RU2714943C1 - Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof - Google Patents
Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2714943C1 RU2714943C1 RU2019117267A RU2019117267A RU2714943C1 RU 2714943 C1 RU2714943 C1 RU 2714943C1 RU 2019117267 A RU2019117267 A RU 2019117267A RU 2019117267 A RU2019117267 A RU 2019117267A RU 2714943 C1 RU2714943 C1 RU 2714943C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- artificial cornea
- cornea
- membrane
- paragraphs
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/14—Eye parts, e.g. lenses, corneal implants; Implanting instruments specially adapted therefor; Artificial eyes
- A61F2/16—Intraocular lenses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Предлагаемое изобретение относится к категории биодеградируемых имплантатов для введения человеку, в частности к устройствам для восстановления поврежденной роговицы глаза и усилению ее биомеханических характеристик. The present invention relates to the category of biodegradable implants for administration to humans, in particular, to devices for restoring a damaged cornea and enhancing its biomechanical characteristics.
Уровень техникиState of the art
Роговица, роговая оболочка — передняя наиболее выпуклая прозрачная часть глазного яблока, одна из светопреломляющих сред глаза. Роговица у человека занимает примерно 1/16 площади наружной оболочки глаза. Она имеет вид выпукло-вогнутой линзы, обращённой вогнутой частью назад. Диаметр роговицы составляет 10±0,56 мм. Толщина роговицы в центральной части 0,56 - 0,60 мм, по краям — 1,0 - 1,2 мм. Максимальная нагрузка на разрыв нормальной роговицы человека составляет 10-12 Ньютон.The cornea, cornea is the anterior most convex transparent part of the eyeball, one of the light-refracting media of the eye. The cornea in humans occupies approximately 1/16 of the outer shell of the eye. It has the appearance of a convex-concave lens, facing the concave part back. The diameter of the cornea is 10 ± 0.56 mm. The thickness of the cornea in the central part is 0.56 - 0.60 mm, along the edges - 1.0 - 1.2 mm. The maximum burst load on the normal human cornea is 10-12 Newton.
Проблема восстановления поврежденных тканей роговицы, их целостности и прозрачности является актуальной для офтальмологии. Бельмо (лейкома) - патологический процесс, сопровождающийся частичным или полным помутнением роговицы. Наиболее частыми причинами образования бельма являются: кератиты различной этиологии (вирусные, туберкулезные и другие), травмы (ранения, химические и термические ожоги), оперативные вмешательства на глазу. Также встречаются врожденные помутнения роговицы, обусловленные внутриутробным воспалительным процессом. The problem of repairing damaged corneal tissues, their integrity and transparency is relevant for ophthalmology. Belmo (leukoma) is a pathological process accompanied by partial or complete clouding of the cornea. The most common causes of thorn formation are: keratitis of various etiologies (viral, tuberculosis and others), injuries (injuries, chemical and thermal burns), surgical interventions on the eye. Congenital corneal opacities due to intrauterine inflammatory process are also found.
Для восстановления прозрачности поврежденной роговицы в клинической практике используют пересадку пациенту донорской роговицы, полученной от донора. На данный момент более чем 10 млн людей во всем мире нуждаются в пересадке донорской роговицы. Однако клиническое использование аллогенного материала осложнено ввиду отсутствия необходимого количества донорских роговиц. Более того, в некоторых случаях наблюдается реакция иммунной системы пациента на антигены донорской роговицы, что приводит к помутнению трансплантата. Одним из возможных вариантов решения данной проблемы является разработка материала для кератопластики, биосовместимого с тканями роговицы и обладающего минимальной иммуногенностью. В данном случае идет речь об отказе от использования донорской роговицы и использовании биокомпозитных полимеров.To restore the transparency of the damaged cornea in clinical practice, a transplant of a donor cornea obtained from a donor to a patient is used. Currently, more than 10 million people worldwide need a transplant of a donor cornea. However, the clinical use of allogeneic material is complicated due to the lack of the required number of donor corneas. Moreover, in some cases, there is a reaction of the patient's immune system to antigens of the donor cornea, which leads to clouding of the graft. One of the possible solutions to this problem is the development of material for keratoplasty, biocompatible with corneal tissues and with minimal immunogenicity. In this case, we are talking about the rejection of the use of a donor cornea and the use of biocomposite polymers.
Последние достижения современной регенеративной медицины обеспечили значительный прогресс в решении данной проблемы. Так, например, в патенте RU 2421185 C2 описана искусственная роговица на основе роговицы животного. В данном патенте искусственную роговицу получают способом, в рамках которого роговая оболочка животного после изъятия подвергается химической обработке для стабилизации материала. Данная искусственная роговица является химически модифицированной тканью животного, поэтому возникает проблема иммуногенности, биосовместимости и продолжительного сохранения оптической прозрачности после имплантации.Recent advances in modern regenerative medicine have made significant progress in solving this problem. So, for example, in patent RU 2421185 C2 an artificial cornea based on an animal’s cornea is described. In this patent, an artificial cornea is obtained by a method in which the cornea of an animal, after removal, is chemically treated to stabilize the material. This artificial cornea is a chemically modified tissue of the animal, so there is a problem of immunogenicity, biocompatibility and long-term preservation of optical transparency after implantation.
Из патента US 5,067,961 известен другой вариант искусственной роговицы, который является небиодеградируемым роговичным имплантатом. В этом патенте предлагается искусственная роговица, состоящая из двух частей. Центральная зона имплантата представлена полимеризованным химически модифицированным коллагеном I и IV типов человека, периферическая - полимеризованным химически модифицированным коллагеном I типа человека. Основным недостатком данного изделия является тот факт, что это изделие не является биодеградируемым и не совместимо с живыми клетками, что через некоторое время приводит к отторжению имплантированного материала и, следовательно, к необходимости повторения операции.From US Pat. No. 5,067,961 another embodiment of the artificial cornea is known, which is a non-biodegradable corneal implant. This patent proposes a two-part artificial cornea. The central zone of the implant is represented by polymerized chemically modified collagen of human types I and IV, and the peripheral zone is represented by polymerized chemically modified collagen of human type I. The main disadvantage of this product is the fact that this product is not biodegradable and is not compatible with living cells, which after some time leads to rejection of the implanted material and, therefore, the need to repeat the operation.
Близкой к заявляемому изобретению по свойствам является искусственная роговица на основе рекомбинантного коллагена человека III типа, описанная в документе WO 2006/020859 A3. Авторы этого изобретения предлагают использовать вместе с коллагеном III типа белки, способствующие адгезии и пролиферации клеток роговицы. Основным недостатком такого изделия является тот факт, что для увеличения прочностных характеристик изделие подвергается химической модификации (в том числе, обработке глютаровым альдегидом), что является причиной повышенной иммуногенности, ограниченной биосовместимости и нарушения оптической прозрачности после имплантации.Close to the claimed invention in properties is an artificial cornea based on recombinant human type III collagen, described in document WO 2006/020859 A3. The authors of this invention propose the use, together with type III collagen, of proteins that promote adhesion and proliferation of corneal cells. The main disadvantage of such a product is the fact that in order to increase the strength characteristics, the product undergoes chemical modification (including treatment with glutaraldehyde), which is the reason for increased immunogenicity, limited biocompatibility and impaired optical transparency after implantation.
