RU2782316C2 - Method for studying microbiota of large intestine by polymerase chain reaction method with fluorescence detection in real time and set of reagents for implementation thereof - Google Patents
Method for studying microbiota of large intestine by polymerase chain reaction method with fluorescence detection in real time and set of reagents for implementation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782316C2 RU2782316C2 RU2020140132A RU2020140132A RU2782316C2 RU 2782316 C2 RU2782316 C2 RU 2782316C2 RU 2020140132 A RU2020140132 A RU 2020140132A RU 2020140132 A RU2020140132 A RU 2020140132A RU 2782316 C2 RU2782316 C2 RU 2782316C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fam
- bhq
- microbiota
- sample
- saaroe
- Prior art date
Links
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 title claims abstract description 14
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 title claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 7
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 abstract description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 2
- 206010064389 Dysbacteriosis Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 2
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 201000006704 ulcerative colitis Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 210000003445 Biliary Tract Anatomy 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infection Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 1
- 206010011401 Crohn's disease Diseases 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000001848 Dysentery Diseases 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000010227 Enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000013165 Exonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 206010019641 Hepatic cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000002551 Irritable Bowel Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Process Diseases 0.000 description 1
- 206010033971 Paratyphoid fever Diseases 0.000 description 1
- 206010037128 Pseudomembranous colitis Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000001072 Type 2 Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 1
- BZFAAUGVDSXTIZ-YDZBNSHISA-N [[(2R,3S,5R)-5-(2-amino-6-oxo-3H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate;[[(2R,3S,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1.C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 BZFAAUGVDSXTIZ-YDZBNSHISA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 201000010092 intestinal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004044 liver cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностирования заболеваний кишечника.The invention relates to medicine, namely to methods for diagnosing bowel diseases.
Известен патент РФ на изобретение №2605913 от 16.12.2011 в котором описана группа изобретений, представленная набором олигонуклеотидных зондов для профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), где указанный набор включает в частности (а) олигонуклеотид, состоящий из (ai) нуклеотидной последовательности, выбранной из 
Использование изобретений позволяет выявлять присутствие и количество определенных бактерий среди множества с высокой точностью благодаря комбинированному эффекту используемого набора зондов.The use of the inventions makes it possible to detect the presence and quantity of certain bacteria among a multitude with high accuracy due to the combined effect of the set of probes used.
К недостаткам известного решения относится узкий спектр микроорганизмов, определяемый набором зондов.The disadvantages of the known solutions include a narrow spectrum of microorganisms, determined by a set of probes.
Задача, на решение которой направлено заявляемое решение разработка способа исследования микробиоты и набора для его проведения более информативного за счет большего количества определяемых последовательностей мишеней, использования более точных олигонуклеотидных праймеров.The task to be solved by the claimed solution is the development of a method for studying the microbiota and a kit for its implementation, more informative due to the greater number of determined target sequences, the use of more accurate oligonucleotide primers.
Поставленная задача решается путем применения способа исследования микробиоты толстого кишечника путем определения ДНК микроорганизмов кишечника методом полимеразной цепной реакции. Способ включает взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определением для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которая присутствует в указанном образце. На основании этого получение профиля микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце. При этом в состав набора олигонуклеотидных праймеров входят стрипы со смесями олигонуклеатидных праймеров (указаны в порядке прямой праймер, обратный праймер, флуорисцентный зонд) для амплификации, запечатанные воском, раствор Taq-полимеразы, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, минеральное масло. В качестве смесей праймеров в наборе 1 используют олигонуклеотиды:The problem is solved by applying a method for studying the microbiota of the large intestine by determining the DNA of intestinal microorganisms by polymerase chain reaction. The method includes interaction of a microbiota sample with a set of oligonucleotide primers, determining for each oligonucleotide in the specified primer set the number of its target nucleotide sequences that is present in the specified sample. Based on this, obtaining a microbiota profile from the relative amounts of target nucleotide sequences present in the sample. At the same time, the set of oligonucleotide primers includes strips with mixtures of oligonucleotide primers (listed in the order of forward primer, reverse primer, fluorescent probe) for amplification, sealed with wax, Taq polymerase solution, positive control sample, negative control sample, mineral oil. The following oligonucleotides are used as primer mixtures in set 1:
В качестве смесей праймеров в наборе 2 используют олигонуклеотиды:The following oligonucleotides are used as primer mixtures in set 2:
В качестве смесей праймеров в наборе 3 используют олигонуклеотиды:The following oligonucleotides are used as primer mixtures in set 3:
Для приготовления компонентов набора используются водные растворы реагентов, разбавителем в которых является вода деионизованная с удельной электропроводностью не более 4.3 мкСим/см. Далее по тексту под термином «водный раствор» подразумевается раствор реагента в деионизованной воде. Олигонуклеотидные праймеры представляют собой олигонуклеотиды, специфичные для определяемых микроорганизмов. То есть нуклеотидные последовательности праймеров и зондов комплементарны участкам ДНК соответствующих детектируемых микроорганизмов.To prepare the components of the kit, aqueous solutions of reagents are used, the diluent in which is deionized water with a specific electrical conductivity of not more than 4.3 μS/cm. Hereinafter, the term "aqueous solution" means a solution of the reagent in deionized water. Oligonucleotide primers are oligonucleotides specific for the microorganisms to be determined. That is, the nucleotide sequences of the primers and probes are complementary to the DNA regions of the corresponding detectable microorganisms.
