RU2783111C1 - Способ защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и устройство для его осуществления - Google Patents
Способ защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и устройство для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2783111C1 RU2783111C1 RU2021122621A RU2021122621A RU2783111C1 RU 2783111 C1 RU2783111 C1 RU 2783111C1 RU 2021122621 A RU2021122621 A RU 2021122621A RU 2021122621 A RU2021122621 A RU 2021122621A RU 2783111 C1 RU2783111 C1 RU 2783111C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- laser radiation
- neurons
- neurodegenerative diseases
- cells
- cell culture
- Prior art date
Links
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002633 protecting Effects 0.000 title abstract description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001678 irradiating Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 23
- 206010061536 Parkinson's disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 abstract description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001537 neural Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004083 survival Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 41
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N oxygen atom Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108091003147 Electron Transport Complex IV Proteins 0.000 description 11
- 102000011686 Electron Transport Complex IV Human genes 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 9
- 108090000365 EC 1.9.3.1 Proteins 0.000 description 9
- 230000002438 mitochondrial Effects 0.000 description 9
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 7
- 229960001456 Adenosine Triphosphate Drugs 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 6
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 5
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000004263 Induced Pluripotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 4
- 102100018522 SNCA Human genes 0.000 description 4
- 101710019466 SNCA Proteins 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 210000003128 Head Anatomy 0.000 description 3
- 101700023759 PINK1 Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003291 dopaminomimetic Effects 0.000 description 3
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 description 2
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 2
- 210000004958 Brain cells Anatomy 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Calypsol Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108009000578 Oxidative Stress Proteins 0.000 description 2
- 102100001553 PINK1 Human genes 0.000 description 2
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002715 bioenergetic Effects 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 206010002855 Anxiety Diseases 0.000 description 1
- 206010057666 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 241000237967 Aplysia Species 0.000 description 1
- 206010003840 Autonomic nervous system imbalance Diseases 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N Bisbenzimide Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- 102100008990 CASP8 Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010007541 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase 8 Proteins 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 1
- 210000003710 Cerebral Cortex Anatomy 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N Coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 206010057668 Cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010035722 EC 1.11.1.10 Proteins 0.000 description 1
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000008665 Gastrointestinal Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101700048573 KLF4 Proteins 0.000 description 1
- 102100006525 KLF4 Human genes 0.000 description 1
- 229940057428 LACTOPEROXIDASE Drugs 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000028880 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102100019096 MB Human genes 0.000 description 1
- 102100015262 MYC Human genes 0.000 description 1
- 229960003987 Melatonin Drugs 0.000 description 1
- 206010061284 Mental disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000003470 Mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 210000001700 Mitochondrial Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108091008108 Myc family Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 238000004497 NIR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029305 Neurological disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 102100001133 OPN4 Human genes 0.000 description 1
- 108020005203 Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 102100019163 POU5F1 Human genes 0.000 description 1
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 210000001428 Peripheral Nervous System Anatomy 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 206010051246 Photodermatosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004560 Pineal Gland Anatomy 0.000 description 1
- 108009000611 Proteasome Degradation Proteins 0.000 description 1
- 108060006633 Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 210000001034 Respiratory Center Anatomy 0.000 description 1
- 210000003994 Retinal Ganglion Cells Anatomy 0.000 description 1
- 101700006931 SOX2 Proteins 0.000 description 1
- 102100018829 SOX2 Human genes 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 Skull Anatomy 0.000 description 1
- 206010040984 Sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007374 Smad Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007945 Smad Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010041466 Speech disease Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000003523 Substantia Nigra Anatomy 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 210000000857 Visual Cortex Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 1
- 230000035591 circadian rhythms Effects 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical group [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000063 excitotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-M hydroperoxide group Chemical group [O-]O MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl radical Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000002647 laser therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108010005417 melanopsin Proteins 0.000 description 1
- DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N melatonin Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCNC(C)=O)C2=C1 DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000005787 mitochondrial ATP synthesis coupled electron transport Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000004723 neuronal vulnerability Effects 0.000 description 1
- 108010007425 oligomycin sensitivity-conferring protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000258 photobiological Effects 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001126 phototherapy Methods 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229910052904 quartz Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000035812 respiration Effects 0.000 description 1
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000000152 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для восстановления и защиты функциональных свойств нейрональных тканей при нейродегенеративных нарушениях, в частности при болезни Паркинсона. Способ исследования защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях характеризуется облучением клеточной культуры лазерным излучением ближнего инфракрасного диапазона с длиной волны 1267 нм, при дозе облучения от 65 до 187 Дж/см2 с дополнительным контролем температуры поверхности покровного стекла с исследуемой культурой клеток для генерации низких доз синглетного кислорода. Устройство для исследования защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях содержит персональный компьютер с программным обеспечением, параллельно соединенные с ним драйверы, каждый из которых соединен с соответствующим блоком питания и через соответствующий источник непрерывного лазерного излучения подключен к волоконно-оптическому кабелю, соединенному с коллиматором, а также последовательно соединенные прецизионный датчик температуры, включенный в мостовую схему измерения с компенсацией нелинейности функции преобразования, аналого-цифровой преобразователь платы сбора данных и последовательно соединенные фотодиодный детектор и измеритель мощности. Применение данной группы изобретений позволит повысить выживаемость в iPSC-производных нейронах человека с мутациями, связанными с различными наследственными формами. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к способам неинвазивного воздействия на ткани мозга и устройствам для его осуществления, и может быть использовано для восстановления и защиты функциональных свойств нейрональных тканей при нейродегенеративных нарушениях, в частности, при болезни Паркинсона.
