RU2782951C1 - Способ обнаружения ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе - Google Patents
Способ обнаружения ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782951C1 RU2782951C1 RU2021139115A RU2021139115A RU2782951C1 RU 2782951 C1 RU2782951 C1 RU 2782951C1 RU 2021139115 A RU2021139115 A RU 2021139115A RU 2021139115 A RU2021139115 A RU 2021139115A RU 2782951 C1 RU2782951 C1 RU 2782951C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hepatitis
- hbv
- virus
- amplification
- dna
- Prior art date
Links
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims abstract description 108
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 82
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 title claims abstract description 42
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 114
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 113
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 61
- 229920002391 Guide RNA Polymers 0.000 claims description 61
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 61
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 28
- 241001112693 Lachnospiraceae Species 0.000 claims description 21
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 11
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 73
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 64
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 13
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 8
- 229920000033 CRISPR Polymers 0.000 description 7
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 6
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 4
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 3
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 3
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 2
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 2
- 210000003563 Lymphoid Tissue Anatomy 0.000 description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710016786 P/C Proteins 0.000 description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 2
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 2
- 229920001891 Small hairpin RNA Polymers 0.000 description 2
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 101710036216 ATEG_03556 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010082319 CRISPR-Associated Protein 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000343557 CRISPR-associated endonuclease Cas12a Proteins 0.000 description 1
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000015084 HIV Reverse Transcriptase Human genes 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 238000010629 Molecular evolutionary genetics analysis Methods 0.000 description 1
- 101710003000 ORF1/ORF2 Proteins 0.000 description 1
- 101700030467 Pol Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000520334 Uca Species 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000407 conserved sequence Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 101700031964 mcrA Proteins 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 101700084252 recA1 Proteins 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 101710004466 rgy Proteins 0.000 description 1
- 101710030364 rgy1 Proteins 0.000 description 1
- 101710030359 rgy2 Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к олигонуклеотидам для предварительной амплификации высококонсервативных участков генома вируса гепатита В и к содержащему их набору. Изобретение позволяет эффективно выявлять ДНК вируса гепатита В после проведения специфической амплификации фрагментов генома этого вируса. Изобретение обеспечивает выявление единичных копий ДНК вируса гепатита В. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 13 ил., 5 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) ДНК вируса гепатита В, а также к диагностическим способам и наборам.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии ДНК вируса гепатита В.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции ДНК вируса гепатита В после проведения специфической амплификации фрагментов генома вируса гепатита В. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПНР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов [J.S. Chen, Е. Ma, L.B. Harrington et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-9, doi: 10.1126/science.aar6245].
He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге [J.S. Gootenberg, О.О. Abudayyeh, J.W. Lee et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science 356(6336) (2017) 438-42, doi: 10.1126/science.aam9321].
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках [J.S. Gootenberg, О.О. Abudayyeh, M.J. Kellner et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science 360(6387) (2018) 439-44, doi: 10.1126/science.aaq0179].
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ [С.Myhrvold, С.А. Freije, J.S. Gootenberg et al., Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13, Science 360(6387) (2018) 444-8, doi: 10.1126/science.aas8836].
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.
В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку технологий для выявления вируса гепатита В in vitro, основанных на применении белков систем направленного редактирования генома.
В 2020 году Zhou R. и соавторы описали способ выявления ДНК вируса гепатита В с помощью белка Cas12a и технологии плазмонной петлевой изотермической амплификации (LAMP) с ортогональным цветовым выводом. Чувствительность описанного метода составляла 140 копий ДНК вируса гепатита В на реакцию [R. Zhou, Y. Li, Т. Dong, Y. Tang, F. Li, A sequence-specific plasmonic loop-mediated isothermal amplification assay with orthogonal color readouts enabled by CRISPR Cas12a, Chemical communications (Cambridge, England) 56(24) (2020) 3536-3538, https://doi.org/10.1039/d0cc00397b].
Cas12a также был использован для выявления ДНК вируса гепатита В в методе, основанном на применении петлевой изотермической амплификации (LAMP) для предварительной амплификации. Визуализация результатов анализа возможна как с помощью флуоресцентного индикатора, так и с помощью тест-полосок. Чувствительность описанной платформы составляла 25 копий ДНК вируса гепатита В на реакцию [R. Ding, J. Long, М. Yuan, X. Zheng, Y. Shen, Y. Jin, H. Yang, H. Li, S. Chen, G. Duan, CRISPR/Cas12-Based Ultra-Sensitive and Specific Point-of-Care Detection of HBV, International journal of molecular sciences 22(9) (2021) 4842, https://doi.org/10.3390/ijms22094842].
