения моноалкилокситритильного производного диэфир серинола конъюгируют к п-гидрокситритильному фрагменту через триэтиленгликоль-карбаматный линкер.In one embodiment, to obtain a monoalkyloxytrityl derivative, the serinol diester is conjugated to the p-hydroxytrityl moiety via a triethylene glycol carbamate linker.
Заявленный способ позволяет получать морфолиновые олигомеры с чистотой не менее 95%.The claimed method allows to obtain morpholine oligomers with a purity of at least 95%.
Детальное описание изобретенияDetailed description of the invention
В данном описании термин «морфолиновый олигомер» обозначает регулярный олигомер из метиленморфолиновых субъединиц, соединенных фосфородиамидатными связями. Рассматриваемые субъединицы представляют собой морфолиновые мономеры, являющиеся соединениями азотистого основания, способного участвовать в комплементарном связывании, и морфолина, иными словами - нуклеозидами, в которых сахарный остаток заменен на морфолин.As used herein, the term "morpholine oligomer" means a regular oligomer of methylenemorpholine subunits linked by phosphorodiamidate bonds. The considered subunits are morpholine monomers, which are compounds of a nitrogenous base capable of participating in complementary binding, and morpholine, in other words, nucleosides in which the sugar residue is replaced by morpholine.
В данном описании термин «липофилизация» описывает процесс, обратимо повышающий липофильность целевой молекулы.As used herein, the term "lipophilization" describes a process that reversibly increases the lipophilicity of a target molecule.
В данном описании термин «укороченные последовательности» описывает побочные продукты синтеза морфолиновых олигомеров, обладающие меньшей молекулярной массой, чем целевой продукт, из-за прерывания цепочки синтеза на ранней стадии. Они представляют собой основную часть примесей при синтезе морфолиновых олигомеров.In this description, the term "truncated sequences" describes by-products of the synthesis of morpholine oligomers, having a lower molecular weight than the target product, due to interruption of the synthesis chain at an early stage. They represent the main part of impurities in the synthesis of morpholine oligomers.
В данном описании термины «носитель», «твердая фаза», «смола» обозначают модифицированный полистирольный полимер, используемый в процессе синтеза олигомеров. Различные термины указывают на важность разных аспектов функциональности материала: «носитель» подчеркивает важность функционализирующих групп, «твердая фаза» - участие в гетерофазном процессе синтеза, а «смола» - изменение объема под действием растворителей.In this description, the terms "carrier", "solid phase", "resin" denote a modified polystyrene polymer used in the synthesis of oligomers. Different terms indicate the importance of different aspects of the functionality of the material: "carrier" emphasizes the importance of functionalizing groups, "solid phase" - participation in the heterophasic synthesis process, and "resin" - the change in volume under the influence of solvents.
В изобретении предложен масштабируемый способ получения морфолинового олигомера, подходящего для дальнейшего использования в медицинских целях, содержащий:The invention proposes a scalable method for obtaining a morpholine oligomer suitable for further use in medical purposes, containing:
а) синтез морфолинового олигомера с использованием морфолиновых мономеров, иa) synthesis of a morpholine oligomer using morpholine monomers, and
б) очистку морфолиновых олигомеров путем обратимой липофилизации продукта моноалкилокситритильным производным и фазового разделения липофильного продукта и гидрофильных примесей с последующим удалением липофильной группировки.b) purification of morpholine oligomers by reversible lipophilization of the product with a monoalkyloxytrityl derivative and phase separation of the lipophilic product and hydrophilic impurities, followed by removal of the lipophilic group.
Морфолиновые мономеры, используемые для синтеза морфолиновых олигомеров, могут быть получены с помощью известных из уровня техники способов. Также можно приобрести коммерчески доступные готовые морфолиновые мономеры, например, в компании Biosynth Carbosynth®, Великобритания (https://www.carbosynth.com/carbosynth/website.nsf/(w-productdisplavV6FEDE36FE413CADF882580050072AA3E, по ссылке, для иллюстрации, цитозиновый морфолиновый мономер, дата обращения 21.12.2021) и использовать их для синтеза морфолиновых олигомеров по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения проводят синтез морфолиновых мономеров способом, который представляет собой усовершенствование существующих способов синтеза морфолиновых мономеров. Известный из уровня техники процесс содержит несколько основных этапов: синтез морфолинового кольца, введение N-тритильной защитной группы, блокирование нескелетных реакционных центров и введение хлорфосфорамидатной группировки. В рамках упомянутого известного реакционного процесса используются субстраты с блокированными нескелетными реакционными центрами, что делает процесс более эффективным. Синтез морфолинового кольца производится путем периодатного расщепления рибозного кольца, за которым следует восстановление при добавлении раствора аллиламин гидрохлорида и тетрабората натрия, что приводит к образованию N-аллилморфолинового производного. Далее гидроксильную группу защищают с образованием силильного эфира, а аллильную защиту, связанную с атомом азота, удаляют для замены на стерически напряженную тритильную. Далее силильная защита удаляется, позволяя присоединить к деблокированной гидроксильной группе хлорфосфорамидатную группировку. Такой подход, несмотря на большее число стадий, позволяет получить удобно очищаемые продукты с высокой эффективностью. Значительная разница в гидрофобности продуктов промежуточных реакций делает флеш-хроматографию максимально простой и надежной. Источник морфолиновых мономеров и/или способ их получения не влияет на достижение технического результата настоящего изобретения.The morpholine monomers used for the synthesis of morpholine oligomers can be obtained using methods known in the art. Commercially available ready-made morpholine monomers can also be purchased, for example, from Biosynth Carbosynth®, UK (https://www.carbosynth.com/carbosynth/website.nsf/(w-productdisplavV6FEDE36FE413CADF882580050072AA3E ) accessed 12/21/2021) and use them for the synthesis of morpholine oligomers according to the present invention. In one of the embodiments of the invention, morpholine monomers are synthesized by a method that is an improvement on existing methods for the synthesis of morpholine monomers. The process known from the prior art contains several main stages: synthesis morpholine ring, introduction of an N-trityl protecting group, blocking of non-skeletal reaction centers, and introduction of a chlorophosphoramidate moiety In this known reaction process, substrates with blocked non-skeletal reaction centers are used, which makes the process more efficient. Synthesis of the morpholine ring is carried out by periodate cleavage of the ribose ring, followed by reduction by adding a solution of allylamine hydrochloride and sodium tetraborate, which leads to the formation of the N-allylmorpholine derivative. Further, the hydroxyl group is protected with the formation of a silyl ester, and the allyl protection associated with the nitrogen atom is removed to be replaced by a sterically strained trityl one. The silyl protection is then removed, allowing the addition of a chlorophosphoramidate group to the deprotected hydroxyl group. This approach, despite the greater number of stages, allows to obtain conveniently cleaned products with high efficiency. A significant difference in the hydrophobicity of the products of intermediate reactions makes flash chromatography as simple and reliable as possible. The source of morpholine monomers and/or the method of their production does not affect the achievement of the technical result of the present invention.