Близкой к заявляемому изобретению по способу изготовления является искусственная роговица на основе коллагена крысы I типа: пластически компрессированная коллагеновая мембрана, описанная в статье Xiao X, Pan S, Liu X, Zhu X, Connon CJ, Wu J, и др. «In vivo study of the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial corneas», J. Biomed. Mater. Res., 2013, 102(6), 1782-1787 и статье Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. «Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gel», J. Biomed. Mater. Res. A., 2010, 95(2), 447-453. Способ приготовления такой искусственной роговицы состоит из нескольких этапов. На первом этапе в одинаковой пропорции смешиваются 0,2% кислый раствор коллагена крысы I типа, среда для культивирования клеток и 1,0 М раствор NaOH. Далее, для формирования коллагенового гидрогеля полученный нейтральный раствор коллагена разливают в специальные прямоугольные формы и инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Полученные коллагеновые гидрогели подвергают пластической компрессии путем приложения к ним постоянной нагрузки в 120 г к большему основания гидрогеля на протяжении 5 минут. Полученная таким образом компрессированная искусственная роговица является полупрозрачной и механически слабой, что ограничивает ее применение для имплантации.Close to the claimed invention, the manufacturing method is an artificial cornea based on rat collagen type I: a plastically compressed collagen membrane described in Xiao X, Pan S, Liu X, Zhu X, Connon CJ, Wu J, etc. "In vivo study of the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial corneas ", J. Biomed. Mater. Res., 2013, 102 (6), 1782-1787 and article Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. “Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gel,” J. Biomed. Mater. Res. A., 2010, 95 (2), 447-453. The method for preparing such an artificial cornea consists of several stages. At the first stage, 0.2% acidic rat type I collagen solution, cell culture medium and 1.0 M NaOH solution are mixed in the same proportion. Further, to form a collagen hydrogel, the resulting neutral collagen solution is poured into special rectangular shapes and incubated at + 37 ° C for 30 minutes. The resulting collagen hydrogels are subjected to plastic compression by applying to them a constant load of 120 g to a larger base of the hydrogel for 5 minutes. The compressed artificial cornea thus obtained is translucent and mechanically weak, which limits its use for implantation.
Еще одним близким к заявляемому изобретению по способу изготовления техническим решением является искусственная роговица на основе свиного ателоколлагена в виде коллагеновой мембраны Vitrigel, описанная в статье Calderon-Colon X., Xia Z., Breidenich J.L., Mulreany D.G. и др., «Structure and properties of collagen vitrigel membranes for ocular repair and regeneraition applications», Biomaterials, 2012, 33(33), 8286-8295 и статье Chae JJ, McIntosh Ambrose W, Espinoza FA, Mulreany DG, Ng S, Takezawa T и др., «Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency», Acta Ophthalmol., 2014. Способ приготовления такой искусственной роговицы состоит из нескольких этапов. На первом этапе в одинаковой пропорции смешиваются 0,5% кислый раствор коллагена и среда для культивирования клеток (например, DMEM). В результате получается нейтральный раствор 0,25% коллагена, смешанный со средой для культивирования клеток. На втором этапе полученный нейтральный раствор 0,25% коллагена переводится в форму гидрогеля путем инкубации при +37°С. На третьем этапе полученный гидрогель переводится в форму жесткой стеклоподобной мембраны путем высушивания на воздухе. Полученная таким образом искусственная роговица является и биосовместимой, и прозрачной в in vivo условиях. Однако, описываемая искусственная роговица на основе свиного ателоколлагена имеет существенный недостаток, заложенный в самой природе такой искусственной роговицы и технологии ее получения - слишком слабые прочностные характеристики данного изделия, суживающие область применения этого изделия только до лечения поверхностных дефектов эпителия роговицы человека.Another technical solution close to the claimed invention according to the manufacturing method is an artificial cornea based on porcine atelocollagen in the form of a Vitrigel collagen membrane described in Calderon-Colon X., Xia Z., Breidenich J.L., Mulreany D.G. et al., “Structure and properties of collagen vitrigel membranes for ocular repair and regeneraition applications”, Biomaterials, 2012, 33 (33), 8286-8295 and an article by Chae JJ, McIntosh Ambrose W, Espinoza FA, Mulreany DG, Ng S, Takezawa T et al., “Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency”, Acta Ophthalmol., 2014. A method for preparing such an artificial cornea consists of several stages. At the first stage, 0.5% acidic collagen solution and cell culture medium (for example, DMEM) are mixed in the same proportion. The result is a neutral solution of 0.25% collagen mixed with cell culture medium. At the second stage, the resulting neutral solution of 0.25% collagen is converted into the hydrogel form by incubation at + 37 ° C. In the third stage, the resulting hydrogel is converted into a rigid glass-like membrane by drying in air. The artificial cornea thus obtained is both biocompatible and transparent in vivo. However, the described artificial cornea based on porcine atelocollagen has a significant drawback inherent in the very nature of such an artificial cornea and the technology for its preparation - the strength characteristics of this product are too weak, narrowing the scope of this product only to treat surface defects of the human corneal epithelium.
Наиболее близким к заявляемой искусственной роговице по технической сущности решением является искусственная роговица, приготовленная из концентрированного раствора коллагена (90 мг/мл), описанная в статье Tidu AL, Ghoubay-Benallaoua D, Lynch B, Haye B, Illoul C, Allain J-M и др. «Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration», Acta Biomaterialia, 2015, 22(C), 50-58. Авторы этой работы предлагают повышать механические характеристики изделия не за счет его химической модификации, а за счет повышения концентрации коллагена в конечном изделии. Способ приготовления такой искусственной роговицы состоит из концентрирования раствора коллагена при помощи ультрацентрифугирования, а затем перевод раствора коллагена в конечную форму коллагенового гидрогеля, в парах аммиака. В итоге, полученная искусственная роговица является прочной, прозрачной в дистиллированной воде (87% светопропускания в диапазоне длин волн 380-780 нм) и совместимой с клетками роговицы. На такой искусственной роговице успешно культивируются эпителиальные клетки роговицы человека, повторяя свое естественное поведение в in vitro условиях. Однако стоит отметить, что описываемая в этой статье искусственная роговица на основе концентрированного раствора коллагена имеет существенный недостаток, также заложенный в технологии ее получения - значительное помутнение коллагеновых гидрогелей в условиях, максимально приближенных к in vivo (см. статью Achilli M, Mantovani D. «Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation», Polymers, 2010, 2(4), 664-680). The closest solution to the claimed artificial cornea in technical essence is an artificial cornea made from a concentrated collagen solution (90 mg / ml) described in the article by Tidu AL, Ghoubay-Benallaoua D, Lynch B, Haye B, Illoul C, Allain JM, etc. . "Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration", Acta Biomaterialia, 2015, 22 (C), 50-58. The authors of this work propose to increase the mechanical characteristics of the product not due to its chemical modification, but by increasing the concentration of collagen in the final product. A method of preparing such an artificial cornea consists of concentrating a collagen solution using ultracentrifugation, and then converting the collagen solution into the final form of collagen hydrogel, in ammonia vapor. As a result, the resulting artificial cornea is strong, transparent in distilled water (87% light transmission in the wavelength range of 380-780 nm) and compatible with corneal cells. On such an artificial cornea, epithelial cells of the human cornea are successfully cultivated, repeating their natural behavior in vitro. However, it is worth noting that the artificial cornea described in this article based on a concentrated collagen solution has a significant drawback, also embedded in the technology for its preparation - significant clouding of collagen hydrogels under conditions as close as possible to in vivo (see article Achilli M, Mantovani D. “ Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation ", Polymers, 2010, 2 (4), 664-680).
Таким образом, остается актуальной потребность в искусственной роговице, которая является биосовместимой, неиммуногенной, оптически прозрачной и прочной, изготовленной из высокоочищенного биоматериала без применения химической модификации.Thus, the need remains for an artificial cornea, which is biocompatible, non-immunogenic, optically transparent and durable, made from highly purified biomaterial without the use of chemical modification.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось создание безопасной, биосовместимой, оптически прозрачной, неиммуногенной и прочной искусственной роговицы с использованием стерильного прозрачного раствора коллагена, полученного путем экстракции из тканей человека или животных без химической модификации.The objective of the present invention was to create a safe, biocompatible, optically transparent, non-immunogenic and durable artificial cornea using a sterile transparent collagen solution obtained by extraction from human or animal tissues without chemical modification.
