RU2783511C1

RU2783511C1 - Комплекс, препарат и применение ботулотоксина типа а clostridium botulinum

Info

Publication number: RU2783511C1
Application number: RU2021135119A
Authority: RU
Inventors: Тцу-Вэнь ЦАУ; Юн-Кай ВАН; Куань-Чэн ШЭНЬ; Юйэх-Чинь У; Чэн-Дэр Тони ЮЙ; Юй-Чунь ЦЭН
Original assignee: Оби Фарма, Инк.
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2022-11-14

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Представлен комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, содержащий компоненты HA70, HA17, HA33, NTNH и BoNT/A1. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая токсин типа А Clostridium botulinum, и фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, и для эстетической медицины, содержащая комплекс токсина типа А Clostridium botulinum. Представлен жидкий препарат для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, и для эстетической медицины, содержащий комплекс токсина типа А Clostridium botulinum. Представлен способ эстетической медицины, а также способ лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, у нуждающегося в этом субъекта; применение комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата при изготовлении лекарственного средства и применение комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата при изготовлении продукта для эстетической медицины. Комплекс ботулотоксина по настоящему изобретению по сравнению с ранее применяемыми комплексами ботулотоксина имеет меньшую молекулярную массу, он более безопасен и обладает значительным терапевтическим эффектом. 8 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 18 табл., 4 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к белковому лекарственному средству в области эстетической медицины или фармацевтики. Также оно относится к композиции на основе токсина Clostridium botulinum.

Уровень техники

Один из наиболее заметных признаков старения - это морщины, причиной которых являются биохимические, гистологические и физиологические изменения, накапливающиеся из-за воздействия факторов окружающей среды на кожу. Существуют и другие, вторичные факторы, вызывающие характерные складки и углубление лицевых морщин (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)). Эти вторичные факторы включают постоянное воздействие силы тяжести, частое и постоянное позиционное сдавление кожи (например, во сне) и повторяющиеся движения с сокращением лицевых мышц (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)).

Для того, чтобы нивелировать некоторые признаки старения, используются различные подходы и методы. Эти подходы и методы весьма разнообразны: от применения увлажняющих средств для лица, содержащих α-гидроксикислоты и ретинол, до хирургического вмешательства и инъекций нейротоксинов. Например, в 1986 г. супруги врач-окулист Джин и дерматолог Алистер Каррутерс разработали метод лечения межбровных мимических морщин с использованием ботулинического токсина типа А (Schantz and Scott, In Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)). Новаторский метод лечения морщин Каррутерсов был опубликован в 1992 г. (Schantz and Scott, in Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)). К 1994 г. эти же исследователи доложили об опыте применения своего метода в случае других мимических лицевых морщин. (Scott, Opthalmol, 87:1044-1049 (1980)). Открытие и разработка применения ботулотоксина типа А послужили началом новой эры в эстетической медицине.

Известно, что ботулинический токсин типа А является смертельно опасным для человека природным ядом - одним из самых сильных известных на сегодняшний день. Споры бактерии Clostridium botulinum присутствуют в почве; они способны прорастать в недостаточно чистых и плохо закрытых емкостях для пищевых продуктов. Проглатывание этих бактерий приводит к отравлению ботулотоксином - ботулизму, что может привести к смерти. Ботулотоксин нарушает передачу нервных импульсов, подавляя высвобождение нейромедиатора ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах; считается, что ботулотоксин воздействует на организм человека и другими путями. Блокирование передачи сигналов от нервов к мышцам, что необходимо для мышечных сокращений, приводит к параличу. В последнее десятилетие паралитическое действие ботулинического токсина на мышечное сокращение было поставлено на службу терапевтическим целям. Контролируемое введение ботулотоксина, вызывающее паралич мышц, позволяет лечить ряд патологических состояний, например, нервно-мышечные расстройства с гиперактивностью скелетных мышц. К числу состояний, при которых помогало лечение ботулотоксином, относятся односторонний спазм лицевых мышц, спастическая кривошея взрослых, трещина заднего прохода, блефароспазм, церебральный паралич, дистония мышц шеи, мигрень, косоглазие, дисфункция височно-нижнечелюстного сустава и различные мышечные судороги и спазмы. Последнее время парализующий мышцы эффект ботулинического токсина применяется в терапевтических и косметологических целях, например, для лечения межбровных и лобных складок и морщин, а также других последствий спастических и иных сокращений мышц лица.

У грамположительных бактерий Clostridium botulinum образуется ботулотоксин не только типа А, но еще семи других различных серологических типов. Из этих восьми серологически различных типов ботулотоксина те семь, которые вызывают паралич, обозначают как серотипы A, B, C, D, E, F и G. Каждый из них нейтрализуется определенными, типоспецифичными антителами. Молекулярная масса у всех форм ботулотоксина составляет около 150 кДa. Молекулярные размеры и структура ботулотоксина таковы, что он не способен проникать через роговой слой эпидермиса и подлежащие слои кожи. У животных разных видов эффект, степень тяжести и продолжительность паралича, вызываемого разными серотипами ботулотоксина, различны. Например, у крыс по степени тяжести паралича ботулотоксин типа А действует в 500 раз сильнее ботулотоксина типа В. Кроме того, установлено, что ботулотокисин типа В в дозе 480 Ед на 1 кг массы тела не токсичен для приматов.

Бактерии Clostridium botulinum выделяют ботулотоксин в составе белкового комплекса, в который помимо собственно белка ботулотоксина с молекулярной массой 150 кДа входят другие, ассоциированные с ним нетоксичные белки. Считается, что эти эндогенные нетоксичные белки относятся к семейству гемагглютининовых белков, а также к не гемагглютининовым белкам. Сообщалось, что нетоксичные белки из комплекса с ботулотоксином стабилизируют его и защищают от денатурации под действием кислот в пищеварительном тракте проглотившего комплекс субъекта. Таким образом, нетоксичные белки ботулотоксинового комплекса защищают токсическую активность ботулотоксина и тем самым усиливают его системное воздействие при попадании в организм через пищеварительный тракт. Также предположено, что некоторые из нетоксичных белков ботулотоксинового комплекса стабилизируют молекулы ботулотоксина в крови.

Как было отмечено ранее, из-за наличия в ботулотоксиновом комплексе нетоксичных белков, молекулярная масса всего комплекса обычно гораздо больше, чем 150 кДа, которые приходятся на собственно ботулотоксин. Например, у Clostridium botulinum могут образовываться комплексы ботулотоксина типа А, имеющие молекулярную массу около 900 кДа, 500 кДа или 300 кДа. Ботулотоксин типов В и С продуцируется в составе комплексов с молекулярной массой около 700 кДа или около 500 кДа. Ботулотоксин типа D продуцируется в составе комплексов с молекулярной массой около 300 кДа или около 500 кДа. Ботулотоксин типов E и F продуцируется в составе комплексов с молекулярной массой около 300 кДа.

Для дополнительной стабилизации ботулотоксина его комплексы в процессе изготовления препарата обычно объединяют с альбумином. Например, продукт BOTOX^® (Allergan, Inc., Ирвин, шт. Калифорния, США) представляет собой препарат, содержащий ботулотоксин типа А в количестве 100 Ед с сопутствующими белками, 0,5 мг человеческого альбумина и 0,9 мг хлорида натрия. Альбумин нужен для связывания и стабилизации ботулотоксиновых комплексов в изменяющихся условиях, включая условия изготовления препарата, транспортировки, хранения и введения субъекту.

Однако на сегодняшний день число доступных композиций на основе ботулотоксина типа А ограничено. Поэтому в данной области техники существует необходимость в получении новых композиций и препаратов, содержащих указанное вещество.

Раскрытие изобретения

Поскольку в данной области техники нужно больше различных комплексов ботулотоксина типа А, авторы данного изобретения предлагают новый комплекс ботулотоксина типа А Clostridium botulinum. По сравнению с существующими на сегодняшний день продуктами (например, Botox^®) комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению имеет меньшую молекулярную массу и, соответственно, его производство обходится дешевле, а также он более стабилен и безопасен.

В одном из аспектов данного изобретения предлагается комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, содержащий компоненты HA70, HA17, HA33, NTNH и BoNT/A1, причем комплекс имеет молекулярную массу 740-790 кДa.

В одном из воплощений данного изобретения комплекс токсина типа А Clostridium botulinum состоит из компонентов HA70, HA17, HA33, NTNH и BoNT/A1 и имеет молекулярную массу около 760 kDa.

В одном из воплощений данного изобретения компонент HA70 содержит любую из следующих последовательностей:

(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1; или

(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 1 с сохранением функции компонента HA70.

В одном из воплощений данного изобретения компонент HA17 содержит любую из следующих последовательностей:

(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2; или

(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 2 с сохранением функции компонента HA17.

В одном из воплощений данного изобретения компонент HA33 содержит любую из следующих последовательностей:

(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 3; или

(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 3 с сохранением функции компонента HA33.

В одном из воплощений данного изобретения компонент NTNH содержит любую из следующих последовательностей:

(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4; или

(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 4 с сохранением функции компонента NTNH.

В одном из воплощений данного изобретения компонент BoNT/A1 содержит любую из следующих последовательностей:

(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 5; или

(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 5 с сохранением функции компонента BoNT/A1.

В другом аспекте данного изобретения предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению и фармацевтически или дерматологически приемлемый носитель.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается жидкий препарат, содержащий комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по любому из пунктов 1-6, а также человеческий сывороточный альбумин, метионин, аргинин, хлорид натрия, Tween 80, цитратный буфер и/или фосфатный буфер.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ эстетической медицины, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата по данному изобретению.

В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый способ эстетической медицины включает снижение выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличение разреза глаз, поднятие уголков губ, или сглаживание кисетных морщин над верхней губой, или общее снижение мышечного тонуса.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата по данному изобретению.

В одном из воплощений данного изобретения заболевание, подлежащее лечению предлагаемым способом, выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается применение комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата по данному изобретению для изготовлении продукта для эстетической медицины, используемого для снижения выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличения разреза глаз, поднятия уголков губ, или сглаживания кисетных морщин над верхней губой, или общего снижения мышечного тонуса, или лекарственного средства, используемого для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина.