Один из способов, которыми могут быть получены морфолиновые мономеры, описан в статье Nekrasov M.D., Lukyanenko E.R. Kurkin A.V. Synthesis of N-substituted morpholine nucleoside derivatives // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 2020, V. 39:9, P. 1223-1244, DOI: 10.1080/15257770.2020.1788078. В частности, способ осуществляли следующим образом. К раствору рибонуклеозида (1 ммоль) в МеОН (20 мл) добавляли периодат натрия (1,02 ммоль), декагидрат тетрабората натрия (2 ммоль) и гидрохлорид амина (2,3 ммоль) и реакционную смесь перемешивали, перемешивали 2,5 ч, после чего реакционную смесь фильтровали. К раствору смеси в МеОН добавляли цианоборгидрид натрия (2,4 моль) и триэтиламин (0,33 мл) и смесь оставляли перемешиваться на 1 час. Затем 0,4 мл кислоты TFA смешивали с 5 мл метанола и добавляли, и смесь оставляли перемешивать 3 ч. Процесс был модифицирован для синтеза мономеров с 1,1-диаллилгидразиновым фрагментом, потому что гидразины являются восстановителями и реагируют с периодатом и иодатом натрия, препятствуя реакции нуклеозидов с этими реагентами. Для предотвращения непредвиденных побочных реакций оставшийся окислитель отфильтровывали, а затем последовательно добавляли тетраборат натрия и гидразина гидрохлорид. Другим ограничивающим фактором в этой реакции являются малорастворимые N-защищенные нуклеозиды, например N4-бензоилцитидин, в метаноле, что приводит к замедлению скорости окисления. Введение силильных заместителей, как правило, увеличивало растворимость нуклеозида и избегало ненужного перегрева реакции (нагревание увеличивало переокисление диальдегида) и позволяло увеличить выход целевых мономеров β. Такой подход позволил синтезировать N-замещенные морфолиновые мономеры с высоким выходом: до 95%, и с разнообразными заместителями. Такой способ синтеза морфолинового цикла сохраняет стереоспецифичность 1- и 5-положений, превращая производные фуранозы в морфолины и избегая рацемизации в а-положениях диальдегида. Все этапы этого синтеза просты и легко масштабируются до 0,5 1 моль с использованием стандартного лабораторного оборудования.One of the ways in which morpholine monomers can be obtained is described in the article by Nekrasov M.D., Lukyanenko E.R. Kurkin A.V. Synthesis of N-substituted morpholine nucleoside derivatives // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 2020, V. 39:9, P. 1223-1244, DOI: 10.1080/15257770.2020.1788078. In particular, the method was carried out as follows. Sodium periodate (1.02 mmol), sodium tetraborate decahydrate (2 mmol) and amine hydrochloride (2.3 mmol) were added to a solution of ribonucleoside (1 mmol) in MeOH (20 ml) and the reaction mixture was stirred, stirred for 2.5 h, after which the reaction mixture was filtered. Sodium cyanoborohydride (2.4 mol) and triethylamine (0.33 ml) were added to a solution of the mixture in MeOH, and the mixture was allowed to stir for 1 hour. Then 0.4 ml of TFA acid was mixed with 5 ml of methanol and added, and the mixture was left to stir for 3 hours. reactions of nucleosides with these reagents. To prevent unexpected side reactions, the remaining oxidizing agent was filtered off, and then sodium tetraborate and hydrazine hydrochloride were added successively. Another limiting factor in this reaction is the sparingly soluble N-protected nucleosides, such as N4-benzoylcytidine, in methanol, which slows down the rate of oxidation. The introduction of silyl substituents, as a rule, increased the solubility of the nucleoside and avoided unnecessary overheating of the reaction (heating increased the overoxidation of dialdehyde) and made it possible to increase the yield of target monomers β. This approach made it possible to synthesize N-substituted morpholine monomers in high yield: up to 95%, and with various substituents. This method of synthesizing the morpholine ring preserves the stereospecificity of the 1- and 5-positions, converting furanose derivatives into morpholines and avoiding racemization at the a-positions of the dialdehyde. All steps of this synthesis are simple and easily scaled up to 0.5 1 mol using standard laboratory equipment.
Первый этап способа по настоящему изобретению, касающийся синтеза морфолинового олигомера, представляет собой усовершенствование существующих способов. Известный из уровня техники процесс представляет собой четырехтактовый цикл реакций: детритилирование, нейтрализация, присоединение звена и кэпирование. В рамках первой стадии синтеза морфолинового олигомера по настоящему изобретению с твердой фазы при помощи кислотной обработки удаляется тритильная защитная группа, что создает новый и однородный реакционный центр на фазе в реакторе. Во время второй стадии образованный на твердой фазе аммонийный катион превращается во вторичный амин (морфолин), способный участвовать в реакции присоединения. Во время третьей стадии в реактор подаются смеси растворов мономера и активатора на основе диазабициклоундецена в 1,3-диметил-2-имидазолидиноне, реактор разогревается до 45°С, и реакция проводится до связывания всех доступных реакционных центров активированным мономером. Эта стадия значительно превосходит стандартные методы синтеза морфолинового олигомера в скорости и эффективности, позволяет значительно уменьшить расход мономеров на синтез. В четвертой стадии цикла твердая фаза обрабатывается смесью растворов 1-метилимидазола и уксусного ангидрида для связывания непрореагировавших реакционных центров и уменьшения количества примесей. Использование двухтактового кэпирования позволяет значительно уменьшить количество примесей за меньшее, чем по стандартным методикам, время. Реакционный цикл производится автоматизированно с помощью ДНК-синтезатора, управляемого компьютером, например ASM-10 производства Biosset, Россия. Это позволяет производить операции герметично, что важно из-за чувствительности хлорфосфоранов к влаге, и в многостадийном синтезе, превышающем по продолжительности сутки. Для достижения технического результата настоящего изобретения синтез морфолинового олигомера также может осуществляться другим известным из уровня техники способом синтеза морфолиновых олигомеров, имеющим стадию деактивации непрореагировавших реакционных центров (кэпирования). Один из таких способов описан, например, в патенте US 8299206 В2, опубл. 30.10.2012. Способы синтеза олигомера с кэпированием позволяют сохранить реакционноспособный центр на олигомере для дальнейшей липофилизации, при этом такой центр отсутствует у молекул-примесей, образующихся в результате многостадийного синтеза регулярного олигомера.The first step of the method of the present invention, concerning the synthesis of the morpholine oligomer, is an improvement on existing methods. The process known from the prior art is a four cycle reaction cycle: detritylation, neutralization, addition of a link and capping. As part of the first step in the synthesis of the morpholine oligomer of the present invention, the trityl protecting group is removed from the solid phase by acid treatment, which creates a new and homogeneous reaction center on the phase in the reactor. During the second stage, the ammonium cation formed on the solid phase is converted into a secondary amine (morpholine) capable of participating in the addition reaction. During the third stage, mixtures of solutions of the monomer and an activator based on diazabicycloundecene in 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone are fed into the reactor, the reactor is heated to 45°C, and the reaction is carried out until all available reaction centers are bound by the activated monomer. This stage significantly exceeds the standard methods for the synthesis of morpholine oligomer in speed and efficiency, and can significantly reduce the consumption of monomers for synthesis. In the fourth stage of the cycle, the solid phase is treated with a mixture of solutions of 1-methylimidazole and acetic anhydride to bind unreacted reaction centers and reduce the amount of impurities. The use of two-cycle capping makes it possible to significantly reduce the amount of impurities in less time than by standard methods. The reaction cycle is performed automatically using a computer-controlled DNA synthesizer, such as ASM-10 manufactured by Biosset, Russia. This makes it possible to carry out hermetic operations, which is important because of the sensitivity of chlorophosphoranes to moisture, and in multi-stage synthesis, which lasts longer than a day. To achieve the technical result of the present invention, the synthesis of a morpholine oligomer can also be carried out by another method known from the prior art for the synthesis of morpholine oligomers, which has a stage of deactivation of unreacted reaction centers (capping). One such method is described, for example, in US patent 8299206 B2, publ. 10/30/2012. Methods for the synthesis of an oligomer with capping make it possible to preserve the reactive center on the oligomer for further lipophilization, while such a center is absent in the impurity molecules formed as a result of the multistage synthesis of a regular oligomer.
Второй этап способа по настоящему изобретению, касающийся очистки реакционной смеси, полученной в результате проведения первых двух этапов способа, производят за счет обратимой липофилизации. При этом сначала целевые молекулы модифицируют таким образом, что их аффинность гидрофобному слою значительно увеличивается, тогда как с примесями такого резкого изменения свойств не происходит. Это достигается благодаря дезактивации побочных продуктов при синтезе олигомера (первый этап заявленного способа) путем обработки ацилирующим реагентом, в результате чего только целевая молекула сохраняет реакционную способность терминальной аминогруппы. При постсинтетической обработке защитную группу удаляют в кислой среде с образованием протонированного амина, затем к упомянутому амину добавляют моноалкилокситритильное производное, что приводит к присоединению модифицированного липофилизированного тритила к терминальной аминогруппе целевого олигомера, в результате чего возникает значительная разница в гидрофобности целевого продукта и примесей. После липофилизации целевого олигомера носитель обрабатывают раствором, отделяющим олигомер от линкерной группировки (например, для линкеров сложноэфирной природы используют водные растворы аммиака или органических аминов). Получаемую смесь разводят дихлорметаном и промывают равными объемами воды, удаляя нелипофильные вещества, после чего олигомер в дихлорметане сушат и упаривают до масла при пониженном давлении. После этого для удаления липофилизированного тритила морфолиновый олигомер обрабатывают 5% раствором трихлоруксусной кислоты в дихлорметане с 10% изопропанола. Далее, реакционную смесь смешивают с избытком диэтилового эфира, центрифугируют для отделения осадка, декантируют эфирный слой, промывают осадок диэтиловым эфиром и сушат при пониженном давлении. Также, для достижения технического результата разделение различающихся по гидрофобности целевого продукта и примесей может быть проведено с использованием других известных из уровня техники способов фазового разделения веществ.The second step of the method according to the present invention, concerning the purification of the reaction mixture obtained by carrying out the first two steps of the method, is carried out by reversible lipophilization. At the same time, the target molecules are first modified in such a way that their affinity for the hydrophobic layer increases significantly, while such a sharp change in properties does not occur with impurities. This is achieved due to the deactivation of by-products during the synthesis of the oligomer (the first stage of the claimed method) by treatment with an acylating reagent, as a result of which only the target molecule retains the reactivity of the terminal amino group. During postsynthetic treatment, the protective group is removed in an acidic medium to form a protonated amine, then a monoalkyloxytrityl derivative is added to the said amine, which leads to the addition of a modified lipophilized trityl to the terminal amino group of the target oligomer, resulting in a significant difference in the hydrophobicity of the target product and impurities. After lipophilization of the target oligomer, the carrier is treated with a solution separating the oligomer from the linker group (for example, aqueous solutions of ammonia or organic amines are used for ester linkers). The resulting mixture is diluted with dichloromethane and washed with equal volumes of water to remove non-lipophilic substances, after which the oligomer in dichloromethane is dried and evaporated to an oil under reduced pressure. After that, to remove the lipophilized trityl, the morpholine oligomer is treated with a 5% solution of trichloroacetic acid in dichloromethane with 10% isopropanol. Next, the reaction mixture is mixed with an excess of diethyl ether, centrifuged to separate the precipitate, the ether layer is decanted, the precipitate is washed with diethyl ether, and dried under reduced pressure. Also, to achieve a technical result, the separation of the target product and impurities differing in hydrophobicity can be carried out using other methods of phase separation of substances known from the prior art.
