RU2786657C2

RU2786657C2 - Enzymatic reaction medium containing surfactant

Info

Publication number: RU2786657C2
Application number: RU2019122303A
Authority: RU
Inventors: Цзяньгуан Чжоу; Пэнфэй ГО; Юй Гай; Михаэль ПАРМЕНТЬЕ; Фабрис Галлу; Вэйюн КУН; Фэн ГАО
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2022-12-23

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology, and it is aimed at improvement of a reaction medium for enzymatic synthesis reactions. An aqueous reaction mixture for enzymatic reaction is proposed, containing enzyme, enzyme substrate, and surfactant. The surfactant is a compound – vitamin E derivative, and it is selected from surfactants having the formula I

Concentration of the surfactant in the reaction mixture is higher than its critical concentration of micelle formation. Enzyme is selected from reductases, transferases, dehydrogenases, lipases, or esterases. In addition, a method for enzymatic reaction, using the specified reaction mixture, is proposed.

EFFECT: inventions allow for an increase in stability and yield of enzymatic reaction at lower temperatures and at low pH values.

32 cl, 4 tbl, 4 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

Настоящее изобретение направлено на улучшение реакционной среды для реакций ферментативного синтеза. Реакционная среда содержит определенное поверхностно-активное вещество (ПАВ), которое усиливает растворение реагентов и продуктов химической реакции и повышает активность фермента по сравнению с общепринятыми ПАВ. Применение определенного ПАВ приводит к повышению выхода и более устойчивой ферментативной реакции. Для этой цели в изобретении предложена реакционная смесь, содержащая фермент и ПАВ, и способ проведения ферментативной реакции с использованием указанной реакционной смеси.The present invention is directed to improving the reaction medium for enzymatic synthesis reactions. The reaction medium contains a certain surfactant, which enhances the dissolution of the reactants and products of the chemical reaction and increases the activity of the enzyme compared to conventional surfactants. The use of a certain surfactant leads to an increase in yield and a more stable enzymatic reaction. For this purpose, the invention provides a reaction mixture containing an enzyme and a surfactant, and a method for carrying out an enzymatic reaction using said reaction mixture.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

Новые методы каталитического синтеза в органической химии, удовлетворяющие все более строгим экологическим требованиям, пользуются большим спросом в фармацевтической и химической промышленностях. Кроме того, необходимы новые каталитические процедуры для получения новых классов органических соединений, которые становятся объектами молекулярных и биомедицинских исследований. Катализируемые ферментами химические превращения теперь широко признаются качестве практических альтернатив традиционному (небиологическому) органическому синтезу и в качестве удобных решений некоторых трудноразрешимых проблем синтеза.New methods of catalytic synthesis in organic chemistry, meeting increasingly stringent environmental requirements, are in great demand in the pharmaceutical and chemical industries. In addition, new catalytic procedures are needed to obtain new classes of organic compounds that are becoming objects of molecular and biomedical research. Enzyme-catalyzed chemical transformations are now widely recognized as practical alternatives to traditional (non-biological) organic synthesis and as convenient solutions to some of the intractable problems of synthesis.

Ферментативные реакции, как правило, выполняют в водной среде. Однако, многие представляющие интерес с точки зрения химической индустрии субстраты и продукты только частично растворимы в воде. Для улучшения растворимости в реакционную смесь часто добавляют органические растворители. С другой стороны, эти органические растворители отрицательно влияют на стабильность и эффективность многих ферментов. Кроме того, некоторые органические растворители вредны для окружающей среды.Enzymatic reactions are generally performed in an aqueous medium. However, many substrates and products of interest to the chemical industry are only partially soluble in water. Organic solvents are often added to the reaction mixture to improve solubility. On the other hand, these organic solvents adversely affect the stability and efficiency of many enzymes. In addition, some organic solvents are harmful to the environment.

Поэтому, в этой области техники существует потребность в реакционной среде для реакций ферментативного синтеза, которая позволила бы растворять гидрофобные субстраты и продукты, но не влияла бы на стабильность и выход ферментативной реакции.Therefore, there is a need in the art for a reaction medium for enzymatic synthesis reactions that would allow the dissolution of hydrophobic substrates and products, but would not affect the stability and yield of the enzymatic reaction.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE PRESENT INVENTION

Настоящее изобретение основано на открытии того, что эффективность реакций химического синтеза с использованием ферментов в качестве катализаторов может быть повышена с помощью введения определенных ПАВ в реакционную смесь. ПАВ можно применять в реакциях ферментативного синтеза для повышения растворимости реагентов и продуктов реакции. Однако, эти ПАВ отрицательно влияют на активность и стабильность ферментов. Данными изобретателями было обнаружено, что применение ПАВ, полученных из витамина Е, таких как TPGS-750-M, значительно повышает эффективность ферментативной реакции по сравнению с общепринятыми ПАВ или сорастворителями. Выход реакции увеличивается также при более низких температурах, и реакция по-прежнему протекает даже при неблагоприятных условиях, таких как низкие значения рН.The present invention is based on the discovery that the efficiency of chemical synthesis reactions using enzymes as catalysts can be increased by introducing certain surfactants into the reaction mixture. Surfactants can be used in enzymatic synthesis reactions to increase the solubility of reactants and reaction products. However, these surfactants adversely affect the activity and stability of enzymes. The present inventors have found that the use of surfactants derived from vitamin E, such as TPGS-750-M, significantly improves the efficiency of the enzymatic reaction compared to conventional surfactants or co-solvents. The yield of the reaction also increases at lower temperatures and the reaction still proceeds even under unfavorable conditions such as low pH values.

В первом аспекте настоящего изобретения предложена водная реакционная смесь, содержащая фермент, субстрат фермента и ПАВ, где ПАВ выбирают из группы, состоящей изIn a first aspect of the present invention, there is provided an aqueous reaction mixture comprising an enzyme, an enzyme substrate, and a surfactant, wherein the surfactant is selected from the group consisting of

(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:(i) Surfactants having the following formula I:

(I)

(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:(ii) Surfactants having the following formula II:

(II)

(II)

иand

(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:(iii) Surfactants having the following formula III:

(III)

гдеwhere

R1 содержит группу поли(C_1-4-алкиленгликоля);R1 contains a poly(C _1-4 -alkylene glycol group);

R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C_1-4-алкил; иR2, R3, R4 and R5 are independently C _1-4 alkyl; and

R6 представляет собой C_5-80-алкил или C_5-80-алкенил.R6 is C _5-80 alkyl or C _5-80 alkenyl.

Во втором аспекте в настоящем изобретении предложен способ проведения ферментативной реакции, включающий следующие стадииIn a second aspect, the present invention provides a method for carrying out an enzymatic reaction, comprising the following steps

(a) предоставление реакционной смеси согласно первому аспекту изобретения, и(a) providing a reaction mixture according to the first aspect of the invention, and

(b) обеспечение самостоятельного протекания реакции.(b) allowing the reaction to proceed independently.

В третьем аспекте в настоящем изобретении предложено применение ПАВ для повышения выхода и/или стабильности ферментативной реакции, включающее введение ПАВ в водную смесь, содержащую фермент и субстрат фермента, где ПАВ выбирают из группы, состоящей изIn a third aspect, the present invention provides the use of a surfactant to increase the yield and/or stability of an enzymatic reaction, comprising introducing a surfactant into an aqueous mixture containing an enzyme and an enzyme substrate, where the surfactant is selected from the group consisting of

(I)

(II)

(II)

иand

(III)

гдеwhere

Вышеуказанные аспекты можно объединять. Другие объекты, признаки, преимущества и аспекты настоящего изобретения будут понятны специалисту в данной области из следующего описания и приложенной формулы изобретения. Однако следует понимать, что нижеследующее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, которые указывают на предпочтительные варианты осуществления заявки, приведены только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в пределах сущности и объема раскрытого изобретения легко станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения нижеследующего.The above aspects can be combined. Other objects, features, advantages and aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following description and the appended claims. However, it should be understood that the following description, the appended claims, and specific examples, which are indicative of preferred embodiments of the application, are provided by way of illustration only. Various changes and modifications within the spirit and scope of the disclosed invention will readily become apparent to those skilled in the art upon reading the following.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В настоящем изобретении, в его первом аспекте предложена водная реакционная смесь, содержащая фермент, субстрат фермента и ПАВ, где ПАВ выбирают из группы, состоящей изThe present invention, in its first aspect, provides an aqueous reaction mixture comprising an enzyme, an enzyme substrate and a surfactant, wherein the surfactant is selected from the group consisting of

(I)

(II)

(II)

иand

(III)