В первом варианте осуществления изобретения предлагается искусственная роговица, представленная коллагеновой мембраной, которая в гидратированном состоянии является коллагеновым гидрогелем гетерогенной плотности, имеющим форму плоского цилиндра, основным компонентом которого является коллаген I типа в концентрации, обеспечивающей необходимую жесткость искусственной роговицы. Помимо коллагена I типа в состав предлагаемой искусственной роговицы входит коллаген V типа. Добавление коллагена V типа позволяет регулировать размер фибрилл в коллагеновом гидрогеле, а следовательно прозрачность готового изделия. Одним из отличительных признаков искусственной роговицы по изобретению является гетерогенная плотность, а именно наличие на периферии области с повышенным содержанием нативного коллагена I типа в форме кольца (называемого также «уплотненным кольцом»), облегчающего фиксацию мембраны в операционном ложе и ускоряющего процесс интеграции искусственной роговицы с окружающими тканями. In a first embodiment, the invention provides an artificial cornea represented by a collagen membrane, which in the hydrated state is a collagen hydrogel of heterogeneous density, having the form of a flat cylinder, the main component of which is type I collagen in a concentration that provides the necessary rigidity of the artificial cornea. In addition to type I collagen, the proposed artificial cornea also includes type V collagen. Adding type V collagen allows you to adjust the size of the fibrils in the collagen hydrogel, and therefore the transparency of the finished product. One of the distinguishing features of the artificial cornea according to the invention is heterogeneous density, namely the presence on the periphery of the region with a high content of native type I collagen in the form of a ring (also called a “tightened ring”), which facilitates the fixation of the membrane in the surgical bed and accelerates the process of integration of the artificial cornea with surrounding tissues.
Вторым вариантом осуществления изобретения является способ получения описанной выше искусственной роговицы. Процесс приготовления искусственной роговицы разделяется на две стадии: получение гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена и витрификация гидрогеля при постоянной пластической компрессии.A second embodiment of the invention is a method for producing the artificial cornea described above. The process of preparing an artificial cornea is divided into two stages: obtaining a hydrogel from a sterile transparent aqueous solution of collagen and vitrification of the hydrogel with constant plastic compression.
Для приготовления геля используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий коллаген I типа и коллаген V типа. Например, в рамках способа по изобретению раствор коллагена можно центрифугировать в цилиндрическом сосуде, затем инкубировать в парах аммиака, а затем инкубировать в стерильной очищенной воде с получением геля. На втором этапе осуществляют компрессионную витрификацию гидрогеля. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии путем приложения к основаниям цилиндрического гидрогеля постоянной нагрузки. В результате витрификации получают стеклоподобную мембрану гетерогенной плотности, включающую структуру уплотненного кольца.To prepare the gel using a sterile transparent aqueous solution containing type I collagen and type V collagen. For example, in the method of the invention, the collagen solution can be centrifuged in a cylindrical vessel, then incubated in ammonia vapor and then incubated in sterile purified water to form a gel. At the second stage, the compression vitrification of the hydrogel is carried out. At this stage, the collagen hydrogel is dried. Simultaneously with drying, a cylindrical collagen hydrogel is subjected to plastic compression by applying a constant load to the bases of a cylindrical hydrogel. As a result of vitrification get a glass-like membrane of heterogeneous density, including the structure of a densified ring.
В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению искусственной роговицы, описанной выше, для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы человека с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; и/или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей мембраны, и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной поверхности мембраны.In a third embodiment, the present invention relates to the use of an artificial cornea described above to enhance the biomechanical characteristics of a human cornea without losing its transparency; to enhance the biomechanical characteristics of the cornea of the human cornea in order to prepare them for keratoprosthetics for treatment with the DALK method of non-penetrating cornea sores, in which the Descemet membrane is not damaged and the endothelial cells located on it are preserved; and / or to create a tissue-engineering construction of a corneal analogue by forming a layer of human corneal epithelial cells on one of the membrane surfaces, and forming a layer of human corneal endothelial cells on the opposite surface of the membrane.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг. 1 приведено схематическое изображение одного из вариантов осуществления процесса пластической компрессии коллагенового гидрогеля по изобретениюIn FIG. 1 is a schematic representation of one embodiment of a plastic compression process of a collagen hydrogel according to the invention.
На фиг. 2 представлены схематичные изображения искусственной роговицы, где изображение А соответствует виду сверху искусственной роговицы, а изображение Б – поперечному сечению искусственной роговицы. Центральная область искусственной роговицы обозначена цифрой 1, а уплотненное кольцо – цифрой 2.In FIG. 2 shows schematic images of an artificial cornea, where image A corresponds to a top view of the artificial cornea, and image B corresponds to a cross section of the artificial cornea. The central region of the artificial cornea is indicated by the
На фиг. 3 представлена фотография образца искусственной роговицы, представляющей собой коллагеновую мембрану гетерогенной плотности, в соответствии с изобретением. По периферии выделяется уплотненное кольцо, внешний диаметр которого подрезает хирург непосредственно во время операции.In FIG. 3 is a photograph of a sample of an artificial cornea, which is a collagen membrane of heterogeneous density, in accordance with the invention. A sealed ring is allocated around the periphery, the outer diameter of which is cut by the surgeon directly during the operation.
На фиг. 4 представлены фотографии глаза кролика с пересаженной искусственной роговицей по изобретению. Левая фотография - сразу после операции; правая - через 3 недели после операции и снятия швов.In FIG. 4 shows photographs of a rabbit eye with a transplanted artificial cornea according to the invention. Left photo - immediately after surgery; right - 3 weeks after surgery and removal of sutures.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
В настоящем изобретении выражения «содержит» и «включает» и их производные используются взаимозаменяемо и понимаются как неограничивающие, т.е. допускающие присутствие/использование других компонентов, стадий, условий и т.п., помимо тех, что перечислены в явном виде. Напротив, выражения «состоит из» и «составлен из» и их производные предназначены для указания на то, что перечисленные затем компоненты, стадии, условия и т.п. являются исчерпывающими.In the present invention, the expressions “comprises” and “includes” and their derivatives are used interchangeably and are understood as non-limiting, i.e. allowing the presence / use of other components, steps, conditions, etc., other than those explicitly listed. On the contrary, the expressions “consists of” and “composed of” and their derivatives are intended to indicate that the components, stages, conditions, and so on, listed later. are comprehensive.
В настоящем изобретении, когда для какой-либо величины приводится диапазон возможных значений, подразумевается, что граничные точки этого диапазона также включены в объем настоящего изобретения. Следует понимать, что все поддиапазоны, лежащие в приведенных диапазонах, также включены в объем настоящего изобретения, как если бы они были указаны в явном виде. В случае, когда для какой-либо величины приведены несколько диапазонов возможных значений, все диапазоны, получаемые путем комбинирования различных граничных точек из указанных диапазонов, также включены в настоящее изобретение, как если бы они были указаны в явном виде.In the present invention, when a range of possible values is given for a value, it is understood that the boundary points of this range are also included in the scope of the present invention. It should be understood that all sub-ranges lying in the above ranges are also included in the scope of the present invention, as if they were indicated explicitly. In the case when for any value several ranges of possible values are given, all ranges obtained by combining various boundary points from these ranges are also included in the present invention, as if they were indicated explicitly.
В случае, когда какие-то признаки изобретения раскрыты в настоящем документе для одного варианта осуществления, эти признаки также могут быть использованы и во всех других вариантах осуществления изобретения, при условии, что это не противоречит букве и духу изобретения.In the case where some features of the invention are disclosed herein for one embodiment, these features can also be used in all other embodiments of the invention, provided that this does not contradict the letter and spirit of the invention.
В рамках настоящего изобретения термины в единственном числе охватывают также и соответствующие термины во множественном числе, и наоборот, при условии, что из контекста явно не следует иное.In the framework of the present invention, the terms in the singular also cover the corresponding terms in the plural, and vice versa, provided that the context clearly does not follow otherwise.
В настоящем документе выражение «или» следует воспринимать как «и/или», при условии, что это не противоречит контексту, даже несмотря на то, что в некоторых случаях выражение «и/или» может использоваться в явном виде.In this document, the expression “or” should be understood as “and / or”, provided that this does not contradict the context, even though in some cases the expression “and / or” may be used explicitly.