При осуществлении заявляемого способа масштабирование может быть ограничено только аппаратными характеристиками используемого оборудования (реактора, ДНК-синтезатора), в котором проводится синтез морфолинового олигомера. Описанный способ не ограничивается масштабом синтеза, приведенным в примерах, и может быть увеличен в соответствии с объемом используемого реактора. Стандартные приборы, используемые в настоящее время для синтеза олигомеров, позволяют получить до 10 г целевого олигомера, некоторые промышленные реакторы позволяют получить до 100 г целевого олигомера. Заявляемый способ может использоваться на этом оборудовании для увеличения количества целевого продукта. В настоящее время отсутствие ДНК-синтезаторов с большим объемом обусловлено отсутствием рутинных способов очистки большого количества олигонуклеотида. Заявляемое изобретение, включающее стадию, позволяющую очищать большое количество целевого продукта, позволит получать морфолиновые олигонуклеотиды в промышленных количествах.When implementing the proposed method, scaling can be limited only by the hardware characteristics of the equipment used (reactor, DNA synthesizer) in which the morpholine oligomer is synthesized. The described method is not limited to the scale of synthesis given in the examples, and can be increased in accordance with the volume of the reactor used. Standard instruments currently used for the synthesis of oligomers make it possible to obtain up to 10 g of the target oligomer; some industrial reactors make it possible to obtain up to 100 g of the target oligomer. The inventive method can be used on this equipment to increase the amount of the target product. Currently, the lack of large volume DNA synthesizers is due to the lack of routine methods for purifying large amounts of oligonucleotide. The claimed invention, including a stage that allows you to purify a large amount of the target product, will allow you to get morpholine oligonucleotides in industrial quantities.
Описание графических материаловDescription of graphic materials
На Фиг. 1 схематически изображен тиминовый морфолиновый мономер.On FIG. 1 schematically depicts a thymine morpholine monomer.
На Фиг. 2 схематически изображен цитозиновый морфолиновый мономер.On FIG. 2 is a schematic representation of a cytosine morpholine monomer.
На Фиг. 3 схематически изображен адениновый морфолиновый мономер.On FIG. 3 is a schematic representation of an adenine morpholine monomer.
На Фиг. 4 схематически изображен гуаниновый морфолиновый мономер.On FIG. 4 is a schematic representation of a guanine morpholine monomer.
На Фиг. 5 представлен масс-спектр морфолинового олигомера Т6.On FIG. 5 shows the mass spectrum of the T6 morpholine oligomer.
На Фиг. 6 схематически изображена структура липофилизирующего агента на основе пальмитиновой кислоты.On FIG. 6 schematically shows the structure of a lipophilizing agent based on palmitic acid.
На Фиг. 7 представлена хроматограмма реакционной смеси для синтеза морфолинового олигомера Т6 (профиль ВЭЖХ реакционной смеси после синтеза).On FIG. 7 shows the chromatogram of the reaction mixture for the synthesis of T6 morpholine oligomer (HPLC profile of the reaction mixture after synthesis).
На Фиг. 8 представлена хроматограмма морфолинового олигомера Т6, очищенного путем обратимой липофилизации.On FIG. 8 is a chromatogram of T6 morpholine oligomer purified by reversible lipophilization.
Данное изобретение поясняется следующими примерами осуществления:The present invention is illustrated by the following embodiments:
Пример 1. Синтез N-аллилморфолин нуклеозидовExample 1 Synthesis of N-allylmorpholine Nucleosides
1 эквивалент рибонуклеозида (5-метилуридин, N6-бензоиладенозин, N2-изобутирилгуанозин, N4-бензоилцитидин) растворяли в 20 л/моль эквивалента метанола и смешивали с 1,02 эквивалента периодата натрия, 2,3 эквивалента тетрабората натрия и 2 л/моль эквивалента 1М раствора аллиламин гидрохлорида в метаноле. Смесь перемешивали 2,5 часа, после чего отфильтровывали, добавляли 0,33 л/моль эквивалента триэтиламина и 2,2 эквивалента цианоборогидрида натрия. 15 минут спустя 0,4 л/моль эквивалента трифторуксусной кислоты смешивали с 0,6 л/моль эквивалента метанола и добавляли к смеси по каплям. 3 часа спустя реакционную смесь упаривали, смешивали с 3 л/моль эквивалента воды и 5 эквивалентами карбоната калия и экстрагировали дважды 30 л/моль эквивалента дихлорметана. Органические слои объединяли, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла. Продукты очищали на хроматографической колонке, нейтрализованной аммиаком (градиент 0 2% метанола в дихлорметане).1 equivalent of ribonucleoside (5-methyluridine, N6-benzoyladenosine, N2-isobutyrylguanosine, N4-benzoylcytidine) was dissolved in 20 L/mol equivalent of methanol and mixed with 1.02 equivalents of sodium periodate, 2.3 equivalents of sodium tetraborate and 2 L/mol equivalent 1M solution of allylamine hydrochloride in methanol. The mixture was stirred for 2.5 hours, after which it was filtered, 0.33 l/mol equivalent of triethylamine and 2.2 equivalents of sodium cyanoborohydride were added. 15 minutes later, 0.4 l/mol equivalent of trifluoroacetic acid was mixed with 0.6 l/mol equivalent of methanol and added dropwise to the mixture. 3 hours later the reaction mixture was evaporated, mixed with 3 l/mol equivalent of water and 5 equivalents of potassium carbonate and extracted twice with 30 l/mol equivalent of dichloromethane. The organic layers were combined, dried over sodium sulfate and evaporated to an oil. The products were purified by column chromatography neutralized with ammonia (
Пример 2. Синтез хлорфосфорамидатных морфолиновых мономеровExample 2 Synthesis of chlorophosphoramidate morpholine monomers
1 эквивалент аллил-морфолинового нуклеозида растворяли в 2,5 л/моль эквивалента диметилформамида, смешивали с 3,5 эквивалента имидазола и 1,75 эквивалента трет-бутилдифенилсилилхлорида. Реакцию проводили 2 часа, после чего добавляли 1 л/моль эквивалента этилацетата, промывали дважды 10 л/моль эквивалента воды, однократно 3 л/моль эквивалента насыщенного раствора хлорида натрия, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла.1 equivalent of allyl-morpholine nucleoside was dissolved in 2.5 l/mol equivalent of dimethylformamide, mixed with 3.5 equivalents of imidazole and 1.75 equivalents of tert-butyldiphenylsilyl chloride. The reaction was carried out for 2 hours, after which 1 L/mol equivalent of ethyl acetate was added, washed twice with 10 L/mol equivalent of water, once with 3 L/mol equivalent of saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate and evaporated to an oil.
Продукт растворяли в 10 л/моль эквивалента метанола, смешивали с 3 эквивалентами 1,3-диметилбарбитуровой кислоты и 0,05 эквивалента тетракис(трифенилфосфин)палладия под аргоновой атмосферой. Реакцию проводили 3 часа, после чего упаривали досуха, смешивали с 3 л/моль эквивалента 15% водного раствора карбоната калия и экстрагировали трижды 3 л/моль эквивалента дихлорметана с 10% метанола. Органические слои объединяли, высушивали сульфатом натрия, отфильтровывали и упаривали досуха.The product was dissolved in 10 l/mol equivalent of methanol, mixed with 3 equivalents of 1,3-dimethylbarbituric acid and 0.05 equivalents of tetrakis(triphenylphosphine)palladium under an argon atmosphere. The reaction was carried out for 3 hours, after which it was evaporated to dryness, mixed with 3 l/mol equivalent of 15% aqueous potassium carbonate solution and extracted three times with 3 l/mol equivalent of dichloromethane with 10% methanol. The organic layers were combined, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness.
