RU2779361C1 - Homogeneous transparent collagen membrane, method for production thereof, and application thereof for reconstructing the cornea - Google Patents
Homogeneous transparent collagen membrane, method for production thereof, and application thereof for reconstructing the cornea Download PDFInfo
- Publication number
- RU2779361C1 RU2779361C1 RU2021116058A RU2021116058A RU2779361C1 RU 2779361 C1 RU2779361 C1 RU 2779361C1 RU 2021116058 A RU2021116058 A RU 2021116058A RU 2021116058 A RU2021116058 A RU 2021116058A RU 2779361 C1 RU2779361 C1 RU 2779361C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- membrane
- paragraphs
- hydrogel
- cornea
- Prior art date
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 146
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 146
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 title claims abstract description 145
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 145
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 83
- 210000004087 Cornea Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 11
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 60
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000011068 load Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 36
- 238000007906 compression Methods 0.000 claims description 19
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 15
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006069 Corneal Opacity Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 claims description 4
- 241001123008 Leukoma Species 0.000 claims description 3
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 claims description 3
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000007717 corneal ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002287 keratoconus Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 2
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 claims description 2
- 201000002154 pterygium Diseases 0.000 claims description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 58
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 10
- 102000012432 Collagen Type V Human genes 0.000 description 8
- 108010022514 Collagen Type V Proteins 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 231100000803 sterility Toxicity 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000003560 Epithelium, Corneal Anatomy 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 3
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009461 vacuum packaging Methods 0.000 description 3
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 2
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 2
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 2
- 206010066968 Corneal leukoma Diseases 0.000 description 2
- 206010011033 Corneal oedema Diseases 0.000 description 2
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229940053973 Novocaine Drugs 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N Procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003786 Sclera Anatomy 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 2
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 201000004778 corneal edema Diseases 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 200000000019 wound Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000009043 Chemical Burns Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 206010011037 Corneal opacity congenital Diseases 0.000 description 1
- 210000002555 Descemet Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@]2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 206010023332 Keratitis Diseases 0.000 description 1
- 206010072138 Limbal stem cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 210000002826 Placenta Anatomy 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 241000785681 Sander vitreus Species 0.000 description 1
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001174 ascending Effects 0.000 description 1
- 239000011173 biocomposite Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000501 collagen implant Substances 0.000 description 1
- 231100000269 corneal opacity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000009864 tensile test Methods 0.000 description 1
- 230000036575 thermal burns Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000989 vascularization Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Предлагаемое изобретение относится к области биодеградируемых имплантатов для введения человеку, в частности к материалам для восстановления поврежденной роговицы глаза. The present invention relates to the field of biodegradable implants for human administration, in particular to materials for the restoration of a damaged cornea of the eye.
Уровень техникиState of the art
Роговица, роговая оболочка – передняя наиболее выпуклая прозрачная часть глазного яблока, одна из светопреломляющих сред глаза. Она имеет вид выпукло-вогнутой линзы, обращенной вогнутой частью назад. Диаметр роговицы составляет 10±0,56 мм. Толщина роговицы в центральной части 0,56 – 0,6 мм, по краям – 1,0 – 1,2 мм. Максимальная нагрузка на разрыв нормальной роговицы человека составляет 10-12 Ньютон.The cornea, the cornea is the anterior most convex transparent part of the eyeball, one of the light-refracting media of the eye. It has the form of a convex-concave lens with its concave part facing back. The corneal diameter is 10±0.56 mm. The thickness of the cornea in the central part is 0.56 - 0.6 mm, along the edges - 1.0 - 1.2 mm. The maximum rupture load of a normal human cornea is 10-12 Newtons.
Проблема восстановления поврежденных тканей роговицы, их целостности и прозрачности является актуальной для офтальмологии. Бельмо (лейкома) - патологический процесс, сопровождающийся частичным или полным помутнением роговицы. Наиболее частыми причинами образования бельма являются: кератиты различной этиологии (вирусные, туберкулезные и другие), травмы (ранения, химические и термические ожоги), оперативные вмешательства на глазу. Также встречаются врожденные помутнения роговицы, обусловленные внутриутробным воспалительным процессом. The problem of restoration of damaged corneal tissues, their integrity and transparency is relevant for ophthalmology. Belmo (leukoma) is a pathological process accompanied by partial or complete clouding of the cornea. The most common causes of the formation of a walleye are: keratitis of various etiologies (viral, tuberculosis and others), injuries (wounds, chemical and thermal burns), surgical interventions on the eye. There are also congenital corneal opacities due to intrauterine inflammation.
Для восстановления прозрачности поврежденной роговицы в клинической практике используют пересадку пациенту донорской роговицы, полученной от донора. На данный момент более чем 10 млн людей во всем мире нуждаются в пересадке донорской роговицы. Однако клиническое использование аллогенного материала осложнено ввиду отсутствия необходимого количества донорских роговиц. Более того, в некоторых случаях наблюдается реакция иммунной системы пациента на антигены донорской роговицы, что приводит к помутнению трансплантата. Одним из возможных вариантов решения данной проблемы является разработка материала для кератопластики, биосовместимого с тканями роговицы и обладающего минимальной иммуногенностью. В данном случае идет речь об отказе от использования донорской роговицы и использовании биокомпозитных полимеров.To restore the transparency of the damaged cornea, transplantation of a donor cornea obtained from a donor is used in clinical practice. Currently, more than 10 million people around the world are in need of a donor cornea transplant. However, the clinical use of allogeneic material is complicated due to the lack of the required number of donor corneas. Moreover, in some cases, the reaction of the patient's immune system to the antigens of the donor cornea is observed, which leads to opacity of the graft. One possible solution to this problem is the development of a material for keratoplasty that is biocompatible with corneal tissues and has minimal immunogenicity. In this case, we are talking about the rejection of the use of a donor cornea and the use of biocomposite polymers.
Близким к заявляемому изобретению по свойствам является однородный коллагеновый гидрогель на основе рекомбинантного коллагена человека III типа, описанный в документе WO 2006/020859 A3. Авторы этого изобретения предлагают использовать вместе с коллагеном III типа белки, способствующие адгезии и пролиферации клеток роговицы. Основным недостатком такого изделия является тот факт, что для увеличения прочностных характеристик изделие подвергается химической модификации (в том числе, обработке глютаровым альдегидом), что, является причиной повышенной иммуногенности, ограниченной биосовместимости и нарушения оптической прозрачности после имплантации.Close to the claimed invention in properties is a homogeneous collagen hydrogel based on recombinant human collagen type III, described in document WO 2006/020859 A3. The authors of this invention propose to use together with type III collagen proteins that promote adhesion and proliferation of corneal cells. The main disadvantage of such a product is the fact that in order to increase the strength characteristics, the product is subjected to chemical modification (including treatment with glutaraldehyde), which causes increased immunogenicity, limited biocompatibility, and impaired optical transparency after implantation.
Из статьи Xiao X., Pan S., Liu X., Zhu X., Connon C.J., Wu J., Mi S. «In vivo study of the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial corneas», J. Biomed. Mater. Res., 2013, 102 (6), 1782–1787 и статьи Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. «Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gels», J. Biomed. Mater. Res. A, 2010, 95 (2), 447–453 известен однородный коллагеновый гидрогель на основе коллагена крысы I типа в концентрации менее 5 мг/мл. Способ приготовления такой мембраны состоит из нескольких этапов. На первом этапе проводят нейтрализацию кислого раствора коллагена путем смешивания со средой для культивирования клеток и 1,0 М раствор NaOH. Далее, для формирования коллагенового гидрогеля полученный нейтральный раствор коллагена разливают в специальные прямоугольные формы и инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Далее полученные коллагеновые гидрогели подвергают пластической компрессии путем приложения к ним постоянной нагрузки в 120 г к большему основанию гидрогеля на протяжении 5 минут, избегая высыхания материала. Полученный таким образом материал является гидратированным, полупрозрачным и механически слабым, не держит хирургический шов, что ограничивает его применение для имплантации.From Xiao X., Pan S., Liu X., Zhu X., Connon C.J., Wu J., Mi S. "In vivo study of the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial corneas", J. Biomed . mater. Res., 2013, 102 (6), 1782–1787 and articles by Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. "Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gels", J. Biomed. mater. Res. A, 2010, 95 (2), 447–453, a homogeneous collagen hydrogel based on type I rat collagen is known at a concentration of less than 5 mg/ml. The method of preparing such a membrane consists of several stages. At the first stage, the acidic collagen solution is neutralized by mixing with the cell culture medium and 1.0 M NaOH solution. Further, to form a collagen hydrogel, the resulting neutral collagen solution is poured into special rectangular molds and incubated at +37°C for 30 minutes. Next, the obtained collagen hydrogels are subjected to plastic compression by applying a constant load of 120 g to the larger base of the hydrogel for 5 minutes, avoiding drying of the material. The material obtained in this way is hydrated, translucent and mechanically weak, does not hold a surgical suture, which limits its use for implantation.