В одном из воплощений данного изобретения указанное заболевание, выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтическая композиция или жидкий препарат для использования при снижении выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличения разреза глаз и поднятия уголков губ, или сглаживания кисетных морщин над верхней губой, или общего снижения мышечного тонуса, причем указанное лекарственное средство применяется для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного передачей нервных сигналов или высвобождением ацетилхолина.

Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum (обозначаемый в настоящем описании также «OBI-858») обладает следующими преимуществами по сравнению с имеющимся в продаже продуктом Botox^®:

(1) его терапевтический эффект (эффективная доза ED₅₀) сравним с таковым продукта Botox^® в экспериментах на мышах, но его летальная доза (LD₅₀) выше, чем у Botox^®, в экспериментах на мышах, и его коэффициент безопасности (MOS) также выше, чем у Botox^®, в экспериментах на мышах и это указывает на то, что препарат на основе ботулотоксина Clostridium botulinum, согласно настоящему изобретению, более безопасен, чем имеющийся в продаже продукт Botox^®;

(2) комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению имеет суммарную молекулярную массу белка 760 кДa в отличие от Botox^®, молекулярная масса которого 900 кДa, и поэтому представляет собой новый комплекс ботулотоксина типа А Clostridium botulinum;

(3) препарат комплекса токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению обладает улучшенной стабильностью.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - определение чистоты продукта методом жидкостной хроматографии высокого разрешения с исключением по размеру (SEC-HPLC).

Фиг. 2 - определение молекулярной массы методом многоуглового светорассеяния (MALS).

Фиг. 3 - определение суммарной молекулярной массы белка в продукте методом электронной микроскопии. (a) OBI-858; стрелка указывает на частицы токсина. (b) Референсное исследование L-PTC/A с молекулярной массой 760 кДа; стрелкой указаны четыре разных ориентации.

Фиг. 4 - оценка в тесте разведения пальцев (DAS).

Осуществление изобретения

Данное изобретение относится к комплексу токсина типа А Clostridium botulinum и его жидкому препарату. Как описывается в настоящей заявке, композиция по данному изобретению может применяться для введения субъекту ботулотоксина путем инъекций в различных лечебных и/или эстетических целях. По сравнению с существующими на сегодняшний день продуктами на основе комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению более безопасен и обладает большей или сравнимой эффективностью. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению предлагается в жидкой лекарственной форме, в составе которой он чрезвычайно стабилен.

Термин «комплекс токсина типа А Clostridium botulinum» в настоящем описании относится к белковой молекуле токсина типа А Clostridium botulinum, имеющей молекулярную массу 150 кДа, и ассоциированным с этим белком эндогенным нетоксичным белкам, то есть к комплексу, сформированному гемагглютинином (HA) и нетоксичным не гемагглютинином (NTNH). Белок гемагглютинин состоит из субкомпонентов с молекулярной массой 70, 33 и 17 кДa, обозначаемых HA70, HA33 и HA17. Для получения комплекса токсина типа А Clostridium botulinum собственно природный токсин, происходящий непосредственно из Clostridium botulinum, не является обязательным. Например, токсин Clostridium botulinum или модифицированный ботулотоксин может быть получен рекомбинантным путем, а затем объединен с нетоксичными белками. Кроме того, рекомбинантный токсин Clostridium botulinum имеется в продаже, и он тоже может быть объединен с нетоксичными белками.

Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, раскрытый в настоящей заявке, содержит также HA70, HA33, HA17, NTNH или BoNT/A1, описанные здесь, или их варианты. Такой вариант имеет аминокислотную последовательность, являющуюся результатом добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в соответствующую последовательность, раскрытую в настоящем описании (например, в любую из последовательностей SEQ ID No. 1-5).

Выражение «один или более» относится к количеству изменений аминокислотной последовательности, не нарушающих значительно активность белка. Например, «один или более» относится к 1-100, предпочтительно 1-80, более предпочтительно 1-50, еще более предпочтительно 1-40 и особенно предпочтительно 1-30, 1-20, 1-10 или 1-5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5) изменениям.

Ниже приводятся аминокислотные последовательности каждого из компонентов комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, указанных в разделе «Примеры».

HA70 (SEQ ID NO. 1)

MNSSIKKIYNDIQEKVINYSDTIDLADGNYVVRRGDGWILSRQNQILGGSVISNGSTGIVGDLRVNDNAIPYYYPTPSFNEEYIKNNIQTVFTNFTEANQIPIGFEFSKTAPSNKNLYMYLQYTYIRYEIIKVLQHEIIERAVLYVPSLGYVKSIEFNPGEKINKDFYFLTNDKCILNEQFLYKKILETTKNIPTNNIFNSKVSSTQRVLPYSNGLYVINKGDGYIRTNDKDLIGTLLIEAGSSGSIIQPRLRNTTRPLFTTSNDTKFSQQYTEERLKDAFNVQLFNTSTSLFKFVEEAPSDKNICIKAYNTYEKYELIDYQNGSIVNKAEYYLPSLGYCEVTNAPSPESEVVKMQVAEDGFIQNGPEEEIVVGVIDPSENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIQFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLHLLNNTNSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIRLHIDITN

HA17 (SEQ ID NO.2)

MSVERTFLPNGNYNIKSIFSGSLYLNPVSKSLTFSNESSANNQKWNVEYMAENRCFKISNVAEPNKYLSYDNFGFISLDSLSNRCYWFPIKIAVNTYIMLSLNKVNELDYAWDIYDTNENILSQPLLLLPNFDIYNSNQMFKLEKI

HA33 (SEQ ID NO. 3)

MEHYSVIQNSLNDKIVTISCKADTNLFFYQVAGNVSLFQQTRNYLERWRLIYDSNKAAYKIKSMDIHNTNLVLTWNAPTHNISTQQDSNADNQYWLLLKDIGNNSFIIASYKNPNLVLYADTVARNLKLSTLNNSNYIKFIIEDYIISDLNNFTCKISPILDLNKVVQQVDVTNLNVNLYTWDYGRNQKWTIRYNEEKAAYQFFNTILSNGVLTWIFSNGNTVRVSSSNDQNNDAQYWLINPVSDTDETYTITNLRDTTKALDLYGGQTANGTAIQVFNYHGDDNQKWNIRNP

NTNH (SEQ ID NO. 4)

MNINDNLSINSPVDNKNVVVVRARKTDTVFKAFKVAPNIWVAPERYYGESLSIDEEYKVDGGIYDSNFLSQDSEKDKFLQAIITLLKRINSTNAGEKLLSLISTAIPFPYGYIGGGYYAPNMITFGSAPKSNKKLNSLISSTIPFPYAGYRETNYLSSEDNKSFYASNIVIFGPGANIVENNTVFYKKEDAENGMGTMTEIWFQPFLTYKYDEFYIDPAIELIKCLIKSLYFLYGIKPSDDLVIPYRLRSELENIEYSQLNIVDLLVSGGIDPKFINTDPYWFTDNYFSNAKKVFEDHRNIYETEIEGNNAIGNDIKLRLKQKFRININDIWELNLNYFSKEFSIMMPDRFNNALKHFYRKQYYKIDYPENYSINGFVNGQINAQLSLSDRNQDIINKPEEIINLLNGNNVSLMRSNIYGDGLKSTVDDFYSNYKIPYNRAYEYHFNNSNDSSLDNVNIGVIDNIPEIIDVNPYKENCDKFSPVQKITSTREINTNIPWPINYLQAQNTNNEKFSLSSDFVEVVSSKDKSLVYSFLSNVMFYLDSIKDNSPIDTDKKYYLWLREIFRNYSFDITATQEINTNCGINKVVTWFGKALNILNTSDSFVEEFQNLGAISLINKKENLSMPIIESYEIPNDMLGLPLNDLNEKLFNIYSKNTAYFKKIYYNFLDQWWTQYYSQYFDLICMAKRSVLAQETLIKRIIQKKLSYLIGNSNISSDNLALMNLTTTNTLRDISNESQIAMNNVDSFLNNAAICVFESNIYPKFISFMEQCINNINIKTKEFIQKCTNINEDEKLQLINQNVFNSLDFEFLNIQNMKSLFSSETALLIKEETWPYELVLYAFKEPGNNVIGDASGKNTSIEYSKDIGLVYGINSDALYLNGSNQSISFSNDFFENGLTNSFSIYFWLRNLGKDTIKSKLIGSKEDNCGWEIYFQDTGLVFNMIDSNGNEKNIYLSDVSNNSWHYITISVDRLKEQLLIFIDDNLVANESIKEILNIYSSNIISLLSENNPSYIEGLTILNKPTTSQEVLSNYFEVLNNSYIRDSNEERLEYNKTYQLYNYVFSDKPICEVKQNNNIYLTINNTNNLNLQASKFKLLSINPNKQYVQKLDEVIISVLDNMEKYIDISEDNRLQLIDNKNNAKKMIISNDIFISNCLTLSYNGKYICLSMKDENHNWMICNNDMSKYLYLWSFK

BoNT/A1 (SEQ ID NO. 5)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

Данное изобретение также относится к способу достижения биологического эффекта в результате введения эффективного количества композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту или пациенту путем инъекций. Биологический эффект включает, например, купирование мышечного паралича, снижение избыточного потоотделения или иной секреции, лечение нейропатической боли или мигрени, облегчение ринита или синусита, ослабление гиперактивности мочевого пузыря, купирование мышечных спазмов, предотвращение или лечение угревой сыпи, ослабление или усиление иммунного ответа, уменьшение выраженности морщин или предотвращение или лечение различных других заболеваний.

Композиция по данному изобретению имеет лекарственную форму, пригодную для введения путем инъекций в кожу или эпителий пациента (человека или иного млекопитающего, нуждающегося в таком специфическом лечении). Определение «нуждающийся» в настоящем описании означает потребность субъекта, связанную с его состоянием здоровья или лекарственными средствами (например, для лечения состояний, обусловленных нежелательными спазмами мышц лица), а также с эстетическими и субъективными соображениями (например, изменение или усовершенствование внешности, затрагивающее ткани лица). В своем самом простом варианте композиция по данному изобретению содержит водный фармацевтически приемлемый разбавитель, например, забуференный солевой раствор (например, физиологический раствор, забуференный фосфатом, PBS). Но композиция по данному изобретению может содержать и другие ингредиенты, обычно присутствующие в фармацевтических или косметологических композициях, вводимых путем инъекций, в том числе дерматологически или фармацевтически приемлемый носитель, совместимый с тканями, в которые вводится композиция. В настоящем описании определение «дерматологически или фармацевтически приемлемый» означает, что композиция или ее компоненты, описанные в настоящей заявке, пригодны для контактирования с тканями организма и у большинства субъектов их применение не вызывает токсических эффектов, аллергических реакций, проявлений несовместимости или нестабильности и других нежелательных явлений. При необходимости композиция по данному изобретению содержит любые компоненты, обычно используемые в данной области техники, в частности в дерматологии и косметологии.

Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится в подкожный мышечный слой путем инъекций (обычно с помощью шприца) или вблизи железистых структур в коже в количестве, эффективном для обеспечения паралича, или расслабления мышц, или ослабления мышечных сокращений, или для предотвращения либо уменьшения мышечной спастичности, сокращения секреции желез или для других нужных эффектов. Такое местное применение ботулотоксина позволяет снизить его дозу, токсичность и более точно подобрать оптимальную дозировку соответственно инъецируемому или имплантируемому препарату для достижения желаемого эффекта.

Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится субъекту так, чтобы обеспечить эффективное количество ботулотоксина. Термин «эффективное количество» в настоящем описании относится к такому количеству, которое достаточно для достижения желаемой степени мышечного паралича или другого биологического или эстетического эффекта, но это количество непременно безопасно, то есть не настолько велико, чтобы вызвать серьезные побочные эффекты. Желаемый эффект включает расслабление определенных мышц, например, снижение выраженности мелких тонких и/или более заметных морщин, в частности на лице, или иное желательное для субъекта изменение внешности, например, увеличение разреза глаз, поднятие уголков губ или снижение мышечного тонуса. Снижение мышечного тонуса возможно на лице или в других частях тела. Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится индивиду путем инъекций для лечения, например, морщин, нежелательных мышечных спазмов на лице или в иных частях тела, гипергидроза, угревой сыпи или других заболеваний, при которых требуется купирование мышечной боли или спазмов. Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится в мышцы или другие связанные с кожей или иными тканями структуры путем инъекций. Например, комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению может быть введен в нижние конечности, плечевой пояс, спину (включая поясницу), подмышечные впадины, ладони, подошву стопы, шею, лицо, паховую область, тыльную сторону кисти или стопы, локоть, плечевую часть руки, колено, бедро, ягодицы, корпус, тазовую область или в любую другую часть тела, где есть в том необходимость.

Введение комплекса токсина Clostridium botulinum по данному изобретению может применяться также для лечения других состояний, включая любое состояние, при котором полезно предотвращать передачу нервных импульсов или высвобождение ацетилхолина в синапсах. Например, состояния, которые можно лечить с помощью комплекса по данному изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным здесь, нейропатическую боль, мигрень или иную головную боль, гиперактивность мочевого пузыря, ринит, синусит, угревую сыпь, дистонию, спастические мышечные сокращения, гипергидроз, гиперсекрецию одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, нервно-мышечные расстройства, характеризующиеся гиперактивностью скелетных мышц. Состояния, подлежащие лечению ботулотоксином, включают односторонний спазм лицевых мышц, спастическую кривошею взрослых, трещину заднего прохода, блефароспазм, церебральный паралич, дистонию мышц шеи, косоглазие, дисфункцию височно-нижнечелюстного сустава и различные мышечные судороги и спазмы. Комплекс по данному изобретению можно использовать также для ослабления или усиления иммунного ответа или для лечения других состояний, применительно к которым предлагались или делались инъекции комплекса токсина Clostridium botulinum. Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению можно получать в твердой форме, например, в виде лиофилизата - порошка, таблеток и др. и для инъекций такой препарат разводят (восстанавливают) водной средой.

Применение комплекса токсина Clostridium botulinum, композиции или препарата по данному изобретению индивиду осуществляется врачом или другим профессиональным медицинским работником либо под их руководством. Использование указанных средств может быть однократным или же многократным на протяжении некоторого периода времени. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения инъекция комплекса токсина Clostridium botulinum, композиции или препарата делается в одно или более мест тела, где требуется эффект, обусловленный токсином Clostridium botulinum. С учетом природы комплекса токсина Clostridium botulinum, ботулотоксин используют предпочтительно в таком режиме дозирования (количество, скорость и частота введения), чтобы достичь желаемого результата без каких-либо побочных или нежелательных последствий.

Препарат, раскрытый в настоящей заявке, содержит человеческий сывороточный альбумин, метионин, аргинин, хлорид натрия, Твин 80, цитратный и/или фосфатный буфер. Предпочтительно указанный препарат содержит человеческий сывороточный альбумин, хлорид натрия и Твин 80, растворенные в цитратном буфере с концентрацией 50 мМ. В указанном препарате концентрация человеческого сывороточного альбумина составляет 0,1-1 мг/мл, например, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 или 0,9 мг/мл. Концентрация хлорида натрия составляет 5-20 мг/мл, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или19 мг/мл, более предпочтительно 11,25 мг/мл. Концентрация Tween 80, растворенного в цитратном буфере с концентрацией 50 мM, может составлять 0,1-0,3 мг/мл, например, 0,2 мг/мл, более предпочтительно 0,188 мг/мл. Препарат по данному изобретению имеет определенный рН, например, 4-8, предпочтительно рН 5,6.

Далее в настоящей заявке концепция данного изобретения описывается подробнее в приведенных ниже примерах. Однако эти примеры служат только для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение OBI-858

(1) Получение лекарственного вещества (лекарственной субстанции) (DS) OBI-858

Замороженные бактериальные клетки OBI-858, взятые из банка клеток, восстанавливали в соответствующей среде и культивировали. Затем бактерии переносили в ферментер. По завершении культивирования клетки и их фрагменты удаляли путем фильтрации. Процесс очистки включал осаждение в два этапа, замену буфера и колоночную хроматографию. Прошедший через хроматографическую колонку раствор лекарственного вещества пропускали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм, после чего непосредственно помещали в изолятор и лиофилизировали.

(2) Приготовление лекарственного средства (DP) OBI-858

Порошковый лиофилизат OBI-858 DS восстанавливали в буфере для препарата. Полученный раствор в асептических условиях пропускали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм, после чего непосредственно помещали в стерильный пакет, находящийся в изоляторе. Затем этот раствор лиофилизовали, получая в результате OBI-858 DP.

Пример 2. Идентификация OBI-858

(1) Выравнивание нуклеотидных последовательностей геномов

Штамм OBI-858 для производственных целей получали независимо и в результате геномного секвенирования было показано, что геном OBI-858 на 98,28% идентичен геному штамма Clostridium botulinum A ATCC 3502 и на 89,69% - геному штамма Clostridium botulinum A Hall (таблица 1). Таким образом, штамм OBI-85 генетически отличается от аналогичных продуктов, существующих на рынке.

Таблица 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей геномов штаммов Clostridium botulinum
Штамм	Степень идентичности геномов (%)
Clostridium botulinum A ATCC 3502	98,28
Clostridium botulinum A ATCC 19397	90,29
Clostridium botulinum A Hall	89,69
Clostridium botulinum H04402 065(A5)	68,98
Clostridium botulinum A2 Kyoto	68,39
Clostridium botulinum A3 Loch Maree	48,84

(2) Анализ белкового состава

Материалы и методы

Чтобы достичь наибольшего покрытия последовательности, белковый образец OBI-858 расщепляли различными ферментами, после чего проводили анализ методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) Вначале белок OBI-858 денатурировали мочевиной (6 M), восстанавливали дитиотреитолом (DTT; 10 мМ) при температуре 37°C в течение 1 часа, затем обрабатывали алкилирующим агентом йодацетамидом (IAM; 50 мМ) в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем проводили расщепление ферментами в растворе бикарбоната аммония (50 мM) в следующих условиях:

(a) трипсин - 37°C, 18 ч;

(b) эндопротеиназа Glu-C - 37°C, 18 ч;

(c) трипсин (37°C, 18 ч) + эндопротеиназа Glu-C (37°C, 18 ч);

(d) эндопротеиназа Lys-C - 37°C,18 ч;

(e) хемотрипсин - 37°C,18 ч;

(f) термолизин - 37°C,18 ч.

После ферментативного расщепления белковый образец разбавляли и подкисляли 0,1%-ной муравьиной кислотой (FA) для масс-спектрометрического анализа.

Анализ проводили на масс-спектрометре Q Exactive (Thermo Scientific), соединенном с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии быстрого разрешения Ultimate 3000 RSLC (Dionex). Для хроматографии использовали колонки C18 (Acclaim PepMap RSLC, 75 мкм x 150 мм, 2 мкм, 100 Å) с приведенными ниже градиентами:

Таблица 2. Параметры жидкостной хроматографии для анализа LC-MS/MS
Время (мин)	Подвижная фаза A (%)	Подвижная фаза B (%)	Скорость потока (мкл/мин)
0	99	1	0,25
5,5	99	1	0,25
45	75	25	0,25
48	40	60	0,25
50	20	80	0,25
60	20	80	0,25
65	99	1	0,25
70	99	1	0,25

Подвижная фаза A: 0,1% муравьиная кислота

Подвижная фаза B: 95% ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота

Полные MS-сканы получали при соотношении масс/заряд (m/z) 300-2000 и для десяти ионов с наибольшей интенсивностью пиков проводили фрагментацию для тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Необработанные данные анализировали и идентифицировали с помощью программы Proteome Discoverer 1.4 и поиска по базам данных в программной системе Mascot.

Экспериментальные результаты

Анализ аминокислотной последовательности токсина типа А Clostridium botulinum OBI-858 методом LC-MS/MS показал, что этот белок состоит из пяти субъединиц разного размера, а именно с молекулярной массой 71 кДа, 17 кДа, 34 кДа, 138 кДа и 149 кДа (см. таблицу 3). Были установлены аминокислотные последовательности этих субъединиц (SEQ ID NO. 1-5) посредством белкового секвенирования.