X. Chen и соавторы в 2021 году для выявления ДНК вируса гепатита В использовали многократную амплификацию с перекрестным смещением (MCDA) для быстрой предварительной амплификации, с последующим детектированием последовательностей-мишеней с помощью Cas12b. Чувствительность описанной платформы составляла 10 копий ДНК вируса гепатита В на реакцию [X. Chen, Y. Tan, S. Wang, X. Wu, R. Liu, X. Yang, Y. Wang, J. Tai, S. Li, A CRISPR-Cas12b-Based Platform for Ultrasensitive, Rapid, and Highly Specific Detection of Hepatitis В Virus Genotypes В and С in Clinical Application, Frontiers in bioengineering and biotechnology 9 (2021) 743322, https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.743322].
Кроме того, в ходе изучения уровня техники были найдены патенты на изобретения, описывающие разработку и получение терапевтических направляющих РНК для удаления ДНК вируса гепатита В из клетки-хозяина, инфицированной HBV, с помощью технологии CRISPR-Cas (RU 2694396, RU 2652899, WO 2017213898, WO 2017070284, CN110656109, EP3365447, MX2016007324). Из перечисленных выше материалов ни один нельзя отнести к ближайшим аналогам настоящего изобретения в виду того, что направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, предназначены для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических (но не терапевтических) систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.
Исходя из вышеизложенного, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости получения направляющих РНК для выявления единичных копий (менее 3 копий ДНК на реакцию) ДНК вируса гепатита В in vitro с помощью Cas12 и разработке соответствующих способов выявления ДНК вируса гепатита В.
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR-Cas, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:
• высокая чувствительность;
• возможность проведения диагностики у постели больного;
• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;
• скорость и простота анализа;
• сниженная стоимость анализа;
• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;
• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.
Изобретение относится к новым средствам направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции ДНК вируса гепатита В в биологических образцах.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления ДНК вируса гепатита В.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат возможность ультрачувствительного выявления ДНК вируса гепатита В до единичных (2) копий ДНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления ДНК вируса гепатита В до 5 раз.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления ДНК вируса гепатита В.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления ДНК вируса гепатита В до единичных (2) копий ДНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления ДНК вируса гепатита В до 5 раз. Технический результат достигается за счет:
• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 для ультра чувствительного выявления ДНК вируса гепатита В, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-6, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками ДНК вируса гепатита В, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий ДНК вируса гепатита В.
• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент РФ №2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции ДНК вируса гепатита В в ультра низких концентрациях (единичные копии).
• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 7-18, для предварительной амплификации фрагментов генома вируса гепатита В.
• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов генома вируса гепатита В.
• определения условий проведения ультрачувствительной детекции ДНК вируса гепатита В и установления последовательности стадий метода.
Направляющие РНК, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса гепатита В. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 1;
• SEQ ID NO: 2;
• SEQ ID NO: 3;
• SEQ ID NO: 4;
• SEQ ID NO: 5;
• SEQ ID NO: 6;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Набор специфических олигонуклеотидов для проведения предварительной амплификации фрагмента генома вируса гепатита В, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса гепатита В. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 7;
• SEQ ID NO: 8;
• SEQ ID NO: 9;
• SEQ ID NO: 10;
• SEQ ID NO: 11;
• SEQ ID NO: 12;
• SEQ ID NO: 13;
• SEQ ID NO: 14;
• SEQ ID NO: 15;
• SEQ ID NO: 16;
• SEQ ID NO: 17;
• SEQ ID NO: 18;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae), пригодные для использования для выявления ДНК вируса гепатита В в ультранизких концентрациях (единичные копии).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-6, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения ДНК вируса гепатита В, с инструкцией по применению.
Способ обнаружения ДНК вируса гепатита В:
i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего вирус гепатита В с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 7-18, с целью получения мишени - предварительно амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В,
ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,
iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,
с обнаружением таким образом ДНК вируса гепатита В.
Предварительно амплифицированные фрагменты генома вируса гепатита В, согласно предложенному способу, могут быть представлены фрагментами размером 100-330 п. о. генома вируса гепатита В.
Предложенный способ обеспечивает выявление ДНК вируса гепатита В в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий.