Олигонуклеотидные праймеры получают путем химического синтеза на ДНК-синтезаторе (Applied Biosystems ABI 3900 и другие приборы со сходными техническими характеристиками) и подвергают очистке методом электрофореза в полиакриламидном геле или методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Олигонуклеотидные праймеры поставляются в лиофилизированном виде.Oligonucleotide primers are prepared by chemical synthesis on a DNA synthesizer (Applied Biosystems ABI 3900 and other devices with similar specifications) and purified by polyacrylamide gel electrophoresis or reverse phase high performance liquid chromatography. Oligonucleotide primers are supplied in lyophilized form.
Олигонуклеотидные праймеры получают путем химического синтеза на ДНК-синтезаторе с химической модификацией и подвергают двухэтапной очистке: методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей очисткой методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Химическая модификация заключается во введении молекулы флуорофора и молекулы гасителя флуоресценции.Oligonucleotide primers are obtained by chemical synthesis on a DNA synthesizer with chemical modification and are subjected to two-stage purification: by electrophoresis in polyacrylamide gel, followed by purification by reverse-phase high-performance liquid chromatography. Chemical modification consists in introducing a fluorophore molecule and a fluorescence quencher molecule.
В качестве флуорофора для канала флуоресценции FAM используют следующие красители: FAM [485 нм (возбуждение), 520 нм (эмиссия)]; для канала HEX используется краситель HEX [530 нм (возбуждение), 556 нм (эмиссия)]; допускается использование красителей VIC или R6G со сходными спектральными характеристиками. В качестве гасителя флуоресценции для канала FAM используют гаситель BHQ-1, для канала HEX используют гаситель BHQ-1 или BHQ-2.The following dyes are used as the fluorophore for the FAM fluorescence channel: FAM [485 nm (excitation), 520 nm (emission)]; the HEX channel uses the HEX dye [530 nm (excitation), 556 nm (emission)]; the use of VIC or R6G dyes with similar spectral characteristics is allowed. The BHQ-1 quencher is used as a fluorescence quencher for the FAM channel, and the BHQ-1 or BHQ-2 quencher is used for the HEX channel.
Для приготовления водного раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) используют хроматографически чистые (99%) дезоксинуклеозидтрифосфаты (2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат 2'-дезокситимидин-5'-трифосфат 2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат), свободные от примесей эндонуклеаз, экзонуклеаз и никаз, следовых количеств ДНК и нуклеотидов, поставляемые в концентрации не менее 100 mM.To prepare an aqueous solution of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), chromatographically pure (99%) deoxynucleoside triphosphates (2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate 2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate 2'-deoxythymidine-5'-triphosphate 2'-deoxycytidine-5 '-triphosphate), free from impurities of endonucleases, exonucleases and nycases, trace amounts of DNA and nucleotides, supplied in a concentration of at least 100 mM.
Для приготовления раствора Taq-полимеразы используют термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из бактерий Thermus aquaticus YT1, свободную от нуклеаз, с удельной активностью 5 ед/мкл.To prepare a solution of Taq polymerase, a thermostable DNA polymerase obtained from Thermus aquaticus YT1 bacteria, free from nucleases, with a specific activity of 5 units/μl, is used.