Продукт растворяли в 2,5 л/моль эквивалента диметилформамида, смешивали с 3 эквивалентами N-этилморфолина и охлаждали до 0°С. Затем 1,1 эквивалент тритил хлорида добавляли к смеси и продолжали реакцию 3 часа, после чего смешивали с 10 л/моль эквивалента этилацетата, промывали дважды 10 л/моль эквивалента, однократно 3 л/моль эквивалента насыщенного солевого раствора, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла. Продукт очищали на хроматографической колонке, нейтрализованной аммиаком (градиент 0-1% метанола в дихлорметане).The product was dissolved in 2.5 l/mol equivalent of dimethylformamide, mixed with 3 equivalents of N-ethylmorpholine and cooled to 0°C. Then 1.1 equivalents of trityl chloride was added to the mixture and the reaction was continued for 3 hours, after which it was mixed with 10 L/mol equivalent of ethyl acetate, washed twice with 10 L/mol equivalent, once with 3 L/mol equivalent of saturated saline solution, dried with sodium sulfate and evaporated to oil. The product was purified on a column chromatography neutralized with ammonia (0-1% methanol in dichloromethane gradient).
Продукт растворяли в 2 л/моль эквивалента тетрагидрофурана и смешивали с 1,1 эквивалента тетрабутиламмония фторида тригидрата. Реакцию продолжали 4 часа, после чего смешивали с 10 л/моль эквивалента этилацетата, промывали дважды 10 л/моль эквивалента, однократно 3 л/моль эквивалента насыщенного солевого раствора, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла.The product was dissolved in 2 l/mol equivalents of tetrahydrofuran and mixed with 1.1 equivalents of tetrabutylammonium fluoride trihydrate. The reaction was continued for 4 hours, after which it was mixed with 10 l/mol equivalent of ethyl acetate, washed twice with 10 l/mol equivalent, once with 3 l/mol equivalent of saturated salt solution, dried with sodium sulfate and evaporated to an oil.
Продукт растворяли в 8 л/моль эквивалента дихлорметана, смешивали с 8 л/моль эквивалента сухого ацетонитрила, 2 эквивалентами бромида лития и 2 эквивалентами диазабициклоундецена. Смесь охлаждали до 0°С, после чего добавляли 1,6 эквивалента диметиламинофосфорного дихлорида. 60 минут спустя реакционный раствор смешивали с 15 л/моль эквивалента дихлорметана, промывали дважды 30 л/моль эквивалента 0,1 М раствора винной кислоты, один раз 30 л/моль эквивалента воды и один раз 10 л/моль эквивалента насыщенного солевого раствора, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла. Продукт очищали на хроматографической колонке (градиент этилацетата 0-50% в дихлорметане).The product was dissolved in 8 l/mol equivalent of dichloromethane, mixed with 8 l/mol equivalent of dry acetonitrile, 2 equivalents of lithium bromide and 2 equivalents of diazabicycloundecene. The mixture was cooled to 0°C, after which was added 1.6 equivalents of dimethylaminophosphorus dichloride. 60 minutes later, the reaction solution was mixed with 15 L/mol equivalent of dichloromethane, washed twice with 30 L/mol equivalent of 0.1 M tartaric acid solution, once with 30 L/mol equivalent of water and once with 10 L/mol equivalent of brine, dried sodium sulfate and evaporated to an oil. The product was purified by column chromatography (0-50% ethyl acetate gradient in dichloromethane).
Пример 3. Синтез морфолиновых олигомеров.Example 3. Synthesis of morpholine oligomers.
В качестве твердой фазы для синтеза продукта использовали полистирольную смолу (меш 150-200), содержащую аминометильные группы вне полимерной цепи в концентрациях 0,5 мкмоль /г, 1 мкмоль/г, 2 мкмоль/г или 4 мкмоль/г, модифицированные путем добавления линкера, обеспечивающего отсутствие стерических затруднений от полимера, отделение от полимера после синтеза, ортогональность синтезу олигомеров и наличие аминогруппы, защищенной тритильной группой.As a solid phase for the synthesis of the product, a polystyrene resin (mesh 150-200) containing aminomethyl groups outside the polymer chain at concentrations of 0.5 µmol/g, 1 µmol/g, 2 µmol/g or 4 µmol/g, modified by adding a linker that ensures the absence of steric hindrance from the polymer, separation from the polymer after synthesis, orthogonality to the synthesis of oligomers, and the presence of an amino group protected by a trityl group.
Носитель может содержать триэтиленгликолевый, тетраэтиленгликолевый или 2,2'-дитиоэтанольный линкеры, соединенные карбаматной группой с N-тритилпиперидиновым фрагментом. Линкеры соединяли с твердой фазой при помощи эфирной связи. Разрыв связи олигомера с твердой фазой, соединенной с 2,2'-дитиоэтанольным линкером, производили 0,1М раствором дитиотреитола в N-метил-2-пирролидиноне с 10% триэтиламина. Разрыв связи олигомера с твердой фазой, соединенной с триэтиленглико левым или тетраэтиленгликолевым линкером, производили раствором аммиака или первичного амина при стандартном протоколе депротекции экзоциклических аминогрупп, при этом этил енгликоле вые группы остаются связанными с олигомером, что значительно увеличивает его растворимость в воде.The carrier may contain triethylene glycol, tetraethylene glycol or 2,2'-dithioethanol linkers connected by a carbamate group to an N-tritylpiperidine moiety. The linkers were connected to the solid phase using an ether bond. Decoupling of the oligomer from the solid phase coupled to a 2,2'-dithioethanol linker was performed with a 0.1M solution of dithiothreitol in N-methyl-2-pyrrolidinone with 10% triethylamine. The cleavage of the bond between the oligomer and the solid phase connected with a triethylene glycol or tetraethylene glycol linker was performed with a solution of ammonia or a primary amine using a standard protocol for the deprotection of exocyclic amino groups, while the ethylene glycol groups remain bound to the oligomer, which significantly increases its solubility in water.
Реактор заполняли твердой фазой в зависимости от геометрии и расширения смолы под действием растворителей. Массу смолы расчитывали как 100-120 мг/(см3 объема)×(см радиуса сечения реактора). Перед синтезом реактор со смолой замачивали в N-метилпирролидоне на 30 минут, после чего промывали избытком дихлорметана и высушивали потоком аргона. Подготовленную таким образом систему использовали для проведения циклов синтеза олигомеров. Циклы синтеза морфолиновых олигомеров состояли из следующих этапов:The reactor was filled with a solid phase, depending on the geometry and expansion of the resin under the action of solvents. The weight of the resin was calculated as 100-120 mg/(cm 3 volume)×(cm reactor sectional radius). Before synthesis, the reactor with resin was soaked in N-methylpyrrolidone for 30 minutes, after which it was washed with excess dichloromethane and dried with a stream of argon. The system prepared in this way was used to carry out cycles of synthesis of oligomers. Cycles for the synthesis of morpholine oligomers consisted of the following steps:
1. Удаление тритильной защиты. Раствором 10% цианоуксусной кислоты и 20% ацетонитрила в дихлорметане заполняли реактор и перемешивали 30 секунд с использованием вибропривода. Затем реактор заполняли снова и повторяли процедуру еще дважды. Затем раствор удаляли из реактора аргоном.1. Removal of trityl protection. A solution of 10% cyanoacetic acid and 20% acetonitrile in dichloromethane was filled into the reactor and stirred for 30 seconds using a vibrator. Then the reactor was filled again and the procedure was repeated twice more. The solution was then removed from the reactor with argon.
2. Нейтрализация системы. Реактор заполняли раствором из 5% диизопропилэтиламина и 25% изопропанола в дихлоретане и перемешивали 40 секунд с использованием вибропривода. Затем реактор заполняли снова и повторяли процедуру еще четырежды. Затем раствор удаляли из реактора аргоном. Затем реактор промывали чистым дихлорметаном и высушивали трижды.2. Neutralization of the system. The reactor was filled with a solution of 5% diisopropylethylamine and 25% isopropanol in dichloroethane and stirred for 40 seconds using a vibrator. Then the reactor was filled again and the procedure was repeated four more times. The solution was then removed from the reactor with argon. The reactor was then washed with pure dichloromethane and dried three times.