гдеwhere

Заявляемая технология подходит для всех химических реакций, в которых используется фермент, чтобы катализировать реакцию. Она, в частности, может применяться для синтеза органических соединений с использованием ферментативных реакций. Устойчивые ферменты для применения в настоящей реакционной смеси включают, например, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы (синтазы), изомеразы и лигазы (синтетазы). Оксидоредуктазы могут катализировать реакцию связей C=O и C=C, восстановительное аминирование C=O групп, и окисление связей C-H, C=C, C-N и C-O. Трансферазы способны переносить функциональные группы, такие как аминогруппа, ацил, фосфорил, метил, гликозил, нитрогруппа и серосодержащие группы из одного соединения в другое. Гидролазы могут катализировать гидролиз сложных эфиров, амидов, лактонов, лактамов, эпоксидов, нитрилов и других групп, а также соответствующие обратные реакции с формированием таких функциональных групп. Лиазы, также называемые синтазами, могут катализировать присоединение малых молекул по двойным связям, таким как C=C, C=N и C=O. Изомеразы могут катализировать преобразование изомеров (изомеризацию), включая рацемизации, эпимеризации и реакции перегруппировки. Лигазы, также называемые синтетазами, могут образовывать комплексные соединения (по аналогии с лиазами) с использованием АТФ в качестве источника энергии. В конкретных вариантах осуществления фермент выбирают из группы, состоящей из кеторедуктаз, ен-редуктаз, трансаминаз, дегидрогеназ, таких как алкогольдегидрогеназы и аминокислотные дегидрогеназы, липаз, эстераз и фенилананин-аммоний-лиаз. Конкретные примеры ферментов включают кеторедуктазу, ен-редуктазу и аланинтрансаминазу.The claimed technology is suitable for all chemical reactions that use an enzyme to catalyze the reaction. In particular, it can be used for the synthesis of organic compounds using enzymatic reactions. Resistant enzymes for use in the present reaction mixture include, for example, oxidoreductases, transferases, hydrolases, lyases (synthases), isomerases, and ligases (synthetases). Oxidoreductases can catalyze the reaction of C=O and C=C bonds, reductive amination of C=O groups, and oxidation of C-H, C=C, C-N and C-O bonds. Transferases are capable of transferring functional groups such as amino, acyl, phosphoryl, methyl, glycosyl, nitro, and sulfur-containing groups from one compound to another. Hydrolases can catalyze the hydrolysis of esters, amides, lactones, lactams, epoxides, nitriles, and other groups, as well as the corresponding back reactions to form such functional groups. Lyases, also called synthases, can catalyze the addition of small molecules at double bonds such as C=C, C=N and C=O. Isomerases can catalyze the conversion of isomers (isomerization), including racemizations, epimerizations, and rearrangement reactions. Ligases, also called synthetases, can form complex compounds (similar to lyases) using ATP as an energy source. In specific embodiments, the enzyme is selected from the group consisting of ketoreductases, en-reductases, transaminases, dehydrogenases such as alcohol dehydrogenases and amino acid dehydrogenases, lipases, esterases, and phenylanine ammonium lyases. Specific examples of enzymes include ketoreductase, en-reductase, and alanine transaminase.

Фермент присутствует в реакционной смеси в концентрации, подходящей для выполнения реакции, например, его содержание составляет от примерно 0,01% до примерно 100% относительно содержания субстрата. В частности, содержание фермента может составлять от примерно 0,1% до примерно 75%, от примерно 0,5% до примерно 50%, от примерно 1% до примерно 40%, от примерно 2% до примерно 30%, от примерно 4% до примерно 25% или от примерно 5% до примерно 20% относительно содержания субстрата. "Содержание" в этом отношении означает либо массовое содержание соединений, либо мольное содержание соединений.The enzyme is present in the reaction mixture at a concentration suitable for carrying out the reaction, for example, its content is from about 0.01% to about 100% relative to the content of the substrate. In particular, the enzyme content may be from about 0.1% to about 75%, from about 0.5% to about 50%, from about 1% to about 40%, from about 2% to about 30%, from about 4 % to about 25% or from about 5% to about 20% relative to the content of the substrate. "Content" in this respect means either the mass content of the compounds or the mole content of the compounds.

В определенных вариантах осуществления водная реакционная смесь дополнительно содержит кофактор и/или кофермент. Наличие кофактора/кофермента зависит от ферментативной реакции, которую требуется провести. Примеры кофакторов включают никотинамидадениндинуклеотид (NAD), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP), флавинадениндинуклеотид (FAD) и пиродоксалмонофосфат. Эти кофакторы можно использовать для предоставления протонов, электронов и/или аминогрупп в ферментативной реакции. NAD, NADP и FAD могут присутствовать в водной реакционной смеси в ионной (например, NAD⁺, NADP⁺) или протонированной (например, NADH, NADPH) форме.In certain embodiments, the aqueous reaction mixture further comprises a cofactor and/or a coenzyme. The presence of the cofactor/coenzyme depends on the enzymatic reaction to be carried out. Examples of cofactors include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), flavin adenine dinucleotide (FAD), and pyrodoxal monophosphate. These cofactors can be used to provide protons, electrons and/or amino groups in an enzymatic reaction. NAD, NADP and FAD may be present in the aqueous reaction mixture in ionic (eg NAD ⁺ , NADP ⁺ ) or protonated (eg NADH, NADPH) form.

Кофактор может присутствовать в водной реакционной смеси в стехиометрических количествах. В частности, мольное содержание кофактора может быть по крайней мере не меньше мольного содержания субстрата. В других вариантах осуществления содержание кофактора может быть ниже содержания субстрата, в частности, оно может составлять от примерно 0,01% до примерно 20%, от примерно 0,05% до примерно 15%, от примерно 0,1% до примерно 10%, от примерно 0,25% до примерно 7,5% или от примерно 0,5% до примерно 5% относительно содержания субстрата. "Содержание" в этом отношении означает либо массовое содержание соединений, либо мольное содержание соединений. В этих вариантах осуществления предпочтительно, чтобы кофактор возобновлялся в ходе реакции, если это необходимо. Например, реакционная смесь может содержать дополнительный фермент, необязательно с соответствующим ему субстратом, который возобновляет кофактор. Например, если NAD, NADP или FAD используют в качестве кофактора, водная реакционная смесь может дополнительно содержать дегидрогеназу, такую как алкогольдегидрогеназу или глюкозодегидрогеназу, и соответствующий субстрат, такой как спирт или глюкоза.The cofactor may be present in the aqueous reaction mixture in stoichiometric amounts. In particular, the molar content of the cofactor may be at least not less than the mole content of the substrate. In other embodiments, the content of the cofactor may be lower than the content of the substrate, in particular, it may be from about 0.01% to about 20%, from about 0.05% to about 15%, from about 0.1% to about 10% , from about 0.25% to about 7.5%, or from about 0.5% to about 5%, based on the content of the substrate. "Content" in this respect means either the mass content of the compounds or the mole content of the compounds. In these embodiments, it is preferred that the cofactor be renewed during the course of the reaction, if necessary. For example, the reaction mixture may contain an additional enzyme, optionally with its corresponding substrate, which renews the cofactor. For example, if NAD, NADP, or FAD is used as the cofactor, the aqueous reaction mixture may further comprise a dehydrogenase such as alcohol dehydrogenase or glucose dehydrogenase and an appropriate substrate such as alcohol or glucose.

В других вариантах осуществления кофактор может возобновляться ферментом, который также катализирует интересующую реакцию. В этих вариантах осуществления второй субстрат этого фермента может присутствовать в водной реакционной среде, в частности, в значительно большем количестве, чем субстрат, представляющий интерес, например, не менее чем в 2 раза большем, предпочтительно - не менее чем в 4 раза, не менее чем в 10 раз или не менее чем в 50 раз большем избытке по сравнению с субстратом, представляющим интерес. Например, для реакции трансаминазы водная реакционная смесь может содержать аминное соединение, такое как изопропиламин, для возобновления кофактора, такого как пиридоксальмонофосфат.In other embodiments, the cofactor may be renewable by an enzyme that also catalyzes the reaction of interest. In these embodiments, the second substrate of this enzyme may be present in the aqueous reaction medium, in particular in a significantly larger amount than the substrate of interest, for example, at least 2 times more, preferably at least 4 times, at least than 10 times or not less than 50 times more than the substrate of interest. For example, for a transaminase reaction, the aqueous reaction mixture may contain an amine compound such as isopropylamine to regenerate a cofactor such as pyridoxal monophosphate.

В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой кеторедуктазу, субстрат представляет собой кетон, а кофактором является NADP. В другом варианте осуществления фермент представляет собой ен-редуктазу, субстрат представляет собой соединение, содержащее двойную связь углерод-углерод, а кофактором является NAD. В другом варианте осуществления фермент представляет собой трансаминазу, субстрат представляет собой кетон, а кофактором является пиридоксальмонофосфат.In a specific embodiment, the enzyme is a ketoreductase, the substrate is a ketone, and the cofactor is NADP. In another embodiment, the enzyme is an en-reductase, the substrate is a compound containing a carbon-carbon double bond, and the cofactor is NAD. In another embodiment, the enzyme is a transaminase, the substrate is a ketone, and the cofactor is pyridoxal monophosphate.

ПАВ в водной реакционной смеси выбирают из группы, состоящей изThe surfactant in the aqueous reaction mixture is selected from the group consisting of

(I)

(II)

(II)

иand

(III)

гдеwhere

ПАВ в водной реакционной смеси может быть любым поверхностно-активным веществом согласно формуле (I), формуле (II) или формуле (III). В некоторых вариантах осуществления ПАВ характеризуется молекулярной массой, равной 10000 г/моль или меньше, в частности, 7500 г/моль или меньше, 5000 г/моль или меньше, 3000 г/моль или меньше, 2500 г/моль или меньше или даже 2000 г/моль или меньше.The surfactant in the aqueous reaction mixture may be any surfactant according to formula (I), formula (II) or formula (III). In some embodiments, the surfactant has a molecular weight of 10000 g/mol or less, such as 7500 g/mol or less, 5000 g/mol or less, 3000 g/mol or less, 2500 g/mol or less, or even 2000 g/mol or less.

В частности, ПАВ не должен взаимодействовать в химической реакции. В некоторых вариантах осуществления ПАВ является неионогенным ПАВ. ПАВ обычно является амфифильным соединением и включает гидрофильную часть и гидрофобную часть. Гидрофильная часть в основном образована остатком R1, а гидрофобная часть в основном образована остатком R6. В определенных вариантах осуществления ПАВ способен формировать мицеллы в смеси ПАВ-вода.In particular, the surfactant should not interact in a chemical reaction. In some embodiments, the surfactant is a nonionic surfactant. The surfactant is usually an amphiphilic compound and includes a hydrophilic part and a hydrophobic part. The hydrophilic part is mainly formed by the R1 residue, and the hydrophobic part is mainly formed by the R6 residue. In certain embodiments, the implementation of the surfactant is able to form micelles in a mixture of surfactant-water.

