RU2781486C1 - Method for quantitative determination of clavulanic acid in muscle tissues of animal origin - Google Patents
Method for quantitative determination of clavulanic acid in muscle tissues of animal origin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781486C1 RU2781486C1 RU2021137933A RU2021137933A RU2781486C1 RU 2781486 C1 RU2781486 C1 RU 2781486C1 RU 2021137933 A RU2021137933 A RU 2021137933A RU 2021137933 A RU2021137933 A RU 2021137933A RU 2781486 C1 RU2781486 C1 RU 2781486C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acetonitrile
- deionized water
- clavulanic acid
- mixture
- ratio
- Prior art date
Links
- 229960003324 Clavulanic Acid Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N Clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 6
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 4
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 4
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 4
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 4
- 229920002397 Thermoplastic olefin Polymers 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000003781 beta lactamase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 2
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N CHEMBL530 Chemical compound N(/[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)=C\N1CCCCCC1 BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- -1 beta-lactam compound Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960001890 mecillinam Drugs 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- DWHGNUUWCJZQHO-ZVDZYBSKSA-M potassium;(2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;(2R,3Z,5R)-3-(2-hydroxyethylidene)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 DWHGNUUWCJZQHO-ZVDZYBSKSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения содержания клавулановой кислоты в мышечных тканях животного происхождения: мышечных тканях крупного рогатого скота (КРС). Сущность способа заключается в извлечении анализируемого соединения из объекта исследования раствором ацетонитрила в деионизованной воде, подкисленным муравьиной кислотой, с последующей очисткой экстрактов на обращеннофазном сорбенте со слабыми анионообменными свойствами, фильтрацией и дальнейшим определением содержания клавулановой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Использование данного способа позволяет с высокой точностью количественно определить содержание клавулановой кислоты в мышечных тканях животного происхождения.The invention relates to the field of analytical chemistry and relates to a method for determining the content of clavulanic acid in muscle tissues of animal origin: muscle tissues of cattle (cattle). The essence of the method consists in extracting the analyzed compound from the object of study with a solution of acetonitrile in deionized water, acidified with formic acid, followed by purification of the extracts on a reverse-phase sorbent with weak anion-exchange properties, filtration and further determination of the content of clavulanic acid by high-performance liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The use of this method allows to quantify the content of clavulanic acid in muscle tissues of animal origin with high accuracy.
Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для контроля содержания остаточных количеств клавулановой кислоты в продукции животноводства.The invention relates to the field of analytical chemistry and can be used to control the content of residual amounts of clavulanic acid in animal products.
Клавулановая кислота представляет собой бета-лактамное соединение, структурно родственное пенициллинам, на фиг. 1. Клавулановая кислота проявляет очень слабую антибактериальную активность, и поэтому не может использоваться в качестве самостоятельного антибиотика. Однако, она является мощным ингибитором β-лактамазы S. aureus и β-лактамаз, опосредованных плазмидами, вырабатываемых грамм-отрицательными бактериями [1].Clavulanic acid is a beta-lactam compound structurally related to penicillins, in FIG. 1. Clavulanic acid exhibits very weak antibacterial activity, and therefore cannot be used as an independent antibiotic. However, it is a potent inhibitor of S. aureus β-lactamase and plasmid-mediated β-lactamases produced by Gram-negative bacteria [1].
В ветеринарии применяют клавулановую кислоту в сочетании с амоксициллином или ампициллином, относя данные комбинированные препараты к отдельному классу антибиотиков - аминопенициллины и бета-лактамазный ингибитор [2]. В последнее десятилетие проводятся успешные доклинические исследования совместного применения клавулановой кислоты с мециллинамом [3].In veterinary medicine, clavulanic acid is used in combination with amoxicillin or ampicillin, referring these combined preparations to a separate class of antibiotics - aminopenicillins and a beta-lactamase inhibitor [2]. In the last decade, successful preclinical studies of the combined use of clavulanic acid with mecillinam have been carried out [3].