Специфический олигонуклеотид для использования в способе выбирается из группы SEQ ID NO: 7-18 и используется для предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса гепатита В, которые распознаются рибонуклеопротеиновыми комплексами.
Набор для использования в способе обнаружения ДНК вируса гепатита В содержит рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса гепатита В, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 7-18.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии ДНК вируса гепатита В, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус гепатита В. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие ДНК вируса гепатита В.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 169 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For HBsAg и Rev HBsAg при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 2. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 304 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For HBV1286 и Rev HBV 1523 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
6 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 3. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 330 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For HBV 1286 и Rev HBV 1550 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
6 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 4. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 288 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For HBV 1674 и Rev HBV 1900 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
6 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 5. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 319 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For HBV 2890 и Rev HBV 3176 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
2 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
4 Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
6 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 6. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA HBV №648.
Фиг. 7. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1523, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA HBV №1316 и crRNA HBV №1447.
Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-HBV-1286-1550, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA HBV №1316 и crRNA HBV №1447.
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-HBV-1674-1900, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA HBV №1690.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-HBV-2890-3176, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA HBV №2942 и crRNA HBV №3098.
Фиг. 11. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 100 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов HBsAg For 1/1 и HBsAg Rev 1/1 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
2 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
7 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
8 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 12. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита В (размером 126 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов HBsAg For 1/2 и HBsAg Rev 1/1 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 000 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
7 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
8 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 13. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg с использованием олигонуклеотидов HBsAg For 1/1 и HBsAg Rev 1/1, а также HBsAg For 1/2 и HBsAg Rev 1/1, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющую РНК crRNA HBV №648.
Примеры осуществления изобретения
ПРИМЕР 1: АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОЛНЫХ ГЕНОМОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В И ДИЗАЙН СПЕЦИФИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ФРАГМЕНТОВ ГЕНОМОВ
Для поиска высококонсервативных участков 50 нуклеотидных последовательностей полных геномов вируса гепатита В, принадлежащих генотипу D, который является наиболее распространенным генотипом в Российской Федерации [Ю.В. Останкова, А.В. Семенов, Е.Б. Зуева, А.А. Тотолян, Первые случаи выявления вируса гепатита В субгенотипа D4 у больных хроническим, острым и скрытым вирусным гепатитом В в Российской Федерации, Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 38 (4) (2020) 180-187; R. Ozaras, I. Inane Balkan, М. Yemisen, F. Tabak, Epidemiology of HBV subgenotypes D, Clin Res Hepatol Gastroenterol 39 (1) (2015) 28-37], были выровнены в программе MEGA7.0.26 [S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870-1874]. Полногеномные последовательности были выровнены с использованием алгоритма ClustalW «Align DNA». Для попарных и множественных выравниваний были установлены следующие параметры: «Gap Opening Penalty» - 15; «Gap Extension Penalty» - 6,66. Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот по умолчанию использовалась оценочная матрица IUB (параметр «Transition Weight» равен 0,5). Отрицательная матрица не использовалась для выравнивания, а параметр «Delay Di-vergent Cutoff» был установлен на уровне 30%.
В результате анализа полученных выравниваний для разработки наборов специфических олигонуклеотидов были выбраны области генома вируса гепатита В, кодирующие поверхностный антиген гепатита В, ДНК-полимеразу, Х-белок и прекоровый/коровый белок вируса гепатита В.
Для предварительной амплификации целевых высококонсервативных последовательностей генома вируса гепатита В были подобраны 9 специфических олигонуклеотидов (Таблица 1), с помощью которых нарабатываются 5 фрагментов (Таблица 2).
ПРИМЕР 2: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ГЕПАТИТА В ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса гепатита В для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса гепатита В с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 3). Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса гепатита В, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-6.
ПРИМЕР 3: КОНСТРУИРОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ МАТРИЦ (КОНТРОЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ)
В качестве модельной матрицы фрагмента генома вируса гепатита В были использованы плазмидные ДНК pGEM-T-HBV-HBsAg, pGEM-T-HBV-1286-1523, pGEM-T-HBV-1286-1550, pGEM-T-HBV-1674-1900 и pGEM-T-HBV-2890-3176, содержащие в своем составе фрагменты генов, кодирующих поверхностный антиген гепатита В (фрагмент 169 п. о., полученный с использованием олигонуклеотидов For HBsAg и Rev HBsAg), ДНК-полимеразу (фрагмент 304 п. о., полученный с использованием олигонуклеотидов For HBV 1286 и Rev HBV 1523; фрагмент 330 п. о., полученный с использованием олигонуклеотидов For HBV 1286 и Rev HBV 1550; а также фрагмент 319 п. о., полученный с использованием олигонуклеотидов For HBV 2890 и Rev HBV 3176), а также Х-белок и прекоровый/коровый белок (фрагмент 288 п. о., полученный с использованием олигонуклеотидов For HBV 1674 и Rev HBV 1900).