ПАВ содержит группу поли(C_1-4-алкиленгликоля) в остатке R1. Эти группа поли(C_1-4-алкиленгликоля) в особенности представляет собой группу поли(пропиленгликоля), в частности, группу поли(этиленгликоля). Группа поли(C_1-4-алкиленгликоля) также может состоять из смеси разных групп поли(C_1-4-алкиленгликоля), такой как смесь поли(этиленгликоля) и поли(пропиленгликоля). R1, в частности, содержит группу поли(C_2-3-алкиленгликоля). Группа поли(C_1-4-алкиленгликоля), особенно группа поли(этиленгликоля), может характеризоваться средней молекулярной массой в пределах от примерно 100 до 10000 г/моль, особенно в пределах от примерно 200 до примерно 5000 г/моль, в частности, в пределах от примерно 250 до 2500 г/моль, от примерно 400 до примерно 2000 г/моль или от примерно 500 до 1500 г/моль, например, примерно 550, примерно 750 или примерно 1000 г/моль.The surfactant contains a poly(C _1-4 -alkylene glycol) group at R1. This poly(C _1-4 alkylene glycol) group is in particular a poly(propylene glycol) group, in particular a poly(ethylene glycol) group. The poly(C _1-4 alkylene glycol) group may also consist of a mixture of different poly(C _1-4 alkylene glycol) groups, such as a mixture of poly(ethylene glycol) and poly(propylene glycol). R1 in particular contains a poly(C _2-3 -alkylene glycol) group. A poly(C _1-4 -alkylene glycol group), especially a poly(ethylene glycol) group, may have an average molecular weight ranging from about 100 to 10000 g/mol, especially in the range from about 200 to about 5000 g/mol, in particular, in the range from about 250 to 2500 g/mol, from about 400 to about 2000 g/mol, or from about 500 to 1500 g/mol, for example, about 550, about 750 or about 1000 g/mol.

Группа поли(C_1-4-алкиленгликоля) остатка R1 может быть присоединена к атому кислорода в основной цепи ковалентной связью или связывающей группой. Связывающая группа может быть любым химическим линкером, пригодным для присоединения группы поли(C_1-4-алкиленгликоля) к атому кислорода. В частности, связывающая группа может представлять собой дикарбоновую кислоту, которая образует сложноэфирные связи с основной цепью и группой поли(C_1-4-алкиленгликоля). Иллюстративные связывающие группы включают дикарбоновую кислоту, имеющую от 2 до 20 атомов углерода, такую как янтарная кислота, себациновая кислота, малоновая кислота, глутаровая кислота, адипиновая кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота.The poly(C _1-4 -alkylene glycol) group of the R1 residue may be attached to the oxygen atom in the main chain by a covalent bond or a linking group. The linking group can be any chemical linker suitable for attaching a poly(C _1-4 -alkylene glycol) group to an oxygen atom. In particular, the linking group may be a dicarboxylic acid that forms ester bonds with the backbone and the poly(C _1-4 -alkylene glycol) group. Exemplary linking groups include a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms, such as succinic acid, sebacic acid, malonic acid, glutaric acid, adipic acid, maleic acid, and fumaric acid.

В некоторых вариантах осуществления R1 дополнительно содержит концевую группу, присоединенную к концу группы поли(C_1-4-алкиленгликоля). Эта концевая группа, в частности, присоединена к группе поли(C_1-4-алкиленгликоля) посредством простой эфирной, сложноэфирной или амидной связью. Концевая группа особенно представляет собой группу C_1-16 алкила или алкенила, в частности, группу C_1-8 алкила, такую как группа C_1-4 алкила. В некоторых вариантах осуществления концевая группа представляет собой группу метила, присоединенную к группе поли(C_1-4-алкиленгликоля) посредством простой эфирной связи.In some embodiments, R1 further comprises an end group attached to the end of a poly(C _1-4 -alkylene glycol) group. This end group is in particular attached to the poly(C _1-4 -alkylene glycol) group via an ether, ester or amide bond. The end group is especially a C _1-16 alkyl or alkenyl group, in particular a C _1-8 alkyl group such as a C _1-4 alkyl group. In some embodiments, the end group is a methyl group attached to the poly(C _1-4 -alkylene glycol) group via an ether bond.

В определенных вариантах осуществления R1 состоит из группы поли(C_1-4-алкиленгликоля), связывающей группы и концевой группы, как описано в данном документе.In certain embodiments, R1 consists of a poly(C _1-4 -alkylene glycol) group, a linking group, and an end group as described herein.

R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой водород или C_1-4-алкил, в частности, водород, метил или этил, особенно водород или метил. В определенных вариантах осуществления R5 представляет собой метил. В определенных вариантах осуществления R4 представляет собой метил. В определенных вариантах осуществления R4 и R5 представляют собой метил. В дополнительных вариантах осуществления R2 и R3 независимо представляют собой водород или метил. В конкретных вариантах осуществления R4 и R5 представляют собой метил, а R2 и R3 независимо представляют собой водород или метил. В некоторых вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (I), все R2, R3, R4 и R5 представляют собой метил. В некоторых вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (II), R4 и R5 представляют собой метил. В некоторых вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (III), R2 представляет собой водород, R3, R4 и R5 представляют собой метил.R2, R3, R4 and R5 are independently hydrogen or C _1-4 alkyl, in particular hydrogen, methyl or ethyl, especially hydrogen or methyl. In certain embodiments, R5 is methyl. In certain embodiments, R4 is methyl. In certain embodiments, R4 and R5 are methyl. In additional embodiments, R2 and R3 are independently hydrogen or methyl. In specific embodiments, R4 and R5 are methyl and R2 and R3 are independently hydrogen or methyl. In some embodiments, where the surfactant is represented by formula (I), all R2, R3, R4 and R5 are methyl. In some embodiments, where the surfactant is represented by formula (II), R4 and R5 are methyl. In some embodiments, where the surfactant is represented by formula (III), R2 is hydrogen, R3, R4 and R5 are methyl.

R6 представляет собой C_5-80-алкил или C_5-80-алкенил. R6 может быть линейным или разветвленным и может содержать циклические группы, включая ароматические группы. В некоторых вариантах осуществления R6 не содержит циклические группы или ароматические группы. В частности, R6 является разветвленным.R6 is C _5-80 alkyl or C _5-80 alkenyl. R6 may be linear or branched and may contain cyclic groups including aromatic groups. In some embodiments, R6 does not contain cyclic groups or aromatic groups. In particular, R6 is branched.

В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (I), R6 может быть C_5-30-алкилом или C_5-30-алкенилом, особенно C_8-25-алкилом или C_8-25-алкенилом, в частности, C_10-20-алкилом или C_10-20-алкенилом, предпочтительно - C_14-18-алкилом или C_14-18-алкенилом. Алкенильная группа может содержать одну или несколько двойных связей углерод-углерод, в частности, одну, две, три, четыре или пять двойных связей, например, две или три, особенно три. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой C₁₆-алкенил, в частности, 4,8,12-триметилтридецил или 4,8,12-триметил-3,7,11-тридекатриенил. В некоторых вариантах осуществления атом углерода, несущий на себе R5 и R6, имеет R конформацию.In embodiments where the surfactant is represented by formula (I), R6 may be C _5-30 alkyl or C _5-30 alkenyl, especially C _8-25 alkyl or C _8-25 alkenyl, in particular C _{10- 20} alkyl or C _10-20 alkenyl, preferably C _14-18 alkyl or C _14-18 alkenyl. The alkenyl group may contain one or more carbon-carbon double bonds, in particular one, two, three, four or five double bonds, for example two or three, especially three. In specific embodiments, R6 is C ₁₆ -alkenyl, in particular 4,8,12-trimethyltridecyl or 4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrienyl. In some embodiments, the carbon atom bearing R5 and R6 is in the R conformation.

В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (II), R6 может быть C_5-20-алкилом или C_5-20-алкенилом, особенно C_6-18-алкилом или C_6-18-алкенилом, в частности, C_7-15-алкилом или C_7-15-алкенилом, предпочтительно - C_8-12-алкилом или C_8-12-алкенилом. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой C₁₀-алкил, в частности, 5-этил-6-метилгептан-2-ил.In embodiments where the surfactant is represented by formula (II), R6 may be C _5-20 alkyl or C _5-20 alkenyl, especially C _6-18 alkyl or C _6-18 alkenyl, in particular C _{7- 15} alkyl or C _7-15 alkenyl, preferably C _8-12 alkyl or C _8-12 alkenyl. In specific embodiments, R6 is C ₁₀ -alkyl, in particular 5-ethyl-6-methylheptan-2-yl.

В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (III), R6 может быть C_30-80-алкилом или C_30-80-алкенилом, особенно C_35-70-алкилом или C_35-70-алкенилом, в частности, C_40-60-алкилом или C_40-60-алкенилом, предпочтительно - C_45-55-алкилом или C_45-55-алкенилом. Алкенильная группа может содержать одну или несколько двойных связей углерод-углерод, в частности, пять, восемь или десять двойных связей, особенно десять. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой C₅₀-алкенил, в частности, 3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-декаметилтетраконта-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-декаенил.In embodiments where the surfactant is represented by formula (III), R6 may be C _30-80 alkyl or C _30-80 alkenyl, especially C _35-70 alkyl or C _35-70 alkenyl, in particular C _{40- 60} alkyl or C _40-60 alkenyl, preferably C _45-55 alkyl or C _45-55 alkenyl. The alkenyl group may contain one or more carbon-carbon double bonds, in particular five, eight or ten double bonds, especially ten. In specific embodiments, R6 is C ₅₀ -alkenyl, in particular 3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-decamethyltetraconta-2,6,10,14,18,22,26 ,30,34,38-decaenyl.