В РФ и РБ зарегистрировано 11 ветеринарных препаратов: комбинаций амоксициллина и клавулановой кислоты [4, 5]. К факторам бесконтрольного применения на территории Российской Федерации препарата типа «амоксиклав» относится то, что данная комбинация веществ зарегистрирована в реестре ветеринарных препаратов как препараты свободного отпуска: не подлежащие ограничению в применении через надзор ветеринарных врачей [4]. Пенициллиновые антибиотики и входящий в них класс «аминопенициллины и бета-лактамазный ингибитор» являются критически важными ветеринарными препаратами. Расчетный расход пенициллиновых антибиотиков на производство биомассы сельскохозяйственных животных на 2007 год в странах ЕС составил 20 мг/кг. Данное значение в общей доли потребления антибиотиков странами ЕС соответствует доли от 10% до 80% [6]. Максимально допустимые уровни остаточного содержания клавулановой кислоты в продукции животноводства следующие: мясо, жир - не более 0,1 мг/кг, печень, почки, молоко - не более 0,2/0,4/0,2 мг/кг, соответственно.In the Russian Federation and the Republic of Belarus, 11 veterinary drugs are registered: combinations of amoxicillin and clavulanic acid [4, 5]. The factors of uncontrolled use in the Russian Federation of the drug "amoxiclav" include the fact that this combination of substances is registered in the register of veterinary drugs as drugs free of charge: not subject to restriction in use through the supervision of veterinarians [4]. Penicillin antibiotics and their class of "aminopenicillins and beta-lactamase inhibitor" are critically important veterinary drugs. The estimated consumption of penicillin antibiotics for the production of farm animal biomass in 2007 in the EU countries was 20 mg/kg. This value in the total share of consumption of antibiotics by EU countries corresponds to a share from 10% to 80% [6]. The maximum allowable levels of residual content of clavulanic acid in livestock products are as follows: meat, fat - no more than 0.1 mg / kg, liver, kidneys, milk - no more than 0.2 / 0.4 / 0.2 mg / kg, respectively.
Описаны способы определения клавулановой кислоты в различных объектах исследования. Разделение и формирование хроматографического пика в них осуществляют на хроматографических колонках с обращенно-фазным сорбентом С8 и С18. Встречаются исследования с применением спектрометрического детектора в ультрафиолетовой области [7], в том числе и в молоке [8]. Масс-спектрометрическому детектированию посвящены работы последних 15 лет [9-16].Methods for the determination of clavulanic acid in various objects of study are described. Separation and formation of a chromatographic peak in them is carried out on chromatographic columns with reverse-phase sorbent C8 and C18. There are studies using a spectrometric detector in the ultraviolet region [7], including in milk [8]. The works of the last 15 years [9–16] have been devoted to mass spectrometric detection.
Наиболее близкий по назначению, является способ определения клавулановой кислоты в тканях свинины методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией [17], Извлечение клавулановой кислоты проводят в течение 15 с. в ходе гомогенизации 1 г образца с 7 см3 фосфатного буфера и последующей экстракцией на встряхивателе, в течение 20 мин. Слои разделяют центрифугированием, а аликвоту супернатанта отбирают для стадии очистки ультрафильтрацией, с отсечением молекул с массой больше 30 кДа. После стадии ультрафильтрации, фильтрат пропускают через насадочный фильтр с порами 0,2 мкм в флакон для хроматографа и анализируют методом ВЭЖХ-МС/МС.The closest in purpose is the method for determining clavulanic acid in pork tissues by liquid chromatography with tandem mass spectrometry [17]. Extraction of clavulanic acid is carried out for 15 s. during homogenization of 1 g of the sample with 7 cm 3 of phosphate buffer and subsequent extraction on a shaker, for 20 min. The layers are separated by centrifugation, and an aliquot of the supernatant is taken for the ultrafiltration purification step, with the cutoff of molecules with a mass greater than 30 kDa. After the ultrafiltration step, the filtrate is passed through a 0.2 µm packed filter into a chromatograph vial and analyzed by HPLC-MS/MS.
