RU2784815C1 - STREPTOMYCES sp. KMM 9044 - PRODUCER OF COMPOUNDS WITH ANTIBACTERIAL ACTIVITY - Google Patents
STREPTOMYCES sp. KMM 9044 - PRODUCER OF COMPOUNDS WITH ANTIBACTERIAL ACTIVITY Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784815C1 RU2784815C1 RU2022119466A RU2022119466A RU2784815C1 RU 2784815 C1 RU2784815 C1 RU 2784815C1 RU 2022119466 A RU2022119466 A RU 2022119466A RU 2022119466 A RU2022119466 A RU 2022119466A RU 2784815 C1 RU2784815 C1 RU 2784815C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- compounds
- kmm
- antibacterial activity
- streptomyces
- strain
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 108010002156 Depsipeptides Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical class O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 4
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 4
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 4
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N DAPTOMYCIN Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 description 4
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 description 4
- 229960005484 Daptomycin Drugs 0.000 description 4
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 4
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000191936 Micrococcus sp. Species 0.000 description 2
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M Potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M Sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000204060 Streptomycetaceae Species 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K Tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N Xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108010041283 teixobactin Proteins 0.000 description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 2
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;iron(3+) Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 2-{2-[3,4-bis(2-hydroxyethoxy)oxolan-2-yl]-2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy}ethyl dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCCOCC(OCCO)C1OCC(OCCO)C1OCCO HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O Ammonium nitrate Chemical compound [NH4+].[O-][N+]([O-])=O DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N Boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 241000083551 Ena Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N Sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L Sodium thiosulphate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241001541764 Streptomyces adustus Species 0.000 description 1
- 241000958215 Streptomyces filamentosus Species 0.000 description 1
- 241000509472 Streptomyces humidus Species 0.000 description 1
- 241000197555 Streptomyces phaeoluteigriseus Species 0.000 description 1
- 241000946783 Streptomyces pseudovenezuelae Species 0.000 description 1
- 241000828296 Streptomyces roseosporus NRRL 11379 Species 0.000 description 1
- 241000799799 Streptomyces variegatus Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- AHBGXTDRMVNFER-UHFFFAOYSA-L Strontium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sr+2] AHBGXTDRMVNFER-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N VANCOMYCIN Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- 229960003165 Vancomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical class Cl* 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic Effects 0.000 description 1
- 125000003308 polyketide hybrid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930001118 polyketide hybrids Natural products 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 231100000812 repeated exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229910001631 strontium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940013553 strontium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 235000019798 tripotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения соединений класса депсипептидов (ДП), обладающих антибактериальной активностью.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain compounds of the class of depsipeptides (DP) with antibacterial activity.
Уровень техникиState of the art
Несмотря на успехи, связанные с применением существующих антибактериальных агентов, продолжает сохраняться потребность в новых антибиотиках. Для многих патогенов повторное взаимодействие с применяемыми антибиотиками, приводит к отбору вариантов штаммов, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. Потеря силы и эффективности антибиотика, определяемые возникновением механизмов устойчивости, приводит к неэффективности антибиотика и, следовательно, может вести к некоторым угрожающим жизни инфекциям, которые практически не поддаются лечению. Как только на рынке появляются и начинают применяться новые антибиотики, микроорганизмы начинают эволюционировать в сторону развития устойчивости к данным новым лекарствам, эффективно создавая потребность в создании новых антибактериальных агентов для борьбы с данными возникающими штаммами.Despite the successes associated with the use of existing antibacterial agents, there continues to be a need for new antibiotics. For many pathogens, repeated exposure to applied antibiotics results in selection of strain variants that are resistant to a wide range of antibiotics. The loss of antibiotic potency and efficacy determined by the emergence of resistance mechanisms results in antibiotic ineffectiveness and therefore may lead to some life-threatening infections that are virtually untreatable. As new antibiotics are introduced and used on the market, microorganisms begin to evolve towards developing resistance to these new drugs, effectively creating a need for new antibacterial agents to combat these emerging strains.
Депсипептиды - это антибактериальные агенты, которые относятся к нерибосомальным пептидам, которые синтезируются с помощью ферментных комплексов пептид-синтетаз, состоящих из повторяющихся доменов с модульной организацией для активации и связывания аминокислот. Основными продуцентами природных ДП являются почвенные бактерии, морские организмы и грибы. Эти соединения могут обладать антибактериальной, иммуномодулирующей, противоопухолевой активностью, а также эффективны против различных микроорганизмов и гельминтов.Depsipeptides are antibacterial agents that refer to non-ribosomal peptides that are synthesized by peptide-synthetase enzyme complexes consisting of repetitive domains with a modular organization to activate and bind amino acids. The main producers of natural DPs are soil bacteria, marine organisms, and fungi. These compounds may have antibacterial, immunomodulatory, antitumor activity, and are also effective against various microorganisms and helminths.