Таблица 3. Теоретические значения молекулярной массы, рассчитанные на основе белкового секвенирования
Аминокислотная последова- тельность (ID)	Теоретическая молекулярная масса (Да)	Обозначение белка	Количество аминокислотных остатков	Брутто-формула
A5HZZ4	71391,01	HA-70	626	C₃₂₀₀H₄₉₅₃N₈₃₇O₉₉₉S₈
A5HZZ5	17034,31	HA-17	146	C₇₇₅H₁₁₆₉N₁₉₁O₂₃₀S₆
A5HZZ6	33872,73	HA-33	293	C₁₅₁₅H₂₃₁₃N₄₀₉O₄₆₈S₄
A5HZZ8	138092,85	NTNH	1193	C₆₂₄₀H₉₅₅₅N₁₅₆₉O₁₉₀₅S₃₃
A5HZZ9	149425,84	BoNT/A1	1296	C₆₇₆₃H₁₀₄₅₂N₁₇₄₄O₂₀₁₁S₃₃

(3) Определение чистоты продукта методом хроматографии с исключением по размеру (SEC-HPLC) и определение молекулярной массы методом многоуглового светорассеяния (MALS).

Материалы и методы

Анализ методом SEC-MALS - это сочетание жидкостной хроматографии высокого разрешения с исключением по размеру и статического светорассеяния, который осуществляется с помощью системы Agilent 1260 HPLC, многоуглового детектора статического рассеяния света WYATT_DAWN HELEOS и колонки SRT SEC-300 (5 мкм; 7,8×300 мм). Управление системой Agilent 1260 HPLC осуществлялось с помощью программного обеспечения ChemStation (Agilent Technologies). Для детектора светорассеяния использовали программное обеспечение ASTRA V (Wyatt Technology). Элюирование было изократическим со скоростью 0,5 мл/мин; подвижная фаза - фосфатный буферный раствор (150 мМ PBS)/NaCl (0,1 М) и NaN₃ (200 ppm), pH6.0. В ходе регистрации светорассеяния концентрацию комплекса OBI-858 отслеживали по поглощению ультрафиолетового излучения при длине волны 280 нм. Молекулярную массу комплекса OBI-858 рассчитывали по данным детекции светорассеяния, используя удельный инкремент показателя преломления (dn/dc) 0,185 мл/г и коэффициент экстинкции UV 1,49 мл/(мг*см).

Экспериментальные результаты

На фиг. 1 представлены результаты определения чистоты продукта методом хроматографии с исключением по размеру (SEC-HPLC); чистота полученного продукта составила 99,36%. На фиг. 2 представлены результаты определения молекулярной массы методом многоуглового светорассеяния (MALS); молекулярная масса по белку составила около 760 кДа.

(4) Электронно-микроскопическое исследование

Материалы и методы

Препарат образца негативно окрашивали, после чего действовали стандартным образом. Вкратце, раствор образца (капля объемом 4 мкл) наносили на медную сеточку с углеродной пленкой-подложкой, обработанной в тлеющем разряде, промывали одной каплей деионизованной воды, обрабатывали 2%-ным уранилацетатом и высушивали на воздухе. Изображения образца получали на просвечивающем электронном микроскопе (TEM) JEM-2100F с автоэмиссионной электронной пушкой при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения регистрировались с помощью камеры DE12.

Экспериментальные результаты

На фиг. 3 представлены результаты определения молекулярной массы суммарного белка с помощью электронного микроскопа. На фиг. 3 (а) показан комплекс OBI-858, стрелками отмечены частицы токсина. На фиг. 3 (b) показано референсное исследование L-PTC/A с молекулярной массой 760 кДа, стрелками отмечены четыре разные ориентации. Таким образом, продукт по данному изобретению отличается от имеющегося в продаже токсина типа А Clostridium botulinum с молекулярной массой 900 кДа.

Пример 3. Изучение эффективности OBI-858

Цель этого исследования - оценить высокий эффект однократной дозы тестируемого продукта (изделия) (OBI-858) при внутримышечном (IM) введении на самках мышей линии ICR. Эффект оценивался в баллах по шкале для теста разведения пальцев (DAS), на основании чего рассчитывали среднюю действующую (полуэффективную) дозу (ED₅₀) для внутримышечного введения. Коэффициент безопасности при внутримышечном введении определяли, как отношение LD₅₀ за 72 часа к ED₅₀за 48 часов.

Материалы и методы

Тестируемый продукт, референсный продукт, несущая среда и контроль

Тестируемый продукт:

Название - OBI-858

Поставщик - OBI Pharma, Inc.

Номер партии - 14004-25, 14004-30, 14004-35, 14004-45

Условия хранения - при температуре от -15°C до -25°C

Другие характеристики - одна емкость стерилизованного порошка, содержащая 1 350 440 Ед.

Референсный продукт:

Название - BOTOX^®

Поставщик - Allergan Inc.

Номер партии - C3461 C2

Другие характеристики - в одной емкости 50 Ед токсина типа А Clostridium botulinum.

Несущая среда и контроль:

В качестве несущей среды для изготовления препарата и отрицательного контроля при дозировании использовали буфер для разведения [физиологический раствор, забуференный фосфатом (30 мM); желатин (0,2% масса/объем); pH 6,8].

Получение и распределение дозы препаратов

Все препараты готовили в день использования соответственно схеме дозирования по дням.

Восстановление препарата (изделия) и дозирование препарата

Все процедуры по изготовлению препаратов осуществляли в боксе биологической безопасности класса II, расположенном в испытательной лаборатории. Препарат дозировали в день исследования перед процедурой введения.

Тестируемый препарат в виде лиофилизованного материала был расфасован (упакован) в стерильные запаянные емкости. Для восстановления в емкость с лиофилизатом вводили с помощью шприца 1 мл буфера для разведения. Емкость хорошенько встряхивали, чтобы добиться полного растворения материала, до тех пор, пока не оставалось видимых невооруженным глазом частиц. Если через по меньшей мере 3 минуты энергичного встряхивания еще видны были частицы, авторы обращались в компанию-изготовитель (OBI) для замены емкости с тестируемым препаратом. Восстановленный исходный тестируемый препарат имел концентрацию 1 350 440 единиц LD₅₀ (U) в 1 мл. Из этого исходного раствора готовили серийные разведения (см. таблицу 4).

Для приготовления каждого серийного разведения нужный объем буфера для разведения (см. выше схему серийных разведений) отбирали микропипеткой и вносили в чистую стеклянную емкость с крышкой. Затем также микропипеткой отбирали нужный объем исходного раствора препарата, подлежащего разведению, и вносили его в емкость, содержащую буфер для разведения. Перемешивание достигалось осторожным повторным пипетированием и аккуратным переворачиванием емкости, плотно закрытой крышкой (и то, и другое по нескольку раз). После каждого переноса использованную микропипетку заменяли на чистую. Полученные растворы 5-15 использовали в качестве тестируемого дозируемого препарата.

Восстановление референсного препарата (изделия) и дозирование препарата Референсный препарат в виде лиофилизованного материала был расфасован (упакован) в стерильные запаянные емкости. Для восстановления в емкость с лиофилизатом вводили с помощью шприца 0,2 мл буфера для разведения. Емкость хорошенько встряхивали, чтобы добиться полного растворения материала, до тех пор, пока не оставалось видимых невооруженным глазом частиц. Восстановленный исходный тестируемый препарат имел концентрацию 250 единиц LD₅₀ (U) в 1 мл. Из этого исходного препарата готовили серийные разведения (см. таблицу 5).

Таблица 5. Схема разведения исходного раствора референсного препарата для приготовления дозированного продукта
Номер раствора (ID)	0 (RТA)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Группа	N/A	12	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2
Объем буферного раствора для разведения (мкл)	1600	360	281	253	229	187	366	327	305	391	373	360
Номер раствора (ID)	N/A	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Добавляемый объем исходного раствора (мкл)	0	1440	1400	1280	1130	950	720	670	600	500	480	450
Общий объем (мкл)	1600	1800	1681	1533	1359	1137	1086	997	905	891	853	810
Вводимый объем (мкл)))	0	400	401	403	409	417	416	397	405	411	403	810
Коэффициент разведения	1	1,25	1,501	1,798	2,162	2,587	3,903	5,807	8,759	15,609	27,739	49,930
Кратность разведения	1	1,25	1,201	1,198	1,203	1,197	1,508	1,488	1,508	1,782	1,777	1,8
Концентрация вводимого препарата (Ед./мл)	250	200	166,568	139,078	115,642	96,623	64,059	43,049	28,541	16,016	9,013	5,007

RТA - исходный раствор референсного изделия; N/A - не применимо

Для приготовления каждого серийного разведения нужный объем буфера для разведения (см. выше схему серийных разведений) отбирали микропипеткой и вносили в чистую стеклянную емкость с крышкой. Затем также микропипеткой отбирали нужный объем исходного раствора препарата, подлежащего разведению, и вносили его в емкость, содержащую буфер для разведения. Перемешивание достигалось осторожным повторным пипетированием и аккуратным переворачиванием емкости, плотно закрытой крышкой (и то, и другое по нескольку раз). После каждого переноса использованную микропипетку заменяли на чистую. Полученные растворы 1-11 использовали в качестве дозированного референсного препарата.

Экспериментальные животные

Описание экспериментальных животных:

Вид, линия - мыши линии ICR.

Источник - BioLASCO Taiwan Co., Ltd (Тайбэй, Тайвань).

Количество особей для отбора в группы - 4 партии по 236 самок. Количество резервных особей - по 14 самок в партии; 4 партии.

Масса тела в день введения препарата - 18-22 г (масса тела подопытных животных варьировала в пределах ±10% от среднего значения).

Идентификация особей - ушная маркировка выщипом; маркировка краской на хвосте или туловище; этикетки на клетках.

Обоснование для отбора - для установленных процедур оценки эффективности и токсичности лекарственных препаратов того класса, к которым относятся испытываемый препарат и референсный препарат, в данном исследовании в качестве тест-системы использовали мышей. Самки мышей использовались при разработке этих процедур, а также в предыдущих исследованиях было показано, что они более восприимчивы к фармакологическому действию и токсичности лекарственных препаратов того класса, к которым относятся тестируемый препарат и референсный препарат. Исходя из установленных процедур и результатов предыдущих исследований, для данного исследования в качестве экспериментальной модели были взяты самки мышей.

Условия окружающей среды

Подопытные животные содержались в следующих условиях.