В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (I), ПАВ специально получают из витамина Е, в частности, из токоферола, особенно из α-токоферола. Некоторые примеры ПАВ включают токоферола полиэтиленгликоля сукцинаты (TPGS), в частности, DL-α-токоферола полиэтиленгликоля сукцинаты, такие как TPGS-750-M, TPGS-1000, TPGS-1500, TPGS-400, TPGS-1100-M, TPGS-2000, TPGS-860-олеат, TPGS-PEG-PPG-PEG-1100 и TPGS-PPG-PEG-70-бутил, и DL-α-токоферола полиэтиленгликоля сукцинаты, такие как TPPG-1000 и TPPG-1000-бутил; и диэфир полиэтиленгликоля α-токоферола и себациновой кислоты (PTS), такой как PTS-600. В определенных вариантах осуществления ПАВ выбран из группы, состоящей из TPGS-750-M, TPGS-1000 и PTS, в частности, TPGS-750-M.In embodiments where the surfactant is represented by formula (I), the surfactant is specifically derived from vitamin E, in particular from tocopherol, especially from α-tocopherol. Some examples of surfactants include tocopherol polyethylene glycol succinates (TPGS), in particular DL-α-tocopherol polyethylene glycol succinates such as TPGS-750-M, TPGS-1000, TPGS-1500, TPGS-400, TPGS-1100-M, TPGS- 2000, TPGS-860-oleate, TPGS-PEG-PPG-PEG-1100 and TPGS-PPG-PEG-70-butyl, and DL-α-tocopherol polyethylene glycol succinates such as TPPG-1000 and TPPG-1000-butyl; and a polyethylene glycol diester of α-tocopherol and sebacic acid (PTS), such as PTS-600. In certain embodiments, the surfactant is selected from the group consisting of TPGS-750-M, TPGS-1000 and PTS, in particular TPGS-750-M.

В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (II), ПАВ специально получают из убихинола. Некоторые примеры ПАВ включают полиэтиленгликоля убихинола сукцинат (PQS), в частности, PQS, содержащий mPEG, такой как mPEG2000.In embodiments where the surfactant is represented by formula (II), the surfactant is specifically derived from ubiquinol. Some examples of surfactants include polyethylene glycol ubiquinol succinate (PQS), in particular PQS containing mPEG such as mPEG2000.

В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (III), ПАВ специально получают из ситостерин, в частности, β-ситостерин. Некоторые примеры ПАВ включают β-ситостерина метоксиэтиленгликоля сукцинат (Nok), в частности, Nok, содержащий mPEG, такой как mPEG550.In embodiments where the surfactant is represented by formula (III), the surfactant is specifically derived from sitosterol, in particular β-sitosterol. Some examples of surfactants include β-sitosterol methoxyethylene glycol succinate (Nok), in particular Nok containing an mPEG such as mPEG550.

Концентрация ПАВ в водной реакционной смеси, в частности, составляет не менее 0,01% (вес/вес), в частности, не менее 0,02% (вес/вес), особенно, не менее 0,5% (вес/вес) или не менее 1% (вес/вес). В определенных вариантах осуществления концентрация ПАВ в водной реакционной смеси находится в пределах от 0,01 до 20% (вес/вес), в частности, в пределах от 0,02 до 15% (вес/вес), в пределах от 0,1 до 10% (вес/вес), от 0,2 до 7.5% (вес/вес) или от 0,5 до 5% (вес/вес), особенно в пределах от 0,75 до 3% (вес/вес), например, примерно 1% (вес/вес), примерно 1,5% (вес/вес) или примерно 2% (вес/вес). В определенных вариантах к осуществления концентрация ПАВ в водной реакционной смеси выше его критической концентрации мицеллообразования.The surfactant concentration in the aqueous reaction mixture is in particular at least 0.01% (w/w), in particular at least 0.02% (w/w), in particular at least 0.5% (w/w ) or at least 1% (w/w). In certain embodiments, the concentration of surfactant in the aqueous reaction mixture is in the range from 0.01 to 20% (w/w), in particular, in the range from 0.02 to 15% (w/w), in the range from 0.1 up to 10% (w/w), 0.2 to 7.5% (w/w) or 0.5 to 5% (w/w), especially in the range of 0.75 to 3% (w/w) , for example, about 1% (w/w), about 1.5% (w/w), or about 2% (w/w). In certain embodiments, the concentration of the surfactant in the aqueous reaction mixture is above its critical micelle concentration.

В некоторых вариантах осуществления водная реакционная смесь дополнительно содержит буфер. Буфер, в частности, должен быть пригоден для поддержания рН реакционной смеси при нейтральном рН или при примерно нейтральном рН. В частности, буфер выбирают из группы, состоящей из TRIS, фосфата, цитрата, ацетата и аммиака. Водная реакционная смесь предпочтительно имеет рН, при котором фермент активен и стабилен, и/или который пригоден для ферментативной реакции. В некоторых вариантах осуществления значение pH находится в пределах от 4,0 до 10,0, в частности, от 6,0 до 8,0, особенно от 6,5 до 7,5, например, равно примерно 7,0.In some embodiments, the aqueous reaction mixture further comprises a buffer. The buffer, in particular, must be suitable for maintaining the pH of the reaction mixture at a neutral pH or approximately neutral pH. In particular, the buffer is selected from the group consisting of TRIS, phosphate, citrate, acetate and ammonia. The aqueous reaction mixture preferably has a pH at which the enzyme is active and stable and/or which is suitable for the enzymatic reaction. In some embodiments, the pH is in the range of 4.0 to 10.0, in particular 6.0 to 8.0, especially 6.5 to 7.5, such as about 7.0.

Субстратом в реакционной смеси может быть любой субстрат, подходящий для проведения ферментативной реакции. Субстрат, в частности, зависит от типа ферментативной реакции, которую требуется провести в реакционной смеси. Реакционная смесь может также содержать более одного субстрата, как например, два субстрата или три субстрата. В определенных вариантах осуществления субстрат и/или продукт ферментативной реакции не смешиваются с водой или только частично водорастворимы. Частично водорастворимое соединение, в частности, только смешивается с водой при концентрации 20 г/л или меньше, особенно 10 г/л или меньше или 5 г/л или меньше при комнатной температуре. Субстрат можно использовать в любой концентрации, которая годится для проведения химической реакции. В частности, субстрат используют при высоких концентрациях. Например, концентрация субстрата в реакционной смеси составляет не менее 0,1 M, в частности, не менее 0,5 M, не менее 1,0 M, не менее 1,1 M, не менее 1,2 M, не менее 1,3 M, не менее 1,5 M, не менее 1,7 M или не менее 2,0 M. Специалист в данной области способен выбрать подходящие субстраты и их концентрации.The substrate in the reaction mixture can be any substrate suitable for carrying out the enzymatic reaction. The substrate, in particular, depends on the type of enzymatic reaction that you want to carry out in the reaction mixture. The reaction mixture may also contain more than one substrate, such as two substrates or three substrates. In certain embodiments, the substrate and/or product of the enzymatic reaction is water immiscible or only partially water soluble. Partially water-soluble compound, in particular, only miscible with water at a concentration of 20 g/l or less, especially 10 g/l or less or 5 g/l or less at room temperature. The substrate can be used at any concentration that is suitable for carrying out the chemical reaction. In particular, the substrate is used at high concentrations. For example, the substrate concentration in the reaction mixture is at least 0.1 M, in particular at least 0.5 M, at least 1.0 M, at least 1.1 M, at least 1.2 M, at least 1, 3 M, not less than 1.5 M, not less than 1.7 M or not less than 2.0 M. The person skilled in the art is able to choose suitable substrates and their concentrations.

В некоторых вариантах осуществления водная реакционная смесь дополнительно содержит сорастворитель. Сорастворитель может быть, в частности, органическим растворителем или дополнительным ПАВ или их смесью.In some embodiments, the aqueous reaction mixture further comprises a co-solvent. The co-solvent may in particular be an organic solvent or an additional surfactant or a mixture thereof.

Органический растворитель может быть любым органическим растворителем. Предпочтительно, чтобы он не нарушал или ингибировал ферментативную реакцию. В некоторых вариантах осуществления органический растворитель смешивается с водой или частично смешивается с водой. Органический растворитель особенно представляет собой апротонный органический растворитель. Подходящие примеры органических растворителей включают ацетон, тетрагидрофуран (THF, ТГФ) и их производные, такие как метилтетрагидрофуран, пиридин, полиэтиленгликоль (PEG, ПЭГ), полипропиленгликоль (PPG, ППГ), в частности, ПЭГ со средней молекулярной массой от примерно 100 г/моль до примерно 2000 г/моль, такие как ПЭГ200, ПЭГ600, ПЭГ1000 и ПЭГ2000, их производные, такие как моно- или диалкил ПЭГ, в частности, моно- или диметил ПЭГ, моно- или диэтил ПЭГ и моно- или дипропил ПЭГ. Дополнительные примеры включают ацетонитрил, диметилформамид (ДМФА), дихлорметан (ДХМ), толуол и спирты, такие как C_1-10 алифатический спирт, в частности, 2-бутиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления содержание органического растворителя в реакционной смеси находится в пределах от 0,1% до 50% (об./об.), в частности, от 1% до 40% (об./об.), от 2% до 30% (об./об.), от 4% до 25% (об./об.) или от 5% до 20% (об./об.).The organic solvent may be any organic solvent. Preferably, it does not disturb or inhibit the enzymatic reaction. In some embodiments, the organic solvent is water-miscible or partially water-miscible. The organic solvent is especially an aprotic organic solvent. Suitable examples of organic solvents include acetone, tetrahydrofuran (THF, THF) and their derivatives such as methyltetrahydrofuran, pyridine, polyethylene glycol (PEG, PEG), polypropylene glycol (PPG, PPG), in particular PEG with an average molecular weight of from about 100 g/ mol to about 2000 g/mol, such as PEG200, PEG600, PEG1000 and PEG2000, their derivatives such as mono- or dialkyl PEG, in particular mono- or dimethyl PEG, mono- or diethyl PEG and mono- or dipropyl PEG. Additional examples include acetonitrile, dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM), toluene, and alcohols such as C _1-10 aliphatic alcohol, in particular 2-butyl alcohol. In some embodiments, the content of the organic solvent in the reaction mixture is in the range from 0.1% to 50% (v/v), in particular, from 1% to 40% (v/v), from 2% to 30% (V/V), 4% to 25% (V/V) or 5% to 20% (V/V).