3. Присоединение звена. Растворы хлорфосфорамидата (согласно заданной последовательности звеньев в олигомере) и активатора в диметилимидазолиноне закачивали в реактор. Реакцию проводили при 45°С на протяжении получаса при перемешивании виброприводом. Завершение реакции отслеживали с помощью хлоранильного теста. По завершении раствор удаляли давлением аргона, затем промывали реактор трижды дихлорметаном.3. Attaching a link. Solutions of chlorophosphoramidate (according to the specified sequence of units in the oligomer) and activator in dimethylimidazolinone were pumped into the reactor. The reaction was carried out at 45°C for half an hour with stirring with a vibration drive. The completion of the reaction was monitored using the chloranil test. Upon completion, the solution was removed under argon pressure, then the reactor was washed three times with dichloromethane.
4. Копирование. Реактор заполняли смесью из 5% уксусного ангидрида, 5% 1-метилимидазола и 5% пиридина в тетрагидрофуране и перемешивали 300 секунд с использованием вибропривода. Затем реактор заполняли снова и повторяли процедуру еще один раз. Затем раствор удаляли из реактора аргоном, реактор промывали чистым дихлорметаном и высушивали трижды.4. Copy. The reactor was filled with a mixture of 5% acetic anhydride, 5% 1-methylimidazole and 5% pyridine in tetrahydrofuran and stirred for 300 seconds using a vibrator. Then the reactor was filled again and the procedure was repeated one more time. Then the solution was removed from the reactor with argon, the reactor was washed with pure dichloromethane and dried three times.
После завершения цикла процесс переходит к началу следующего согласно последовательности, либо к завершающему этапу для последнего звена. Завершающий этап содержит последовательность из 12 30-секундных промывок реактора N-метилпирролидоном, удаление концевой тритильной защиты, трехкратную промывку реактора дихлорметаном и высушивание от растворителя аргоном. После этого реактор извлекали и высушивали при пониженном давлении.After the cycle is completed, the process proceeds to the beginning of the next according to the sequence, or to the final stage for the last link. The final stage consists of a sequence of 12 30-second reactor washes with N-methylpyrrolidone, removal of the terminal trityl protection, 3-times washing of the reactor with dichloromethane, and drying from the solvent with argon. Thereafter, the reactor was removed and dried under reduced pressure.
Пример 4. Синтез липофилизирующего агентаExample 4 Synthesis of a Lipophilizing Agent
Монобензил сукцинат растворяли в 2 л/моль эквивалента дихлорметана, охлаждали до 0°С, смешивали с 2 эквивалентами оке ал ил хлорид а и каталитическим количеством диметилформамида. Смесь перемешивали 3 часа, после которых смесь испаряли при пониженном давлении, получая хлорангидрид монобензилянтарной кислоты.Monobenzyl succinate was dissolved in 2 l/mol equivalent of dichloromethane, cooled to 0° C., mixed with 2 equivalents of oxalyl chloride a and a catalytic amount of dimethylformamide. The mixture was stirred for 3 hours, after which the mixture was evaporated under reduced pressure to give monobenzysuccinic acid chloride.
3 эквивалента триэтиленгликоля (либо, тетра- или пента-этиленгликоля) смешивали с 2 л/моль эквивалента дихлорметана и 2 эквивалентами триэтиламина. Смесь охлаждали и добавляли по каплям раствор хлорангидрида монобензилянтарной кислоты в 2 л/моль эквивалента дихлорметана с активным перемешиванием. 3 часа спустя раствор промывали разбавленным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении. Продукт очищали флеш-хроматографией в дихлорметане в градиенте метанола (0-2%).3 equivalents of triethylene glycol (either tetra- or penta-ethylene glycol) were mixed with 2 l/mol equivalents of dichloromethane and 2 equivalents of triethylamine. The mixture was cooled and a solution of monobenzysuccinic acid chloride in 2 l/mol equivalent of dichloromethane was added dropwise with vigorous stirring. 3 hours later, the solution was washed with dilute sodium bicarbonate solution, water and saturated sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure. The product was purified by flash chromatography in dichloromethane in a methanol (0-2%) gradient.
Продукт смешивали с 2 л/моль эквивалента дихлорметана, 1,5 эквивалента триэтиламина и 1,1 эквивалента метансульфонил хлорида. Через 30 минут раствор промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении. Продукт растворяли в 4 л/моль эквивалента сухого тетрагидрофурана, смешивали с 2 эквивалентами бромида лития, и нагревали до 75°С на рефлюксе. 6 часов спустя реакционную смесь испаряли при пониженном давлении, растворяли в этилацетате, промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении, получая бензил (2-(2-(2-бромоэтокси)этокси)этил сукцинат.The product was mixed with 2 l/mol equivalents of dichloromethane, 1.5 equivalents of triethylamine and 1.1 equivalents of methanesulfonyl chloride. After 30 minutes, the solution was washed twice with water and once with saturated sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure. The product was dissolved in 4 l/mol equivalent of dry tetrahydrofuran, mixed with 2 equivalents of lithium bromide, and heated to 75° C. under reflux. 6 hours later, the reaction mixture was evaporated under reduced pressure, dissolved in ethyl acetate, washed twice with water and once with saturated sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to give benzyl (2-(2-(2-bromoethoxy)ethoxy )ethyl succinate.
1 эквивалент п-гидрокси трифенилкарбинола смешивали с 1,2 эквивалента бензил (2-(2-(2-бромоэтокси)этокси)этил сукцината, 2 л/моль эквивалента диметилформамида, 2 эквивалентами карбоната калия и 0,1 эквивалента иодида калия. Смесь нагревали при активном перемешивании до 50°С 6 часов, после чего смешивали с этилацетатом, промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении. Продукт очищали флеш-хроматографией в гексане в градиенте этилацетата (25-50%).1 equivalent of p-hydroxy triphenylcarbinol was mixed with 1.2 equivalents of benzyl (2-(2-(2-bromoethoxy)ethoxy)ethyl succinate, 2 L/mol equivalents of dimethylformamide, 2 equivalents of potassium carbonate and 0.1 equivalents of potassium iodide. The mixture was heated with vigorous stirring to 50°C for 6 hours, after which it was mixed with ethyl acetate, washed twice with water and once with saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure.The product was purified by flash chromatography in hexane in an ethyl acetate gradient (25 -50%).
Продукт растворяли в 2 л/моль эквивалента метанола и смешивали с 5% по массе 10% палладия на угле, устанавливали водородную атмосферу и проводили реакцию с интенсивным перемешиванием 6 часов. Потом смесь отфильтровывали на селите и очищали флеш-хроматографией в дихлорметане в градиенте метанола (0-2%), получая 4-(2-(2-(2-(4-гидроксидифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутановую кислоту.The product was dissolved in 2 L/mol equivalent of methanol and mixed with 5% by weight of 10% palladium on carbon, placed under a hydrogen atmosphere and reacted with vigorous stirring for 6 hours. The mixture was then filtered on Selite and purified by flash chromatography in dichloromethane with a gradient of methanol (0-2%) to give 4-(2-(2-(2-(4-hydroxydiphenylmethyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-4- oxobutanoic acid.
2,5 эквивалента пальмитиновой (или маргариновой, стеариновой, нонадекановой, арахиновой) кислоты растворяли в 2 л/моль эквивалента дихлорметана, охлаждали до 0°С смешивали с 4 эквивалентами оксалилхлорида и каталитическим количеством диметилформамида. Смесь перемешивали 3 часа, после которых смесь выпаривали при пониженном давлении, получая хлор ангидрид пальмитиновой кислоты.2.5 equivalents of palmitic (or margaric, stearic, nonadecanoic, arachidic) acid was dissolved in 2 l/mol equivalent of dichloromethane, cooled to 0° C. mixed with 4 equivalents of oxalyl chloride and a catalytic amount of dimethylformamide. The mixture was stirred for 3 hours, after which the mixture was evaporated under reduced pressure to give palmitic acid chloride.
3 эквивалента триэтиламина смешивали с 2 л/моль эквивалента дихлорметана и 1 эквивалентом N-Boc-серинола. Смесь охлаждали и добавляли раствор хлорангидрида пальмитиновой кислоты в 2 л/моль эквивалента дихлорметана с активным перемешиванием. 3 часа спустя раствор промывали разбавленным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Продукт очищали флеш-хроматографией в гексане в градиенте этилацетата (3-5%).3 equivalents of triethylamine were mixed with 2 l/mol equivalents of dichloromethane and 1 equivalent of N-Boc-serinol. The mixture was cooled and a solution of palmitic acid chloride in 2 L/mol equivalent of dichloromethane was added with vigorous stirring. 3 hours later, the solution was washed with dilute sodium bicarbonate solution, water and saturated sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure. The product was purified by flash chromatography in hexane with an ethyl acetate (3-5%) gradient.