1. Недостаток способа-прототипа состоит в том, что извлечение клавулановой кислоты из объекта исследования проводят с помощью фосфатного буфера, без применения дополнительной стадии очистки от его компонентов, что может приводить к загрязнению источника ионов масс-спектрометра.1. The disadvantage of the prototype method is that the extraction of clavulanic acid from the object of study is carried out using a phosphate buffer, without the use of an additional purification step from its components, which can lead to contamination of the ion source of the mass spectrometer.
2. Недостатком способа-прототипа является применение узкоспециализированных устройств ультрафильтрации (Amicon Microcon® YM-30), граница отсечения которых (30 кДа) является недостаточной для получения чистых фильтратов, и приводит к нарастающему снижению чувствительности средства измерения.2. The disadvantage of the prototype method is the use of highly specialized ultrafiltration devices (Amicon Microcon® YM-30), the cut-off limit of which (30 kDa) is insufficient to obtain pure filtrates, and leads to an increasing decrease in the sensitivity of the measuring instrument.
3. Недостатком способа-прототипа является отсутствие описания работоспособности подхода на образцах говядины и других представителей КРС.3. The disadvantage of the prototype method is the lack of a description of the performance of the approach on samples of beef and other cattle.
Настоящее изобретение направлено на устранение недостатков прототипа, а именно, на замену вида экстрагента и введение стадии твердофазной очистки (ТФО) с селективным к клавулановой кислоте сорбентом с анионообменными свойствами, взамен ультрафильтрации, предусмотрены возможности работы с образцами говядины.The present invention is aimed at eliminating the disadvantages of the prototype, namely, to replace the type of extractant and the introduction of a solid-phase purification (SFT) stage with a clavulanic acid-selective sorbent with anion-exchange properties, instead of ultrafiltration, it is possible to work with beef samples.
Патентуемый способ количественного определения клавулановой кислоты в мышечных тканях животного происхождения включает: извлечение анализируемого соединения из образца смесью деионизованной воды, ацетонитрила, подкисленной муравьиной кислотой; стадию твердофазной очистки на обращеннофазном сорбенте со слабыми анионо-обменными свойствами, с последующей фильтрацией сквозь насадочный фильтр в флакон хроматографа и анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.The patented method for the quantitative determination of clavulanic acid in muscle tissues of animal origin includes: extracting the analyzed compound from the sample with a mixture of deionized water, acetonitrile, acidified with formic acid; the stage of solid-phase purification on a reverse-phase sorbent with weak anion-exchange properties, followed by filtration through a packed filter into a chromatograph vial and analysis by high-performance liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry.
Способ отличается от прототипа следующими признаками. В качестве экстрагента клавулановой кислоты, применяют смесь деионизованной воды, ацетонитрила и муравьиной кислоты, в соотношении 90/9,5/0,5. Проводят процедуру ТФО, на картридже с обращеннофазным сорбентом со слабыми анионо-обменными свойствами марки Oasis WAX Waters (60 мг, 3 см3), пропусканием экстракта сквозь слой сорбента и последующей промывкой 1 см3 смеси ацетонитрила и деионизованной воды, в соотношении 1/1, элюированием клавулановой кислоты в новую пробирку с помощью 1 см3 смеси ацетонитрила с деонизованной водой и муравьиной кислотой в соотношении 49,75/49,75/0,5, соответсвенно, с последующей фильтрацией и анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.The method differs from the prototype in the following features. As an extractant of clavulanic acid, a mixture of deionized water, acetonitrile and formic acid is used, in a ratio of 90/9.5/0.5. The TPO procedure is carried out on a cartridge with a reverse-phase sorbent with weak anion-exchange properties of the brand Oasis WAX Waters (60 mg, 3 cm 3 ), passing the extract through the sorbent layer and subsequent washing with 1 cm 3 of a mixture of acetonitrile and deionized water, in a ratio of 1/1 , eluting clavulanic acid into a new tube with 1 cm 3 of a mixture of acetonitrile with deionized water and formic acid in a ratio of 49.75 / 49.75 / 0.5, respectively, followed by filtration and analysis by high performance liquid chromatography in combination with tandem mass -spectrometry.