Дополнительное ПАВ может быть любым поверхностно-активным веществом. Предпочтительно, чтобы оно не нарушало или ингибировало ферментативную реакцию. В некоторых вариантах осуществления гидрофильная часть ПАВ содержит полиалкиленгликолевый фрагмент, особенно полиэтиленгликолевый фрагмент или полипропиленгликолевый фрагмент. Полиалкиленовый фрагмент, особенно полиэтиленгликолевый фрагмент, может характеризоваться средней молекулярной массой в пределах от примерно 100 до 10000 г/моль, особенно в пределах от примерно 300 до примерно 3000 г/моль, в частности, в пределах от примерно 400 до 2000 г/моль. Определенные примеры дополнительных ПАВ, содержащих полиалкиленгликолевый фрагмент, включают Triton X-100; простые алкиловые эфиры полиэтиленгликоля, такие как Brij ПАВ, в частности, Brij 30, Brij 35, Brij 52, Brij 56, Brij 58, Brij 72, Brij 76, Brij 78, Brij 92, Brij 96, Brij 98, Cremophor A6, Cremophor A25 и Thesit; сложные эфиры полиэтиленгликоля, такие как полиэтиленгликоля (15)-гидроксистеарат (Solutol HS 15); эфиры полиэтиленгликоля и сорбита с жирной кислотой, также известные как полисорбаты или Tween, такие как полисорбат 20, полисорбат 21, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 61, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 81, полисорбат 85 и полисорбат 120; холестерила ПЭГ сукцинаты, такие как холестерила ПЭГ1000 сукцинат; эфир ПЭГ и (дезокси) холевой кислоты, такой как холевый эфир PEG1000 и дезоксихолевый эфир PEG1000; хроманолполиэтиленгликольсукцинаты, такие как Chrom-400 и Chrom-1000; и другие производные ПЭГ, такие как C4-азо-ПЭГ; цетилтриметиламмония бромид (CTAB, ЦТАБ); межфазные ПАВ, такие как дезоксихолат натрия; и октановую кислоту и другие кислоты с длинной алкильной цепью, в частности, кислоты с цепью C_6-20 алкила. Концентрация дополнительного ПАВ в водной реакционной смеси, в частности, находится в пределах от 0,1 до 10% (вес/вес). В некоторых вариантах осуществления концентрация дополнительного ПАВ в водной реакционной смеси находится в пределах от 0,5 до 5% (вес/вес), особенно в пределах от 0,8 до 4% (вес/вес), от 1 до 3% (вес/вес) или от 1,5 до 2,5% (вес/вес), например, примерно 2% (вес/вес).The additional surfactant may be any surfactant. Preferably, it does not disturb or inhibit the enzymatic reaction. In some embodiments, the hydrophilic moiety of the surfactant contains a polyalkylene glycol moiety, especially a polyethylene glycol moiety or a polypropylene glycol moiety. The polyalkylene moiety, especially the polyethylene glycol moiety, may have an average molecular weight in the range from about 100 to 10,000 g/mol, especially in the range from about 300 to about 3000 g/mol, in particular, in the range from about 400 to 2000 g/mol. Certain examples of additional surfactants containing a polyalkylene glycol moiety include Triton X-100; polyethylene glycol alkyl ethers such as Brij surfactants, in particular Brij 30, Brij 35, Brij 52, Brij 56, Brij 58, Brij 72, Brij 76, Brij 78, Brij 92, Brij 96, Brij 98, Cremophor A6, Cremophor A25 and Thesit; esters of polyethylene glycol such as polyethylene glycol (15)-hydroxystearate (Solutol HS 15); fatty acid esters of polyethylene glycol and sorbitol, also known as polysorbates or Tween, such as polysorbate 20, polysorbate 21, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 61, polysorbate 65, polysorbate 80, polysorbate 81, polysorbate 85 and polysorbate 120; cholesteryl PEG succinates such as cholesteryl PEG1000 succinate; an ester of PEG and (deoxy)cholic acid such as PEG1000 cholic ester and PEG1000 deoxycholic ester; chromanol polyethylene glycol succinates such as Chrom-400 and Chrom-1000; and other PEG derivatives such as C4-azo-PEG; cetyltrimethylammonium bromide (CTAB, CTAB); interfacial surfactants such as sodium deoxycholate; and octanoic acid and other long alkyl chain acids, in particular C _6-20 alkyl chain acids. The concentration of additional surfactant in the aqueous reaction mixture, in particular, is in the range from 0.1 to 10% (w/w). In some embodiments, the concentration of additional surfactant in the aqueous reaction mixture is in the range of 0.5 to 5% (w/w), especially in the range of 0.8 to 4% (w/w), 1 to 3% (w/w). /wt) or from 1.5 to 2.5% (w/w), for example about 2% (w/w).

Настоящая технология особенно полезна для применений, где желательны высокие концентрации субстрата в реакционной смеси, например, в очень крупномасштабных или в очень мелкомасштабных процессах. В одном варианте осуществления реакционная смесь имеет промышленный масштаб. Она может иметь объем, например, не менее 1 л, в частности, не менее 10 л, не менее 100 л, или не менее 1000 л. В другом варианте осуществления реакционная смесь имеет микромасштаб. Она может иметь объем, например, равный 10 мл или меньше, в частности, 1 мл или меньше, 100 мкл или меньше, 10 мкл или меньше или 1 мкл или меньше.The present technology is particularly useful for applications where high substrate concentrations in the reaction mixture are desired, such as in very large scale or very small scale processes. In one embodiment, the reaction mixture is industrial scale. It may have a volume of, for example, at least 1 liter, in particular at least 10 litres, at least 100 litres, or at least 1000 litres. In another embodiment, the reaction mixture is microscale. It may have a volume of, for example, 10 ml or less, in particular 1 ml or less, 100 μl or less, 10 μl or less, or 1 μl or less.

Реакционная смесь представляет собой смесь загрузки или партии для проведения химической реакции. В некоторых вариантах осуществления реакционная смесь не содержит каких-либо продуктов ферментативной реакции или содержит только остаточные количества каких-либо продуктов ферментативной реакции. В других вариантах осуществления она может содержать значительные количества продукта ферментативной реакции.A reaction mixture is a batch or batch mixture for carrying out a chemical reaction. In some embodiments, the implementation of the reaction mixture does not contain any products of the enzymatic reaction or contains only residual amounts of any products of the enzymatic reaction. In other embodiments, it may contain significant amounts of an enzymatic reaction product.

(a) предоставление водной реакционной смеси, как описано в данном документе, и(a) providing an aqueous reaction mixture as described herein, and

Реакционная смесь в особенности содержит фермент, субстрат фермента и ПАВ, где ПАВ выбирают из группы, состоящей изThe reaction mixture especially contains an enzyme, an enzyme substrate and a surfactant, where the surfactant is selected from the group consisting of

(I)

(II)

(II)

иand

(III)

гдеwhere

В частности, водная реакционная смесь может характеризоваться любыми из признаков, вариантов осуществления и примеров, описанных здесь, включая их комбинации.In particular, the aqueous reaction mixture may be characterized by any of the features, embodiments, and examples described herein, including combinations thereof.

Ферментативная реакция может представлять собой любые химические реакции, в которых используется фермент, чтобы катализировать реакцию. В частности, реакции органического химического синтеза можно проводить, например, с по меньшей мере частично гидрофобными соединениями. Типичные химические реакции включают восстановительные реакции, окислительные реакции, реакции аминирования, реакции нитрирования, реакции гидролиза, реакции этерификации и реакции амидирования, такие как ацилирование. Фермент и субстрат в водной реакционной смеси подходят для конкретной химической реакции. В частности, фермент и субстрат специально выбирают так, чтобы ферментативная реакция протекала требуемым образом. Подходящие ферменты и субстраты описаны в данном документе.An enzymatic reaction can be any chemical reaction that uses an enzyme to catalyze the reaction. In particular, organic chemical synthesis reactions can be carried out, for example, with at least partially hydrophobic compounds. Representative chemical reactions include reduction reactions, oxidation reactions, amination reactions, nitration reactions, hydrolysis reactions, esterification reactions, and amidation reactions such as acylation. The enzyme and substrate in the aqueous reaction mixture are appropriate for the particular chemical reaction. In particular, the enzyme and substrate are specifically chosen so that the enzymatic reaction proceeds in the desired manner. Suitable enzymes and substrates are described in this document.

В некоторых вариантах осуществления ферментативной реакции на стадии (b) позволяют протекать в условиях реакции, подходящих для осуществления ферментативной реакции. В частности, условия реакции включают температуру, равную 80°C или ниже, особенно 60°C или ниже, 45°C или ниже, или 40°C или ниже. В частности, ферментативную реакцию проводят при температуре в интервале от 10°C до 50°C, в частности, от 20°C до 45°C или от 25°C до 40°C. Например, ферментативной реакции позволяют протекать при примерно 37°C, при примерно 30°C или при примерно комнатной температуре. В определенных вариантах осуществления реакционную смесь взбалтывают, в частности, перемешивают в продолжении ферментативной реакции.In some embodiments, the enzymatic reaction in step (b) is allowed to proceed under reaction conditions suitable for the enzymatic reaction. In particular, the reaction conditions include a temperature of 80°C or less, especially 60°C or less, 45°C or less, or 40°C or less. In particular, the enzymatic reaction is carried out at a temperature in the range from 10°C to 50°C, in particular from 20°C to 45°C or from 25°C to 40°C. For example, the enzymatic reaction is allowed to proceed at about 37°C, at about 30°C, or at about room temperature. In certain embodiments, the implementation of the reaction mixture is agitated, in particular, stirred in the continuation of the enzymatic reaction.

Кроме того, условия реакции, в частности, включают значение pH в пределах от 4,0 до 10,0, в частности, от 5,0 до 9,5, от 5,5 до 9,0, от 6,0 до 8,5 или от 6,5 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления pH поддерживают постоянным в продолжение ферментативной реакции, в частности, в пределах +/- 1,0 единицы рН, особенно в пределах +/- 0,5 единицы pH от требуемой величины pH. В других вариантах осуществления, однако, значение рН может варьироваться на величину больше, чем 1,0 единицы рН, в частности, больше чем 1,5 единицы рН, или даже больше чем 2,0 единицы рН. Описанная здесь водная реакционная смесь способна стабилизировать фермент так, что изменение рН не оказывает значительного влияния на ферментативную реакцию.In addition, the reaction conditions particularly include a pH value in the range of 4.0 to 10.0, in particular 5.0 to 9.5, 5.5 to 9.0, 6.0 to 8 .5 or 6.5 to 8.0. In some embodiments, the pH is maintained constant throughout the enzymatic reaction, in particular within +/- 1.0 pH units, especially within +/- 0.5 pH units of the desired pH value. In other embodiments, however, the pH may vary by more than 1.0 pH units, in particular more than 1.5 pH units, or even more than 2.0 pH units. The aqueous reaction mixture described herein is capable of stabilizing the enzyme such that a change in pH does not significantly affect the enzyme reaction.