Для конструирования модельных матриц была проведена амплификация соответствующих фрагментов с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в таблице 1. Полученные фрагменты были визуализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, после чего были очищены с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты были лигированы в вектор pGEM®-T (Promega6 США). Полученные лигазные смеси были трансформированы в химически компетентные клетки XL10-Gold (TetrD(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F' proAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]). Клоны, содержащие вставку длиной требуемого размера, идентифицировали при помощи ПЦР с праймерами M13For и M13Rev (ГенТерра, Россия). Плазмидную ДНК выделяли и верифицировали корректность встроенной последовательности методом капиллярного секвенирования. Полученные плазмидные ДНК pGEM-T-HBV-HBsAg, pGEM-T-HBV-1286-1523, pGEM-T-HBV-1286-1550, pGEM-T-HBV-1674-1900 и pGEM-T-HBV-2890-3176 использовали в качестве модельных матриц для выявления ДНК вируса гепатита В.
ПРИМЕР 4: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ
Подготовку материала для обнаружения ДНК вируса гепатита В проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельных матриц фрагментов генома вируса гепатита В биологического образца использовали плазмидные ДНК, описанные в Примере 3.
Предварительную амплификацию фрагмента генома вируса гепатита В проводили методом ПЦР с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблице 1. Размер амплифицированных фрагментов перечислен в Таблице 2. Температурный профиль амплификации приведен ниже:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
В ходе подготовки материала для обнаружения ДНК вируса гепатита В методом предварительной амплификации проводили титрование модельных матриц путем приготовления серийных разведений (Таблица 4).
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагментам генома вируса гепатита В, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг.1-5).
Подготовленный описанным способом материал без предварительной очистки использовали для экспериментов по выявлению ДНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-6.
ПРИМЕР 5: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В
Для получения направляющих РНК для обнаружения ДНК вируса гепатита В был разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 5. Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (табл.5), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса гепатита В, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса гепатита В;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса гепатита В;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса гепатита В.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HBV №648, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 648 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HBV №648, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HBV №1316, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 1316 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HBV №1316, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HBV №1447, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 1447 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HBV №1447, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HBV №1690, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 1690 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HBV №1690, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HBV №2942, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 2942 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HBV №2942, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HBV №3098, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 3098 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HBV №3098, составляет 62 пары нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, содержащие РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации:
95°С- 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация:
72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса гепатита В, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса гепатита В, проводили с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса гепатита В, использовали в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса гепатита В, осуществляли методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждали из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.
Создание готовых рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, и соответствующую направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С.Anders, М. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5].
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревали при 90°С в течение 5 минут и позволяли медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную соответствующую направляющую РНК смешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса гепатита В.
ПРИМЕР 6: ОБНАРУЖЕНИЕ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR-CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНЫХ МАТРИЦ
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 4, использовали в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 5.
Для обнаружения ДНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, содержащих LbCpf1 из Lachnospiraceae, готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:
• 10 х буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);
• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);
• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA HBV №648 или crRNA HBV №1316 или crRNA HBV №1447 или crRNA HBV №1690 или crRNA HBV №2942 или crRNA HBV №3098);
• 10 pmol флуоресцентный зонд (FAM-TTA-TT-BHQ1);
• Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса гепатита В);
• вода mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:
60 циклов:
37°С - 35 сек,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению ДНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельных матриц pGEM-T-HBV-HBsAg, pGEM-T-HBV-1286-1523, pGEM-T-HBV-1286-1550, pGEM-T-HBV-1674-1900 и pGEM-T-HBV-2890-3176. На Фиг. 6-10 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней, обработанных рибонуклеопротеиновыми комплексами CRISPR-Cas, содержащими соответствующие направляющие РНК. Наилучший результат - выявление 6 копий модельной матрицы в реакционной смеси был показан для направляющих РНК crRNA HBV №648 (фиг.6), crRNA HBV №1690 (фиг.9) и crRNA HBV №3098 (фиг.10). Направляющая РНК crRNA HBV №1447 была способна обнаружить от 585 до 5850 копий модельных матриц pGEM-T-HBV-1286-1523 или pGEM-T-HBV-1286-1550 в реакционной смеси (фиг.7, 8). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, содержащие в своем составе направляющие РНК crRNA HBV №1316 и crRNA HBV №2942 не обладают способностью выявлять ДНК вируса гепатита В (фиг.7, 8, 10).