Болезнь Паркинсона (БП) - второе по распространенности нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера, характеризующееся потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции с последующей обширной потерей не дофаминергических нейронов (Gandhi S. et al. PINK1-associated Parkinson's disease is caused by neuronal vulnerability to calcium-induced cell death // Molecularcell. - 2009. - V. 33. - №. 5. - P. 627-638). Симптомы ранней БП обычно трудно распознать, при этом латентный период от потери дофаминергических нейронов до появления симптомов составляет около 5 лет. В дополнение к таким тяжелым проявлениям БП как тремор, брадикинезия, беспокойство, депрессия и когнитивные нарушения, люди с БП страдают многочисленными сопутствующими заболеваниями: частыми инфекционными болезнями, сердечными, психическими и желудочно-кишечными расстройствами, вегетативными дисфункциями, затруднениями глотания, нарушениями сна, речи, а также травмами, связанными с потерей координации. Перед появлением симптомов у пациентов развиваются патологические изменения в головном мозге на клеточном уровне, которые не выявляются при скрининговой диагностике, например, методом магнитно-резонансной томографии. БП главным образом поражает пожилых людей и поэтому становится проблемой с высоким приоритетом из-за тенденции общего старения населения. В Европе распространенность БП составляет примерно 160 случаев на 100000 человек в возрасте старше 65 лет, и эта частота заболеваемости имеет тенденцию к росту в ближайшие годы (Dorsey Е.R. et al. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations, 2005 through 2030 // Neurology. - 2007. - V. 68. - №. 5. - P. 384-386).
В настоящий момент существует несколько одобренных лекарственных препаратов, облегчающих ограниченное число симптомов БП. Недостатком таких средств является отсутствие возможности изменения патологических процессов, лежащих в основе БП.
Одним из перспективных направлений по устранению патологических состояний, вызванных БП, является применение фотобиомодуляции (ФБМ) для предотвращения процессов гибели клеток нейрональных тканей мозга.
Первые попытки лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы с применением излучения аргонового лазера для защиты клеток тканей от гибели были предприняты в 1960-х годах (Fork R.L. Laser stimulation of nerve cells in Aplysia // Science. - 1971. - V. 171. - №. 3974. - P. 907-908), вскоре после этого была опубликована работа о положительном воздействии излучения рубинового лазера (Mester Е. et al. The stimulating effect of low power laser rays on biological systems. - Medical Univ., Budapest, 1968).
Для ФБМ характерно использование красного или ближнего инфракрасного оптического излучения на уровнях интенсивности, которые не приводят к существенному нагреву ткани. Внедрение светодиодов сделало этот подход более доступным, так как светодиоды безопаснее и дешевле, чем ранее использовавшиеся лазерные источники. Еще одним фактором, который привел ФБМ к более широкому распространению, является существенный прогресс в понимании механизмов действия лазерного излучения на молекулярном и клеточном уровнях. В частности, понимание молекулярных механизмов функционирования мозга позволяет оценить возможные эффекты воздействия оптического излучения на нервные клетки. Одним из физиологических примеров естественной ФБМ является регуляция секреции мелатонина эпифизом под воздействием видимого света для поддержания циркадного ритма и сна (Hattar S. et al. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity // Science. - 2002. - V. 295. - №. 5557. - P. 1065-1070).
Несмотря на то, что в развитие нейродегенеративных заболеваний вовлечены разные типы тканей и клеток, в большинстве случаев инициирующие факторы их возникновения связаны с митохондриальными патологиями (Lezi Е., Swerdlow R.Н. Mitochondria in neurodegeneration //Advances in Mitochondrial Medicine. - 2012. - №942. - P. 269-286). Известны три белковые структуры, способные поглощать свет в диапазоне инфракрасного излучения: гемоглобин, миоглобин и цитохром с-оксидаза (Jobsis F.F. et al. Reflectance spectrophotometry of cytochrome aa3 in vivo // Journal of applied physiology. - 1977. - V. 43. - №. 5. - P. 858-872; Cooper С.E., Springett R. Measurement of cytochrome oxidase and mitochondrial energetics by near-infrared spectroscopy // Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. - 1997. - V. 352. - №. 1354. - P. 669-676, Galkin A. et al. Synthesis of optically active amino acids from alpha-keto acids with Escherichia coli cells expressing heterologous genes // Applied and environmental microbiology. - 1997. - V. 63. - №. 12. - P. 4651-4656). В то же время, только цитохром с-оксидаза напрямую связана с митохондриальной функцией и воздействие на нее потенциально может иметь терапевтический эффект для предотвращения и лечения нейродегенеративных заболеваний.