Еще одним близким к заявляемому изобретению по способу изготовления техническим решением является сухая однородная коллагеновая мембрана на основе свиного ателоколлагена I типа в концентрации менее 5 мг/мл в виде коллагеновой мембраны Vitrigel, описанная в статье Calderón-Colón X., Xia Z., Breidenich J.L., Mulreany D.G., Guo Q., Uy O.M., Tiffany J.E., Freund D.E., McCally R.L., Schein O.D., Elisseeff J.H., Trexler M.M. «Structure and properties of collagen vitrigel membranes for ocular repair and regeneration applications», Biomaterials, 2012, 33(33), 8286–8295 и статье Chae J.J., Ambrose W.M., Espinoza F.A., Mulreany D.G., Ng S., Takezawa T., Trexler M.M., Schein O.D., Chuck R.S., Elisseeff J.H. «Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen Vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency», Acta Ophthalmol., 2015, 93 (1), e57–e66. Способ приготовления такой мембраны состоит из нескольких этапов. На первом этапе проводят нейтрализацию кислого раствора коллагена. Далее нейтральный раствор коллагена переводится в форму гидрогеля путем инкубации при +37°С. На третьем этапе полученный гидрогель переводится в форму жесткой стеклоподобной мембраны путем высушивания на воздухе. Полученная таким образом сухая коллагеновая мембрана является биосовместимой и прозрачной в in vivo условиях. Мембрана хранится в сухом виде, перед применением ее необходимо регидратировать. Однако, описываемая сухая коллагеновая мембрана на основе свиного ателоколлагена имеет существенный недостаток, заложенный в природе такого изделия и технологии его получения - слишком слабые прочностные характеристики (не держит хирургический шов), суживающие область применения этого изделия только до лечения поверхностных дефектов эпителия роговицы человека. Another technical solution close to the claimed invention in terms of the manufacturing method is a dry homogeneous collagen membrane based on type I porcine atelocollagen at a concentration of less than 5 mg / ml in the form of a Vitrigel collagen membrane, described in the article Calderón-Colón X., Xia Z., Breidenich J.L. , Mulreany D.G., Guo Q., Uy O.M., Tiffany J.E., Freund D.E., McCally R.L., Schein O.D., Elisseeff J.H., Trexler M.M. "Structure and properties of collagen vitrigel membranes for ocular repair and regeneration applications", Biomaterials, 2012, 33(33), 8286–8295 and Chae J.J., Ambrose W.M., Espinoza F.A., Mulreany D.G., Ng S., Takezawa T., Trexler M.M., Schein O.D., Chuck R.S., Elisseeff J.H. “Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen Vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency”, Acta Ophthalmol., 2015, 93 (1), e57–e66. The method of preparing such a membrane consists of several stages. At the first stage, the acid solution of collagen is neutralized. Next, the neutral collagen solution is converted into a hydrogel form by incubation at +37°C. At the third stage, the resulting hydrogel is converted into the form of a rigid glass-like membrane by drying in air. The dry collagen membrane thus obtained is biocompatible and transparent under in vivo conditions. The membrane is stored dry and must be rehydrated before use. However, the described dry collagen membrane based on porcine atelocollagen has a significant drawback inherent in the nature of such a product and the technology for its production - too weak strength characteristics (does not hold a surgical suture), narrowing the scope of this product only to the treatment of superficial defects in the human corneal epithelium.
Еще одним близким к изобретению по способу изготовления техническим решением является однородный коллагеновый гидрогель, приготовленный из концентрированного раствора коллагена (90 мг/мл), описанный в статье Tidu A., Ghoubay-Benallaoua D., Lynch B., Haye B., Illoul C., Allain J.M., Borderie V.M., Mosser G. «Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration», Acta Biomater., 2015, 22, 50–58. Авторы этой работы предлагают повышать механические характеристики изделия не за счет его химической модификации, а за счет повышения концентрации коллагена в конечном изделии. Способ приготовления такого материала состоит из концентрирования раствора коллагена при помощи ультрацентрифугирования, а затем перевод раствора коллагена в конечную форму коллагенового гидрогеля, в парах аммиака. В итоге, полученная искусственная роговица является прочной, прозрачной в дистиллированной воде (87% светопропускания в диапазоне длин волн 380-780 нм) и совместимой с клетками роговицы. На такой искусственной роговице успешно культивируются эпителиальные клетки роговицы человека, повторяя свое естественное поведение в in vitro условиях. Однако стоит отметить, что описываемая искусственная роговица на основе концентрированного раствора коллагена имеет существенный недостаток, заложенный в технологии его получения - это значительное помутнение коллагеновых гидрогелей в условиях, максимально приближенных к in vivo (см. статью Achilli M, Mantovani D. «Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation», Polymers, 2010, 2(4), 664-680).Another technical solution close to the invention in terms of the manufacturing method is a homogeneous collagen hydrogel prepared from a concentrated collagen solution (90 mg/ml), described in the article Tidu A., Ghoubay-Benallaoua D., Lynch B., Haye B., Illoul C ., Allain J.M., Borderie V.M., Mosser G. "Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration", Acta Biomater., 2015, 22, 50–58. The authors of this work propose to improve the mechanical characteristics of the product not due to its chemical modification, but by increasing the concentration of collagen in the final product. The method of preparing such a material consists of concentrating the collagen solution by ultracentrifugation, and then transferring the collagen solution to the final form of collagen hydrogel, in ammonia vapor. As a result, the resulting artificial cornea is durable, transparent in distilled water (87% light transmission in the wavelength range of 380-780 nm) and compatible with corneal cells. On such an artificial cornea, human corneal epithelial cells are successfully cultivated, repeating their natural behavior in in vitro conditions. However, it should be noted that the described artificial cornea based on a concentrated collagen solution has a significant drawback inherent in its production technology - this is a significant clouding of collagen hydrogels under conditions as close as possible to in vivo (see the article by Achilli M, Mantovani D. "Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation”, Polymers, 2010, 2(4), 664-680).
Наиболее близким к изобретению по технической сущности, способу изготовления и применения является сухая коллагеновая мембрана гетерогенной плотности на основе нативного коллагена I типа (предпочтительно нативного коллагена свиньи I типа), описанная в патенте RU 2714943. В этом патенте предложена коллагеновая мембрана, которая в гидратированном состоянии является коллагеновым гидрогелем гетерогенной плотности (жесткости), имеющая форму плоского цилиндра, основным компонентом которой является коллаген I типа. Помимо коллагена I типа в состав предлагаемой мембраны входит также коллаген V типа. Согласно патенту, добавление коллагена V типа позволяет регулировать размер фибрилл в коллагеновом гидрогеле и, как следствие, прозрачность готового изделия. Closest to the invention in technical essence, method of manufacture and use is a dry collagen membrane of heterogeneous density based on native type I collagen (preferably native type I pig collagen), described in patent RU 2714943. This patent proposes a collagen membrane, which in a hydrated state is a collagen hydrogel of heterogeneous density (rigidity), having the shape of a flat cylinder, the main component of which is type I collagen. In addition to type I collagen, the composition of the proposed membrane also includes type V collagen. According to the patent, the addition of type V collagen makes it possible to control the size of the fibrils in the collagen hydrogel and, as a result, the transparency of the finished product.
В патенте RU 2714943 предложен также способ изготовления коллагеновой мембраны. Способ приготовления подразделяется на две стадии: получение гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена и витрификация гидрогеля при постоянный пластической компрессии. Для приготовления геля авторы использовали стерильный прозрачный водный раствор, содержащий коллаген I типа и коллаген V типа. Patent RU 2714943 also proposes a method for manufacturing a collagen membrane. The method of preparation is divided into two stages: obtaining a hydrogel from a sterile transparent aqueous solution of collagen and vitrifying the hydrogel with constant plastic compression. To prepare the gel, the authors used a sterile clear aqueous solution containing type I collagen and type V collagen.