Технический результат изобретения - возможность количественного определения клавулановой кислоты без применения узкоспециализированных расходных материалов для процедуры ультрафильтрации, повышение относительной интенсивности сигнала средства измерения за счет снижения шумов от применения этапа ТФО.The technical result of the invention is the possibility of quantitative determination of clavulanic acid without the use of highly specialized consumables for the ultrafiltration procedure, an increase in the relative intensity of the signal of the measuring instrument by reducing noise from the use of the TFO stage.
Патентуемый способ позволяет, увеличить извлечение определяемого соединения из объектов исследования относительно прототипа, увеличить аналитический отклик сигнала детектора масс-спектрометра по клавулановой кислоте, а также получать экстракты, дополнительно очищенные от примесей буфера.The patented method allows, to increase the extraction of the analyte from the objects of study relative to the prototype, to increase the analytical response of the signal of the mass spectrometer detector for clavulanic acid, and also to obtain extracts additionally purified from buffer impurities.
Заявленный технический результат достигается за счет того, что при осуществлении способа в качестве экстрагента применяют смесь деионизованной воды, ацетонитрила и муравьиной кислоты, в соотношении 90/9,5/0,5, а процедуру тфердофазной очистки, проводят на картридже с обращеннофазным сорбентом марки Oasis WAX Waters (60 мг, 3 см3), с дополнительной стадией промывки 1 см3 смеси ацетонитрила и деионизованной воды, в соотношении 1/1, и элюированием клавулановой кислоты с помощью 1 см3 смеси ацетонитрила с деонизованной водой и муравьиной кислотой в соотношении 49,75/49,75/0,5, с последующей фильтрацией перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.The claimed technical result is achieved due to the fact that in the implementation of the method, a mixture of deionized water, acetonitrile and formic acid is used as an extractant, in a ratio of 90/9.5/0.5, and the procedure of ferdophase purification is carried out on a cartridge with a reverse-phase sorbent brand Oasis WAX Waters (60 mg, 3 cm 3 ), with an additional wash step of 1 cm 3 of a mixture of acetonitrile and deionized water, in a ratio of 1/1, and elution of clavulanic acid with 1 cm 3 of a mixture of acetonitrile with deionized water and formic acid in a ratio of 49 .75/49.75/0.5, followed by filtration before analysis by high performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry.
Рекомендуемые режимы выполнения способа подобраны в результате экспериментов, проведенных заявителем: исследована зависимость полноты извлечения определяемого соединения и относительной интенсивности сигнала на детекторе масс-спектрометра от типа экстрагента; исследована возможность перехода от стадии ультрафильтрации к стадии ТФО, при различных условиях проведения ТФО на различных типах сорбентов.The recommended modes for performing the method were selected as a result of experiments conducted by the applicant: the dependence of the completeness of the extraction of the analyte and the relative intensity of the signal on the detector of the mass spectrometer on the type of extractant was studied; the possibility of transition from the stage of ultrafiltration to the stage of TFO, under different conditions of carrying out TFO on various types of sorbents, was studied.
Перед проведением экспериментов, в гомогенаты мышечной ткани КРС, вводили эквивалентное количество клавулановой кислоты. Процедура подготовки образцов к анализу, при оценке зависимости полноты извлечения определяемых соединений и относительной интенсивности сигнала на детекторе масс-спектрометра от типа экстрагента, соответствовала прототипу. В эксперименте варьировался тип экстрагента. За эталон принимали холостой образец, прошедший процедуру пробоподготовки согласно прототипу, с введением в него определяемого компонента перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.Before the experiments, an equivalent amount of clavulanic acid was injected into the homogenates of the muscle tissue of cattle. The procedure for preparing samples for analysis, when assessing the dependence of the completeness of the extraction of analytes and the relative intensity of the signal on the detector of the mass spectrometer on the type of extractant, corresponded to the prototype. The type of extractant varied in the experiment. A blank sample was taken as the standard, which underwent the sample preparation procedure according to the prototype, with the introduction of the analyte before analysis by high performance liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry.