Мышей размещали по одной в поликарбонатных клетках с подстилкой в сертифицированном отделении Международной ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC International). Температура 20,7 - 23,1°C; относительная влажность 51,2 - 67,1%; режим освещенности 12 ч/12 ч; питание - готовый стерилизованный корм Autoclaved Rodent Diet 5010 (PMI^® Nutrition International; Inc., шт. Миссури, США) без ограничений, вода без ограничений. Корм и воду регулярно проверяли; результаты этих анализов имеются в архиве сертифицированного отделения. Ни в корме, ни в воде не должно было содержаться каких-либо примесей, которые могли бы повлиять на результаты данного исследования.

Схема эксперимента

Акклиматизация и отбор животных

Перед введением препарата животных выдерживали на карантине в испытательной лаборатории в течение 2 суток, затем давали привыкнуть к обстановке в течение 3-4 суток. По меньшей мере за сутки до введения препарата животных случайным образом разбивали на группы (группы 1-12, в каждой группе две подгруппы - А и В) согласно предполагаемой схеме эксперимента. Каждой особи, взятой для эксперимента, присваивали четырехзначный номер. Что касается массы тела подопытных особей, то ни между группами, ни между подгруппами не было статистически значимой разницы в средней массе тела (p < 0,05), что показано путем однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) или с использованием рангового критерия Краскела-Уоллиса. Те мыши, которых не взяли в опыт, служили резервными. Животных, предназначенных для эксперимента, в том случае, если бы в День 0 или ранее у них обнаружились какие-либо отклонения в состоянии здоровья [в том числе превышение предельно приемлемой массы тела (24 г)] и/или возникли бы подозрения на ошибку в дозировании, заменяли бы резервными особями. После завершения периода акклиматизации сбор данных по резервным особям не проводился. После Дня 1 резервные особи не включались в эксперимент.

Схема эксперимента

В приведенной ниже таблице 6 указаны группы особей, номинальные дозовые концентрации, объем доз, номинальные дозовые уровни и количество животных в каждой группе, получавшей препараты.

Таблица 6. Схема эксперимента
Группы	Номинальная дозовая концентрация (Ед./мл)^а	Объем вводимой дозы (мл/особь)	Номинальный дозовый уровень (Ед./особь)^b	Количество животных (F- самки)
Группы	Номинальная дозовая концентрация (Ед./мл)^а	Объем вводимой дозы (мл/особь)	Номинальный дозовый уровень (Ед./особь)^b	OBI-858	BOTOX^®
1	0c	0,02	0	10F
				Подгруппа A	Подгруппа B
2	5	0,02	0,1	10F	10F
3	9	0,02	0,18	10F	10F
4	16	0,02	0,32	10F	10F
5	28,5	0,02	0,57	10F	10F
6	43	0,02	0,86	10F	10F
7	64	0,02	1,28	10F	10F
8	96,5	0,02	1,93	10F	10F
9	115,5	0,02	2,31	10F	10F
10	139	0,02	2,78	10F	10F
11	166,5	0,02	3,33	10F	10F
12	200	0,02	4	10F	10F
13	844,025	0,1	84,402,5	3F+ 3F^d	0

a - См. расчет дозовой концентрации в разделе 4.3.4.

b - За исключением группы 13 реальный дозовый уровень получается умножением концентрации на объем.

c - В группе 1 (контрольной) животным вводили буфер для разведения.

d - Группа 13 служила для проверки целостности испытываемого изделия. Мышей в группу 13 отбирали из резервных особей в день введения препарата.

Проверка целостности испытываемого препарата

В каждой группе мышей в день введения препарата (День 0) из резервных животных случайным образом отбирали 3 особи. Брали одну емкость с тестируемым препаратом и восстанавливали содержимое (исходный раствор 0); часть этого исходного раствора 0 разводили в 1,6 раза. Отобранным резервным мышам вводили в хвостовую вену 0,1 мл восстановленного и разведенного тестируемого препарата. Особям основной группы вводили препарат после того, как целостность тестируемого препарата подтверждалась тем, что по меньшей мере две мыши из тех, которым внутривенно ввели указанный раствор в указанном количестве умирали не позже чем через 1 час после введения. Если же по меньшей мере две особи из получивших указанную инъекцию за 1 час не умирали, то данную емкость с исходным раствором 0 тестируемого препарата отбрасывали. В таком случае брали вторую емкость с тестируемым препаратом, готовили из ее содержимого новый исходный раствор 0 и повторяли процедуру проверки. Если и вторая емкость не проходила проверку, введение препарата из партии, к которой принадлежали эти две емкости, не проводили из-за неприемлемого качества тестируемого препарата в данной партии. В описываемом эксперименте все тестируемые емкости с препаратами успешно прошли проверку и поэтому описанных выше повторных процедур не потребовалось.

Применение тестируемого препарата - внутримышечная инъекция в икроножную мышцу правой задней конечности.

Обоснование выбора дозировки и пути введения

Номинальный дозовый уровень был выбран компанией-изготовителем (OBI) таким образом, чтобы при внутримышечном введении ожидаемые полуэффективная доза (IM ED₅₀) и полулетальная доза (IM LD₅₀) различались на порядок.

Частота введения - однократно.

Введение отрицательного контроля

В качестве отрицательного контроля мышам группы 1 вводили внутримышечно в икроножную мышцу правой задней конечности 20 мкл буфера для разведения. Процедура контрольной инъекции была такой же, как инъекции тестируемого препарата.

Наблюдение и осмотр животных

В день 0 после введения препарата животных осматривали по меньшей мере каждые 6 часов, чтобы выявить умерших особей. Затем такой осмотр делали ежедневно на протяжении всего периода исследования параллельно с проведением теста разведения пальцев (вплоть до дня 3). Регистрировали каждый случай смерти как по отдельности, так и суммарно в каждой группе, чтобы рассчитать LD₅₀.

Тест разведения пальцев (DAS)

В каждой группе подопытных животных осматривали на предмет признаков мышечной слабости через 24-26, 48-50 и 72-74 часов после введения препарата первой особи данной группы в день 0. Мышечную слабость оценивали по результатам теста разведения пальцев. У каждой особи регистрацию мышечной слабости проводили два сотрудника независимо друг от друга. Из этих независимых оценок для анализа брали среднее значение. Тест разведения пальцев проводили следующим образом (приводится выдержка из опубликованной заявки на патент США № US 2010/0168023A1). Мышечный паралич оценивали по результатам теста разведения пальцев (DAS), как сообщалось в работе Aoki, K. R. in “A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice”, Toxicon 2001; 39(12):1815-1820. Мышь на короткое время подвешивали за хвост, что вызывает характерную реакцию испуга, при которой животное вытягивает задние конечности и растопыривает на них пальцы. Степень выраженности такой реакции оценивается по пятибалльной шкале (от 0 до 4): оценка «0» отражает нормальную реакцию, оценка «4» - максимальное ослабление разведения пальцев и вытягивания задних конечностей. Шкала оценки разведения пальцев приведена в таблице 7.

Таблица 7. Шкала оценки в тесте разведения пальцев (DAS)
Оценка в баллах	4	Стопа изогнута, 5 пальцев сомкнуты
		Смерть
	3	Стопа плоская, 5 пальцев сомкнуты
		Стопа изогнута, 4 пальца сомкнуты
	2	Стопа плоская, расходятся только кончики всех пальцев
		Стопа плоская, 3 пальца касаются друг друга.
	1	Стопа плоская, расстояние между пальцами отличается от такового в контрлатеральной конечности (в которую препарат не вводили)
		Стопа плоская, 2 пальца сомкнуты, остальные полностью растопырены
	0	Без отклонений от нормальной реакции

Мыши, умершие в период проведения теста DAS, получали оценку “4” для полноты результатов теста.

Масса тела

Массу тела мышей измеряли по меньшей мере один раз для разделения на группы и в День 0 перед введением препарата.

Статистический анализ

При построении и анализе кривых доза-ответ (количество единиц токсина - оценка в тесте DAS) и расчете IM ED₅₀, а также IM LD₅₀ использовали пробит-модель и логистическую сигмоидную функцию для зависимости «количество единиц токсина-реакция DAS». Статистический анализ осуществляли с помощью программного обеспечения Minitab^®. Коэффициент безопасности партий препарата рассчитывали исходя из значений IM ED₅₀ (DAS) через 48 часов после введения препарата и IM LD₅₀ через 72 часа после введения. Критерием приемлемости для регрессионного анализа считали R²>0,9.

Информационно-вычислительная компьютерная система

Для сбора и анализа данных по массе тела использовали лабораторную информационную онлайновую систему Pristima^® (версия 6.3.2; Xybion Medical Systems Corporation) в испытательной лаборатории.

Результаты и обсуждение

Проверка целостности препарата OBI-858 RDS в различных партиях

Сводка результатов тестирования целостности OBI-858 приведена в таблице 8:

Таблица 8. Проверка целостности препарата OBI-858
Партия	Номер партии-емкости	Среднее время выживания после введения препарата (мин)
1	14004-25	34,0 ± 2,6
2	14004-30	33,3 ± 1,5
3	14004-35	34,7 ± 3,1
4	14004-45	31,7 ± 2,3

Все емкости с тестируемым препаратом прошли проверку целостности препарата, при которой определяли среднюю выживаемость животных в течение не более 1 часа после введения препарата.

Масса тела

В опытах с каждой партией препарата масса тела мышей в пределах группы особей, получавших ту или иную дозу препарата, варьировала в пределах +/- 10% от среднего для данной группы значения.

Тест разведения пальцев и расчет ED₅₀

OBI-858

Признаки изменений в разведении пальцев появлялись у мышей уже через 24 часа после введения препарата. Степень выраженности паралича коррелировала с увеличением дозы OBI-858 RDS и при дальнейшем увеличении дозы выходила на плато по достижении максимальной выраженности (включая смерть). Результаты определения IM ED₅₀за период 48 часов после введения препарата для всех партий, кроме партии 1, удовлетворяли критериям приемлемости для регрессионного анализа (R²>0,9). Для партий 2, 3 и 4 ED₅₀ за период 48 часов после введения препарата составила 0,33; 0,32 и 0,36 Ед/особь соответственно.