За исключением экспериментальной части описания, все численные значения, выражающие какие-либо количества и условия в настоящем изобретении, являются приближенными, и их следует читать, как предваряемые термином «приблизительно» или «около», даже если эти термины и не приводятся в явном виде. Напротив, в экспериментальной части описания все численные величины приведены настолько точно, насколько это возможно, однако следует понимать, что любая экспериментально определенная величина по природе своей несет в себе некоторую погрешность. Таким образом, все численные величины, приведенные в экспериментальной части описания, следует воспринимать с учетом существования указанной экспериментальной погрешности и, по меньшей мере, с учетом количества приведенных значащих цифр и стандартных методик округления.With the exception of the experimental part of the description, all numerical values expressing any quantities and conditions in the present invention are approximate and should be read as preceded by the term “approximately” or “about”, even if these terms are not explicitly stated . On the contrary, in the experimental part of the description, all numerical values are given as accurately as possible, but it should be understood that any experimentally determined quantity by its nature carries a certain error. Thus, all the numerical values given in the experimental part of the description should be perceived taking into account the existence of the indicated experimental error and, at least, taking into account the number of significant figures given and standard rounding methods.
В настоящем документе все проценты являются массовыми, если явно не указано иное.In this document, all percentages are by weight unless explicitly stated otherwise.
Как указано выше, настоящее изобретение основано на искусственной роговице, представленной коллагеновой мембраной, которая в гидратированном состоянии является коллагеновым гидрогелем гетерогенной плотности, имеющим форму плоского цилиндра, основным компонентом которого является коллаген I типа в концентрации, обеспечивающей необходимую жесткость искусственной роговицы. As indicated above, the present invention is based on an artificial cornea represented by a collagen membrane, which in the hydrated state is a collagen hydrogel of heterogeneous density, having the form of a flat cylinder, the main component of which is type I collagen in a concentration that provides the necessary rigidity of the artificial cornea.
Помимо коллагена I типа в состав предлагаемой искусственной роговицы входит коллаген V типа, добавление которого позволяет регулировать размер фибрилл в коллагеновом гидрогеле, а следовательно прозрачность готового изделия. In addition to type I collagen, the composition of the proposed artificial cornea includes type V collagen, the addition of which allows you to control the size of the fibrils in the collagen hydrogel, and therefore the transparency of the finished product.
Предпочтительно коллаген I типа и/или коллаген V типа в настоящем изобретении являются нативным коллагеном I типа и/или нативным коллагеном V типа, соответственно. Под нативностью коллагена (в частности, коллагена I типа) в настоящем изобретении понимается то, что данный белок был экстрагирован в раствор из ткани без ферментативной обработки пепсином или другими протеолитическими препаратами.Preferably, type I collagen and / or type V collagen in the present invention are native type I collagen and / or native type V collagen, respectively. By the nativeness of collagen (in particular type I collagen) in the present invention is meant that this protein was extracted into a solution from tissue without enzymatic treatment with pepsin or other proteolytic drugs.
Коллаген I типа и коллаген V типа для использования в настоящем изобретении могут быть получены известными методами из различных животных, включая свиней, крыс, коров, людей и т.п. В наиболее предпочтительном варианте в рамках настоящего изобретения коллаген является коллагеном свиней.Type I collagen and type V collagen for use in the present invention can be obtained by known methods from various animals, including pigs, rats, cows, humans, and the like. In the most preferred embodiment, in the framework of the present invention, collagen is pig collagen.
В предпочтительном варианте осуществления искусственной роговицы по изобретению на коллаген I типа приходится от 75 до 95% мас., наиболее предпочтительно от 85 до 90% мас. от совокупной массы коллагена в искусственной роговице. In a preferred embodiment of the artificial cornea according to the invention, type I collagen accounts for 75 to 95% by weight, most preferably 85 to 90% by weight. from the total mass of collagen in the artificial cornea.
В предпочтительном варианте осуществления искусственной роговицы по изобретению на коллаген V типа приходится от 5 до 25% мас., наиболее предпочтительно от 10 до 15% мас. от совокупной массы коллагена в искусственной роговице.In a preferred embodiment of the artificial cornea of the invention, type V collagen accounts for 5 to 25% by weight, most preferably 10 to 15% by weight. from the total mass of collagen in the artificial cornea.
Толщина искусственной роговицы по изобретению в гидратированном состоянии предпочтительно лежит в диапазоне от 0,4 до 1,2 мм, более предпочтительно от 0,5 до 0,8 мм. При этом, в некоторых вариантах осуществления изобретения толщина искусственной роговицы может быть неоднородной, например толщина центральной части искусственной роговицы может быть меньше толщины ее периферической части.The thickness of the artificial cornea according to the invention in a hydrated state preferably lies in the range from 0.4 to 1.2 mm, more preferably from 0.5 to 0.8 mm. Moreover, in some embodiments of the invention, the thickness of the artificial cornea may be heterogeneous, for example, the thickness of the central part of the artificial cornea may be less than the thickness of its peripheral part.
Одним из отличительных признаков искусственной роговицы по изобретению является ее гетерогенная плотность, а именно наличие на периферии роговицы области с повышенным содержанием нативного коллагена I типа в форме кольца (называемого также «уплотненным кольцом»). Такое кольцо облегчает фиксацию мембраны в операционном ложе и ускоряет процесс интеграции искусственной роговицы с окружающими тканями.One of the distinguishing features of the artificial cornea according to the invention is its heterogeneous density, namely the presence on the periphery of the cornea of a region with a high content of native type I collagen in the form of a ring (also called a “densified ring”). Such a ring facilitates the fixation of the membrane in the operating bed and accelerates the integration of the artificial cornea with surrounding tissues.
Внутренний диаметр уплотненного кольца обычно составляет от 7 до 10 мм. Внешний диаметр уплотненного кольца обычно составляет около 12 мм.The inner diameter of the sealed ring is usually from 7 to 10 mm. The outer diameter of the sealed ring is usually about 12 mm.
Максимальная нагрузка на разрыв искусственной роговицы по изобретению, как правило, равна 10 Н или более, например максимальная нагрузка на разрыв может лежать в диапазоне от 10 Н до 30 Н, наиболее предпочтительно – в диапазоне от 10 до 25 Н.The maximum tensile load of the artificial cornea according to the invention is typically 10 N or more, for example, the maximum tensile load may lie in the range from 10 N to 30 N, most preferably in the range from 10 to 25 N.
Коэффициент пропускания света в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм (прозрачность) искусственной роговицы по изобретению, как правило, составляет не менее, чем 85% при толщине искусственной роговицы 1,0 мм, в случае, когда мембрана изготовлена из раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл.The transmittance of light in the wavelength range from 400 to 780 nm (transparency) of the artificial cornea according to the invention, as a rule, is not less than 85% when the thickness of the artificial cornea is 1.0 mm, when the membrane is made of a collagen solution with a concentration 20 mg / ml.
Искусственная роговица по изобретению может быть получена способом получения согласно второму варианту осуществления изобретения, где указанный способ включает стадию образования геля и стадию витрификации при постоянной пластической компрессии.The artificial cornea according to the invention can be obtained by the production method according to the second embodiment of the invention, wherein said method comprises a gel formation step and a vitrification step with constant plastic compression.
Стадия образования геляGel Formation Step
Для осуществления стадии образования геля наиболее предпочтительно используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий нативный коллаген свиньи I типа и коллаген свиньи V типа, полученный в соответствии с описанием изобретения, приведенным в заявке на выдачу патента РФ на изобретение № 2019106356 от 06.03.2019. Для наглядности, ниже приводится краткое описание способа получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена согласно заявке № 2019106356.To carry out the gelation stage, it is most preferable to use a sterile transparent aqueous solution containing native type I pig collagen and type V pig collagen obtained in accordance with the description of the invention given in the application for the grant of a patent of the Russian Federation for invention No. 2019106356 of 03/06/2019. For clarity, the following is a brief description of the method for producing a sterile transparent concentrated solution of biocompatible collagen according to application No. 2019106356.