Было установлено, что в результате смены экстрагента, увеличивается полнота извлечения компонента на 23,4% из образцов мышечной ткани. Зависимость степени извлечения от типа экстрагента отображена графически на фиг. 2 и в табл. 1.It was found that as a result of changing the extractant, the completeness of the extraction of the component increased by 23.4% from muscle tissue samples. The dependence of the degree of extraction on the type of extractant is displayed graphically in Fig. 2 and in table. one.
Согласно полученным данным можно заключить, что оптимальным экстрагентом является смесь Ацетонитрил/вода/муравьиная кислота в соотношении 9,5:90:0,5, соответственно. Что соответствует опыту №4 (Табл. 1). Сравнение масс-хроматограммы клавулановой кислоты полученной по прототипу с масс-хроматограммой, полученной в результате эксперимента №4, представлено на фиг. 3.According to the data obtained, it can be concluded that the optimal extractant is a mixture of Acetonitrile/water/formic acid in a ratio of 9.5:90:0.5, respectively. Which corresponds to experiment No. 4 (Table 1). Comparison of the mass chromatogram of clavulanic acid obtained according to the prototype with the mass chromatogram obtained as a result of experiment No. 4 is shown in Fig. 3.
Было установлено, что при замене процедуры очистки экстракта, с улырафилырафии (Amicon Microcon® YM-30) на ТФО с обращеннофазным сорбентом со слабыми анионо-обменными свойствами марки Oasis WAX Waters (60 мг, 3 см3), увеличивается относительный отклик сигнала детектора по клавулановой кислоте до 17-18%, относительно прототипа. Зависимость отклика сигнала детектора от способа очистки экстракта выражена в % от прототипа и отображена графически в табл. 2 и на фиг. 4.It was found that when replacing the extract purification procedure from ulrafilraffia (Amicon Microcon® YM-30) to TFO with a reverse-phase sorbent with weak anion-exchange properties of the Oasis WAX Waters brand (60 mg, 3 cm 3 ), the relative response of the detector signal to clavulanic acid up to 17-18%, relative to the prototype. The dependence of the response of the detector signal on the method of purification of the extract is expressed in% of the prototype and is displayed graphically in table. 2 and in FIG. four.
При проведении экспериментов, варьировали, способ очистки экстрактов (ультрафильтрация/ТФО) и способы промывки экстрактов на стадии ТФО. Эксперименты проводили на экстрактах гомогенатов мышечной ткани, полученных по опыту №4 (Табл. 1) в которые вводили эквивалентное количество клавулановой кислоты, перед стадией очистки. За промывочный объем стадии ТФО принимали 1 см3 раствора, указанного в табл. 2. После стадии промывки, анализируемый компонент элюировали в приемный флакон 1 см3 смеси ацетонитрила с деонизованной водой и муравьиной кислотой в соотношении 49,75/49,75/0,5 и анализировали. За эталонное значение принимали результат, полученный с применение стадии ультрафилырации на Amicon Microcon® YM-30.During the experiments, the method of purification of the extracts (ultrafiltration/TFO) and the methods of washing the extracts at the TFO stage were varied. Experiments were carried out on extracts of muscle tissue homogenates obtained according to experiment No. 4 (Table 1), which were injected with an equivalent amount of clavulanic acid, before the purification step. For the washing volume of the TPO stage, 1 cm 3 of the solution indicated in Table 1 was taken. 2. After the washing step, the analyzed component was eluted into a 1 cm 3 receiving vial of a mixture of acetonitrile with deionized water and formic acid in a ratio of 49.75/49.75/0.5 and analyzed. The reference value was taken as the result obtained using the ultrafilation step on Amicon Microcon® YM-30.