Так, из уровня техники известен циклический депсипептид тейксобактин, открытый в 2015 г как метаболит почвенной β-протеобактериии Eleftheria terrae [Ling, L.L., Schneider, Т., Peoples, A.J., Spoering, A.L., Engels, I., Conlon, B.P., Mueller, A., Schaberle, T.F., Hughes, D.E., Epstein, S., Jones, M., 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517 (7535), 455-459], а впоследствии синтезированный [Karas JA, Chen F, Schneider-Futschik EK, Kang Z, Hussein M, Swarbrick J, Hoyer D, Giltrap AM, Payne RJ, Li J, Velkov T. Synthesis and structure-activity relationships of teixobactin. Ann N Y Acad Sci. 2020 Jan; 1459(1): 86-105. doi: 10.1111/nyas.14282], является перспективным кандидатом на разработку лекарственного средства [Teixobactin and preparation method thereof (патент CN107266531A)].Thus, the cyclic depsipeptide teixobactin is known from the prior art, discovered in 2015 as a metabolite of the soil β-proteobacterium Eleftheria terrae [Ling, L.L., Schneider, T., Peoples, A.J., Spoering, A.L., Engels, I., Conlon, B.P., Mueller , A., Schaberle, T.F., Hughes, D.E., Epstein, S., Jones, M., 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517 (7535), 455-459], and subsequently synthesized [Karas JA, Chen F, Schneider-Futschik EK, Kang Z, Hussein M, Swarbrick J, Hoyer D, Giltrap AM, Payne RJ, Li J, Velkov T. Synthesis and structure-activity relationships of teixobactin. Ann N Y Acad Sci. Jan 2020; 1459(1): 86-105. doi: 10.1111/nyas.14282], is a promising candidate for drug development [Teixobactin and preparation method thereof (patent CN107266531A)].
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является штамм-продуцент антимикробных соединений Streptomyces roseosporus, из культуральной жидкости которого был выделен циклический депсипептид даптомицин как самый активный компонент смеси соединений с 13-членным аминокислотным циклом. Пройдя все стадии изучения, он был зарегистрирован как лекарственный препарат [Tedesco KL, Rybak MJ. Daptomycin. Pharmacotherapy. 2004 Jan; 24(1):41-57. Review.]. Даптомицин проявлял высокую активность in vitro против Грам-положительных бактерий - энтерококков, включая устойчивые к ванкомицину (VRE), стафилококков, включая устойчивые к метициллину (MRSA), стрептококков и коринебактерий. Известно изобретение, относящееся к улучшению способа очистки даптомицина (патент RU 2348647 С2, опубл. 10.03.2009).The closest analogue of the claimed invention is the strain-producer of antimicrobial compounds Streptomyces roseosporus, from the culture fluid of which the cyclic depsipeptide daptomycin was isolated as the most active component of a mixture of compounds with a 13-membered amino acid cycle. Having passed all the stages of study, it was registered as a drug [Tedesco KL, Rybak MJ. Daptomycin. pharmaceutical therapy. 2004 Jan; 24(1):41-57. Review.]. Daptomycin showed high activity in vitro against Gram-positive bacteria - enterococci, including vancomycin-resistant (VRE), staphylococci, including methicillin-resistant (MRSA), streptococci and corynebacteria. An invention is known relating to the improvement of the purification method of daptomycin (patent RU 2348647 C2, publ. 10.03.2009).
На основании анализа гена 16S рРНК и полных геномов штаммы Streptomyces sp. KMM 9044 и S. roseosporus NRRL 11379 принадлежат к разным видам рода Streptomyces (16S рРНК - 98.15%, ANI - 77.37%, dDDH - 22.50%) и имеют характерные фенотипические признаки для представителей этого рода.Based on the analysis of the 16S rRNA gene and complete genomes, strains of Streptomyces sp. KMM 9044 and S. roseosporus NRRL 11379 belong to different species of the genus Streptomyces (16S rRNA - 98.15%, ANI - 77.37%, dDDH - 22.50%) and have characteristic phenotypic features for representatives of this genus.
Вместе с тем, в настоящее время не известны точные аналоги (штаммы-продуценты) нового антибактериального соединения, стрептоциннамида, активного в отношении грамположительных бактерий.At the same time, exact analogues (producing strains) of the new antibacterial compound, streptocinnamide, active against gram-positive bacteria, are not currently known.
Поскольку в получении депсипептидных соединений важную роль играют микроорганизмы, получение штаммов-продуцентов новых ДП является актуальной задачей в борьбе с антибиотикорезистентностью патогенных бактерий.Since microorganisms play an important role in the production of depsipeptide compounds, the production of new DP producing strains is an urgent task in combating the antibiotic resistance of pathogenic bacteria.
Задачей, решаемой с помощью заявляемого изобретения, является получение штамма-продуцента антимикробных соединений класса депсипептидов с высоким выходом, обладающих высокой активностью.The problem solved with the help of the claimed invention is to obtain a strain-producer of antimicrobial compounds of the class of depsipeptides with a high yield and high activity.
Для решения этой задачи предлагается штамм Streptomyces sp. КММ 9044 из коллекции морских микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН), справка о депонировании №16146-203 от 19.05.2022 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью, а также применение указанного штамма для получения соединений, обладающих антибактериальной активностью.To solve this problem, a strain of Streptomyces sp. KMM 9044 from the collection of marine microorganisms of the Federal State Budgetary Institution of Science Pacific Institute of Bioorganic Chemistry. G.B. Elyakova of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences (TIBOCH FEB RAS), deposit certificate No. 16146-203 dated May 19, 2022 - producer of compounds with antibacterial activity, as well as the use of this strain to obtain compounds with antibacterial activity.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма-продуцента новых депсипептидных соединений, обладающих антибактериальной активностью.The technical result of the claimed invention is to obtain a strain-producer of new depsipeptide compounds with antibacterial activity.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 относится к роду Streptomyces (семейство Streptomycetaceae, класс Actinobacteria).Streptomyces sp. KMM 9044 belongs to the genus Streptomyces (family Streptomycetaceae, class Actinobacteria).
Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 выделен из образца грунта, отобранного в прибрежной зоне в бухте Джигит, Японское море, Россия, 26.10.2009. Штамм выделен методом прямого посева суспензии грунта на агаризованную среду SWM с добавлением морской воды следующего состава (г/л): пептон - 5.0; гидролизат казеина - 2.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкоза - 1.0; K2HPO4 - 0.2; MgSO4 - 0.05; 500 мл дистиллированной воды, 500 мл морской воды.Streptomyces sp. KMM 9044 was isolated from a soil sample taken in the coastal zone in Dzhigit Bay, Sea of Japan, Russia, on October 26, 2009. The strain was isolated by direct inoculation of a soil suspension on an agar medium SWM with the addition of sea water of the following composition (g/l): peptone - 5.0; casein hydrolyzate - 2.0; yeast extract - 2.5; glucose - 1.0; K 2 HPO 4 - 0.2; MgSO4 - 0.05; 500 ml distilled water, 500 ml sea water.
Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 выращивали при 28°С на плотных и жидких питательных средах следующего состава (г/л):Streptomyces sp. KMM 9044 was grown at 28°C on solid and liquid nutrient media of the following composition (g/L):
1) среда SWM: пептон - 5.0, растворимый крахмал - 10.0, глюкоза - 1.0, дрожжевой экстракт - 2.5, K2HPO4 - 0.2, MgSO4 - 0.05, морская вода - 500 мл, дистиллированная вода - 500 мл, рН 6.8.1) SWM medium: peptone - 5.0, soluble starch - 10.0, glucose - 1.0, yeast extract - 2.5, K 2 HPO 4 - 0.2, MgSO 4 - 0.05, sea water - 500 ml, distilled water - 500 ml, pH 6.8.
2) среда ISP4: растворимый крахмал - 10.0, K2HPO4 - 1.0, MgSO4x7H2O - 1.0, NaCl - 1.0, (NH4)2SO4 - 2.0, СаСО3 - 2.0, FeSO4x6H2O - 0.001, MnCl2x7H2O - 0.001, ZnSO4x7H2O - 0.001, глюкоза - 2.0, дистиллированная вода - до 1 л, рН 7.3.2) ISP4 medium: soluble starch - 10.0, K 2 HPO 4 - 1.0, MgSO 4 x7H 2 O - 1.0, NaCl - 1.0, (NH4) 2 SO 4 - 2.0, CaCO 3 - 2.0, FeSO 4 x6H 2 O - 0.001 , MnCl 2 x7H 2 O - 0.001, ZnSO 4 x7H 2 O - 0.001, glucose - 2.0, distilled water - up to 1 l, pH 7.3.
3) среда ISP4 с добавлением NaBr - 8.0 г/л, рН 7.3.3) ISP4 medium with the addition of NaBr - 8.0 g/l, pH 7.3.
4) среда Sucrose yeast (SY): сахароза - 40.0; дрожжевой экстракт - 5.0; K2HPO4 - 1.5; MgSO4x7H2O - 3.1; NaCl - 2.0; (NH4)2SO4 - 2.0; СаСО3 - 4.0; FeSO4x6H2O - 0.001; MnCl2x7H2O - 0.001; глюкоза - 2.0, дистиллированная вода - до 1 л, рН 6.8.4) Sucrose yeast (SY) medium: sucrose, 40.0; yeast extract - 5.0; K 2 HPO 4 - 1.5; MgSO 4 x7H 2 O - 3.1; NaCl - 2.0; (NH 4 ) 2 SO 4 - 2.0; CaCO 3 - 4.0; FeSO 4 x6H 2 O - 0.001; MnCl 2 x7H 2 O - 0.001; glucose - 2.0, distilled water - up to 1 l, pH 6.8.
5) среда SY без добавления СаСО3, рН 6.8.5) SY medium without CaCO 3 addition, pH 6.8.
6) Marine Broth 2216 (Sigma-Aldrich): пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 1.0, цитрат железа - 0.1, хлорид натрия - 19.45, хлорид магния - 5.9, сульфат магния - 3.24, хлорид кальция - 1.8, хлорид калия - 0.55, бикарбонат натрия - 0.16, бромид калия - 0.08, хлорид стронция - 0.034, борная кислота - 0.022, силикат натрия - 0.004, фторид натрия - 0.0024, нитрат аммония - 0.0016, динатрий фосфат - 0.008, рН 7.6.6) Marine Broth 2216 (Sigma-Aldrich): peptone - 5.0, yeast extract - 1.0, iron citrate - 0.1, sodium chloride - 19.45, magnesium chloride - 5.9, magnesium sulfate - 3.24, calcium chloride - 1.8, potassium chloride - 0.55, sodium bicarbonate - 0.16, potassium bromide - 0.08, strontium chloride - 0.034, boric acid - 0.022, sodium silicate - 0.004, sodium fluoride - 0.0024, ammonium nitrate - 0.0016, disodium phosphate - 0.008, pH 7.6.