Этот способ получения раствора коллагена включает несколько этапов, выполняемых в заданной последовательности: This method of obtaining a collagen solution includes several steps that are performed in a given sequence:
1) экстракция коллаген-содержащей ткани, такой как сухожилия, плацента млекопитающих животных, таких как бык, свинья, крыса или человек, в раствор разбавленной (не более 0,5 М) органической кислоты после тщательной отмывки от белковых неколлагеновых примесей с использованием щелочных или нейтральных водно-солевых растворов (например, 0,5М Na2HPO4) и от примесных белков, гликопротеинов, жиросодержащих агрегатов с использованием органических растворителей (например, ацетон, этанол, ацетонитрил); 1) extraction of collagen-containing tissue, such as tendons, placenta of mammalian animals, such as a bull, pig, rat or human, in a solution of diluted (not more than 0.5 M) organic acid after thorough washing from protein non-collagen impurities using alkaline or neutral water-salt solutions (for example, 0.5 M Na 2 HPO 4 ) and from impurity proteins, glycoproteins, fat-containing aggregates using organic solvents (for example, acetone, ethanol, acetonitrile);
2) многократная (не менее 3 раз) очистка кислого водно-солевого экстракта от потенциально иммуногенных макромолекул путем избирательного осаждения коллагена высокими концентрациями хлорида натрия (до 3М) при низкой температуре раствора (менее 10°С); 2) repeated (at least 3 times) purification of acidic water-salt extract from potentially immunogenic macromolecules by selective deposition of collagen with high concentrations of sodium chloride (up to 3M) at a low solution temperature (less than 10 ° C);
3) Очистка кислого водно-солевого экстракта от оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул методом адсорбции оставшихся примесей на ДЭАЭ-целлюлозе; 3) Purification of acidic water-salt extract from the remaining impurities of potentially immunogenic macromolecules by adsorption of the remaining impurities on DEAE-cellulose;
4) Очистка от пирогенных примесей методом адсорбции липосахаридов на аффинном сорбенте (например, с иммобилизованным полимиксином (Affi-Prep®) или специфичными к ЛПС антителами); 4) Purification of pyrogenic impurities by adsorption of liposaccharides on an affinity sorbent (for example, with immobilized polymyxin (Affi-Prep®) or LPS-specific antibodies);
5) Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена методом микрофильтрации кислых растворов коллагена через мембраны с диаметром пор 0,22-0,45 мкм; 5) Purification of impurities of conventional and spore-forming microorganisms, as well as supramolecular collagen aggregates by microfiltration of acidic collagen solutions through membranes with pore diameters of 0.22-0.45 microns;
6) Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена, молекулы которого сохраняют структуру тройной спирали и имеют молекулярную массу не менее 300 кДа, одним из известных методов: ультрафильтрация, упаривание, лиофилизация и растворение, или абсорбция воды нерастворимыми гидрофильными полимерами.6) Bringing the collagen solution to the required concentration of collagen protein in it, the molecules of which retain the structure of the triple helix and have a molecular weight of at least 300 kDa, is one of the known methods: ultrafiltration, evaporation, lyophilization and dissolution, or absorption of water by insoluble hydrophilic polymers.
Общая концентрация коллагена в водном растворе коллагена, используемом в настоящем изобретении, может быть подобрана специалистом в данной области техники, но обычно она лежит в диапазоне от 5 до 35 мг/мл, наиболее предпочтительно – в диапазоне от 10 до 25 мг/мл.The total concentration of collagen in the aqueous collagen solution used in the present invention can be selected by a person skilled in the art, but usually it lies in the range of 5 to 35 mg / ml, most preferably in the range of 10 to 25 mg / ml.
Получение гидрогеля из водного раствора коллагена может быть осуществлено специалистами согласно известным методикам. Obtaining a hydrogel from an aqueous solution of collagen can be carried out by specialists according to known methods.
В одном варианте осуществления для формирования коллагенового гидрогеля необходимый объем стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу. Далее чашу с раствором центрифугируют, например при скорости вращения ротора 3000-5000 об/мин, наиболее предпочтительно 4000 об/мин. Центрифугирование предпочтительно осуществляют при температуре +5°С в течение 30 мин. После завершения центрифугирования форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в парах аммиака проводят при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в стерильной очищенной воде. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в стерильной очищенной воде проводят в течение 24 часов при +20°С. В качестве стерильной очищенной воды может быть использована вода, очищенная известными специалисту методами, такими как дистилляция, обратный осмос и т.п.In one embodiment, to form a collagen hydrogel, the required volume of a sterile clear collagen solution is carefully added to a cylindrical bowl to avoid air bubbles. Next, the solution cup is centrifuged, for example, at a rotor speed of 3000-5000 rpm, most preferably 4000 rpm. Centrifugation is preferably carried out at a temperature of + 5 ° C for 30 minutes After centrifugation is complete, the collagen solution form is incubated in ammonia vapors. In a preferred embodiment, the incubation in ammonia vapors is carried out at + 4 ° C for 12 hours. The resulting collagen hydrogel is removed from the mold and incubated in sterile purified water. In a preferred embodiment, incubation in sterile purified water is carried out for 24 hours at + 20 ° C. As sterile purified water, water purified by methods known to those skilled in the art, such as distillation, reverse osmosis, and the like, can be used.
Следующий этап способа по изобретению представляет собой компрессионную витрификацию. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. В предпочтительном варианте осуществления сушку осуществляют в условиях контролируемой температуры и влажности, например при 20°С и при относительной влажности 60-70%. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии, путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки. В предпочтительно варианте осуществления нагрузку 15-50 г, предпочтительно 30 г, прикладывают на протяжении всего времени сушки (см. Фиг. 1). Прикладывание нагрузки во время сушки позволяет сформировать на периферии мембраны уплотненное кольцо, которое облегчает фиксацию искусственной роговицы в операционном ложе. Размер такого кольца можно регулировать за счет изменения диаметра исходного гидрогеля и/или изменения прикладываемой нагрузки. По окончании процесса витрификации компрессированный коллагеновый гидрогель переходит в форму стеклоподобной мембраны с уплотненным внешним кольцом. The next step of the method according to the invention is compression vitrification. At this stage, the collagen hydrogel is dried. In a preferred embodiment, the drying is carried out under conditions of controlled temperature and humidity, for example at 20 ° C and at a relative humidity of 60-70%. Simultaneously with drying, a cylindrical collagen hydrogel is subjected to plastic compression by applying a constant load to the hydrogel bases. In a preferred embodiment, a load of 15-50 g, preferably 30 g, is applied throughout the drying time (see FIG. 1). Applying a load during drying allows the formation of a sealed ring on the periphery of the membrane, which facilitates the fixation of the artificial cornea in the surgical bed. The size of such a ring can be adjusted by changing the diameter of the original hydrogel and / or changing the applied load. At the end of the vitrification process, the compressed collagen hydrogel passes into the form of a glass-like membrane with a sealed outer ring.
Применение искусственной роговицы, полученной в соответствии с настоящим изобретением, может быть осуществлено специалистом в рассматриваемой области техники согласно известным методикам. В частности, искусственная роговица по изобретению может быть использована для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; и/или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей искусственной роговицы, и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной поверхности искусственной роговицы. The use of an artificial cornea obtained in accordance with the present invention can be carried out by a person skilled in the art according to known methods. In particular, the artificial cornea according to the invention can be used to enhance the biomechanical characteristics of the human cornea without losing its transparency; to enhance the biomechanical characteristics of the corneal cervix in order to prepare them for keratoprosthetics; for treatment with the DALK method of non-penetrating cornea sores, in which the Descemet membrane is not damaged and the endothelial cells located on it are preserved; and / or to create a tissue-engineering construction of a corneal analogue by forming a layer of human corneal epithelial cells on one of the surfaces of the artificial cornea, and forming a layer of human corneal endothelial cells on the opposite surface of the artificial cornea.
Далее в описании более подробно описаны осуществление изобретения, способ изготовления искусственной роговицы и ее применение. Приведенные примеры являются иллюстративными и не должны восприниматься, как основание для ограничения притязаний по изобретению. The following describes in more detail the implementation of the invention, a method of manufacturing an artificial cornea and its use. The examples given are illustrative and should not be construed as a basis for limiting the claims of the invention.
Пример 1. Способ изготовления искусственной роговицы. Example 1. A method of manufacturing an artificial cornea.