Согласно полученным данным, можно заключить, что оптимальным способом очистки, является ТФО, а протоколом ее проведения - дополнительная промывка смесью ацетонитрил/деионизованная вода в соотношении 1:1, что соответствует опыту №6 (Табл. 2). Введение дополнительной очистки позволяет добиться значительного увеличения сигнала детектора масс-спектрометра. На Фиг. 5 изображена разница относительных интенсивностей сигналов детектора масс-спектрометра между клавулановой кислотой, прошедшей ультрафильтрацию - «А», ТФО на Oasis WAX Waters (60 мг, 3 см3) с минимальным протоколом очистки - «Б», ТФО на Oasis WAX Waters (60 мг, 3 см3) с расширенным протоколом очистки - «В».According to the data obtained, it can be concluded that TPO is the optimal purification method, and the protocol for its implementation is additional washing with a mixture of acetonitrile/deionized water in a ratio of 1:1, which corresponds to experiment No. 6 (Table 2). The introduction of additional purification makes it possible to achieve a significant increase in the mass spectrometer detector signal. On FIG. 5 shows the difference in relative intensities of the mass spectrometer detector signals between ultrafiltrated clavulanic acid - "A", TFO on Oasis WAX Waters (60 mg, 3 cm 3 ) with minimal purification protocol - "B", TFO on Oasis WAX Waters (60 mg, 3 cm 3 ) with an extended purification protocol - "B".
Было установлено, что при применении новых протоколов экстракции и ТФО на Oasis WAX Waters (60 мг, 3 см3) с расширенным протоколом очистки значительно повышает аналитический отклик детектора масс-спектрометра при определении клавулановой кислоты в мышечных тканях КРС и позволяет проводить полноценный количественный анализ данного соединения. Пример градуировочной зависимости клавулановой кислоты, полученный в соответствии с патентуемым способом представлен на фиг. 6.It was found that when using new extraction protocols and TFO on Oasis WAX Waters (60 mg, 3 cm 3 ) with an extended purification protocol, it significantly increases the analytical response of the mass spectrometer detector in the determination of clavulanic acid in bovine muscle tissues and allows for a full quantitative analysis of this connections. An example of the calibration dependence of clavulanic acid, obtained in accordance with the patented method, is shown in Fig. 6.
Список литературыBibliography
1. Clavulanic acid - Режим доступа: https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB9722501.htm1. Clavulanic acid - Access mode: https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB9722501.htm
2. OIE list of antimicrobial agents of veterinary importance - Режим доступа: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Our_scientific_expertise/docs/pdf/AMR/ A_OIE_List_antimicrobials_May2018.pdf2. OIE list of antimicrobial agents of veterinary importance - Mode of access: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Our_scientific_expertise/docs/pdf/AMR/A_OIE_List_antimicrobials_May2018.pdf
3. Birgy A. et al. //Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2017. V. 72, I. 7. P. 1911-1914.3. Birgy A. et al. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2017. V. 72, I. 7. P. 1911-1914.
4. Реестр ветеринарных препаратов Российской Федерации. - Режим доступа: https://galen.vetrf.ru/#/registry/pharm/registry?page=l&f_chemicalName=%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%B2%D1%83%D0%BB%D0%B0%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D1%8F%20%D0%BA%D0%B8%D1%81%D0%BB%D0%BE%D 1%82%D0%B04. Register of veterinary preparations of the Russian Federation. - Access mode: https://galen.vetrf.ru/#/registry/pharm/registry?page=l&f_chemicalName=%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%B2%D1%83%D0%BB %D0%B0%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D1%8F%20%D0%BA%D0%B8%D1%81%D0%BB%D0%
5. Реестр ветеринарных препаратов Республики Беларусь. - Режим доступа: http://www.dvpn.gov.by/uploads/download/vp%2020_10.htm5. Register of veterinary drugs of the Republic of Belarus. - Access mode: http://www.dvpn.gov.by/uploads/download/vp%2020_10.htm
6. Всемирная организация здравоохранения. Европейское региональное бюро. 2011. Борьба с устойчивостью к антибиотикам с позиций безопасности пищевых продуктов в Европе. - Режим доступа: https://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0011/144695/e94889R.pdf6. World Health Organization. European Regional Office. 2011. Fighting Antibiotic Resistance from a Food Safety Perspective in Europe. - Access mode: https://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0011/144695/e94889R.pdf
7. Foroutan S.M. at al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007. V. 45. Issue 3. P. 531-534.7. Foroutan S.M. at al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007. V. 45.