Цитохром с-оксидаза (комплекс IV митохондриальной электронной транспортной цепи) - терминальный фермент аэробной дыхательной цепи, катализирующий окисление цитохрома-с и восстановление молекулярного кислорода до воды. Комплекс IV вместе с комплексами I и III активно переносит протоны из митохондриального матрикса в межмембранное пространство, создавая протонный, а также электростатический градиенты. Обратный поток протонов управляет синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) из аденозиндифосфата (АДФ) и фосфата комплексом V. Известно, что атомы меди в цитохром с-оксидазе поглощают свет в видимом и инфракрасном диапазонах спектра (Gibson Q.Н. etal. The reaction of cytochrome oxidase with cytochrome с // Journal of Biological Chemistry. - 1965. - V. 240. - №. 2. - P. 888-894, Karu T. Primary and secondary mechanisms of action of visible to near-IR radiation on cells // Journal of Photochemistry and photobiology B: Biology. - 1999. - V. 49. - №. 1. - P. 1-17). Таким образом, воздействие лазерного излучения на данный фермент является одним из главных возможных механизмов ФБМ живых клеток.
Имеется относительно мало работ по влиянию ФБМ на первичные нейроны, главным образом, вследствие того, что последние являются технически сложными для культивирования объектами. В то же время первичные культуры нейронов являются более адекватной моделью для исследования эффектов от влияющих агентов, чем клеточные линии, большинство из которых имеют раковое происхождение.
В работе по ФБМ на первичных нейронах (Wong-Riley М. Т. Т. etal. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins: role of cytochrome с oxidase //Journal of Biological Chemistry. - 2005. - V. 280. - №. 6. - P. 4761-4771) были исследованы эффекты от воздействия инфракрасным излучением на культивируемые нейроны. Среди протестированных длин волн (670, 728, 770, 830 и 880 нм) наиболее эффективные (830 и 670 нм) соответствовали спектру поглощения окисленной цитохром с-оксидазы в ближнем инфракрасном диапазоне. Обнаруженные эффекты от облучения объяснялись поглощением цитохром с-оксидазой и увеличением продукции активных форм кислорода (АФК). Работа выполнялась на первичных культивируемых нейронах зрительной коры, подвергнутых воздействию излучения светодиодами различных длин волн. Повышение концентрации АТФ в клетке связано с клеточным метаболизмом и считается показателем жизнеспособности и здоровья клетки. Эти результаты показывают положительное влияние оптического излучения на клеточный метаболизм в культурах нейронных клеток in vitro.
ФБМ стимулирует синтез АТФ главным образом за счет активации цитохром с-оксидазы, при этом ингибитор этого фермента должен ослаблять действие ФБМ дозозависимым образом. Цианид (KCN) - известный мощный ингибитор цитохром с-оксидазы (Wikstrom М., Krab K.., Saraste М. Cytochromeoxidase-a synthesis. - AcademicPress, New York, 1981; (b) MF, 1981) - является цитотоксичным веществом. Даже в концентрации 10 MKMKCN вызывает значительное снижение активности данного фермента в культивируемых первичных нейронах. В концентрации от 10 до 10000 мкМ KCN индуцирует прогрессирующее снижение активности ферментов и жизнеспособности клеток. Ранее было показано, что воздействие лазерного излучения с длиной волны 670 нм, мощностью 4 Дж/см2 в течение 80 секунд два раза в день в течение 5 дней подряд способно компенсировать токсическое действие KCN (10-100 мкМ) на активность ферментов в первичных нейронах. Однако внесение более высоких концентраций KCN (более 1000 мкМ) приводило к увеличению гибели нейронов и компенсировало любое положительное воздействие лазерного излучения (Wong-Riley М. Т. Т. et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins: role of cytochrome с oxidase // Journal of Biological Chemistry. - 2005. - V. 280. - №. 6. - P. 4761-4771).
В работе (Sharma S.K. et al. Dose response effects of 810 nm laser light on mouse primary cortical neurons // Lasers in surgery and medicine. - 2011. - V. 43. - №. 8. - P. 851-859) было установлено, что воздействие дозой 3 Дж/см2 лазерного излучения с длиной волны 810 нм дает улучшенную стимуляцию нейронов коры головного мозга. ФБМ повышала митохондриальный мембранный потенциал (ММП) выше исходного уровня, с повышением уровня АТФ и снижением продукции АФК и оксида азота (NO). Однако, если доза превышает оптимальные значения (в 100 раз больше в Дж/см2) ММП и продукция АТФ снижаются ниже исходного уровня, то наблюдается повышение уровней АФК и NO. Если клетки подвергаются негативным воздействиям, таким как окислительный стресс или эксайтотоксичность, снижающим уровень АТФ и жизнеспособность клеток, эффект ФБМ заключается в поднятии ММП до исходного уровня и увеличении уровня АТФ. Так как нейроны - это клетки с высоким уровнем метаболизма и более высокой активностью митохондрий в сравнении со многими другими типами клеток, положительные эффекты ФБМ в них могут быть более выражены, чем в других клетках. Возможно, это является причиной, почему ткани мозга лучше реагирует на ФБМ.