Для приготовления искусственной роговицы с гетерогенной плотностью был использован стерильный прозрачный водный раствор, содержащий 9 мг/мл нативного коллагена свиньи I типа и 1 мг/мл коллагена свиньи V типа, полученный согласно заявке на патент РФ на изобретение № 2019106356, как раскрыто выше в настоящем изобретении. Для формирования коллагенового гидрогеля 2 мл стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу с диаметром 15 мм. Далее чашу с раствором центрифугируют на скорости 4000 об/мин при температуре +5°С в течение 30 мин. После чего форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в 20 мл стерильной дистиллированной воде в течение 24 часов при +20°С.To prepare an artificial cornea with heterogeneous density, a sterile transparent aqueous solution was used containing 9 mg / ml of native pig collagen type I and 1 mg / ml of collagen pig type V obtained according to the patent application of the Russian Federation for invention No. 2019106356, as described above in this invention. To form a collagen hydrogel, 2 ml of a sterile transparent collagen solution is carefully added to avoid the appearance of air bubbles in a cylindrical bowl with a diameter of 15 mm. Next, the solution bowl is centrifuged at a speed of 4000 rpm at a temperature of + 5 ° C for 30 minutes. After that, the form with the collagen solution is incubated in ammonia vapor at + 4 ° C for 12 hours. The resulting collagen hydrogel is removed from the mold and incubated in 20 ml of sterile distilled water for 24 hours at + 20 ° C.
Затем производят сушку коллагенового гидрогеля в условиях контролируемой температуры (20°С) и влажности (60-70%). Одновременно с этим коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергается пластической компрессии путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки в 30 г на протяжении всего времени сушки. Это позволяет сформировать на периферии мембраны уплотненное кольцо, которое необходимо для фиксации искусственной роговицы в операционном ложе. По окончании процесса витрификации компрессированный коллагеновый гидрогель переходит в форму стеклоподобной мембраны с уплотненным внешним кольцом. Перед применением мембрану регидратировали в 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Толщина мембраны после регидратации составила 0,61±0,04 мм, внутренний диаметр уплотненного кольца составил 10 мм (см. Фиг. 3).Then the collagen hydrogel is dried under conditions of controlled temperature (20 ° C) and humidity (60-70%). At the same time, a cylindrical collagen hydrogel undergoes plastic compression by applying a constant load of 30 g to the hydrogel bases over the entire drying time. This allows you to form a sealed ring on the periphery of the membrane, which is necessary for fixing the artificial cornea in the surgical bed. At the end of the vitrification process, the compressed collagen hydrogel passes into the form of a glass-like membrane with a sealed outer ring. Before use, the membrane was rehydrated in 0.1 ml of sterile saline. The membrane thickness after rehydration was 0.61 ± 0.04 mm, the inner diameter of the sealed ring was 10 mm (see Fig. 3).
Измерение максимальной нагрузки на разрывMaximum tensile strength measurement
Полученную коллагеновую мембрану зажимали между двух металлических пластин с отверстием 3 мм в центре, таким образом, чтобы отверстие было в центральной области. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию мембраны во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении коллагеновой мембраны с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. По результатам испытаний определялась максимальная нагрузка на разрыв, характеризующая прочность образцов, которая для данной мембраны составила 15±2Н.The resulting collagen membrane was clamped between two metal plates with a 3 mm hole in the center, so that the hole was in the central region. The finished structure was lowered into physiological saline to prevent the membrane from drying out during the study. Biomechanical properties were evaluated using a scaled analogue of the ASTM D5748 test. The study consists in biaxial loading of the collagen membrane at a constant speed to a puncture. The tests were carried out on an Instron universal testing machine model 5982 using a load sensor ± 50 N of the 2530 series. The maximum tensile load, which characterizes the strength of the samples, which for this membrane was 15 ± 2N, was determined from the test results.
Пример 2. Влияние концентрации коллагена в растворе, используемом для приготовления искусственной роговицы, на ее биомеханические свойства.Example 2. The effect of the concentration of collagen in the solution used to prepare the artificial cornea on its biomechanical properties.
Для того, чтобы искусственная роговица успешно интегрировалась с окружающими тканями, она должна обладать достаточными механическими свойствами, близкими к свойствам нативной роговицы человека.In order for the artificial cornea to successfully integrate with the surrounding tissues, it must have sufficient mechanical properties close to those of the native human cornea.
Задача состояла в том, чтобы определить максимальную нагрузку, которую необходимо приложить к изделию, чтобы разорвать его. В соответствии с методом, описанном в примере 1, используя исходно стерильные прозрачные растворы коллагена, в которых концентрация коллагена варьировалась от 5 мг/мл до 35 мг/мл, были приготовлены образцы изделия толщиной 500 мкм с различным содержанием коллагена, и следовательно с различными прочностными характеристиками. Как и ожидалось, увеличение содержания коллагена в изделии приводит к усилению его прочностных характеристик. При этом, как видно из таблицы 1, когда концентрация коллагена в растворе, используемом для приготовления изделия, начинает превышать 10 мг/мл, то прочностные характеристики изделия достигают или превышают прочностные характеристики нормальной роговицы человека (максимальная нагрузка на разрыв для нормальной роговицы человека - 12 ±2 H)The task was to determine the maximum load that must be applied to the product in order to break it. In accordance with the method described in example 1, using initially sterile transparent collagen solutions in which the collagen concentration ranged from 5 mg / ml to 35 mg / ml, product samples were prepared with a thickness of 500 μm with different collagen content, and therefore with different strength characteristics. As expected, an increase in the collagen content in the product leads to an increase in its strength characteristics. Moreover, as can be seen from table 1, when the concentration of collagen in the solution used to prepare the product begins to exceed 10 mg / ml, the strength characteristics of the product reach or exceed the strength characteristics of the normal human cornea (the maximum burst load for a normal human cornea is 12 ± 2 H)
Таблица 1Table 1
Пример 3. Влияние концентрации коллагена в растворе, используемом для приготовления искусственной роговицы, на ее прозрачностьExample 3. The effect of the concentration of collagen in the solution used to prepare the artificial cornea on its transparency
В соответствии с методом, описанным в примере 1, используя стерильные прозрачные растворы коллагена, в которых концентрация коллагена варьировалась от 5 мг/мл до 35 мг/мл, были приготовлены образцы изделия толщиной 500 мкм и 700 мкм с различным содержанием коллагена. Контроль прозрачности коллагеновых гидрогелей был проведен при помощи планшетного спектрофотометра (xMarkTM, Biorad) в видимом спектре длин волн. Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что при концентрации коллагена в растворе, используемом для приготовления изделия, превышающей 25 мг/мл, и при обоих вариантах толщины мембраны, пропускание видимого света становится менее 90%, что не вполне соответствует требованиям прозрачности.In accordance with the method described in example 1, using sterile transparent collagen solutions in which the collagen concentration ranged from 5 mg / ml to 35 mg / ml, product samples were prepared with a thickness of 500 μm and 700 μm with different collagen content. The transparency control of collagen hydrogels was carried out using a tablet spectrophotometer (xMark TM , Biorad) in the visible wavelength spectrum. From the results presented in table 2, it can be seen that when the collagen concentration in the solution used to prepare the product exceeds 25 mg / ml, and with both variants of the membrane thickness, the transmittance of visible light becomes less than 90%, which does not fully meet the transparency requirements.
Таблица 2table 2
Пример 4. Определение оптимального соотношения между коллагеном I типа и коллагеном V типа в искусственной роговице.Example 4. Determination of the optimal ratio between type I collagen and type V collagen in an artificial cornea.
По методике, описанной в примере 1, используя стерильные прозрачные растворы коллагена, в которых общее содержание коллагена составляло 25 мг/мл, была приготовлена линейка изделий, имеющих различные соотношения между коллагеном I типа и коллагеном V типа. Полученные изделия исследовали по свойствам прозрачности и биомеханических характеристик. Контроль прозрачности коллагеновых гидрогелей был проведен при помощи планшетного спектрофотометра (xMarkTM, Biorad) в видимом спектре длин волн, а биомеханические характеристики изделий определяли по методике, описанной в примере 1.According to the method described in example 1, using sterile transparent collagen solutions in which the total collagen content was 25 mg / ml, a line of products was prepared having different ratios between type I collagen and type V collagen. The resulting products were investigated by the properties of transparency and biomechanical characteristics. The transparency control of collagen hydrogels was carried out using a tablet spectrophotometer (xMark TM , Biorad) in the visible wavelength spectrum, and the biomechanical characteristics of the products were determined according to the method described in example 1.