ПРИМЕР 7: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR-CAS
Для обнаружения единичных копий ДНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas было принято решение оптимизировать процесс предварительной амплификации. Для этого были разработаны дополнительные олигонуклеотиды (Таблица 1) для амплификации фрагмента гена, кодирующего поверхностный антиген вируса гепатита В, входящего в состав модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg.
Для предварительной амплификации с новыми олигонуклеотидами модельную матрицу pGEM-T-HBV-HBsAg титровали путем приготовления серийных разведений (Таблица 4) как описано в Примере 4.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты гена, кодирующего поверхностный антиген вируса гепатита В, входящего в состав модельной матрицы pGEM-T-HBV-HBsAg, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 4.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов:
1. денатурация:
95°С в течение 3 минут;
2. 30, 35 или 40 циклов амплификации:
95°С- 15 сек,
55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация:
72°С в течение 5 минут.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагментам генома вируса гепатита В, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг.11, 12).
Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения единичных копий ДНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 5.
Обнаружение единичных копий провирусной ДНК вируса гепатита В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 6.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющей РНК crRNA HBV №648 обладают способностью выявлять единичные копии ДНК вируса гепатита В (2 копии/реакция). Применение оптимизированных олигонуклеотидов HBsAg For 1/1, HBsAg For 1/2 и HBsAg Rev 1/1 позволило обнаруживать до 2 копий ДНК, внесенных в реакцию предварительной амплификации (фиг.13). При этом в среднем уже на 20 цикле (20 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) вдвое; к 31 циклу анализа более чем в 5 раз, а к 43 циклу более чем в 10 раз.
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии ДНК вируса гепатита В в образце после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.
--->
Перечень последовательностей
<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
<120>
<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 18
<210> SEQ ID NO: NO 1
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 1 (crRNA HBV №648):
aau uuc uac uaa gug uag aug caa aau acc uau ggg agu g 40
<210> SEQ ID NO: NO 2
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 2 (crRNA HBV №1316):
aau uuc uac uaa gug uag aug cuc gca gcc ggu cug gag c 40
<210> SEQ ID NO: NO 3
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 3 (crRNA HBV №1447):
aau uuc uac uaa gug uag auc guc ccg ucg gcg cug aau c 40
<210> SEQ ID NO: NO 4
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 4 (crRNA HBV №1690):
aau uuc uac uaa gug uag aua agu agg ccu caa ggu cgg u 40
<210> SEQ ID NO: NO 5
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 5 (crRNA HBV №2942):
aau uuc uac uaa gug uag auc cga uca uca guu gga ccc u 40
<210> SEQ ID NO: NO 6
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 6 (crRNA HBV №3098):
aau uuc uac uaa gug uag aug ggu gga gcc cuc agg cuc a 40
<210> SEQ ID NO: NO 7
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 7 (For HBsAg):
ggc aac tct atg ttt ccc tca tgt tgc tgt ac 32
<210> SEQ ID NO: NO 8
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 8 (Rev HBsAg):
gcc cta cga acc act gaa caa atg gca cta g 31
<210> SEQ ID NO: NO 9
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 9 (For HBV 1286):
ctc ctc tgc cga tcc ata ctg cgg aac tcc tag c 34
<210> SEQ ID NO: NO 10
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 10 (Rev HBV 1523):
aca gac ggg gag acc gcg taa aga gag gtg cgc c 34
<210> SEQ ID NO: NO 11
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 11 (Rev HBV 1550):
gca cac gga ccg gca gat gag aag gca cag acg 33
<210> SEQ ID NO: NO 12
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 12 (For HBV 1674):
cca agg tct tac ata aga gga ctc ttg gac tcc 33
<210> SEQ ID NO: NO 13
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 13 (Rev HBV 1900):
cca aat tct tta taa ggg tca atg tcc atg 30
<210> SEQ ID NO: NO 14
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 14 (For HBV 2890):
gag gtt ggt cat caa aac ctc gca aag gca tgg 33
<210> SEQ ID NO: NO 15
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 15 (Rev HBV 3176):
atg gga gta ggc tgc ctt cct gac tgc cga ttg g 34
<210> SEQ ID NO: NO 16
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 16 (HBsAg For 1/1):
ctg agc caa gag aaa cgg ac 20
<210> SEQ ID NO: NO 17
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 17 (HBsAg For 1/2):
acc act gaa caa atg gca c 19
<210> SEQ ID NO: NO 18
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 18 (HBsAg Rev 1/1):
aac cta cgg atg gaa att gca c 22
<---
Claims (9)
1. Способ обнаружения ДНК вируса гепатита B, содержащий:
i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего вирус гепатита B, с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 7-18, с целью получения мишени – предварительно амплифицированного фрагмента генома вируса гепатита B,
ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1-6; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,
iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе
с обнаружением таким образом ДНК вируса гепатита B.