В патенте RU 2714943 предложен также способ применения коллагеновой мембраны для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы человека с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; и/или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей мембраны, и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной поверхности мембраны.Patent RU 2714943 also proposes a method for using a collagen membrane to enhance the biomechanical characteristics of the human cornea without losing its transparency; to enhance the biomechanical characteristics of human corneal leukomas in order to prepare them for keratoprosthetics; for the treatment of nonpermeable corneal leukomas using the DALK method, in which the Descemet's membrane is not damaged and the endothelial cells located on it are preserved; and/or to create a tissue-engineered construct of the cornea analog by forming a layer of human corneal epithelial cells on one of the membrane surfaces, and forming a layer of human corneal endothelial cells on the opposite membrane surface.
Одним из недостатков искусственной роговицы, описанной в патенте RU 2714943, является ее сложный состав (смесь коллагена I типа и коллагена V типа), что существенно повышает себестоимость производства такого материала. Другим недостатком является ограниченный срок хранения искусственной роговицы, так как при хранении в сухом состоянии (более 3 недель) данный материал становится излишне жестким и очень хрупким, и, как следствие, его становится невозможно использовать по назначению.One of the disadvantages of the artificial cornea described in patent RU 2714943 is its complex composition (a mixture of type I collagen and type V collagen), which significantly increases the cost of production of such a material. Another disadvantage is the limited shelf life of the artificial cornea, since when stored in a dry state (more than 3 weeks), this material becomes excessively rigid and very brittle, and, as a result, it becomes impossible to use it for its intended purpose.
Таким образом, в данной области техники остается актуальной потребность в искусственной роговице, которая является биосовместимой, неиммуногенной, оптически прозрачной и прочной, изготовленной из высокоочищенного биоматериала без применения химической модификации.Thus, there remains an urgent need in the art for an artificial cornea that is biocompatible, non-immunogenic, optically transparent and durable, made from a highly purified biomaterial without the use of chemical modification.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось улучшение технологии получения искусственной роговицы, описанной в патенте RU 2714943, с целью устранения обозначенных выше недостатков для создания прозрачного, предпочтительно однородного, коллагенового гидрогеля для восстановления роговицы человека, полученного с использованием стерильного прозрачного раствора коллагена, полученного путем экстракции из тканей человека или животных без химической модификации.The task solved in the framework of the present invention was to improve the technology for obtaining an artificial cornea, described in patent RU 2714943, in order to eliminate the above disadvantages in order to create a transparent, preferably homogeneous, collagen hydrogel for the restoration of the human cornea, obtained using a sterile transparent solution of collagen obtained by extraction from human or animal tissues without chemical modification.
В первом варианте осуществления изобретения предлагается коллагеновая мембрана для восстановления роговицы, представляющая собой коллагеновый гидрогель, содержащий нативный коллаген I типа, где содержание нативного коллагена I типа составляет от 5 до 20% мас. Коллагеновая мембрана по изобретению может иметь максимальную нагрузку на разрыв более 20Н. In the first embodiment of the invention, a collagen membrane for corneal repair is provided, which is a collagen hydrogel containing native type I collagen, where the content of native type I collagen is from 5 to 20% wt. The collagen membrane of the invention may have a maximum tensile strength of more than 20N.
Вторым вариантом осуществления изобретения является способ получения описанной выше коллагеновой мембраны. Процесс приготовления коллагеновой мембраны разделяется на три стадии: а) получение гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена, б) витрификация гидрогеля при постоянной пластической компрессии, и в) стадию регидратации коллагеновой мембраны, полученной на стадии б). The second embodiment of the invention is a method for obtaining the collagen membrane described above. The process of preparing a collagen membrane is divided into three stages: a) obtaining a hydrogel from a sterile transparent aqueous solution of collagen, b) vitrifying the hydrogel under constant plastic compression, and c) a stage of rehydration of the collagen membrane obtained in stage b).
Для приготовления геля используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий коллаген I типа. Например, в рамках способа по изобретению раствор коллагена можно центрифугировать в цилиндрическом сосуде, затем инкубировать в парах аммиака, а затем инкубировать в стерильной очищенной воде с получением геля. На втором этапе осуществляют компрессионную витрификацию гидрогеля. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии путем приложения к основаниям цилиндрического гидрогеля постоянной нагрузки в диапазоне от 1 до 5 кг. В результате витрификации получают однородную стеклоподобную мембрану, которая при дальнейшем вымачивании в стерильной очищенной воде принимает вид коллагеновой мембраны по изобретению. To prepare the gel, a sterile, clear aqueous solution containing type I collagen is used. For example, in the process of the invention, a collagen solution can be centrifuged in a cylindrical vessel, then incubated in ammonia vapor and then incubated in sterile purified water to form a gel. At the second stage, compression vitrification of the hydrogel is carried out. At this stage, the collagen hydrogel is dried. Simultaneously with drying, the cylindrical collagen hydrogel is subjected to plastic compression by applying a constant load in the range from 1 to 5 kg to the bases of the cylindrical hydrogel. As a result of vitrification, a homogeneous glass-like membrane is obtained, which, upon further soaking in sterile purified water, takes the form of a collagen membrane according to the invention.
В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению коллагеновой мембраны, описанной выше, для улучшения/восстановления анатомических и функциональных характеристик роговицы глаза. Указанное изделие можно применять для проведения передней послойной и укрепляющей кератопластики для лечения бельм и язв роговицы различной этиологии, птеригиума, кератоконуса, а также при хирургическом лечении травматических повреждений глазного яблока и для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей коллагенового гидрогеля и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной его поверхности. In a third embodiment, the present invention relates to the use of the collagen membrane described above for improving/restoring the anatomical and functional characteristics of the cornea of the eye. This product can be used for anterior layering and strengthening keratoplasty for the treatment of leukomas and corneal ulcers of various etiologies, pterygium, keratoconus, as well as for the surgical treatment of traumatic injuries of the eyeball and for creating a tissue-engineered design of the cornea analogue by forming a layer of human corneal epithelial cells on one of the surfaces of collagen hydrogel and the formation of a layer of endothelial cells of the human cornea on its opposite surface.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
На фиг. 1 представлена фотография упакованного образца изделия.In FIG. 1 is a photograph of a packaged product sample.
На фиг. 2A и фиг. 2B представлена фотография образца изделия, представляющего собой однородную коллагеновую мембрану диаметром 21 мм и толщиной 500 мкм. In FIG. 2A and FIG. 2B is a photograph of a product sample that is a uniform collagen membrane 21 mm in diameter and 500 µm thick.
На фиг. 3A и фиг. 3B представлена фотография оперированного глаза кролика, через 6 месяцев после операции, до снятия швов (фиг. 3A) и после снятия швов (фиг. 3B).In FIG. 3A and FIG. 3B is a photograph of an operated rabbit eye, 6 months postoperatively, before suture removal (FIG. 3A) and after suture removal (FIG. 3B).
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
В настоящем изобретении выражения «содержит» и «включает» и их производные используются взаимозаменяемо и понимаются как неограничивающие, т.е. допускающие присутствие/использование других компонентов, стадий, условий и т.п., помимо тех, что перечислены в явном виде. Напротив, выражения «состоит из» и «составлен из» и их производные предназначены для указания на то, что перечисленные затем компоненты, стадии, условия и т.п. являются исчерпывающими. In the present invention, the terms "comprises" and "includes" and their derivatives are used interchangeably and are understood to be non-limiting, i. allowing the presence/use of other components, steps, conditions, etc., in addition to those listed explicitly. On the contrary, the expressions "consists of" and "composed of" and their derivatives are intended to indicate that the following listed components, steps, conditions, etc. are exhaustive.
Термин «мембрана» используется в настоящем изобретения в широком смысле как обозначение тонкого прозрачного слоя, предназначенного для размещения на наружной поверхности структур глаза с целью восстановления роговицы глаза.The term "membrane" is used in the present invention in a broad sense as a designation of a thin transparent layer intended to be placed on the outer surface of eye structures in order to restore the cornea of the eye.