Продукт смешивали с 2 л/моль эквивалента трифторуксусной кислоты и перемешивали 30 минут, после чего испаряли, растворяли в дихлорметане, промывали трижды одномолярным водным раствором гидроксида натрия, один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали, получая 2-аминоопропан-1,3,-диил дипальмитинат.The product was mixed with 2 L/mol equivalent of trifluoroacetic acid and stirred for 30 minutes, then evaporated, dissolved in dichloromethane, washed three times with 1M aqueous sodium hydroxide solution, once with saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate, filtered and evaporated, obtaining 2-amino-propane -1,3, -diyl dipalmitinate.
4-(2-(2-(2-(4-гидроксидифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутановую кислоту (1,2 эквивалента) растворяли в 2 л/моль эквивалента дихлорметана, охлаждали до 0°С, смешивали с 2,4 эквивалентами оксалилхлорида и каталитическим количеством диметилформамида. Смесь перемешивали 3 часа, после которых смесь выпаривали при пониженном давлении. Продукт растворяли в 2,5 л/моль эквивалента сухого тетрагидрофурана, смешивали с 3 эквивалентами диизопропилэтиламина и охлаждали до 0°С. Затем раствор 2-аминоопропан-1,3,-диил дипальмитината в 2,5 л/моль эквивалента тетрагидрофуране добавляли по каплям и перемешивали смесь 6 часов. После этого раствор выпаривали и продукт очищали флеш-хроматографией в дихлорметане в градиенте этилацетата (0-50%).4-(2-(2-(2-(4-Hydroxydiphenylmethyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-4-oxobutanoic acid (1.2 equivalents) was dissolved in 2 L/mol equivalent dichloromethane, cooled to 0°C, mixed with 2.4 equivalents of oxalyl chloride and a catalytic amount of dimethylformamide. The mixture was stirred for 3 hours, after which the mixture was evaporated under reduced pressure. The product was dissolved in 2.5 l/mol equivalent of dry tetrahydrofuran, mixed with 3 equivalents of diisopropylethylamine and cooled to 0°C. Then a solution of 2-aminopropane-1,3,-diyl dipalmitinate in 2.5 l/mol equivalent of tetrahydrofuran was added dropwise and the mixture was stirred for 6 hours. The solution was then evaporated and the product was purified by flash chromatography in dichloromethane with an ethyl acetate gradient (0-50%).
Продукт растворяли в 2 л/моль эквивалента тионил хлорида и перемешивали 6 часов, затем выпаривали, получая 2-(4-(2-(2-(2-(4-(хлородифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутанамидо)-пропан-1,3-диил дипальмитат.The product was dissolved in 2 L/mol equivalent of thionyl chloride and stirred for 6 hours, then evaporated to give 2-(4-(2-(2-(2-(4-(chlorodiphenylmethyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-4- oxobutanamido)-propane-1,3-diyl dipalmitate.
Пример 5. Анализ структур морфолиновых мономеров и липофилизирующего агента методами 1Н ЯМРExample 5 Analysis of the structures of morpholine monomers and a lipophilizing agent by 1 H NMR
Анализ при помощи 1Н ЯМР проводился на приборе Bruker Avance 400 на частоте 400 МГц с калибровкой по недейтерированному хлороформу (δН = 7.28 ppm). 1 H NMR analysis was performed on a
Моно(6-(5-метил-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или тиминовый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 1. Выход 75,4%. Белая пена. Rf (CH2Cl2:EtOAc 1:1, UV)=0.50. 1H NMR: 1.35-1.55 (2Н, m), 1.71 (1H, s), 1.84 (1H, s), 2.60-2.69 (6Н, m), 3.16 (1Н, d, J=11.86 Hz), 3.38 (1H, d, J=11.13 Hz), 4.04-4.10 (1H, m), 4.36-4.44 (1H, m), 6.14 (1H, dd, J1=9.6 Hz, J2=2.14 Hz), 7.00-7.57 (16Н, m), 8.57 (1H, s)Mono(6-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-tritylmorpholin-2-yl)methyl dimethylphosphoramidochloridate or thymine morpholine monomer is shown in FIG. 1. Yield 75.4%. White foam. Rf (CH2Cl2:EtOAc 1:1, UV)=0.50. 1H NMR: 1.35-1.55 (2H, m), 1.71 (1H, s), 1.84 (1H, s), 2.60-2.69 (6H, m), 3.16 (1H, d, J=11.86 Hz), 3.38 (1H , d, J=11.13 Hz), 4.04-4.10 (1H, m), 4.36-4.44 (1H, m), 6.14 (1H, dd, J1=9.6 Hz, J2=2.14 Hz), 7.00-7.57 (16Н, m), 8.57 (1H, s)
(6-(4-бензамидо-2-оксо-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или цитозиновый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 2. Выход 66,7%. Белая пена. Rf (CH2Cl2:EtOAc 1:1, UV)=0.39. 1Н NMR: 1.52 (1H, t, J=11.13 Hz), 1.75 (1H, s), 2.17 (1H, s), 2.64 (6H, d, J=13.82 Hz), 3.17 (1H, d, J=11.98 Hz), 3.60 (1H, d, J=11.37 Hz), 4.40-4.48 (1H, m), 6.29 (1H, d, J=7.58 Hz), 7.14-7.77 (20H, m), 7.87 (2H, d, J=7.46 Hz), 8.64 (1H, s)(6-(4-Benzamido-2-oxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-tritylmorpholin-2-yl)methyl dimethylphosphoramidochloridate or cytosine morpholine monomer is shown in FIG. 2. Yield 66.7%. White foam. Rf (CH2Cl2:EtOAc 1:1, UV)=0.39. 1H NMR: 1.52 (1H, t, J=11.13 Hz), 1.75 (1H, s), 2.17 (1H, s), 2.64 (6H, d, J=13.82 Hz), 3.17 (1H, d, J=11.98 Hz), 3.60 (1H, d, J=11.37 Hz), 4.40-4.48 (1H, m), 6.29 (1H, d, J=7.58 Hz), 7.14-7.77 (20H, m), 7.87 (2H, d , J=7.46 Hz), 8.64 (1H, s)
(6-(6-бензамидо-9Н-пурин-9-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или адениновый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 3. Выход 48,5%. Белая пена. Rf (EtOAc, UV)=0.39. 1H NMR: 1.60-1.68 (1H, m), 1.82 (1H, td, J1=10.67 Hz, J2=4.59 Hz), 2.61 (3H, d, J=6.97H), 2.64 (3H, d, J=7.09 Hz), 2.71 (1H, d, J=1.34 Hz), 2.74 (1H, d, J=1.34 Hz), 3.26 (1H, dd, J=11.74 Hz, J2=1.83 Hz), 3.55 (1H, d, J=11.62 Hz), 4.49-4.57 (1H, m), 6.43 (1H, d, J=8.93 Hz), 7.18-7.64 (20H, m), 8.02 (2H, dd, J1=9.35 Hz, J2=2.02 Hz), 8.81 (1H, s)(6-(6-Benzamido-9H-purin-9-yl)-4-tritylmorpholin-2-yl)methyl dimethylphosphoramidochloridate or adenine morpholine monomer is shown in FIG. 3. Yield 48.5%. White foam. Rf (EtOAc, UV)=0.39. 1H NMR: 1.60-1.68 (1H, m), 1.82 (1H, td, J1=10.67 Hz, J2=4.59 Hz), 2.61 (3H, d, J=6.97H), 2.64 (3H, d, J=7.09 Hz), 2.71 (1H, d, J=1.34 Hz), 2.74 (1H, d, J=1.34 Hz), 3.26 (1H, dd, J=11.74 Hz, J2=1.83 Hz), 3.55 (1H, d, J=11.62 Hz), 4.49-4.57 (1H, m), 6.43 (1H, d, J=8.93 Hz), 7.18-7.64 (20H, m), 8.02 (2H, dd, J1=9.35 Hz, J2=2.02 Hz), 8.81 (1H, s)
(6-(2-изобутириламидо-6-метилен-1Н-пурин-9(6Н)-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или гуаниновый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 4. Выход 47,0%. Белая пена. Rf (CH2Cl2:THF 9:1, UV)=0.47. 1H NMR: 1.23 (3Н, d, J=6.85 Hz), 1.30 (3H, d, J=6.97 Hz), 1.55 (1H, td, J1=3.30 Hz, J2=2.08 Hz), 1.65-1.74 (1H, m), 2.64 (6H, dt, J1=9.66 Hz, J2=4.16 Hz), 2.68-2.77 (1H, m), 3.22 (1H, d, J=11.86 Hz), 3.42 (1H, d, J=11.37 Hz), 4.01-4.22 (2H, m), 4.40-4.49 (1H, m), 6.00 (1H, ddd, J1=9.57 Hz, J2=7.31 Hz, J3=2.20 Hz), 7.15-7.51 (1H, m), 7.58 (1H, d, J=3.91 Hz), 9.05 (1H, d, J=84.12 Hz), 12.08 (1H, s)(6-(2-isobutyrylamido-6-methylene-1H-purin-9(6H)-yl)-4-tritylmorpholin-2-yl)methyl dimethylphosphoramidochloridate or guanine morpholine monomer is shown in FIG. 4. Yield 47.0%. White foam. Rf (CH2Cl2:THF 9:1, UV)=0.47. 1H NMR: 1.23 (3H, d, J=6.85 Hz), 1.30 (3H, d, J=6.97 Hz), 1.55 (1H, td, J1=3.30 Hz, J2=2.08 Hz), 1.65-1.74 (1H, m), 2.64 (6H, dt, J1=9.66 Hz, J2=4.16 Hz), 2.68-2.77 (1H, m), 3.22 (1H, d, J=11.86 Hz), 3.42 (1H, d, J=11.37 Hz), 4.01-4.22 (2H, m), 4.40-4.49 (1H, m), 6.00 (1H, ddd, J1=9.57 Hz, J2=7.31 Hz, J3=2.20 Hz), 7.15-7.51 (1H, m ), 7.58 (1H, d, J=3.91 Hz), 9.05 (1H, d, J=84.12 Hz), 12.08 (1H, s)