Таблица 9. Результаты определения ED₅₀(Ед/особь) за 48 ч после введения тестируемого препарата OBI-858
Партия	ED₅₀	L 95%	H 95%	R²
1	0,21	0,13	0,35	0,89
2	0,33	0,27	0,41	0,97
3	0,32	0,23	0,46	0,92
4	0,36	0,27	0,47	0,95

L 95% - нижняя граница 95%-ного доверительного интервала

H 95% - верхняя граница 95%-ного доверительного интервала

BOTOX^®

Признаки изменений в тесте разведения пальцев появлялись у мышей уже через 24 часа после введения препарата. Степень выраженности паралича коррелировала с увеличением дозы OBI-858 RDS и при дальнейшем увеличении дозы выходила на плато по достижении максимальной выраженности (включая смерть) при меньшей дозе, чем в случае OBI-858 RDS. Результаты определения IM ED₅₀за период 48 часов после введения препарата для всех партий, кроме партии 1, удовлетворяли критериям приемлемости при регрессионном анализе (R²>0,9). Для партий 2, 3 и 4 ED₅₀ за период 48 часов после введения препарата составила 0,22; 0,24 и 0,23 Ед./особь соответственно. В целом IM ED₅₀ за период 48 часов после введения BOTOX^® меньше, чем в случае OBI-858.

Таблица 10. Результаты определения ED₅₀(Ед/особь) за 48 ч после введения BOTOX^®
Партия	ED₅₀	L 95%	H 95%	R²
1	0,36	0,21	0,60	0,82
2	0,22	0,19	0,25	0,99
3	0,24	0,22	0,26	1,00
4	0,23	0,19	0,29	0,98

Смертность и расчет LD₅₀

OBI-858

В большинстве случаев гибели животных смерть наступала через 72 часа после введения препарата, хотя в группах 11 и 12 после введения препарата из некоторых партий мыши умирали и раньше, даже через 48 часов после введения. Для четырех партий препарата (1, 2, 3, 4) через 72 часа после введения LD₅₀ составила 3,00; 3,42; 3.33 и 3,35 Ед/особь соответственно. Однако для этого периода времени только для партий 2, 3 и 4 было достаточно разных по дозе групп животных для регрессионного анализа в пределах линейной корреляции доза-ответ, в которых смертность варьировала от 0% до 100% (для такого анализа требуется по меньшей мере три разные по дозе группы особей). Из указанных трех партий только в случае партий 2 и 3 данные удовлетворяли критериям приемлемости для регрессионного анализа.

Таблица 11. LD₅₀(Ед/особь) через 72 ч после введения тестируемого препарата OBI-858
Партия	LD₅₀	L 95%	H 95%	R²
1	3,00
2	3,42	2,70	4,32	0,99
3	3,33	3,31	3,36	1,00
4	3,35	1,66	6,75	0,86

BOTOX^®

Среди мышей, которым вводили BOTOX^®, смерть наступала раньше (уже через 24 часа после введения препарата) и при более низких дозах, чем среди животных, получавших OBI-858 RDS (в группах 6-12 через 72 ч после введения препарата). Через 72 ч после введения препарата рассчитанная LD₅₀ для четырех партий препарата (1, 2, 3, 4) составила 2,21; 1,63; 2.14 и 1.57 Ед/особь соответственно. Однако ни для одной из этих партий данные по смертности не удовлетворяли критериям приемлемости для регрессионного анализа. В случае партий 2, 3 и 4 не было разных по дозе групп в пределах линейной корреляции доза-ответ через 72 ч после введения препарата. Поэтому нельзя было провести регрессионный анализ рассчитанных LD₅₀ для этих партий. Для партии 1 R² получилось 0,74, что ниже критериев приемлемости.

Taблица 12. LD₅₀(Ед/особь) через 72 ч после введения BOTOX^®
Партия	LD₅₀	L 95%	H 95%	R²
1	2,21	0,80	6,11	0,74
2	1,63
3	2,14
4	1,57

Определение влияния вариаций массы тела на результаты расчета ED₅₀

Ни для OBI-858 RDS, ни для BOTOX^® не было обнаружено разницы в результатах расчета ED₅₀ для мышей с массой тела в пределах установленного диапазона (18-22 г) и для мышей с большей массой тела (более 22 г) на момент введения препарата. Исключение данных, полученных для животных с излишней массой тела, из расчета ED₅₀ не влияло на получаемые значения ED₅₀ в сравнении с общей для всех особей величиной ED₅₀ (см. таблицу 13).

Таблица 13. Сравнение рассчитанных значений ED₅₀ (Ед/особь) за период 48 часов после внутримышечного введения препарата для животных с разной массой тела
Партия	OBI-858			BOTOX^®
Партия	IM ED₅₀ 48 ч	IM ED₅₀ 48 ч (Масса тела 18-22 г)	IM ED₅₀ 48 ч (Масса тела > 22 г)	IM ED₅₀ 48 ч	IM ED₅₀ 48 ч (Масса тела 18-22 г)	IM ED₅₀ 48 ч (Масса тела > 22 г)
1	0,21	0,19	0,23	0,36	0,36	0,41
2	0,33	0,33	0,40	0,22	0,21	0,22
3	0,32	0,37	0,32	0,24	0,25	0,25
4	0,36	0,38	0,36	0,23	0,24	0,25

У одной особи на момент введения препарата масса тела была меньше нижней границы установленного диапазона (18 г), а именно 17,7 г. У этой мыши [ID 0193; группа 9, подгруппа B (Botox^®); партия 2] во всех сериях теста разведения пальцев наблюдались в основном такие же оценки, как и у других особей из той же группы. Иными словами, отклонение массы тела не влияло на результаты экспериментов.

Определение коэффициента безопасности (MOS)

Коэффициент безопасности рассчитывали, как отношение LD₅₀ за период 72 часа после внутримышечного введения препарата к ED₅₀ за период 48 часов после внутримышечного введения препарата.

Для четырех партий (1, 2, 3 и 4) OBI-858 значения MOS составили 14,07; 10,32; 10,33 и 9,29 соответственно. Для четырех партий (1, 2, 3 и 4) BOTOX^® значения MOS составили 6,20; 7,58; 8,98 и 6,73 соответственно. Коэффициент безопасности (MOS) OBI-858 RDS неизменно получался больше, чем у BOTOX^®(таблица 16).

Выводы

В этом исследовании все исследуемые емкости с OBI-858 прошли проверку на целостность препарата. Излишняя масса тела (22-24 г) на момент введения препарата у некоторых подопытных мышей существенно не влияла на результаты расчета ED_50. Для приемлемых партий препарата OBI-858 значения LD₅₀ за период 72 ч после внутримышечного введения и ED₅₀ за период 48 ч после внутримышечного введения в случае партии 2 составили 3,42 Ед/особь и 0,33 Ед/особь соответственно, в случае партии 3 - 3,33 Ед/особь и 0,32 Ед/особь соответственно. Значения MOS для партий 2 и 3 составили 10,32 и 10,33 соответственно. Для препарата BOTOX^® значения LD₅₀ за период 72 ч после внутримышечного введения и ED₅₀ за период 48 ч после внутримышечного введения в случае партии 2 составили 1,63 Ед/особь и 0,22 Ед./особь соответственно, в случае партии 3 - 2,14 Ед./особь и 0,24 Ед/особь соответственно. Значения MOS для партий 2 и 3 составили 7,58 и 8,98 соответственно. Короче говоря, препарат OBI-858 обладает более сильным действием, чем BOTOX^®. У OBI-858 выше LD₅₀ за период 72 ч после внутримышечного введения и более высокий коэффициент безопасности, чем у BOTOX^®.

Таблица 16. Коэффициент безопасности партий OBI-858 и BOTOX^®
Партия	OBI-858	BOTOX^®
1	14,07	6,20
2	10,32	7,58
3	10,33	8,98
4	9,29	6,73

Пример 4. Проверка стабильности OBI-858

Материалы и методы

(1) Состав LF08:

0,5 мг/мл человеческий сывороточный альбумин (HSA); 11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween 80, растворенные в фосфатном буфере (50 мМ; pH 6,3).

(2) Состав LF09:

0,5 мг/мл человеческий сывороточный альбумин (HSA); 11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween 80, растворенные в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота/цитрат натрия; pH 5,6).

(3) Состав LF10:

0,5 мг/мл метионин; 11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween 80;150 мМ аргинин, растворенные в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота/цитрат натрия; pH 6,0).

(4) Состав LF11:

11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween, растворенные в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота/цитрат натрия; pH 6,3).

(5) Экспериментальные животные

Восемь самок мышей линии ICR с массой тела 18-22 г. Отобранным особям вводили в хвостовую вену 0,1 мл OBI-858 для определения летальной дозы (LD₅₀/мл).

Результаты

(1) Определение стабильности препаратов разного состава

Восстанавливали порошковый лиофилизат OBI-858 DS четырех разных составов. Полученные препараты выдерживали при температуре 45°C в течение 14 суток, а затем при 4°C в течение 24 часов. После этого препараты согревали в течение 1 часа до комнатной температуры и вводили подопытным мышам в хвостовую вену. В таблице 17 приведены значения летальной дозы (LD₅₀/мл) для этих четырех составов. Полученные данные свидетельствуют, что наилучшей стабильностью обладал препарат с составом LF09.

Таблица 17. Проверка стабильности препаратов разного состава
Состав	LF08	LF09	LF10	LF11
Летальная доза до исследования (LD₅₀/мл)	6,15E+05	8,12E+05	6,75E+05	1,63E+05
Температура	45°C
Продолжительность	14 суток
Летальная доза после исследования (LD₅₀/мл)	0	2,58E+05	0	0

(2) Исследование стабильности препарата OBI-858 с составом LF09 в условиях ускоренной деградации (4-60°C)

Восстанавливали порошковый лиофилизат OBI-858 DS состава LF09. Полученные препараты выдерживали при четырех разных температурах (4°C, 25°C, 45°C и 60°C) в течение 7 суток, после чего еще 24 часа при температуре 4°C. Затем препараты согревали в течение 1 часа до комнатной температуры и вводили подопытным мышам в хвостовую вену. В таблице 18 приведены значения летальной дозы (LD₅₀/мл) для препарата с составом LF09. Эти данные показывают, что после хранения при температуре 45°C данный препарат все еще стабилен.