8. Guo P. et al. // Food Additives & Contaminants. 2017. DOI: 10.1080/19440049.2016.1277271.8 Guo P. et al. // Food Additives & Contaminants. 2017. DOI: 10.1080/19440049.2016.1277271.
9. Baldzsi J. et al. // Studia Universitatis Babes-Bolyai Chemia. 2017. DOI: 10.24193/subbchem.2017.2.12.9. Baldzsi J. et al. // Studia Universitatis Babes-Bolyai Chemia. 2017. DOI: 10.24193/subbchem.2017.2.12.
10. Yoona R.-H. et al. //Journal of Chromatography B. 2004. 813. P. 121-12710. Yoona R.-H. et al. // Journal of Chromatography B. 2004. 813. P. 121-127
11. Parijatha B. et al. // World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences. 2017. V. 6, Issue 1, P. 1540-1554.11. Parijatha B. et al. // World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences. 2017. V. 6,
12. DubalaA. et al. //Journal of Chromatographic Science. 2015. 53. P. 694-701.12. DubalaA. et al. //Journal of Chromatographic Science. 2015. 53. P. 694-701.
13. Bhandarkar, D. et al. //ASMS. 2015. TP 280. Shimadzu Analytical (India) Pvt.Ltd.13. Bhandarkar, D. et al. //ASMS. 2015. TP 280. Shimadzu Analytical (India) Pvt.Ltd.
14. Ramanatham V.S., Venkateswarlu, P.A. // Indo American Journal of Pharmaceutical Research. 2017:7(12).14. Ramanatham V.S., Venkateswarlu, P.A. // Indo American Journal of Pharmaceutical Research. 2017:7(12).
15. Chaitanya Krishna, A. et al. // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2012. V. 4. Suppl. 3.15. Chaitanya Krishna, A. et al. // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2012. V. 4. Suppl. 3.
16. Ciric, B. et al. // Vojnosanit Pregl. 2010. 67(11). P. 887-892.16 Ciric, B. et al. // Vojnosanit Pregl. 2010.67(11). P. 887-892.
17. Reyns, T. et al. //Analytica Chimica Acta 597. 2007. P. 282-28917. Reyns, T. et al. //Analytica Chimica Acta 597. 2007. P. 282-289
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2781486C1 true RU2781486C1 (en) | 2022-10-12 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105784876A (en) * | 2016-05-12 | 2016-07-20 | 东北农业大学 | Method for detecting clavulanic acid in milk by adopting high performance liquid chromatography and application of method |
| RU2729620C1 (en) * | 2019-12-19 | 2020-08-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Method for simultaneous detection of a complex of antibiotics (tetracycline group, levomycetin, bacitracin) in meat and meat products using high-performance liquid chromatography |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105784876A (en) * | 2016-05-12 | 2016-07-20 | 东北农业大学 | Method for detecting clavulanic acid in milk by adopting high performance liquid chromatography and application of method |
| RU2729620C1 (en) * | 2019-12-19 | 2020-08-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Method for simultaneous detection of a complex of antibiotics (tetracycline group, levomycetin, bacitracin) in meat and meat products using high-performance liquid chromatography |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PUTECOVA K. et al. Mass spectrometric identification and quantification of the antibiotic clavulanic acid in broiler chicken plasma and meat as a necessary analytical tool in finding ways to increase the effectiveness of currently used antibiotics in the treatment of broiler chickens. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2021, V. 413, pp. 3561-3571, Published: 14 April 2021, [онлайн], [найдено 29.06.2022]. Найдено из Интернет: https://doi.org/10.1007/s00216-021-03307-6. MISHRA A. et al. Rapid and Simultaneous Analysis of Multiple Classes of Antimicrobial Drugs by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and Its Application to Routine Biomedical, Food, and Soil Analyses, ACS Omega 2020, V. 5, N. 49, pp. 31584-31597, [онлайн], [найдено 29.06.2022]. Найдено из Интернет: https://doi.org/10.1021/acsomega.0c03863. * |
| REYNS T. et al. Quantitative analysis of clavulanic acid in porcine tissues by liquid chromatography combined with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2007, V. 597, N. 2, pp. 282-289, [онлайн], [найдено 29.06.2022]. Найдено в PubMed PMID: 17683740, doi:10.1016/j.aca.2007.06.056. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hernández et al. | Analysis of antibiotics in biological samples by capillary electrophoresis | |