2-(4-(2-(2-(2-(4-(хлородифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутанамидо)пропан-1,3-диил дипальмитат, или липофилизирующий агент представлен на Фиг. 6. 0.77 (6Н, t, J=6.68 Hz), 1.15 (52Н, br.s.), 1.50 (4Н, t, J=6.86 Hz), 2.21 (4H, t, J=7.56 Hz), 2.36 (2H, t, J=6.65 Hz), 2.58 (2H, t, J=6.59 Hz), 3.52-3.65 (6H, m), 3.70-3.79 (2H, m), 4.05-4.19 (4H, m), 4.26-4.39 (1H, m), 5.91-5.98 (1H, m), 6.68-6.76 (2H, d, J=8.67 Hz), 6.85-7.04 (4H, m), 7.05-7.22 (8H, m)2-(4-(2-(2-(2-(4-(Chlorodiphenylmethyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-4-oxobutanamido)propane-1,3-diyl dipalmitate or lipophilizing agent is shown in FIG. 6. 0.77 (6Н, t, J=6.68 Hz), 1.15 (52Н, br.s.), 1.50 (4Н, t, J=6.86 Hz), 2.21 (4H, t, J=7.56 Hz), 2.36 ( 2H, t, J=6.65 Hz), 2.58 (2H, t, J=6.59 Hz), 3.52-3.65 (6H, m), 3.70-3.79 (2H, m), 4.05-4.19 (4H, m), 4.26 -4.39 (1H, m), 5.91-5.98 (1H, m), 6.68-6.76 (2H, d, J=8.67 Hz), 6.85-7.04 (4H, m), 7.05-7.22 (8H, m)
Пример 6. Липофилизация олигомеров, полученных методом твердофазного синтезаExample 6 Lipophilization of Oligomers Produced by Solid Phase Synthesis
Очищаемый олигомер синтезировали методами твердофазного автоматизированного синтеза с кэпированием побочных продуктов, снятием терминальной защиты и без деблока боковых групп. Твердофазный носитель смешивали с 1-метил-2-пирролидоном, 10 эквивалентами липофилизирующего агента и 20 эквивалентами изопропилэтиламина, после чего перемешивали 4 часа при температуре 40°С. Затем раствор отфильтровывали.The oligomer to be purified was synthesized by automated solid-phase synthesis with capping of by-products, removal of terminal protection, and without deblocking of side groups. The solid phase carrier was mixed with 1-methyl-2-pyrrolidone, 10 equivalents of a lipophilizing agent and 20 equivalents of isopropylethylamine, followed by stirring for 4 hours at 40°C. Then the solution was filtered.
Пример 7. Очистка липофилизированного олигомераExample 7 Purification of the Lipophilized Oligomer
Носитель с липофилизированным продуктом смешивали с раствором для депротекции (например, трет-бутиламин : метанол : вода 1:1:2 для амидных защитных групп) и перемешивали согласно принятому для этого класса соединений протоколу [патент US 8299206 B2, опубл. 14.11.2014]. Затем раствор отфильтровывали, промывали, носитель обрабатывали 0,1 молярным раствором дитиотреитола в 1-метил-2-пирролидоне с 10% триэтиламина. Через 30 минут раствор собирали, смешивали с дихлорметаном и промывали водой 3 раза, затем 1 раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали растворитель. Продукт обрабатывали 10% раствором цианоуксусной кислоты в смеси дихлорметан : ацетонитрил 4:1 на протяжении 1 часа, затем высаживали в диэтиловый эфир, нейтрализовали раствором из 5% диизопропилэтиламина, 25% изопропанола и 70% дихлорметана и повторно высаживали в диэтиловый эфир.The carrier with the lipophilized product was mixed with a deprotection solution (for example, tert-butylamine : methanol : water 1:1:2 for amide protecting groups) and mixed according to the protocol adopted for this class of compounds [patent US 8299206 B2, publ. November 14, 2014]. Then the solution was filtered, washed, the carrier was treated with a 0.1 molar solution of dithiothreitol in 1-methyl-2-pyrrolidone with 10% triethylamine. After 30 minutes, the solution was collected, mixed with dichloromethane and washed with
Пример 8. Оценка эффективности очистки олигонуклеотидовExample 8 Oligonucleotide Purification Efficiency Evaluation
Анализ методом ВЭЖХ проводили с помощью хроматографа Agilent 1220 Infinity LC на колонке ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18 (4,6×150 мм, размер гранул 5 мкм Agilent P/N 993967-902) со скоростью потока 1,5 мл/мин и регистрацией поглощения на волне 260 нм. 1,5 ОЕ олигомера в объеме 0,5 мл вносили на колонку при комнатной температуре и пропускали градиент буфера В 0-100% за 15 минут (со 2 до 17 минуты на хроматограмме).HPLC analysis was performed using an Agilent 1220 Infinity LC chromatograph on a ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18 column (4.6×150 mm,
Для сравнения использовали образцы реакционной смеси и очищенной порции морфолинового олигомера Т7 с модифицированным флуореноном концевым звеном.For comparison, samples of the reaction mixture and a purified portion of T7 morpholine oligomer with a fluorenone-modified terminal unit were used.
Буфер А 0,01М триэтиламмония ацетат в бидистилированной водеBuffer A 0.01M triethylammonium acetate in bidistilled water
Буфер В вода : ацетонитрил 1:4 (v:v)Buffer B water: acetonitrile 1:4 (v:v)
Раствор реакционной смеси (Фиг. 7) и очищенного вещества (Фиг. 8) был проанализирован приведенным выше методом анализа ВЭЖХ. Хроматограммы содержат отчетливый пик продукта (12,4 мин), а также низко интенсивные пики примесей. Отношение интегралов сигналов пиков примеси и основного вещества в реакционной смеси составило 10473 к 66974, то есть примесь составляет 13.52% смеси по оптическому поглощению на волне 260 нм. Отношение интегралов сигналов пиков примеси и основного вещества в очищенном веществе составило 2881.24 к 50167.41, то есть удаленная примесь составляла 5,43% смеси по оптическому поглощению на волне 260 нм. Оставшиеся примеси составляют менее 5%, что соответствует действующим фармакологическим стандартам.A solution of the reaction mixture (FIG. 7) and the purified substance (FIG. 8) was analyzed by the above HPLC analysis method. The chromatograms show a distinct product peak (12.4 min) as well as low intensity impurity peaks. The ratio of the integrals of the signals of the peaks of the impurity and the main substance in the reaction mixture was 10473 to 66974, that is, the impurity makes up 13.52% of the mixture in terms of optical absorption at a wavelength of 260 nm. The ratio of the integrals of the signals of the peaks of the impurity and the main substance in the purified substance was 2881.24 to 50167.41, that is, the removed impurity was 5.43% of the mixture in terms of optical absorption at a wavelength of 260 nm. The remaining impurities are less than 5%, which is in line with current pharmacological standards.
Пример 9. Качественный анализ морфолиновых олигомеров, синтезированных заявляемым способом.Example 9. Qualitative analysis of morpholine oligomers synthesized by the claimed method.