Способы проведения ферментативной реакции могут включать дополнительную стадию выделения продукта ферментативной реакции. В частности, эту стадию выполняют после завершения ферментативной реакции. Продукт, в частности, отделяют от одного или нескольких, в частности, по сути всех других компонентов водной реакционной смеси. Например, продукт отделяют от оставшегося субстрата, побочных продуктов, фермента, ПАВ, коферментов, кофакторов и/или органических растворителей. Выделения продукта можно достичь с помощью технологий, известных в области техники, включая, например, выпаривание растворителей, агрегации или кристаллизации или фильтрации, разделения фаз, хроматографического разделения и др.Methods for carrying out an enzymatic reaction may include the additional step of isolating the product of the enzymatic reaction. In particular, this step is performed after the completion of the enzymatic reaction. The product is in particular separated from one or more, in particular essentially all other components of the aqueous reaction mixture. For example, the product is separated from the remaining substrate, by-products, enzyme, surfactant, coenzymes, cofactors and/or organic solvents. Product isolation can be achieved using techniques known in the art, including, for example, solvent evaporation, aggregation or crystallization or filtration, phase separation, chromatographic separation, and others.

Настоящее изобретение улучшает растворимость субстратов и продуктов в водной реакционной смеси и повышает стабильность фермента. Таким образом, повышается выход ферментативной реакции, а количество нежелательных побочных продуктов, образующихся в ходе ферментативной реакции, уменьшается. С учетом этого, в дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложено применение ПАВ для повышения выхода ферментативной реакции, включающее введение ПАВ в водную смесь, содержащую фермент и субстрат фермента, где ПАВ выбирают из группы, состоящей изThe present invention improves the solubility of substrates and products in an aqueous reaction mixture and enhances enzyme stability. Thus, the yield of the enzymatic reaction is increased, and the amount of undesirable by-products formed during the enzymatic reaction is reduced. With this in mind, in a further aspect, the present invention provides the use of a surfactant to increase the yield of an enzymatic reaction, comprising adding a surfactant to an aqueous mixture containing an enzyme and an enzyme substrate, wherein the surfactant is selected from the group consisting of

(I)

(II)

(II)

иand

(III)

гдеwhere

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложено применение ПАВ для повышения стабильности ферментативной реакции, включающее введение ПАВ в водную смесь, содержащую фермент и субстрат фермента, где ПАВ выбирают из группы, состоящей изIn a further aspect, the present invention provides the use of a surfactant to improve the stability of an enzymatic reaction, comprising adding a surfactant to an aqueous mixture containing an enzyme and an enzyme substrate, wherein the surfactant is selected from the group consisting of

(I)

(II)

(II)

иand

(III)

гдеwhere

Повышенная стабильность ферментативной реакции, в частности, включает в себя повышенную стабильность фермента в реакционной смеси.The increased stability of the enzymatic reaction, in particular, includes the increased stability of the enzyme in the reaction mixture.

В вариантах осуществления, описанные в данном документе признаки и примеры, включая их комбинации, для способов выполнения ферментативной реакции и водных реакционных растворов одинаково относятся к применению ПАВ для увеличения выхода и/или стабильности ферментативной реакции.In embodiments, the features and examples described herein, including combinations thereof, for enzymatic reaction methods and aqueous reaction solutions equally refer to the use of surfactants to increase the yield and/or stability of an enzymatic reaction.

Выражение "включает" или "содержит" в данном контексте, помимо своего непосредственного значения, также включает и особенно относится к выражениям "состоит в основном из" и "состоит из". Таким образом, выражение "содержит" относится к вариантам осуществления, в которых предмет, который "содержит" конкретно перечисленные элементы, может и/или действительно включает в себя дополнительные элементы, а также к вариантам осуществления, в которых предмет, который "содержит" конкретно перечисленные элементы, не содержит другие элементы. Выражение "имеет" или "характеризуется" в данном контексте, помимо своего непосредственного значения, также включает и особенно относится к выражениям "состоит в основном из" и "состоит из".The expression "includes" or "comprises" in this context, in addition to its immediate meaning, also includes and especially refers to the expressions "consists primarily of" and "consists of". Thus, the expression "comprises" refers to embodiments in which an item that "comprises" specifically listed items can and/or does include additional items, as well as to embodiments in which an item that "comprises" specifically listed listed elements, does not contain other elements. The expression "has" or "is characterized" in this context, in addition to its immediate meaning, also includes and especially refers to the expressions "consists mainly of" and "consists of".

Числовые интервалы, описанные здесь, включают числа, определяющие границы интервала. Заголовки, представленные здесь, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления этого изобретения, которые могут быть прочитаны со ссылкой на описание в целом. Согласно одному варианту осуществления объект, описанный в данном документе как включающий определенные стадии в случае способов или как содержащий определенные ингредиенты в случае композиций, относится к объекту, состоящему из соответствующих стадий или ингредиентов. Предпочтительно выбирать и комбинировать конкретные аспекты и варианты осуществления, описанные в данном документе, а конкретный объект, возникающий из соответствующей комбинации конкретных вариантов осуществления, также охвачен настоящим раскрытием.The numeric ranges described herein include numbers that define the boundaries of the interval. The headings provided herein are not intended to limit the various aspects or embodiments of this invention, which may be read with reference to the description as a whole. According to one embodiment, an entity described herein as comprising specific steps in the case of methods, or as containing specific ingredients in the case of compositions, refers to an entity consisting of the respective steps or ingredients. It is preferable to select and combine specific aspects and embodiments described herein, and the specific subject matter resulting from an appropriate combination of specific embodiments is also covered by this disclosure.

Перечень фигурList of figures

На Фигуре 1 показано сравнение кинетики реакции в различных реакционных средах. Условия реакции: В каждую ампулу вносили 20 мг кетона 1, 5 мг KRED-EW124, 5 мг GDH, 2 мг NADP, 25 мг глюкозы, 2 мM MgCl₂ в системах сорастворителей согласно описанию. pH=7, температура=30°C. Анализ ВЭЖХ реакционной смеси выполняли в заданный момент времени. Figure 1 shows a comparison of the reaction kinetics in various reaction media. Reaction conditions: 20 mg of ketone 1, 5 mg KRED-EW124, 5 mg GDH, 2 mg NADP, 25 mg glucose, 2 mM MgCl ₂ were added to each vial in co-solvent systems as described. pH=7, temperature=30°C. HPLC analysis of the reaction mixture was performed at a given time point.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1. Example 1 Синтез (R)-4-гидрокси-2-(4-(метоксикарбонил)фенил)пиперидин-1-карбоксилата бензила с использовавнием кеторедуктазыSynthesis of (R)-4-hydroxy-2-(4-(methoxycarbonyl)phenyl)piperidine-1-carboxylate benzyl using ketoreductase

Применение ПАВ в биокатализе для модификации активностей фермента дает благоприятные результаты, такие как повышение растворимости реагентов и повышение избирательности реакции. Хотя число ПАВ, включая ионогенные жидкости, SDS и Triton X, к настоящему времени широко использовались при биопреобразованиях, применение TPGS-750-M, разработанного в лаборатории Lipshutz, в качестве альтернативного ПАВ не было исследовано. В ходе исследования опосредованной кеторедуктазой (KRED) реакции, показанной на схеме 1, значительные усилия были направлены на поиск подходящей реакционной среды, что было обусловлено низкой растворимостью обоих исходного кетона 1 и продукта-спирта 2 в этой гетерогенной реакции.The use of surfactants in biocatalysis to modify enzyme activities gives favorable results, such as an increase in the solubility of the reagents and an increase in the selectivity of the reaction. Although a number of surfactants, including ionic liquids, SDS and Triton X, have been widely used in bioconversion to date, the use of TPGS-750-M, developed in the Lipshutz laboratory, as an alternative surfactant has not been explored. During the investigation of the ketoreductase-mediated (KRED) reaction shown in Scheme 1, considerable effort was devoted to finding a suitable reaction medium, which was due to the low solubility of both starting ketone 1 and alcohol product 2 in this heterogeneous reaction.

Схема 1Scheme 1

Сначала использовали несколько систем сорастворителей, включая TPGS, PEG400 и DMSO, в водных растворах, параллельно проводя скрининг условий указанной выше реакции. Как показано на Фиг. 1, в ходе первой фазы реакции, продолжавшейся 2,5 ч, показатели TPGS были лучше, чем у PEG400 и DMSO, при этом разница в уровнях конверсии составляла 10%. По мере дальнейшего протекания реакции, реакция шла значительно быстрее в TPGS, а наблюдаемая разница в уровнях конверсии составляла примерно 40% по сравнению с реакцией в PEG400 и DMSO за период 6 ч. Через 22 ч конверсия в реакции в TPGS была практически полной (100%), в то время как реакция в PEG400 и DMSO остановилась при конверсиях 82% и 86%, соответственно. Этот факт является следствием более низкой стабильности кеторедуктазы в присутствии добавок органических растворителей в системе обоих PEG400 и DMSO.Initially, several co-solvent systems were used, including TPGS, PEG400 and DMSO, in aqueous solutions while screening for the above reaction conditions in parallel. As shown in FIG. 1, during the first phase of the reaction, which lasted 2.5 hours, the TPGS performance was better than that of PEG400 and DMSO, while the difference in conversion levels was 10%. As the reaction proceeded further, the reaction proceeded significantly faster in TPGS, and the observed difference in conversion levels was approximately 40% compared to the reaction in PEG400 and DMSO over a period of 6 hours. After 22 hours, the conversion in the reaction in TPGS was almost complete (100% ), while the reaction in PEG400 and DMSO stopped at 82% and 86% conversions, respectively. This fact is a consequence of the lower stability of ketoreductase in the presence of additions of organic solvents in the system of both PEG400 and DMSO.