7) TSB (Sigma-Aldrich): триптон - 17.0, соевый пептон (сойтон) - 3.0, глюкоза - 2.5, хлорид натрия - 5.0, фосфат калия - 2.5, рН 6.8.7) TSB (Sigma-Aldrich): tryptone - 17.0, soy peptone (soyton) - 3.0, glucose - 2.5, sodium chloride - 5.0, potassium phosphate - 2.5, pH 6.8.
Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7-8 сут при температуре 28°С, поддерживали на агаризованной среде SY, хранили не более трех месяцев при температуре около 4°С в холодильной камере. Длительное хранение культуры осуществляли в жидком глицерине при -70°С.Streptomyces sp. KMM 9044 was grown on Petri dishes for 7–8 days at a temperature of 28°C, maintained on SY agar medium, stored for no more than three months at a temperature of about 4°C in a refrigerator. Long-term storage of the culture was carried out in liquid glycerol at -70°C.
На всех вышеуказанных средах колонии изученного штамма KMM 9044 желтые или светло-желтые, выпуклые, плотные, непрозрачные, складчатые с неровным краем, врастающие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на среде Sucrose yeast в течение 5-7 суток. Вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы. Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов стрептомицетов.On all the above media, the colonies of the studied strain KMM 9044 are yellow or light yellow, convex, dense, opaque, folded with an uneven edge, growing into agar. White aerial mycelium is formed on the Sucrose yeast medium within 5-7 days. Vegetative and aerial hyphae are weakly or intensively fragmented with age into rod-shaped immovable elements. The morphology of the studied strains is characteristic of the described species of streptomycetes.
Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 представляет собой аэробные галотолерантные бактерии, растущие при содержании хлористого натрия в среде 0-6% и при температуре 15-37°С. Бактерия КММ 9044 гидролизует казеин, крахмал, твин-40, твин-80 и ДНК, и показала отрицательные реакции на нитратредукцию, гидролиз желатина, деградацию тирозина, гидролиз целлюлозы, ксантина, гипоксантина и продукцию сероводорода из тиосульфата натрия.Streptomyces sp. KMM 9044 is an aerobic halotolerant bacteria growing at a sodium chloride content in the medium of 0-6% and at a temperature of 15-37°C. The KMM 9044 bacterium hydrolyzes casein, starch, tween-40, tween-80 and DNA and has shown negative reactions to nitrate reduction, gelatin hydrolysis, tyrosine degradation, cellulose hydrolysis, xanthine, hypoxanthine, and production of hydrogen sulfide from sodium thiosulfate.
Штамм Streptomyces sp.КММ 9044 продуцирует стрептоциннамиды А и Б (Scm A, Scm В), показывающие антимикробную активность в отношении Micrococcus luteus. Общий выход вещества составляет 3-5 мг на 1 л культуральной жидкости (КЖ). Количество извлекаемого продукта и соотношение компонентов Scm А и Scm В в образцах может варьировать из-за влияния разных факторов на продукцию штамма.The Streptomyces sp.KMM 9044 strain produces streptocinnamides A and B (Scm A, Scm B), showing antimicrobial activity against Micrococcus luteus. The total yield of the substance is 3-5 mg per 1 liter of culture fluid (QOL). The amount of the extracted product and the ratio of the Scm A and Scm B components in the samples may vary due to the influence of various factors on the production of the strain.
Биотехнология получения Scm А и Scm В состоит из следующих этапов.Biotechnology for obtaining Scm A and Scm B consists of the following steps.
1. Подготовка посевного материала.1. Preparation of seed.
2. Выращивание посевного материала 1-й генерации.2. Cultivation of seed material of the 1st generation.
3. Выращивание посевного материала 2-й генерации (второго инокулята).3. Cultivation of inoculum of the 2nd generation (second inoculum).
4. Культивирование в ферментере.4. Cultivation in a fermenter.
5. Отделение КЖ от биомассы.5. Separation of QOL from biomass.
6. Подготовка сорбционного картриджа.6. Preparation of the sorption cartridge.
7. Нанесение КЖ на полимерный сорбент.7. Application of CL on a polymeric sorbent.
8. Элюирование с картриджа.8. Elution from the cartridge.
9. Идентификацию компонентов.9. Identification of components.
10. Очистка субстанции.10. Purification of substance.
11. Получение сухого продукта.11. Getting a dry product.
Краткое описание поясняющих материаловBrief description of explanatory materials
Таблица 1 - Значения ANI (внизу) и dDDH (вверху) между геномами штамма Streptomyces sp. КММ 9044 и наиболее близкими типовыми штаммами известных видов Streptomyces, %.Table 1 - ANI (bottom) and dDDH (top) values between genomes of Streptomyces sp. KMM 9044 and the closest type strains of known Streptomyces species, %.
Таблица 2. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) соединений I и IITable 2. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of compounds I and II
Рис. 1. Структура (I), вместе с данными ЯМР. Протонные, углеродные и азотные химические сдвиги при 30С в CDCl3 показаны красным, голубым и зеленым цветом соответственно.Rice. 1. Structure (I), along with NMR data. Proton, carbon and nitrogen chemical shifts at 30C in CDCl 3 are shown in red, blue and green, respectively.