Материалом для изготовления положительного контрольного образца являются образцы плазмидной ДНК, полученные методом генной инженерии с использованием продуктов специфической амплификации участка генома детектируемых микроорганизмов. Амплифицированные фрагменты встраивают в плазмиды путем лигирования, полученные конструкции используют для трансформации E.coli. Культуру E.coli выращивают на селективных средах; плазмидную ДНК со встроенными фрагментами очищают с помощью набора для очистки плазмидной ДНК.The material for the production of a positive control sample is plasmid DNA samples obtained by genetic engineering using products of specific amplification of the genome region of the detected microorganisms. The amplified fragments are inserted into plasmids by ligation, and the resulting constructs are used to transform E. coli. E. coli culture is grown on selective media; plasmid DNA with inserted fragments is purified using a plasmid DNA purification kit.
Реагенты и смеси реагентов помещают в пробирки и стрипованные пробирки (стрипы) из полипропилена, предназначенные для ПЦР, сертифицированные на отсутствие следовых количеств ДНК, ДНК-аз, РНК-аз и ингибиторов ПЦР. Пробирки должны быть изготовлены из высококачественного полипропилена.Reagents and mixtures of reagents are placed in test tubes and strip tubes (strips) made of polypropylene intended for PCR, certified for the absence of trace amounts of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors. The tubes must be made of high quality polypropylene.
Для запечатывания смесей для амплификации в пробирках и стрипах используют воск для ПЦР с температурой плавления 37°С.PCR wax with a melting point of 37°C is used to seal the amplification mixtures in tubes and strips.
Для количественной оценки результатов анализа используют ЭВМ с программным обеспечением, которое преобразует полученные для каждого выявляемого показателя значения порогового цикла Ct в количество копий на мл. Пересчет проводится на основе метода Пфаффла с поправкой на эффективность амплификации. Полученные значения (копий/мл) преобразуются в КОЕ/мл с учетом копийности гена, используемого для амплификации и являются окончательным результатом теста.To quantify the results of the analysis, a computer with software is used that converts the threshold cycle Ct values obtained for each indicator to be detected into the number of copies per ml. The recalculation is carried out on the basis of the Pfaffl method, adjusted for the amplification efficiency. The obtained values (copies/ml) are converted to CFU/ml taking into account the copy number of the gene used for amplification and are the final result of the test.
В один стрип с олигонуклеатидным праймером входит:One strip with an oligonucleotide primer includes:
- олигонуклеотидный праймер, представляющий водный раствор полученных на ДНК-синтезаторе двух олигонуклеотидных праймеров, специфичных для генома исследуемых микроорганизмов. Концентрация каждого праймера в реакционной смеси - 4,0 пмоль/мкл;- oligonucleotide primer representing an aqueous solution obtained on a DNA synthesizer of two oligonucleotide primers specific for the genome of the studied microorganisms. The concentration of each primer in the reaction mixture is 4.0 pmol/µl;
- водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ;- an aqueous solution of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs); the concentration of each dNTP - 2.5 mm;
- 10-кратный буферный раствор, содержащий 300 mM Трис-HCl, 166 mM аммония сульфат, 25 mM магния хлорид, рН 8,6;- 10-fold buffer solution containing 300 mM Tris-HCl, 166 mM ammonium sulfate, 25 mM magnesium chloride, pH 8.6;
- флуоресцентный зонд для специфического фрагмента. Содержат флуорофор FAM [485 нм (возбуждение), 520 нм (эмиссия)] или флуорофор HEX [530 нм (возбуждение), 556 нм (эмиссия)]. Концентрация каждого зонда в реакционной смеси - 0,5 пмоль/мкл;- fluorescent probe for a specific fragment. Contain FAM fluorophore [485 nm (excitation), 520 nm (emission)] or HEX fluorophore [530 nm (excitation), 556 nm (emission)]. The concentration of each probe in the reaction mixture is 0.5 pmol/µl;
- вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).- distilled water (GOST 6709-72).
Раствор Taq-полимеразы представляет собой 2 пробирки по 200 мкл [термостабильная ДНК-полимераза, полученная из бактерий Thermus aquaticus YT1, свободная от нуклеаз, в буферном растворе с рН 8.6, состоящем из 700 mM Трис-HCl, 60% глицерина; 1 мМ дитиотрейтола; 166 mM аммония сульфата, 25 mM магния хлорида, удельная активность фермента - 1 ед/мкл.The Taq polymerase solution is 2 x 200 µl tubes [thermostable DNA polymerase derived from Thermus aquaticus YT1 bacteria free of nucleases in pH 8.6 buffer solution consisting of 700 mM Tris-HCl, 60% glycerol; 1 mM dithiothreitol; 166 mM ammonium sulfate, 25 mM magnesium chloride, enzyme specific activity 1 U/µl.