Таблица 18. Стабильность препарата OBI-858 с составом LF09 в условиях ускоренной деградации
Температура хранения	4°C	25°C	45°C	60°C
Летальная доза до исследования (LD₅₀/мл)	5,07E+05	5,07E+05	5,07E+05	5,07E+05
Время хранения	7 суток
Летальная доза после исследования (LD₅₀/мл)	5,07E+05	5,07E+05	4,06E+05	0

Следует принять во внимание, что приведенные в настоящей заявке примеры воплощений данного изобретения носят описательный характер и не ограничивают объем изобретения. Как правило, раскрытие признаков или вариантов в том или ином воплощении изобретения, приведенном в качестве примера, могут быть применимы к другим сходным признакам или вариантам в иных воплощениях изобретения. Хотя одно или более воплощений данного изобретения, приведенных в качестве примера, проиллюстрированы с помощью прилагающихся фигур, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что эти воплощения могут быть осуществлены с различными изменениями по форме и деталям без отступления от сущности и объема настоящего изобретения согласно соответствующей формуле изобретения.

Список последовательностей

<110> ОБИ ФАРМА, ИНК.

<120> КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕПАРАТ И ПРИМЕНЕНИЕ БОТУЛОТОКСИНА ТИПА А CLOSTRIDIUM BOTULINUM

<130> F20W6191

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 626

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 1

Met Asn Ser Ser Ile Lys Lys Ile Tyr Asn Asp Ile Gln Glu Lys Val

1 5 10 15

Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val

20 25 30

Arg Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg

50 55 60

Val Asn Asp Asn Ala Ile Pro Tyr Tyr Tyr Pro Thr Pro Ser Phe Asn

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Thr Asn Phe Thr

85 90 95

Glu Ala Asn Gln Ile Pro Ile Gly Phe Glu Phe Ser Lys Thr Ala Pro

100 105 110

Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr

115 120 125

Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu

130 135 140

Tyr Val Pro Ser Leu Gly Tyr Val Lys Ser Ile Glu Phe Asn Pro Gly

145 150 155 160

Glu Lys Ile Asn Lys Asp Phe Tyr Phe Leu Thr Asn Asp Lys Cys Ile

165 170 175

Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn

180 185 190

Ile Pro Thr Asn Asn Ile Phe Asn Ser Lys Val Ser Ser Thr Gln Arg

195 200 205

Val Leu Pro Tyr Ser Asn Gly Leu Tyr Val Ile Asn Lys Gly Asp Gly

210 215 220

Tyr Ile Arg Thr Asn Asp Lys Asp Leu Ile Gly Thr Leu Leu Ile Glu

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ile Gln Pro Arg Leu Arg Asn Thr Thr

245 250 255

Arg Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn Asp Thr Lys Phe Ser Gln Gln Tyr

260 265 270

Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr

275 280 285

Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asp Lys Asn

290 295 300

Ile Cys Ile Lys Ala Tyr Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Glu Leu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser

325 330 335

Leu Gly Tyr Cys Glu Val Thr Asn Ala Pro Ser Pro Glu Ser Glu Val

340 345 350

Val Lys Met Gln Val Ala Glu Asp Gly Phe Ile Gln Asn Gly Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Ile Val Val Gly Val Ile Asp Pro Ser Glu Asn Ile Gln Glu

370 375 380

Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Gly Ile

385 390 395 400

Val Asn Asn Asn Pro Phe Tyr Ile Leu Phe Thr Val Asn Thr Thr Gly

405 410 415

Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gln Asn Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ile Tyr

420 425 430

Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys

435 440 445

Asp Asp Asp Ile Lys Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Phe Asp Ser Pro

450 455 460

Asn Ala Lys Ser Tyr Leu Val Val Leu Leu Asn Lys Asp Lys Asn Tyr

465 470 475 480

Tyr Ile Arg Val Pro Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Asn Gln Ile Gln

485 490 495

Phe Lys Arg Glu Glu Gly Asp Leu Arg Asn Leu Met Asn Ser Ser Val

500 505 510

Asn Ile Ile Asp Asn Leu Asn Ser Thr Gly Ala His Tyr Tyr Thr Arg

515 520 525

Gln Ser Pro Asp Val His Asp Tyr Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Ile Pro

530 535 540

Gly Asn Phe Asn Asn Lys Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Ser

545 550 555 560

Tyr Asn Gln Gly Ile Gly Thr Leu Phe Arg Val Thr Glu Thr Ile Asp

565 570 575

Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Ile Gln Gln Asn Leu His Leu Leu Asn Asn

580 585 590

Thr Asn Ser Ile Arg Leu Leu Asn Gly Ala Ile Tyr Ile Leu Lys Val

595 600 605

Glu Val Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Asn Ile Arg Leu His Ile Asp Ile

610 615 620

Thr Asn

625

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

Met Ser Val Glu Arg Thr Phe Leu Pro Asn Gly Asn Tyr Asn Ile Lys

1 5 10 15

Ser Ile Phe Ser Gly Ser Leu Tyr Leu Asn Pro Val Ser Lys Ser Leu

20 25 30

Thr Phe Ser Asn Glu Ser Ser Ala Asn Asn Gln Lys Trp Asn Val Glu

35 40 45

Tyr Met Ala Glu Asn Arg Cys Phe Lys Ile Ser Asn Val Ala Glu Pro

50 55 60

Asn Lys Tyr Leu Ser Tyr Asp Asn Phe Gly Phe Ile Ser Leu Asp Ser

65 70 75 80

Leu Ser Asn Arg Cys Tyr Trp Phe Pro Ile Lys Ile Ala Val Asn Thr

85 90 95

Tyr Ile Met Leu Ser Leu Asn Lys Val Asn Glu Leu Asp Tyr Ala Trp

100 105 110

Asp Ile Tyr Asp Thr Asn Glu Asn Ile Leu Ser Gln Pro Leu Leu Leu

115 120 125

Leu Pro Asn Phe Asp Ile Tyr Asn Ser Asn Gln Met Phe Lys Leu Glu

130 135 140

Lys Ile

145

<210> 3

<211> 293

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 3

Met Glu His Tyr Ser Val Ile Gln Asn Ser Leu Asn Asp Lys Ile Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asp Thr Asn Leu Phe Phe Tyr Gln Val Ala

20 25 30

Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu Arg Trp

35 40 45

Arg Leu Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys Ser Met

50 55 60

Asp Ile His Asn Thr Asn Leu Val Leu Thr Trp Asn Ala Pro Thr His

65 70 75 80

Asn Ile Ser Thr Gln Gln Asp Ser Asn Ala Asp Asn Gln Tyr Trp Leu

85 90 95

Leu Leu Lys Asp Ile Gly Asn Asn Ser Phe Ile Ile Ala Ser Tyr Lys

100 105 110

Asn Pro Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asp Thr Val Ala Arg Asn Leu Lys

115 120 125

Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Asn Tyr Ile Lys Phe Ile Ile Glu Asp

130 135 140

Tyr Ile Ile Ser Asp Leu Asn Asn Phe Thr Cys Lys Ile Ser Pro Ile

145 150 155 160

Leu Asp Leu Asn Lys Val Val Gln Gln Val Asp Val Thr Asn Leu Asn

165 170 175

Val Asn Leu Tyr Thr Trp Asp Tyr Gly Arg Asn Gln Lys Trp Thr Ile

180 185 190

Arg Tyr Asn Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Thr Ile Leu

195 200 205

Ser Asn Gly Val Leu Thr Trp Ile Phe Ser Asn Gly Asn Thr Val Arg

210 215 220

Val Ser Ser Ser Asn Asp Gln Asn Asn Asp Ala Gln Tyr Trp Leu Ile

225 230 235 240

Asn Pro Val Ser Asp Thr Asp Glu Thr Tyr Thr Ile Thr Asn Leu Arg

245 250 255

Asp Thr Thr Lys Ala Leu Asp Leu Tyr Gly Gly Gln Thr Ala Asn Gly

260 265 270

Thr Ala Ile Gln Val Phe Asn Tyr His Gly Asp Asp Asn Gln Lys Trp

275 280 285

Asn Ile Arg Asn Pro

290

<210> 4

<211> 1193

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 4

Met Asn Ile Asn Asp Asn Leu Ser Ile Asn Ser Pro Val Asp Asn Lys

1 5 10 15

Asn Val Val Val Val Arg Ala Arg Lys Thr Asp Thr Val Phe Lys Ala

20 25 30

Phe Lys Val Ala Pro Asn Ile Trp Val Ala Pro Glu Arg Tyr Tyr Gly

35 40 45

Glu Ser Leu Ser Ile Asp Glu Glu Tyr Lys Val Asp Gly Gly Ile Tyr

50 55 60

Asp Ser Asn Phe Leu Ser Gln Asp Ser Glu Lys Asp Lys Phe Leu Gln

65 70 75 80

Ala Ile Ile Thr Leu Leu Lys Arg Ile Asn Ser Thr Asn Ala Gly Glu

85 90 95

Lys Leu Leu Ser Leu Ile Ser Thr Ala Ile Pro Phe Pro Tyr Gly Tyr

100 105 110

Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala Pro Asn Met Ile Thr Phe Gly Ser Ala

115 120 125

Pro Lys Ser Asn Lys Lys Leu Asn Ser Leu Ile Ser Ser Thr Ile Pro

130 135 140

Phe Pro Tyr Ala Gly Tyr Arg Glu Thr Asn Tyr Leu Ser Ser Glu Asp

145 150 155 160

Asn Lys Ser Phe Tyr Ala Ser Asn Ile Val Ile Phe Gly Pro Gly Ala

165 170 175

Asn Ile Val Glu Asn Asn Thr Val Phe Tyr Lys Lys Glu Asp Ala Glu

180 185 190

Asn Gly Met Gly Thr Met Thr Glu Ile Trp Phe Gln Pro Phe Leu Thr

195 200 205

Tyr Lys Tyr Asp Glu Phe Tyr Ile Asp Pro Ala Ile Glu Leu Ile Lys

210 215 220

Cys Leu Ile Lys Ser Leu Tyr Phe Leu Tyr Gly Ile Lys Pro Ser Asp

225 230 235 240

Asp Leu Val Ile Pro Tyr Arg Leu Arg Ser Glu Leu Glu Asn Ile Glu

245 250 255

Tyr Ser Gln Leu Asn Ile Val Asp Leu Leu Val Ser Gly Gly Ile Asp

260 265 270

Pro Lys Phe Ile Asn Thr Asp Pro Tyr Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Phe