Термин «восстановление роговицы» используется в настоящем изобретении в широком смысле для обозначения устранения любых дефектов/повреждений роговицы глаза, в том числе для улучшения и/или восстановления анатомических и функциональных характеристик роговицы глаза.The term "corneal repair" is used in the present invention in a broad sense to refer to the elimination of any defects/damages of the cornea of the eye, including to improve and/or restore the anatomical and functional characteristics of the cornea of the eye.
В настоящем изобретении, когда для какой-либо величины приводится диапазон возможных значений, подразумевается, что граничные точки этого диапазона также включены в объем настоящего изобретения. Следует понимать, что все поддиапазоны, лежащие в приведенных диапазонах, также включены в объем настоящего изобретения, как если бы они были указаны в явном виде. В случае, когда для какой-либо величины приведены несколько диапазонов возможных значений, все диапазоны, получаемые путем комбинирования различных граничных точек из указанных диапазонов, также включены в настоящее изобретение, как если бы они были указаны в явном виде. In the present invention, when a range of possible values is given for any quantity, it is understood that the end points of this range are also included in the scope of the present invention. It is to be understood that all sub-ranges within the ranges given are also included within the scope of the present invention as if they were expressly stated. In the event that multiple ranges of possible values are given for any value, all ranges obtained by combining different endpoints from the indicated ranges are also included in the present invention as if they were explicitly stated.
В случае, когда какие-то признаки изобретения раскрыты в настоящем документе для одного варианта осуществления, эти признаки также могут быть использованы и во всех других вариантах осуществления изобретения, при условии, что это не противоречит букве и духу изобретения. In the event that any features of the invention are disclosed herein for one embodiment, those features may also be used in all other embodiments of the invention, provided that this does not contradict the letter and spirit of the invention.
В рамках настоящего изобретения термины в единственном числе охватывают также и соответствующие термины во множественном числе, и наоборот, при условии, что из контекста явно не следует иное. Within the scope of the present invention, terms in the singular also cover the corresponding terms in the plural, and vice versa, unless the context clearly implies otherwise.
В настоящем документе выражение «или» следует воспринимать как «и/или», при условии, что это не противоречит контексту, даже несмотря на то, что в некоторых случаях выражение «и/или» может использоваться в явном виде. In this document, the expression "or" should be understood as "and/or", provided that this does not contradict the context, even though in some cases the expression "and/or" may be used explicitly.
В настоящем документе выражение «изготовлен по существу из» следует понимать, как указание на то, что, хотя в изделии и могут присутствовать известные специалистам в данной области техники примеси и дополнительные компоненты, эти примеси и дополнительные компоненты могут присутствовать лишь в таком количестве, которое не оказывает существенного влияния на обсуждаемые в настоящем изобретении явления и свойства. В частности (но не ограничиваясь только этим), выражение «изготовлен по существу из» охватывает в том числе вариант «изготовлен исключительно из».As used herein, the expression "made essentially from" should be understood to indicate that although impurities and additional components known to those skilled in the art may be present in the product, these impurities and additional components may be present only in such an amount that does not significantly affect the phenomena and properties discussed in the present invention. In particular (but not limited to), the expression "made essentially from" includes, but is not limited to, the option "made exclusively from".
За исключением экспериментальной части описания, все численные значения, выражающие какие-либо количества и условия в настоящем изобретении, являются приближенными, и их следует читать, как предваряемые термином «приблизительно» или «около», даже если эти термины и не приводятся в явном виде. Напротив, в экспериментальной части описания все численные величины приведены настолько точно, насколько это возможно, однако следует понимать, что любая экспериментально определенная величина по природе своей несет в себе некоторую погрешность. Таким образом, все численные величины, приведенные в экспериментальной части описания, следует воспринимать с учетом существования указанной экспериментальной погрешности и, по меньшей мере, с учетом количества приведенных значащих цифр и стандартных методик округления. With the exception of the experimental part of the description, all numerical values expressing any quantities and conditions in the present invention are approximate and should be read as preceded by the term "approximately" or "about", even if these terms are not explicitly given. . On the contrary, in the experimental part of the description, all numerical values are given as accurately as possible, however, it should be understood that any experimentally determined value by its nature carries some error. Thus, all numerical values given in the experimental part of the description should be taken into account the existence of the specified experimental error and, at least, taking into account the number of significant figures given and standard rounding techniques.
В настоящем документе все проценты являются массовыми, если явно не указано иное. In this document, all percentages are by weight, unless expressly stated otherwise.
Как указано выше, настоящее изобретение основано на однородном коллагеновом гидрогеле, имеющем форму плоского округлого диска, который содержит коллагена I типа и таким образом обеспечивает необходимую жесткость искусственной роговицы. As stated above, the present invention is based on a homogeneous collagen hydrogel having the shape of a flat rounded disk, which contains type I collagen and thus provides the necessary stiffness of the artificial cornea.
В предпочтительном варианте толщина коллагеновой мембраны согласно изобретению составляет от 0,3 до 1,2 мм, предпочтительно 400-800 мкм, более предпочтительно 410-710 мкм, а диаметр ее лежит в диапазоне от 15 до 25 мм, предпочтительно составляет 18-23 мм, более предпочтительно 20-23 мм. Preferably, the thickness of the collagen membrane according to the invention is 0.3 to 1.2 mm, preferably 400-800 µm, more preferably 410-710 µm, and its diameter is in the range of 15 to 25 mm, preferably 18-23 mm , more preferably 20-23 mm.
В предпочтительном варианте коллагеновая мембрана изготовлена по существу из гидрогеля коллагена I типа, в некоторых вариантах осуществления - исключительно из гидрогеля коллагена I типа. In a preferred embodiment, the collagen membrane is made essentially from type I collagen hydrogel, in some embodiments, exclusively from type I collagen hydrogel.
Предпочтительно коллаген I типа в настоящем изобретении является нативным коллагеном I типа. Под нативностью коллагена в настоящем изобретении понимается то, что данный белок был экстрагирован в раствор из ткани без ферментативной обработки пепсином или другими протеолитическими препаратами. Preferably the type I collagen in the present invention is native type I collagen. Under the nativeness of collagen in the present invention is understood that this protein was extracted into solution from the tissue without enzymatic treatment with pepsin or other proteolytic drugs.
Коллаген I типа для использования в настоящем изобретении может быть получен известными методами от различных животных, включая свиней, крыс, коров, людей и т.п. В наиболее предпочтительном варианте в рамках настоящего изобретения коллаген является коллагеном свиней. Type I collagen for use in the present invention can be obtained by known methods from various animals, including pigs, rats, cows, humans, and the like. In the most preferred embodiment within the scope of the present invention, the collagen is porcine collagen.
В предпочтительном варианте осуществления в коллагеновой мембране по изобретению на коллаген I типа приходится от 5 до 20% мас., наиболее предпочтительно от 8 до 15% мас. от совокупной массы гидрогеля. In a preferred embodiment, in the collagen membrane of the invention, type I collagen accounts for 5 to 20% by weight, most preferably 8 to 15% by weight. from the total mass of the hydrogel.
Коэффициент пропускания света в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм (прозрачность) коллагеновой мембраны по изобретению, как правило, составляет не менее, чем 80% при толщине коллагенового гидрогеля 0,5 мм, в случае, когда мембрана изготовлена из раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл. The light transmittance in the wavelength range from 400 to 780 nm (transparency) of the collagen membrane according to the invention, as a rule, is not less than 80% at a collagen hydrogel thickness of 0.5 mm, in the case when the membrane is made from a collagen solution with a concentration 20 mg/ml.
Одной из отличительных особенностей коллагеновой мембраны по изобретению является то, что ее получают и хранят в гидратированном состоянии, и такая коллагеновая мембрана в течение долгого времени сохраняет прочностные характеристики, достаточные для ее фиксации с использованием хирургического шва. Это позволяет увеличить срок хранения минимум до 1 года.One of the distinguishing features of the collagen membrane according to the invention is that it is obtained and stored in a hydrated state, and such a collagen membrane for a long time retains strength characteristics sufficient for its fixation using a surgical suture. This allows you to increase the shelf life of at least 1 year.