Имея в своем распоряжении результаты скрининга, мы смогли далее оптимизировать реакцию в масштабе граммов. Особенно мы сравнивали показатели систем TPGS и DMSO. Так, реакции проводили в 2% TPGS и 15% DMSO водном растворе, соответственно, при 40^oC, используя 5 вес.% загрузку фермента. Реакция достигла 93% конверсии через 18 ч в системе TPGS, в то время как более низкая 80% конверсия через 20 ч наблюдалась в системе DMSO. Более важно то, что реакция продолжалась и достигла 98,8% конверсии в TPGS после дополнительных 25 ч. А в случае DMSO для достижения 98,6% конверсии потребовалось дополнительно внести 2 вес.% фермента (запись 1, таблица 1). Это наблюдение наглядно демонстрирует более высокий уровень активности и стабильный характер фермента в TPGS по сравнению с DMSO. Другим интересным наблюдением было то, что после незапланированного воздействия на фермент в течение 24 ч среды с pH 4,7 в реакционной системе TPGS и после этого доведения pH до 7, фермент был по-прежнему достаточно активным, чтобы и далее катализировать реакцию с тем же уровнем активности (запись 2, таблица 1). Превосходной стабильности можно получить за счет молекулярных взаимодействий между TPGS и белком и защиты каталитически активного сайта фермента от водной реакционной среды.With the screening results at our disposal, we were able to further optimize the response on a gram scale. We especially compared the performance of TPGS and DMSO systems. Thus, the reactions were carried out in 2% TPGS and 15% DMSO aqueous solution, respectively, at 40 ^° C. using a 5 wt. % enzyme loading. The reaction reached 93% conversion after 18 h in the TPGS system, while a lower 80% conversion after 20 h was observed in the DMSO system. More importantly, the reaction proceeded and reached 98.8% conversion to TPGS after an additional 25 hours. And in the case of DMSO, an additional 2 wt.% enzyme was required to achieve 98.6% conversion (entry 1, table 1). This observation clearly demonstrates the higher level of activity and stable nature of the enzyme in TPGS compared to DMSO. Another interesting observation was that after unscheduled exposure of the enzyme for 24 h to pH 4.7 in the TPGS reaction system and after that pH was adjusted to 7, the enzyme was still active enough to further catalyze the reaction with the same activity level (record 2, table 1). Excellent stability can be obtained by molecular interactions between TPGS and protein and protection of the catalytically active site of the enzyme from the aqueous reaction medium.

Таблица 1: Сравнение кеторедуктазы в TPGS и DMSOTable 1: Comparison of ketoreductase in TPGS and DMSO

УсловияConditions 2% TPGS-750M2% TPGS-750M DMSO/водаDMSO/water Конверсия при 40°C (с 5% фермента)Conversion at 40°C (with 5% enzyme) 93% за 18 ч; вплоть до 98,8% за дополнительных 25 ч без дополнительного внесения ферментов 93% in 18 hours; up to 98.8% in an additional 25 hours without additional enzymes 80% за 20 ч; вплоть до 98,6% за дополнительных 32 ч требуется дополнительное внесение ферментов80% in 20 hours; up to 98.6% in an additional 32 hours, additional enzymes are required Активность ферментаEnzyme activity По-прежнему активен в течение 6 д, даже при падении pH до 4,7 за 24 ч при к.т.Still active for 6 days even when pH drops to 4.7 in 24 hours at RT. pH должен быть постоянным при 6,9-7,1 для активного катализаpH must be constant at 6.9-7.1 for active catalysis

Наконец, реакция в TPGS более пригодна для масштабирования, и соединение 1 можно добавлять в твердой форме без предварительного получения раствора или размола с целью уменьшения размера частиц. Типичная экспериментальная процедура представляет собой следующее: к дегазированному 2% по массе раствору TPGS-750-M в забуференной воде (34 мл, 10 об.; стандартный раствор готовят из 74 мл 2% по массе водного раствора TPGS-750-M, 1,6 г Na₂HPO₄.12H₂O и 0,5 г NaH₂PO₄.2H₂O) добавляли глюкозу (3,2 г, 18 ммоль, 2,0 экв.) в реактор с механическим перемешиванием, оборудованный системой регулирования pH/ОВП при к.т. Суспензию перемешивали при к.т. в течение 20 минут и к полученной смеси последовательно добавляли NADP (59 мг, чистота 68%), GDH (33 мг) и кеторедуктазу (0,16 г, 5 (вес.)% субстрата 1). Затем добавляли субстрат 1 (3,3 г, 9 ммоль, 1,0 экв.) и pH реакционную смесь доводили до 6,8-7,2 добавлением 1M водн. NaOH при к.т. Полученную смесь нагревали до 40°C и перемешивали при 40°C в течение 43 часов до завершения реакции, которое определяли с помощью ВЭЖХ. По мере протекания реакции продукт 2 выпадал в осадок из реакционной смеси и образовывал суспензию. Полученную суспензию отфильтровывали при 40^oC, а полученный на фильтре осадок промывали и сушили с получением продукта 2 в виде грязно-белого твердого вещества (2,8 г, чистота 97%, выход 85%).Finally, the TPGS reaction is more suitable for scaling up and Compound 1 can be added in solid form without prior solution or milling to reduce particle size. A typical experimental procedure is as follows: to a degassed 2% by weight solution of TPGS-750-M in buffered water (34 ml, 10 vol.; standard solution prepared from 74 ml of a 2% by weight aqueous solution of TPGS-750-M, 1. 6 g Na ₂ HPO ₄ .12H ₂ O and 0.5 g NaH ₂ PO ₄ .2H ₂ O) were added glucose (3.2 g, 18 mmol, 2.0 eq.) to a mechanically stirred reactor equipped with a control system pH/ORP at RT The suspension was stirred at rt. for 20 minutes and to the resulting mixture were added NADP (59 mg, 68% purity), GDH (33 mg) and ketoreductase (0.16 g, 5 (wt.)% of substrate 1) in succession. Substrate 1 (3.3 g, 9 mmol, 1.0 eq.) was then added and the pH of the reaction mixture was adjusted to 6.8-7.2 with 1M aq. NaOH at RT The resulting mixture was heated to 40°C and stirred at 40°C for 43 hours until completion of the reaction, which was determined using HPLC. As the reaction progressed, product 2 precipitated from the reaction mixture and formed a suspension. The resulting suspension was filtered at 40 ^° C. and the filter cake washed and dried to give product 2 as an off-white solid (2.8 g, 97% purity, 85% yield).

Схема 2Scheme 2

Вывод: был показан благоприятный эффект от TPGS в качестве добавки при биопреобразовании, опосредованном кеторедуктазой, включая отличную кинетику реакции и устойчивость процесса. Получаемая в TPGS стабильность фермента будет сходным образом благоприятна при применении в широком перечне биокаталитических преобразований.Conclusion: A beneficial effect of TPGS as an additive in ketoreductase mediated biotransformation has been shown, including excellent reaction kinetics and process stability. The enzyme stability obtained in TPGS will be similarly beneficial when used in a wide range of biocatalytic transformations.

Пример 2: Example 2: Синтез (R)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-2-(1-гидроксиэтил)-4H-хромен-4-она с использованием кеторедуктазыSynthesis of (R)-5-fluoro-3-(3-fluorophenyl)-2-(1-hydroxyethyl)-4H-chromen-4-one using ketoreductase

Схема 3Scheme 3

Реакционная смесь:Reaction mixture:

20 мг субстрата 320 mg substrate 3

фермент кеторедуктаза KRED-EW-109 (количество: см. таблицу 2)ketoreductase enzyme KRED-EW-109 (amount: see table 2)

20 мг D-глюкозы20 mg D-glucose

0,4 мг (2%(масс./масс.)) глюкозодегидрогеназы (GDH)0.4 mg (2% (w/w)) glucose dehydrogenase (GDH)

0,2 мг (1%(масс./масс.)) NADP0.2 mg (1% (w/w)) NADP

0,1M PBS (количество: см. таблицу 2)0.1M PBS (amount: see table 2)

2% TPGS-750-M (масс./масс.) в 0,1M PBS (количество: см. таблицу 2)2% TPGS-750-M (w/w) in 0.1M PBS (amount: see table 2)

DMSO (количество: см. таблицу 2)DMSO (amount: see table 2)

Условия реакции: pH 7,0, 30°CReaction conditions: pH 7.0, 30°C

Таблица 2table 2

№No. ферментenzyme 0,1M PBS0.1M PBS 2% TPGS в PBS2% TPGS in PBS DMSODMSO
(об./об.)(v/v) Конверсия Conversion 17,5 ч17.5 h 24 ч24 hours 1one 1 мг
5,0% (масс./масс.)1 mg
5.0% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 72,6%72.6% 67,5%67.5% 22 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 87,2%87.2% 87,2%87.2% 33 0,2 мг
1,0% (масс./масс.)0.2 mg
1.0% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 3,9%3.9% 4,1%4.1% 44 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 11,7%11.7% 13,2%13.2% 5five 0,1 мг
0,5% (масс./масс.)0.1 mg
0.5% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 1,5%1.5% 1,5%1.5% 66 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 7,9%7.9% 9,3%9.3% 77 1 мг
5,0% (масс./масс.)1 mg
5.0% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 63,2%63.2% 61,0%61.0% 8eight 0,5мл0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 89,9%89.9% 90,4%90.4% 9nine 0,2 мг
1,0% (масс./масс.)0.2 mg
1.0% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 2,1%2.1% 2,5%2.5% 1010 0,5мл0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 12,6%12.6% 14,4%14.4% 11eleven 0,1 мг
0,5% (масс./масс.)0.1 mg
0.5% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 1,2%1.2% 1,6%1.6% 1212 0,5мл0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 7,6%7.6% 8,4%8.4%