Потеря способности к апоптозу у клеток является основой в развитии многих патологических процессов, включая канцерогенез и неконтролируемую пролиферацию. Существует механизм индукции и ингибирования апоптоза с помощью синглетного кислорода. Синглетный кислород является АФК, участвующей в клеточной сигнализации таких процессов, как экспрессия генов, фотостарение и апоптоз (Zhuang S., Demirs J.Т., Kochevar I.E. Proteinkinase С inhibits singlet oxygen-induced apoptosis by decreasing caspase-8 activation // Oncogene. - 2001. - V. 20. - №. 46. - P. 6764-6776). Синглетный кислород - это общее название электронно-возбужденного состояния триплетного кислорода, которое менее стабильно, чем молекулярный кислород в основном электронном состоянии. Несмотря на высокую реакционную способность, время жизни синглетного кислорода в водных растворах выше, чем у большинства других АФК, за исключением перекиси водорода. С учетом этого синглетный кислород может участвовать в ряде физиологических процессов в качестве сигнальной и стимулирующей молекулы или в тех же реакциях, что и триплетный кислород, но с более высокой реакционной способностью. Имеются данные, что синглетный кислород образуется в клеточных ферментативных реакциях в ряде пероксидазных ферментов, включая миелопероксидазу, лактопероксидазу, хлоропероксидазу, во время реакций, катализируемых липоксигеназой (Davies М.J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen // Photochemical & Photobiological Sciences. - 2004. - V. 3. - №. 1. - P. 17-25). Потенциально синглетный кислород может выделяться при разложении гидропероксидных липидов. Кроме того, синглетный кислород может образовываться в клетках под воздействием оптического излучения в присутствии фотосенсибилизаторов, которые способны продуцировать ряд других АФК. Данное свойство лежит в основе механизма их фототоксичности, которая может использована для селективного повреждения опухолевых тканей.
Такой подход активно применяется в фотодинамической терапии опухолевых заболеваний (Soleymani Т., Abrouk М., Kelly К. М. An analysis of laser therapy for the treatment of nonmelanoma skin cancer // Dermatologic surgery: official publication for American Society for Dermatologic Surgery [et al.]. - 2017. - V. 43. - №. 5. - P. 615).
Низкие дозы синглетного кислорода могут запускать физиологический митохондриальный биогенез за счет производства супероксида из убисемихинона, при этом более длительное окислительное воздействие является токсичным (Cadenas Е., Davies K. J. A. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging // Free radical biology and medicine. - 2000. - V. 29. - №. 3-4. - P. 222-230). Способность инфракрасного лазерного излучения с длиной волны 1267 нм производить синглетный кислород в органическом растворе и в линии раковых клеток была продемонстрирована в работе по исследованию продукции синглетного кислорода (Anquez, F. Chapter 4 Production of Singlet Oxygen by Direct Photoactivation of Molecular Oxygen / F. Anquez, A. Sivery, I.E. Yazidi-Belkoura, J. Zemmouri, P. Suret, S. Randoux, E. Courtade // Singlet Oxygen: Applications in Biosciences and Nanosciences, Volume 1. The Royal Society of Chemistry. - 2016. - V. 1. - P. 75-91). Также показано, что глубина проникновения оптического излучения в интервале 1000-1350 нм по сравнению с излучением в интервале 700-1000 нм выше на 10% для тканей костей черепа и кожи, и на 35% - для тканей мозга (GolovynskyiS. et al. Optical windows for head tissues in near-infrared and short-wave infrared regions: Approaching transcranial light applications //Journal of biophotonics. - 2018. - T 11. - №. 12. - P. e201800141).
Для проведения ФБМ с целью предотвращения процессов нейродегенерации (патент US 2009254154, МПК A61F 7/00; A61N 5/06, 2009 г.) предлагается использовать лазерную импульсную терапию на длине волны 808 нм. Предложенным способом было достигнуто снижение амилоидной нагрузки в тканях мозга трансгенных мышей, склонных формировать амилоидные фибриллы к 6-месячному возрасту, приводящих к развитию болезни Альцгеймера. Недостатком данного метода является необходимость длительного курса облучения, в течение двух минут 3 раза в неделю на протяжении 6 месяцев, кроме этого, эффективность фототерапии доказана только при развитии начальных стадий патологии, которые на сегодняшний день не могут быть диагностированы в большинстве случаев.
Известен метод лечения неврологических расстройств, который осуществляется посредством воздействия с длинами волн от 200 до 2000 нм с мощностью от 10,01 до 20,00 Вт с одновременной терапией кетамином. Длительность каждой процедуры воздействия варьируется от 30 с до 30 мин, и может проводиться как в непрерывном, так и в импульсном режиме в ближнем инфракрасном диапазоне для минимизации нагрева поверхности ткани. Также предлагается использовать импульсное управление с периодом 1-1000 мс при дозе лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона 0,64-1,95 Дж/см2 (патент US 20180111004, МПК А61В 6/00; А61В 6/03; A61K 31/135; A61N 5/06, 2018 г.).
Недостатком данного метода является применение инфузий кетамина с целью активации внутренних процессов восстановления мозга, так как сопряжено с рисками угнетения дыхательного центра и центральной нервной системы.
Наиболее близким по технической сущности решением является способ, заключающийся в применении лазерного излучения с длиной волны 808 нм и мощностью 50 мВт/см2 на нейрональных клетках-предшественниках человека, который позволяет достичь двукратного повышения жизнеспособности клеток в сравнении с интактной культурой (патент US 2010105977; МПК А61Н 21/00, 2001 г.).