| Lu et al. | A pass-through solid-phase extraction clean-up method for the determination of 11 quinolone antibiotics in chicken meat and egg samples using ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
| Peris-Vicente et al. | Liquid chromatography, a valuable tool in the determination of antibiotics in biological, food and environmental samples | |
| Junza et al. | Multiclass method for the determination of quinolones and β-lactams, in raw cow milk using dispersive liquid–liquid microextraction and ultra high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Rambla-Alegre et al. | Analysis of selected veterinary antibiotics in fish by micellar liquid chromatography with fluorescence detection and validation in accordance with regulation 2002/657/EC | |
| Farouk et al. | Challenges in the determination of aminoglycoside antibiotics, a review | |
| Lara et al. | Advances in the determination of β-lactam antibiotics by liquid chromatography | |
| Schenck et al. | Chromatographic methods of analysis of antibiotics in milk | |
| Camara et al. | An HPLC-DAD method for the simultaneous determination of nine β-lactam antibiotics in ewe milk | |
| CN103760269B (en) | A kind of detection method of residue of veterinary drug | |
| Posyniak et al. | Sample preparation for residue determination of gentamicin and neomycin by liquid chromatography | |
| Yu et al. | Determination of fluoroquinolones, sulfonamides, and tetracyclines multiresidues simultaneously in porcine tissue by MSPD and HPLC–DAD | |
| Bruno et al. | Solid-phase extraction followed by liquid chromatography− mass spectrometry for trace determination of β-lactam antibiotics in bovine milk | |
| Pinto et al. | Determination of drugs in plasma samples by disposable pipette extraction with C18-BSA phase and liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Ferrone et al. | Air assisted dispersive liquid-liquid microextraction with solidification of the floating organic droplets (AA-DLLME-SFO) and UHPLC-PDA method: Application to antibiotics analysis in human plasma of hospital acquired pneumonia patients | |
| De Paula et al. | Simultaneous quantification of sulfamethoxazole and trimethoprim in whole egg samples by column-switching high-performance liquid chromatography using restricted access media column for on-line sample clean-up | |
| RU2729620C1 (en) | Method for simultaneous detection of a complex of antibiotics (tetracycline group, levomycetin, bacitracin) in meat and meat products using high-performance liquid chromatography | |
| El-Shahat et al. | Flow injection analysis–solid phase extraction (FIA–SPE) method for preconcentration and determination of trace amounts of penicillins using methylene blue grafted polyurethane foam | |
| US20080050838A1 (en) | Methods for matrix cleanup and analysis of drugs and metabolites in biological matrices | |
| Takeba et al. | Simultaneous determination of β-lactam antibiotics in milk by ion-pair liquid chromatography | |
| Castillo-Aguirre et al. | Determination of veterinary antibiotics in cow milk using rotating-disk sorptive extraction and liquid chromatography | |
| Chirollo et al. | Investigation of the persistence of penicillin G and dihydrostreptomycin residues in milk of lactating buffaloes (Bubalus bubalis) using ultra-high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry | |
| RU2781486C1 (en) | Method for quantitative determination of clavulanic acid in muscle tissues of animal origin | |
| Hyung et al. | Method improvement for analysis of enrofloxacin and ciprofloxacin in chicken meat: application of in-sample addition of trace ethylenediaminetetraacetic acid to isotope dilution ultra-performance liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Tuzimski et al. | A QuEChERS-based sample preparation method for the analysis of 5-nitroimidazoles in bovine milk by HPLC–DAD |