Коллагеновая мембрана по изобретению может быть получена способом согласно второму варианту осуществления изобретения, где указанный способ включает стадию образования геля, стадию витрификации при постоянной пластической компрессии и стадию регидратации.The collagen membrane of the invention can be obtained by the method according to the second embodiment of the invention, wherein said method includes a gel formation step, a vitrification step under constant plastic compression, and a rehydration step.
Стадия образования геля Gel formation step
Для осуществления стадии образования геля наиболее предпочтительно используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий нативный коллаген свиньи I типа, полученный в соответствии с описанием, приведенным в патенте RU 2715715 и/или в патенте RU 2714943. Для наглядности, ниже приводится краткое описание способа получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена согласно патенту RU 2715715. To carry out the gel formation stage, it is most preferable to use a sterile transparent aqueous solution containing native type I porcine collagen, obtained in accordance with the description given in patent RU 2715715 and/or in patent RU 2714943. For clarity, below is a brief description of the method for obtaining a sterile transparent concentrated solution of biocompatible collagen according to patent RU 2715715.
Этот способ получения раствора коллагена включает несколько этапов, выполняемых в заданной последовательности: This method of obtaining a collagen solution includes several stages performed in a given sequence:
1) экстракция коллаген-содержащей ткани, такой как сухожилия, плацента млекопитающих животных, таких как бык, свинья, крыса или человек, в раствор разбавленной (не более 0,5 М) органической кислоты после тщательной отмывки от белковых неколлагеновых примесей с использованием щелочных или нейтральных водно-солевых растворов (например, 0,5М Na2HPO4) и от примесных белков, гликопротеинов, жиросодержащих агрегатов с использованием органических растворителей (например, ацетон, этанол, ацетонитрил); 1) extraction of collagen-containing tissue, such as tendons, placenta of mammalian animals, such as bovine, pig, rat or human, into a solution of dilute (not more than 0.5 M) organic acid after thorough washing from protein non-collagen impurities using alkaline or neutral water-salt solutions (for example, 0.5M Na 2 HPO 4 ) and from impurity proteins, glycoproteins, fat-containing aggregates using organic solvents (for example, acetone, ethanol, acetonitrile);
2) многократная (не менее 3 раз) очистка кислого водно-солевого экстракта от потенциально иммуногенных макромолекул путем избирательного осаждения коллагена высокими концентрациями хлорида натрия (до 3М) при низкой температуре раствора (менее 10°С); 2) repeated (at least 3 times) purification of the acidic water-salt extract from potentially immunogenic macromolecules by selective precipitation of collagen with high concentrations of sodium chloride (up to 3M) at a low temperature of the solution (less than 10°C);
3) Очистка кислого водно-солевого экстракта от оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул методом адсорбции оставшихся примесей на ДЭАЭ-целлюлозе; 3) Purification of the acidic water-salt extract from the remaining impurities of potentially immunogenic macromolecules by adsorption of the remaining impurities on DEAE-cellulose;
4) Очистка от пирогенных примесей методом адсорбции липосахаридов на аффинном сорбенте (например, с иммобилизованным полимиксином (Affi-Prep®) или специфичными к ЛПС антителами);4) Purification of pyrogenic impurities by adsorption of liposaccharides on an affinity sorbent (for example, with immobilized polymyxin (Affi-Prep®) or LPS-specific antibodies);
5) Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена методом микрофильтрации кислых растворов коллагена через мембраны с диаметром пор 0,22-0,45 мкм; 5) Purification from impurities of ordinary and spore-forming microorganisms, as well as supramolecular aggregates of collagen by microfiltration of acidic solutions of collagen through membranes with a pore diameter of 0.22-0.45 microns;
6) Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена, молекулы которого сохраняют структуру тройной спирали и имеют молекулярную массу не менее 300 кДа, одним из известных методов: ультрафильтрация, упаривание, лиофилизация и растворение, или абсорбция воды нерастворимыми гидрофильными полимерами. 6) Bringing the collagen solution to the required concentration of collagen protein in it, the molecules of which retain the triple helix structure and have a molecular weight of at least 300 kDa, by one of the known methods: ultrafiltration, evaporation, lyophilization and dissolution, or absorption of water by insoluble hydrophilic polymers.
Общая концентрация коллагена в водном растворе коллагена, используемом в настоящем изобретении, может быть подобрана специалистом в данной области техники, но обычно она лежит в диапазоне от 5 до 35 мг/мл, наиболее предпочтительно – в диапазоне от 20 до 30 мг/мл. The total concentration of collagen in the aqueous collagen solution used in the present invention can be adjusted by one skilled in the art, but is typically in the range of 5 to 35 mg/mL, most preferably in the range of 20 to 30 mg/mL.
Для формирования коллагенового гидрогеля необходимый объем стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу. Далее чашу с раствором центрифугируют, например при скорости вращения ротора 3000-5000 об/ мин, наиболее предпочтительно 4000 об/мин. Центрифугирование предпочтительно осуществляют при температуре +5°С в течение 30 мин. В одном варианте осуществления центрифугирование может осуществляться в планшете (например, в 24-х луночном планшете).To form a collagen hydrogel, the necessary volume of a sterile transparent collagen solution is carefully added to a cylindrical bowl, avoiding the appearance of air bubbles. Next, the bowl with the solution is centrifuged, for example at a rotor speed of 3000-5000 rpm, most preferably 4000 rpm. The centrifugation is preferably carried out at +5° C. for 30 minutes. In one embodiment, centrifugation may be performed in a plate (eg, in a 24 well plate).
После завершения центрифугирования форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в парах аммиака проводят при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в стерильной очищенной воде. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в стерильной очищенной воде проводят в течение 24 часов при +20°С. В качестве стерильной очищенной воды может быть использована вода, очищенная известными специалисту методами, такими как дистилляция, обратный осмос и т.п. After centrifugation is completed, the form with a collagen solution is incubated in ammonia vapor. In a preferred embodiment, the incubation in ammonia vapor is carried out at +4°C for 12 hours. The resulting collagen hydrogel is removed from the mold and incubated in sterile purified water. In a preferred embodiment, incubation in sterile purified water is carried out for 24 hours at +20°C. As sterile purified water, water purified by methods known to the person skilled in the art, such as distillation, reverse osmosis, and the like, can be used.
Следующий этап представляет собой компрессионную витрификацию. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. В предпочтительном варианте осуществления сушку осуществляют в условиях контролируемой температуры и влажности, например при 20°С и при относительной влажности 60-70% в течение 1 недели. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии, путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки на протяжении всего времени сушки. The next step is compression vitrification. At this stage, the collagen hydrogel is dried. In a preferred embodiment, drying is carried out under conditions of controlled temperature and humidity, for example at 20°C and at a relative humidity of 60-70% for 1 week. Simultaneously with drying, the cylindrical collagen hydrogel is subjected to plastic compression by applying a constant load to the bases of the hydrogel throughout the entire drying time.
Отличительным признаком способа получения коллагеновой мембраны согласно изобретению является то, что, в отличие от использованной в патенте RU 2714943 на стадии компрессионной витрификации нагрузки в 15-50 г, в настоящем изобретении используется более высокая нагрузка в диапазоне от 1 до 5 кг, предпочтительно около 3 кг. Прикладывание такой нагрузки во время сушки и компрессионной витрификации позволяет сформировать однородную прозрачную и прочную коллагеновую мембрану без использования коллагена V типа.A distinctive feature of the method for producing a collagen membrane according to the invention is that, in contrast to the load of 15-50 g used in patent RU 2714943 at the stage of compression vitrification, the present invention uses a higher load in the range from 1 to 5 kg, preferably about 3 kg. Applying such a load during drying and compression vitrification allows the formation of a homogeneous transparent and strong collagen membrane without the use of type V collagen.