275 280 285

Ser Asn Ala Lys Lys Val Phe Glu Asp His Arg Asn Ile Tyr Glu Thr

290 295 300

Glu Ile Glu Gly Asn Asn Ala Ile Gly Asn Asp Ile Lys Leu Arg Leu

305 310 315 320

Lys Gln Lys Phe Arg Ile Asn Ile Asn Asp Ile Trp Glu Leu Asn Leu

325 330 335

Asn Tyr Phe Ser Lys Glu Phe Ser Ile Met Met Pro Asp Arg Phe Asn

340 345 350

Asn Ala Leu Lys His Phe Tyr Arg Lys Gln Tyr Tyr Lys Ile Asp Tyr

355 360 365

Pro Glu Asn Tyr Ser Ile Asn Gly Phe Val Asn Gly Gln Ile Asn Ala

370 375 380

Gln Leu Ser Leu Ser Asp Arg Asn Gln Asp Ile Ile Asn Lys Pro Glu

385 390 395 400

Glu Ile Ile Asn Leu Leu Asn Gly Asn Asn Val Ser Leu Met Arg Ser

405 410 415

Asn Ile Tyr Gly Asp Gly Leu Lys Ser Thr Val Asp Asp Phe Tyr Ser

420 425 430

Asn Tyr Lys Ile Pro Tyr Asn Arg Ala Tyr Glu Tyr His Phe Asn Asn

435 440 445

Ser Asn Asp Ser Ser Leu Asp Asn Val Asn Ile Gly Val Ile Asp Asn

450 455 460

Ile Pro Glu Ile Ile Asp Val Asn Pro Tyr Lys Glu Asn Cys Asp Lys

465 470 475 480

Phe Ser Pro Val Gln Lys Ile Thr Ser Thr Arg Glu Ile Asn Thr Asn

485 490 495

Ile Pro Trp Pro Ile Asn Tyr Leu Gln Ala Gln Asn Thr Asn Asn Glu

500 505 510

Lys Phe Ser Leu Ser Ser Asp Phe Val Glu Val Val Ser Ser Lys Asp

515 520 525

Lys Ser Leu Val Tyr Ser Phe Leu Ser Asn Val Met Phe Tyr Leu Asp

530 535 540

Ser Ile Lys Asp Asn Ser Pro Ile Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Tyr Leu

545 550 555 560

Trp Leu Arg Glu Ile Phe Arg Asn Tyr Ser Phe Asp Ile Thr Ala Thr

565 570 575

Gln Glu Ile Asn Thr Asn Cys Gly Ile Asn Lys Val Val Thr Trp Phe

580 585 590

Gly Lys Ala Leu Asn Ile Leu Asn Thr Ser Asp Ser Phe Val Glu Glu

595 600 605

Phe Gln Asn Leu Gly Ala Ile Ser Leu Ile Asn Lys Lys Glu Asn Leu

610 615 620

Ser Met Pro Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Ile Pro Asn Asp Met Leu Gly

625 630 635 640

Leu Pro Leu Asn Asp Leu Asn Glu Lys Leu Phe Asn Ile Tyr Ser Lys

645 650 655

Asn Thr Ala Tyr Phe Lys Lys Ile Tyr Tyr Asn Phe Leu Asp Gln Trp

660 665 670

Trp Thr Gln Tyr Tyr Ser Gln Tyr Phe Asp Leu Ile Cys Met Ala Lys

675 680 685

Arg Ser Val Leu Ala Gln Glu Thr Leu Ile Lys Arg Ile Ile Gln Lys

690 695 700

Lys Leu Ser Tyr Leu Ile Gly Asn Ser Asn Ile Ser Ser Asp Asn Leu

705 710 715 720

Ala Leu Met Asn Leu Thr Thr Thr Asn Thr Leu Arg Asp Ile Ser Asn

725 730 735

Glu Ser Gln Ile Ala Met Asn Asn Val Asp Ser Phe Leu Asn Asn Ala

740 745 750

Ala Ile Cys Val Phe Glu Ser Asn Ile Tyr Pro Lys Phe Ile Ser Phe

755 760 765

Met Glu Gln Cys Ile Asn Asn Ile Asn Ile Lys Thr Lys Glu Phe Ile

770 775 780

Gln Lys Cys Thr Asn Ile Asn Glu Asp Glu Lys Leu Gln Leu Ile Asn

785 790 795 800

Gln Asn Val Phe Asn Ser Leu Asp Phe Glu Phe Leu Asn Ile Gln Asn

805 810 815

Met Lys Ser Leu Phe Ser Ser Glu Thr Ala Leu Leu Ile Lys Glu Glu

820 825 830

Thr Trp Pro Tyr Glu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Lys Glu Pro Gly Asn

835 840 845

Asn Val Ile Gly Asp Ala Ser Gly Lys Asn Thr Ser Ile Glu Tyr Ser

850 855 860

Lys Asp Ile Gly Leu Val Tyr Gly Ile Asn Ser Asp Ala Leu Tyr Leu

865 870 875 880

Asn Gly Ser Asn Gln Ser Ile Ser Phe Ser Asn Asp Phe Phe Glu Asn

885 890 895

Gly Leu Thr Asn Ser Phe Ser Ile Tyr Phe Trp Leu Arg Asn Leu Gly

900 905 910

Lys Asp Thr Ile Lys Ser Lys Leu Ile Gly Ser Lys Glu Asp Asn Cys

915 920 925

Gly Trp Glu Ile Tyr Phe Gln Asp Thr Gly Leu Val Phe Asn Met Ile

930 935 940

Asp Ser Asn Gly Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Leu Ser Asp Val Ser Asn

945 950 955 960

Asn Ser Trp His Tyr Ile Thr Ile Ser Val Asp Arg Leu Lys Glu Gln

965 970 975

Leu Leu Ile Phe Ile Asp Asp Asn Leu Val Ala Asn Glu Ser Ile Lys

980 985 990

Glu Ile Leu Asn Ile Tyr Ser Ser Asn Ile Ile Ser Leu Leu Ser Glu

995 1000 1005

Asn Asn Pro Ser Tyr Ile Glu Gly Leu Thr Ile Leu Asn Lys Pro

1010 1015 1020

Thr Thr Ser Gln Glu Val Leu Ser Asn Tyr Phe Glu Val Leu Asn

1025 1030 1035

Asn Ser Tyr Ile Arg Asp Ser Asn Glu Glu Arg Leu Glu Tyr Asn

1040 1045 1050

Lys Thr Tyr Gln Leu Tyr Asn Tyr Val Phe Ser Asp Lys Pro Ile

1055 1060 1065

Cys Glu Val Lys Gln Asn Asn Asn Ile Tyr Leu Thr Ile Asn Asn

1070 1075 1080

Thr Asn Asn Leu Asn Leu Gln Ala Ser Lys Phe Lys Leu Leu Ser

1085 1090 1095

Ile Asn Pro Asn Lys Gln Tyr Val Gln Lys Leu Asp Glu Val Ile

1100 1105 1110

Ile Ser Val Leu Asp Asn Met Glu Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Glu

1115 1120 1125

Asp Asn Arg Leu Gln Leu Ile Asp Asn Lys Asn Asn Ala Lys Lys

1130 1135 1140

Met Ile Ile Ser Asn Asp Ile Phe Ile Ser Asn Cys Leu Thr Leu

1145 1150 1155

Ser Tyr Asn Gly Lys Tyr Ile Cys Leu Ser Met Lys Asp Glu Asn

1160 1165 1170

His Asn Trp Met Ile Cys Asn Asn Asp Met Ser Lys Tyr Leu Tyr

1175 1180 1185

Leu Trp Ser Phe Lys

1190

<210> 5

<211> 1296

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 5

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

Claims

1. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, содержащий компоненты HA70, HA17, HA33, NTNH и BoNT/A1, в котором

(1) компонент HA70 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1, причем функция компонента HA70 сохраняется;

(2) компонент HA17 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2, причем функция компонента HA17 сохраняется;

(3) компонент HA33 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 3, причем функция компонента HA33 сохраняется;

(4) компонент NTNH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4, причем функция компонента NTNH сохраняется;

(5) компонент BoNT/A1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 5, причем функция компонента BoNT/A1 сохраняется.

2. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, терапевтически эффективная доза которого (ED₅₀) в эксперименте на мышах/животных составляет 0,1-0,5 Ед.

3. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, летальная доза которого (LD₅₀) в эксперименте на мышах/животных составляет 1-5 Ед.

4. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, коэффициент безопасности которого (MOS) в эксперименте на мышах/животных составляет 2-50.

5. Нуклеиновая кислота, кодирующая токсин типа А Clostridium botulinum по п. 1.

6. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, и для эстетической медицины, содержащая комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1 и фармацевтически или дерматологически приемлемый носитель, предпочтительно находящаяся в лиофилизованной форме.

7. Жидкий препарат для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, и для эстетической медицины, содержащий комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1.

8. Жидкий препарат по п. 7, содержащий человеческий сывороточный альбумин, метионин, аргинин, хлорид натрия, Твин 80, цитратный и/или фосфатный буфер.

9. Способ эстетической медицины, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества комплекса токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, фармацевтической композиции по п. 6 или жидкого препарата по п. 7 или п. 8.

10. Способ эстетической медицины по п. 9, включающий снижение выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличение разреза глаз, поднятие уголков губ, или сглаживание кисетных морщин над верхней губой, или общее снижение мышечного тонуса.

11. Способ лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества комплекса токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, фармацевтической композиции по п. 6 или жидкого препарата по п. 7 или п. 8.

12. Способ по п. 11, в котором заболевание выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.

13. Применение комплекса токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, фармацевтической композиции по п. 6 или жидкого препарата по п. 7 или п. 8 при изготовлении лекарственного средства, причем указанное лекарственное средство используется для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина.

14. Применение по п. 13, в котором заболевание выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.

15. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, фармацевтическая композиция по п. 6 или жидкий препарат по п. 7 или п. 8 для для использования при снижении выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличении разреза глаз, поднятия уголков губ, или сглаживании кисетных морщин над верхней губой, или общем снижении мышечного тонуса, причем лекарственное средство используется с целью лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина.

16. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтическая композиция или жидкий препарат по п. 15, причем заболевание выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.

17. Применение комплекса токсина типа А Clostridium botulinum по п. 1, фармацевтической композиции по п. 6 или жидкого препарата по п. 7 или 8 при изготовлении продукта для эстетической медицины, причем указанный продукт для эстетической медицины используется для снижения выраженности мелких тонких или более глубоких морщин, в частности, на лице, или для увеличения разреза глаз, поднятия уголков губ, или сглаживания кисетных морщин над верхней губой, или общего снижения мышечного тонуса.