Как видно из результатов, представленных в таблице 3, изделие, изготовленное полностью из коллагена I типа, обладает наилучшими прочностными характеристиками, однако прозрачность изделия, процент пропускания видимого света через изделие, не достигал 90%, что считалось неудовлетворительным. Добавление коллагена V типа в состав изделия позволяет улучшить прозрачность, однако при этом ухудшаются прочностные характеристики. Таким образом, оптимальным соотношением между коллагеном I типа и коллагеном V типа в конечном изделии с точки зрения прозрачности и прочности является следующее - коллаген I типа 85-90%, коллаген V типа - 10-15%.As can be seen from the results presented in table 3, the product made entirely of type I collagen has the best strength characteristics, however, the transparency of the product, the percentage of visible light transmission through the product, did not reach 90%, which was considered unsatisfactory. The addition of type V collagen to the composition of the product can improve transparency, but at the same time, the strength characteristics are deteriorated. Thus, the optimal ratio between type I collagen and type V collagen in the final product from the point of view of transparency and strength is the following - type I collagen 85-90%, type V collagen 10-15%.
Таблица 3Table 3
Пример 5. Способ проведения операции глубокой послойной пересадки роговицы (DALK) с использованием искусственной роговицы по изобретению.Example 5. A method for performing a deep layered corneal transplant (DALK) operation using the artificial cornea of the invention.
По методике, описанной в примере 1, было изготовлено несколько искусственных роговиц. Эксперимент проводили на 30 кроликах-самцах породы Шиншилла. Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом фирмы «Leica» при увеличении в 15 раз, использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani». Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% ультракаином. При помощи трепана формировалась круговая насечка на роговице на половину ее толщины. Ножом-расслаивателем осуществлялось удаление поверхностных слоев роговицы в пределах сформированного разреза до десцеметовой мембраны. В сформированное ложе имплантировали искусственную роговицу и фиксировали непрерывным швом. Сверху имплантат фиксировали при помощи жесткой линзы для защиты коллагена от смаргивания и других механических повреждений. According to the method described in example 1, several artificial corneas were made. The experiment was performed on 30 chinchilla male rabbits. The operation on the eyes of rabbits was performed under a Leica microscope with a magnification of 15 times, using a delaminator and suture material from Mani. The course of the operation was as follows. For anesthesia, animals underwent retrobulbar blockade of 0.5% ultracaine. With the help of a trepan, a circular notch was formed on the cornea at half its thickness. The exfoliating knife removed the surface layers of the cornea within the formed incision to the descemet membrane. An artificial cornea was implanted into the formed bed and fixed with a continuous suture. The implant was fixed on top with a hard lens to protect collagen from blinking and other mechanical damage.
Результатыresults
В первые сутки после операции у животных глаз был умеренно раздражен, передняя камера глаза глубокая, влага передней камеры прозрачная. Было отмечено наличие незначительной перикорнеальной инъекции, полное отсутствие слизистой гнойной отделяемой. Искусственная роговица сохранила прозрачность, сохранялась реакция зрачка на свет, что свидетельствовало о минимальном уровне хирургической травмы. Через две недели после операции отмечалось видимое офтальмоскопически прирастание коллагеновой мембраны к роговице в области контакта. Сама искусственная роговица была полностью покрыта эпителием. Через три недели после операции ситуация с общим состоянием глаза для животных не изменилась. У животных оптический срез роговицы был абсолютно прозрачен во всех секторах зоны операции. Глаз был спокоен, перикорнеальная инъекция, неоваскуляризация, слезотечение и слизистая отделяемая отсутствовали (см. рис. 4). In the first days after the operation, the eye was moderately irritated in animals, the anterior chamber of the eye was deep, the moisture of the anterior chamber was transparent. It was noted the presence of a slight pericorneal injection, the complete absence of purulent discharge mucosa. The artificial cornea retained transparency, the pupil’s reaction to light remained, indicating a minimal level of surgical trauma. Two weeks after surgery, there was a visible ophthalmoscopic increase in the collagen membrane to the cornea in the contact area. The artificial cornea itself was completely covered with epithelium. Three weeks after surgery, the situation with the general condition of the eye for animals has not changed. In animals, the optical section of the cornea was completely transparent in all sectors of the operation area. The eye was calm, pericorneal injection, neovascularization, lacrimation and mucous discharge were absent (see Fig. 4).
Пример 6. Преимущества, достигаемые при использовании нативного коллагена I типа.Example 6. The benefits achieved when using native collagen type I.
По методике, описанной в примере 1, было изготовлено две группы искусственных роговиц. В первую группу вошли изделия, изготовленные из раствора нативного коллагена свиньи I типа (полученного согласно заявке на патент РФ на изобретение №2019106356 от 06.03.2019). Во вторую группу вошли изделия, изготовленные из ателоколлагена свиньи I типа (продукт P C11-AD, ООО фирмы «Имтек», Россия), т.е. коллагена, который на этапе изготовления был подвергнут обработке пепсином. According to the method described in example 1, two groups of artificial corneas were made. The first group included products made from a solution of native pig collagen type I (obtained according to the application for a patent of the Russian Federation for invention No.201106356 of 03/06/2019). The second group included products made from atelocollagen of type I pig (product P C11-AD, LLC Imtek, Russia), i.e. collagen, which at the manufacturing stage was subjected to pepsin treatment.
Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом фирмы «Leica» при увеличении в 15 раз, использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani». Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% ультракаином. При помощи трепана формировалась круговая насечка на роговице на половину ее толщины. Ножом-расслаивателем осуществлялось удаление поверхностных слоев роговицы в пределах сформированного разреза до десцеметовой мембраны. В сформированное ложе имплантировали искусственную роговицу и фиксировали непрерывным швом. Сверху имплантат фиксировался при помощи жесткой линзы для защиты коллагена от смаргивания и других механических повреждений. The operation on the eyes of rabbits was performed under a Leica microscope with a magnification of 15 times, using a delaminator and suture material from Mani. The course of the operation was as follows. For anesthesia, animals underwent retrobulbar blockade of 0.5% ultracaine. With the help of a trepan, a circular notch was formed on the cornea at half its thickness. The exfoliating knife removed the surface layers of the cornea within the formed incision to the descemet membrane. An artificial cornea was implanted into the formed bed and fixed with a continuous suture. The implant was fixed on top with a hard lens to protect collagen from blinking and other mechanical damage.
Результатыresults
В обеих группах операция проходила без осложнений. В первые сутки после операции у животных из всех групп глаз был умеренно раздражен, передняя камера глаза глубокая, влага передней камеры прозрачная. Было отмечено наличие незначительной перикорнеальной инъекции, полное отсутствие слизистой гнойной отделяемой. Искусственная роговица сохранила прозрачность, сохранялась реакция зрачка на свет, что свидетельствовало о минимальном уровне хирургической травмы. Через две недели после операции у всех прооперированных кроликов, за исключением кроликов, которым имплантировали искусственную роговицу на основе нативного коллагена I типа, наметились прорезания искусственной роговицы в области швов, которые привели к отрыву материала через три-четыре недели после проведения операции. У животных, которым имплантировали искусственную роговицу на основе нативного коллагена, через две недели после операции отмечалось видимое офтальмоскопически прирастание имплантата к роговице в области контакта. Сама искусственная роговица была полностью покрыта эпителием. Таким образом, искусственная роговица, приготовленная из нативного коллагена I типа, обладала более высокой биосовместимостью.In both groups, the operation was uneventful. On the first day after the operation, the animals from all eye groups were moderately irritated, the anterior chamber of the eye was deep, the moisture of the anterior chamber was transparent. It was noted the presence of a slight pericorneal injection, the complete absence of purulent discharge mucosa. The artificial cornea retained transparency, the pupil’s reaction to light remained, indicating a minimal level of surgical trauma. Two weeks after the operation, all operated rabbits, with the exception of rabbits that were implanted with an artificial cornea based on native type I collagen, saw incisions in the artificial cornea in the suture area, which led to tearing of the material three to four weeks after the operation. In animals that were implanted with an artificial cornea based on native collagen, two weeks after surgery, an ophthalmoscopically visible growth of the implant to the cornea in the contact area was observed. The artificial cornea itself was completely covered with epithelium. Thus, an artificial cornea made from native type I collagen had a higher biocompatibility.