Отрицательный контрольный образец 1 пробирка (150 мкл) - вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72). Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.Negative control sample 1 tube (150 µl) - distilled water (GOST 6709-72). A positive result in this sample indicates the need to change reagents and re-arrange the experiment.
При осуществлении способа по заявляемому изобретению из биологического материала (кал человека) выделяется бактериальная ДНК с помощью набора реагентов, предназначенных для этих целей. На одно определение генетических маркеров заболевания для одного образца используется 6 пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и интеркалирующий краситель. Во все подготовленные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.When implementing the method according to the claimed invention, bacterial DNA is isolated from biological material (human feces) using a set of reagents designed for these purposes. For one determination of genetic markers of the disease for one sample, 6 tubes with a prepared reaction mixture containing specific synthetic oligonucleotide primers and an intercalating dye are used. Taq-polymerase solution is added to all prepared tubes without damaging the paraffin layer.
В каждую пробирку, кроме пробирок с отрицательным контрольным образцом и положительным контрольным образцом, при постановке реакции амплификации добавляется образец бактериальной ДНК, выделенной из образца кала человека. Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно стандартным режимам. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору. В случае наличия в ДНК специфических маркеров, комплементарных праймерам, происходит наработка ПЦР-продукта и возрастание уровня флуоресценции. Интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве образующегося продукта. Для количественной оценки результатов анализа используют ЭВМ с программным обеспечением, которое преобразует полученные для каждого выявляемого показателя значения порогового цикла Ct в количество копий на мл. Пересчет проводится на основе метода Пфаффла с поправкой на эффективность амплификации. Выявляемое изменение титра 10^4 коп/мл.In each tube, except for tubes with a negative control sample and a positive control sample, when setting up the amplification reaction, a sample of bacterial DNA isolated from a human feces sample is added. All test tubes are installed in the cycler block, amplification is carried out according to standard modes. Detection of results is carried out automatically by the detecting cycler during amplification. Analysis of the results is carried out in accordance with the instructions for the device. In the case of the presence of specific markers in DNA that are complementary to primers, the PCR product is produced and the fluorescence level increases. The intensity of fluorescence is indicative of the amount of product formed. To quantify the results of the analysis, a computer with software is used that converts the threshold cycle Ct values obtained for each indicator to be detected into the number of copies per ml. The recalculation is carried out on the basis of the Pfaffl method, adjusted for the amplification efficiency. The detected change in titer is 10^4 kop/ml.
Разработанный способ исследования микробиоты толстого кишечника и варианты наборов для его осуществления позволяют выявить присутствие патогенных микроорганизмов или значительное увеличение отдельных представителей микрофлоры кишечника, например, снижение содержания бифидобактерий и/или лактобацилл, изменение количества сапрофитной, грибов или условно-патогенной микрофлоры, изменение соотношения субпопуляций анаэробных бактерий, осуществляющих различные виды брожения (например, продуцентов бутирата и продуцентов пропионата).The developed method for studying the microbiota of the large intestine and variants of kits for its implementation make it possible to detect the presence of pathogenic microorganisms or a significant increase in individual representatives of the intestinal microflora, for example, a decrease in the content of bifidobacteria and / or lactobacilli, a change in the number of saprophytic, fungi or opportunistic microflora, a change in the ratio of subpopulations of anaerobic bacteria that carry out various types of fermentation (for example, butyrate producers and propionate producers).
Разработанный способ и набор для его осуществления, за счет комбинации показателей используемых праймеров позволяет диагностировать дисбактериозы кишечника, кандидомикозный сепсис, антибиотик-ассоцированную диарею, иммунодефицитные состояния, гастроэнтерит, энтерит, энтероколит, стафилококковый дисбактериоз, антибиотик-ассоциированный колит, псевдомембранозный колит, пищевые токсикоинфекции, некротический энтерит, неспецефический язвенный колит, острые кишечные инфекционные заболевания, гастрит, неопластические процессы в толстом кишечнике, канцерогенез, генерализованный тифопаратифозный инфекционный процесс, дизентерию, дисбиоз, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, диабеты 1-го и 2-го типа, цирроз печени, избыточный бактериальный рост, анаэробный дисбаланс, различные аутоиммунные патологии, синдром раздраженной толстой кишки, аллергию, патологии желчевыводящих путей, полипоз тостого кишечника, колоректальный рак.The developed method and a set for its implementation, due to the combination of indicators of the primers used, makes it possible to diagnose intestinal dysbacteriosis, candidiasis sepsis, antibiotic-associated diarrhea, immunodeficiency states, gastroenteritis, enteritis, enterocolitis, staphylococcal dysbacteriosis, antibiotic-associated colitis, pseudomembranous colitis, food poisoning, necrotizing enteritis, nonspecific ulcerative colitis, acute intestinal infectious diseases, gastritis, neoplastic processes in the large intestine, carcinogenesis, generalized typhoid and paratyphoid infectious process, dysentery, dysbiosis, Crohn's disease, nonspecific ulcerative colitis, type 1 and type 2 diabetes, liver cirrhosis , bacterial overgrowth, anaerobic imbalance, various autoimmune pathologies, irritable bowel syndrome, allergies, biliary tract pathologies, colon polyposis, colorectal cancer.