Следующий этап представляет собой регидратацию высушенной коллагеновой мембраны. Для этого полученную мембрану вымачивают в стерильной очищенной воде. В предпочтительном варианте осуществления вымачивание осуществляют в течение небольшого промежутка времени, такого как 5 минут. Затем изделие, как будет понятно специалистам, можно разместить в предварительно простерилизованной первичной упаковке, соответствующей требованиям ГОСТ ИСО 11607-1-2018, например путем выкладывания изделия на плоской подложке, например на подложке из фторопласта. После этого изделие упаковывают под вакуумом, например в стерильный металлизированный вакуумный пакет. Такая упаковка изделия позволяет сохранять ее свойства (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность), как минимум, в течение одного года при хранении при температуре от 4°С до 10°С. The next step is the rehydration of the dried collagen membrane. To do this, the resulting membrane is soaked in sterile purified water. In a preferred embodiment, the soaking is carried out for a short period of time, such as 5 minutes. Then, as will be understood by those skilled in the art, the product can be placed in a pre-sterilized primary packaging that meets the requirements of GOST ISO 11607-1-2018, for example, by laying the product on a flat substrate, for example, on a fluoroplast substrate. After that, the product is packed under vacuum, for example in a sterile metallized vacuum bag. Such packaging of the product makes it possible to preserve its properties (thickness, diameter, transparency, strength, biocompatibility, sterility) for at least one year when stored at a temperature of 4°C to 10°C.
При использовании необходимый размер коллагеновой мембраны хирург может подрезать непосредственно в ходе операции.When using the required size of the collagen membrane, the surgeon can cut directly during the operation.
Коллагеновая мембрана по изобретению выгодным образом характеризуется максимальной нагрузкой на разрыв более 20Н, а предпочтительно - более 23Н. Максимальная нагрузка на разрыв может быть измерена любым известным специалисту способом, например в соответствии с масштабированным аналогом теста ASTM D5748.The collagen membrane according to the invention is advantageously characterized by a maximum tensile strength of more than 20N, and preferably more than 23N. The maximum tensile strength can be measured by any method known to those skilled in the art, for example according to the scaled analog of the ASTM D5748 test.
Далее в описании более подробно описаны осуществление изобретения, способ изготовления коллагеновой мембраны и ее применение. Приведенные примеры являются иллюстративными и не должны восприниматься, как основание для ограничения притязаний по изобретению.Further in the description, the implementation of the invention, the method of manufacturing a collagen membrane and its use are described in more detail. The examples given are illustrative and should not be taken as a basis for limiting the claims of the invention.
Пример 1. Способ изготовленияExample 1 Manufacturing method
Для приготовления изделия был использован стерильный прозрачный водный раствор, содержащий 30 мг/мл нативного коллагена свиньи I типа, полученный согласно патенту RU 2715715, как раскрыто выше в настоящем изобретении. Для формирования коллагенового гидрогеля 0,5 мл стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу с диаметром 15,4 мм. Далее чашу с раствором центрифугируют на скорости 4000 об/мин при температуре +5°С в течение 30 мин, после чего форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в 20 мл стерильной дистиллированной воды в течение 24 часов при +20°С. For the preparation of the product, a sterile transparent aqueous solution was used containing 30 mg/ml of native porcine type I collagen, obtained according to patent RU 2715715, as disclosed above in the present invention. To form a collagen hydrogel, 0.5 ml of a sterile, clear collagen solution is carefully added to a cylindrical bowl with a diameter of 15.4 mm, avoiding the appearance of air bubbles. Next, the bowl with the solution is centrifuged at a speed of 4000 rpm at a temperature of +5°C for 30 minutes, after which the form with the collagen solution is incubated in ammonia vapor at +4°C for 12 hours. The resulting collagen hydrogel is removed from the mold and incubated in 20 ml of sterile distilled water for 24 hours at +20°C.
Затем осуществляли сушку коллагенового гидрогеля в условиях контролируемой температуры (20°С) и влажности (60-70%) на протяжении 1 недели. Одновременно с этим коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергали пластической компрессии путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки в 3 кг на протяжении всего времени сушки. По окончании процесса витрификации компрессированный коллагеновый гидрогель принимал форму однородной стеклоподобной мембраны. Then the collagen hydrogel was dried under controlled temperature (20°C) and humidity (60-70%) for 1 week. At the same time, the cylindrical collagen hydrogel was subjected to plastic compression by applying a constant load of 3 kg to the bases of the hydrogel throughout the entire drying time. At the end of the vitrification process, the compressed collagen hydrogel took the form of a homogeneous glass-like membrane.
Полученную мембрану вымачивали в стерильной очищенной воде на протяжении 5 минут, после чего выкладывали на плоскую подложку из фторопласта, помещали в предварительно простерилизованную первичную упаковку, соответствующую требованиям ГОСТ ИСО 11607-1-2018, а затем упаковывали под вакуумом в стерильный металлизированный вакуумный пакет. The resulting membrane was soaked in sterile purified water for 5 minutes, after which it was laid out on a flat PTFE substrate, placed in a pre-sterilized primary package that meets the requirements of GOST ISO 11607-1-2018, and then packed under vacuum in a sterile metallized vacuum bag.
Толщина мембраны после регидратации составила 0,52±0,03 мм, а диаметр – 21,0±0,3 мм (cм. Фиг. 1). Упакованное таким образом изделие может сохранять свои свойства (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность), как минимум, в течение одного года при хранении при температуре от 4°С до 10°С.The membrane thickness after rehydration was 0.52±0.03 mm, and the diameter was 21.0±0.3 mm (see Fig. 1). A product packed in this way can retain its properties (thickness, diameter, transparency, strength, biocompatibility, sterility) for at least one year when stored at a temperature of 4°C to 10°C.
Измерение максимальной нагрузки на разрывMeasurement of maximum breaking load
Полученное изделие зажимали между двух металлических пластин с отверстием 3 мм в центре, таким образом, чтобы отверстие было в центральной области. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию мембраны во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении коллагеновой мембраны с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. По результатам испытаний определялась максимальная нагрузка на разрыв, характеризующая прочность образцов, которая для данной мембраны составила 23,2±0,5Н. The resulting product was clamped between two metal plates with a 3 mm hole in the center, so that the hole was in the central region. The finished structure was immersed in physiological saline to prevent the membrane from drying out during the study. Biomechanical properties were evaluated using a scaled analogue of the ASTM D5748 test. The study consists in biaxial loading of the collagen membrane at a constant rate until puncture. The tests were carried out on an Instron universal testing machine model 5982 using a ±50 N load cell of the 2530 series. Based on the test results, the maximum tensile load characterizing the strength of the samples was determined, which for this membrane was 23.2 ± 0.5 N.
Пример 2. Влияние прикладываемой во время пластической компрессии нагрузки на прозрачность и прочность готового изделияExample 2. Effect of the load applied during plastic compression on the transparency and strength of the finished product
В соответствии с методом, описанным в примере 1, и методом, описанным в патенте RU 2714943, варьируя прикладываемую во время пластической компрессии нагрузку, были приготовлены различные образцы коллагеновый мембраны толщиной около 500 мкм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 25 мг/мл. Контроль прозрачности изделий осуществляли при помощи спектрофотометра ПЭ-5400УФ (Экросхим, Россия) в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм. Из результатов, представленных в таблице 1, видно, что при нагрузке от 1 до 5 кг образцы коллагеновых гидрогелей, как с коллагеном V типа, так и без него, имеют сопоставимую прозрачность. При этом образцы коллагеновых гидрогелей без коллагена V типа обладали лучшими механическим характеристиками. Таким образом, прикладываемая во время пластической компрессии нагрузка в диапазоне от 1 до 5 кг, предпочтительно 3 кг, позволяет изготавливать коллагеновый гидрогель, который по своим оптическим характеристикам сопоставим с коллагеновым гидрогелем, приготовленным по методике, описанной в патенте RU 2714943. Однако более высокая нагрузка позволяет упростить состав гидрогеля и повысить прочность коллагенового гидрогеля по сравнению с коллагеновым гидрогелем, приготовленным по методике, описанной в патенте RU 2714943.In accordance with the method described in example 1, and the method described in patent RU 2714943, varying the load applied during plastic compression, various samples of a collagen membrane with a thickness of about 500 μm were prepared from a sterile transparent collagen solution with a concentration of 25 mg/ml. The transparency of products was controlled using a PE-5400UF spectrophotometer (Ekroskhim, Russia) in the wavelength range from 400 to 780 nm. From the results presented in Table 1, it can be seen that with a load of 1 to 5 kg, samples of collagen hydrogels, both with and without type V collagen, have comparable transparency. At the same time, samples of collagen hydrogels without type V collagen had better mechanical characteristics. Thus, the load applied during plastic compression in the range from 1 to 5 kg, preferably 3 kg, makes it possible to produce a collagen hydrogel, which, in its optical characteristics, is comparable to a collagen hydrogel prepared according to the method described in patent RU 2714943. However, a higher load allows to simplify the composition of the hydrogel and increase the strength of the collagen hydrogel compared to the collagen hydrogel prepared according to the method described in the patent RU 2714943.