Рис. 2. Различающиеся фрагменты структуры компонентов (I) и (II) и ЯМР данные для этих фрагментов.Rice. 2. Different fragments of the structure of components (I) and (II) and NMR data for these fragments.
Рис. 3а - Спектры MS1 молекулярного иона Scm A(Z) [М+Н]+ и [M+Na]+,Rice. 3a - MS1 spectra of the molecular ion Scm A(Z) [M+H]+ and [M+Na]+,
Рис. 3б - спектр MS2 молекулярного иона [М+Н]+ при 1190.4234,Rice. 3b - MS2 spectrum of the molecular ion [M+H]+ at 1190.4234,
Рис. 3в - схема фрагментации родительского иона.Rice. 3c - fragmentation scheme of the parent ion.
Рис. 4а - спектр MS2 молекулярного иона Scm B(Z) [М+Н]+ при 1154.4461,Rice. 4a - MS2 spectrum of the molecular ion Scm B(Z) [M+H]+ at 1154.4461,
Рис. 4б - схема фрагментации родительского иона.Rice. 4b is a diagram of the fragmentation of the parent ion.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Пример 1. Получение и характеристики штаммаExample 1 Preparation and Characterization of the Strain
Штамм Streptomyces sp.КММ 9044 культивировали в лабораторных условиях при 28°С на плотных и жидких питательных средах нескольких составов (см. выше).The Streptomyces sp.KMM 9044 strain was cultivated under laboratory conditions at 28°C on solid and liquid nutrient media of several compositions (see above).
Штамм выращивали на чашках Петри в течение 7-8 суток при температуре 28°С, поддерживали на агаризованной среде SY, хранили не более трех месяцев при температуре около 4°С в холодильной камере. Длительное хранение культуры осуществляли в жидком глицерине при -70°С.The strain was grown on Petri dishes for 7-8 days at a temperature of 28°C, maintained on SY agar medium, stored for no more than three months at a temperature of about 4°C in a refrigerator. Long-term storage of the culture was carried out in liquid glycerol at -70°C.
На основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК штамм относится к роду Streptomyces (семейство Streptomycetaceae, класс Actinobacteria), наиболее близок к известным видам S. pseudovenezuelae DSM 40212T (98.97% сходства), S. variegatus NRRL В-16380T (98.96%), S. cahuitamycinicus 13K301T (98.96%), S. qaidamensis S10T (98.83%), S cacaoi subsp.asoensis NRRL В-16592T (98.76%), S. phaeoluteigriseus DSM 41896T (98.76%), S. adustus WH-9T (98.69%) и S. humidus NBRC 12877T (98.69%).Based on the analysis of the nucleotide sequences of the 16S rRNA gene fragments, the strain belongs to the genus Streptomyces (family Streptomycetaceae, class Actinobacteria), is closest to the known species S. pseudovenezuelae DSM 40212 T (98.97% similarity), S. variegatus NRRL B-16380 T (98.96% ), S. cahuitamycinicus 13K301 T (98.96%), S. qaidamensis S10 T (98.83%), S cacaoi subsp.asoensis NRRL В-16592 T (98.76%), S. phaeoluteigriseus DSM 41896 T (98.76%), S. adustus WH-9 T (98.69%) and S. humidus NBRC 12877 T (98.69%).
Результаты анализа геномной сборки Streptomyces sp. КММ 9044 показали, что штамм имеет размер генома 7.15 млн п. н. и ГЦ-состав ДНК - 71.1 мол%.The results of the analysis of the genomic assembly of Streptomyces sp. KMM 9044 showed that the strain has a genome size of 7.15 million bp. and GC-composition of DNA - 71.1 mol%.
Значения средней идентичности нуклеотидов (ANI) и ДНК-ДНК гибридизации in silico (dDDH) между геномами штамма KMM 9044 и наиболее близких известных видов (Таблица 1) не превышают пороговых значений ANI (95-96%) и dDDH (70%), предложенных для определения принадлежности штаммов к одному виду [Chun J., Oren A., Ventosa А., Christensen Н., Arahal D.R., da Costa M.S., Rooney A.P., Yi H., Xu X.W., De Meyer S., Trujillo M.E. 2018. Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 68(1):461-466].The values of the average nucleotide identity (ANI) and DNA-DNA hybridization in silico (dDDH) between the genomes of strain KMM 9044 and the closest known species (Table 1) do not exceed the threshold values of ANI (95-96%) and dDDH (70%) proposed by to determine whether strains belong to the same species [Chun J., Oren A., Ventosa A., Christensen H., Arahal D.R., da Costa M.S., Rooney A.P., Yi H., Xu X.W., De Meyer S., Trujillo M.E. 2018. Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes. Int. J. Syst. Evol. microbiol. 68(1):461-466].
Полученные нами нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК и полного генома штамма КММ 9044 депонированы в базы данных DDBJ/ENA/GenBank.The nucleotide sequences of the 16S rRNA gene and the complete genome of the KMM 9044 strain that we obtained were deposited in the DDBJ/ENA/GenBank databases.
Пример 2.Example 2
Технология получения Scm A, Scm В основана на культивировании штамма-продуцента КММ 9044 и извлечении субстанции из культуральной жидкости (КЖ) указанного штамма методом твердофазной экстракции и жидкостной хроматографии. Биотехнология состоит из следующих этапов.The technology for obtaining Scm A, Scm B is based on the cultivation of the producer strain KMM 9044 and the extraction of the substance from the culture liquid (CL) of the specified strain by solid-phase extraction and liquid chromatography. Biotechnology consists of the following steps.