Пример 3: Example 3: Синтез 1-фенилэтанола с использованием кеторедуктазыSynthesis of 1-phenylethanol using ketoreductase

Схема 4Scheme 4

Реакционная смесь:Reaction mixture:

20 мкл ацетофенона20 µl acetophenone

фермент кеторедуктаза KRED-EW-124 (количество: см. таблицу 3)ketoreductase enzyme KRED-EW-124 (amount: see table 3)

20 мг D-глюкозы20 mg D-glucose

0,2 мг (1%(масс./масс.)) NADP0.2 mg (1% (w/w)) NADP

0,1M PBS (количество: см. таблицу 3)0.1M PBS (amount: see table 3)

2% TPGS-750-M (масс./масс.) в 0,1M PBS (количество: см. таблицу 3)2% TPGS-750-M (w/w) in 0.1M PBS (amount: see Table 3)

DMSO (количество: см. таблицу 3)DMSO (amount: see table 3)

Условия реакции: pH 7,0, 30°CReaction conditions: pH 7.0, 30°C

Таблица 3Table 3

№No. ферментenzyme 0,1M PBS0.1M PBS 2% TPGS в PBS2% TPGS in PBS DMSODMSO
(об./об.)(v/v) КонверсияConversion 18 ч18 h 1one 8 мг
40% (масс./масс.)8 mg
40% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 53,5%53.5% 22 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 55,0%55.0% 33 4 мг
20% (масс./масс.)4 mg
20% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 48,7%48.7% 44 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 52,4%52.4% 5five 2 мг
10% (масс./масс.)2 mg
10% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 45,2%45.2% 66 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 47,5%47.5% 77 8 мг
40% (масс./масс.)8 mg
40% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 53,2%53.2% 8eight 0,5мл0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 52,5%52.5% 9nine 4 мг
20% (масс./масс.)4 mg
20% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 47,9%47.9% 1010 0,5мл0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 50,6%50.6% 11eleven 2 мг
10% (масс./масс.)2 mg
10% (w/w) 0,9мл0.9ml н.о.but. 0,1 мл
10%(об./об.)0.1 ml
10%(v/v) 43,3%43.3% 1212 0,5мл0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 45,2%45.2%

Пример 4: Example 4: Синтез (S)-3-(3-бромпиридин-4-ил)-5-метилциклогексан-1-она с использованием ен-редуктазыSynthesis of (S)-3-(3-bromopyridin-4-yl)-5-methylcyclohexan-1-one using en-reductase

Схема 5Scheme 5

Реакционная смесь:Reaction mixture:

20 мкл субстрата 520 µl Substrate 5

фермент ен-редуктаза ENE012 (количество: см. таблицу 4)en-reductase enzyme ENE012 (amount: see table 4)

20 мг D-глюкозы20 mg D-glucose

0,2 мг (1%(масс./масс.)) NAD0.2 mg (1%(w/w)) NAD

0,1M PBS (количество: см. таблицу 4)0.1M PBS (amount: see table 4)

2% TPGS-750-M (масс./масс.) в 0,1M PBS (количество: см. таблицу 4)2% TPGS-750-M (w/w) in 0.1M PBS (amount: see table 4)

толуол (количество: см. таблицу 4)toluene (amount: see table 4)

Условия реакции: pH 7,0, 30°CReaction conditions: pH 7.0, 30°C

Таблица 4Table 4

№No. ферментenzyme 0,1M PBS0.1M PBS 2% TPGS в PBS2% TPGS in PBS ТолуолToluene
(об./об.)(v/v) КонверсияConversion 19,5 ч19.5 h 43,5 ч43.5 h 1one 4 мг
20% (масс./масс.)4 mg
20% (w/w) 0,8мл0.8ml н.о.but. 0,2 мл
20%(об./об.)0.2 ml
20%(v/v) 45,8%45.8% 36,7%36.7% 22 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 82,7%82.7% 79,9%79.9% 33 2 мг
10% (масс./масс.)2 mg
10% (w/w) 0,8мл0.8ml н.о.but. 0,2 мл
20%(об./об.)0.2 ml
20%(v/v) 30,9%30.9% 33,8%33.8% 44 н.о.but. 1мл1ml н.о.but. 42,3%42.3% 69,3%69.3% 5five 4 мг
20% (масс./масс.)4 mg
20% (w/w) 0,8мл0.8ml н.о.but. 0,2 мл
20%(об./об.)0.2 ml
20%(v/v) 47,8%47.8% 44,4%44.4% 66 0,5мл 0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 62,3%62.3% 59,0%59.0% 77 2 мг
10% (масс./масс.)2 mg
10% (w/w) 0,8мл0.8ml н.о.but. 0,2 мл
20%(об./об.)0.2 ml
20%(v/v) 28,1%28.1% 28,2%28.2% 8eight 0,5мл 0.5ml 0,5мл0.5ml н.о.but. 47,6%47.6% 75,2%75.2%

Claims

1. An aqueous reaction mixture for carrying out an enzymatic reaction containing an enzyme, an enzyme substrate and a surfactant, where the surfactant is selected from

(i) Surfactants having the following formula I:

(I)

where R1 contains a group of poly(C _1-4 -alkylene glycol);

R2, R3, R4 and R5 are independently hydrogen or C _1-4 alkyl; and

R6 is C _5-80 -alkyl or C _5-80 -alkenyl, where the enzyme is selected from the group consisting of reductases, transferases, dehydrogenases, lipases and esterases, and where the surfactant having formula (I) is a compound - a derivative vitamin E, and

where the surfactant concentration in the reaction mixture is higher than its critical micelle concentration.

2. The reaction mixture according to claim 1 wherein R1 is a poly(C _1-4 alkylene glycol) group which is attached to the backbone oxygen atom via a covalent bond or linking group and which optionally contains a C _1-4 alkyl terminal group.

3. The reaction mixture according to claim 2, wherein the linking group is a dicarboxylic acid which forms ester bonds with the backbone and the poly(C _1-4 -alkylene glycol) group.

4. The reaction mixture according to claim 3, wherein the linking group is a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms, such as succinic acid or sebacic acid.

5. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-4, where the terminal C _1-4 -alkyl group is methyl.

6. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-5, where the poly(C _1-4 -alkylene glycol) group is a poly(ethylene glycol) group.

7. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-6, where the poly(C _1-4 -alkylene glycol) group is characterized by an average molecular weight of from about 250 to 2500 g/mol, in particular from about 500 to 1500 g/mol, for example about 550, about 750 or about 1000 g/ mol.

8. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-7 where R5 is methyl.

9. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-8 where R4 is methyl.

10. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-9, where R2 and R3 are independently hydrogen or methyl.

11. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-9, where

(i) The surfactant is represented by formula (I) and R2, R3, R4 and R5 are all methyl.

12. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-11, where R6 is branched or linear, in particular R6 is branched.

13. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-12 where

(i) The surfactant is represented by formula (I) and R6 is C _8-25 alkyl or C _8-25 alkenyl, in particular C _14-18 alkyl or C _14-18 alkenyl.

14. The reaction mixture according to paragraph 13, where

(i) The surfactant is represented by formula (I) and R6 is C ₁₆ -alkyl or C ₁₆ -alkenyl, in particular 4,8,12-trimethyltridecyl or 4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrienyl.

15. The reaction mixture according to claim 1, where the surfactant is D-α-tocopherol poly(ethylene glycol) succinate, in particular TPGS-750-M, TPGS-1000, PTS acids).

16. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-15, wherein the enzyme is selected from the group consisting of ketoreductases, en-reductases, transaminases, alcohol dehydrogenases, amino acid dehydrogenases, and lipases.

17. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-16, additionally containing a coenzyme or cofactor that is necessary for the enzymatic reaction.

18. The reaction mixture according to claim 17, wherein the coenzyme or cofactor is selected from the group consisting of alcohol dehydrogenases, NAD, NADP, FAD, and pyridoxal monophosphate.

19. The reaction mixture according to claim 17, wherein the enzyme is a ketoreductase, the substrate is a ketone, and the cofactor is NADP.

20. The reaction mixture according to claim 17, wherein the enzyme is an en-reductase, the substrate is a compound containing a carbon-carbon double bond, and the cofactor is NAD.

21. The reaction mixture according to claim 17, where the enzyme is a transaminase, the substrate is a ketone, and the cofactor is pyridoxal monophosphate.

22. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-21, where the concentration of surfactants in the reaction mixture is at least 0.01% (w/w), in particular at least 0.02% (w/w), especially at least 0.5% ( w/w) or at least 1% (w/w).

23. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-22, where the concentration of surfactants in the reaction mixture is in the range from 0.1 to 10% (wt./wt.), in particular from 0.5 to 5% (wt./wt.), especially from 0, 75 to 3% (w/w), for example equal to 2% (w/w).

24. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-23, where the enzyme content is from 0.1 to 50% relative to the substrate content, in particular from 0.5 to 35%, especially from 1 to 20%.

25. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-24, additionally containing a buffer.

26. The reaction mixture according to claim 25, wherein the buffer is selected from the group consisting of TRIS, phosphate, citrate, acetate, and ammonia.

27. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-26, where the pH value of the reaction mixture is suitable for the enzymatic reaction.

28. The reaction mixture according to claim 27, where the pH value is in the range from 4.0 to 10.0, in particular from 6.0 to 8.0, especially from 6.5 to 7.5, for example, equal to about 7, 0.

29. The reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-28, where the reaction mixture has an industrial scale.

30. The reaction mixture according to claim 29, wherein the volume of the reaction mixture is at least 10 liters, preferably at least 100 liters or at least 1000 liters.

31. A method for carrying out an enzymatic reaction, including the steps

(a) providing the reaction mixture according to any one of paragraphs. 1-30, and

(b) allowing an enzymatic reaction to proceed, wherein the reaction is carried out at a temperature of 80° C. or lower, and wherein the pH of the reaction mixture changes by at least 1.0 during the course of the reaction, in particular by at least 2.0.

32. The method according to p. 31, where the reaction is carried out at a temperature in the range from 10 to 50°C, in particular from 20 to 45°C.