Недостатком указанного способа является то, что предлагаемая длина волны имеет не самую высокую проникающую способность в ткани головы в сравнении с другими используемыми областями ближнего инфракрасного излучения.
Известно устройство для обработки стволовых клеток с целью улучшения клеточной терапии для восстановления неврологических функций пациента при поражениях мозга, представленное лазером с длиной волны 808 нм и мощностью 50 мВт/см2, направленным с помощью адаптера и волоконно-оптического кабеля к поверхности клеточной культуры и позволяющим увеличить реакцию стволовых клеток на факторы дифференциации (например, факторы роста) по сравнению с контрольными клетками и повысить устойчивость к неблагоприятным факторам, таким как гипоксия (патент US 10913943 B2; МПК A61N 5/06, C12N 13/00, 2010 г.).
Также известно устройство для проведения стимуляции митогенных факторов и выживаемости клеточных культур, характеризующееся применением источника лазерного излучения, который имеет длину волны около 810 нм, плотность мощности около 1 мВт/см2, 50 мВт/см2 или 100 мВт/см2 и общую дозу излучения около 0,2-10 Дж (патент WO 2006105254 А2; МПК H01L 27/00, 2005 г.)
Общими недостатками указанных выше устройств является отсутствие данных в примере реализации изобретения об эффективности воздействия лазерного излучения на клетках, имеющих патологические изменения, что не может быть подтверждением заявляемых терапевтических свойств при поражении тканей мозга. Кроме этого, устройства не позволяют контролировать изменения температуры поверхности стекла с клеточной культурой, что затрудняет интерпретацию полученных результатов в связи с возможностью изменения исследуемых параметров под действием теплового эффекта от воздействия лазерного излучения.
Известно устройство для измерения температуры, позволяющее измерять температуру с контактной поверхности, содержащее датчики температуры, скомпонованные на различных глубинах относительно контактной поверхности (патент RU 2489690 C2; МПК G01K 1/16, МПК G01K 7/42,2013 г.).
Недостатком данного устройства является трудность его применения для измерения температуры тонкой стеклянной подложки с культурой живых клеток мозга при облучении лазерным излучением.
Технической задачей изобретения является защита нейронов и повышение их жизнеспособности на примере БП, благодаря восстановлению митохондриальной функции клеток мозга.
Поставленная задача защиты нейронов при БП достигается облучением клеточной культуры лазерным излучением ближнего инфракрасного диапазона с длиной волны 1267 нм, имеющим высокую проникающую способность в комплекс тканей головы, при выходной мощности от 65 до 187 Дж/см2 с дополнительным контролем температуры, для генерации низких доз синглетного кислорода. После облучения клетки выдерживаются в течение суток в инкубаторе для накопления эффекта от ФБМ. Для реализации поставленной задачи используется устройство для защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, содержащее персональный компьютер (ПК) с программным обеспечением, параллельно соединенные с ним драйверы, каждый из которых соединен с соответствующим блоком питания и через соответствующий источник непрерывного лазерного излучения подключен к волоконно-оптическому кабелю, соединенному с коллиматором, а также последовательно соединенные прецизионный датчик температуры, включенный в разработанную мостовую схему измерения с компенсацией нелинейности функции преобразования, аналого-цифровой преобразователь (АЦП) платы сбора данных и последовательно соединенные фотодиодный детектор и измеритель мощности.
Технический результат заключается в повышении выживаемости в iPSC-производных нейронах человека с мутациями, связанными с различными наследственными формами, при их облучении лазерным излучением с длиной волны 1267 нм в сравнении с клетками, которые не подвергались облучению.
Сущность изобретения поясняется следующими графическими материалами.
На фиг. 1 представлена схема устройства для защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях; на фиг. 2 - график изменения температуры под воздействием лазерного излучения в области исследования; на фиг. 3 - график контроля индуцирования синглетного кислорода в культуре клеток под воздействием лазерного излучения; на фиг. 4 - гистограммы контроля клеточной смерти после воздействия лазерного излучения.
Способ осуществляют путем облучения клеточной культуры с помощью разработанного устройства (фиг. 1), содержащего источники 1 и 2, выходы которых через волоконно-оптический кабель 3 связаны с коллиматором 4. Вход источника 1 через драйвер 5 соединен с выходом ПК 6, а вход источника 2 через драйвер 7 соединен с другим выходом ПК 6, при этом вход драйвера 5 связан с блоком 8 питания, а вход драйвера 7 - с блоком 9 питания. Для контроля мощности лазерного излучения на выходе коллиматора 4в процессе проведения исследований установлен измеритель мощности 10, соединенный с фотодиодным детектором 11 для регистрации излучения в спектральном диапазоне 200-1100 нм и ПК 6. Для контроля изменения температуры к ПК 6 подключены последовательно соединенные прецизионный датчик 12 температуры (М622 Pt 2000, Heraeus, Германия), включенный в мостовую схему 13 измерения с компенсацией нелинейности функции преобразования и АЦП 14и ПК 6.