1. Подготовка посевного материала. Штамм Streptomyces sp.KMM 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7 сут при температуре 28°С на среде Sucrose yeast.1. Preparation of seed. The Streptomyces sp.KMM 9044 strain was grown on Petri dishes for 7 days at 28°С on Sucrose yeast medium.
2. Выращивание посевного материала 1-й генерации (первого инокулята). Культуру переносили с поверхности агаризованной среды в колбу Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл питательной среды SY. Культивирование осуществляли при 28°С в течение 5 сут на термостатируемой качалке Innova 40 (New Brunswick Scientific) при 150 об/мин.2. Growing seed material of the 1st generation (first inoculum). The culture was transferred from the surface of the agar medium to a 750 ml Erlenmeyer flask with 50 ml of SY nutrient medium. Cultivation was carried out at 28°С for 5 days on an Innova 40 thermostatically controlled shaker (New Brunswick Scientific) at 150 rpm.
3. Выращивание посевного материала 2 генерации (второго инокулята). Посевную культуру второй генерации выращивали в среде SY в аналогичных условиях в течение 5 сут, используя для засева первый инокулят в количестве 5% об.3. Growing inoculum of the 2nd generation (second inoculum). The seed culture of the second generation was grown in the SY medium under similar conditions for 5 days, using the first inoculum for seeding in the amount of 5% vol.
4. Культивирование в ферментере. Культивирование проводили в ферментере BIOSTAT A plus (Sartorius BBI Systems) объемом 2 л. В ферментер, содержащий 1350 мл стерильной среды SY, вносили посевной материал в объеме 10% (150 мл культуры на 1.5 л среды) и 150 мл стерильного раствора глюкозы с концентрацией 20 г/л (конечная концентрация 2 г/л). Культивирование проводили при температуре 28°С. Концентрацию растворенного кислорода (pO2) поддерживали на уровне 90%, скорость перемешивания составила 300 об/мин, количество стерильного воздуха, подаваемого в аппарат, - 1.5 л/мин, рН среды поддерживали в интервале 6.8 титрованием 25% раствором аммиака. Пеногаситель силикон (0.01%) вносили в конце первого дня культивирования. Продолжительность ферментации составила 43 ч.4. Cultivation in a fermenter. Cultivation was carried out in a 2 L BIOSTAT A plus fermenter (Sartorius BBI Systems). Inoculation material in a volume of 10% (150 ml of culture per 1.5 L of medium) and 150 ml of sterile glucose solution at a concentration of 20 g/L (final concentration 2 g/L) were added to a fermenter containing 1350 ml of sterile SY medium. Cultivation was carried out at a temperature of 28°C. The concentration of dissolved oxygen (pO2) was maintained at 90%, the stirring speed was 300 rpm, the amount of sterile air supplied to the apparatus was 1.5 L/min, and the pH of the medium was maintained in the range of 6.8 by titration with 25% ammonia solution. Silicone defoamer (0.01%) was added at the end of the first day of cultivation. The duration of fermentation was 43 hours.
5. Отделение КЖ от биомассы. Выращенную культуру центрифугировали на скорости 10000 rpm (центрифуга Beckman J2-21), после чего супернатант фильтровали. Были использованы стекловолоконные фильтры Whatman glass microfiber GF/A и MF-Millipore MCE membrane с диаметром пор 0.45 мкм. Полученный объем КЖ составил 1.2 л.5. Separation of QOL from biomass. The grown culture was centrifuged at 10,000 rpm (Beckman J2-21 centrifuge), after which the supernatant was filtered. Whatman glass microfiber GF/A and MF-Millipore MCE membrane glass fiber filters with a pore diameter of 0.45 µm were used. The resulting volume of QOL was 1.2 liters.
6. Подготовка сорбционного картриджа. Картридж заполняли полимерным сорбентом LPS-500-H, фракция 70 мкм (компании «Техносорбент») насыпным способом. Использовали картридж объемом 45 мл, вес сорбента около 7.5 г.6. Preparation of the sorption cartridge. The cartridge was filled with polymeric sorbent LPS-500-H, fraction 70 μm (Technosorbent company) in bulk. A 45 ml cartridge was used; the sorbent weight was about 7.5 g.
7. Нанесение КЖ на полимерный сорбент. Картридж промывали 150 мл ацетонитрила (АЦН) и активировали 150 мл дистиллированной воды с помощью перистальтического насоса Masterflex Easy-Load 11 при скорости потока 15 мл/мин. При той же скорости наносили КЖ; по окончании картридж промывали 150 мл воды. Картридж можно использовать повторно, но не более 5 раз.7. Application of CL on a polymeric sorbent. The cartridge was washed with 150 ml of acetonitrile (ACN) and activated with 150 ml of distilled water using a Masterflex Easy-Load 11 peristaltic pump at a flow rate of 15 ml/min. QOL was applied at the same speed; when finished, the cartridge was washed with 150 ml of water. The cartridge can be reused, but not more than 5 times.