Таблица 1Table 1
95,3±1,1 (λ=780)85.1±1.5 (λ=400)
95.3±1.1 (λ=780)
95,6±1,6 (λ=780)85.5±1.1 (λ=400)
95.6±1.6 (λ=780)
95,9±1,4 (λ=780)85.8±1.7 (λ=400)
95.9±1.4 (λ=780)
95,9±1,6 (λ=780)85.8±1.5 (λ=400)
95.9±1.6 (λ=780)
95,9±1,7 (λ=780)85.8±1.3 (λ=400)
95.9±1.7 (λ=780)
83,3±1,1 (λ=780)75.1±1.2 (λ=400)
83.3±1.1 (λ=780)
85,3±0,9 (λ=780)78.1±1.2 (λ=400)
85.3±0.9 (λ=780)
90,3±1,3 (λ=780)80.1±1.0 (λ=400)
90.3±1.3 (λ=780)
92,3±1,0 (λ=780)81.2±0.5 (λ=400)
92.3±1.0 (λ=780)
92,4±1,1 (λ=780)81.3±0.8 (λ=400)
92.4±1.1 (λ=780)
Пример 3. Вариант применения для усиления биомеханических характеристик глаза Example 3 Application to enhance the biomechanical characteristics of the eye
В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 500 мкм и диаметром 18,5 мм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 30 мг/мл.According to the method described in Example 1, collagen membranes about 500 µm thick and 18.5 mm in diameter were prepared from a sterile, clear collagen solution at a concentration of 30 mg/ml.
Двенадцати кроликам-самцам породы шиншилла, массой 3,5 кг, оперировали левый глаз. Выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином. Производился разрез роговицы протяженностью 5 мм на 2/3 ее глубины концентрично лимбу. В данной плоскости при помощи расслаивателя формировали роговичный интрастромальный карман «от лимба до лимба». При помощи пинцета для завязывания и шпателя вводили имплантат в полость сформированного кармана. На разрез накладывались швы. Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин по 1 капле 2 раза в день.Twelve male chinchilla rabbits weighing 3.5 kg were operated on the left eye. Performed retrobulbar blockade with 0.5% novocaine. A corneal incision was made with a length of 5 mm for 2/3 of its depth concentric to the limbus. In this plane, a corneal intrastromal pocket "from limbus to limbus" was formed using a stratifier. Using forceps for tying and a spatula, the implant was inserted into the cavity of the formed pocket. The incision was sutured. Then, for one week, okomistin was instilled 1
Клиническую оценку состояния глаз животных проводили по степени воспалительной реакции, васкуляризации роговицы, интенсивности помутнения роговицы. The clinical assessment of the condition of the eyes of animals was carried out according to the degree of inflammatory reaction, corneal vascularization, and the intensity of corneal opacity.
Результаты экспериментов оценивали морфологически. Роговую оболочку вырезали по окружности лимба, а затем фиксировали ее в формалине в течение суток. Полученный диск роговицы разрезали пополам. Оба фрагмента обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 8-10 мкм изготавливали на микротоме и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование срезов роговицы проводили под световым микроскопом при 16- и 40-кратном увеличении. The experimental results were evaluated morphologically. The cornea was excised along the circumference of the limbus, and then it was fixed in formalin for 24 hours. The resulting disc of the cornea was cut in half. Both fragments were dehydrated in ascending alcohols and embedded in paraffin.
Для исследования биомеханических характеристик роговую оболочку вырезали по окружности, захватывая при этом участок склеры, отступая 3 мм от лимба. Для чистоты эксперимента использовали свежевыкроенные ткани животных, полученные непосредственно перед проведением исследования. Полученный диск роговицы зажимали между двух металлических пластин с отверстием в центре, соответствующем диаметру роговицы, таким образом, чтобы фиксация происходила за ткань склеры, а роговица была интактной. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию тканей во время исследования. Оценку биомеханических свойств проводили при помощи исследования тканей на прокол на разрывных машинах фирмы «Instron».To study the biomechanical characteristics, the cornea was cut out along the circumference, while capturing a portion of the sclera, retreating 3 mm from the limbus. For the purity of the experiment, freshly cut animal tissues obtained immediately before the study were used. The obtained disk of the cornea was clamped between two metal plates with a hole in the center corresponding to the diameter of the cornea, so that the fixation took place behind the sclera tissue, and the cornea was intact. The finished structure was immersed in physiological saline to prevent the tissues from drying out during the study. The assessment of biomechanical properties was carried out by examining tissues for puncture using Instron tensile testing machines.
В раннем послеоперационном периоде отмечено наличие незначительного отека роговицы. Отек был слабо выражен и обусловлен, по всей видимости, наличием операционной травмы. Клинических признаков острого инфекционного поражения окружающих тканей при осмотре не обнаружено. Далее клиническая картина была стабильная. Через 2 месяца клинически значимых изменений не отмечалось. К концу периода наблюдения, через 6 месяцев, гистологическое исследование области трансплантата показало его частичное разволокнение и интеграцию с окружающей стромой. Роговица при этом незначительно утолщена. Исследование биомеханических свойств показало повышение прочностных характеристик тканей в 2,5 раза.In the early postoperative period, there was a slight corneal edema. The edema was mild and apparently due to the presence of an operative injury. Clinical signs of acute infectious lesions of surrounding tissues were not found during examination. Further, the clinical picture was stable. After 2 months, there were no clinically significant changes. By the end of the observation period, after 6 months, a histological examination of the graft area showed its partial disintegration and integration with the surrounding stroma. The cornea is slightly thickened. The study of biomechanical properties showed an increase in the strength characteristics of tissues by 2.5 times.
Пример 4. Вариант применения для восстановления целостности роговицыExample 4 Corneal Integrity Application
В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 410 мкм и диаметром 18,5 мм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 30 мг/мл.According to the method described in Example 1, collagen membranes about 410 µm thick and 18.5 mm in diameter were prepared from a sterile, clear collagen solution at a concentration of 30 mg/ml.
Шести кроликам-самцам породы шиншилла, массой 3,5 кг, оперировали левый глаз. Выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином. Выполняли несквозную трепанацию поверхностных слоёв роговицы на 2\3 её глубины. Затем при помощи расслаивателя проводили иссечение поверхностных слоёв чтобы сформировалось трепанационное ложе в области операции, в которое затем помещали коллагеновый имплантат в виде диска диаметром на 1 мм больше диаметра трепанационного отверстия и фиксировали его непрерывным швом. Излишки материала подворачивались под край трепанации и обеспечивали дополнительную механическую фиксацию. Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин по 1 капле 2 раза в день.Six male chinchilla rabbits weighing 3.5 kg were operated on the left eye. Performed retrobulbar blockade with 0.5% novocaine. Non-through trepanation of the superficial layers of the cornea was performed at 2/3 of its depth. Then, using a delaminator, the surface layers were excised to form a trepanation bed in the area of the operation, in which a collagen implant was then placed in the form of a disc with a
Клиническую оценку состояния глаз животных, морфологические проводили согласно примеру 3. Clinical assessment of the condition of the eyes of animals, morphological was carried out according to example 3.
В раннем послеоперационном периоде отмечено наличие незначительного отека роговицы. Отек был слабо выражен и обусловлен, по всей видимости, наличием операционной травмы. Клинических признаков острого инфекционного поражения окружающих тканей при осмотре не обнаружено. На 7-й день отмечалось появление новообразованных сосудов эксцентрично лимбу которые запустевали к концу 2ой недели. К концу первого месяца отмечалась стойкая стабилизация клинической картины. Через 2 месяца клинически значимых изменений не отмечалось. К концу периода наблюдения (6 месяцев) у кролика наблюдалось прозрачное приживление трансплантата и отсутствие признаков воспаления (фиг. 3). Гистологическое исследование области трансплантата показало его частичное разволокнение и интеграцию с окружающей стромой, особенно в месте контакта с краем трепанационного отверстия, в некоторых местах под трансплантатом наблюдалось образование незначительного количества соединительной ткани и признаки рубцевания. Роговица хорошо эпителизирована, гладкая и блестящая.In the early postoperative period, there was a slight corneal edema. The edema was mild and apparently due to the presence of an operative injury. Clinical signs of acute infectious lesions of surrounding tissues were not found during examination. On the 7th day, the appearance of newly formed vessels in the eccentric limbus was noted, which became empty by the end of the 2nd week. By the end of the first month, there was a stable stabilization of the clinical picture. After 2 months, there were no clinically significant changes. By the end of the observation period (6 months), the rabbit showed clear graft engraftment and no signs of inflammation (Fig. 3). Histological examination of the graft area showed its partial defibration and integration with the surrounding stroma, especially at the point of contact with the edge of the burr hole; in some places, a small amount of connective tissue was formed under the graft and signs of scarring were observed. The cornea is well epithelized, smooth and shiny.