В качестве источников 1 и 2 непрерывного лазерного изучения используются лазерные диоды LD-1267-PM-500 и LD-1122-РМ-500 (Innolume GmbH, Германия), обеспечивающие воздействие на длинах волн 1276 и 1122 нм соответственно. Источник 2 с длиной волны 1122 нм добавлен в качестве контрольного лазера сравнения с целью обоснования использования длины волны 1267 нм источника 1 для выработки синглетного кислорода. Для питания источников 1 и 2 и изменения режимов их работы применяются специализированные драйверы 5и 7 с блоками 8 и 9 питания (SF8150-ZIF14, OOO «МАЙМАН ЭЛЕКТРОНИКС», Россия) соответственно. Управление работой источников 1 и 2 осуществляют через ПК 6 с помощью программного обеспечения MaimanBenchSoft. Доставку лазерного излучения от источников 1 и 2 к объекту исследования осуществляют с применением специально изготовленного волоконно-оптического кабеля 3с использованием кварцевого волокна, обеспечивающего передачу излучения с минимальным затуханием сигнала в спектральном диапазоне 400-2000 нм и числовой апертурой NA=0,22. Для формирования параллельного пучка световых лучей после волоконно-оптического кабеля 3 установлен коллиматор 4 (F280FC-C, ThorLabs, Inc., Германия). Применение коллиматора 4 позволяет обеспечить воспроизводимость экспериментальных исследований за счет исключения зависимости изменения освещенности объекта исследования от расстояния до торца волоконно-оптического кабеля 3 при расходящемся световом пучке. Диаметр пучка лазерного излучения на выходе коллиматора 4 при проведении исследований составляет 3,4 мм.
Перед проведением исследований была установлена зависимость между оптической мощностью на выходе волоконно-оптического кабеля 3и током блоков питания 8 и 9 для каждого из источников лазерного излучения 1 и 2 с помощью измерителя мощности 10 (РМ400, ThorLabs, Inc., Германия), соединенного с фотодиодным детектором 11(S122C, ThorLabs, Inc., Германия).
Важным параметром при проведении исследований, объектом которых выступают клеточные культуры, является температура среды, которая не должна превышать 37°С, в противном случае регистрируемые параметры и исследуемые механизмы будут изменяться под действием теплового эффекта. Для исключения данного фактора предварительно определена зависимость изменения температуры на поверхности покровного стекла с исследуемой культурой клеток от воздействия лазерного излучения с помощью прецизионного датчика 12 температуры (М622 Pt 2000, Heraeus, Германия), с инерционностью 0,25 с, порогом чувствительности 0,05°С, имеющего габаритные размеры 5,9×2,1 мм. Аналоговый сигнал, поступающий через АЦП 12 платы сбора данных (National Instruments, США) в ПК 13, обрабатывался в последнем с помощью разработанной программы в среде LabVIEW.
Полученные результаты (фиг. 2) показали, что воздействие лазерного излучения провоцировало изменение температуры в области исследования, однако уровень температуры в момент воздействия лазерного излучения был ниже 37°С, при этом прирост температуры (ΔT) составлял менее 6°С (ΔT (1267 нм, кривая 15) = 5,44°С; ΔT (1122 нм, кривая 16) = 2,14°С).
Для контроля генерации синглетного кислорода (фиг. 3) в культуре клеток под воздействием лазерного изучения (кривые 17 и 18 на длинах волн 1267 и 1122 нм соответственно) был использован флуоресцентный зонд Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) (Thermo Fisher Scientific Inc., США), который является коммерчески доступным флуоресцентным зондом. По данным, предоставленным компанией Thermo Fisher Scientific Inc., SOSG отличается высокой селективностью по отношению к синглетному кислороду и не проявляет заметной активности в отношении других АФК, включая гидроксильный радикал и супероксид (Singlet Oxygen Sensor Green Reagent, Product Information. // Molecular Probes / Thermo Fisher Scientific. - 2004. - 1-2 p.). Изначально зонд обладает слабой синей флуоресценцией с максимумами возбуждения 372 и 393 нм и эмиссией с максимумами 395 и 416 нм. При взаимодействии с синглетным кислородом, происходит его окисление, продукт которого характеризуется зеленой флуоресценцией, близкой к испусканию флуоресцеина (полосы возбуждения/испускания - 504/525 нм). Так как SOSG деградирует со временем, это обстоятельство было учтено в проведении эксперимента. Каждый раз использовался свежеприготовленный раствор SOSG. Регистрацию флуоресценции зонда осуществляли с помощью конфокального микроскопа ZEISS LSM 900 с системой Airyscan 2 (CarlZeiss AG, Германия) при возбуждении на длине волны 488 нм.
Загрузка клеточной культуры SOSG (10 мМ) приводит к медленному окислению этого зонда. При включении лазерного излучения с длиной волны 1267 нм наблюдалось резкое возрастание интенсивности флуоресценции. При облучении клеточной культуры лазерным излучением с длиной волны 1122 нм интенсивность флуоресценции SOSG практически не изменилась.