8. Элюирование с картриджа с использованием флэш-хроматографа. Картридж присоединяли к линии подачи элюента хроматографа PuriFlash 5.250 и элюировали со скоростью 15 мл/мин смесью растворителей вода - АЦН (степень чистоты "для ВЭЖХ"). Содержание АЦН в элюенте было задано по следующей программе: начальный состав - 5%; 1 мин - 45%, 10 мин - 45%, 11 мин - 100%, 22 мин - 100%. Состав элюата контролировали с помощью УФ детектора при длине волны 290 нм. УФ профили имели два пика: мажорный пик в области 5-6 мин, отвечающий сумме нецелевых соединений, и минорный пик в области 13-15 мин, содержащий целевые соединения Scm А и Scm В, УФ спектр которых имеет максимум при 290 нм. Данную фракцию объемом около 30 мл собирали с помощью коллектора фракций.8. Elution from the cartridge using a flash chromatograph. The cartridge was attached to the eluent line of a PuriFlash 5.250 chromatograph and eluted at a rate of 15 ml/min with a mixture of solvents water - ACN (HPLC grade). The content of ACN in the eluent was set according to the following program: initial composition - 5%; 1 min - 45%, 10 min - 45%, 11 min - 100%, 22 min - 100%. The composition of the eluate was monitored using a UV detector at a wavelength of 290 nm. The UV profiles had two peaks: a major peak at 5–6 min, corresponding to the sum of non-target compounds, and a minor peak at 13–15 min, containing the target compounds Scm A and Scm B, whose UV spectrum has a maximum at 290 nm. This fraction of about 30 ml was collected using a fraction collector.
9. Очистка субстанции. Очистку Scm А и Scm В проводили методом ВЭЖХ (хроматограф Шимадзу Нексера). Весь объем фракции после картриджа помещали в колбу роторного испарителя (Buchi Rotavapor), концентрировали примерно в 5 раз. К раствору добавляли раствор 0.1% уксусной кислоты - половину от полученного объема (в конкретном случае 30 мл концентрировали до 6 мл и добавляли 3 мл раствора уксусной кислоты). При наличии осадка раствор центрифугируют на скорости 10000 rpm, супернатант переносят в пробирки. Разделение проводят колонке полупрепаративного размера на сорбенте типа С18, фракция 5 или 10 мкм, при том же составе элюента, температуре термостата колонки и длине волны УФ детектора, как в п. 5. Расходы элюента и объем пробы, элюируемой за один цикл разделения, выбирают в зависимости от размера колонки. На колонке 9.2 х 150 мм проводили разделения порциями по 1.5 мл при скорости потока 3 мл/мин. Продолжительность каждого разделения составляет 20 мин. Для очистки всего объема фракции требуется повторить операцию несколько раз, в данном случае 6 раз.9. Purification of substance. Scm A and Scm B were purified by HPLC (Shimazu Necker chromatograph). The entire volume of the fraction after the cartridge was placed in a flask of a rotary evaporator (Buchi Rotavapor), concentrated by about 5 times. A solution of 0.1% acetic acid was added to the solution - half of the volume obtained (in the specific case, 30 ml was concentrated to 6 ml and 3 ml of acetic acid solution was added). In the presence of a precipitate, the solution is centrifuged at a speed of 10000 rpm, the supernatant is transferred into test tubes. Separation is carried out on a semi-preparative size column on a C18 sorbent,
10. Получение сухого продукта из растворов фракций. Растворы фракций объединяют, сливают в колбу и высушивают на роторном испарителе с минимальным подогревом или на лиофильной сушке с центрифугой типа MyVac. Общий выход вещества составляет 3-5 мг на 1 л КЖ. Количество извлекаемого продукта и соотношение компонентов Scm А и Scm В в образцах может варьировать из-за влияния разных факторов на продукцию штамма.10. Obtaining a dry product from solutions of fractions. Fraction solutions are combined, poured into a flask and dried on a rotary evaporator with minimal heating or freeze-drying with a MyVac centrifuge. The total yield of the substance is 3-5 mg per 1 liter of QOL. The amount of the extracted product and the ratio of the Scm A and Scm B components in the samples may vary due to the influence of various factors on the production of the strain.
Для полученных соединений Scm А (структурная формула I) и, Scm В (структурная формула II) установлены структурные формулы по результатам ЯМР-спектроскопии (рис. 1, 2) и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (рис. 3, 4).For the obtained compounds Scm A (structural formula I) and Scm B (structural formula II), the structural formulas were established by the results of NMR spectroscopy (Fig. 1, 2) and high-resolution tandem mass spectrometry (Fig. 3, 4).
Пример 3. Подтверждение антибактериальной активности полученных соединений.Example 3. Confirmation of the antibacterial activity of the obtained compounds.
Для тестирования были использованы штаммы Micrococcus sp. KMM 1467 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова, Arthrobacter sp. 21022 (АТСС) и Mycobacterium smegmatis АТСС 700084 из коллекции Lytech Co. Ltd.For testing, strains of Micrococcus sp. KMM 1467 from the collection of marine microorganisms of the TIBOKH im. G.B. Elyakova, Arthrobacter sp. 21022 (ATCC) and Mycobacterium smegmatis ATCC 700084 from the collection of Lytech Co. Ltd.
Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) бактерий определяли серийными двукратными разведениями (0.1-10000 нг/мл) в бульоне 2YT (BD, США). МИК определяли, как наименьшую концентрацию, препятствующую росту тестируемого организма в 96-луночном планшете после 16 ч культивирования. Для Mycobacterium smegmatis МИК определяли через 60 ч культивирования. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли, как наименьшую концентрацию, препятствующую повторному культивированию тест-организма через 24 ч инкубации. Длительное культивирование приводит к разложению Scm и к завышенным значениям МИК. Временной ход роста бактерий отслеживали при 800 нм с использованием многорежимного считывающего устройства Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).Minimal inhibitory concentrations (MICs) of bacteria were determined by serial twofold dilutions (0.1–10000 ng/mL) in 2YT broth (BD, USA). MIC was defined as the lowest concentration that interferes with growth of a test organism in a 96-well plate after 16 hours of culture. For Mycobacterium smegmatis, MICs were determined after 60 hours of cultivation. The minimum bactericidal concentration (MBC) was defined as the lowest concentration preventing re-cultivation of the test organism after 24 hours of incubation. Prolonged cultivation results in Scm degradation and inflated MIC values. The temporal course of bacterial growth was monitored at 800 nm using a Varioskan Flash multimode reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Оба варианта структур Scm А (I) и Scm В (II) имеют противомикробную активность, причем для репортерного штамма Micrococcus sp. KMM 1467 величины минимальных ингибирующих концентраций (МИК) были на уровне нг/мл: 6 нг/мл для Scm А и 2 нг/мл для Scm В, т.е. значения для эпокси-производного в несколько раз ниже, чем значения для хлор-производного.Both variants of structures Scm A (I) and Scm B (II) have antimicrobial activity, and for the reporter strain Micrococcus sp. KMM 1467 minimum inhibitory concentrations (MICs) were at the level of ng/ml: 6 ng/ml for Scm A and 2 ng/ml for Scm B, i.e. the values for the epoxy derivative are several times lower than those for the chlorine derivative.
В отношении других патогенов активность соединений была существенно ниже. Были измерены МИКи для Scm А (структура I). Результаты исследования представлены в табл. 2.Against other pathogens, the activity of the compounds was significantly lower. MICs were measured for Scm A (structure I). The results of the study are presented in table. 2.
Claims (2)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2784815C1 true RU2784815C1 (en) | 2022-11-29 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348647C2 (en) * | 2001-08-06 | 2009-03-10 | Кьюбист Фармасьютикалз, Инк | New depsipeptides and methods of their obtainment |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348647C2 (en) * | 2001-08-06 | 2009-03-10 | Кьюбист Фармасьютикалз, Инк | New depsipeptides and methods of their obtainment |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LING, L.L., et al, A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance., 2015, Nature 517 (7535), 455-459. * |
| TEDESCO KL, et al, Daptomycin. Pharmacotherapy. 2004 Jan; 24(1):41-57, Review. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3123078B2 (en) | Deacylation of cyclic lipopeptide substances | |
| Driche et al. | A new Streptomyces strain isolated from Saharan soil produces di-(2-ethylhexyl) phthalate, a metabolite active against methicillin-resistant Staphylococcus aureus | |
| El-Naggar Moustafa et al. | Meroparamycin production by newly isolated Streptomyces sp. strain MAR01: taxonomy, fermentation, purification and structural elucidation | |
| JPH0362715B2 (en) | ||
| GB2220657A (en) | Antifungal fermentation product | |
| NZ509306A (en) | Nocathiacin antibiotics | |
| KR0139628B1 (en) | Antibiotic mersacidine, process for producing it and its use as a medicament | |
| US10301690B2 (en) | Streptomyces filamentosus variant and method for producing daptomycin using same | |
| KR960013432B1 (en) | Antimicrobial agent fr 109615 and production thereof | |
| KR930003107B1 (en) | Antitumor antibiotic compound | |
| RU2784815C1 (en) | STREPTOMYCES sp. KMM 9044 - PRODUCER OF COMPOUNDS WITH ANTIBACTERIAL ACTIVITY | |
| JP5144167B2 (en) | Novel KB-3346-5 substance and production method thereof | |
| Ramakrishnan et al. | Streptomyces sp. SCBT isolated from rhizosphere soil of medicinal plants is antagonistic to pathogenic bacteria | |
| RU2795449C1 (en) | New depsipeptide compounds with antibacterial activity | |
| FI101402B (en) | A method for preparing a new antibiotic, balhimycin | |
| EP0276947B1 (en) | Carboxylic acid derivatives | |
| EP0193608B1 (en) | Gif-2 and its preparation | |
| RU2789838C1 (en) | New producer strain of ramoplanin actinoplanes ramoplaninifer | |
| RU2801749C1 (en) | New producer strain of vancomycin amycolatopsis keratiniphila | |
| RU2724537C1 (en) | Amycolatopsis rifamycinica - producer of tetracenomycin x antibiotic | |
| JP3830964B2 (en) | A novel thiodepsipeptide isolated from marine actinomycetes | |
| RU2802575C1 (en) | Streptomyces baarnensis, a new daptomycin producer | |
| RU2788348C1 (en) | New strain producing vancomycin amycolatopsis japonica | |
| KR20200073354A (en) | Novel microorganism Brevibacillus sp. TGS2-1 and compounds isolated from TGS2-1 strain for inhibiting growth of methicillin resistance Staphylococcus aureus | |
| AU631666B2 (en) | Antibiotics plusbacin |