Claims (60)
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021131090A Division RU2781855C1 (en) | 2021-10-25 | Method for studying the microbiota of the large intestine by the polymerase chain reaction method with fluorescence detection in real time and set of reagents for implementation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020140132A RU2020140132A (en) | 2022-06-07 |
| RU2782316C2 true RU2782316C2 (en) | 2022-10-25 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2605913C2 (en) * | 2010-12-16 | 2016-12-27 | Дженетик Энэлисиз Ас | Sets of oligonucleotide probes and methods of gastrointestinal microbiota profiling |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2605913C2 (en) * | 2010-12-16 | 2016-12-27 | Дженетик Энэлисиз Ас | Sets of oligonucleotide probes and methods of gastrointestinal microbiota profiling |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| С.М. ЮДИН, А.М. ЕГОРОВА и др., АНАЛИЗ МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА. РОССИЙСКИЙ И ЗАРУБЕЖНЫЙ ОПЫТ, Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований, 2018, N 11, часть 1 - С. 175-180. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dunbar et al. | Quantitative, multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP™ system | |
| Avaniss-Aghajani et al. | Molecular technique for rapid identification of mycobacteria | |
| KR0171629B1 (en) | Rapid assays for amplification products | |
| CN106399517B (en) | Nucleic acid detection technology combining multi-cross constant-temperature amplification with gold nano biosensing | |
| JP7391877B2 (en) | Biomarker panels and methods for detecting microsatellite instability in cancer | |
| US6063572A (en) | Method of assay of nucleic acid sequences | |
| CN102918155B (en) | Chlamydia trachomatis detection primer and probe and use the detection method of chlamydia trachomatis of this primer and probe | |
| CN113201594A (en) | Method for rapidly detecting food-borne Burkholderia gladioli | |
| JP2018528780A (en) | Improved detection of short homopolymer repeats | |
| Jannes et al. | A review of current and future molecular diagnostic tests for use in the microbiology laboratory | |
| CN105755134B (en) | Endonuclease-mediated real-time multiple cross-displacement nucleic acid amplification technology and application | |
| CN109777861A (en) | The loop-mediated isothermal amplification method of mispairing tolerance and application | |
| CA2489196C (en) | Method and test kit for quantitative determination of polynucleotides in a mixture | |
| Mianzhi et al. | Contemporary nucleic acid-based molecular techniques for detection, identification, and characterization of Bifidobacterium | |
| Rintamäki et al. | Detection of Streptococcus pneumoniae DNA by using polymerase chain reaction and microwell hybridization with Europium-labelled probes | |
| RU2782316C2 (en) | Method for studying microbiota of large intestine by polymerase chain reaction method with fluorescence detection in real time and set of reagents for implementation thereof | |
| RU2781855C1 (en) | Method for studying the microbiota of the large intestine by the polymerase chain reaction method with fluorescence detection in real time and set of reagents for implementation thereof | |
| Galluzzi et al. | Current molecular techniques for the detection of microbial pathogens | |
| US7368246B2 (en) | Quantitative gene expression profiling | |
| WO2011086006A1 (en) | Method for detecting more than one target in a pcr-based approach applying an unspecific dye which is not interfering with the emission of fluorophore-labeled probes | |
| US20100112563A1 (en) | Multiplex analysis of nucleic acids | |
| JP2003174900A (en) | Method for determining pyrophosphoric acid and nucleic acid and apparatus therefor | |
| Thies | Molecular methods for studying soil ecology | |
| JP2009504173A (en) | Analysis method and kit | |
| Clarke | Detection of Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae in blood and cerebrospinal fluid using fluorescence-based PCR |