Нейропротекторный эффект от воздействия лазерным излучением с длиной волны 1267 нм исследовался на человеческих нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), которые, в свою очередь, получены из фибробластов пациентов с наследственными формами БП, а именно с мутацией гена, кодирующего PINK1 (homozygous p.Try90Leufsxl2) и мутацией гена, кодирующего альфа-синуклеин (SNCA х3). Все iPSCs были получены от доноров, которые дали подписанное информированное согласие на вывод линий iPSCs из биопсии кожи (1М1 программа ЕС StemBANCC). Для репрограммирования фибробластов применяли набор CytoTune-iPS (ThermoFisher Scientificlnc, США) посредством экспрессии ОСТ4, SOX2, KLF4 и c-MYC четырьмя отдельными вирусными векторами Sendai. Наличие мутаций у пациентов подтверждено последовательностью Сенгера (GENEWIZ). iPSCs культивировали на Geltrex (ThermoFisher Scientificlnc, США) в среде Essential 8 (ThermoFisher Scientific Inc., США) с добавлением 0,5 мМ EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Нейрональная индукция была выполнена через SMAD-ингибирование с использованием SB431542 (Tocris, Великобритания) и дигидрохлорида дорсоморфина (Tocris, Великобритания) в средах N2B27 - DMEM (Gibco, США); F12 + глутамакс, нейробазальная среда, с добавлением В28, N2, глутамакса, инсулина, незаменимых аминокислот, 2-меркаптоэтанол, пенициллина/стрептомицина. Клетки были сначала пассированы с диспазой (Thermo Fisher Scientiric Inc., США) на 10 день после первого появления нейроэпителиального листка. При появлении нейронных розеток на 20-21 день клетки снова пересаживали с использованием диспазы. Клетки были пересажены еще три раза, прежде чем использовались в эксперименте на 70-90 день культивирования. Все линии были протестированы на наличие микоплазмы.
ФБМ лазерным излучением с длиной волны 1267 нм оценивали по клеточной смерти (фиг. 4) в интактной группе 19 и группах с разными дозами облучения 20 и 21, соответствующие 65 и 187 Дж/см2, через 24 часа после воздействия. Клетки инкубировали cPI (Invitrogen, США) и Hoechst 33342 (Invitrogen, США) в течение 30 минут при температуре 30-37°С. По истечении времени исследуемые клетки подвергали трехкратной отмывке раствором Хенкса (Gibco, США). Жизнеспособные клетки не способны накапливать красный флуоресцентный Р1, который аккумулируется в ядрах клеток с нарушенной проницаемостью плазматической мембраны, тогда как Hoechst (Invitrogen, США) окрашивает ДНК во всех клетках, что позволяет количественно определять мертвые клетки по отношению к общему количеству клеток. Интенсивность флуоресценции используемых красителей оценивали с помощью конфокального микроскопа ZEISS LSM 900 с системой Airyscan 2 (CarlZeiss AG, Германия) в двухволновом режиме (длины волн возбуждения - 405 и 561 нм). Для обработки результатов по оценке жизнеспособности культуры клетки подсчитывали в «синем» (Hoechst (Invitrogen, США)) и «красном» (PI (Invitrogen, США)) каналах с помощью программы ImageJ плагина Cell Counter.
По итогам полученных данных были построены соответствующие графические зависимости. Данные клеточной смерти представлены в виде гистограммы процента нежизнеспособных клеток от общего числа клеток в исследуемом участке в каждой экспериментальной группе. Каждый из представленных на гистограмме (фиг. 4) столбцов является средним из трех независимых экспериментов, в каждом из которых было исследовано не менее 100 клеток.
Значимость статистических различий выборок была оценена с помощью однофакторного дисперсионного анализа (One-way ANOVA). Уровень значимости р<0,01 считался существенным. В результате исследования выявлено, что заявляемый способ защиты нейронов при болезни Паркинсона с помощью использования лазерного излучения с длиной волны 1267 нм, обладает большой эффективностью. Повышение выживаемости клеток достигалось за счет того, что лазерное излучение с длиной волны 1267 нм вызывает генерацию синглетного кислорода в исследуемой культуре клеток, который оказывает воздействие на биоэнергетику клетки.
Способ защиты нейронов для защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях может быть, проиллюстрирован на следующих примерах.
Пример 1.
Для изучения нейропротекторных свойств низких доз синглетного кислорода, вырабатывающихся после воздействия лазерным излучением с длиной волны 1267 нм, были использована нейроны человека с мутацией PINK 1 (homozygous p.Try90Leufsxl2), связанной с аутосомно-рецессивной БП. При данной патологии клетки имеют значительные нарушения в биоэнергетике клетки, включая снижение ММП, изменения окислительно-восстановительных процессов, а также нарушения процессов дыхания клетки и повышенную чувствительность к стимуляции кальцием и связанное с этим открытие митохондриальных пор.
При оценке влияния лазерного излучения с длиной волны 1267 нм было зарегистрировано снижение клеточной смерти на 33% при использовании мощности, равной 65 Дж/см2 и на 44% при 187 Дж/см2. В сравнении с клетками, которые не подвергались облучению (фиг. 4).
Пример 2.
Нейропротекторный эффект от воздействия лазерным излучением с длиной волны 1267 нм исследовался на нейронах человека с мутацией альфа-синуклеина (SNCA x3), ответственного за аутосомно-доминантную БП.
Ген SNCA кодирует белок, состоящий из 140 аминокислот под названием альфа-синуклеин. Мутации в гене SNCA приводят к агрегации альфа-синуклеина. Патологическое отложение агрегированного альфа-синуклеина приводит к нарушениям протеасомной деградации, стрессу эндоплазматического ретикулума, повышению внутриклеточного кальция и ухудшению митохондриальной эффективности.