Пример 5. Иллюстрация необходимости использования вакуумной упаковки для сохранения основных свойств изделияExample 5. Illustration of the need to use vacuum packaging to preserve the main properties of the product
В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 500 мкм и диаметром 18,5 мм из стерильного прозрачного раствора коллагена с концентрацией 30 мг/мл. Мембраны были разделены на 3 группы по способу хранения. Первая - в герметичной вакуумной упаковке; вторая – в герметичной упаковке, соответствующей требованиям ГОСТ ИСО 11607-1-2018; третья - в герметичном стакане с дистиллированной водой. По пять мембран в каждой группе было заложено на опытное хранение в интервале температур от +4°С до +10°С. Через год мембраны извлекались для проведения оценки их основных свойств (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность) в сравнении со свежеприготовленным материалом. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из результатов, представленных в таблице 2, только мембраны из группы 1 (в герметичной вакуумной упаковке) могут сохранять все свои свойства (толщина, диаметр, прозрачность, прочность, биосовместимость, стерильность), как минимум, в течение одного года при хранении при температуре от +4°С до +10°. According to the method described in Example 1, collagen membranes about 500 µm thick and 18.5 mm in diameter were prepared from a sterile, clear collagen solution at a concentration of 30 mg/ml. The membranes were divided into 3 groups according to the method of storage. The first is in sealed vacuum packaging; the second - in a sealed package that meets the requirements of GOST ISO 11607-1-2018; the third - in a sealed glass with distilled water. Five membranes in each group were placed for experimental storage in the temperature range from +4°C to +10°C. A year later, the membranes were removed to evaluate their main properties (thickness, diameter, transparency, strength, biocompatibility, sterility) in comparison with freshly prepared material. The results are shown in table 2. As can be seen from the results presented in table 2, only membranes from group 1 (in sealed vacuum packaging) can maintain all their properties (thickness, diameter, transparency, strength, biocompatibility, sterility), at least within one year when stored at temperatures from +4°С to +10°.
Таблица 2table 2
%light transmittance,
%
разрыв, НStress on
gap, N
мость*Biocompatibility
bridge*
*Биосовместимость проверяли in vitro с использованием стромальных клеток роговицы кролика.*Biocompatibility tested in vitro using rabbit corneal stromal cells.
Пример 6. Влияние содержания нативного коллагена I типа в готовом изделии на прозрачность и прочностьExample 6. Effect of the content of native type I collagen in the finished product on transparency and strength
В соответствии с методом, описанным в примере 1, были приготовлены коллагеновые мембраны толщиной около 500 мкм и диаметром 20 мм, в которых содержание нативного коллагена I типа варьировалось в диапазоне от 2% до 30% в расчете на совокупную массу изделия.In accordance with the method described in example 1, collagen membranes were prepared with a thickness of about 500 μm and a diameter of 20 mm, in which the content of native type I collagen varied in the range from 2% to 30% based on the total weight of the product.
Контроль прозрачности изделий осуществляли при помощи спектрофотометра ПЭ-5400УФ (Экросхим, Россия) в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм. Нагрузку на разрыв измеряли по методу, описанному в примере 1. В соответствии с полученными результатами, представленными в таблице 3, оптимальным по параметрам прозрачность-прочность содержанием нативного коллагена I типа в изделии является содержание от 5 до 20% мас., предпочтительно от 8 до 15% в расчете на совокупную массу готового изделия. The transparency of products was controlled using a PE-5400UF spectrophotometer (Ekroskhim, Russia) in the wavelength range from 400 to 780 nm. The tensile load was measured according to the method described in example 1. In accordance with the results obtained, presented in table 3, the optimal transparency-strength content of native type I collagen in the product is from 5 to 20% wt., preferably from 8 to 15% based on the total weight of the finished product.
Таблица 3Table 3
Claims (27)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2779361C1 true RU2779361C1 (en) | 2022-09-06 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2613417C1 (en) * | 2016-02-11 | 2017-03-16 | Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of reinforcing cornea albugo in experiment |
US20170334969A1 (en) * | 2014-11-21 | 2017-11-23 | Sewoncellontech Co., Ltd. | Method for producing high-concentration collagen for using as medical material |
RU2714943C1 (en) * | 2019-06-04 | 2020-02-21 | Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof |
RU2715715C1 (en) * | 2019-03-06 | 2020-03-03 | Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" | Sterile transparent concentrated solution of biocompatible collagen, method for production and use thereof |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20170334969A1 (en) * | 2014-11-21 | 2017-11-23 | Sewoncellontech Co., Ltd. | Method for producing high-concentration collagen for using as medical material |
RU2613417C1 (en) * | 2016-02-11 | 2017-03-16 | Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of reinforcing cornea albugo in experiment |
RU2715715C1 (en) * | 2019-03-06 | 2020-03-03 | Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" | Sterile transparent concentrated solution of biocompatible collagen, method for production and use thereof |
RU2714943C1 (en) * | 2019-06-04 | 2020-02-21 | Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
СИДОРЕНКО Е.И. Офтальмология. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015, 450 с.. ACHILLI M et.al. Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation, Polymers, 2010, 2(4), 664-680. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Palchesko et al. | Natural biomaterials for corneal tissue engineering, repair, and regeneration | |
Mahdavi et al. | Bioengineering approaches for corneal regenerative medicine | |
Liu et al. | Recombinant human collagen for tissue engineered corneal substitutes | |
Niu et al. | Heparin-modified gelatin scaffolds for human corneal endothelial cell transplantation | |
CA1336812C (en) | Human collagen processing and autoimplant use | |
Duan et al. | Dendrimer crosslinked collagen as a corneal tissue engineering scaffold: mechanical properties and corneal epithelial cell interactions | |
US7476398B1 (en) | Corneal implant and uses thereof | |
US9474791B2 (en) | Sterile autologous, allogenic or xenogenic implant and the method of its production | |
WO2016178586A2 (en) | Collagen compositions and preparation and uses thereof | |
JP2008508959A (en) | Ophthalmic devices and related methods and compositions | |
JP2009515619A (en) | Composite materials, especially for medical applications, and methods for producing the materials | |
JP2001503299A (en) | Chemical modification of biomedical materials with genipin | |
Mori et al. | Transparent biocompatible wool keratin film prepared by mechanical compression of porous keratin hydrogel | |
US20130337227A1 (en) | Non-fibrogenesis collagen material and a manufacturing method thereof | |
CN108601861A (en) | Composite collagen hydrogel material, the implanted Ophthalmoligic instrument comprising the material and manufacture the material and the method for the device | |
WO2006124946A2 (en) | Engineered extracellular matrices | |
US20170087274A1 (en) | Silica-based composite ocular device and methods | |
RU2714943C1 (en) | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof | |
Qian et al. | Dopamine‐Based High‐Transparent Hydrogel as Bioadhesive for Sutureless Ocular Tissue Repair | |
RU2779361C1 (en) | Homogeneous transparent collagen membrane, method for production thereof, and application thereof for reconstructing the cornea | |
Lan et al. | Swim bladder-derived biomaterials: structures, compositions, properties, modifications, and biomedical applications | |
CA3163956A1 (en) | Novel corneal tissues and methods of making the same | |
Jorge E et al. | In vivo Biocompatibility of Chitosan and Collagen–Vitrigel Membranes for Corneal Scaffolding: a Comparative Analysis | |
JP2013048643A (en) | Method for preparing transparentized amnion, and transparentized amnion | |
AU2015203038B2 (en) | Silica-based composite ocular device and methods |