Качественный анализ полученных мономеров проводили методами MALDI масс-спектрометрии. Анализ проводили с помощью масс-спектрометра Autoflex III (Bruker Daltonics, Inc) с использованием 2,5-дигидроксибензойной кислоты в качестве матрицы (MALDI-TOF). В качестве стандарта использовали образец очищенного ВЭЖХ олигомера морфолино Т6. Пик m/z = 2211.71923828 совпадает с массой протонированного продукта (Т6+Н+), другие пики спектра соответствуют продуктам его распада при ионизации, что подтверждает пригодность метода для синтеза морфолиновых олигомеров. Масс-спектр приведен на Фиг. 5.Qualitative analysis of the obtained monomers was carried out by MALDI mass spectrometry. Analysis was performed with an Autoflex III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Inc) using 2,5-dihydroxybenzoic acid as a matrix (MALDI-TOF). A sample of purified HPLC morpholino T6 oligomer was used as a standard. The peak m/z = 2211.71923828 coincides with the mass of the protonated product (Т 6 +Н + ), other peaks of the spectrum correspond to the products of its decomposition during ionization, which confirms the suitability of the method for the synthesis of morpholine oligomers. The mass spectrum is shown in Fig. five.
Таким образом, морфолиновые олигомеры могут быть синтезированы и очищены от укороченных последовательностей с помощью заявляемого способа. Получение хлорфосфорамидатных морфолиновых мономеров заявляемым способом подтверждается спектрами ЯМР. Получение морфолиновых олигомеров заявляемым способом подтверждается результатами MALDI масс-спектрометрии. Спектр поглощения УФ на волне 260 нм при ВЭЖХ - разделении очищенного и неочищенного продукта, подтверждает, что заявляемый способ позволяет очистить смесь от примесей до по меньшей мере 95.3% чистоты (по количеству вещества, на основании закона Бугера-Ламберта-Бера для усредненного поглощения нуклеотидов на волне 260 нм).Thus, morpholine oligomers can be synthesized and purified from truncated sequences using the proposed method. Obtaining chlorophosphoramidate morpholine monomers by the claimed method is confirmed by NMR spectra. Obtaining morpholine oligomers by the claimed method is confirmed by the results of MALDI mass spectrometry. The UV absorption spectrum at a wavelength of 260 nm during HPLC - separation of the purified and crude product, confirms that the proposed method allows you to purify the mixture from impurities to at least 95.3% purity (by the amount of substance, based on the Bouguer-Lambert-Beer law for the average absorption of nucleotides at 260 nm).
Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.All publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference. While this invention has been described in the foregoing description with respect to certain preferred embodiments thereof, and many of the details have been set forth for purposes of illustration, it will be apparent to those skilled in the art that the invention is capable of further embodiments and that some of the details described herein are may vary significantly without deviating from the essence of the invention.
Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.The use of terms in the singular in the context of the description of the invention should be construed as covering both the singular and the plural, unless otherwise specified in this document or clearly contrary to the context. The terms "consisting of", "having", "including" and "comprising" should be construed as non-limiting terms, i.e. meaning "including but not limited to" unless otherwise noted. The listing of ranges of values in this document is merely intended to be used as a shorthand way of individually referring to each individual value falling within that range, unless otherwise noted here, and each individual value is included in the specification as if it were set out separately in this document. . All methods described herein may be performed in any suitable order, unless otherwise indicated herein or otherwise expressly contradicted by the context. The use of any and all examples or illustrative language (eg, "such as") provided herein is merely intended to better describe the invention and does not limit the scope of the invention unless otherwise stated. Nothing in the specification should be construed as indicating any unclaimed element as essential to the practice of the invention.
Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.Embodiments of this invention are described herein, including the best method known to the inventors for carrying out the invention. Variations of these embodiments may become apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The authors expect those skilled in the art to use such variations as the case may be, and the authors expect the invention to be practiced otherwise than specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications and equivalents of the features set forth in the appended claims, as permitted by applicable law. Moreover, any combination of the above features in all their possible variations is covered by the invention, unless otherwise specified in this document or otherwise clearly contrary to the context.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ получения морфолиновых олигомеров» на предмет выдачи патента на изобретение.The applicant asks to consider the submitted materials of the application "Method for obtaining morpholine oligomers" in order to issue a patent for the invention.
Claims (29)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787350C1 true RU2787350C1 (en) | 2023-01-09 |
Family
ID=
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185444A (en) * | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
| US6107479A (en) * | 1996-11-07 | 2000-08-22 | Novartis Ag | Process for the preparation of an oligomeric compound |
| WO2001085220A1 (en) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Rna-Tec N.V. | Labeled nucleosides and method for their preparation |
| CA2479901A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Avecia Biotechnology Inc | Purification methods for oligonucleotides and their analogs |
| US8299206B2 (en) * | 2007-11-15 | 2012-10-30 | Avi Biopharma, Inc. | Method of synthesis of morpholino oligomers |
| RU2606627C2 (en) * | 2007-11-15 | 2017-01-10 | Серепта Терапьютикс,Инк. | Method for synthesis of morpholine oligomers |
| WO2017205880A1 (en) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185444A (en) * | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
| US6107479A (en) * | 1996-11-07 | 2000-08-22 | Novartis Ag | Process for the preparation of an oligomeric compound |
| WO2001085220A1 (en) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Rna-Tec N.V. | Labeled nucleosides and method for their preparation |
| CA2479901A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Avecia Biotechnology Inc | Purification methods for oligonucleotides and their analogs |
| US8299206B2 (en) * | 2007-11-15 | 2012-10-30 | Avi Biopharma, Inc. | Method of synthesis of morpholino oligomers |
| RU2606627C2 (en) * | 2007-11-15 | 2017-01-10 | Серепта Терапьютикс,Инк. | Method for synthesis of morpholine oligomers |
| WO2017205880A1 (en) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Mikhail D. Nekrasov et al., Synthesis of N-substituted morpholine nucleoside derivatives / Nucleosides Nucleotides Nucleic Acid, 2020, Vol.39, N.9, pp.1223-1244. Sankha Pattanayak et al., Lithium bromide-DBU mediated synthesis of chlorophosphoramidate-activated morpholino nucleoside subunits / Tetrahedron Letters, 2012, Vol.53, N 49, pp. 6714-6717. Shchepinov M.S. et al., Recent applications of bifunctional trityl groups / Chem. Soc. Rev., 2003. V.32. pp. 170-180. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2519406B2 (en) | Novel compound containing an oligonucleotide chain having a protective agent attached thereto | |
| EP0101985B1 (en) | Oligonucleotide derivatives and production thereof | |
| KR101032008B1 (en) | Polynucleotide labelling reagent | |
| EP1874792B1 (en) | Activators for oligonucleotide and phosphoramidite synthesis | |
| US6291669B1 (en) | Solid phase synthesis | |
| Cormier et al. | Synthesis of hexanucleotide analogues containing diisopropylsilyl internucleotide linkages. | |
| JP2008537733A (en) | Ionic liquid supported synthesis | |
| EP3778619A1 (en) | Segment for oligonucleotide synthesis, production method for same, and oligonucleotide synthesis method using same | |
| AU725627B2 (en) | Reusable solid support for oligonucleotide synthesis, process for production thereof and process for use thereof | |
| US6043353A (en) | Reusable solid support for oligonucleotide synthesis, process for production thereof and process for use thereof | |
| WO2007013190A1 (en) | Oligonucleotide probe | |
| JP7475056B2 (en) | Method for producing photoresponsive nucleotide analogues | |
| RU2787350C1 (en) | Method for producing morpholine oligomers | |
| US20040044195A1 (en) | Process for separating and deprotecting oligonucleotides | |
| CN110891961B (en) | Improved process for the preparation of imaelstat | |
| Kolganova et al. | Simple and Stereoselective Preparation of an 4‐(Aminomethyl)‐1, 2, 3‐triazolyl Nucleoside Phosphoramidite | |
| EP0565646A1 (en) | Nucleosides and oligonucleosides with a phosphate-free internucleoside backbone and process for preparing the same | |
| US20030129593A1 (en) | Process for producing multiple oligonucleotides on a solid support | |
| US7098326B2 (en) | Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides | |
| US20040220397A1 (en) | Solid support for the synthesis of 3'-amino oligonucleotides | |
| JP4015136B2 (en) | Deoxyribose derivatives having a phenol skeleton and photoresponsive nucleotides | |
| US6153742A (en) | General process for the preparation of cyclic oligonucleotides | |
| JPH05501418A (en) | Oligonucleotide functionalization methods | |
| KR101354692B1 (en) | Oligomer and the synthesis of the oligomer | |
| Misra et al. | Fluorescent labelling of ribonucleosides at 2′-terminus; Comparative fluorescence studies |