Пример 7. Способ усиления биомеханических характеристик роговицы с использованием искусственной роговицы.Example 7. A method for enhancing the biomechanical characteristics of the cornea using an artificial cornea.
По методике, описанной в примере 1, было изготовлено пятнадцать искусственных роговиц. Операцию на глазах кроликов выполняли микроскопом фирмы «Leica» при увеличении в 15 раз; использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani». Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% ультракаином. Производился разрез роговицы протяженностью 5 мм концентрично лимбу. В данной плоскости при помощи расслаивателя формировали роговичный интрастромальный карман «от лимба до лимба». В полость сформированного кармана имплантировали искусственную роговицу, у которой предварительно было удалено уплотненное кольцо. Разрез ушивался с использованием шовного материала. Через неделю после операции оптический срез роговицы был абсолютно прозрачен во всех секторах зоны операции, и ситуация не изменялась на протяжении всего опыта. According to the method described in example 1, fifteen artificial corneas were made. The operation on the eyes of rabbits was performed with a Leica microscope with a magnification of 15 times; used the delaminator and suture material of the company "Mani". The course of the operation was as follows. For anesthesia, animals underwent retrobulbar blockade of 0.5% ultracaine. A 5 mm corneal incision was made concentrically to the limbus. In this plane, with the help of a delaminator, a corneal intrastromal pocket was formed “from limb to limb”. An artificial cornea was implanted into the cavity of the formed pocket, in which the densified ring was previously removed. The incision was sutured using suture material. A week after the operation, the optical section of the cornea was completely transparent in all sectors of the operation area, and the situation did not change throughout the experiment.
Для исследования биомеханических характеристик по пять животных выводились из эксперимента через 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца после операции. Глаза животных энуклеировали, роговую оболочку вырезали по окружности, захватывая при этом участок склеры. Полученные таким образом экспериментальные роговицы зажимали между двух металлических пластин с отверстием 3 мм в центре, таким образом, чтобы отверстие было в центральной области. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию ткани во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении материала с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. Полученные результаты представлены в таблице 4. Как видно из таблицы 4, в результате проведенной операции, через 3 месяца после операции биомеханические характеристики роговицы возрастают примерно в три раза, при этом сохраняется оптическая прозрачность оперированной роговицы.To study the biomechanical characteristics of five animals were removed from the
Таблица 4Table 4
Claims (18)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019117267A RU2714943C1 (en) | 2019-06-04 | 2019-06-04 | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019117267A RU2714943C1 (en) | 2019-06-04 | 2019-06-04 | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2714943C1 true RU2714943C1 (en) | 2020-02-21 |
Family
ID=69630867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019117267A RU2714943C1 (en) | 2019-06-04 | 2019-06-04 | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2714943C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2748951C1 (en) * | 2020-08-12 | 2021-06-02 | Общество с ограниченной ответственностью "Дубна-Биофарм" | Material for keratoplasty and method for obtaining it |
| CN113773379A (en) * | 2021-09-13 | 2021-12-10 | 熹微(苏州)生物医药科技有限公司 | Method for preparing polyethylene glycol collagen and application thereof |
| RU2779361C1 (en) * | 2021-06-03 | 2022-09-06 | Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" | Homogeneous transparent collagen membrane, method for production thereof, and application thereof for reconstructing the cornea |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999037752A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | University Of Ottawa | Artificial cornea |
| US20170043021A1 (en) * | 2014-04-25 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Compositions comprising cyclodextrin incorporated collagen matrices for use in biomedical applications |
| RU2613417C1 (en) * | 2016-02-11 | 2017-03-16 | Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of reinforcing cornea albugo in experiment |
| US20180289857A1 (en) * | 2015-12-22 | 2018-10-11 | Linkocare Life Sciences Ab | Composite collagen hydrogel material, an implantable ophthalmic device comprising such material and methods of producing the composite collagen hydrogel material and the implantable ophthalmic device |
| EP2471902B9 (en) * | 2009-08-25 | 2018-12-19 | Servicio Andaluz De Salud | Production of artificial tissues by means of tissue engineering using agarose-fibrin biomaterials |
-
2019
- 2019-06-04 RU RU2019117267A patent/RU2714943C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999037752A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | University Of Ottawa | Artificial cornea |
| EP2471902B9 (en) * | 2009-08-25 | 2018-12-19 | Servicio Andaluz De Salud | Production of artificial tissues by means of tissue engineering using agarose-fibrin biomaterials |
| US20170043021A1 (en) * | 2014-04-25 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Compositions comprising cyclodextrin incorporated collagen matrices for use in biomedical applications |
| US20180289857A1 (en) * | 2015-12-22 | 2018-10-11 | Linkocare Life Sciences Ab | Composite collagen hydrogel material, an implantable ophthalmic device comprising such material and methods of producing the composite collagen hydrogel material and the implantable ophthalmic device |
| RU2613417C1 (en) * | 2016-02-11 | 2017-03-16 | Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of reinforcing cornea albugo in experiment |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2748951C1 (en) * | 2020-08-12 | 2021-06-02 | Общество с ограниченной ответственностью "Дубна-Биофарм" | Material for keratoplasty and method for obtaining it |
| RU2779361C1 (en) * | 2021-06-03 | 2022-09-06 | Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" | Homogeneous transparent collagen membrane, method for production thereof, and application thereof for reconstructing the cornea |
| CN113773379A (en) * | 2021-09-13 | 2021-12-10 | 熹微(苏州)生物医药科技有限公司 | Method for preparing polyethylene glycol collagen and application thereof |
| CN113773379B (en) * | 2021-09-13 | 2023-08-01 | 熹微(苏州)生物医药科技有限公司 | Method for preparing polyethylene glycol collagen-like protein and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Trujillo-de Santiago et al. | Ocular adhesives: Design, chemistry, crosslinking mechanisms, and applications | |
| CA2576308C (en) | Ophthalmic devices and related methods and compositions | |
| Niu et al. | Heparin-modified gelatin scaffolds for human corneal endothelial cell transplantation | |
| US4969912A (en) | Human collagen processing and autoimplant use | |
| US20050287223A1 (en) | Use of amniotic membrane as biocompatible devices | |
| WO2016178586A2 (en) | Collagen compositions and preparation and uses thereof | |
| US20100028407A1 (en) | Layered bio-adhesive compositions and uses thereof | |
| KR20110090242A (en) | Method for preparing contact lens-shaped amniotic dressing | |
| WO2008131639A1 (en) | A cell-removing cornea substrate and a method of preparation thereof | |
| RU2714943C1 (en) | Artificial cornea, which is a collagen-based heterogeneous stiffness membrane, and a method for production and use thereof | |
| Andreev et al. | A new collagen scaffold for the improvement of corneal biomechanical properties in a rabbit model | |
| WO2011074208A1 (en) | Method for preparation of corneal transplantation material by transparentization of skin dermis or amnion | |
| RU2779361C1 (en) | Homogeneous transparent collagen membrane, method for production thereof, and application thereof for reconstructing the cornea | |
| CN107050515B (en) | Corneal stroma, preparation method and application | |
| Jorge E et al. | In vivo Biocompatibility of Chitosan and Collagen–Vitrigel Membranes for Corneal Scaffolding: a Comparative Analysis | |
| CN112494722A (en) | Collagen-based cornea regeneration repair material capable of realizing rapid epithelialization and preparation method thereof | |
| US20230355844A1 (en) | Electrospun Reinforced Suturable Artificial Cornea and Uses Thereof | |
| RU2124331C1 (en) | Keratoprosthesis | |
| JP2013048643A (en) | Method for preparing transparentized amnion, and transparentized amnion | |
| US5993796A (en) | Biocompatible polymeric materials, methods of preparing such materials and uses thereof | |
| Carriel Araya et al. | Scleral surgical repair through the use of nanostructured fibrin/agarose-based films in rabbits. | |
| CN118403223A (en) | Collagen-based double-layer bionic repair membrane, preparation method and application | |
| AU2015203038B2 (en) | Silica-based composite ocular device and methods | |
| JP2023521307A (en) | High-strength collagen composition and method of use | |
| US20140074231A1 (en) | Biocompatible compositions and methods of manufacture |