При оценке влияния лазерного излучения с длиной волны 1267 нм было зарегистрировано снижение клеточной смерти на 42% при выходной мощности, равной 65 Дж/см2 и 58% при 187 Дж/см2, в сравнении с клетками, которые не подвергались облучению (фиг. 4).
Claims (2)
1. Способ исследования защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, характеризующийся облучением клеточной культуры лазерным излучением ближнего инфракрасного диапазона с длиной волны 1267 нм, при дозе облучения от 65 до 187 Дж/см2 с дополнительным контролем температуры поверхности покровного стекла с исследуемой культурой клеток для генерации низких доз синглетного кислорода.
2. Устройство для исследования защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, содержащее персональный компьютер с программным обеспечением, параллельно соединенные с ним драйверы, каждый из которых соединен с соответствующим блоком питания и через соответствующий источник непрерывного лазерного излучения подключен к волоконно-оптическому кабелю, соединенному с коллиматором, а также последовательно соединенные прецизионный датчик температуры, включенный в мостовую схему измерения с компенсацией нелинейности функции преобразования, аналого-цифровой преобразователь платы сбора данных и последовательно соединенные фотодиодный детектор и измеритель мощности.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2783111C1 true RU2783111C1 (ru) | 2022-11-09 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117618105A (zh) * | 2024-01-25 | 2024-03-01 | 浙江巴泰医疗科技有限公司 | 激光消融探头的功率控制系统及控制方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2489690C2 (ru) * | 2008-08-28 | 2013-08-10 | Кембридж Темприче Консептс Лимитед | Структура датчика температуры |
| RU2731813C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2020-09-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем точной механики и управления Российской академии наук | Способ управляемой лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов |
| RU2737704C2 (ru) * | 2020-05-15 | 2020-12-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России) | Способ интраоперационной фотодинамической терапии в комбинированном лечении местно-распространенных сарком мягких тканей |
| RU2740123C1 (ru) * | 2019-12-27 | 2021-01-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Способ лазерной биомодуляции и повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2489690C2 (ru) * | 2008-08-28 | 2013-08-10 | Кембридж Темприче Консептс Лимитед | Структура датчика температуры |
| RU2731813C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2020-09-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем точной механики и управления Российской академии наук | Способ управляемой лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов |
| RU2740123C1 (ru) * | 2019-12-27 | 2021-01-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Способ лазерной биомодуляции и повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера |
| RU2737704C2 (ru) * | 2020-05-15 | 2020-12-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России) | Способ интраоперационной фотодинамической терапии в комбинированном лечении местно-распространенных сарком мягких тканей |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117618105A (zh) * | 2024-01-25 | 2024-03-01 | 浙江巴泰医疗科技有限公司 | 激光消融探头的功率控制系统及控制方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Salehpour et al. | Penetration profiles of visible and near-infrared lasers and light-emitting diode light through the head tissues in animal and human species: a review of literature | |
| De Jager et al. | Ultraviolet light induced generation of reactive oxygen species | |
| Rojas et al. | Low-level light therapy of the eye and brain | |
| Karu | Low-power laser therapy | |
| JP6714606B2 (ja) | 脳の非侵襲的神経刺激療法のための方法、システム及び装置 | |
| Karu | Cellular and molecular mechanisms of photobiomodulation (low-power laser therapy) | |
| Hamblin et al. | Mechanisms of low level light therapy | |
| Migliario et al. | Near infrared low‐level laser therapy and cell proliferation: The emerging role of redox sensitive signal transduction pathways | |
| Karu et al. | Exact action spectra for cellular responses relevant to phototherapy | |
| Osborne et al. | Visual light effects on mitochondria: The potential implications in relation to glaucoma | |
| Finlay et al. | Photobleaching kinetics of Photofrin in vivo and in multicell tumour spheroids indicate two simultaneous bleaching mechanisms | |
| Morstein et al. | New players in phototherapy: photopharmacology and bio-integrated optoelectronics | |
| US9610460B2 (en) | Light therapy treatment | |
| Azeemi et al. | The mechanistic basis of chromotherapy: Current knowledge and future perspectives | |
| Ateş et al. | Indocyanine green-mediated photobiomodulation on human osteoblast cells | |
| Kashiwagi et al. | Photobiomodulation and nitric oxide signaling | |
| GB2479030A (en) | Photo-dynamic therapy device | |
| Hamblin et al. | Low level laser (light) therapy and photobiomodulation: the path forward | |
| Topaloglu et al. | Mechanistic approaches to the light-induced neural cell differentiation: Photobiomodulation vs Low-Dose Photodynamic Therapy | |
| Tian et al. | Photobiomodulation for Alzheimer’s disease: photoelectric coupling effect on attenuating Aβ neurotoxicity | |
| Li et al. | Light modulation of brain and development of relevant equipment | |
| Chamkouri et al. | Brain photobiomodulation therapy on neurological and psychological diseases | |
| RU2783111C1 (ru) | Способ защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и устройство для его осуществления | |
| Chen et al. | Effects of photobiomodulation on high glucose induced oxidative stress in human embryonic skin fibroblasts | |
| Knels et al. | Effects of narrow‐band IR‐A and of water‐filtered infrared A on fibroblasts |