2. Способ по п.1, где предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса гепатита B представлен фрагментами размером 100-330 п.о.
3. Способ по п.1 или 2, где способ обеспечивает выявление ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий.
4. Специфический олигонуклеотид, выбранный из SEQ ID NO: 7-18, для использования в способе по пп.1, 2 или 3 для предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса гепатита B, которые распознаются рибонуклеопротеиновым комплексом.
5. Набор для использования в способе обнаружения ДНК вируса гепатита B по пп.1, 2 или 3, содержащий один или несколько специфических олигонуклеотидов по п.4, рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1-6; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2782951C1 true RU2782951C1 (ru) | 2022-11-07 |
Family
ID=
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799430C1 (ru) * | 2022-11-29 | 2023-07-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях |
| CN118222765A (zh) * | 2024-05-23 | 2024-06-21 | 江西乐成欣生生物技术研究有限责任公司 | 一种基于CRISPR的HBVpgRNA检测试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (ru) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рекомбинантной нуклеазы CAS, по существу, свободного от бактериальных эндотоксинов, полученный данным способом препарат и содержащий его набор для использования в системе CRISPR/Cas |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (ru) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рекомбинантной нуклеазы CAS, по существу, свободного от бактериальных эндотоксинов, полученный данным способом препарат и содержащий его набор для использования в системе CRISPR/Cas |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TALWAR C.S. et al. Detection of Infectious Viruses Using CRISPR-Cas12-Based Assay, Biosensors (Basel), 2021, vol. 11, N. 9, 301. RONG X. et al. Monitoring hepatitis B by using point-of-care testing: biomarkers, current technologies, and perspectives, Expert Rev Mol Diagn., 2021, vol. 21, N. 2, pp. 195-211. WANG S. et al. Highly sensitive and specific detection of hepatitis B virus DNA and drug resistance mutations utilizing the PCR-based CRISPR-Cas13a system, Clin Microbiol Infect., 2021, vol. 27, N. 3, pp. 443-450. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799430C1 (ru) * | 2022-11-29 | 2023-07-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях |
| RU2800420C1 (ru) * | 2022-11-29 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе |
| RU2800421C1 (ru) * | 2022-11-29 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях |
| RU2818585C1 (ru) * | 2023-09-11 | 2024-05-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ пробоподготовки образцов ДНК вируса гепатита В для полногеномного секвенирования и олигонуклеотидные праймеры для его реализации |
| CN118222765A (zh) * | 2024-05-23 | 2024-06-21 | 江西乐成欣生生物技术研究有限责任公司 | 一种基于CRISPR的HBVpgRNA检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112094944B (zh) | 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒 | |
| CN112980928B (zh) | 一种茎环引物辅助的等温核酸扩增方法 | |
| RU2782951C1 (ru) | Способ обнаружения ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2782700C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях | |
| RU2792891C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas12 и препарат для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях | |
| RU2745637C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости bla VIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях | |
| RU2802783C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях в ультранизких концентрациях | |
| RU2764022C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2802781C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas12 и препарат для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях | |
| RU2720767C1 (ru) | Способ обнаружения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2764024C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas14 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2764020C1 (ru) | Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2802079C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2800421C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях | |
| RU2720769C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS и препарат для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях | |
| JP2005514012A (ja) | キメラバクテリオファージ標準を使用する高感度ゲノムアッセイ | |
| RU2764023C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2800420C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2764015C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2764021C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2720768C1 (ru) | Система CRISPR-Cas для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях | |
| RU2747820C1 (ru) | Система CRISPR-Cas для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях | |
| RU2747819C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях | |
| RU2747880C1 (ru) | Способ обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2799430C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях |